JPH0515379A - 酵母雑種ベクター及び該ベクターを使用するポリペプチドの製造方法 - Google Patents

酵母雑種ベクター及び該ベクターを使用するポリペプチドの製造方法

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JPH0515379A
JPH0515379A JP2419332A JP41933290A JPH0515379A JP H0515379 A JPH0515379 A JP H0515379A JP 2419332 A JP2419332 A JP 2419332A JP 41933290 A JP41933290 A JP 41933290A JP H0515379 A JPH0515379 A JP H0515379A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】酵素酸性ホスファターゼプロモーターと非酵母
ペプチド又は該酸性ホスファターゼプロモーターに対し
て異種性のペプチドをコードする領域とを含有するハイ
ブリドベクターにより形質転換された酵母を培養し、そ
して発現生成物を採取することを特徴とする前記ペプチ
ドの製造方法を提供する。 【効果】培地中のリン酸塩濃度を変えることにより、簡
単に目的遺伝子の発現を制御することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野）この発明は、酵母酸性ホスファターゼ遺
伝子のプロモーターを含有するＤＮＡ断片、前記プロモ
ーターを含有し酵母細胞を形質転換することができる雑
種ベクター、及び該雑種ベクターにより形質転換された
酵母細胞に関する。この発明はさらに、組み換えＤＮＡ
技術を用いる前記ＤＮＡ断片、前記雑種ベクター及び前
記酵母細胞の製造方法を提供する。さらに、この発明
は、前記雑種ベクター中の挿入遺伝子によりコードさ
れ、そしてヒト及び動物の病気の治療に有用なポリペプ
チド及びその誘導体の製造方法に関する。
（発明の背景）組み換えＤＮＡ技術の発達に伴って、有
用なポリペプチド、特に医薬として有利なポリペプチド
の制御された微生物的生産が可能となった。組み換えＤ
ＮＡ技術を使用する最近の研究のほとんどは原核生物に
関する。これらの生物に真核性蛋白質をコードするＤＮ
Ａを導入する方法は一層精巧になり、今や十分に確立さ
れている。この新しい技術によって変性された若干の生
物種、特にエッセリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）の菌株が入手可能であり、そしてこれによ
りインスリン、ヒト−白血球インターフェロン及びヒト
線繊芽細胞インターフェロン、並びにヒト−生長ホルモ
ンのごとき非常に重要なポリペプチドの商業的生産が可
能となった。しかしながら、今後多くの目的のために、
蛋白質、特に薬理学的に重要な蛋白質の商業的生産にお
いて、真核系の使用が望ましく、又は必要となろう。酵
母は真核生物であるから、多くの生物学的経路を、他の
真核生物、特に重要な哺乳動物細胞と共通にしている。
薬理学的に重要な多くの蛋白質が哺乳動物細胞により合
成されるから、２つの系を関連させることが特に有利で
ある。例えば、酵母の分泌経路は高等動物細胞のそれと
類似しており、そして信号配列（蛋白質の負荷されてい
ない（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ）Ｎ−末端部分、通常は分泌
輸送中に切断される）を切断する機構を有することが知
られている（４７）。グリコシル化系が分泌経路と関連
する。グリコシル化蛋白質を導く基本的な段階はすべて
の真核生物における場合と類似しており、そして酵母細
胞は原核細胞と異り、十分にグリコシル化された蛋白質
を生産することができる（この経路における幾つかの最
終段階は異るであろうが）と説明される。さらに、酵母
細胞は内性毒素（エンドトキシン）を含有しない。Ｅ・
コリからの蛋白質標品には内性毒素による汚染がしばし
ば見出され、そして不経済な精製段階を通じてこれを除
去しなければならない。酵母は微生物であるから、酵母
細胞は培養が容易である。酵母の場合、培養液の容積当
りから得られる細胞の量はＥ．コリの場合に比べて相当
に多い。さらに、酵母の発酵的挙動はよく理解されてお
り、そして大規模発酵の条件はすでに確立されている。
過去数年の間に、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ
ー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）は、基礎及び応用研究分野の分子生物学者の間でま
すます注目されるようになってきた。この発展は、外来
性ＤＮＡの導入及びクローニングのごとき遺伝子操作の
ために酵母を用いることを可能にした形質転換系の確立
〔ヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）等（１）；ベッグス（Ｂｅ
ｇｇｓ）（２）〕に大きく依存している。原核系の場合
と同様に、プラスミドは酵母細胞を形質転換するため、
すなわち酵母細胞に組み換えＤＮＡを導入するために使
用するのに好ましいベクターである。酵母細胞を形質転
換するのに適するベクター、該ベクターにより形質転換
された酵母、該形質転換された酵母により生産されたポ
リペプチド、及びその製造方法に関する多くの特許出願
及びその他の発表が存在する。一般的な酵母形質転換法
はヒンネン等（１）、ベッグス（２）、ヒックス（Ｈｉ
ｃｋｓ）等（３）及びストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）等
（４）に開示されている。プラスミド中でサッカロミセ
ス・セレビシエーのアルコールデヒドロゲナーゼ１（Ａ
ＤＨ１）の５′−側配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕ
ｅｎｓｅ）のＤＮＡ断片に連続され、そして酵母細胞に
導入されたヒト−インターフェロン遺伝子の発現につい
てはヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）等（５）に記載
されている。家兎の染色体性β−グロビン遺伝子を含有
するプラスミドによるサッカロミセス・セレビシエーの
形質転換がベッグス等（６）により報告されている。こ
の発表においては、遺伝子は不正確に転写され、そして
一次β−グロビン転写のスプライシングは検出されてい
ない。ポリペプチドをコードしそして誘導し得るプロモ
ーターに連結されている外来性ＤＮＡ、及び形質転換さ
れた細胞の検出を可能にする連結されていないＤＮＡに
より形質転換された真核細胞、例えば酵母及び特に哺乳
動物細胞、並びにその製造方法がＰＣＴ特許出願８１／
０２４２５（７）に記載されている。真核性複製部位を
コードするＤＮＡ配列、低複製数において有糸分裂安定
性を有しそして真核性複製部位を含有する真核性ベクタ
ー、及びこのベクターにより形質転換された酵母細胞が
ヨーロッパ特許出願第４８０８１号（８）に開示されて
いる。特に真核性宿主自律複製断片を含んでなる雑種Ｄ
ＮＡ、その製造方法、及びこの雑種ＤＮＡによる高頻度
形質転換真核細胞、例えば酵母がヨーロッパ特許出願第
４５５７３年（９）に開示されている。エッシェリヒア
・コリのβ−ｌａｃＺ遺伝子のプロモーターにより制御
されそして酵母細胞中に導入され得る卵白アルブミン遺
伝子を含有するプラスミドが独国出願公開第２９２３２
９７号、及び仏国特許出願第２４５８５８５号（１１）
に記載されている。細菌プラスミドのＤＮＡ、酵母２μ
プラスミドのＤＮＡの全部又は一部分及び酵母ＵＲＡ３
遺伝子を含んで成る雑種プラスミド、並びに該プラスミ
ドにより形質転換された酵母がヨーロッパ特許出願第１
１５６２号（１２）に開示されている。
（発明の目的）近年、遺伝子工学の分野において大きな
発展があり、そして遺伝的に操作された生物、特に腸内
細菌エッセリシア・コリを用いる系が現在機能してい
る。しかしながら、蛋白質の経済的且つ大規模な工業生
産に適する前記以外のそして改良された系、特に酵母の
ごとき真核系の必要性が存在する。現在、遺伝子のクロ
ーニングのための種々の酵母ベクターが利用可能であ
る。外来遺伝子の効率的な発現のためには、構造コード
配列を、遺伝子発現の外的制御を可能にする制御特性を
有利に示す強力な酵母プロモーターと組合わせる必要が
ある。このような要求に合致する酵母プロモーターを提
供することがこの発明の目的である。さらに、この発明
は、前記のプロモーター及び該プロモーターにより制御
される外来性構造遺伝子を含んで成る雑種ベクターを提
供することを目的とする。
（発明の詳細な記載） （１） 酵母酸性ホスファターゼプロモーターを含有す
るＤＮＡ断片及びその調製 この発明は、改良された発現性を有する新しく分離され
た酵母プロモーター及びその製造方法を提供する。この
発明の酵母プロモーターは、酵母、特にサッカロミセス
・セレビシエーの遺伝子ＤＮＡから誘導される。酵母に
おける酸性ホスファターゼの発現には、少なくとも２つ
の構造遺伝子（ＰＨＯ３及びＰＨＯ５）、並びに数個の
制御遺伝子（ＰＨＯ２、ＰＨＯ４、ＰＨＯ８０、ＰＨＯ
８１、ＰＨＯ８５）が関与する〔例えば参考文献（１
３）を参照のこと〕。ＰＨＯ５及びＰＨＯ３は、それぞ
れ抑制的（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）及び構成的（ｃｏ
ｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）酵母酸性ホスファターゼをコー
ドする。ＰＨＯ５遺伝子は高濃度の無機燐酸塩により抑
制され、そして無機燐酸塩飢餓の下で抑制が解除され
（通常、適当な生理的条件下で大はばに）、他方ＰＨＯ
３遺伝子は低いレベルにおいて構成的に発現する。抑制
的酵素はグリコシル化され、そして約４９０ｋダルトン
の分子量を有する（１４）。従来技術の組み換えＤＮＡ
技術においては酸性ホスファターゼを制御するプロモー
ターは分離されておらず、又は使用されておらず、その
ためそのヌクレオチド配列はまだ解明されていない。最
近の組み換えＤＮＡ技術において使用される他の酵母プ
ロモーターと異り、酵母酸性ホスファターゼプロモータ
ーに直接続くＤＮＡ配列が、分泌過程に関与すると考え
られる信号ペプチドをコードする。外来性蛋白質コード
領域を、蛋白質の酵母細胞膜を通過する生体内輸送を保
証する酵母信号配列に連結するのが有利であろう。こう
することにより、生成物の分解及び宿主細胞成分による
生成物の汚染が少なくなり、そして生成物の回収が促進
されるであろう。各遺伝子が構成的に転与されるのが、
組み換えＤＮＡ技術において従来使用されてきたプロモ
ーターの欠点である。発現されたポリペプチドは酵母細
胞にとって毒性である（殺カビ活性）場合があり、又少
なくとも細胞増殖を阻害する（静カビ活性）場合があ
り、あるいは又ポリペプチドが細胞内で、特に酵母プロ
テアーゼと長時間接触した場合に、分解される場合があ
る。これらすべての場合において、目的とするポリペプ
チドの収量が低下するであろう。ＰＨＯ５プロモーター
及び該プロモーターを含有するベクターを使用すること
によって前記の欠点を回避することができる。培地中の
無機燐酸塩の濃度を単に上昇せしめ又は低下せしめるこ
とによって、実験者の意のままに、ＰＨＯ５を抑制し、
又は抑制を解除することができる。すなわち、酵母の指
数増殖期中プロモーターを抑制し、そして定常期の初め
において抑制を解除することにより最高の細胞濃度にお
いてＰＨＯ５プロモーターにより制御された遺伝子を発
現せしめることができる。このような性質が高レベルの
転写とあいまって、ＰＨＯ５プロモーターをしてこの発
明の好ましいプロモーターとしている。この発明は特
に、酵母酸性ホスファターゼプロモーター、例えばＰＨ
Ｏ３プロモーター、又は好ましくはＰＨＯ５プロモータ
ー、及び側配列を含んでなるＤＮＡ断片に関する。場合
によっては、酵母酸性ホスファターゼプロモーターの次
に、該プロモーターにはじめから連結されていた酵母酸
性ホスファターゼコード領域の信号配列の全部又は一部
分が続く。さらに、前記のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの効
率的な翻訳のために必要とされる配列を含有することが
できる。さらに、前記ＤＮＡ断片のプロモーター機能を
保有する変異体もこの発明に含まれる。この発明のＤＮ
Ａ断片は、例えば、（Ａ）酸性ホスファターゼ遺伝子の
野性型コピーを含有するプラスミドＤＮＡ（酵母遺伝子
試料集団から入手される）を用いて形質転換することに
より酸性ホスファターゼ欠損酵母菌株を補完し、そして
該遺伝子を分離することによって酸性ホスファターゼ遺
伝子を調製し、（Ｂ）得られた遺伝子のサブクローンを
調製し、そして（Ｃ） 前記サブクローンのプロモータ
ーの領域の位置を同定し、そして酸性ホスファターゼプ
ロモーターを含んで成るＤＮＡ断片を分離する、ことに
より製造することができる。さらに詳しくは、前記ＤＮ
Ａ断片の調製には次の段階が関与する。
（１） 細菌細胞及び酵母細胞のいずれにおいても発現
可能なマーカーを担持した細菌（特にエッセリヒア・コ
リ）−酵母雑種プラスミド中にクローニングした野性型
酵母ＤＮＡを用いて酵母遺伝子試料集団を構成する（適
切なマーカーについては下記を参照のこと）。
（２）前記試料集団のプラスミド試料を用いて酸性ホス
ファターゼ欠損酵母菌株を形質転換することにより酵母
酸性ホスファターゼを含有するクローンを選択する。
（３）形質転換された酵母から酸性ホスファターゼ遺伝
子を含有するプラスミドを分離し、そしてこれをＥ・コ
リに逆形質転換し、細菌用マーカー（例えばアンピシリ
ン耐性）の表現形により選択することによって該プラス
ミドを増幅する。
（２′）前記の方法に代えて、遺伝子試料群を亜試料群
に分割し、これを用いて酸性ホスファターゼ欠損酵母菌
株を形質転換し、そして有効な亜試料群を再度亜分割
し、そしてこれを用いて上記のように形質転換し、単一
のクローンが同定されるまでこれを反復する。
（４）同定されたクローンのプラスミドＤＮＡを分離
し、適当な制限エンドヌクレアーゼにより分解し、そし
て断片を適当な酵母ベクターに再クローニングする。
（５）酵母酸性ホスファターゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片
は、前記のベクターにより酸性ホスファターゼ欠損酵母
菌株を形質転換することにより同定することができる。
上記の方法により、約３００塩基対の精度をもって酸性
ホスファターゼ遺伝子の境界を決定することができる。
（６）同定された断片のＤＮＡ配列を決定することによ
り、プロモーター領域、酸性ホスファターゼ蛋白質をコ
ードする領域、そしてさらには、さらに処理するため、
例えば制限エンドヌクレアーゼによりプロモーター機能
のために必要でないＤＮＡ配列を切断除去するために有
用な制限部位の位置を決定する。制限エンドヌクレアー
ゼの選択に依存して、酸性ホスファターゼプロモーター
を含有するＤＮＡ断片はさらに、プロモーター機能を有
しない３′及び５′末端にもとから存在する側ＤＮＡ配
列をも含有する場合があり、この配列は次に行うクロー
ニング操作における連結配列として使用される。所望に
より、これらの追加の配列は制限エンドヌクレアゼ（も
し可能であれば）、又は適当なエキソヌクレアーゼ、例
えばＢａｌ １３１、による切断によって短縮すること
ができる。さらに、断片を、好ましくは適当な制限エン
ドヌクレアーゼを認識する配列を含有する化学合成した
ＤＮＡリンカーに連結することができる。酵母酸性ホス
ファターゼプロモーター、及び酸性ホスファターゼ蛋白
質コード領域からの隣接する信号配列の一部又は全部を
含有するＤＮＡ断片を分離しそして／又は形成すること
もできる。適切に切断した外来性ポリペプチドコード領
域に連結した場合、こうして得られた雑種ＤＮＡは酵母
で発現し、そして酸性ホスファターゼ信号配列又は融合
した信号配列を伴うポリペプチドを生成せしめるであろ
う。この発明の酵母酸性ホスファターゼプロモーター
は、酵母雑種ベクター中の酵母ポリペプチド又は非酵母
ポリペプチドコード領域の発現を制御するために用いる
ことができる。
（２）酵母酸性ホスファターゼプロモーターを含有する
雑種ベクター及びその調製 この発明はさらに、酵母酸性ホスファターゼプロモータ
ー、及び該プロモーターにより制御される酵母ポリペプ
チド又は非酵母ポリペプチドコード領域を含んで成る雑
種ベクターに関する。この明細書において、「ベクタ
ー」、「雑種ベクター」、「ＤＮＡ配列」等の語は特に
二重鎖ＤＮＡに関して使用する。しかしながら単鎖ＤＮ
Ａも含まれる。ベクター及び雑種ベクターは、線状又は
環状の形で存在し得る。酵母酸性ホスファターゼプロモ
ーターは、特に第１章において記載したものであり、そ
して好ましくは抑制的酸性ホスファターゼプロモーター
ＰＨＯ５である。上記のプロモーターの１つによって制
御される酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコ
ードする領域（遺伝子）は、遺伝子ＤＮＡから、もしく
はｍＲＮＡ経路を介してｃＤＮＡから誘導することがで
き、又は学的に合成することができる。非酵母ポリペプ
チドをコードする領域（遺伝子）は、ウイルス、原核細
胞、又は高等真核細胞、特にヒトの細胞を含む真核細胞
に由来する。宿主酵母細胞中で発現する場合、これらの
遺伝子により広範囲の種類のポリペプチドが生産され、
グリコシル化されたポリペプチドを含むこれらのポリペ
プチドには、例えば、栄養素を製造するため及び化学反
応を酵素的に行うための酵素、又は非酵素性ポリペプチ
ド、例えばホルモン、免疫調節性、抗ウイルス性及び抗
癌性ポリペプチド、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝
血因子、食料及びこれらに類するものが含まれる。例え
ば前記の遺伝子は、アミラーゼ、プロテアーゼ、リゾチ
ーム、ウイルス性チミジンキナーゼ、レンニン、β−ラ
クタマーゼ、グルコースイソメラーゼ、セクレチン、チ
モシン、レラクシン、カルシトニン、ソマトスタチン、
ヒトもしくは牛の生長ホルモン、インスリン、黄体形成
ホルモン、小皮小体ホルモン、アデノコルチコトロピ
ン、β−エンドルフィン、黒血球刺激ホルモン、β−リ
ポトロピン、ウロガストロン、インターフェロン、例え
ばヒト−インターフェロン、例えばヒト−白血球、リン
パ芽球細胞（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄｃｅｌｌ）
もしくは繊維芽細胞から誘導されるヒト−インターフェ
ロン−αもしくは−βポリペプチド、又はヒト−インタ
ーフェロン−γ、リンポカイン、腫瘍壊死因子、抗レン
ニン抗体、肝炎Ａウイルス抗原、肝炎Ｂウイルス（ＨＢ
Ｖ）表面もしくは心抗原、肝炎非−Ａ非−Ｂウイルス抗
原、ヒト組織適合性抗原、食品及び口疾患ウイルス抗
原、インフルエンザヘマグルチニン、鳥類ペストウイル
スヘマグルチニン、血清アルブミン、卵アルブミン、タ
ウマチン、エグリンス（ｅｇｌｉｎｓ）もしくはプラス
ミノーゲン活性化物質をコードする。選択されたペプチ
ドコード領域は、場合によっては信号配列又はその一部
を含有する。前記のように、この領域により、外来性の
熟成ポリペプチドと共に、ＰＨＯ５信号配列、又はＰＨ
Ｏ５信号配列の一部分と外来性ポリペプチドの信号配列
の一部分とを含んで成る雑種信号配列を含有する融合蛋
白質が生成する。このいずれの場合にも、外来性ポリペ
プチドの熟成に際して信号配列が切除される組合わせが
好ましい。酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵母
ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードする領域
のほかに、プロモーターの機能のため、すなわちポリペ
プチドコード領域の発現のためには必要ではなく、又は
重要ではないが、例えば前記雑種ベクターにより形質転
換された酵母細胞の増殖の際に重要な機能を果す追加の
ＤＮＡ配列を含有することができる。追加のＤＮＡ配列
は、原核細胞及び／又は真核細胞から誘導され、そして
染色体性及び／又は染色体外ＤＮＡ配列を含むことがで
きる。例えば、追加のＤＮＡ配列は、プラスミド、例え
ば細菌性もしくは真核性プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤ
ＮＡ及び／又は染色体ＤＮＡ、例えば細菌性、酵母性も
しくは高等真核性染色体ＤＮＡにより生じる（又は構成
される）。好ましい雑種ベクターは、細菌プラスミド、
特にエッセリヒア・コリプラスミドｐＢＲ３２２もしく
は関連プラスミド、バクテリオファージλ、酵母２μプ
ラスミド、及び／又は酵母染色体ＤＮＡを含有する。追
加のＤＮＡ配列は酵母複製開始点及び酵母用選択遺伝子
マーカーを含有することが好ましい。酵母複製開始点、
例えば染色体性自律複製部分（１個又は複数個）を含有
する雑種ベクターは、形質転換後、酵母細胞中で染色体
外で保持され、そして有糸分裂の際に自律的に複製され
る。酵母２μプラスミドＤＮＡと相同の配列を含有する
雑種ベクターも又使用することができる。これらの雑種
ベクターは、組み換えにより細胞内にすでに存在する２
μプラスミド中に一体化され、又は自律的に複製するで
あろう。２μ配列は高頻度形質転換プラスミドのために
特に適し、そして高コピー数を供することができる。さ
らに、この発明の雑種ベクターは宿主酵母の染色体中に
存在する遺伝子のＤＮＡ配列（例えばＰＨＯ５）を含有
することができ、このプロモーターは酵母ポリペプチド
又は非酵母ポリペプチドをコードする領域に連結されて
いてよい。配列が相同であるため、組み換えによりベク
ター全体が宿主の染色体に安定に導入され得る。従っ
て、増殖の過程で、子孫細胞は選択圧が無くても導入さ
れた遺伝物質を維持するであろう。酵母用の選択遺伝子
マーカーとして、マーカーの表現型発現に基いて形質転
換体の選択を促進する任意のマーカーを使用することが
できる。酵母用の適当なマーカーは、特に抗生物質耐性
を発現するマーカー、又は栄養要求性酵母変異株の場合
には宿主の障害を補足する遺伝子である。対応する遺伝
子は、例えば抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を
供し、又は栄養要求性酵母変異株に原栄養性を供する遺
伝子、例えばＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３又はＴＲＰ
１遺伝子である。形質転換される宿主がマーカーにより
発現される生成物を要求する場合には、自律複製部分に
関連する構造遺伝をマーカーとして使用することもでき
る。有利には、この発明の雑種ベクター中に存在する追
加のＤＮＡ配列にはさらに、複製開始点及び細菌宿主、
特にエッセリヒア・コリ用選択遺伝子マーカーを含める
ことができる。酵母雑種ベクター中にはＥ．コリ複製開
始点及びＥ．コリマーカーの存在に関連する有用な特徴
がある。第１に、Ｅ．コリにおける増殖及び増幅によっ
て多量の雑種ベクターＤＮＡが得られる。そして第２
に、Ｅ．コリに基礎を置くクローニング技術の全知見を
用いて雑種ベクターを便利に形成することができる。
Ｅ．コリプラスミド、例えばｐＢＲ３２２等はＥ．コリ
複製開始点、及び抗生物質、例えばテトラサイクリン及
びアンピシリンに対する耐性を供するＥ．コリ遺伝マー
カーを含有し、そして酵母雑種ベクターの一部として有
利に用いられる。例えば、酵母及び細菌宿主用複製開始
点及び遺伝マーカー（上記を参照）を含有する追加のＤ
ＮＡ配列は、以後「ベクターＤＮＡ」と称し、このもの
は酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵母ポリペプ
チド又は非酵母ポリペプチドをコードする領域と一緒に
なってこの発明の雑種ベクターを構成する。雑種ベクタ
ーは、当業界において知られている方法により、例え
ば、酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び該プロ
モーターにより制御される酵母ポリペプチド又は非酵母
ポリペプチドコード領域をベクターＤＮＡに導入するこ
とにより調製することができる。少なくとも１個、好ま
しくは２個又はそれより多くの制限部位を有する、すで
に遺伝子地図が作られている線状の、又は好ましくは環
状のベクターＤＮＡ、例えば細菌プラスミドＤＮＡ等を
用いることができる。すでに複製開始点並びに酵母宿主
及び／又は細菌宿主用遺伝子マーカーを含有しているベ
クターＤＮＡを用いるのが便利である。適当な制限エン
ドヌクレアーゼを用いてベクターＤＮＡを開裂する。制
限酵素処理されたＤＮＡを、酸性ホスファターゼプロモ
ーターを含有するＤＮＡ断片、及び酵母ペプチド又は非
酵母ペプチドをコードするＤＮＡ断片に連結する。プロ
モーターとポリペプチドコード領域との連結に先立っ
て、又はその後で（あるいは又それと同様に）、酸母宿
主用もしくは細菌宿主用の複製開始点及び／又はマーカ
ーを導入することができる。いかなる場合にも、制限処
理及び連結処理（アニーリング）の条件は、ベクターＤ
ＮＡ及びプロモーターの本質的機能が害されないように
選択する。雑種ベクターは逐次的に、又は必要とするす
べての配列を含む２つのＤＮＡ部分を連結することによ
り形成することができる。試験管内でＤＮＡ断片を連結
するのに種々の技法が使用される。ある種のエンドヌク
レアーゼによって形成される平滑末端（ブラントエン
ド）（ＤＮＡが完全に対を成している）は、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて直接連結することができる。さらに一
般的には、ＤＮＡ断片をその単鎖接着末端（コヘーシブ
エンド）を介してリンクせしめ、そしてＤＮＡリガー
ゼ、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼにより共有結合的に連結
する。この単鎖「接着末端」は、ＤＮＡを、ずれのある
末端（２本鎖ＤＮＡが数個のヌクレオチドだけはなれた
異る部位で切断されている）を形成する他の種類のエン
ドヌクレアゼにより切断することにより形成される。単
鎖は、平滑末端又はずれのある末端（ｓｔａｇｇｅｒｄ
ｅｎｄ）に末端トランスフェラーゼを用いてヌクレオ
チドを付加することにより、又はλ−エキソヌクレアー
ゼのごとき適当なエキソヌクレアーゼを用いて平滑末端
の１つの鎖を切り取ることにより形成することができ
る。ずれのある末端を形成するための前記以外の方法に
は、平滑末端ＤＮＡ断片に、ずれのある末端を形成する
エンドヌクレアーゼに認識される部位を含有する化学合
成リンカーＤＮＡを連結し、そしてこうして生成したＤ
ＮＡを対応するエンドヌクレアーゼにより切断する方法
がある。効率的な発現のためには、酵母蛋白質又は非酵
母蛋白質をコードする遺伝子が、転写機能（酸性ホスフ
ァターゼプロモーター）及び翻訳機能（リボゾーム結合
部位）を含む配列に対して適当な位置に存在しなければ
ならない。第１に、プロモーターを含んで成るＤＮＡ断
片とポリペプチドをコードする領域は適切な方向に連結
しなければならない。もし２種類の方向付けが可能であ
る場合には、常用の制限解析により正しい方向を決定す
ることができる。正しくない方向付けがされた挿入遺伝
子を含有する雑種ベクターは、適当な制限エンドヌクレ
アーゼにより挿入遺伝子を切取り、そしてこの遺伝子を
雑種ベクター断片に再連結することによって再方向付け
を行うことができる。ある場合には、それぞれ末端に異
る制限部位を有する２つのＤＮＡ断片を連続することに
より間違った方向付けを回避することができる。さら
に、雑種ベクターの構成は、正しい転写の開始と停止が
可能なように行わなければならない。後者に関して、転
写は、酵母染色体ＤＮＡ又は酵母２μプラスミドから誘
導されたＤＮＡ配列において終了するのが好ましい。酵
母遺伝子、例えばＰＨＯ５又はＰＨＯ３の転写停止信号
を含有するＤＮＡ配列において転写が終るのが好まし
い。第２に、正しい読取わく（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅ）を確立しなければならない。プロモーター領域及
びポリペプチドコード領域のいずれのヌクレオチド配列
も連結に先立って知られており、又は容易に決定するこ
とができる〔例えば（１５）〕から、正しい読取わくを
確立することについては問題がない。さらに、遺伝子の
より効率的な発現のためにはＤＮＡの特定の二次構造が
必要かもしれない。酸性ホスファターゼプロモーターを
外来性コード配列に連結するための好ましい部位は、大
（ｍａｊｏｒ）酸性ホスファターゼｍＲＮＡ開始点と酸
性ホスファターゼコード領域のＡＴＧとの間であり、例
えばＰＨＯ５プロモーターを使用する場合には、大ＰＨ
Ｏ５ｍＲＮＡ開始点とＰＨＯ５酸性ホスファターゼコー
ド領域のＡＴＧとの間の約４０ｂｐ（塩基対）の範囲で
ある。この領域において連結を行うために、外来性コー
ド配列は、翻訳開始のための自らのＡＴＧを有する必要
があり、あるいは、追加の合成オリゴヌクレオチドによ
りそれを与えられる必要がある。高等生物のポリペプチ
ドの多くは、熟成ポリペプチドのＮ末端に付加された信
号ペプチドを含む前−ポリペプチドとして一次的に発現
されるので、挿入遺伝子中に信号配列を含有せしめるの
が有用である。信号配列としては、発現されるべきポリ
ペプチド遺伝子又は酸性ホスファターゼプロモーターに
もとから連結されていたものが好ましい。これに代え
て、酸性ホスファターゼ信号配列の一部分とポリペプチ
ド信号配列の一部分とを連結して融合信号配列を形成す
ることもできる。直接的に熟成ポリペプチドを発現せし
める必要がある場合には、場合によってはプロモーター
領域の次に存在する、又は場合によっては熟成ポリペプ
チドコード領域の前に存在する信号配列又はその一部分
を、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えばＢａｌ ３１
による分解により除去しなければならない。中間生成
物、例えばなお１つ又は複数の本質的機能を欠いている
ベクター、及びこの発明の最終的な雑種ベクターは、前
記の理由（中間生成物及び雑種プラスミドの大量調製）
のため、細菌宿主、特にＥ・コリに形質転換することが
できる。細菌ベクター、例えばＥ・コリプラスミドｐＢ
Ｒ３２２、並びに細菌用複製開始点及び遺伝子マーカー
を含有する前記プラスミドの断片は、そのために最も好
ましいベクターである。このような細菌ベクターを使用
する場合、酵母雑種ベクターの調製の最終段階に、酵母
用の遺伝子マーカー及び複製開始点の導入を含めるのが
好ましい。この発明の雑種ベクターを調製するために細
菌ベクターに挿入されるＤＮＡ断片、例えば自律複製部
分〔（４）を参照のこと〕、酵母２μプラスミド配列
（２）又は酵母マーカーＤＮＡ（１６）は、それぞれ酵
母染色体ＤＮＡ及び酵母２μプラスミドＤＮＡから常法
に従って分離することができる。酵母ポリペプチド又は
非酵母ポリペプチドをコードする遺伝子は、常用の技法
を用いてｍＲＮＡ経路（前記）を介してｃＤＮＡから誘
導される染色体ＤＮＡもしくは染色体外ＤＮＡから分離
することができ〔例えば（１７）、（１８）〕、又は化
学的に合成することもできる。この発明の好ましい態様
においては、雑種ベクターを調製する方法は、（１）野
生型酵母ＤＮＡを用いて酵母遺伝子試料集団を構成し、
（２）酸性ホスフェターゼ遺伝子、特にＰＨＯ５遺伝子
を分離し、そしてこれを、細菌プラスミド例えばｐＢＲ
３２２又は生物的に活性な、特にもとの複製開始点及び
選択マーカーを含有する該プラスミドの断片にクローニ
ングし、（３）前記プラスミド中に酵母用遺伝子マーカ
ー、例えばＴＲＰ１遺伝子、及び酵母複製開始点、例え
ば染色体性自律複製断片又はこれの代りに酵母２μプラ
スミド配列を挿入し、（４）酵母ポリペプチド又は非酵
母ポリペプチド、例えばヒト−インターフェロン、ＨＢ
Ｖ表面抗原をコードするＤＮＡ断片を、前記酸性ホスフ
ァターゼプロモーターが前記ポリペプチドコード部分を
制御するように導入し、そして（５）場合によっては、
ポリペプチドコード領域より下流に、酵母遺伝子、例え
ばＰＨＯ５の転写停止信号を含有するＤＮＡ配列を挿入
する、ことから成る。例えば、段階（２）の生成物とし
て得られた組み換えプラスミド中に、まずポリペプチド
をコードする部分を導入し、次に酵母用遺伝子マーカー
及び複製開始点を導入するというように、段階（３）〜
（５）の順序を変えて行うことも可能である。酵母用遺
伝子マーカー、酵母複製開始点及びポリペプチドコード
部分を挿入するのに先立って、場合によっては、必須で
ない機能部分、例えば酸性ホスファターゼ構造遺伝子
を、段階（２）において得られた組み換えプラスミドか
ら除去することができる。特に、酵母ポリペプチド又は
非酵母ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、大酸性
ホスファターゼｍＲＮＡ開始点と酸性ホスファターゼコ
ード領域のＡＴＧとの間で、酸性ホスファターゼプロモ
ーターに連結する（段階４）。場合によっては、適当な
制限部位を含有する合成リンカーを導入することによっ
て、前記ＤＮＡ断片と酸性ホスファターゼプロモーター
との連結を可能にする。酵母酸性ホスファターゼプロモ
ーターを含んで成り、そしてまだ酵母ペプチド又は非酵
母ペプチドをコードする配列を含有していない中間体雑
種ベクターもこの発明の対象であり、そして上記の逐次
段階（１），（２），（３）及び場合によっては（５）
により調製され、この場合酸性ホスファターゼプロモー
ターの末端を大酸性ホスファターゼｍＲＮＡ開始部位と
酸性ホスファターゼ遺伝子のＡＴＧとの間に位置せしめ
そして／又は場合によっては、適当な制限部位を含有す
る合成リンカーを導入して酵母ポリペプチド又は非酵母
ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片の挿入を可能にす
る。
（３） 酵母酸性ホスファターゼプロモーター含有雑種
ベクターによる酵母の形質転換 他の観点において、この発明は、酵母ポリペプチド又は
非酵母ポリペプチドを生産することができる形質転換さ
れた酵母細胞の製造方法に関する。この方法は２章で記
載した任意の雑種ベクターにより酵母を形質転換するこ
とからなる。有用な酵母には、サッカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃ
ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシ
ス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属及び類縁属に属する種、
特にサッカロミセス・セレビシエーの菌株が含まれる。
雑種ベクターによる酵母の形質転換は、文献により公知
の方法により、例えばヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）等
（１）に記載されている方法により行うことができる。
この方法は次の３段階にわけることができる。すなわ
ち、（１） 酵母細胞壁を除去し、（２） ＰＥＧ（ポ
リエチレングリコール）及びＣａ＋＋イオンの存在下
で、形質転換ＤＮＡにより「裸」の酵母細胞（スフェロ
プラスト）を処理し、そして（３）寒天固形層中で細胞
壁を再生せしめ、そして形質転換された細胞を選択す
る。好ましい力法においては、 （１′）浸透圧的に安定な溶液（例えば１Ｍソルビトー
ル）中で、グルコシダーゼの種々の標品、例えばカタツ
ムリ腸液（例えばグルスラーゼ▲Ｒ▼、もしくはヘリカ
ーゼ▲Ｒ▼）又は微生物から得られた酵素の混合物（例
えば、チモリアーゼ▲Ｒ▼）を用いて酵素的に酵母細胞
壁を除去する。
（２′）ＰＥＧの存在下で酵母スフェロプラストを凝集
せしめ、そして細胞質膜の局所的融合を誘導する。「融
合様（ｆｕｓｉｏｎ ｌｉｋｅ）」状態の発生は決定的
であり、形質転換の過程で多くの形質転換された酵母細
胞は二倍体又は三倍体にさえなる。形質転換体を濃縮す
るために融合したスフェロプラストを選択する手法を用
いることができる。すなわち、形質転換された細胞は予
備選択された融合生成物の中から容易に選択することが
できる。
（３′）細胞壁を有しない酵母細胞は分裂することがで
きないから、細胞壁を再生しなければならない。この再
生は、スフェロプラストを寒天中に埋め込むことによっ
て便利に行うことができる。例えば、溶融した寒天（約
５０℃）をスフェロプラストと混合する。溶液を酵母の
増殖温度（約３０℃）に冷却することにより固相が得ら
れる。この寒天相により、必須の巨大分子がスフェロプ
ラストから急速に拡散し、そして失われることが防止さ
れ、これにより細胞壁の再生が促進される。しかしなが
ら（効率は低いが）スフェロプラストを、あらかじめ形
成した寒天層表面に置くことによっても細胞壁の再生を
行うことができる。好ましくは、細胞壁再生用寒天は再
生と形質転換された細胞の選択とが同時に可能となるよ
うに調製する。一般に、アミノ酸生合成経路の酵素をコ
ードする遺伝子が選択マーカーとして使用される（２章
を参照のこと）から、酵母最少培地寒天中で再生を行う
のが好ましい。しかしながら、非常に高い再生効率が必
要な場合には、２段階法、すなわち（１）豊富な複合培
地中で細胞壁の再生を行い、そして（２）レプリカ法に
より細胞層を選択寒天プレートに移すことにより形質転
換された細胞を選択する方法が有利である。雑種ベクタ
ーがマーカー遺伝子を全く含有しない場合には、他の方
法により形質転換された細胞を選択することができる。
これらの方法には、例えば、雑種ベクターの配列と相同
のラベルされたＤＮＡ断片とその場でハイブリッドを形
成せしめる方法〔ヒンネン等（１）参照〕、導入された
遺伝子の生産物の抗体が利用できる場合にはその場で免
疫測定する方法、又は形質転換プラスミドによりコード
された遺伝子生成物を測定する他の選択方法が含まれ
る。前記の方法に代えて、酵母を、この発明の雑種ベク
ター及び酵母用遺伝子マーカーを含有する第２のベクタ
ーを用いて二重形質転換することができる。異なる２つ
のベクターが共通のＤＮＡ配列を有する場合（ベクター
上に細菌配列が存在し得る）、組み換えが生じて融合さ
れた選択され得る雑種分子が誘導される場合がある。こ
の発明はさらに、酵母酸性ホスファターゼプロモータ
ー、及び酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコ
ードする領域を含有する雑種ベクターにより形質転換さ
れた酵母宿主に関する。
（４）形質転換された酵母細胞の培養、及びポリペプチ
ド合成の誘導 自律複製プラスミド、例えば酵母２μプラスミドＤＮＡ
を含有するプラスミドにより形質転換された酵母細胞
は、導入された雑種プラスミドを喪失する傾向を種々の
程度に有する（１６参照）。このため、このような酵母
は、選択的条件下、すなわちプラスミドにコードされた
遺伝子の発現が増殖のために必須である条件下で増殖せ
しめなければならない。現在使用されているほとんどの
選択マーカーは、アミノ酸生合成又はプリン生合成酵素
をコードする遺伝子である。このため、対応するアミノ
酸又はプリン塩基を含有しない合成最少培地を使用する
必要がある。しかしながら、抗生物質耐性を供するある
種の遺伝子〔例えば、シクロヘキシミド耐性又はアミノ
グリコシドＧ４１８耐性を供する遺伝子（２１参照）〕
を用いることもできる。抗生物質耐性遺伝子を含有する
ベクターにより形質転換された酵母細胞は対応する抗生
物質を含有する複合培地で増殖することができ、従って
より速い増殖速度及びより高い細胞濃度を達成すること
ができる。染色体に一体化するＤＮＡにより形質転換さ
れた酵母細胞は選択的増殖条件を必要としない。これら
の形質転換された細胞は、選択圧がなくても十分安定に
増殖することができる。従って、このような細胞は、複
合培地中で有利に増殖する。構成的酸性ホスファターゼ
プロモーター（例えば、ＰＨＯ３）を有する雑種プラス
ミドを含有する酵母細胞は、誘導を必要としないで、該
プロモーターに付加された酵母蛋白質又は非酵母蛋白質
遺伝子を発現せしめる。しかしながら、酵母蛋白質又は
非酵母蛋白質遺伝子が抑制される酸性ホスファターゼプ
ロモーターＰＨＯ５の制御の下にある場合には、最高レ
ベルのｍＲＮＡ転写が得られるように増殖培地の組成を
調整しなければならない。すなわち、ＰＨＯ５プロモー
ターの抑制を解除するため、増殖培地中の無機燐酸塩含
量は低濃度でなければならない。
５．発現されたポリペプチドの分離及び生成 この発明はさらに、酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペ
プチド、例えばヒト−インターフェロン又はＨＢＶ表面
抗原の製造方法に関し、この方法は、（１） 酵母酸性
ホスファターゼプロモーター、及び酵母ポリペプチド又
は非酵母ポリペプチドをコードする領域を含有する雑種
ベクターにより形質転換された酵母を、適当な栄養条件
の下で培養し、そして（２） 前記のポリペプチドを分
離し、そして精製する、段階を含んで成る。この発明の
形質転換された酵母菌株は、資化性炭素源及び窒素源並
びに無機塩を含有する液体培地中で培養する。種々の炭
素源を使用することができる。好ましい炭素源の例とし
て、資化性炭水化物、例えばグルコース、マルトース、
マンニトールもしくはラクトース、酢酸塩を挙げること
ができ、これらは単独で又は適当に混合して使用するこ
とができる。適当な窒素源には、例えばアミノ酸、例え
ばカザミノ酸、ペプチド、並びに蛋白質及びその分解生
成物、例えばトリプトン、ペプトン、又は肉エキストラ
クト、さらには酵母エキストラクト、マルトエキストラ
クト、コーンスチープリカー、さらにアンモニウム塩、
例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸ア
ンモニウムが含まれ、これらは単独で又は適当に混合し
て使用することができる。使用することができる無機塩
には、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムの
硫酸塩、塩化物、燐酸塩及び炭酸塩が含まれる。さら
に、栄養培地には、増殖促進物質及び／又は雑種プラス
ミドの喪失を防止するための選択圧を供する物質を含有
せしめることもできる。増殖促進物質には、例えば、微
量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン及びこれらに類する
もの、又は個々のアミノ酸が含まれる。雑種プラスミド
が抗生物質耐性を供する遺伝子を含有する場合、このよ
うな雑種プラスミドを含有する細胞は抗生物質を補給さ
れた培地中で生存し、他方この雑種プラスミドを喪失し
た細胞、及び抗生物質感受性の汚染微生物は生存しない
であろう。雑種プラスミドが栄養要求性酵母変異株に原
栄養性を与える遺伝子例えば、ＬＥＵ２遺伝子又はＨＩ
Ｓ３遺伝子を含有する場合には、栄養培地から遺伝子生
成物、例えばロイシン又はヒスチジンを除去することに
より選択圧を生じさせることができる。培養される酵母
菌株が抑制される酸性ホスファターゼプロモーターＰＨ
Ｏ５を含有する雑種プラスミドにより形質転換されてい
る場合、最高レベルのｍＲＮＡ転写を確保し、従ってポ
リペプチドの最高収量を確保するために、前培養期間の
後、栄養培地中の無機燐酸塩含量を低下せしめなければ
ならない。培養は常法を用いて行う。培養条件例えば温
度、培地のｐＨ及び発酵時間は、ポリペプチドが最高レ
ベルで生産されるように選択する。選択された酵母菌株
は、約２５℃〜３５℃の温度、好ましくは約３０℃、ｐ
Ｈ４〜８、例えば約ｐＨ７において、そして約４〜２０
時間、好ましくはポリペプチドの収量が最高に達するま
で、振とう又は攪拌を行いながら、液体培地中好気的条
件下で増殖せしめるのが好ましい。形質転換された酵母
細胞が十分な細胞濃度にまで増殖した後、発現されたポ
リペプチドを回収する第一段階として細胞内からポリペ
プチドを遊離せしめる。ほとんどの方法において、ま
ず、グルコジダーゼを用いて酵素的分解により細胞壁を
除去する（３章を参照のこと）。次に、得られたスフェ
ロプラストを洗剤、例えばトリトンに（Ｔｒｉｔｏｎ）
により処理する。この方法に代えて、細胞を破壊するた
めに機械的な力、例えば剪断力（例えばＸ−プレス、又
はフレンチプレス）、又はガラスビーズとの振とうを用
いることができる。得られたポリペプチド混合物中の目
的ポリペプチドを濃縮するために常用手段、例えば硫酸
アンモニウム又はトリクロロ酢酸による沈澱、ゲル電気
泳動、透析、クロマトグラフィー、例えばイオン交換ク
ロマトグラフィー、サイズ−エクスクルーションクロマ
トグラフィー、ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣ、及びこれら
に類するものを用いることができる。予備精製された生
成物の最終精製を、例えば抗原アフィニティークロマト
グラフィーにより行うことができる。原則として、精製
段階（細胞の分解段階を除く）は、ヒト−白血球インタ
ーフェロンの精製のためにスターリン（Ｓｔａｅｈｅｌ
ｉｎ）等（２２）により開発された方法に従って実施す
ることができる。例えば、目的とするポリペプチドの分
離及び精製は次の段階を用いて行うことができる。すな
わち、（１）グルコシダーゼを用いて酵母細胞を分解
し、（２）洗剤で処理し、（３）ポリエチレンイミンで
処理することにより非蛋白質性物質の大部分を除去し、
（４）溶液を硫酸アンモニウムで飽和することによりポ
リペプチドを沈澱せしめ、（５）適当な緩衝混合物中で
透析し、（６）ＤＥＡＥ−セルロースを用いてカラムク
ロマトグラフ処理し、（７）モノクローン抗体カラムを
用いてアフィニティークロマトグラフ処理し、そして
（８）適当なセファデックス▲Ｒ▼カラムを用いて分子
サイズを整える。十分に純粋な生成物を得るために、必
要により、追加の精製段階、例えば陽イオン又は陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸
着、逆相ＨＰＬＣ等を行うことができる。他方、可能で
あれば、上記の段階の１つ又は複数を省略することがで
き、又は段階の順序を変えることができる。目的ポリペ
プチドが酵母によりペリプラスム間隙に分泌される場合
には、単純化された方法を用いることができる。すなわ
ち、細胞を溶解することなく、細胞壁の酵素的除去によ
り、又は細胞壁を破壊してポリペプチドの遊離を可能に
する薬剤、例えばチオール試薬又はＥＤＴＡによる処理
によりポリペプチドを回収することができる。ポリペプ
チドが培養液中に分泌される場合には、培養液から直接
ポリペプチドを回収することができる。この発明により
得られるポリペプチドは有用であり、そしてヒト又は動
物の疾患の治療又は予防のために（例えば、インターフ
ェロン、ＨＢＶ表面抗原等）使用することができ、又は
食料、飼料、飼料添加物として、あるいは酵素反応にお
いて使用することができる（上記２を参照のこと）。こ
れらのポリペプチドの天然に存在する誘導体、例えば蛋
白質分解により切断されたポリペプチド及び／又はグリ
コシル化ポリペプチドも又この発明に含まれると理解す
べきである。この発明はさらに、ポリペプチド及びこの
発明の方法により生産される限りにおいて天然に存在す
る前記ポリペプチドの誘導体に関する。この発明はさら
に、この発明の方法に従って生産される新規なポリペプ
チドに関する。この発明は特に、ＤＮＡ断片、雑種ベク
ター、形質転換された酵母、ポリペプチド、及び例に記
載されたこれらの調製方法に関する。次に例によりこの
発明をさらに詳細に説明する。但しこれによりこの発明
の範囲を限定するものではない。実験の部 例において次の略号を使用する。
Ｅｔ Ｂｒ エチジウムブロミド ＢＳＡ 牛血清アルブミン ＤＴＴ １，４−ジチオスレイトール（１，４−ジ
メルカプト−２，３−ブタンジオール ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＴＮＥ １００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ・
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、 及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液 Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ＨＣｌによりｐＨを調整したトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン ＰＭＳＦ フェニルメタンスルホニルフルオリド ＴＥ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液例１ 酵母遺伝子試料集団の形成 野性型サッカロミセス セレビシエー菌株 Ｓ２８８Ｃからの全高分子酵母ＤＮＡ（２３）３０μｇ
を、供給者の推奨に従って２５０μｌのＥｃｏＲＩメチ
レーション緩衝液中で、３７℃にて３０分間、２Ｕ（ユ
ニット）のＥｃｏＲＩメチラーゼ（ニューイングラン
ド、バイオラブス）と共にインキュベートする。ＤＮＡ
をエタノールで沈澱せしめ、５００μｌの２５ｍＭＴｒ
ｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｅｃ
ｏＲＩ＊緩衝液）（２４）中に再懸濁し、そしてＥｃｏ
ＲＩ（ベーリンガー）を用いてＤＮＡ断片の大きさの分
布が３０〜５０ｋｂの範囲に最高値を有するまで分解す
る（λＤＮＡのＸｈｏＩ分解により約３３ｋｂ及び１７
ｋｂのマーカーが得られる）。ＥｃｏＲＩ＊条件下で分
解された酵母ＤＮＡを、ＳＷ４０ローター中、３８，０
００ｒｐｍにて６時間、シュークロース勾配〔１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ
中５〜２０％シュークロース〕上でサイズ分画する。
０．４ｍｌずつの３０個の分画を、勾配の頂部から集め
る。分画１６は３０〜４０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を
含む。この分画のＤＮＡ（３μｇ）をエタノールで沈澱
せしめ、そして１５℃にて１６時間、全容１５μｌにて
１μｇのコスミドベクターｐＹｃｌ（２５）に連結し、
ＥｃｏＲＩにより線状にする。連結は供給者により記載
された緩衝液系を用いて３００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ニューイングランド、バイオラブス）により行う。Ｄ
ＮＡを、試験管内でバクテリオファージλに詰め込み、
そして集めたファージ の形質導入に使用する。形質導入効率は、ｐＹｃｌベク
ターμｇ当り約５０００個のアンピシリン耐性コロニー
である。ａｍｐＲコロニー３０００個を取り上げ、そし
てミクロタイター皿のウエルに収容した、１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地〔１０ｇのバク
ト−トリプトン（ディフコ）、５ｇのバクトイーストエ
キストラクト（ディフコ）、１０ｇのＮａＣｌ〕中で増
殖せしめる。
例２．抑制される酸性ホスファターゼ遺伝子 ＰＨＯ５の分離 遺伝子試料集団のレプリカを、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ培地に１５
ｇ／ｌの寒天を加えたもの）上で増殖せしめる。５００
コロニーの細胞材料をプレートから洗い取り、そして貯
蔵する。次の方法により、各貯蔵試料からＤＮＡを分離
する。細胞を遠心分離（ソルバル、ＧＳＡローター、
６，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間）し、１００ｍｌ
のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、そして前記の条件下で
再度遠心分離する。細胞塊を３ｍｌのＴｓｕｃ〔５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５（Ｗ／Ｖ）％
シュークロース〕に再懸濁し、そしてＳＳ−３４ポリプ
ロピレン製ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）チューブに移
す。これ以後の段階はすべて氷上で行う。０．３ｍｌの
リゾチウム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ウォーシントン製、
１１，０００Ｕ／ｍｇ）を加え、５分間後に１．２ｍｌ
のＥＤＴＡ（５００ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、さらに
５分間後に４．８ｍｌの洗剤〔０．１％のトリトンＸ−
１００（メルク）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕を加える。５分間後、分
解物を、プレコートしたＳＳ−３４ローター中で、４℃
にて４０分間遠心分離する。上澄液に注意深く団体のＣ
ｓＣｌを加える（８．７ｍｌの上澄液に８．３ｇのＣｓ
Ｃｌ）。エッチジウムブロミド（シグマ）を加えた後
（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ上澄液）、溶液を１３．５ｍｌ
のクィックシールポリアロマーチューブ（ベックマン）
に移し、そしてベックマンＴｉ５０ローター中で４０，
０００ｒｐｍにて４０時間遠心分離する。長波長ＵＶ
（３６６ｎｍ）により蛍光帯が観察される。下方の帯に
スーパーコイルプラスミドＤＮＡが含まれており、これ
を、チューブの側面から２ｍｌのシリンジ（１８Ｇ針）
で穴をあけることにより取り出す。同容量のイソプロパ
ノール（ＣｓＣｌで飽和）で５回抽出することによりエ
チジウムブロミドを除去し、生成物を３０ｍｌのコーレ
ックスチューブに移す。２．５容量のＴＥを加え、そし
てエタノールによりＤＮＡを沈澱せしめる。次に、溶液
を１２〜１５時間−２０℃に保持する。沈澱したＤＮＡ
を、ソルベルＨＢ−４ローター中で、０℃にて３０分
間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離することにより集
め、そして２００μｌのＴＥに溶解する。１００ｍｌの
培養液から５０〜１００μｇの雑種プラスミドＤＮＡを
回収する。これらの貯蔵試料からのプラスミドＤＮＡを
用いて、ヒンネン等により記載された方法（１）に従っ
てＳ セレビシエーＡＨ２１６（ａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ
３，ｐｈｏ３，ｐｈｏ５）を形質転換する。酵母形質転
換体を低燐酸塩最少培地〔２０ｇ／ｌのグルコースを補
給した「アミノ酸を含まないディフコ酵母最少培地」、
ディフコの処方（ディフコマニュアル、ディフコボラト
リーズ、デトロイト、米国）に従って調製する。但し、
１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４の代りに０．０３ｇ／ｌＫＨ２
ＰＯ４及び１ｇ／ｌＫＣｌを使用する。〕上にレプリカ
し、そしてこの上に染色寒天〔１００ｍＭ酢酸緩衝液、
ｐＨ４．０，２ｍｇ／ｍｌのファストブルーβ塩（セル
バ）及び０．２ｍｇ／ｍｌのα−ナフトールホスフェー
ト（セルバ）〕を重層することにより酸性ホスファター
ゼ活性を見るための染色を行う。機能的ＰＨＯ５を有す
るコロニーは、低燐酸塩培地上で遺伝子の抑制が解除さ
れ赤く染まる。遺伝子試料集団３のサブプーリング（１
７）を反復することにより抑制される酸性ホスファター
ゼ活性を有する独立コロニーを得る。これらのクローン
の１つ（ｐＧ７）をさらに分析する。雑種プラスミドは
４２ｋｈの大きさを有する。ｐＧ７のＥｃｏＲＩ及びＢ
ａｍＨＩ断片を、それぞれｐＢＲ３２２／ＨＩＳ３（１
６）及びｐＪＤＢ２０７（２８）中にサブクローニング
する。供給者（ニューイングランド、バイオラブス）が
推奨する方法により制限分解を行い、２０μｌ中１５０
ＵＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド、バイオラ
ブス）及び２０μｇ／ｍｌのそれぞれの分解プラスミド
（ニューイングランド、バイオラブスにより示唆された
条件）を用いて連結する。８ｋｂＥｃｏＲＩ断片の一部
である５．１ｋｂＢａｍＨＩ断片を、酵母ベクターｐＪ
ＤＢ２０７中にサブクローニングし、そして酵母ＡＨ２
１６株の形質転換に際して、この雑種プラスミド（ｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨＯ５，ＰＨＯ３、第１図参照のこと）
は、抑制が解除された（燐酸塩濃度が低い）条件下で高
いホスファターゼ活性（ＰＨＯ５遺伝子）を供し、そし
て通常の酵母最少培地で（ＰＨＯ３遺伝子の発現によ
り）低いレベルの活性を供する。
及びＤＮＡ配列解析 ＢａｍＨＩ断片中のＰＨＯ３及びＰＨＯ５の位置を決定
するためには、Ｓａｕ３Ａ制限部位及びＩｓｔＩ部位の
パターンを用いるのが有利である。制限エンドヌクレア
ーゼＳａｕ ３Ａ（ニューイングランド、バイオラブ
ス）によるＢａｕ ＨＩ断片の分解により６個の断片
（Ａ〜Ｆ、第２図）が生ずる。Ｓａｕ３Ａ部分分解物
を、自律複製酵母ベクターｐＪＤＢ２０７のＢａｍＨＩ
部位にサブクローニングすることによりＳａｕ ３Ａ断
片の異る組合わせを有するプラスミドが生成する。次
に、これらのプラスミドを、酵母Ｓ．セレビシエーＡＨ
２１６Ｐｈｏ３，Ｐｈｏ５変異株を形質転換するのに用
いる。形質転換体を低燐酸塩培地プレート又は正常最少
培地プレート上で増殖せしめた後、酸性ホスファターゼ
活性について検定する。少なくともＳａｕ ３Ａ断片Ａ
及びＢ（第２図、Ｎｏ．１〜４）を含有するクローンは
完全な５．１ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ断片と同じレベルで酸
性ホスファターゼを発現する（例２に記載した酸性ホス
ファターゼ染色寒天を重層した後定性的測定を行う）。
発現は培地中の無機燐酸塩の濃度により正常に制御され
る。Ｓａｕ ３Ａ断片Ａのみを有するクローン（第２図
Ｎｏ．５及び６）は低いレベルの酸性ホスファターゼを
発現し、これは培地中の無機燐酸イオン濃度に影響され
ない。このことは、Ｓａｕ ３Ａ断片Ａに担持されてい
る情報が構成的酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３）の発現
のために十分であることを示している。Ｓａｕ ３Ａ断
片Ｂ（第２図、Ｎｏ．７）のみでは、抑制条件又は抑制
解除条件のいずれにおいても酸性ホスファターゼを発現
しない。しかしながら、Ｂａｍ ＨＩ部位とＰｓｔ Ｉ
部位の間の完全配列を有するサブクローンは、酸性ホス
ファターゼの抑制的合成を行うが構成的合成は行わな
い。従ってこのサブクローンは酵母ＰＨＯ５遺伝子（１
６）を含有していなければならない。ＰＨＯ５遺伝子の
正確な位置は、マクソン（Ｍａｘｏｎ）及びジルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１５）の方法を用いてＤＮＡ配列
を決定することにより決定される。前記の分解条件及び
連結条件を用いて（すべての酵素はニューイングラン
ド、パイオラブス製）、３７５位から６５０位（ｐＢＲ
３２２における番号）にわたるＢａｍＨＩ−Ｓａｌ Ｉ
断片に代えて６２３ｂｐのＢａｍ ＨＩ一ＳａｌＩ制限
断片をプラスミドｐＢＲ３２２中にクローニングする
（第１図参照のこと）。ＢａｍＨＩ−Ｓａｌ ＩＤＮＡ
挿入部は、その５’末端において次の部位で非対称的に
ラべルされる。すなわちＢａｍ ＨＩ（−５４１）、Ｓ
ａｕ３Ａ（−２００）及びＳａｌ Ｉ（＋８２）（ナン
バリングについては第３ａ図を参照のこと）である。６
２３ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｓａｌ ＩＤＮＡ挿入部のヌク
レオチド配列を第３ａ図に示す。挿入部がＰＨＯ５プロ
モーター領域及びＰＨＯ５ホスファターゼ蛋白質コード
領域の一部を含有することが明らかである。
ＰＨＯ３遺伝子の正確な位置は、ニューイングランド、
バイオラブスにより発表された方法「Ｍ１３ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｙｓｔ
ｅｍ」によるＤＮＡ配列解析により決定される。４１６
ｂｐの（５′）ＰｓｔＩ−ＲｓａＩ（３′）断片を、ユ
ニークＰｓｔＩ及びＳｍａＩ制限部位を用いてベクター
Ｍ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９（４９）にサブクローニ
ングする。４１６ｂｐのＰｓｔＩ−ＲｓａＩＤＮＡ挿入
部のヌクレオチド配列を第３ｂ図に示す。この挿入部は
ＰＨＯ３プロモーター領域及びＰＨＯ３酸性ホスファタ
ーゼ蛋白コード配列の一部を含有することが明らかであ
る。例４ プラスミドｐ３０の形成（第４図参照のこと） （ａ）プラスミドｐＢＲ３２２中のＢａｌ Ｉ制限部位
の除去 第４図に概略を示す方式においては、プラスミドｐＢＲ
３２２中のユニークＢａｌ Ｉ制限部位を除去する必
要がある。３μｇのｐＢＲ ３２２を、供給者の推奨に
従って、制限エンドヌクレアーゼＢａｌＩ（ＢＲＬ）及
びＰｖｕＩＩ（バイオラブス）により完全に分解する。
ｐＢＲ３２２をＢａｌ Ｉ／ＰｖｕＩＩ二重分解するこ
とにより大きさが３７３８ｂｐ及び６２２ｂｐの２つの
制限断片が生ずる。２つの断片を、ＴＢＥ緩衝液（９０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．３、２．５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、９０ｍＭ硼酸）中、１％低融点アガロースゲル
（シグマ）上で分離する。ＤＮＡバンドをエチジウムブ
ロミドで染色し、そして３６６ｎｍの長波長ＵＶ光の下
で観察する。３７３８ｂｐ断片を含有するアガロース片
をゲルから切り取り、６５℃にて液化し、５００ｍＭ
ＮａＣｌに調整し、そして６５℃にて２０分間インキュ
ベートする。１容量のフェノール（１０ｍＭＴｒｉｓ・
ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ
ＮａＣｌで平衡化したもの）を加える。水相をフェノー
ルで２回、そしてクロロホルムで１回再抽出する。ＤＮ
Ａを２．５容量の冷無水エタノールで再沈澱せしめ、そ
して遠心分離により集める。ＤＮＡ塊を８０％冷エタノ
ールで洗浄し、そして次に真空乾燥する。ＤＮＡをＴＥ
中に、０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁する。分離さ
れた３７３８ｂｐＤＮＡ断片は、Ｂａｌ Ｉ及びＰｖｕ
ＩＩによる二重分解により生じた２つの平滑末端を有す
る。ＤＮＡを平滑末端連結により還化する。０．６μｇ
のＤＮＡを、３０μｌの６０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、
ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ、４ｍＭＡＴＰ及び９００ＵのＴ４ ＤＮＡ リガー
ゼ（バイオラブス）を含有する溶液中で、室温にて一夜
インキュベートする。連結反応混合物のアリコート５μ
ｌを、カルシウム処理した、マンデル（Ｍａｎｄｅｌ）
等の方法（２９）により調製した形質転換能を有する
Ｅ．コリＨＢ １０１細胞５０μｌに加える。混合物を
５分間氷上に保持し、次に３７℃にて２分間インキュベ
ートし、そして室温に１０分間置き、１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートに接種す
る。６個のａｍｐＲコロニーを取り上げ、それぞれ別々
に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ
（前記の培地から寒天を除去したもの）中で増殖せしめ
る。例２に記載した方法を用いて細胞からプラスミドＤ
ＮＡを調製する。Ｈａｅ ＩＩＩ（バイオラブス製、供
給者が示唆する分解条件を使用）、Ｐｖｕ ＩＩ及びＢ
ａｌ Ｉによるプラスミドの制限分解物を、ＴＢＥ緩衝
液中１．５％アガロースゲル上で分析する。新しく形成
された連結断片の制限パターン及び予想される大きさか
ら、プラスミドは同じであり、そしてＢａｌ Ｉ−Ｐｖ
ｕ ＩＩ断片以外のすべてのｐＢＲ３２２配列を含有す
ることが示される。これらのプラスミドはＢａｌＩ制限
部位を喪失しており、そしてｐＢＲ３２２ΔＢａｌ Ｉ
と称する。
ＨＩ制限断片のｐＢＲ３２２ΔＢａｌＩへのクローニン
グ ｐＪＤＢ ２０７／ＰＨＯ５，ＰＨＯ３（第１図参照）
は抑制される酵母酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）及び
構成的酵母酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３）の遺伝子を
含む酵母５．１ＢａｍＨＩ挿入部を含有する。ｐＪＤＢ
２０７／ＰＨＯ５，ＰＨＯ３、及びプラスミドｐＢＲ３
２２ΔＢａｌＩを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
で分解する。完全に分解した後酵素を６５℃にて２分間
不活性化する。両ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そ
して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０にそれぞ
れ０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁する。ＢａｍＨＩで分
解したＤＮＡ（２種類）のそれぞれ０．５μｇずつを混
合し、そして３００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する
２０μｌの連結緩衝液中で、１５℃にて２０時間連結す
る。連結混合物の５μｌのアリコートを５０μｌのカル
シウム処理したＥ．コリＨＢ１０１細胞に加え、そして
例４ａに記載したのと同様にして形質転換を行う。形質
転換されたＥ．コリ細胞を、そのアンピシリン耐性及び
テトラサイクリン耐性について試験する。８個のａｍｐ
Ｒ，ｔｅｔＳコロニーを分離し、そして１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍｌ中で増
殖せしめる。細胞からプラスミドＤＮＡを分離する（例
２を参照）。ＢａｍＨＩによる制限分解物は、４プラス
ミドが３．７ｋｂベタター断片（ｐＢＲ３２２ΔＢａｌ
Ｉ）のほかに５．１ｋｂ挿入部を含有することを示す。
ＳａｌＩ（ニューイングランド、バイオラブス）を用い
る制限分解物により挿入された５．１ｋｂ断片の方向を
決定する。すなわち、２つのプラスミドは第４図に示す
ような方向の挿入部を有する。これらの１つをｐ３０と
称する。５．１ｋｂ挿入部中のＰＨＯ５，ＰＨＯ３遺伝
子の転写の方向は第４図に示すごとく反時計方向であ
る。例５ 外来性ＤＮＡのｐ３０への挿入（第４図参照） （ａ）ｐ３０の３．９ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｂａｌ Ｉ断
片（断片Ａ）の分離 １０μｇのｐ３０ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｌＩにより分解する。フェノール／クロロホルムにより
抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮ
Ａを１００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁する。調製用０．
８％低融点アガロースゲル（シグマ）上で制限断片を分
離する。ｐ３０のベクター部分を含有する５．１ｋｂ断
片を、例４ａに記載した方法によりゲルから溶出する。
低塩緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ・
ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中ＤＥ５２
（ワットマン）イオン交換カラムにＤＮＡを吸着せし
め、そして高塩緩衝液（１．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴ
ｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）によ
りこれを溶出することによりＤＮＡを精製する。ＤＮＡ
をエタノールで沈澱せしめ、そしてさらにＥｃｏＲＩ
（ベーリンガー）により分解する。３．９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｌＩ制限断片を、調製用０．８％低融点アガ
ロースゲル上で分離し、例４ａに記載したようにして回
収し、そしてエタノールで沈澱せしめる。このＤＮＡ断
片を断片Ａと称する。
（ｂ）ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８′１の
６０２ｂｐＨａｅＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（断片Ｂ）の
分離 Ｅ．コリ ＨＢ−１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩ
ＦＮ−８′１株（例１０Ｅ参照）を、１０μｇ／ｍｌの
テトラサイクリンを補給したＬＢ培地１００ｍｌ中で増
殖せしめ、そして例２に記載したのと同様にしてプラス
ミドＤＮＡを分離する。９μｇのＨＬｙｃＩＦＮ−８′
１ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨａｅＩＩＩにより
完全に分解する。制限断片を調製用０．８％低融点アガ
ロースゲル上で分離する。９４０ｂｐＨａｅＩＩＩ断片
部分を切り取り、そして例４ａに記載した方法によりア
ガロースゲルから溶出する。ＤＮＡを、例５ａに記載し
たようにしてＤＥ５２により精製し、そしてさらにＥｃ
ｏＲＩにより分解する。６０２ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｈａｅ
ＩＩＩ断片を調製用０．８％低融点アガロースゲル上で
分離し、例４ａの場合と同様にして回収し、そしてエタ
ノールで沈澱せしめる。このＤＮＡ断片を断片Ｂと称す
る。
（ｃ）断片Ａ及びＢの連結（第５図参照） ２つの制限断片を、ＥｃｏＲＩの接着末端、並びにＢａ
ｌＩ及びＨａｅＩＩＩの平滑末端のそれぞれを介して酵
素的に連結する。こうしてユニークＥｃｏＲＩ部位、及
びＨａｅＩＩＩで切断され（但しＢａｌＩにより切断さ
れない）ＢａｌＩ−ＨａｅＩＩＩ結合を有する環分子が
形成される。連結は、６０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、４ｍ
Ｍ ＡＴＰ，３００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する
緩衝液系で、全容量１０μｌ中断片ＡのＤＮＡ濃度を２
０μｇ／ｍｌ、断片Ｂのそれを３μｇ／ｍｌとして、２
３℃にて１６時間にわたって行う。
転換 連結混合液（例５ｃ参照）のアリコート２μｌを、５０
μｌのカルシウム処理したＥ．コリＨＢ１０１細胞（例
４ａ）に加える。次に、この混合物を、１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを補給したＬＢ寒天プレートに接種す
る。プレートを３７℃にて１６時間インキュベートす
る。Ｅ．コリＨＢ１０１のアンピシリン耐性コロニー約
３００個を得る。８個のアンピシリン耐性コロニーから
プラスミドＤＮＡを分離し、分析し、そしてＥｃｏＲＩ
及びＨａｅＩＩＩにより切断した後に得られた制限断片
の移動性を標準ＤＮＡ〔Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（ニューイン
グランド、バイオラブス）により分解したバクテリアフ
ァージλＤＮＡ、ＨａｅＩＩＩ及びＥｃｏＲＩにより分
解したｐ３０プラスミドＤＮＡ〕のそれと比較すること
によりその構造を決定する。連結の構造を確認した後、
正しい構造を有する５つのプラスミドを得る。８′１−
インターフェロンポリペプチドをコードする領域（第５
図参照）に連結されるＰＨＯ５を含有するこれらのプラ
スミドの１つをｐ３０ＩＦＮ１（８′１）と称する。例６ 酵母用複製開始点及び選択マーカーの添加 （第４図参照） （ａ）プラスミドＹｒｐ７からの１．５ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ断片の分離、及びこの断片のプラスミドｐ３０ＩＦＮ
１（８′１）への連結 連結反応を促進するため１．５ｋｂＥｃｏＲＩ制限断片
を精製する。プラスミドＹｒｐ７（４）をＥｃｏＲＩで
切断し、得られた２つの断片を０．８％アガロースゲル
上で分離し、そして酵母自律複製部分及び酵母ＴＲＰ１
遺伝子を含有する１．５ｋｂ断片を精製し、そして例４
ａに記載したようにして分離する。連結は、（ニューイ
ングランド、バイオラブスにより示唆された方法に従っ
て）２０μｇ／ｍｌのＥｃｏＲＩ切断ｐ３０ＩＦＮ
（８′１）及び１０μｇ／ｍｌのＹｒｐ７からのＥｃｏ
ＲＩ制限断片を用いて行う。この場合１００ＵのＴ４リ
ガーゼを使用する。
転換 ＴＲＰ１酵母遺伝子を含有するプラスミドは、Ｅ．コリ
ｔｒｐＣ変異株ＪＡ１９４（ｔｒｐＣ ，ｌｅｕＢ，Ｂ
１）の形質転換により直接選択することができる。Ｅ．
コリｔｒｐＣ遺伝子は、Ｅ．コリＮ−（５′−ホスホリ
ボシル）−アンスラニレートイソメラーゼをコードす
る。Ｅ．コリｔｒｐＣ変異株を酵母ＴＲＰ１遺伝子
（４）により補促することができる。Ｅ．コリＪＡ１９
４株の形質転換はＥ．コリＨＢ１０１（例４ａを参照の
こと）について記載したのと同様にして行う。但し、次
のように変更する。混合物を寒天プレートに接種する前
に１ｍｌのＬＢ培地中に３７℃にて６０分間おき、細胞
をＥ．コリＭ９最少培地（３０）により１回洗浄し、そ
してビタミンＢ１（１μｇ／ｍｌ）及びＬ−ロイシン
（２０ｍｇ／ｍｌ）を補給したＭ９最少培地プレート上
に接種する。プレートを３７℃に２日間インキュベート
する。約１０００個のトリプトファン原栄養性Ｅ．コリ
コロニーを回収する。
（ｃ）雑種プラスミドの分離及び特徴付け Ｔｒｐ＋コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を補給したＬＢプレート上で純化する。個々のコロニー
を拾い上げ、例２に記載した方法によりプラスミドを分
離する。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ及びＢ
ｇｌＩ（バイオラブス）により切断した制限断片の大き
さを測定することにより精製したプラスミドを分析す
る。２つの存在し得る方向の１．５ｋｂＥｃｏＲＩ制限
断片を含有する２つの異るタイプのプラスミドを得る。
これらを、第４図に示すように、ｐ３０ＩＦＮ２（８′
１）及びｐ３０ＩＦＮ２′（８′１）と称する。
転換及びインターフェロン生産の誘導 ヒンネン等（１）が記載したのと同様の方法で、プラス
ミドｐ３０ＩＦＮ２（８′１）及びｐ３０ＩＦＮ２′
（８′１）のそれぞれをサッカロミセス・セレビシエー
ＲＨ９７１株（ａ，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４）に
導入する。１μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのス
フェロプラスト懸濁液に加え、そして（１）に記載され
ているのと同様にして混合物をポリエチレングリコール
で処理する。スフェロプラストを１０ｍｌの再生寒天と
混合し、そしてロイシンを含まない酵母最少培地プレー
ト上に接種する。３０℃にて３日間インキュベートした
後、約１０００の形質転換細胞が得られる。 酵母形質
転換プレートからの１つの単一コロニー〔それぞれサッ
カロミセス・セレビシエーＲＨ９７１／ｐ３０ＩＦＮ２
（８′１）、及び／ｐ３０ＩＦＮ２′（８′１）と称す
る〕を、１００ｍｌのエルレンマイアーフラスコに収容
した１０ｍｌの酵母最少培地に拾い上げ、そして３０
℃、２００ｒｐｍにて２４時間、濃度が約２〜３×１０
７細胞／ｍｌになるまで増殖せしめる。細胞を２０ｍｌ
の低燐酸塩最少培地により１回洗浄する。３ｍｌの再懸
濁細胞を、１０００ｍｌのエルレンマイアーフラスコに
収容した３００ｍｌの低燐酸塩最少培地及び３００ｍｌ
の通常最少培地に接種する。３０℃、１６０ｒｐｍにて
培養する。ＰＨＯ５プロモーターの誘導の後、トー（Ｔ
ｏｈｅ）等（３１）に記載された方法により全細胞中の
酸性ホスファターゼ活性を測定する。細胞は約１〜２×
１０７細胞／ｍｌに増殖する（培養２６〜３０時間）。例８ 酵母細胞抽出物の調製及びインターフェロン力価
の測定 濃度１〜２×１０７／ｍｌの培養液３００ｍｌ（例７参
照）をソルバルＧＳＡローターで、４℃にて、８，００
０ｒｐｍの回転速度で５分間遠心分離することにより集
菌する。細胞を１００ｍｌの水で１回洗浄し、６ｍｌの
氷冷した分解混液〔０．１Ｍ燐酸カルシウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．４、１（ｖ／ｖ）％トリトンＸ−１００、０．０
００１Ｍ ＰＭＳＦ（メルク）〕に再懸濁し、そして３
０ｍｌのコーレックスチューブに移す。懸濁液を、ソル
バルＳＳ−３４ローター中、４℃、８，０００ｒｐｍに
て５分間再度遠心分離し、そして０℃にて３ｍｌの分解
混液に再懸濁する。４ｇのガラスビーズ（直径０．４ｍ
ｍ）を細胞に加え、そして懸濁液を、ボルテックスミキ
サー（Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ）（サイエンティフィ
ックインストルメンツ社、米国）により、最高速度で３
０秒間振とうし、そして氷浴中で１分間冷却する。この
振とう操作を、９０％より多くの細胞が破壊されるまで
（光学顕微鏡で調べる）５〜１０回反復する。ソルバル
ＨＢ−４ローター中、４℃、８，０００ｒｐｍにて１０
分間遠心分離することにより細胞断片及びガラスビーズ
を除去する。上澄液をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ）チューブに移し、液体窒素で凍結し、そして−６
０℃で貯蔵する。ヒトＣＣＬ−２３細胞、及び攻撃ウイ
ルスとしての小水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用い
るアームストロング（Ａｒｍｓｔｏｒｏｎｇ）の方法に
従ってインターフェロンの活性を測定する。結果を第１
表に要約する。
例９ 高複製数（ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）
酵母２μベクターｐＪＯＢ ２０７へのインターフェロ
ン遺伝子の挿入（第６図参照） 供給者（バイオラブス）の説明に従って制限エンドヌク
レアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを使用してプラ
スミドｐ３０ＩＦＮ２′（８′１）を分解する。４．０
ｋｂ及び２．０ｋｂの大きさの２種類の断片が生ずる。
２．０ｋｂ制限断片を分離し、そして段階４ａに記載し
たのと同様にして、低融点アガロースゲルを用いる電気
泳動法により精製する。プラスミドｐＪＤＢ２０７（２
８）を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａ
ｍＨＩを用いて分解する。３種類の断片が生ずる。６．
５ｋｂの制限断片を上記のようにして分離する。０．３
μｇの２．０ｋｂ断片（インターフェロン蛋白質をコー
ドする領域に連結されたＰＨＯ ５プロモーターを含有
する）を、全容２０μｌ中、３００ＵＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて供給者（バイオラブス）により記載された条
件下で１５時間にわたり６．５ｋｂ ベクター断片と連
結する。Ｅ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換し、そして
アンピシリン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮ
Ａを分離し、そして分離されたプラスミドＤＮＡをＨｉ
ｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて分解し、そして同じ
酵素で分解したｐ３０ＩＦＮ２′（８′１）及びｐＪＤ
Ｂ ２０７を分子量標準として用いることにより、分離
されたプラスミドＤＮＡの正しい構造を確認する。この
新しく得られたプラスミドをｐＪＤＢ ２０７／ＩＦＮ
２′（８′１）と称する。プラスミドｐＪＤＢ ２０７
／ＩＦＮ２′（８′１）を、（１）に記載されている方
法と同様にしてＳ・セレビシエーＲＨ ９７１株に形質
転換し、ロイシン原栄養性コロニーを選択する。１つの
単一ロイシン原栄養性酵母コロニー〔サッカロミセス・
セレビシエーＲＨ ９７１／ｐＪＤＢ ２０７／ＩＦＮ
２′（８′１）と称する〕を拾い上げ、そして例７に記
載した方法により増殖せしめる。結果を第１表に示す。
例１０ ヒト−リンパ芽球インターフェロンをコードす
る領域を含有する組換プラスミドにより形質転換された
Ｅ．コリ株の調製（第７図） Ａ．ＨｕＩＦＮ ｍＲＮＡが濃縮されたポリ（Ａ）ＲＮ
Ａの分離 （ａ） ナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞の誘導 ナマルワ細胞を、牛胎児血清１０％を含有する培地ＲＰ
ＭＩ １６４０ 中に３７℃で増殖せしめる。細胞濃度
が３×１０６細胞／ｍｌに達したとき、懸濁液を、室温
にて、８００×ｇにおいて１０分間遠心分離する。集め
た細胞を、グルタミン（０．０２７容量％）、ペニシリ
ン２００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）を含有する培地２００ｍｌに再懸濁する。細胞
を、１９０ＨＡＵ／１０６細胞（ＨＡＵ：ヘマグルチネ
ーション単位）の比率のニューカッスル病ウイルス（Ｎ
ＤＶ １１０）と共に、３７℃にて９０分間インキユベ
ートする。新しい培地を加えることにより細胞濃度を
１．３×１０６細胞／ｍｌに調整し、そして細胞懸濁液
を３４℃にて１００ｒｐｍで振とうする。１２時間後、
６×１０９の細胞を得、そして５００ｍｌの燐酸緩衝化
塩溶液（「ＰＢＳ」；１ｌ中８０ｇのＮａＣｌ，２ｇの
ＫＣｌ，１４．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４及び２ｇのＫＨ２
ＰＯ４を含有する）に再懸濁する。細胞を集める前に試
料を採取し、そしてインターフェロン活性を、ヒトＣＣ
Ｌ−２３細胞、及び攻撃ウイルスとしての小水疱性口内
炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いるアームストロング（３
２）の方法に従って測定する。
（ｂ） 細胞の破壊及び蛋白質の除去 細胞懸濁液（５０ｍｌのＰＢＳ中６×１０９細胞）を、
室温にて８００ｍｌの分解緩衝液〔０．０５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．
５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２％ＳＤＳ（結晶、研究銘柄、セ
ルバ）を含んで成る〕に加える。この分解物を、０．２
ｍｇ／ｍｌのプレインキュベート（３７℃にて２時間）
したプロテアーゼ（プロテアーゼＰ，タイプＶＩ，シグ
マ）により、室温にて１時間、液を撹拌しながら分解す
る。この溶液をＴＮＥで飽和したフェノール５００ｍｌ
で３回、そしてクロロホルム５００ｍｌで５回抽出する
ことにより蛋白質を除去する。５００ｍｇ（２６０ｎｍ
の吸光により測定）の核酸を得る。
（ｃ） 汚染ＤＮＡ及びＲＮＡの除去 前記の（段階Ａｂ）ようにして得たわずかに粘稠な水溶
液を０．３ＭＮａＣｌ濃度に調整し、そして１ｇのオリ
ゴ（ｄＴ）セルロース（タイプ７，Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルス）を加える。室温にて３０分間撹拌した後、この懸
濁液を、ソルバルＲＣ−３遠心分離機を用い、１ｌソル
バルびん中４０００ｒｐｍにて１０分間、室温にて遠心
分離し、そしてオリゴ（ｄＴ）セルローススラリーを、
０．５％のＳＤＳを含有する２×ＴＮＥ４０ｍｌで２回
洗浄する。次に、２．５ｍｌの水で５回続けて洗浄する
ことにより結合したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出する。光学
濃度の測定により測定する場合７２０μｇのポリ（Ａ）
ＲＮＡが得られる。第１図の吸着から得られた上澄ＲＮ
Ａ溶液につき１ｇのオリゴ（ｄＴ）セルロースを用いて
２度目の吸着を行う。上記のようにして溶出することに
より３２０μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを得る。溶出液を一
緒にし、ＴＮＥに調整し、そして６７％エタノールを用
いて−２０℃にて１０分間ポリ（Ａ）ＲＮＡを沈澱せし
める。ソルベルＲＣ−５Ｂ遠心分離機を用いて０℃にて
１０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離することにより
ＲＮＡを集める。沈澱１ｍｇを１ｍｌの１ｍＭＥＤＴＡ
に再溶解する。次のように、キセノプス・レービス（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞に注射すること
によりＨｕＩＦＮｍＲＮＡ活性に関するＲＮＡを測定す
る。５０ｎｌのＲＮＡ溶液を、２０個の卵母細胞のそれ
ぞれに注射する。グードン（Ｇｕｒｄｏｎ）（３３）、
バース（Ｂａｒｔｈ）（３４）及びコルマン（Ｃｏｌｍ
ａｎ）等（３５）に従って、卵母細胞をバース（Ｂａｒ
ｔｈ）培地（２ｍＭＴｒｉｓ，８８ｍＭ ＮａＣｌ，１
ｍＭ ＫＣｌ，０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２・Ｈ２
Ｏ，０．４１ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，０．８２ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２．４ｍＭ ＮａＨＣ
Ｏ３，０．０１ｍｇ／ｍｌのペリシリン，０．０１ｍｇ
／ｍｌのストレプトマイシン；溶液をＨＣｌによりｐＨ
７．６に調整）中にインキュベートする。注射された卵
母細胞を４２〜４８時間インキュベートし、そしてイン
キュベーション培地を取り出し、エッペンドルフ遠心分
離機で５分間遠心分離し、そして上澄液を−２０℃又は
−８０℃にて、測定に使用するまで貯蔵する。ＩＦＮ活
性を本質上アームストロング（３２）の方法に従って測
定する。但し、Ｈｅｐ−２−細胞（フロウラボラトリー
ズ）上攻撃ウイルスとしてＶＳＶを使用する。卵母細胞
抽出物は、注射したＲＮＡ当り６００ＩＵのインターフ
エロン比活性を有する。
（ｄ） Ｈｕ ＩＦＮ ｍＲＮＡ についてのポリ
（Ａ）ＲＮＡの濃縮 ポリ（Ａ）ＲＮＡを、０．５ｍｌのベッドボリウムのセ
ファデックス−１００のカラム（２００〜４００メッシ
ュ，バイオラド）を通し、カラムを１ｍｌの１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡで洗浄する。溶出液（２ｍｌのＥＤＴＡ中１ｍｇ
〜のポリ（Ａ）ＲＮＡ）を１００℃にて２分間加熱し、
そしてシュークロース濃度勾配〔５０ｍＭＴｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），０．２ＭＮａＣｌ及び１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含有し、シュークロース濃度が５重量／容量％
〜２３重量／容量％に増加するシュークロース溶液１４
ｍｌ〕を通して遠心分離する。遠心操作は、ＴＳＴ ４
１ ローター（コントロンＡＧ）中、５℃にて１６時
間、３５，０００ｒｐｍにおいて行う。ＩＳＣＯ勾配コ
レクターを用いて０．３ｍｌの分画を集める。各分画に
２容量のエタノールを加え、そして−２０℃にて１０時
間放置する。沈澱したｍＲＮＡを遠心分離（ソルバル，
ＨＢ−４ローター、０℃，１０，０００ｒｐｍ，１０分
間）により集める。各分画の沈澱を２５μｌの１ｍＭＥ
ＤＴＡに再溶解し、そして各分画のヒト−ＩＦＮｍＲＮ
Ａ活性を、上記の方法（段階Ａｃ）により、但しＲＮＡ
試料ごとに２０個ではなく１０個の卵母細胞を使用して
測定する。結果を第２表に示す。
分画２３〜２９を一緒にし、そしてポリ（Ａ）ＲＮＡを
次のようにして精製する。ポリ（Ａ）ＲＮＡ溶液を０．
５％ＳＤＳ中２×ＴＮＥに調整し、そして２００μｌの
オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに適用する。カラム
を、０．５％ＳＤＳ中２×ＴＮＥ２ｍｌで洗浄し、そし
て０．５ｍｌの水で５回洗浄することによりポリ（Ａ）
ＲＮＡを溶出する。溶出液をＴＮＥに調整し、そして溶
液を同量のフェノール（ＴＮＥで飽和したもの）で２
回、及び同量のクロロホルムで２回抽出する。ポリ
（Ａ）ＲＮＡを、２倍容量のエタノールを用いて−２０
℃にて１０時間沈澱せしめ、そして前記のようにＨＢ−
４ローターを用いる遠心分離により集める。ポリ（Ａ）
ＲＮＡを１００μｌの０．５ｍＭ ＥＤＴＡに溶解す
る。光学濃度の測定により測定した収量は４０μｇであ
る。ポリ（Ａ）ＲＮＡをヒトＩＦＮ活性に関し、前記の
ようにして、測定当たり２０個の卵母細胞を用いて測定
する。ポリ（Ａ）ＲＮＡ標品は、ＲＮＡμｇ当たり８１
００ＩＵインターフェロンの比活性を有する。
Ｂ． 二重鎖ｃＤＮＡの調製（第７図） エスストラチアジス（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ）等
（３６）により記載された方法と実質上同様にして、Ｈ
ｕＩＦＮ ｍＲＮＡ（段階Ａｄ）について濃縮したポリ
（Ａ）ＲＮＡを鋳型として用いて２重鎖ｃＤＮＡを調製
する。
（ａ） ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），
３０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ
ＤＴＴ〔カルビオチム （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
・）〕、１ｍＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｐ−
Ｌバイオケミカルス）、及び１ｍＭ３２Ｐ−ｄＡＴＰ
（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ），比活性５０，０
００ｃｐｍ／ｎモル〕，２０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄ
Ｔ）１２〜１８（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）、４０μｇ
／ｍｌポリ（Ａ）ＲＮＡ及び１００Ｕのトリ−骨髄芽球
症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ライフサイエンス社，ペ
テルブルグ，フロリダ）を含む反応混合物２５０μｌ
を、３７℃にて８０分間インキュベートする。溶液を１
０ｍＭＥＣＴＡ及び０．１％ＳＤＳ に調整することに
より反応を停止する。混合物を、１容量のフェノールに
より１回抽出する。水相を１容量のクロロホルムで再抽
出し、そして３ｍｌのセフアテックスＧ−５０（ファル
マシア、純品）カラムに適用する。０．１ｍｌの分画を
集める。各分画の放射能を、チェレンコフ（Ｃｅｒｅｎ
ｋｏｖ）放射線の測定により測定する。放射活性分画を
一緒にし、そして２倍容量のエタノールを用いて−２０
℃にて１０時間核酸を沈澱せしめる。試料を、ＨＢ−４
ローターにより２０分間、０℃，１０，０００ｒｐｍで
遠心分離する。沈澱を９５μｌの水に溶解する。５μｌ
の１０ＮＮａＯＨを加え、そして混合物を２５℃にて４
０分間インキュベートする。５Ｍ酢酸により中和した
後、５０μｌの水及び２容量のエタノールを加え、そし
て試料を−２０℃にて１０時間貯蔵する。沈澱を、上記
のようにして遠心分離により集め、２００μｌの０．１
ｍＭ ＥＤＴＡに溶解する。単鎖ｃＤＮＡの収量は３．
７μｇである。ｃＤＮＡの大きさは、７Ｍ尿素を含有す
るＴｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡ（１ｌ中１０ｇのＴｒ
ｉｓ，９．５ｇのＥＤＴＡ ナトリウム、及び５０ｇの
硼酸を含む、ｐＨ８．３）中６％ポリアクリルアミドゲ
ル中での電気泳動における移動度を既知の長さのマーカ
ーＤＮＡ（３９）と比較して測定した場合、７００〜１
５００ヌクレオチドの長さである。
（ｂ） 第２鎖合成及びＳ１エンドヌクレアーゼ分解 得られたｃＤＮＡ溶液を１００℃にて９０秒間加熱し、
冷却し、そして０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．
９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＤＴＴ（カル
ビオケム）、１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭ ｄＣＴＰ，１
ｍＭ ｄＴＴＰ（Ｐ−Ｌ，ビオケミカルム）、１ｍＭ
３Ｈ−ｄＧＴＰ（アマ−シャム、比活性９４，０００ｃ
ｐｍ／ｎモル）及び１６５Ｕ／ｍｌのＥ．コリＤＮＡポ
リメラーゼＩ（バイオラブス，ニューイングランド）を
含んで成る反応混合物４００μｌ中で、１５℃にて８時
間インキュベートする。ＥＤＴＡ及びＳＤＳを最終濃度
がそれぞれ１０ｍＭ及び０．１％になるように加えるこ
とにより反応を停止する。反応混合物をフェノール及び
クロロホルムで抽出し、セファデックスＧ−５０（ファ
ルマシア、微細、ベッドボリューム２ｍｌ）によりクロ
マトグラフ処理し、そして前記（段階Ｂａ）のごとくエ
タノールで沈澱せしめる。得られたＤＮＡを、０．２５
ＭＮａＣｌ，５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）
及び１ｍＭ ＺｎＳＯ４を含有するインキュベーション
混合液５０μｌ中で６ＵのＳ１エンドヌクレアーゼ（Ｐ
−Ｌバイオケミカルス）により、３７℃にて３０分間処
理する。０．１％ＳＤＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡにより
反応を停止する。１容量のフェノール（５０ｍＭ酢酸ナ
トリウムに飽和、ｐＨ４．５）及びクロロホルムにより
反応混合物の脱蛋白質を行う。水相を、ＴＮＥ中２ｍｌ
のセファデックスＧ−５０（ファルマシア、微細）カラ
ムでクロマトグラフ処理する。１００μｌの分画を集
め、そして各分画のチェレンコフ放射線を測定する。排
出された区分を集め、そして前記のごとく２容量のエタ
ノールを用いて−２０℃にて１０時間ＤＮＡを沈澱せし
める。沈澱物をＨＢ−４ローター（前記）により遠心分
離し、そして集めた沈澱を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する
溶液１００μｌに溶解する。４μｇのＤＮＡを得る。Ｔ
ＳＴ−６０ローター〔コントロン（Ｋｏｎｔｒｏｎ）Ａ
Ｇ〕を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）及び１ｍＭＥＤＴＡを含有するシュークロース密度
勾配（５〜２３％）により、ＤＮＡを分画する。遠心分
離は、１５℃にて５時間、５５，０００ｒｐｍにおいて
行う。平行して行う勾配試験において８００塩基対のマ
ーカーＤＮＡより速く沈降するＤＮＡを集め、ＴＮＥに
調整し、そして６７％エタノールにより−２０℃にて１
０時間沈澱せしめる。０．４μｇの二重鎖ｃＤＮＡを得
る。
Ｃ．ｐＢＫ３２２に連結されたｃＤＮＡの調製（第７
図） （ａ） ｄＣＭＰ−延長ｃＤＮＡの調製 １００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２．
５ｍＭ ＣｏＣｌ２，５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ（カルビ
オケム）、１ｍＭ ｄＣＴＰ及び１０Ｕの末端ヌクレオ
チドトランスフェラーゼ／μｇのｄｓ ｃＤＮＡを含有
する反応混合物１０μｌ中で、得られたｄｓ ｃＤＮＡ
０．１μｇの３′末端にポリ（ｄＣ）尾部を加える。
インキュベーション（２７℃にて２０分間）後１０ｍＭ
となるようにＥＤＴＡを加え、そして試料を使用するま
で−２０℃にて貯蔵する。
（ｂ） Ｐｓｔ Ｉで切断され、ｄＧＭＧで延長された
ｐＢＲ３２２の調製 １０μｇのｐＢＲ ３２２プラスミドＤＮＡを、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，６ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），６ｍＭ ＭｇＣｌ２，６ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール及び１００μｇ／ｍｌのゼラチンを含有する１
００μｌの溶液中で、１０ＵのＰｓｔ Ｉエンドヌクレ
アーゼ（バイオラブス）を用いて、３７℃にて１時間分
解する。溶液を１容量のフェノール及びクロロホルムで
抽出する。溶液をＴＮＥに調整し、そして線状になった
ＤＮＡを、２容量のエタノールにより−２０℃にて５時
間沈澱せしめる。線状にされたプラスミドＤＮＡを、１
００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，５０μｇ／ｍ
ｌのＢＳＡ，１ｍＭ ｄＧＴＰ及び１００Ｕの末端デオ
キシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａ
ｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒｄｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を含有する反
応液２００μｌ中で、ｄＧＭＰにより延長する。３７℃
にて２０分間インキュベートした後、ＥＤＴＡを１０ｍ
Ｍ濃度に加え、そして反応混合物を使用するまで−２０
℃に凍結する。
（ｃ） ｄＧＭＰ延長ｐＢＲ ３２２のｄＣＭＰ延長ｄ
ｃｃＤＮＡへのアニーリング ５００μｌのＴＮＥ緩衝液中ｄＣＭＰ延長二重鎖ｃＤＮ
Ａ（０．１μｇ）及びｄＧＭＰ尾部付加線状ｐＢＲ ３
２２（０．５μｇ）の混合物を、６５℃にて１時間、４
６℃にて１時間、３７℃にて１時間及び２０℃にて１時
間インキュベートする。ｐＢＲ ３２２連結 ｃＤＮＡ
を含有する溶液を氷上におき、そしてただちに形質転換
に使用する。
（ｄ） アニールされた雑種プラスミドによるＥ．コリ
１０１の形質転換 マンデル（Ｍａｎｄｅｌ）等（２９）の方法により形質
転換のためにカルシウム処理されたＥ．コリＨＢ１０１
を調製する。上記（段階Ｃｃ）のようにして調製したア
ニールされたｐＢＲ ３２２雑種プラスミドＤＮＡを含
有する反応混合物１０μｌを、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
１０ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）中カルシウム処理Ｅ．コリＨＢ１０１を
含有する混合物に加えることにより、全量を２００μｌ
とする。混合物を氷中で２０分間冷却し、４２℃に１分
間加熱し、そして２０℃にて１０分間インキュベートす
る。１ｍｌのトリプトン培地〔１ｌの蒸留水中に１０ｇ
のバクト−トリプトン（ディフコ）、１ｇの酵母エキス
トラクト（ディフコ）、１ｇのグルコース、８ｇのＮａ
Ｃｌ及び２９４ｍｇのＣａＣｌ２。２Ｈ２Ｏを含む〕を
加え、そして混合物を、３７℃にて３０分間３００ｒｐ
ｍにて振とうすることによりインキュベートする。混合
物を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（シグマ）を
補給した２つの寒天プレート〔マッコンキー（Ｍｃ Ｃ
ｏｎｋｅｙ）寒天、ディフコ、プレート当り０．６ｍ
ｌ〕接種する。プレートを３７℃にて１２〜１７時間イ
ンキュベートする。形質転換されたＥ．コリＨＢ１０１
のテトラサイクリン耐性コロニー約５６００個を得る。
Ｅ． ＨｕＩＦＮ ｃＤＮＡを含有するコロニーの同定 （ａ） １３連オリゴヌクレオチドプライマーの合成
（第８図） ＨｕＩＦＮ−α及びＨｕＩＦＮ−β ｍＲＮＡの両者に
共通に存在する１３ヌクレオチドに相補的なオリゴヌク
レオチドを、ホスホトリエステル法〔イタクラ等（４
０）、ドゥロイ（ｄｅ Ｒｏｏｉｊ）等（４１）〕によ
り化学的に合成する。個々の合成段階を第８図に要約す
る。第８図の１行目に示す出発物質（保護基を有するモ
ノデオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチド）
は文献から知られている。保護基はイタクラ等により記
載された方法により除去する。すなわち、５′−モノメ
トキシトリチル（Ｍ）又はジメトキシトリチル（Ｄ）で
置換されたヒドロキシル基の脱保護は室温にて酢酸（８
０％）により行う、そしてβ−シアノエチルホスフェー
ト基は、ジオキサン−水（４：１）中０．１Ｎ水酸化ナ
トリウムにより室温において脱離する。構成部分の縮合
は、活性化剤としてトリイソプロピルベンゼンスルホニ
ルクロリドを使用して行い、第８図の７行目に示す十分
に保護された１３連プライマーまでのオリゴデオキシヌ
クレオチドを得る。最終段階（すべての保護基の完全な
除去）は次のようにして行う。３ｍｌのジオキサン及び
１ｍｌのアセトニトリル中に十分に保護された１３連オ
リゴデオキシヌクレオチド６４．６ｍｇを含有する溶液
を、２００ｍｇのｓｙｎ−ｐ−ニトロベンズアルドキシ
ム及び１２４ｍｇのＮ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３−テトラメ
チルグアニジンで処理し、そして２７時間置く。１０ｍ
ｌのアンモニア（２５％）を加え、溶液を５０℃にて２
４時間貯蔵する。溶剤を真空蒸発せしめた後、残渣を水
に溶解し、酢酸によりｐＨを４に調製し、そして溶液を
クロロホルムにより２０回抽出する。水溶液を蒸発乾燥
せしめ、そして残渣を１ｍｌの酢酸（８０％）に溶解す
る。溶液を１時間放置し、６ｍｌの水で稀釈し、クロロ
ホルムで３回抽出し、そして凍結乾燥する。得られた粗
生成物の３分の１を、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５
（カラムの大きさ１０×１．３ｃｍ）上０．１〜１．２
Ｍトリエチルアンモニウムビカルボネート勾配２００ｍ
ｌを用いるクロマトグラフィーにより精製する。勾配濃
度中０．８７Ｍにおいて主分画が溶出する。ＨＰＬＣ試
験における純生成物を含有する主分画を水と共に３回蒸
発せしめ、１０ｍｌのダウエックス５０Ｗ（ＮＨ４塩）
を通して▲ろ▼過し、そして凍結乾燥する。ＨＰＬＣ
〔パーマファーゼ（ｐｅｒｍａｐｈａｓｅ）ＡＡＸ、カ
ラム大９０×０．３ｃｍ、６０℃、２ｍｌ／分；勾配：
Ａ＝０．００５ＭＫＨ２ＰＯ４，Ｂ＝０．５ＫＨ２ＰＯ
４，０．５Ｍ ＫＣｌ，ｐＨ４．５；３０分間に２０％
Ａ→１００％Ｂとする〕：ｔＲ１１．８分。
（ｂ） ３２Ｐ−ラベルされたヒトＩＦＮ−α及びＩ
ＦＮ−β特異的ｃＤＮＡプローブの調製（第９図） ４０Ｐモルの合成１３連オリゴデオキシヌクレオチドプ
ライマー（段階Ｅａ）及び４０ｐモルの〔ｒ−３２Ｐ〕
−ＡＴＰ（５７００Ｃｉ・ｍｍｏｌ−１，アマーシャ
ム）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．５），
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び５ｍＭ ＤＴＴを含有する溶
液１００μｌ中で一緒にする。５０ＵのＴ４ポリヌクオ
チドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を加え、そし
て３７℃にて３０分間置いた後追加の酵素２０Ｕを加
え、そして３７℃にて１５分間さらにインキュベートを
続ける。３２Ｐ−ラベルされたプライマーを含有する溶
液をフェノール抽出により精製する。１ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中４ｍｌのセファデックスＧ−
５０（ファルマシア、微細）カラムによるクロマトグラ
フィーによりさらに精製する。０．１ｍｌの分画を集め
る。各分画の放射能を、チェレンコフ放射線を測定する
ことにより測定する。オリゴデオキシヌクレオチドｐモ
ル当り４×１０６チェレンコフｃｐｍの比活性が得られ
る。３２Ｐ−ラベルプライマー（４０ｐモル）を凍結乾
燥し、１４μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡ（ナマルワ細胞から
誘導され、段階Ａに記載した方法により調製したもの）
を含有する水９１μｌに再懸濁し、そして１００℃にて
６０秒間加熱する。９μｌの４ＭＫＣｌを加え、そして
混合物を２５℃にて６０分間インキュベートする。４５
０μｌの逆転写酵母混合物を加え、反応混合物が４０ｍ
ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）、４ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，１ｍＭＤＴＴ（カルビオケム社）、７４ｍＭＫＣ
ｌ，１ｍＭずつのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴ
ＴＰ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）及び９０Ｕのトリ−骨
髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を含有するよう
にする。３７℃にて１時間インキュベーションを続け
る。溶液を１容量のフェノール（ＴＮＥに飽和）により
抽出し、そして核酸を２容量のエタノールにより−２０
℃にて１０時間沈澱せしめる。沈澱物を遠心分離（ＨＢ
−４ローター、２０分間、１０，０００ｒｐｍ、０℃）
により集め、そして９０（ｖ／ｖ）％のホルムアミド
（メルク、分析用）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブ
ロムフェノールブルー及び０．０５％のキシレンシアノ
ールブルーを含有する色素混液２０μｌに溶解する。試
料を９０℃にて２分間加熱し、そしてＴｒｉｓ−ボレー
ト−ＥＤＴＡ〔ピーコック（Ｄｅａｃｏｃｋ）等（３
９）〕中５％ポリアクリルアミドゲルに適用する。プラ
スミドｐＢＲ３２２のＨｅａＩＩＩによる分解により得
られた２６７ｂｐ及び４３５ｂｐの３２Ｐ−ラベルマー
カーＤＮＡ断片の間を泳動する単一のバンドがオートラ
ジオグラム上に見られる。３２Ｐ−ラベルｃＤＮＡ断片
を、ミュラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）等の方法（４２）によ
りゲルから抽出し、そして精製する。２０，０００チェ
レンコフｃｐｍの３２Ｐ−ラベルヒト−ＩＦＮ−α及び
ＩＦＮ−β特異性ｃＤＮＡプローブが得られる。
（ｃ） Ｈｕ ＩＦＮ ｃＤＮＡを含有するコロニーの
選択（第９図） 前記の方法（段階Ｄ）により得られた１６５０個の形質
転換されたコロニーを、ニトロセルロース▲ろ▼紙ＢＡ
８５〔シュライケル＆シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、直径８ｃｍ〕に移す。細胞を分解
し、そのＤＮＡを変性し、そしてグルンスタイン（Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ）及びホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方
法（２０）に従ってその場で▲ろ▼紙に固定する。コロ
ニーを担持した▲ろ▼紙を、４×ＳＥＴ〔０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１（ｗ／ｖ）％のフィコ
ール（Ｆｉｃｏｌｌ）４００（ファルマシア）、０．１
（ｗ／ｖ）％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−３６
０，シグマ）、０．１（ｖ／ｖ）％のＢＳＡ，０．５％
のＳＤＳ，５０μｇ／ｍｌの変性子牛胸腺ＤＮＡ（製
法：５ｍｇの子牛胸腺ＤＮＡ（タイプＩ、シグマ）を
０．５ＮＮａＯＨ中で１０分間煮沸することによりＤＮ
Ａを分離し、５Ｍ酢酸により中和し、そして２容量のエ
タノールにより−２０℃にて沈澱せしめ、この沈澱をＨ
Ｂ−４ローターを用いて０℃にて１０分間遠心分離し、
そして５００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ に再溶解す
る）を含有する溶液〕中で、▲ろ▼紙当たり２０ｍｌを
用いて、６５℃で４時間予備ハイブリッド形成し、そし
て、５×ＳＥＴ〔０．０２（ｗ／ｖ）％のフィコール、
０．０１％のポリピニルピロリドン、０．０２（ｖ／
ｖ）％のＢＳＡ、０．２％のＳＤＳ及び５０μｇ／ｍｌ
の変性子牛胸腺ＤＮＡ〕中ニトロセルロース▲ろ▼紙当
たり１０３チェレンコフｃｐｍの３２Ｐ−ラベルプロー
ブを用いてハイブリッド形成を行う。このハイブリッド
形成は６５℃にて３６時間行う。▲ろ▼紙を、クロロホ
ルム中で１回、ＳＥＰ、０．５％ＳＤＳ中で２回室温に
おいてすすぎ、そしてＳＥＴ、０．５％ＳＤＳ中で２回
６０℃にて１時間すすぎ、そして３ｍＭトリズマ（Ｔｒ
ｉｚｍａ）塩基により１回室温にて１時間すすぐ。この
▲ろ▼紙を、３ＭＭ−紙（ワットマン）上で吸取ること
により乾燥し、そしてスクリーン〔イルホルド（Ｉｌｆ
ｏｖｄ）強化スクリーン〕を用いてＸ線フィルム（フ
ジ）を前記の▲ろ▼紙に露光する。オートラジオグラム
上で９個の陽性コロニーを同定し、そしてその後の実験
に使用する。形質転換された細胞の一次コロニーは場合
によっては１種類より多くのＤＮＡ分子を含有するの
で、ハイブリッド形成陽性の９個のコロニーから雑種プ
ラスミドＤＮＡを分離し、そして前記のごとくＥ．コリ
ＨＢ１０１を形質転換するのに使用する。 雑種プラス
ミドＤＮＡを次のようにして分離する。２５ｍｌのエル
レンマイヤーフラスコ中、１０μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを補給したトリプトン培地１０ｍｌに１コロニー
を接種する。培養物を３７℃，３００ｒｐｍにて１５〜
１８時間振とうする。遠心分離（ソルバル、ＨＳ−４ロ
ーター、４，０００ｒｐｍにて１０分間、４℃）により
集菌する。約０．１ｇの細胞を得、１ｍｌの５０ｍＭＴ
ｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁する。０．２５
ｍｌのリゾチーム溶液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）中１０ｍｇ／ｍｌ、リゾチームはシグマ
製〕を加え、そして０℃にて１０分間インキュベートし
た後０．１５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）
を加える。０℃にてさらに１０分間置いた後、６０μｌ
の２％トリトンＸ−１００（メルク）を加える。０℃に
て３０分置いた後、試料を、ソルバルＳＡ−６００ロー
ターを用いて１５，０００ｒｐｍ、４℃にて３０分間遠
心分離する。１容量のフェノール（ＴＮＥ飽和）を用い
て上澄液の除蛋白質を行う。５，０００ｒｐｍ，４℃に
て１０分間遠心分離（ソルバルＨ−Ｂ４ローター）する
ことにより相分離を行う。上相を１容量のクロロホルム
で２回抽出する。膵臓ＲＮＡアーゼＡ（シグマ、ＴＮＥ
中１０ｍｇ／ｍｌ、８５℃にて１０分間前加熱）を加え
最終濃度を２５μｇ／ｍｌとし、そして混合物を３７℃
にて４０分間インキュベートする。次に、溶液を１Ｍ
ＮａＣｌ及び１０％ポリエチレングリコール６０００
〔フルカ（Ｆｌｕｋａ）、１２０℃にて２０分間オート
クレーブしたもの〕に調整し、そして−１０℃にて２時
間インキュベートする。ソルバルＨＢ−４ローター（１
０，０００ｒｐｍ、０℃にて２０分間）により沈澱を集
め、そして１００μｌのＴＮＥに溶解する。ＤＮＡ溶液
を１容量のフェノールで抽出し、そして２容量のエタノ
ールを用いて−８０℃にて１０分間ＤＮＡを沈澱せしめ
る。エッペンドルフ遠心分離機中で遠心分離することに
より沈澱を集め、そして２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ含有
溶液中にＤＮＡを再溶解する。１０ｍｌの培養物から８
〜１０μｇの雑種プラスミドＤＮＡを得る。９種類の分
離された雑種ＤＮＡのそれぞれによりＥ．コリＨＢ１０
１を形質転換し、そして前記（段階Ｄのごとく、形質転
換された細胞をテトラサイクリンを含有する寒天プレー
ト上に接種する。各形質転換体から３個のテトラサイク
リン耐性コロニーを拾い上げ、１０ｍｌの培養物を調製
し、そして前記の方法により雑種ＤＮＡを分離する。再
形質転換の前後におけるすべてのＤＮＡ試料を、Ｐｓｔ
Ｉエンドヌクレアーゼによる切断、及び５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−アセテート（ｐＨ７．８）及び１ｍＭＥＤＴＡ中１
％アガロースゲルによる電気泳動により分析する。すべ
ての試料は再形質転換の前後において同じ切断パターン
を示す。再クローニングした組換ＤＮＡ分子の１つから
２つのバンドが生じ、１つはＰｓｔ−切断ｐＢＲ３２２
の移動度を有し、他方は約１０００ｂｐに対応する移動
度を有する。これをＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−１´ｂと称する。他の１つの組換ＤＮＡから３つの
バンドが生じ、１つはＰＳｔＩ−切断ｐＢＲ３２２の移
動度を有し、他の１つは６００ｂｐの移動度を有し、そ
して他の１つは約１５０ｂｐの移動度を有する。このク
ローン中の組換ＤＮＡ分子をＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃＩＦＮ−β１と称する。
（ｄ）クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
１´ｂ、及びＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β
１の特徴付け クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１´
ｂ、及びＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１の
組換プラスミドＤＮＡを前記の方法（段階Ｅｃ）により
培養物から分離し、そしてマクサム（Ｍａｘａｍ）及び
ジルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）により記載された方法
（１５）を用いてｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定す
ることにより特徴付ける。基本的には次の方法を用い
る。分離された組換プラスミドＤＮＡを種々の制限エン
ドヌクレオチドにより分解する。酵素は本質上供給者
（ニューイングランド、バイオラブス）により記載され
た方法により用いる。但し、酵素緩衝液中のＢＳＡの代
りにゼラチンを用いる。制限分解されたＤＮＡを含有す
る溶液をフェノール（ＴＮＥで飽和）を用いて脱蛋白質
する。ＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめ、５０μｇ
／ｍｌのＤＮＡ濃度において５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）に再溶解し、そしてＤＮＡ５´末端ｐ
モル当り０．１Ｕの子牛腸アルカリホスファターゼ（ベ
ーリンガー）と共に３７゜Ｃにて３０分間インキュベー
トする。溶液を６０℃にて６０分間加熱することにより
酵素を不活性化する。ミュラー等の記載（４２）に従っ
てＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーによりＤＮ
Ａを精製し、そしてエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡ
の５´末端を〔γ−３２Ｐ〕−ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ
／ミリモル、アマーシャム）及びＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を用いてラベルす
る。この方法は本質上マクサム及びジルバートの記載
（１５）に従って行うが、但し、キナーゼ反応の前にＤ
ＮＡの変性を行わない。一般に、比活性は１〜３×１０
６ｃｐｍ／ｐモル５´末端である。ラベルされたＤＮＡ
断片を第２の制限エンドヌクレアーゼによって切断し、
そしてＴｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡ緩衝液中６％、８
％又は１０％ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動
により生成物を分離する。ＤＮＡ断片をゲルから抽出
し、そしてミュラー等の方法（４２）に従って精製す
る。ヌクレオチド配列の決定のため、ＤＮＡ断片を化学
的に分解し、そして生成物を、マクソン及びジルバート
の方法（１５）に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離する。特に、クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２
／ＨＬｙｃＩＦＮ−１´ｂの分離されたプラスミドＤＮ
Ａは次のように処理する。一方において、５μｇのプラ
スミドＤＮＡをＢｇｌＩＩにより分解し、５´末端をラ
ベルし、そしてＰｖｕＩＩにより切断する。ＰｖｕＩＩ
−ＢｇｌＩＩ＊ＤＮＡ断片（＊はラベルの位置を示す）
及びＢｇｌＩＩ−ｐｖｕＩＩ＊ＤＮＡ断片を６％ポリア
クリルアミドゲル上で分離する。他方において、５μｇ
のプラスミドをＡｌｕＩにより分解し、５´末端をラベ
ルし、そしてＰｓｔＩにより切断する。ＰｓｔＩ−ＡＩ
ｕＩ＊ＤＮＡ断片を８％ポリアクリルアミドゲル上で分
離する。次に、各断片をマクサム及びジルバートの方法
に従って分解し、そして配列する。得られたヌクレオチ
ド配列を第１０図に示す。約２５〜３５のデオキシグア
ノシン残基の区間がｃＤＮＡ挿入部の５´末端に先行す
る。示されたヌクレオチド配列はゲデル（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ）等〔（４３）、及びワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ
ｎ）（４４）を参照のこと〕により記載されたＩＦＮ−
α（タイプＦ）ｃＤＮＡのそれと幾分類似するが、多く
の明らかな相違（点変異）が存在し、これらの幾つかは
生成するアミノ酸に影響を与える。クローンＣＲ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１の分離されたプラスミ
ドＤＮＡを同様に処理する。５μｇのプラスミドをＰｖ
ｕＩＩで分解し、そして５´末端ラベルする。混合物の
半分をＰｓｔＩにより切断し、そして他方をＢｇｌＩＩ
で切断する。ＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ＊断片及びＢｇｌＩ
Ｉ−ＰｖｕＩＩ＊断片を、上記の方法と同様にして６％
ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、
そして分解する。ヌクレオチド配列（Ｎ−末端配列）を
第１１図に示す。この結果は、タニグチ等（４５）によ
り記載されているように、ｃＤＮＡ挿入部がＩＦＮ−β
１ｃＤＮＡのＮｏ．１０２ヌクレオチドから出発してい
ることを示している。従って、ｃＤＮＡ挿入部はＮ−末
端において１１個のアミノ酸が欠落したヒトＩＥＮ−β
１をコードする能力を有する。ｃＤＮＡ挿入部の５´末
端には約２０〜２５のデオキシグアノシン残基の区間が
配置されており、１５３位に点変異が存在し、ここでは
ＣがＴに変わっているが生ずるアミノ配には影響しな
い。
（ｅ） ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１´ｂ
及びＣＧ−ｐＢＲ３２ ２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１の挿入部に交差ハイブリド形
成する組換ＤＮＡ分子を含有するクローンの同定 クローンＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１´ｂ
及びＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１の組換
プラスミドＤＮＡを、前記（段階Ｅｃ）のようにして培
養物から分離する。ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−１´ｂプラスミドＤＮＡ（５μｇ）をＢｇｌＩＩに
より分解し、５´末端をラベルし、ＰｖｕＩＩにより切
断する。他方、分離されたＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙ
ｃＩＦＮ−β１プラスミドＤＮＡ（５μｇ）をＰｖｕＩ
Ｉにより分解し、５´末端をラベルし、そしてＢｇｌＩ
Ｉにより切断する。ｐｖｕＩＩ−ＢｇＩＩ＊（３５１ｂ
ｐ）ＤＮＡ断片（プローブＡ）及びＰｖｕＩＩ＊−Ｂｇ
ｉＩＩ（３６８ｂｐ）ＤＮＡ断片（プローブＢ）を、上
記（段階Ｅｄ）のようにして８％ポリアクリルアミドゲ
ルから分離し、そしてその場でコロニーハイブリッド形
成するのに使用する（下記）。プラスミドＤＮＡの制
限、ラベル及び精製は、前記（段階Ｅｄ）の場合と同様
にして行う。上記（段階Ｄ）のようにして得られた４０
００の形質転換体コロニーをニトロセルロース▲ろ▼紙
ＢＡ８５（シュライケル＆シュエル、直径８ｃｍ）に移
す。細胞を分解し、そしてそれらのＤＮＡを、グルンス
タイン及びホグネス（２０）の方法に従ってその場で変
性し、そして▲ろ▼紙に固定する。プローブＡ及びＢ
（両プローブは混合されている）へのハイブリド形成
は、上記（段階Ｅｃ）のようにして行う。６個の陽性コ
ロニーをオートラジオグラフィーにより同定し、その内
の３つを次の様に称する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ １０１
ＣＧ−ｐＢＲ ３２２／ＨＬｙｃ ＩＦＮ−４１、
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ
ＩＦＮ−５１、及びＥ．ｃｏｌｉＨＢ １０１ ＣＧ−
ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ ＩＦＮ−８´１。これらをこ
の後の実験に使用する。上記（段階Ｅｄ）のようにし
て、これらのクローンのプラスミドＤＮＡを分離し、再
形質転換し、そして再分離する。組換ＤＮＡの挿入部の
性質を確定するために、ｃＤＮＡ挿入部（部分的又は全
体的）のヌクレオチド配列を上記（段階Ｅｄ）の一般的
方法を用いて確定する。特に、５μｇの分離されたプラ
スミドＤＮＡ ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
４１及びＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ ＩＦＮ−８´
１のそれぞれをＰｖｕＩＩにより分解し、５´末端をラ
ベルし、そしてＰｓｔＩにより切断する。ＤＮＡ断片
を、８％ポリアクリルアミドゲル上で分画し、そして８
´１ＤＮＡからのＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ＊（〜１２０ｂ
ｐ）、及び４１ＤＮＡからのＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ
＊（８２ｂｐ）を通常の方法で分離する。分離されたプ
ラスミドＤＮＡ ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ
−５１を次のように処理する。一方において、５μｇの
プラスミドＤＮＡをＨａｅＩＩＩにより分解し、５´末
端をラベルし、そしてＰｓｔＩにより切断する。Ｐｓｔ
Ｉ−ＨａｅＩＩＩ＊（５７ｂｐ）ＤＮＡ断片を１０％ポ
リアクリルアミドゲル上で分離する。他方において、５
μｇのプラスミドをＥｃｏＲＩにより分解し、５´末端
をラベルし、そしてＰｓｔＩにより切断する。ＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ＊（２３５ｂｐ）及びＥｃｏＲＩ＊−Ｐｓ
ｔＩ（〜７００ｂｐ）ＤＮＡ断片を、８％ポリアクリル
アミドゲル上で分離する。種々のＤＮＡ断片の配列を、
マクサム及びジルバートの方法（１５）により決定す
る。ｃＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配列を第１２〜１４
図に示す。第１２図にはＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ
ＩＦＮ−４１のｃＤＮＡ挿入部の部分的ヌクレオチド
配列が示されている。挿入部の５´末端には２３のデオ
キシグアノシン残基の区間が配置されており、そしてス
トレイリ（Ｓｔｒｅｕｌｉ）等（４６）により記載され
たＩＦＮ−α２（Ｌｅ）ｃＤＮＡの一部を含んでいる。
３´−シストロン外領域（ｅｘｔｒａ−ｃｉｓｔｒｏｎ
ｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）には若干の小変化（点変異）及び
追加の３１８ヌクレオチド区間が存在する。ＣＧ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８´１のｃＤＮＡ挿入部の
ヌクレオチド配列を第１３図に示す。挿入部の５´末端
には２０〜２３デオキシグアノシン残基の区間が配置さ
れており、そしてゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）等（４
３）、マンテニ（Ｍａｎｔｅｉ）等（２７）により記載
されているＮＦＮ−α（タイプＤ）ｃＤＮＡに類似して
いるが同一ではない。ＩＦＮをコードする配列の前後の
ｃＤＮＡ領域における相違とは別に、ＮＦＮ遺伝子は２
８〜３０位にＧＣＣトリプレットを、そして４０９〜４
１１位にＧＣＧトリプレット（いずれもアラニンをコー
ドする）を含み、ＧＴＣ及びＧＴＧ（バリンをコードす
る）ではない。最後に、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ
ＩＦＮ−５１（第１４図）のｃＤＮＡ挿入部のヌクレ
オチド配列には、５´末端に１７デオキシグアノシン残
基の区間が存在する。ヌクレオ配列は、ゴーデル等（４
３）により記載されたＩＦＮ−α（タイプＢ）ｃＤＮＡ
のそれと関連する。しかしながら、ＨＬｙｃ ＩＦＮ−
５１のｃＤＮＡ挿入部の５´に追加のヌクレオチドが存
在し、シストロン外領域及びＩＦＮコード領域に点変
異、欠落及び挿入が存在し、特に２２位及び３６１〜３
７２において明らかである。
Ｆ． ヒト−ＩＦＮ特異的組換ＤＮＡ分子を含有する 合成 ヒト−ＩＦＮ特異的組換ＤＮＡ分子を含有することが示
された５個のクローン、すなわち、 につき、それぞれ次のようにしてＩＦＮ活性を試験し
た。対応するＥ．コリのクローン（３０ｍｌ懸濁液）
を、トリプトン培地において、光学濃度（ＯＤ６５０）
が約１になるまで増殖せしめる。細胞を集め、そして
０．５ｍｌの水溶液〔３０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８０）を含有〕に再懸濁す
る。リゾチーム（シグマ）を１ｍｇ／ｍｌとなるように
加える。０℃にて３０分間置いた後、懸濁液を凍結（液
体窒素）し、そして５分間解凍（３７℃）し、そしてＳ
Ｓ３４ソルバルローターを用いて、２０，０００ｒｐ
ｍ、４゜Ｃにて２０分間遠心分離する。上澄液のＩＦＮ
活性を、段階Ａｃにおいて記載したアームストロングの
方法（３２）に従って、細胞病理的（ｃｙｔｈｏ ｐａ
ｔｈｉｃ）生物測定法を用いて測定する。その結果次の
活性が認められる。
おそらく、測定し得るＩＦＮ活性を示さないクローン
は、ＨｏＬｙ ＩＦＮ−ｃＤＮＡ挿入部が転写の方向に
関して不適当な方向を有する組換ＤＮＡを含有している
であろう。従って、十分な長さのｃＤＮＡ挿入部を含有
するこのようなクローンの１つ（ＣＧ−ｐＢＲ３２２／
ＨＬｙｃ ＩＦＮ−１´ｈ）の組換ＤＮＡを次のように
して再配向する。クローンＥ・コリＨＢ １０１ ＣＧ
−ｐＢＰ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１´ｂのプラスミド
ＤＮＡを前記（段階Ｅｃ）のようにして分離し、そして
ＰｓｔＩにより切断する。２０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ
ＤＴＴ、２５ｍＭ ＮａＣｌ及び５０μｇ／ｍｌのゼラ
チンを含有する緩衝液２０μｌ中０．５μｇの切断ＤＮ
Ａを、０．２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラブス）
及び０．５ｍＭＡＴＰにより、１５℃にて２時間処理す
る。上記（段階Ｄ）のようにしてｃＤＮＡ混合物により
Ｅ・コリＨＢ １０１ を形質転換する。形質転換され
たコロニーを、テトラサイクリンを補給したマッコンキ
ー（Ｍｃ Ｃｏｎｋｅｙ）寒天プレート上で選択し、そ
してニトロセルロース▲ろ▼紙上にレプリカする。組換
ＤＮＡ ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１´ｂ
（段階Ｅｅ・参照）の３２Ｐ−ラベルされたＰｖｕＩＩ
−Ｂｇｌ ＩＩ＊断片（３５１ｂｐ）とハイプリド形成
する４つの細菌コロニーを、Ｅ．コリＨＢ１０１ＣＧ−
ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ ＩＦＮ−１´ｂ１〜−１´ｂ
４と称する。４種類のクローンの抽出物を調製し、そし
て前記のようにしてＩＦＮ活性を測定する。次の活性が
得られる。
従って、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−１´ｂ４は ＩＦＮ活性を有するポリペプチドの合
成を指令することができるｃＤＮＡ挿入部を含有する。
Ｇ． ＩＦＮ活性を有するポリペプチドを高レベルで生
産し得る組換ＤＮＡの形成 （Ｉ） ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）ＬｙＩＦＮ−α−１組換
プラスミドの形成 クローンＥ・コリＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃＩＦＮ−１´ｂのＩＦＮ特異的蛋白質収量を改良す
るため、第１５図に概略を示した方法により次のような
方法を行う。
（ａ） ｃＤＮＡ挿入部の調製 クローンＥ．コリＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃ ＩＦＮ−１´ｂの組換プラスミドＤＭＡ（１５０
μｇ）を、標準法（段階Ｅｄ）を用いてＰｓｔＩ（バイ
オラブス）により切断する。フェノール抽出及びエタノ
ール沈澱の後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中シュークロース密度勾配遠
心分離（５〜２３％）により切取られた挿入部を分離す
る。遠心分離は、ＴＳＴ４１ローター（コントロンＡ
Ｇ）中、１５℃にて１６時間行う。ＩＳＣＯ勾配コレク
ターを用いて０．３ｍｌずつの分画を１ｍｌ／分の速度
で集める。小断片（すなわち挿入部）を含有する分画を
一緒にする。常法に従ってＤＮＡをエタノールにより沈
澱せしめ、ＨＢ−４ローター（ソルバル）を用いて１
０，０００ｒｐｍ、０℃にて１０分間遠心分離すること
により沈澱を集める。沈澱を６０μｌの１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．０５ｍＭＥＤＴＡ
含有溶液中に溶解する。光学濃度の測定による場合３０
μｇのＤＮＡを回収する。挿入ＤＮＡ（１０μｇ）をＨ
ａｅＩＩＩ（バイオラブス）により分解し、そして断片
を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ硼酸、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ及び０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有
する溶液中２％アガロースゲル上で分画する。最も大き
なＤＮＡ断片、すなわちＨａｅＩＩＩ−ＰｓｔＩ（８６
９ｂｐ）及びＨａｅＩＩＩ−ＨａｅＩＩＩ（８２ｂｐ）
（第１５図、それぞれ断片３及び４を参照）をそれぞれ
ゲルから切取り、小さい針の注射器を通して、０．１５
ＭＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液５ｍｌ中に注入
し、そして−夜振とうする。溶出液を１００μｌのＤＥ
−５２（ワットマン）パスツール−ピペットカラムを通
すことによりＤＮＡを吸着せしめる。カラムを２ｍｌの
同じ緩衝液で洗浄し、そして１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを
含有する溶液４００μｌでＤＮＡを溶出する。２容量の
エタノールにより−２０℃にて一夜ＤＮＡを沈澱せしめ
る。エッペンドルフ遠心分離機により遠心分離すること
により沈澱を集める。ＨａｅＩＩＩ−ＨａｅＩＩＩＤＮ
Ａ断片（８２ｂｐ）を再溶解し、そしてＳａｕ ３Ａ
（バイオラブス）により分解する。６５℃にて３０分加
熱することにより酵素を不活性化する。１μｇのＨａｅ
ＩＩＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片（８６９ｂｐ）を加え、溶
液を１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ及び０．
５ｍＭ ＡＴＰに調製し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（バイオラブス）を３０Ｕ／μｌとなるように反応混合
物に加える。溶液を１５℃にて１０時間インキュベート
する。フェノール及びクロロホルムにより抽出した後、
溶合物を、エチジウムブロミドの存在下で、Ｔｒｉｓ−
ボレート−ＥＤＴＡ中２％アガロースゲルにより分画す
る。前記のようにしてＳａｕ ３Ａ−ＰｓｔＩＤＮＡ断
片（第１５図、断片５を参照）を抽出し、エタノールに
より沈澱せしめ、そして１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液
１０μｌに再溶解する。
（ｂ） ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ制御領域 （ＡｐＰｒ）を含有するＤＮＡ断片の調製 プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔＩにより切断し（段階
Ｃｂを参照）、そして３０℃において４〜１０分間、４
Ｕ／ｍｌのエキソヌクレアーゼＢａｌ３１〔ベセスダ
リザーチ ラブ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂ．〕により処理することによりβ−ラクタマー
ゼコード部分を除去する。式、 で示される化学的ＤＮＡリンカーを、前記（段階Ｅａ）
の方法を用いて合成する。常法により、リンカーをＢａ
ｌ３１で処理したｐＢＲ３２２ＤＮＡに加える。これに
より生成した雑種分子を制限エンドヌクレアーゼＢｃｌ
Ｉ（バイオラブス）及びＥｃｏＲＩにより切断する。反
応生成物を、前記（段階Ｂａ）のようにしてＴｒｉｓ−
ボレート−ＥＤＴＡ中８％ポリアクリルアミドグルによ
り分画する。１８４ｂｐ及び２３４ｂｐマーカーＤＮＡ
の間を泳動するＤＮＡ断片（ＡｐＰｒＤＮＡ断片）を上
記（段階Ｉａ）のようにして分離し、そして常法に従っ
てエタノールにより沈澱せしめる。沈澱を１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．０５ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含有する溶液に溶解する。
（ｃ） ＡｐＰｒＤＮＡ断片のｃＤＮＡ挿入部への連結 ＡｐＰｒ ＤＮＡ断片を含有する溶液及びｃＤＮＡ挿入
部を含有する溶液を一緒にする。混合物を１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ及び０．５ｍＭＡＴＰに調
整し、そして１５℃にて１２時間、３０Ｕ／μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（バイオラブス）と共にインキュベート
する。フェノール及びクロロホルムにより抽出した後、
混合物を１％低融点アガロースゲル（バイオラド）によ
り分画する。得られたＡｐＰｒ−ｃＤＮＡ断片を、次の
ようにして、ＰｓｔＩ（バイオブス）及びＥｃｏＲＩ
（バイオラブス）の両者により切断したｐＢＲ３２２の
大断片に連結する。ＡｐＰｒ−ｃＤＮＡ断片を含有する
ゲル片をｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片と混
合し、６５℃にて２分間溶融せしめ、３７℃に冷却し、
０．５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２に調整し、そして３０Ｕ／μｌのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（バイオラブス）と共に１５℃にて１２時間イ
ンキュベートする。１０分の１容量の１００ｍＭＴｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍｇＣａＣｌ２及び
１００ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する溶液を加え、溶液を
６５℃にて１０分間加熱することによりリガーゼを不活
性化し、そして３７℃に冷却する。次に、上記（段階
Ｄ）のようにして、溶液を加えてＣａ＋＋処理したＥ．
コリＨＢ１０１を形質転換し、そして１０μｇ／ｍｌの
テトラサイクリンを補給したマッコンキー寒天プレート
に接種する。形質転換したコロニーをＩＦＮ活性に関し
て選択する（段階Ｆ参照）。最高レベルのＩＦＮ活性を
供するクローンを選択し、これをＥ．コリＨＢ１０１Ｃ
Ｇ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１と称する。４
０，０００（ＩＵ／ｍｇ）の活性が見出され、もとのク
ローンであるＥ．コリＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／
ＨＬｙｃＩＦＮ−１′ｂに比べてて１３００倍強化され
ている。クローンＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−
α−１の組換プラスミドＤＮＡを、前記（段階３ｃ）と
同様にして培養物から分離し、そしてｃＤＮＡ挿入部
（ＩＦＮ遺伝子）及びβ−ラクタマーゼ制御領域のヌク
レオチド配列を確定することにより特徴付ける。結果を
第１６図に要約する。
（ＩＩ）組換プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩ
ＦＮ−α−３の形成 Ｅ．コリ ＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−８′１のＩＦＮ特異的蛋白質の収量を次のようにし
て改良する（第１７図参照）。
（ａ） β−ラクタマーゼ制御領域を含有するＤＮＡ断
片のＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１からの
調製 ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−１ＤＮＡ（１
００μｇ）をＨｉｎｄＩＩＩ（バイオラブス）及びＢｇ
ｌ ＩＩ（バイオラブス）により切断する。フェノール
抽出及びエタノール沈澱の後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ中シュークロ
ース密度勾配遠心分離（５〜２３％）により切り取った
ＤＮＡ断片を分離する。遠心分離はＴＳＴ６０ローター
（コントロンＡＧ）を用い、１５℃、５８，０００ｒｐ
ｍにおいて４時間行う。０．２ｍｌの分画を上記のよう
にして集める。小断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ）
を含有する分画を一緒にし、そして常法に従ってＤＮＡ
をエタノールにより沈澱せしめる。沈澱を、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）及び０．０５ｍＭＥＤ
ＴＡを含有する液８０μｌに溶解する。光学濃度の測定
により測定した場合１６μｇのＤＮＡが回収される。Ｄ
ＮＡ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ）（４μｇ）を
Ｓａｕ３Ａ（バイオラブス）により切断し、そして分解
生成物を、Ｔｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡ中６％ポリア
クリルアミドゲル上で前記のようにして分画する。ＤＮ
Ａ断片をＥｔＢｒ（０．５μｇ／ｍｌ）中で染色し、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｕ３Ａ ＤＮＡ断片（２３９ｂｐ）
を抽出し、そして前記のようにして分離する。常法に従
ってＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめる。沈澱を、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．０
５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液２０μｌに溶解する。
（ｂ） ｃＤＮＡ挿入部の調製 上記（段階Ｉａ）のようにして、組換プラスミドＣＧ−
ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８′１からｃＤＮＡ挿
入部を切り取る。ｃＤＮＡ挿入部（２μｇ）を１０μｇ
／ｍｌのＥｔＢｒ中２．５ＵのＳａｕ３Ａ（バイオラブ
ス）により分解し、そして３７℃にて６０分間インキュ
ベートする。分解物をフェノール抽出し、そして前記の
ようにしてＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめる。Ｄ
ＮＡ断片を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ硼酸、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミ
ドを含有する溶液中１．２％アガロースゲルにより分画
する。２番目に大きなＤＮＡ断片（Ｓａｕ ３Ａ−Ｐｓ
ｔＩ：６９３ｂｐ）をゲルから抽出し、そして段階Ｉａ
に記載した方法により精製する。ＤＮＡを１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．０５ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含有する液２０μｌに溶解する。
（ｃ） ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｕ ３Ａ ＤＮＡ断片の
ｃＤＮＡ挿入部（Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ）への連結 等量の両ＤＮＡ断片（〜５０ｎｇ）を、１０ｍＭ Ｍｇ
ｃｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ及び３０
Ｕ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（バイオラブス）を含
有する溶液中で１５℃にて３時間インキュベートする。
混合物を８０℃にて１５分間インキュベートし、そして
５０ｍＭ ＮａＣｌに調整する。ＤＮＡ混合物を、０．
５ＵのＰｓｔＩ（バイオラブス）及び１ＵのＨｉｎｄＩ
ＩＩ（バイオラブス）により３７℃にて２０分間分解す
る。ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈澱し、そ
して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び
０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液２０μｌに溶解
する。得られた混合物の半分を、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ、及び３
０Ｕ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（バイオラブス）を
含有する溶液中で、１５℃にて２時間、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔ Ｉ ＤＮＡ大断片
に連続する。溶液の１０分の１容量を用いて前記（段階
Ｄ）のようにしてＥ．コリＨＢ １０１ を形質転換す
る。形質転換されたコロニーを用いて前記（段階Ｆ参
照）のごとくＩＦＮ活性を試験する。最高レベルのＩＦ
Ｎ活性を供するクローンを選択し、これをＥ．コリＨＢ
１０１ ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３
と称する。ＩＦＮ活性は、上記（段階Ｆ）の方法により
測定する。７０，０００（ＩＵ／ｍｌ）の活性が認めら
れ、もとのクローンであるＥ．コリＨＢ １０１ ＣＧ
−ｐＢＲ３２２／ＨｌｙｃＩＦＮ−８′１と比べて７０
０倍強化されている。前記（段階Ｃｃ）のようにして、
培養物からクローンＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ
−α−３の組換プラスミドＤＮＡを分離し、そしてｃＤ
ＮＡ挿入部（ＩＦＮ遺伝子）及びβ−ラクタマーゼ制御
領域のヌクレオチド配列を確定することにより特徴づけ
る。結果を第１８図に要約する。プラスミドＣＧ−ｐＢ
Ｒ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−３の形成方法は、すべて
のα−ＩＦＮ ｃＤＮＡ遺伝子、又は適切に切り出され
た染色体α−ＩＦＮ遺伝子の場合にも一般的に使用する
ことができる。例えば、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（Ａ
Ｐ）／ＬｙＩＦＮ−α−３について記載したのと同様に
して、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ
−５１から出発してプラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／
ＬｙＩＦＮ−α−２が得られる。この新しいプラスミド
は、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５１のＤＮ
Ａ挿入部及びＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−
１からのβ−ラクタマーゼ制御部位を含有する。このよ
うにしてＥ．コリＨＢ １０１ ＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）
／ＬｙＩＦＮ−α−２と称するクローンが得られる。５
０，０００（ＩＵ／ｍｌ）のＩＮＦ活性が認められ、も
とのＥ．コリＨＢ１０１ ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙ
ｃＩＦＮ−５１に比べて５倍強化されている。プラスミ
ドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦＮ−α−２のｃＤＮ
Ａ挿入部及びβ−ラクタマーゼ制御部位のヌクレオチド
配列を前記の方法によって確定し、第１９図に示す。
（ＩＩＩ） 調製した微生物の寄託 例１０において前記のようにして調製した微生物及び組
換ＤＮＡ分子は、１９８１年９月１４日にＮＲＲＬ（Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、次の受け入れ
番号が付されている。
例 １１．Ｅ．コリ プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／
ＨＬｙｃＩＦＮ−１′ｂ及び−５１のリンパ芽球性ＩＦ
Ｎ−１′ｂ及びＩＦＮ−５１をコードする配列は、例５
及び６においてＩＦＮ−８′１について記載したのと同
様にしてプラスミドｐ３０（例４参照）にサブクローニ
ングすることができる。制限エンドヌクレアーゼＨａｅ
ＩＩＩを用いて部分分解する必要がある。こうして得ら
れた酵母雑種プラスミドがｐ３０ＩＦＮ２（１′ｂ）、
ｐ３０ＩＦＮ２′（１′ｂ）、ｐ３０ＩＦＮ２
（５１）、及びＰ３０ＩＦＮ２′（５１）である。こう
して得られた雑種プラスミドを使用して、例７に記載し
たのと同様にして、サッカロミセス・セレビシエーＲＨ
９７１を形質転換することができる。リンパ芽球ＩＦＮ
ｃＤＮＡ挿入部を有する雑種プラスミドを含有する次の
コロニーを選択することができる。
例 １２．例９に記載したのと同様にして、プラスミド
ｐ３０ＩＦＮ２（１′ｂ）、−（５１）、−
（８′１）、及びｐ３０ＩＦＮ２′（１′ｂ）、−（５
１）から出発して、それぞれ酵母雑種プラスミドｐＪＤ
Ｂ２０７／ＩＦＮ２（１′ｂ）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ
Ｎ２′（１′ｂ）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦＮ２
（５１）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦＮ２′（５１）、及び
ｐＪＤＢ２０７／ＩＦＮ２（８′１）が得られる。これ
らのプラスミドは、ロイシン原栄養性コロニーを選択す
ることによりＳ．セレビシエＲＨ９７１に形質転換する
ことができる。リンパ芽球ＩＦＮｃＤＮＡ挿入部を有す
る雑種プラスミドを含有する次のコロニーが得られる。
例 １３．ＰＨＯ５プロモーター及びＰＨＯ５転写停止
信号を含有する発現プラスミドの形成 （ａ） プラスミドｐ３０中のＥｃｏＲＩ制限部位の除
去 第２０〜２２図に概略を示す方法においては、プラスミ
ド ｐ３０ 中のユニークＥｃｏＲＩ制限部位を除去す
る必要がある。５μｇの ｐ３０ ＤＮＡ（例４参照）
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）
により完全に分解する。生成した接着末端を満たすため
に、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、０．
２５ｍＭｄＡＴＰ及び０．２５ｍＭ ｄＴＴＰを含有す
る溶液５０μｌ中１μｇのＥｃｏＲ Ｉ分解ｐ３０を、
１ＵのＤＮＡポリメラーゼ〔クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）
大断片、ＢＲＬ〕と共に、３７℃にて３０分間インキュ
ベートする。エタノール沈澱により回収したＤＮＡを常
法に従って連結し、そして、例４に記載したのと同様に
して受容能力を有するＥ．コリＨＢ１０１の形質転換に
使用する。ＥｃｏＲＩ分解に耐性を有するコロニーをｐ
３０／ＥｃｏＲＩＲと称する。
（ｂ） ０．３７ｋｂ Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩＰＨＯ５
転写停止断片の分離 ＰＨＯ５ 転写はＳＩヌークレアーゼマッピングによりす
でにマップされている（４８）。転写停止信号はＰＨＯ
５遺伝子の０．３７ｋｂ Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片に
位置することがすでに示されている。Ｓａｕ３Ａ−Ｐｓ
ｔＩ断片のヌクレオチド断片を第２１図に示す。５μｇ
のｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５，ＰＨＯ３ＤＮＡ（例２参
照）を制限エンドヌクレアーゼ Ｓａｕ３Ａ及びＰｓｔ
Ｉにより完全に分解する。制限断片を、ＴＢＥ緩衝液中
垂直の１．５％低融アガロースゲルにより分離する。
０．３７ｋｂ Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片の位置をエチ
ジウムブロミドにより決定し、そしてこのＤＮＡ断片を
含有するできるだけ小さいゲル片を切り取る。
（ｃ） Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩＰＨＯ５断片のＭ１３ｍ
ｐ９へのクローニング Ｍ１３ｍｐ９フアージＤＮＡは、１群のユニーク制限部
位を有する有用なクローニングベクターである（４
９）。５μｇのＭ１３ｍｐ ９ＤＮＡを、制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩを用いて完全に分解
する。７．２ｋｂＤＮＡ断片を、０．８％低融アガロー
スゲル上で非常に小さい断片（８ｂＰ）から分離する。
大ＤＮＡ断片を含有するゲル片をゲルから切り取る。ｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５，ＰＨＯ３の０．３７ｋｂＳａ
ｕ３Ａ−ＰｓｔＩ断片（例１３ｂ参照）を有するゲル
片、及びＭ１３ｍｐ９の７．２ｋｂＢａｍＨＩ−Ｐａｔ
Ｉ断片を有するゲル片を６５℃にて液化し、およそ同量
ずつ混合し、そして水で稀釈することによりアガロース
の濃度を０．３％に低下せしめる。６０ｍＭＴｒｉｓ・
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ及び６００ＵのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（バイオラブス）を含有する溶液２００μｌ中で
連結を行う。ニユーイングランド、バイオ・ラブスによ
り発表された「Ｍ１３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮ
Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ」 を有する細胞の形質導入を行う。多数の白色プラクから
のファージを増殖せしめ、そして制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いて切断することによ
り、これらのＤＮＡ挿入部の大きさを分析する。Ｓａｕ
３Ａ−ＰｓｔＩＰＨＯ５転写停止断片を含有するＭ１３
ｍｐ９誘導クローンを分離し、そしてこれをＭ１３ｍｐ
９／ＰＨＯ５（Ｓａｕ３Ａ−Ｐｓｔ１）と称する。
（ｄ） ＰＨＯ５転写停止断片のｐ３０／ＥｃｏＲＩＲ
へのクローニング ファージＭ１３ｍｐ９にクローニングされたもとのＰＨ
Ｏ５転写停止断片〔Ｍ１３ｍｐ９／ＰＨＯ５（Ｓａｕ
３Ａ−ＰｓｔＩ）〕を、ＨａｅＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片として、Ｂａｌ Ｉ 及びＨｉｎｄＩＩＩにより切
断されたプラスミドｐ３０／ＥｃｏＲＩＲに再クローニ
ングする。Ｍ１３ｍｐ９／ＰＨＯ５（Ｓａｕ ３Ａ−Ｐ
ｓｔＩ）ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨａｅＩＩＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩにより完全に切断する。生成する２
つのＤＮＡ断片を、ＴＢＥ緩衝液中垂直の１．５％低融
アガロースゲルにより分離する。０．３９ｋｂの断片を
ゲルから切り取ったゲル片中に分離する。ｐ３０／Ｅｃ
ｏＲＩＲＤＮＡをＢａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて
分離する。大きな３．９８ｋｂ断片を、ＴＢＥ緩衝液中
０．８％低融アガロースゲルにより分離し、そしてＤＮ
Ａ断片を含有するゲル片を切り取ることにより分離す
る。０．３９ｋｂ ＨａｅＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＰＨ
Ｏ５転写停止断片を有するゲル片、及びｐ３０／Ｅｃｏ
ＲＩＲの３．９８ｋｂＢａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
有するゲル片を６５℃にて溶融し、そしておよそ同量ず
つ混合する。例４に記載したようにして、連結及び受容
能力を有するＥ．コリ ＨＢ １０１細胞の形質転換を
行う。形質転換された細胞のＤＮＡをＢａｌＩ及びＨａ
ｅＩＩＩにより切断する。ＰＨＯ５転写停止断片を含有
するクローンをさらに分析し、そしてｐ３１と称する
（第２０図参照）。発現プラスミドｐ３１はＰＨＯ５プ
ロモーター領域、ＰＨＯ５信号配列の一部分及びこれに
隣接するＰＨＯ５転写停止信号伴うＤＮＡ断片を含有す
る。このベクター中で発現すべき外来性コード配列は、
プロモーターと転写停止信号配列との間に便利に挿入す
ることができる。例 １４． リンパ芽球インターフェロン−５１ＤＮＡ
のプラスミドｐ３１への挿入（第２２図） （ａ） プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−５１のＨａｅＩＩＩ−Ｈｐａ Ｉ断片の分離 Ｅ．コリ ＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−５１株（例１０Ｅ参照）を、１０μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを保給したＬＢ培地１００ｍｌに増殖せし
め、そして例２に記載した方法によりプラスミドＤＮＡ
を分離する。１０μｇのＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃ
ＩＦＮ−５１、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉ及びＨｐａ Ｉにより完全に分解する。制限断片を調
製用０．８％低融アガロースゲルにより分離する。ＩＦ
Ｎ−５１をコードする配列を含有する約８６０ｂｐのＰ
ｓｔＩ−Ｈｐａ Ｉ断片をゲルから切取り、そして例４
ａに記載した方法によりアガロースゲルから溶出し、そ
して例５ａに記載した方法によりＤＥ５２イオン交換ク
ロマトグラフィーにより精製する。ＰｓｔＩ−Ｈｐａ
Ｉ断片は、ＩＦＮ−５１コード配列中のＡＴＧから４
１、６５及び１４６位に３個のＨａｅＩＩＩ部位を有す
る。ＨａｅＩＩＩによる部分分解により６９９ｂｐ、７
８０ｂｐ及び８０４ｂｐの３個のＨａｅＩＩＩ−Ｈｐａ
Ｉ断片が生ずる。３つの断片のすべてがおよそ等量ず
つ生ずるように注意深くＨａｅＩＩＩ分解を行う。断片
の混合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱し、そし
て１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）溶液に０．１ｍｇ／ｍｌ
の濃度で再懸濁する。
（ｂ）ＢａｌＩで切断され脱燐酸されたプラスミドｐ３
１の調製 ６μｇのｐ３１ＤＮＡ（例１３ｄ参照）を制限エンドヌ
クレアーゼＢａｌ Ｉ（ＢＲＬ）により完全に分解す
る。フェノール抽出及びエタノール沈澱を行った後、Ｄ
ＮＡを１００μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．
０）に再溶解し、そしてシリコンパスツールピペット中
５０μｌのベッドの平衡化ケレックス（Ｃｈｅｌｅｘ）
１００（ビオラドに通す。流過液及びその後の４５０μ
ｌの洗浄液を一緒にする。０．４Ｕの子牛腸アルカリホ
スファターゼを加える。３７℃にて１時間インキュベー
トした後、６５℃にて１．５時間酵素を不活性化する。
インキュベーション混合物中のＮａＣｌ濃度を１５０ｍ
Ｍに調整する。線状化され脱燐酸化されたｐ３１ＤＮＡ
をＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィー（例５ａ参
照）により精製する。エタノール沈澱の後、ＤＮＡを１
０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中に０．３ｍｇ／ｍｌ
の濃度で再懸濁する。
（ｃ） 線状化され脱燐酸化されたｐ３１ＤＮＡのＩＦ
Ｎ−５１ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ−ＨｐａＩ断片への連結 ＢａｌＩにより切断された脱燐酸化ｐ３１ベクターＤＮ
Ａ ０．６μｇをＩＦＮ−５１ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ−
Ｈｐａ Ｉ部分分解断片（例１４ａ参照）０．５μｇに
連結する。連結は、６０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、
１０ｍｇ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭＡＴ
Ｐ及び３００ＵのＴ４ＤＮＡアーゼ（バイオラブス）を
含有する溶液１０μｌ中で室温にて一夜行う。連結混合
物の１μｌのアリコートをカルシウム処理された形質転
換能を有するＥ．コリＨＢ１０１細胞５０μｌに加え
る。形質転換は例４ａに記載した方法に従って行う。形
質転換されたａｍｐＲコロニーを、それぞれ別別に、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で増
殖せしめる。ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ）等の方法（５
０）に従ってプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限エ
ンドヌクレアーゼＢｓｔＩＩ（ＰＨＯ５プロモーター中
に１個のユニーク部位を有する）を用いて分解すること
により分析する。ＩＦＮ−５１挿入部を含有するクロー
ン２０個を、ＢｓｔＩＩ−ＥｃｏＲＩによる二重分解に
よりさらに分析することにより挿入部の方向及び大きさ
を決定する。正しい方向の挿入部を有する８個のクロー
ンにおいて、３種類すべての期待される大きさの挿入部
が見出される。この大きさは、ＩＦＮ−５１遺伝子（例
１４ａ参照）のＨａｅＩＩＩによる部分分解により生ず
る３種のＨａｅＩＩＩ１〜３−ＨｐｅＩ断片に相当す
る。これらのクローンをｐ３１／ＩＦ１（５１）、ｐ３
１／ＩＦ２（５１）及びｐ３１／ＩＦ３（５１）と称
し、それぞれＩＦＮ−５１挿入部の８０４ｂｐ（Ｈａｅ
ＩＩＩ１−ＨｐａＩ挿入部）、７８０ｂｐ（ＨａｅＩＩ
Ｉ２−ＨｐａＩ）及び６９９ｂｐ（ＨａｅＩＩＩ３−Ｈ
ｐａＩ）を有する。例 １５ ． リンパ芽球性インターフェロン１′ｂＤＮ
Ａのプラスミドｐ３１への挿入（第２２図参照） （ａ） プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ−１′ｂのＨａｅＩＩＩ−ＲｓａＩ断片の分離 １０μｇのＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＮＦ−１′
ｂＤＮＡ（例１０Ｅ参照）を制限エンドヌクレアーゼＰ
ｓｔＩ及びＲｓａ Ｉにより分解する。制限断片を０．
８％低融アガロースゲルにより分離する。約８７０ｂｐ
のＰｓｔＩ−Ｒｓａ Ｉ断片をゲルから分離し、そして
前記の方法（例１４ａ）により精製する。Ｐｓｔ１−Ｒ
ｓａ１断片は、ＩＦＮ−１′ｂコード配列のＡＴＧから
１３、３７及び１１８位に３つのＨａｅＩＩＩ部位を含
有する。ＨａｅＩＩＩによる部分分解によりそれぞれ７
３５ｂｐ、８１６ｂｐ及び８４０ｂｐのＨａｅＩＩＩ−
Ｒｓａ Ｉ断片が生ずる。断片の混合物をフェノール抽
出及びエタノール沈澱し、そして０．１ｍｇ／ｍｌの濃
度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁す
る。
（ｂ） 線状化され脱燐酸されたｐ３１ＤＮＡの、ＩＦ
Ｎ−１′ｂＤＮＡのＨａｅＩＩＩ−ＲｓａＩ断片への連
結 ＢａｌＩにより切断され脱燐酸されたｐ３１ベクターＤ
ＮＡ（例１４ｂ参照）０．６μｇを、ＩＦＮ−１′ｂＤ
ＮＡのＨａｅＩＩＩ−ＲｓａＩ部分分解断片０．５μｇ
に連結する。連結操作、連結混合物による受容能力を有
するＥ．コリＨＢ１０１細胞の形質転換、及び形質転換
されたａｍｐＲコロニーの選択を、例１４ｃに記載した
方法により行う。プラスミドＤＮＡを、ホルメス等（５
０）の方法に従って調製し、そして制限エンドヌクレア
ーゼＢｓｔＥＩＩによる分解によって分析する。ＩＦＮ
−１′ｂ挿入部を含有する７つのクローンをＢｓｔＩＩ
−ＰｖｕＩＩを用いる二重分解により分析する。２つの
クローンが正しい方向のＨａｅＩＩＩ２−ＲｓａＩ断片
（８１６ｂｐ）を含有することが示される。この構成を
ｐ３１／ＩＦ２（１′ｂ）と称する。例 １６ ． リンパ芽球性インターフェロン−８′１Ｄ
ＮＡのプラスミドｐ３１への挿入（第２３図参照） （ａ） プラスミドｐ３１ＩＦＮ１（８′１）の１．４
６ｋｂのＳａｌＩ−ＥｃｏｌＩ断片の分離 ５μｇのｐ３０ＩＦＮ１（８′１）ＤＮＡ（例５ｄ参
照）を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩ及びＥｃｏＲ
Ｉにより分解する。ＩＦＮ−８′１の蛋白質コード領域
に連結されているＰＨＯ５プロモモーターを含有する
１．４６ｋｂ Ｓａｌ Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片を、０．８
％低融アガロースゲルにより分離する。エチジウムブロ
ミド染色によりＤＮＡバンドの位置を決定し、そしてゲ
ルを切り取る。
（ｂ） プラスミドｐ３１の３．５ｋｂＳａｌＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片の分離 ５μｇのＰ３１ＤＮＡ（例１３ｄ参照）を、制限エンド
ヌクレアーゼＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩを用いて完全分解
する。ＰＨＯ５転写停止配列を含有する３．５ｋｂベク
ター断片を、０．８％低融カガロースゲルにより分離
し、そしてＤＮＡバンドを切り取る。
（ｃ） ｐ３１の３．５ｋｂＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片
へのｐ３０ＩＦＮ１（８′１）の１．４６ｋｂＳａｌＩ
−ＥｃｏＲＩ断片の連結 ｐ３１の３．５ｋｂＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片０．６７
μｇを含むゲル片、及びｐ３０ＩＦＮ１（８′１）の
１．４６ｋｂＳａｌ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片０．５μｇ
を含むゲル片を使用して、２４０μｌ中で、例４ａの方
法により１５℃にて一夜連結する。１０μｌの連結混合
物を用いて受容能力を有するＥ．コリＨＢ１０１細胞を
形質転換する。形質転換されたａｍｐＲコロニーをそれ
ぞれ別々に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
るＬＢ培地に増殖せしめる。ホルメス等（５０）の方法
によりプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限エンドヌ
クレアーゼＢｓｔＥＩＩ（ＰＨＯ５プロモーター中に１
個のユニーク部位を有する）を用いて分解することによ
り分析する。ＩＦＮ−８′１挿入部を含有する多くのコ
ロニーを、ＢｓｔＥＩＩ−ＰｖｕＩＩを用いる二重分解
により分析する。これらはすべて１．４６ｋｂＳａｌＩ
−ＥｃｏＲＩ断片を含有する。これらの同一コロニーを
ｐ３１／ＩＦ（８′１）と称する。例 １７ ． 遺伝子構成物の高コピー数酵母ベクターｐ
ＪＤＢ２０７へのサブクローニング 例１４〜１６に記載した構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ）はＰＨＯ５プロモーター、種々のインターフェロ
ンコード領域及びＰＨＯ５転写停止信号を縦列的（ｔａ
ｎｄｅｍａｒｒａｙ）に含有し、すベてｐＢＲ３３２誘
導ベクターに挿入されている。酵母において発現せしめ
るために、全挿入部を、ロイシン原栄養性コロニーを選
択しながら（例９及び第６図参照）酵母ベクターｐＪＤ
Ｂ２０７（２８）にサブクローニングする。ｐ３１／Ｉ
Ｆ（８′１）ＤＮＡ、ｐ３１／ＩＦ１（５１）ＤＮＡ、
ｐ３１／ＩＦ２（５１）ＤＮＡ、ｐ３１／ＩＦ３
（５１）ＤＮＡ、及びｐ３１／ＩＦ２（１′ｂ）ＤＮＡ
のそれぞれ２μｇを制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩにより分解する。制限断片を調製用
０．８％低融アガロースゲルにより分離する。各分解物
の小断片（〜２ｋｂの大きさ）を含むゲルを切取る。１
０μｇのｐＪＤＢ２０７ＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより分解する。大きな
６．２ｋｂ断片を調製用０．８％低融アガロースゲルに
より分離する。ＤＮＡ断片を含有するゲル片を６５℃に
て液化し、そして水によりアガロースの濃度が約０．３
％になるまで稀釈する。プラスミドｐ３１／ＩＦ（８′
１）、ｐ３１／ＩＦ１（５１）、ｐ３１／ＩＦ２
（５１）、ｐ３１／ＩＦ３（５１）、及びｐ３１／ＩＦ
２（１′ｂ）の各２ｋｂ ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を等モル量のｐＪＤＢ２０７の６．２ｋｂＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＳａｌＩ断片と混合する。１００μｌ中１５℃に
て４時間連結を行う。１０μｌずつの各連結混合物を用
いて、例４ａに記載した方法に従って、受容能力を有す
るＥ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換する。各実験から
の複数個ずつのａｍｐＲコロニーを、それぞれ別々に、
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に
増殖せしめる。プラスミドＤＮＡの挿入部の大きさを、
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａ１Ｉ
を用いて切断することにより分析する。正しい挿入部を
有するコロニーをｐＪＤＢ２０７／ＩＦ（８′１）ｐＪ
ＤＢ２０７／ＩＦ１（５１）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２
（５１）（第２７図参照）、及びｐＪＤＢ２０７／ＩＦ
２（１′ｂ）と称する。
の形質転換及びインターフェロン生産の誘導 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ（８′１）ｐＪＤＢ２
０７／ＩＦ１（５１）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２
（５１）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ３（５１）及びｐＪＤ
Ｂ２０７／ＩＦ２（１′ｂ）のそれぞれを、サッカロミ
セス・セレビシエーＡＨ２２０株（ａ，ｔｒｐ１，ｌｅ
ｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３，ｐｈｏ５，ｐ
ｈｏ３）に導入する。この場合、ヒンネン等（１）に記
載されている形質転換法を用いる。形質転換された酵母
細胞を、ロイシンを含まない酵母最少培地プレート上で
選択する。単離された形質転換酵母コロニーを拾い上
げ、例７に記載した方法により増殖せしめる。それぞれ
の酵母コロニーを次のように称する。
例１９ 酵母細胞抽出物の調製及びインターフェロン力
価の測定 例８に記載した方法に従って細胞抽出物を調製し、そし
てインターフェロン力価を測定する。結果を第３表に示
す。
例２０． 酵母ＰＨＯ５プロモーターの制御下における
肝炎Ｂウイルス表面（ＨＢＶｓ）抗原の発現 （ａ） ＰＨＯ５プロモータとＨＢＶｓ蛋白質コード領
域との間の融合の形成 プラスミドｐＨＢＶ １３０（５１）のＤＮＡ ５μｇ
を、供給者（ニューイングランド、バイオラブス）の推
奨する方法に従って、制限エンドヌクレアーゼＡｖａＩ
により分解する。ＨＢＶｓの完全な蛋白質コド領域（２
７塩基対のポテンシャルプレＨＢＶｓ配列を含む）を含
む１３３６塩基対（ｂｐ）の断片を得る〔参考文献（５
１）の第２図を参照のこと：ＡｖａＩ断片はＸｈｏ部位
から、表面コード領域とバコード領域の間に位置するＢ
ａｍＨＩ部位を６２塩基対越えてＡｖａＩ部位までのＤ
ＮＡ部分にわたる〕。１３３６ｂｐ断片を、例４ａに記
載する方法に従って、軟アガロース電気泳動（０．８％
アガロースゲル）により精製する。５μｇのプラスミド
ｐＢＲ ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｓａｌ（第１図参
照）を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩ及びＡｖａ Ｉ
（ｐＢＲ３２２の１４２４位）により切断し、そしてこ
うして生成した、ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｓａｌ部分と共にｐ
ＢＲ３２２配列を含有する。３．９ｋｂのベクター断片
を、前記の軟アガロース電気泳動により精製する。１μ
ｇの１３３６ｂｐ断片を、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ及び６００ＵのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（バイオラブス）を含有する溶液５０μｌ中で、１５
℃にて４時間、３μｇの３．９ｋｂベクター断片に連結
する。Ｅ．コリＨＢ１０１のアンピシリン耐性への形質
転換及びプラスミドの分離を、例４ａに記載した方法に
従って行う。プラスミドの正しい構造を制限分析により
確認する。こうして形成した新規なプラスミドをｐＢＲ
３２２／ＰＨＯ５／ＨＢＶｓと称する（第２４図参
照）。
質コード領域への調整 前記の融合により第２５図に示すＤＮＡ配列が生ずる。
配列データは第３図（ＰＨＯ５）及びパセク（Ｐａｓｅ
ｋ）等（５２；ＨＢＶｓ）から得られる。ｍＲＮＡ開始
部位は、ｐＢＲ３２２／ＨＯ５ Ｂａｍ−Ｓａｌ（第１
図）を用いて常用のＳ１マッピング（４８）により決定
する。ｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５／ＨＢＶｓ中に存在する
ＰＨＯ５蛋白質コード領域を除去するために、５μｇの
プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉにより
分解し（供給者、ニューイングランド、バイオラブスに
より特定された条件において）、線状プラスミドを生成
せしめる。４μｇの線状化プラスミド、１Ｕのエキソヌ
クレアーゼＢａ１３１ （ベセスダ リザーチ ラボラ
トリー）を用いて、１２ｍＭ ＣａＣｌ２，１２ｍＭ
ＭｇＣｌ２， ３００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．１）を含有する全量
１００μｌの溶液中で、３０℃にて４５秒間分解する。
前記の方法によるフェノール抽出により反応を停止せし
める。エタノール沈澱の後、ＤＮＡを５０μｌのＴＥに
再懸濁する。１μｇのＤＮＡを、２０μｌの容積中で、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再環化する（条件について
は例４ａを参照）。Ｅ．コリＨＢｌ０１をアンピシリン
耐性に形質転換した後（例４ａ参照）、プラスミドＤＮ
Ａを前記のようにして分離し、そして各プラスミド標品
につきＨａｅＩＩＩ，ＰｓｔＩ，ＢｓｔＥＩＩ及びＨｈ
ａＩを用いて制限分析を行う。この分析に続き、Ｈｈａ
Ｉ部位の存在（ＨＢＶｓ蛋白質コード領域の出発点の前
６ｂｐ）を決定し、そして除去された大きさを測定す
る。連結領域のＤＮＡ配列を、マクサム及びジルバート
（１５）の方法（部位−３７４のＢｓｔＥ ＩＩ部位に
おける放射能ラベルによる、第３図参照）を用いて決定
する。プラスミドの１つに生じた除去部の終点を第２４
図に示す。このプラスミドをｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５／
ＨＢＶｓΔ１４と称する。
ｐＪＤＢ２０７への導入（第２６図） プラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５ＨＢＶｓΔ１４のＤ
ＮＡ５μｇを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（ニ
ューイングランド、バイオラブス、供給者が記載した条
件による）により分解する。例４ａに記載した方法によ
り軟アガロースゲル電気泳動法（０．８％アガロース）
を用いて１．８ｋｂＢａｍＨ Ｉ断片を調製する。２μ
ｇの酵母ベクターｐＪＤＢ ２０７を同じ酵素により分
解する。１μｇの分解されたｐＪＤＢ２０７と１μｇの
１．８ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ制限断片を、全容２０μｌに
おいて例２０ａに記載した条件を用いて連結する。Ｅ．
コリＨＢ１０１のアンピシリン耐性への形質転換を、前
記（例４ａ）の方法に従って行う。各プラスミドをＢａ
ｍＨ Ｉ制限分析により分析し、そして挿入されたＢａ
ｍＨ Ｉ断片の方向をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ二
重分解により決定する。第２図に形成方法を示す。第２
６図に示した方法により得られたプラスミドをｐＪＤＢ
２０７／ＰＨＯ５／ＨＢＶｓΔ１４と称する。例７に記
載した方法によりプラスミドを酵母ＡＨ２２０株に形質
転換する。例７に記載した方法に従って、形質転換され
た酵母細胞を選択し、液体培地にインキユベートレ、そ
して抑制解除条件下で増殖せしめる。１つの形質転換酵
母コロニーをサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２０
／ｐＪＤＢ２０７／ＨＢＶｓΔ１４と称する。例８の方
法に従って細胞抽出物を調製し、アボット（Ａｂｂｏｔ
ｔ）の放射免疫測定法（５１）を用いて、生産されたＨ
ＢＶｓ蛋白質の量を測定する。酵母により生産されたＨ
ＢＶｓ抗原がヒト−血清中の抗原と同様に反応すると仮
定して、抑制解除条件下で酵母抽出液ｍｌ当り約２μｇ
のＨＢＶｓ抗原が見出される。抑制条件下では力価が
０．００１μｇ／ｍｌより低い。
スミドへのＰＨＯ５−ＨＢＶｓ融合物の導入 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ（８´１）（例１７）
のＤＮＡ５μｇを、前記のようにしてＢａｍＨＩにより
分解し、そして例４ａに記載した方法により軟アガロー
ス電気泳動法（０．８％アガロース）を用いて６．９ｋ
ｂベクター部分を分離する。５μｇのｐＢＲ３２２／Ｐ
ＨＯ５／ＨＢＶｓΔ１４を前記のようにしてＢａｍＨＩ
により分解し、そして軟アガロースゲル電気泳動法によ
り１．８μｂ ＢａｍＨＩ断片を分離する。１μｇの
６．９ｋｂベクター断片を、全容２０μｌにおいて２０
ａに記載した条件を用いて、１μｇの１．８ｋｂＢａｍ
ＨＩ断片と連結する。例４ａに記載した方法に従って、
Ｅ．コリＨＢ１０１のアンピシリン耐性への形質転換、
及びプラスミドの分離を行う。制限エンドヌクレアーゼ
分解によりプラスミドの分析を行う。第２６図に示す方
法により得られたプラスミドをｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ
５／ＨＢＶｓΔ１４ｔと称する。例７に記載した方法に
従って、酵母ＡＨ ２２０の形質転換、及び形質転換さ
れた細胞の選択を行う。単一の形質転換酵母コロニーを
サッカロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２
０７／ＨＢＶｓΔ１４ｔと称する。例２１． ヨーロッパ特許出願第１３８２８号に記載され
ている次のプラスミド、 から切り出された肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ配列
を、例５，１４又は１５に記載した方法に従ってプラス
ミドｐ３０又はｐ３１に挿入し、そして次に例１７に記
載した方法に従ってプラスミドｐＪＤＢ２０７に挿入す
ることができる。Ｓ・セレビシエーの形質転換は例１８
の方法に従って行う。ＨＢＶ抗原性を有するポリペプチ
ドの発現を例２０ｃの方法に従って行う。例２２ プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）及
びｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（１´ｂ）中の３´非翻訳Ｄ
ＮＡ配列の除去（第２７及び２８図） プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）及びｐＪＤ
Ｂ２０７／ＩＦ２（１´ｂ）（例１７参照）の形成にお
いて、それぞれ約４４０ｂｐ及び４８０ｂｐの比較的長
い３´非翻訳領域が生ずる。構成物のこの領域を短縮す
るために、エキソヌクレアーゼＢａｌ１３１を用いて、
この領域の中央に存在するユニークＳｍａＩ部位からＤ
ＮＡを分解する。Ｘｈｏリンカーを導入し、そして連結
によりＤＮＡを環化する。
（ａ） ＳｍａＩ で切断されたプラスミドｐＪＤＢ２
０７／ＩＦ２（５１）及びｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２
（１′ｂ）Ｂａ１３１分解 ２０μｇずつのプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼＳｍａＩにより分解する。フエノール／クロロホル
ムにより抽出した後、エタノールによりＤＮＡを沈澱せ
しめる。ＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ
８．０）中に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁する。１
０μｇずつのＳｍａＩにより切断されたＤＮＡを、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２ｍＭ ＣａＣｌ２、及
び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液１００μｌ中で、２
ＵのエンドヌクレアーゼＢａ１３１（ＢＲＬ）を用いて
分解する。３０℃にてインキュベーション中の９０秒、
１２０秒、１５０秒及び１５０秒後に３μｇのＤＮＡの
アリコートを取り出し、そしてただちに５０μｌのフエ
ノール及び６０μｌのＴＮＥと混合する。フエノール／
クロロホルムによる抽出及びエタノール沈澱の後、ＤＮ
Ａを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に１００μｇ／
ｍｌの濃度に再懸濁する。Ｂａ１３１のエキソヌクレオ
チド分解物を分析するため、各時点におけるＤＮＡのア
リコート０．７μｇを、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２
（５１）誘導試料についてはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲ
Ｉにより、又はｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（１´ｂ）誘導
試料についてはＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより分解
する。以後の実験のために９０秒時点でのＤＮＡを使用
する。
（ｂ） Ｂａ１３１処理ＤＮＡへのＸｈｏＩリンカーの
付加 それぞれ２．２μｇずつのプラスミドＤＮＡｐＪＤＢ２
０７／ＩＦ２（５１）及びｐＪＢ２０７／ＩＦ２（１´
ｂ）を９０秒間Ｂａ１３１分解（例２２ａ参照）した
後、６０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、及び０．１ｍＭ ｄＮＴＰ′を含有する溶液３５
μｌ中で、３７℃にて１時間２．８Ｕのクレノウ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）ＤＮＡ ポリメラーゼ（ポリメラーゼ１の大
断片、ＢＢＬ）と共にインキュベートする。３μｇのＸ
ｈｏＩリンカー（５´−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３′、コラ
ボラティブリサーチ）を、６ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＤＴＴ、０．５
ｍＭ ＡＴＰ及び３５ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（ベーリンガー）を含有する溶液５０μｌ中で、３７
℃にて３０分間キナーゼ処理する。キナーゼ処理した
０．６７μｇのＸｈｏＩリンカーと、プラスミドｐＪＤ
Ｂ２０７／ＩＦ２（５１）又はｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２
（１´ｂ）のＢａ１３１処理された平滑末端を有するＤ
ＮＡ ０．４μｇとを、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．
５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、３．５ｍ
Ｍ ＡＴＰ及び４５０ＵのＴ ４ ＤＮＡリガーゼを含
有する溶液２５μｌ中で、室温にて一夜連結処理する。
連結されたＤＮＡを、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．５４容量のイソプ
ロパノールの存在下でイソプロパノール沈澱することに
より過剰のリンカーから分離する。室温で３５分間イン
キュベートした後、ＤＮＡを遠心沈降せしめる。ペレッ
トを空気乾燥し、そして６ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２及び
６ｍＭ メルカプトエタノールを含有する溶液１７μｌ
中に再懸濁する。ＤＮＡに連結されたＸｈｏＩリンカー
をＸｈｏＩで切断し、前記のようにしてＤＮＡをイソプ
ロパノールで沈澱せしめ、そして連結により環化する。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ及び６００Ｕ
のＴ４−ＤＮＡ リガーゼを含有する溶液５０μｇ中で
１５℃にて６時間連結した後、各連結混合物を１００μ
ｌのカルシウム処理され形質転換可能なＥ．コリＨＢ１
０１細胞に加える。ＩＦＮ−５１挿入部を有するプラス
ミドを含有する形質転換されたａｍｐＲコロニー７２個
を、それぞれ別々に、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを
含有するＬＢ培地に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを
ＨａｅＩＩＩ分解により分析する。制限パターンにより
Ｂａ１３１により行われた除去のおよその大きさを判断
することができる。２つのクローンをさらに分析し、そ
してインターフエロン活性を測定する。これらをｐＪＤ
Ｂ２０７／ＩＦ２（５１）Δ７２、及びｐＪＤＢ２０７
／ＩＦ２（５１）Δ８２と称する。ＩＦＮ−５１遺伝子
の３′非翻訳領域とＰＨＯ５転写停止領域の間の新しい
連結（Ｘｈｏ Ｉリンカー）の両側のヌクレオチド配列
を第２８図に示す。同様にして、ＩＦＮ−１´ｂ挿入部
を有するプラスミドを含有するａｍｐＲコロニー６０個
を、それぞれ別々に、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを
含有するＬＢ培地に増殖せしめる。１つのクローンを選
びそしてＩＦＮ活性について測定する。これをｐＪＤＢ
２０７／ＩＦ２（１´ｂ）Δ と称する。例２３ 成熟リンパ芽球性ＩＦＮを直接発現するために
使用することができるポータブルＩＦＮ−５１−８´１
及び−１´ｂｃＤＮＡを含有する組換プラスミドの形成
（第２９及び３０図） （ａ） ｃＤＮＡ挿入部の調製 組換プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−
８´１ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１´ｂ、
ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５１のプラスミ
ドＤＮＡ１５０μｇずつを、ＰｓｔＩ（バイオラブス）
を用いて供給者により示唆された条件下で分解すること
によりｃＤＮＡ挿入部を切り出す。フエノール抽出及び
エタノール沈澱の後、切り出した挿入部を、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ
中シュークロース密度勾配遠心（５〜２３％）により分
離する。遠心分離はＴＳＴ４１ローター（コントロンＡ
Ｇ）を用いて１５℃、３５，０００ｒｐｍにて１６時間
行う。ＩＳＣＯ勾配コレクターを用いて、１ｍｌ／分に
おいて０．３ｍｌずつの分画を集める。小断片（すなわ
ち挿入部）を含有する分画を一緒にする。常法に従って
エタノールによりＤＮＡを沈澱せしめ、そしてＨＢ−４
ローター（ソルバル）を用いて０℃、１０，０００ｒ
ｐｍにて１０分間遠心分離することにより沈澱を集め
る。沈澱を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液６０μｌに
再溶解する。光学濃度の測定により測定したＤＮＡの回
収量は３０μｇである。各ｃＤＮＡ挿入部２μｇずつ
を、１０μｇ／ｍｌＥｔＢｒ中２．５ＵのＳａｕ３Ａ
（バイオラブス）により分解し、そして３７℃にて６０
分間インキュベートする。前記のようにして分解物をフ
エノール抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。
ＤＮＡ断片を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ硼酸、１
ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロ
ミドを含有する溶液中１．２％アガロースゲルにより分
画する。３つの各分解物からの２番目に大きいＤＮＡ断
片（Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ）をゲルから切り出し、注射
器の小針を通して、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭＴ
ｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含
有する溶液５ｍｌに注入し、そして一夜振とうすること
により溶出する。溶出液を、１００μｌのＤＥ−５２
（ワットマン）パスツール−ピペットカラムに通してＤ
ＮＡを吸着せしめる。カラムを同じ緩衝液２ｍｌで洗浄
し、そして１．５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液４
００μｌにより溶出する。ＤＮＡを、２容量のエタノー
ルを用いて−２０℃にて一夜沈澱せしめる。エッペンド
ルフ遠心分離機により遠心分離することにより沈澱を集
め、そして１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、
０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０μｌの溶液中に
再溶解する。
（ｂ） 受容プラスミドＤＮＡ断片の調製 （１） ＥｃｏＲＩ及びＳ１によるプラスミドｐＢＲ３
２２の分解 １０μｇのプラスミドＤＮＡｐＢＲ３２２を１５ＵのＥ
ｃｏＲＩ（バイオラブス）を用いて３７℃にて６０分
間、供給者により記載された条件の下で分解する。フエ
ノール抽出及びエタノール沈澱の後、ＤＮＡを２５μｌ
の水に再溶解し、そしてＤＮＡを、２５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、３０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１ｍＭ
ＺｎＳＯ４を含有する溶液３５０μｌ中３０℃にて３
０分間２０ＵのエンドヌクレアーゼＳ１（Ｐ−Ｌバイオ
ケミカルス）により処理することによりずれのある末端
を除去する。ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加えて１０ｍＭ
にすることにより反応を停止する。フエノールで抽出
し、そしてエタノール沈澱によりＤＮＡを濃縮し、そし
て１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．０
５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液５０μｌに再溶解す
る。
（２） ＥｃｏＲＩ及びＳ１により分解されたｐＢＲ３
２２への化学合成ＤＮＡリンカーの連結 次の式、 で示されるオリゴデオキシヌクレオチドを例１０Ｅａに
記載した方法により調製する。８０ｐモルの各オリゴヌ
クレオチドを、０．１ｍＭ ｒＡＴＰ（シグマ）、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ及び２０ＵのＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を含有する
８０μｌの反応溶液中で、３７℃にて３０分間２０μＣ
ｉ〔γ−３２ｐ〕−ＡＴＰ（６７００Ｃｉ・ｍ ｍｏｌ
−１、アマーシヤム）と共にインキュベートすることに
より、合成オリゴデオキシヌクレオチドの５´末端を燐
酸化する。次の式、 で示される生成した放射性燐酸化リンカーを、次に０．
５ｍＭ ｒＡＴＰ（シグマ）、０．１ｍＭ ＤＴＴ（カ
ルビオケム）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び４×１０３ＵのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（バイオラグス）を含有する反応液２００
μｌ中で、１５℃において２時間、ＥｃｏＲ Ｉにより
切断されたｐＢＲ３２２６μｇとインキュベートする。
フエノール抽出により溶液を脱蛋白し、エタノール沈澱
によりＤＮＡを濃縮する。ＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを
含有する１００μｌの溶液に溶解し、そして５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを
含有する溶液中シュークロース勾配（５〜２３％）遠心
分離を行う。遠心分離は、ＴＳＴ６０ローター（コント
ロンＡＧ）を使用して１５℃、６０，０００ｒｐｍにお
いて２．５時間行う。ＩＳＣＯ勾配コレクターを用いて
１ｍｌ／分において０．２ｍｌずつの分画を集める。〔
３２Ｐ〕−ラベルプラスミドＤＮＡを含有する分画（２
２分画中１１〜１４分画）を一緒にし、ＤＮＡをエタノ
ールで沈澱せしめ、そして１２ＵのＢｃｌＩ（バイオラ
ブス）を用い、供給者により推奨される方法に従って分
解する。フエノール抽出及びエタノール沈澱の後、分解
されたＤＮＡを１０ＵのＰｓｔＩ（バイオラブス）を用
い、供給者により推奨される方法に従って処理する。次
に、フエノール抽出及びエタノール沈澱をした分解物
を、ＴＳＴ４１ローターを用いて１５℃、３５，０００
ｒｐｍにて１５時間、シュークロース密度勾配（５〜２
３％）遠心分離する。０．３ｍｌずつの分画を（前記の
ようにして）集め、〔３２Ｐ〕−ラベルされた大Ｂｃｌ
Ｉ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片（４２分画中２７〜３１分
画）を含有する分画を一緒にし、そしてエタノール沈澱
により濃縮する。ＤＮＡをＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液２０μｌ
に再溶解する。
（ｃ） ｃＤＮＡ挿入部への受容プラスミド断片の連結 ２μｌの受容プラスミドＤＮＡ断片（〜１００ｎｇ） （上記）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ｒＡＴＰ、
０．１ｍＭ ＤＴＴ及び４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ
を含有する反応液１０μｌ中で、５μｌのｃＤＮＡ挿入
部（〜２０ｎｇ）と共に１５℃にて３時間インキュベー
トする。次に、５μｌの反応混合物を、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、１０ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液中に１５０μｌのカ
ルシウム処理されたＥ．コリＨＢ１０１を含む合計２０
０μｌの混合物に加える。混合物を氷中で２０分間冷却
し、そして４２℃にて１分間加熱し、そして２０℃にて
１０分間インキュベートする。１ｍｌのトリプトン培地
〔トリプトン培地は、１ｌの蒸留水中に１０ｇのバクト
−トリプトン（ディフコ）、１ｇの酵母エキストラクト
（ディフコ）、１ｇのグルコース、８ｇのＮａＣｌ及び
２９４ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含有する〕を加
え、そして混合物を３００ｒｐｍ振とうしながら３７℃
にて３０分間インキュベートする。混合物を、１０μｇ
／ｍｌのテトラサイクリン（シグマ）を補給した２枚の
寒天プレート（マッコンキー寒天、ディフコ、０．６ｍ
ｌ／プレート）上に接種する。プレートを３７℃にて１
２〜１７時間インキュベートする。形質転換混合物当た
り約１０００コロニーを得る。各形質転換混合物から４
コロニーを取り上げさらに分析する。
（ｄ）雑種プラスミドの制限分析 能力のある雑種プラスミドをさらに分析するために、１
２コロニー（３種類の連結混合物から４個ずつ）からプ
ラスミドＤＮＡを分離する。雑種プラスミドＤＮＡを次
のようにして分離する。２５ｍｌのエルレンマイヤーフ
ラスコ中、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補給し
たトリプトン培地１０ｍｌに１コロニーを接種する。培
養物を３７℃、３００ｒｐｍにて１５〜１８時間振とう
する。細胞を遠心分離（ソルバル、ＨＳ−４ローター、
１０分間、４０００ｒｐｍ、４℃）により集める。約
０．１ｇの細胞を得、そして１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁する。０．２５ｍｌ
のリゾチーム溶液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）中１０ｍｇ／ｍｌ、シグマ製〕を加え、０℃に
て１０分間インキュベートした後０．１５ｍｌの０．５
ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加える。０℃にてさらに１
０分間おいた後、６０μｌの２％トリトンＸ−１００を
加える。０℃にて３０分置いた後、試料を、ソルバルＳ
Ａ−６００ローターを用いて１５，００ｒｐｍ、４℃に
て３０分間遠心分離する。上澄液を１容量のフエノール
（ＴＮＥにより飽和）により脱蛋白する。５０００ｒｐ
ｍ、４℃にて１０分間遠心分離（ソルバルＨＢ−４ロー
ター）することにより相分離を行う。上相を１容量のク
ロロホルムで２回抽出する。膵臓ＲＮＡアーゼＡ（シグ
マ、ＴＮＥ中１０ｍｇ／ｍｌ、８５℃にて１０分間前加
熱）を最終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように加え、そ
して混合物を３７℃にて４０分間インキュベ−トする。
次に溶液を１Ｍ ＮａＣｌ及び１０％ポリエチレングリ
コール６００（フルカ、１２０℃にて２０分間オートク
レーブしたもの）に調整し、そして−１０℃にて２時間
インキュベートする。ソルベルＨＢ−４ローター（２０
分間、１０，０００ｒｐｍ、０℃）により沈澱を集め、
そして１００μｌのＴＮＥに再溶解する。ＤＮＡ溶液を
１容量のフエノールで抽出し、ＤＮＡを２容量のエタノ
ールにより−８０℃にて１０分間沈澱せしめる。エッペ
ンドルフ遠心分離機により沈澱を集め、そしてＤＮＡ
を、１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．
５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液２０μｌに再溶解す
る。１０ｍｌの培養物から８〜１０μｇの雑種プラスミ
ドＤＮＡを得る。プラスミドＤＮＡのすべてを次の二重
分解により分析する。０．５μｇずつの各ＤＮＡを、標
準法に従って、ＨｉｎｄＩＩＩ（バイオラブス）とＰｖ
ｕＩＩ（バイオラブス）、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔ１
（バイオラブス）、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨ１（バイ
オラブス）、ＥｃｏＲＩ（バイオラブス）とＰｓｔＩを
用いて分解し、そして４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・酢酸（ｐＨ
７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５μｇ／ｍｌのＥ
ｔＢｒを含む溶液中、１．５％アガロースゲルにより、
大きさに従って分画する。所望の制限酵素パターンを有
する雑種プラスミドを選択する。結果を第２９及び第３
０図に示す。ｐＢＲ３２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８´１、ｐ
ＢＲ３３２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５１及びｐＢＲ３２２／
ＨＬｙｃＩＦＮ−１´ｂから誘導された挿入部を含むプ
ラスミドＤＮＡをそれぞれＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙ
ｃＩＦＮ（α−３）−２５２、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／Ｈ
ＬｙｃＩＦＮ（α−２）−２６１、及びＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬｙｃＩＦＮ（α−１）−２５８と称する。リ
ンカーとＩＦＮｃＤＮＡのコード配列の出発部との間の
連結点における構造をさらに確認するために、この領域
におけるヌクレオチド配列を決定する。具体的には、２
μｇの分離されたプラスミドＤＮＡＣＧ−ｐＢＲ３２２
／ＨＬｙｃＩＮＦ（α−１）−２５８をＥｃｏＲＩで分
解し、５′末端をラベルし、そしてＰｓｔＩにより切断
する。ＤＮＡ断片を６％ポリアクリルアミドゲル上で分
画し、そして前記の方法によりＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ
（９．４ｂｐ）ＤＮＡ断片を抽出する。このＤＮＡ断片
をマクソン及びジルバート（１５）の方法に従って配列
分析にかける。同様にして、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬｙｃＩＦＮ（α−２）−２６１及びＣＧ−ｐ
ＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ（α−３）−２５２中のリ
ンカーとＩＦＮｃＤＮＡのコード配列の出発部との間の
連結点における構造を確認する。プラスミドＣＧ−ｐＢ
Ｒ３２２／ＨＬｙｃＩＮＦ（α−１）−２５８、（α−
２）−２６１、及び（α−３）−２５２においてＩＦＮ
コード配列の前にＥｃｏＲＩ制限部位を含有する次のヌ
クレオチド部分が存在する。
例２４ 発現プラスミドｐ３１中のＰＨＯ５ 信号配外
の除去（第３１図参照） 発現プラスミドｐ３１は、ｍＲＮＡ 出発部位を含むＰ
ＨＯ５プロモーター配列、酸性ホスファターゼの翻訳出
発コードンＡＴＧ、及び酸性ホスファターゼ信号配列の
一部分をコードする追加の４０ヌクレオチドを含む。こ
の構造において、信号配列のヌクレオチド及びＡＴＧは
Ｂａｌ３１分解により除去される。ＰＨＯ５プロモータ
ーと適当な成熟コード配列（例えばインターフェロン遺
伝子）との連結を可能にするためにＥｃｏＲＩリンカー
を導入する。
（ａ） ＢａｌＩで切断されたプラスミドｐ３０のＢａ
ｌ３１分解 ２０μｇのＰ３０ＤＮＡ（例４ｂ参照）を制限エンドヌ
クレアーゼＢａｌＩにより分解して３．７ｋｂ及び５．
１ｋｂの２つの断片を得る。フエノール／クロロホルム
で抽出した後、エタノールによりＤＮＡを沈澱せしめ
る。ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に
０．５μｇ／ｍｌの濃度に再懸濁する。ＢａｌＩで切断
されたｐ３０ＤＮＡ９μｇを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭＭｇＣｌ
２、１２ｍＭＣａＣｌ２及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する
溶液１００μｌ中で２ＵのエキソヌクレアーゼＢａｌ３
１（ＢＲＬ）により分解する。３０℃でインキュベート
しながら、２μｇＤＮＡのアリコートを１５秒、３０
秒、４５秒及び６０秒後に拌取する。フエノール／クロ
ロホルムによる抽出及びエタノール沈澱の後、ＤＮＡを
１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に１００μｇ／ｍｌ
の濃度に再懸濁する。Ｂａｌ３１によるエキソヌクレア
ーゼ分解の程度を分析するために、各時点における０．
５μｇのＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより
分解し、そしてＴｒｉｓ−硼酸緩衝液（ｐＨ８．３）中
１．５％アガロースゲル上で分析する。Ｂａｌ３１分解
の４５秒間に断片の各末端から平均７０ｂｐが除去され
る。その後の実験には４５秒の時間でのＢＮＡを使用す
る。
（ｂ） Ｂａｌ３１処理されたＤＮＡへのＥｃｏＲＩリ
ンカーの付加 ２Ａ２６０ＵのＥｃｏＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡＴ
ＴＣＣ−３′、ＢＲＬ）を、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ
８）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液２５０μｌに懸
濁する。２μｇのＥｃｏＲＩリンカーを、６０ｍＭＴｒ
ｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１５ｍＭＤ
ＴＴ、１０μＭＡＴＰ及び３３ＵのＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ベーリンガー）を含有する溶液７５μｌ中
でキナーゼ処理する。３７℃に１時間おいた後、混合物
を室温に放冷し、そして−２０℃に貯蔵する。アニール
した二重鎖ＥｃｏＲＩリンカーを、その平滑末端によ
り、Ｂａｌ３１処理されたＤＮＡ断片に連結する。０．
５μｇのＢａｌ３１処理ＤＮＡ（例２４ａ参照）を、６
０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、
１０ｍＭＤＴＴ、４ｍＭＡＴＰ及び６００ＵのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（バイオラブス）を含有する溶液２０μｌ中
で、５０倍過剰量のキナーゼ処理ＥｃｏＲＩリンカーと
共に室温において１６時間インキュベートする。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを不活性化（６５℃にて１０分）した後、
過剰のＥｃｏＲＩリンカーを５０μｌにおいて５０Ｕの
ＥｃｏＲＩにより切断する。ＤＮＡをフエノール／クロ
ロホルムにより抽出し、エタノールで沈澱せしめ、そし
て１０ｍＭＴｒｉｓ及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液
に懸濁する。制限エンドヌクレアーゼは両ＢａｌＩ断片
（３．７ｋｂ及び５．１ｋｂ）の末端に付加されたＥｃ
ｏＲＩリンカーのみならず、５．１ｋｂ断片の内部のＥ
ｃｏＲＩ部位をも切断し、３．９ｋｇ及び１．２ｋｂの
断片を生成せしめる。３．７ｋｂ及び３．９ｋｂの断片
を、９０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、９０ｍ
Ｍ硼酸、及び２．５ｍＭ ＥＤＴＡ中０．８％低融アガ
ロースゲル（シグマ）により１．２ｋｂ断片から分離す
る。ＤＮＡバンドをエチジウムクロリドにより染色し、
そして長波長ＵＶ光線により３６６ｎｍにおいて観察す
る。３．７ｋｂ及び３．９ｋｂの２つの大ＤＮＡ断片は
分離しない。これらを１つのゲル片に含まれた状態で切
り取り、例４ａに記載した方法により抽出する。Ｅｃｏ
ＲＩ接着末端を有する線状断片を連結により環化する。
約０．２５μｇの断片を、６０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
５）１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴ
Ｐ、及び６００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する溶液
１００μｌ中で１５℃にて４時間連結する。連結混合物
の１０μｌのアリコートを１００μｌのカルシウム処理
された形質転換受容能力を有するＥ．コリＨＢ１０１細
胞（例４ａ参照）に加える。形質転換されたａｍｐＲコ
ロニーを、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含有するＬＢ培地中で増殖せしめる。７プラス
ミドＤＮＡをホルメス等（５０）の方法に従って調製
し、そしてＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ二重分解により分析
する。
（ｃ） ＥｃｏＲＩリンカー付加部位を決定するための
ヌクレオチド配列分析 ３５コロニーのほとんどは、各ＤＮＡ分子のＢａｌ３１
分解の程度に応じて、ＰＨＯ５プロモーター領域におけ
るＥｃｏＲＩリンカーの付加位置が相互に異る。ヌクレ
オチド配列分析のために、プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉにより分解する。フエノール／クロロホルムにより抽
出した後、制限処理されたＤＮＡをエタノールにより沈
澱せしめる。例１０Ｅｄに記載した方法によりＤＮＡを
脱燐酸し、そして５′末端をラベルする。ラベルされた
ＤＮＡ断片を第２の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＩに
より切断する。生成物を０．８％低融アガロースにより
分離する。０．５〜０．６ｋｂの５′ラベルＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片を例４ａに記載した方法により低融ア
ガロースから分離する。ＥｃｏＲＩリンカーに隣接して
いるヌクレオ配列を決定するために種々のＤＮＡ断片を
化学的に分解し、そして生成物をマクサム及びジルバー
トの方法（１５）に従ってポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離する。種々のクローン及びＰＨＯ５配列
の対応する最後のヌクレオチドの部位（この後にＥｃｏ
ＲＩリンカーが続く）を第４表に示す（さらに第３２図
を参照のこと）。
（ｂ） ＰＨＯ５／Ｒプロモーターを含有する０．５３
ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片の分離 プラスミドｐＲは５３４ｂｐＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断
片上にＰＨＯ５／Ｒプロモーターを含有する。第３ａ図
のナンバリングによれば、断片はヌクレオチド−５４１
（ＢａｍＨＩ部位）からヌクレオチド−１０までのＰＨ
Ｏ５プロモーター配列をカバーする。ヌクレオチド−１
０（例２４ｂ）に連結されたＥｃｏＲＩリンカーはＥｃ
ｏＲＩ切断において２つのＧ残基に寄与する。プラミド
ｐＲを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲ
Ｉにより分解する。例４ａの方法に従って０．５３ｋｂ
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を０．８％低融アガロース
ゲルにより分離する。ヌクレオチド配列を第３３図に示
す。同様にして、プラスミドｐＹを分解し、ＰＨＯ５／
Ｙプロモーターを含有する０．５３ｋｂＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を分離する。ヌクレオチド配列を第３４図
に示す。
（ｅ） 新しい構成のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片による
プラスミドｐ３１中のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片の置換 ５μｇのプラスミドｐ３１（例１３ｄ参照）を制限エン
ドヌクレアーゼＳａｌＩにより分解する。制限分解され
たＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ
ＭｇＣｌ２を含有する溶液５０μｌに再懸濁する。ＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩにより完全分解する。制限断片を、トリ
ス−ボレート−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．２）中０．８
％低融アガロースゲルにより分離する。ＤＮＡバンドを
含有するゲル小片中に３．５ｋｂＤＮＡ断片を分離す
る。５μｇずつのクローンｐＲ及びｐＹ（第４表及び第
３２図参照）を前記と同様にしてＳａｌＩ及びＥｃｏＲ
Ｉにより分解する。低融アガロースゲル小片中に０．８
ｋｂＤＮＡ断片を分離する。ベクターｐ３１の３．５ｋ
ｂＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片０．６７μｇを、プラスミ
ドｐＲ又はｐＹの０．８ｋｂＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片
０．３４μｇのそれぞれに連結する。ＤＮＡ断片を含有
する適当なゲル片を混合し、そして６５℃において溶融
する。液化したゲルを３倍に稀釈する。６０ｍＭＴｒｉ
ｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭＡＴＤ及び７５００のＴ４ＤＮＡリガーゼ
（バイオラブス）を含有する全容２４０μｌの溶液中
で、１５℃にて一夜連結を行う。各連結における２μｌ
のアリコートを、カルシウム処理された形質転換受容能
を有するＥ．コリＨＢ１０１細胞（例４ａ参照）１００
μｌに加える。８個の形質転換されたａｍｐＲコロニー
を、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有するＬＢ培地に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡ
を制限分析により分析する。各群のクローンは同じであ
る。各１クローンをさらに使用する。これらをそれぞれ
ｐ３１／Ｒ又はｐ３１／Ｙと称する（第３１図）。例２５ プラスミドｐ３１／Ｒ又はｐ３１／Ｙへのリン
パ芽球性インターフェロンα−３ＤＮＡの挿入（第３５
図） この形成法においては、ＰＨＯ５プロモーター領域を成
熟インターフェロン−α−３をコードする遺伝子に連結
する。ＰＨＯ５又はインターフェロンの信号配列は存在
しないが、連結部位に導入されたＥｃｏＲＩリンカーが
存在する。プラスミドｐ３１／Ｒ（例２４ｅ参照）はＰ
ＨＯ５プロモーター配列を含有し、この配列は酸性ホス
ファターゼ遺伝子のＡＴＧの前９ヌクレオチドにおいて
ＥｃｏＲＩリンカー５′−ＧＧＡＡ ＴＴＣＣ−３′に
より終る。プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩ
ＦＮ（α−３）−２５２（例２３参照）中のリンパ芽球
性インターフェロン−α−３遺伝子を、ＰＨＯ５プロモ
ーター中のＥｃｏＲＩリンカーに連結するために特に整
える。成熟インターフェロンα−３コード配列の５′末
端に追加のヌクレオチドによって、ＥｃｏＲＩ制限部
位、及びインターフェロン遺伝子の翻訳に必要なＡＴＧ
を得る（第２９図）。本質上同じ方法によりプラスミド
ｐ３１／Ｙ（例２４ｅ参照）を用いる形成を行うことが
できる。
（ａ） ＥｃｏＲＩ切断脱燐酸プラスミドｐ３１／Ｒの
調製 ５μｇのプラスミドｐ３１／Ｒを制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）により完全に分解する。
フェノール／クロロホルムを用いて抽出した後、エタノ
ールによりＤＮＡを沈澱せしめ、そして１００μｌの５
０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁する。ＤＮＡを
セレックス１００（ビオラド）を通過せしめた後、子牛
腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー）により脱燐
酸し、そして脱燐酸したＤＮＡをＤＥ５２イオン交換ク
ロマトグラフィーにより精製する。これらは第１４ｂに
記載した方法により行う。ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液
に０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁する。
（ｂ） プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ（α−３）−２５２のＩＦＮ−α−３コード配列を含
有する０．６ｋｂＥｃｏＲＩ断片の分離 １０μｇのプラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩ
ＦＮ（α−３）−２５２を制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲＩにより分解する。分解により３．８ｋｂ及び０．
６ｋｂの２つの断片が生ずる。０．６ｋｂ断片はインタ
ーフェロン−α−３コード領域を含有する。断片を、Ｔ
ｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡ緩衝液中０．６％低融アガ
ロースゲルにより分離する０．６ｋｂＤＮＡ断片を含有
するゲル片をゲルから切り取り、そして連結に使用す
る。
（ｃ） 線状化脱燐酸化ｐ３１／ＲＤＮＡとＩＦＮ−α
−３ＤＮＡの０．６ｋｂＥｃｏＲＩ断片との連結 ＥｃｏＲＩで切断され脱燐酸化ｐ３１／ＹベクターＤＮ
Ａ１．５μｇを、ＩＦＮ−α−３の０．６ｋｂＥｃｏＲ
Ｉ断片０．１９μｇと連結する。後者の断片は低融アガ
ロースゲルの小片に含まれており、この小片は６５℃で
溶融する。液化ゲルを２倍に稀釈する。連結は、６０ｍ
ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０
ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰを含有する全容２２０μｌ
の溶液中で、８００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラ
ブス）を用いて１５℃にて一夜行う。連結混合物の１０
μｌのアリコートを、カルシウム処理した、形質転換受
容能力を有するＥ．コリＨＢ１０１細胞（例４ａ参照）
１００μｌに加える。６個の形質転換されたａｍｐＲコ
ロニーを、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含有するＬＢ培地に増殖せしめる。プラスミド
ＤＮＡをホルメス等（５０）の方法に従って調製し、そ
してＢｇｌＩＩ／ＢｓｔＥＩＩにより二重分解すること
により挿入部の方向及び大きさを決定する。これらのコ
ロニーの１つをｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−３）と称する。ｐ
３１／Ｙ（例２４ｅ参照）を用いて同様の形成を行う。
６個の形質転換されたａｍｐＲコロニーからのプラスミ
ドを分析する。２つのクローンが正しい方向の挿入部を
有する。その１つをｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−３）と称す
る。例２６ プラスミドｐ３１／Ｒへのリンパ芽球性インタ
ーフェロンα−２ＤＮＡの挿入（第３６図参照） この形成においては、ＰＨＯ５プロモーターを成熟イン
ターフェロン−α−２コード領域に連結する。
（ａ） ベクターｐ３１／Ｒの３．９ｋｂＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片の分離 １０μｇのベクターｐ３１／ＲをＨｉｎｄＩＩＩにより
完全分解する。０．１容量の１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
５）を用いて緩衝調整する。次に、ＨｉｎｄＩＩＩで切
断したｐ３１／ＲＤＮＡをＥｃｏＲＩにより分解する。
３．９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、０．８
％低融アガロースゲルからゲル片として分離する。
（ｂ） ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）の０．９ｋｂ
ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の分離 ５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／１Ｆ２（５１）
（例１７参照）を、ＨｉｎｄＩＩＩにより完全分解す
る。０．１容量の１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）により緩
衝調整する。次に、ＨｉｎｄＩＩＩ切断プラスミドをＸ
ｂａＩにより分解する。０．９ｋｂＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片はインターフェロン−α−２コード配列の一
部分及び下流のＰＨＯ５転写停止信号を含有する。０．
９ｋｂ断片を０．８％低融アガロースゲルにより分離
し、そしてゲルを切り取る。
（ｃ） プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ（α−２）−２６１のＩＦＮ−α−２コードの配列の
一部分を含有する２５２ｂｐＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片
の分離 １０μｇのプラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩ
ＦＮ（α−２）−２６１（例２３参照）を、６ｍＭＴｒ
ｉｓ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＭｇ
Ｃｌ２及び６ｍＭメルカプトエタノールを含有する１０
０μｌの溶液中で、ＸｂａＩにより分解する。ＸｂａＩ
による完全分解の後、線状化プラスミドＤＮＡを３Ｕの
ＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）により部分分解する。３７
℃にて２０分間置いた後−７０℃に凍結することにより
分解を停止する。ＤＮＡ断片を、Ｔｒｉｓ−ボレート−
ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．３）中１．５％アガロースゲ
ルにより分析する。２５２ｂｐＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断
片は、成熟インターフェロン−α−２コード配列の５′
部分（ＸｂａＩ部位まで）をＰＨＯ５プロモーターと連
結するための特異リンカーと共に含有する。２５２ｂｐ
断片は、０．８％低融アガロースゲルからゲル小片中に
分離する。
（ｄ）ＤＮＡ断片の連結 例２６ａ〜ｃに記載した、適当な接着末端を有する３種
のＤＮＡ断片を１反応によって連結する。ベクターｐ３
１／Ｒの３．９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片
０．６７μｇ、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）の０．
９ｋｂＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片０．１６μｇ、及
びＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ（α−２）−２
６１の２５０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片約７０ｎｇ
を連結する。これら３つのＤＮＡ断片はいずれも低融ア
ガロースのゲル小片中に含まれている。３片のアガロー
スゲルを一緒にし、６５℃にて溶融し、そして３倍に稀
釈する。連結は、６０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＤを含
有する全容４５０μｌの溶液中で、１２００ＵのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて１５℃にて１６時間行う。連結混
合物のアリコート１０μｌをカルシウム処理された形質
転換受容能を有するＥ．コリＨＢ１０１細胞（例４ａ参
照）１００μｌに加える。１２個の形質転換されたａｍ
ｐＲコロニーを、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含有するＬＢ媒地に増殖せしめる。ホル
メス等の方法（５０）によってプラスミドＤＮＡを調製
し、そしてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって二重分
解することにより分析する。すべてのコロニーは同一の
分解パターンを示す。これらの１つをｐ３１ＲＲ／ＩＦ
（α−２）と称する。ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）
の０．９ｋｂＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の代りに、
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）Δ７２又は
ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ（５１）Δ８２（例２２参照）の
０．５ｋｂＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用して連
結を行うこともできる。又、ベクターｐ３１／Ｒの３．
９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片の代りに、ベク
ターｐ３１／Ｙの３．９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片を用いて連結を行うこともできる。ＤＮＡ断片の
連結及びＥ．コリＨＢ１０１の形質転換の条件は前記の
通りである。各連結の形質転換されたａｍｐＲコロニー
１２個ずつを、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリ、を含有するＬＢ培地中に増殖せしめる。プラ
スミドＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ二重分析に
より分析する。こうして得られたクローンをｐ３１Ｒ／
ＩＦ（α−２）Δ７２、ｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ８
２、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−２）、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−
２）Δ７２、及びｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ８２と称
する。例２７ プラスミドｐ３１／Ｒへのリンパ芽球性インタ
ーフェロンα−１の挿入（第３７図参照） （ａ） ベクターｐ３１／Ｒの３．９ｋｂ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片の分離 例２６ａに記載した方法に従って、１０μｇのベクター
ｐ３１／ＲをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いて分
解する。生成した０．４ｋｂ及び３．９ｋｂの断片を調
製用０．８％低融アガロースゲルにより分離する。例４
ａに記載した方法に従ってゲルから３．９ｋｂＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を溶出する。ＤＮＡをＤＥ５０
（ワットマン）イオン交換クロマトグラフィー（例５ａ
参照）により精製し、エタノールで沈澱せしめ、そして
０．１ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．１）及び１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含有する溶液中に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁
する。
（ｂ） ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（１′ｂ）の０．９
ｋｂＰｖｕＩＩ−ＨｎｄＩＩＩ断片の分離 ５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（１′ｂ）
（例１７参照）をＰｖｕＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより
分解する。生成する断片０．９ｋｂ及び７．３ｋｂを
０．８％調製用低融アガロースゲルにより分離する。
０．９ｋｂの断片をゲルから溶出し、そして例２７ａに
記載した方法に従って精製する。ＤＮＡを１０ｍＭＴｒ
ｉｓ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液
中に０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁する。
（ｃ） プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦ
Ｎ（α−１）−２５８のＩＦＮ−α−１コード配列の一
部を含有する２８６ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片
の分離 １０μｇのプラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩ
ＦＮ（α−１）−２５８（例２３参照）をＰｖｕＩＩ及
びＥｃｏＲＩにより分解する。２８６ｂｐ制限断片を、
調製用０．８％低融アガロースゲルにより４．２ｋｂ断
片から分離する。２８６ｂｐＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩを
断片を例２７ａに記載した方法に従ってゲルから溶出し
そして精製する。ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．
０）及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液に０．０３ｍｇ
／ｍｌ濃度でｃ再懸濁する。
（ｄ）ＤＮＡ断片の連結 ベクターｐ３１／Ｒの３．９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片０．５μｇ、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（１′
ｂ）の０．９ｋｂＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｂＩＩＩ断片０．
２５μｇ、及びプラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙ
ｃＩＦＮ（α−１）−２５８の２８６ｂｐＥｃｏＲＩ−
ＰｖｕＩＩ断片０．１μｇを、６０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭＭｇｃｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、４ｍ
ＭＡＴＰ及び６００ＵのＤＮＡリガーゼを含有する溶液
２０μｌ中で、１５℃にて１６時間連結する。連結反応
混合物のアリコート３μｌを、カルシウム処理された形
質転換受容能力を有するＥ．コリＨＢ１０１細胞（例４
ａ参照）１００μｌに加える。形質転換されたａｍｐＲ
コロー−１２個を、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含有するＬＢ培地に増殖せしめる。プ
ラスミドをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ二重分解により
分析する。１．４ｋｂのＢａｍＨＩ断片及び３９０ｂｐ
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を生ずる１クローンを
さらに分析し、そしてｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−１）と称す
る。ベクターｐ３１／Ｒの３．９ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−
ＥｃｏＲＩ断片の代りにベクターｐ３１／ＹのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を用いることもできる。又、ｐ
ＪＤＢ２０７／ＩＦ２（１′ｂ）の０．９ｋｂＰｖｕＩ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の代りにｐＪＤＢ２０７／ＩＦ
２（１′ｂ）Δの０．４５ｋｂＰｖｕＩＩ−ＨｎｄＩＩ
Ｉ断片を使用して連結を行うこともできる。生成したク
ローンを前記のように分析する。これらのクローンをｐ
３１Ｒ／ＩＦ（α−１）Δ、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−１）
及びｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−１）Δと称する。例２８ 高コピー数酵母ベクターｐＪＤＢ２０７への遺
伝子構成物のサブクローニング（第３８図参照） 例２５〜２７に記載した構成物はＰＨＯ５プロモータ
ー、種々のインターフェロンコード領域及びＰＨＯ５転
写停止信号を縦列的に含み、すべてｐＢＲ３２２誘導ベ
クターに挿入されている。上記一連の配列をすべて含有
するＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、例１７に記載し
たようにしてｐＪＤＢ２０７の６．２ｋｂＳａｌＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片に連結する。２μｇのプラスミドｐ３
１Ｒ／ＩＦ（α−３）を制限エンドヌクレアーゼＳａｌ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩにより分解する。制限断片を調製
用０．８％低融アガロースゲルにより分離する。小断片
（１．８ｋｂの大きさ）を含むゲルを切り取る。プラス
ミドｐＪＤＢ２０７を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩにより分解し、そして例１７に記載
した方法に従って６．２ｋｂの大断片を分離する。例１
７に記載した方法に従ってＤＮＡ断片の連結及び受容能
力を有するＥ．コリＨＢ１０１細胞の形質転換を行う。
８個のａｍｐＲコロニーを、それぞれ別々に、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に増殖せし
める。プラスミドＤＮＡの挿入部の大きさを、制限エン
ドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩを用いる切
断により分析する。正しい挿入部を有する１つのクロー
ンを選択し、そしてｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−３）
と称する。同様にして、プラスミドｐ３１Ｙ／ＩＦ（α
−３）、ｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−２）、ｐ３１Ｒ／ＩＦ
（α−２）Δ７２、ｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ８２、
Ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−２）、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−２）
Δ７２、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ８２、ｐ３１Ｒ／
ＩＦ（α−１）、ｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−１）Δ、ｐ３１
Ｙ／ＩＦ（α−１）及びｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−１）Δか
ら出発して、次のプラスミド、すなわち、 を得る。
形質転換及びインターフェロン生産の誘導 プラスミド、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）Δ７２、
ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）Δ８２、ｐＪＤＢ２０
７／ＩＦ２（１′ｂ）Δ、ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α
−３）、ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−３）、ｐＪＤＢ
２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）、ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ
（α−２）Δ７２、ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）
Δ８２、ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−２）、ｐＪＤＢ
２０７Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ７２、ｐＪＤＢ２０７Ｙ／
ＩＦ（α−２）Δ８２、ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−
１）、ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−１）Δ、ｐＪＤＢ
２０７〔／ＩＦ（α−１）及びｐＪＤＢ２０７〔／ＩＦ
（α−１）Δ のそれぞれを、サッカロミセス・セレビ
シエーＡＨ２２０株（ａ，ｔｒｐ１，ｌｅｕ２−３，ｌ
ｅｕ２−１１２，ｈｉｓ３，ｐｈｏ５，ｐｈｏ３）に、
ヒンネン等（１）の方法に従って形質転換する。形質転
換された酵母細胞をロイシンを含有しない酵母最少培地
プレート上で選択する。単一の酵母コロニーを拾い上
げ、そして例７に記載した方法に従って増殖せしめる。
これらの酵母コロニーを、 と称する。
の形質転換及びインターフェロン生産の誘導 例２９に記載した方法と同様にして、例２９に列挙した
プラスミドによりサッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ
１８株（α，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｌｅｕ
２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｃａｎＲ ）を形質転換す
る。これらの酵母を、 と称する。例３１ 酵母細胞抽出液の調製及びインターフェロン力
価の測定 細胞濃度１〜２×１０７／ｍｌの培養液５０ｍｌ中の細
胞を、ソルバルＧＳＡローターを用いて３０００ｒｐｍ
にて１０分間遠心分離することにより集める。細胞を２
ｍｌの０．１ＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）に再懸濁
し、そして室温にて５分間３０００ｒｐｍにおいて遠心
分離する。沈澱した細胞を氷冷した１．２ｍｌの分解混
液〔０．１Ｍ燐酸緩衡液（ｐＨ７．４）、１（Ｖ／Ｖ）
％のトリトンＸ−１００、０．１ｍＭＰＭＳＦ（メル
ク）〕に再懸濁し、そして３０ｍｌのコレックスチュー
ブに移す。１．６ｇのガラスビーズ（直径０．４ｍｍ）
を細胞に加え、そして懸濁液をボルテックスミキサー
（Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ）（サイエンティフィック
インストルメンツ、米国上で、最高速度で３０秒間振
とうし、そして氷浴中で１分間冷却する。この振とう操
作を、９０％より多くの細胞が破壊されるまで（光学顕
微鏡により監視する）５〜１０回反復する。ソルバルＨ
Ｂ−４ ローターを用いて、８０００ｒｐｍ、４℃にて
１０分間遠心分離することにより細胞の破片及びガラス
ビーズを除去する。上澄液をエッペンドルフチューブに
移し、液体窒素により冷結し、そして、−６０℃にて貯
蔵する。ヒト−ＣＣＬ−２３細胞及び攻撃ウイルスとし
て小水庖性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用い、アームス
トロングの方法（３２）に従って、インターフェロン活
性を測定する。結果を第５表に示す。組換プラスミドに
より形質転換された後のＳ．セレビシエーＡＨ２２０株
及びＧＲＨ１８株におけるインターフェロン活性は一般
に同じである。第６表は、表に記載したプラスミドによ
り形質転換した後の両株のインターフェロン活性の比較
を示す。
例３２ 換株による３００ｌ規模でのインターフェロン−α−２
株の生産，サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／
ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ８２株は、宿主生
物中におけるプラスミドの選択的保持を可能にするロイ
シンマーカー、ヒト−インターフェロン−α−２の構造
遺伝子、及び限定された量の無機燐酸塩を含有する培地
中でＩＦＮ−α−２遺伝子を発現せしめることができる
酸性ホスファターゼＰＨＯ５プロモーターを含有するプ
ラスミドを担持している。ロイシンを含有しない限定培
地により調製した寒天スラント上に菌株を維持すること
によりプラスミドの保持を確保する。新しく接種したス
ラントを３０℃にて２４時間インキュベートする。スラ
ント上の表面培養物を３ｍｌの前培養培地に懸濁し、次
にこれを第１前培養振とうフラスコに移す。５００ｍｌ
のフラスコは、１個のバッフルを有し、次の組成を有す
る１００ｍｌの前培養培地を収容する。培地組成（ｇ／
ｌ）：酵母エキストラクト（ディフコ）＝１０．０、Ｌ
−アスパラギン＝６．６、ＫＨ２ＰＯ４＝１．０、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ＝１．０、Ｌ−ヒスチジン＝０．０
２、及びＤ−グルコース（一水和物）＝３３．０。脱イ
オン水を用いて調製された培地のｐＨは約６．０であ
る。グルコースは別途雑菌する。第１前培養物を、５ｃ
ｍの工程と２５０ｒｐｍの速度を有する回転振とう機上
で３０℃にて２４時間インキュベートする。第１前培養
フラスコから第２前培養フラスコ用の種母を得る。第２
前培養フラスコには１（Ｖ／Ｖ）％の種母を加える。培
地及び培養条件は第１前培養のそれと同一にする。３６
本のフラスコからの培養液を一緒にし、主生産発酵槽用
の１（Ｖ／Ｖ）％の種母に用いる。生産発酵槽は全容５
００ｌであり、４枚の邪魔板と直径２３０ｍｍの６枚羽
根ディスクタービン攪拌機１本を有する。攪拌速度は４
５０ｒｐｍ、０．３バール加圧とし、通気速度を１Ｖ／
Ｖ／分とする。発酵槽には次の組成の培地を３００ｌ収
容する。培地組成（ｇ／ｌ）：Ｌ−アスパラギン＝２．
０、Ｌ−ヒスチジン＝０．０２、ＫＨ２ＰＯ４＝０．０
３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ＝０．０５、ＮａＣｌ＝０．
１、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ＝０．１、ＫＣｌ＝１．０、
Ｄ−グルコース（一水和物）＝２０．０、ビタミン溶液
＝５ｍｌ／ｌ、及び微量元素溶液＝５ｍｌ／ｌ。培地の
ｐＨはＮａＯＨにより殺菌前に７．２に調製する。グル
コース、ビタミン及び微量元素は別々に殺菌し、そして
培地に加える。ビタミン及び微量元素のストック溶液は
次の組成を有する。ビタミン（ｇ／ｌ）：ビオチン＝
０．０００２、Ｄ−パントテン酸カルシウム＝０．０
４、葉酸＝０．０００２、ニコチン酸＝０．０４、ｐ−
アミノ安息香酸＝０．０２、塩酸ピリドキシン＝０．０
４、リボフラビン＝０．０２、塩酸チアミン＝０．０
４、及びイノシトール＝０．２（脱イオン水使用）。微
量元素（ｇ／ｌ）：硼酸＝０．０５、ＣｕＳＯ４・５Ｈ
２Ｏ＝０．００４、ＫＩ＝０．０１、ＦｅＣｌ３・６Ｈ
２Ｏ＝０．０２、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ＝０．０４、Ｎ
ａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ＝０．０２、及びＺｎＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ＝０．０４（脱イオン水使用）。発酵温度は３
０℃とする。ｐＨは約４．０〜４．２に低下するが、必
要があれば水酸化ナトリウムにより中性に調整すること
ができる。約１８時間の発酵の後、インターフェロンの
収量が最高に達する〔アームストロングの方法（３２）
に従って測定〕。光学濃度（約２．０に達する）及び酸
性ホスファターゼ活性は発酵の進行の有用な標識とな
る。必要があれば、酵母細胞を集める前に発酵液を１０
℃に冷却することができる。例３３ ＨＬｙＩＦＮ−α−２の分離及び精製 （ａ） モノクローン抗体カラムに適用するポリペプチ
ド溶液の調製 全容６００ｌのｐＨ４．１の培養液を１０℃に冷却す
る。アルファーラバル（Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ）ＢＲＰ
Ｘ−２０７スラッジ除去用遠心分離機を用いて細胞を分
離する。透明な上澄液はＩＦＮ活性を有しない。細胞に
担持された残留液は、２０ｌの分解緩衡液Ａ〔１００ｍ
ＭＫＨ２ＰＯ４、５００ｍＭＮａＣｌ、０．１（Ｖ／
Ｖ）％トリトンＸ−１００▲Ｒ▼、及び０．１ｍＭＰＭ
ＳＦ（ＫＯＨによりｐＨ７．５に調整）〕で洗浄するこ
とにより除去する。遠心分離機ボウルの内容物を十分に
排出し、そしてスラッジ除去器を５ｌの分解緩衡液Ａに
より１回洗浄する。得られた細胞を６０ｌの緩衡液Ａに
より稀釈する。７．３のｐＨ値を有する。懸濁液を５〜
１０℃に冷却し、そして１００ｌ／時の供給速度でＤＹ
ＮＯ▲Ｒ▼−Ｍｉｌｌ（ＫＤ５型）を通す。粉砕機には
ポリウレタン攪拌ディスク及び４２００ｍｌのガラスビ
ーズ（直径０．５〜０．７５ｍｍ）を入れ、１６２５ｒ
ｐｍで運転する。破砕された細胞懸濁液（ｐＨ〜７．
３）を前記のようにして遠心分離する。上液７５ｌを限
外▲ろ▼過により３ｌに濃縮する。このポリペプチド溶
液のアリコート（３００ｍｌ）を、アミコン（Ａｍｉｃ
ｏｎ）ＤＣ−２ホローフィブルシステム（Ｈｏｌｌｏｗ
Ｆｉｂｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＨＩＰ１００ホ
ロー（Ｈｏｌｌｏｗ）▲ろ▼過遠心機を通過せしめる。
さらに２ｌの緩衡液系Ｂ〔３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．５に調整）を▲ろ▼
過機に適用する。一緒にした▲ろ▼液及び洗浄液（２
ｌ）を、ＨＩＰ１０ホロー▲ろ▼過遠心機により１００
ｍｌに濃縮する。濃縮液をＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙ
ｌ▲Ｒ▼ＭＤＥＡＥ（ＬＫＢ社）のカラムに吸着せしめ
る。カラムを洗浄し、そして緩衡液Ｃ〔２００ｍＭＮａ
Ｃｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）〕に
より溶出する。溶出液は、アームストロングの方法（３
２）により測定した場合１．４×１０６／ｍｇポリペプ
チドのインターフェロン測定を有する。
（ｂ） モノクローン抗体カラムによるヒト−ＬｙＩＦ
Ｎ−α−２の精製 モノクローン抗体カラム〔セルテク（ＣＥＬＬＴＥＣ）
英国〕（ベッドボリウム２０ｍｌ）を、２０ｍＭ Ｎａ
−ホスフェート、１５４ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に
より平衡化し、そして上記ポリペプチド溶液を５０ｍｌ
／時の速度で室温においてカラムに適用する。非吸着ポ
リペプチドを含有する第１分画及び１００ｍｌのＰＢＳ
洗浄液を廃棄する。さらに非特異的結合ポリペプチド
を、追加の０．５ＭＮａＣｌ及び０．２％ Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ１００▲Ｒ▼を含有するＰＢＳ１００ｍｌにより溶
出する。カラムを、２０ｍＭＮａ−ホスフェート、０．
３ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する溶液２００ｍｌ
で洗浄し、この後特異的に吸着したポリペプチドを５０
ｍｌの緩衡液Ｄ〔０．１Ｍクエン酸、０．３ＭＮａＣｌ
（ｐＨ２．０）〕により溶出する。この溶液のｐＨを２
ＮＮａＯＨにより６．３に調整し、そして４℃にてイマ
ージブルーＣＸＴＭ分子分離器（ミリポア▲Ｒ▼）によ
り濃縮する。濃縮物を、０．０２５Ｍヒスチジン・ＨＣ
ｌ（ｐＨ６．３）で平衡にしたセファデックスＧ−２５
▲Ｋ▼微細カラム（２．６×３４ｃｍ、２００ｍｌベッ
ドボリウム）に適用する。カラムを、同じヒスチジン・
ＨＣｌ緩衡液を用いて４℃にて４２ｍｌ／時の流速で溶
出する。１０．５ｍｌずつの２０分画を集める。ポリペ
プチド含有分画を２８０ｎｍにおける光吸着により検知
する。分画７及び８に、ＩＦＮ活性を有するポリペプチ
ドが含まれる〔アームストロング（３２）の方法により
測定〕。ＬｙＩＦＮ−α−２を含有する活性区分を−２
０℃にて次に使用するまで貯蔵する。分画のＩＦＮ活性
は１．８×１０８ＩＵ／ｍｇポリペプチドである（３
２）。上記の分画を凍結乾燥することにより１ｍｌの溶
液から２０〜４０μｇのポリペプチドが得られる。ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により〔（５３）参
照〕得られたＬｙＩＦＮ−α−２の分子量は約１８Ｋダ
ルトンであることが示される。
例３４ 形質転換された酵母細胞による培地へのインタ
ーフェロンの分泌 蛋白質分泌に対するＮ−末端蛋白質信号配列の効果を測
定するために、酵母Ｓ・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪ
ＤＢ２０７／ＩＦ（８１′）株（雑種信号配列を含有す
る、例１７参照）、及び酵母Ｓ・セレビシエーＧＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−３）（信号配列を有
しない）を、例２８に記載した方法に従って増殖せしめ
る。培地に存在する生産されたインターフェロンの量及
び細胞抽出液（例３１に記載した方法に従って調製）中
に存在するインターフェロンの量を測定し、そして結果
を第７表に示す。
参 考 文 献 １．Ａ．Ｈｉｎｎｅｎ等，“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５，１９２９ （１９７８） ２．Ｊ．Ｄ． Ｂｅｇｇｓ，“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｂｙ ａ ｒｅｐｌｉｃａ
ｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｓｍｉｄ”，Ｎａｔｕ
ｒｅ ２７５，１０４（１９７８） ３．Ｊ．Ｈｉｃｋｓ等，“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ
ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，Ｃｏ
ｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｓｙｍｐ．Ｑｕ
ａｎｔ． Ｂｉｏｌ．４３，１３０５（１９７９） ４．Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ等，“Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎ
ｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒ−ｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａ
ｓｔ； ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａ−ｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７６，１０３５（１９７９） ５．Ｒ．Ａ． Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，“Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ”， Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９３， ７１７（１９８１） ６．Ｊ．Ｄ． Ｂｅｇｇｓ等，“Ａｂｎｏｒｍａｌ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
ｒａｂｂｉｔ β−ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”，
Ｎａｔｕｒｅ ２８３，８３５（１９８０） ７．Ｒ．Ａｘｅｌ，“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｅｕｋａ
ｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏ−ｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆｐｒｏ
ｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ”，ＰＣＴ
特許出願 ８１／０２４２５ ８．Ｊ．Ａ． Ｃａｒｂｏｎ等，“ＤＮＡ ｃａｐａｂ
ｌｅ ｏｆ ｒｅｐｌｉ−ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔ
ａｂｌｅ ｍｉｔｏｔｉｃ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ
ｉｎ ａ ｈｏｓｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｅ，ｍｅｔｈｏ
ｄ′ｏｆ ｐｒｅｐａ−ｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ
ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｏｎｔ
ａｉｎｉｎｇ ｓａｍｅ”，ヨーロッパ特許出願 ４８
０８１ （Ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） ９．Ｄ．Ｔ． Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等，“Ｅｕｋａｒ
ｙｏｔｉｃ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃ
ａｔｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔ”，ヨーロッパ特許出願４
５５７３ （Ｔｈｅ ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｒｕｓｔｅ
ｅｓ ｏｆ Ｌｅｌａｎｄ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｊｕｎ
ｉｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）１０．“Ｐｌａｓｍｉ
ｄｖｅｋｔｏｒｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｐｌａｓｍｉｄｅ
ｕｎｄ ｉｈｒｅ Ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ ｚｕｒ Ｈ
ｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｅ
ｎ”，独国出願公開２９２３２９７（Ｉｎｓｔｉ−ｔｕ
ｔ Ｐａｓｔｅｕｒ） １１．“Ｐｒｏｃｅｄｅ ｄｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎｅｓ ｐａｒ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｄｅｓ ｇｅｎｅｓ ｃｏｒｒｅ−ｓｐｏｎｄ
ａｎｔｓ ｄａｎｓ ｄｅｓ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｓ ｅｔｖｅｃｔｅｕｒｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂ
ｌｅｓ ｄ ｅｔｒｅ ｍｉｓ ｅｎｏｅｕｖｒｅ ｄ
ａｎｓ ｄｅ ｔｅｌｓ ｐｒｏｃｅｄｅｓ”，フラン
ス国特許出願２４５８５８５ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐ
ａｓｔｅｕｒ） １２．Ｍ．Ａｉｇｌｅ等，“Ｎｏｕｖｅａｕｘ ｐｌａ
ｓｍｉｄｅｓ ｈｙｂｒｉｄｅｓ ｅｔ ｍｉｃｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｌｅｓ ｃｏｎｔｅｎａｎｔ”，
ヨーロッパ特許出願１１５６２ （Ａｇｅｎｃｅ ｎａ
ｔｉｏｎａｌｅｄｅ ｖａｌｏｒｉｓａｔｉｏｎ ｄｅ
ｌａ ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ） １３．Ａ．Ｓｃｈｕｒｒ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６５，２９１（１９７１）及びＡ．Ｔｏｈ−ｅ
等，Ｍｏｌ・Ｇｅｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．１６２，１３９
（１９７８） １４．Ｐ．Ｍｉｌｄｎｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ． Ａｃｔａ４２９，２７４ （１９７６） １５．Ａ．Ｍ．Ｍａｘａｍ等，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
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ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎｙｅａｓｔ”， Ｃｕｒｒ．
Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．９
６，１０１（１９８２） １７．Ａ．Ｈｉｎｎｅｎ等，“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ
Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕ−ｌａｔｉｏｎ”， ｖｏｌ． １
４，Ｐ．４３，ニューヨーク １９７９ １８．“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”
（ｅｄ． Ａ．Ｍ． Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ），ウエ
ストパームビーチ１９７８ １９．Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ，“Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ”，
アムステルダム １９７１ ２０．Ｍ．Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２， ３９６１（１
９７９） ２１． Ａ・Ｊｉｍｅｎｅｚ等， Ｎａｔｕｒｅ２８
７，８６９（１９８０）２２．Ｔ．Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ
等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６， ９７５０（１
９８１） ２３．Ｍ．Ｖ．Ｏｌｓｏｎ等，Ｊ．Ｍｏｌ・Ｂｉｏｌ．
１３２，３８７ （１９７９） ２４．Ｈ．Ｍｅｙｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．９０，３
４１（１９７８） ２５．Ｂ．Ｈｏｈｎ等“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ”，ｖｏｌ．２， ｐ．１６９，ニューヨー
ク １９８０ ２６．Ｂ．Ｈｏｈｎ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ”，ｖｏｌ． ６８， Ｐ．２９９，ニ
ューヨーク １９７９ ２７．Ｎ．Ｍａｎｔｅｉ等，Ｇｅｎｅ １０，１（１９
８０） ２８．Ｊ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ｖｏｌ． ２，ｐ．１７５，ニュ
ーヨーク １９８１ ２９．Ｍ．Ｍａｎｄｅｌ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５
３，１５９ （１９７０） ３０．Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，
コールドスプリング ハーバー １９７２ ３１．Ａ．Ｔｏｈ−ｅ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
１３，７２７ （１９７３） ３２．Ｊ．Ａ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．２１，７２３（１９７１） ３３．Ｊ．Ｂ．Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．２０，４０１−４１４（１９６８） ３４．Ｂａｒｔｈ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏ
ｒｐｈ．７，２１０２２２（１９５９） ３５．Ａ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｃｅｌｌ １７，５１７（１
９７９） ３６．Ａ．Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ等，Ｃｅｌｌ
４，３６７−３７８ （１９７５） ３７．Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等，Ｃｅｌｌ ８，１６３
−１８２（１９７６）３８．Ｊ．Ｈ．Ｊ．Ｈｏｅｉｊｍ
ａｋｅｒｓ等，Ｇｅｎｅ ８，３９１−４１７（１９８
０） ３９．Ａ．Ｃ．Ｐｅａｃｏｃｋ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ６，１８１８（１９６７） ４０．Ｋ．ＩｔａＫｕｒａ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．９７，７３２７（１９７５） ４１．Ｊ．Ｆ．Ｍ．ｄｅ Ｒｏｏｉｊ等， Ｒｅｃｌ．
Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ ９８，５３７
−５４８ （１９７９） ４２．Ｗ．Ｍｕｅｌｌｅｒ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１２４，３４３ （１９７８） ４３．Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ等，Ｎａｔｕｒｅ ２９
０，２０（１９８１） ４４．Ｃ．Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，ヨーロッパ特許出願Ｎ
ｏ．３２１３４ （Ｂｉｏｇｅｎ Ｎ．Ｖ．） ４５．Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等，Ｇｅｎｅ １０，１
１（１９８０） ４６．Ｍ．Ｓｔｒｅｕｌｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０
９，１３４３ （１９８０） ４７．Ｐｅｒｌｍａｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，７８１（１９８２） ４８．Ａ．Ｊ．Ｂｅｒｋ等，Ｃｅｌｌ １２，７２１−
７３２（１９７７） ４９．Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，ｔｈｅ ３ｒｄ Ｃｌｅｖ
ｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ
ｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ （ｅｄ．
Ａ．Ｗａｌｔｏｎ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ １９８１，ｐｐ．１４３−１５３ ５０．Ｄ．Ｓ．Ｈｏｌｍｅｓ等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１１４，１９３−１９７ （１９８１） ５１．Ｎ．Ｍ．Ｇｏｕｇｈ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１６２，４３−６７（１９８２） ５２．Ｐａｓｅｋ等，Ｎａｔｕｒｅ ２８２，５７５−
５７９（１９７９） ５３．Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ ２２
７，６８０−６８５ （１９７０） なお、第１０図〜第１４図において使用されている記号
は次の意昧を有する。
それぞれの図面に示されている記号は、例１０に記載さ
れている最も密接な従来技術の文献と比較されている。
他の図面において使用されている記号は次の意味を有す
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＨＯ５ 遺伝子の分離源として、又はＤＮ
Ａ配列決定のために使用したプラスミドｐＪＤＢ２０７
／ＰＨＯ５，ＰＨＯ３、及びｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂ
ａｍ−Ｓａｌの部分的な制限エンドヌクレアーゼ地図で
あり、 第２図は、酵母遺伝子試料集団から分離された５．１Ｋ
ｂ ＢａｍＨＩ 断片中の（抑制的）ＰＨＯ５及び（構
成的）ＰＨＯ３酸性ホスファターゼ遺伝子の位置付けを
示し、 第３ａ図及び３ｂ図は、それぞれ、ＰＨＯ５プロモータ
ー領域を含むＰＨＯ５のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ制限断片
のヌクレオチド配列、及びＰＨＯ３プロモーター領域を
含むＰＨＯ３のＰｓｔＩ−ＲｓａＩ制限断片のヌクレオ
チド配列を示し、 第４図は、雑種プラスミドｐ３０ＩＦＮ２（８１′）、
及びｐ３０ＩＦＮ２′（８１′）の形成を示す略図であ
り、 第５図は、プラスミドｐ３０ＩＦＮＩ（８１′）の形成
におけるＰＨＯ５プロモーターＤＮＡとＩＦＦ−８１′
ｃＤＮＡとの連結（ＰＨＯＨプロモーターＤＮＡとＣＧ
−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８１′のｃＤＮＡ挿
入部との連結）を示し、図中、（ａ）はＰＨＯ５プロモ
ーター、及び隣接する蛋白質コード領域を含むＤＮＡ部
分であり、（ｂ）はインターフェロンプロモーター、及
び隣接する蛋白質コード領域を含むＤＮＡ部分であり、
そして（ｃ）はｐ３０ＩＦＮＩ（８１′）中（ａ）及び
（ｂ）の融合生成物のＤＮＡ部分、並びにこれにより生
成するインターフェロンポリペプチドのＮ−末端配列で
あり、 第６図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦＮ２′（８
１′）の形成の概略を示し、 第７図は、ナマルワ（ＮａｍａｌＷａ）ｃＤＮＡを含む
組み換えＤＮＡ分子の形成の概略を示し、 第８図は、α１及びβＩＦＮｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ
プライマー（１３連）の合成に使用される技法を示し、 第９図は、ＨｕｌＩＦＮ−β及びＨｕＩＦＮ−αに特異
なプローブの合成、並びにヒト−リンパ芽球性ＩＦＮｃ
ＤＮＡ含有クローンの同定のための該プローブの使用の
概略を示し、 第１０図〜第１４図は、それぞれ組み換えプラスミドＤ
ＮＡであるＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−１′
ｂ、ＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−β１、ＣＧ
−ｐＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＴＦ−４１、ＣＧ−ｐＢＲ
３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−８１′、及びＣＧ−ｐＢＲ３
２２／ＨＬｙｃＩＦＮ−５１のｃＤＮＡ挿入部のＤＮＡ
配列、並びに対応するアミノ酸配列を示し、 第１５図はプラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩＦ
Ｎ−α−１の形成を示し、 第１６図は、第１５図に示すＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／Ｌ
ｙＩＦＮ−α−１のｃＤＮＡ挿入部のＤＮＡ配列、及び
アミノ酸配列を示し、 第１７図は、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩ
ＦＮ−α−３の形成を示し、 第１８図は、第１７図に示すプラスミドのｃＤＮＡ挿入
部のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示し、 第１９図は、プラスミドＣＧ−ｐＢＲ（ＡＰ）／ＬｙＩ
ＦＮ−α−２のｃＤＮＡ挿入部のＤＮＡ配列及びアミノ
酸配列を示し、 第２０図は、ＰＨＯ５停止断片を含有する発現プラスミ
ドｐ３１の形成の概略を示し、 第２１図は、Ｓａｕ３Ａ−ＰｓｔＩ ＰＨＯ５転写停止
断片のヌクレオチド配列を示し、 第２２図は、プラスミドｐ３１／ＩＦ１（５１）、ｐ３
１／ＩＦ２（５１）、ｐ３１／ＩＦ３（５１）、及びｐ
３１／ＩＦ２（１′ｂ）の形成（ＩＦＮ−５１及びＩＦ
Ｎ１′ｂをコードする配列のプラスミドｐ３１への挿
入）の概略を示し、 第２３図は、発現プラスミドｐ３１／ＩＦ（８１′）の
形成の概略を示し、 第２４図は、プラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５／ＨＢ
ＶｓΔ１４における正しいＰＨＯ５−ＨＢＶｓ連結の形
成の概略を示し、 第２５図は、プラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５／ＨＢ
ＶｓにおけるＰＨＯ５プロモーターとＨＢＶｓ蛋白質を
コードする領域との融合点の付近ＤＮＡ配列を示し、 第２６図は、酵母発現プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ
Ｏ５／ＨＢＶｓΔ１４、及びｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５
／ＨＢＶｓΔ１４ｔの形成を示す概略であり、 第２７図は、酵母発現プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ
２（１′ｂ）Δ、及びｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）
Δ７２の形成を示す略図であり、 第２８図は、ＩＦＮ−５１の３′非翻訳領域とＰＨＯ５
転写停止領域との間のＸｈｏＩ連結の付近におけるプラ
スミドｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）Δ７２及びｐＪ
ＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）Δ８２のヌクレオ配列を示
し、 第２９図は、ポータブルなヒト−リンパ芽球ＩＦＮ−α
−３ｃＤＮＡ挿入部を含有する雑種プラスミドＣＧ−ｐ
ＢＲ３２２／ＨＬｙｃＩＦＮ（α−３）−２５２の形成
を示す略図であり、 第３０図は、雑種プラスミドＣＧ−ｐＢＲ３２２／ＨＬ
ｙｃＩＦＮ（α−２）−２６１、及びＣＧ−ｐＢＲ３２
２／ＨＬｙｃＩＦＮ（α−１）−２５８ の構造を示
し、 第３１図は、発現プラスミドｐ３１中のＰＨＯ５信号配
列の除去方法の概略を示し、そして特にプラスミドｐ３
１／Ｒの形成を示し、 第３２図は、第３１図に示した方法における、ＥｃｏＲ
Ｉリンカーを有するＰＨＯ５領域におけるＢａ１３１除
去集まりを示し、 第３３図及び第３４図は、それぞれ、ＰＨＯ５／Ｒプロ
モーター領域及びＰＨＯ５／Ｙプロモーター領域を含有
するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片のヌクレオチド配
列を示し、 第３５図〜第３７図は、それぞれ、プラスミドｐ３１／
ＲへのＩＦＮ−α−３ＤＮＡ、ＩＦＮ−α−２ＤＮＡ及
びＩＦＮ−α−１ＤＮＡの挿入方法の概略を示し、そし
て、 第３８図は、発現プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ
（α−３）の形成を示す略図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 酵母酸性ホスファターゼプロモータ
ーを用いるポリペプチドの製造方法
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/04 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/19 9050−4Ｂ 15/55 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｆ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/81 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ベルント メイハツク スイス国，4310 ラインフエルデン，ゼツ キンガーシユトラーセ ６ (72)発明者 フランソワ メイヤー スイス国，4103 ボツトミンゲン，フアフ エンラインシユトラーセ 46

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．酵母酸性ホスファターゼプロモーター及び側配列を
    含んで成るＤＮＡ断片、並びにプロモーター機能を保有
    するその変異体。 ２．ＰＨＯ３プロモーターを含んで成る特許請求の範囲
    第１項記載のＤＮＡ断片、及びプロモーター機能を保有
    するその変異体。 ３．ＰＨＯ５プロモーターを含んで成る特許請求の範囲
    第１項記載のＤＮＡ断片、及びプロモーター機能を保有
    するその変異体。 ４． 酵母酸性ホスファターゼプロモーターと連結され
    た対応する酸性ホスファターゼ蛋白質をコードする領域
    の信号配列の全部又は一部分を含んで成る特許請求の範
    囲第１項記載のＤＮＡ断片、及びプロモーター機能を保
    有するその変異体。 ５．次のヌクレオチド配列、 を有する特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片、並び
    にプロモーター機能を保有するその亜断片及び変異体。 ６． 次のヌクレオ配列、 を有するＤＮＡ断片、及び次のヌクレオ配列 を有するＤＮＡ断片から成る群から選ばれた特許請求の
    範囲第５項記載のＤＮＡ断片。 ７ 次のヌクレオチド配列、 を有する特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片、並び
    にプロモーター機能を有するその亜断片及び変異体。 ８．（Ａ） 酸性ホスファターゼ遺伝子の野性型コピー
    を含有する酵母遺伝子試料集団に由来するプラスミドＤ
    ＮＡを用いて形質転換することにより酸性ホスファター
    ゼ欠損酵母菌株を補完し、そして該遺伝子を分離するこ
    とにより酸性ホスファターゼ遺伝子を調製し、 （Ｂ） 得られた遺伝子のサブクローンを調製し、そし
    て、 （Ｃ） 前記サブクローンのプロモーターの領域の位置
    を同定し、そして酸性ホスファターゼプロモーターを含
    んで成るＤＮＡ断片を分離する、ことを含んで成る酵母
    酸性ホスファターゼプロモーターの製造方法。 ９． 酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵母
    ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードし該プロ
    モーターにより制御される領域を含んで成る雑種ベクタ
    ー。 １０． 酵母酸性ホスファターゼプロモーターがＰＨＯ
    ３プロモーターである特許請求の範囲第９項記載の雑種
    ベクター。 １１． 酵母酸性ホスファターゼプロモーターがＰＨＯ
    ５プロモーターである特許請求の範囲第９項記載の雑種
    ベクター。 １３． 酵母ペプチド又は非酵母ペプチドをコードする
    領域が、酵素、ホルモン、免疫調節性、抗ウイルス性も
    しくは抗癌性ポリペプチド、抗体、ウイルス性抗原、ワ
    クチン、又は凝血因子をコードする特許請求の範囲第９
    項記載の雑種ベクター。 １３．酵母ペプチド又は非酵母ペプチドをコードする領
    域がヒト−インターフェロンをコードする特許請求の範
    囲第１２項記載の雑種ベクター。 １４．酵母ペプチド又は非酵母ペプチドをコードする領
    域が肝炎Ｂウイルス抗原をコードする特許請求の範囲第
    １２項記載の雑種ベクター。 １５．細菌プラスミド、バクテリオファージλ、酵母２
    μプラスミド及び／又は酵母染色体ＤＮＡから誘導され
    た追加のＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲第９項記
    載の雑種ベクター。 １６．酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコー
    ドする転写が、酵母遺伝子の転写停止信号を含有するＤ
    ＮＡ配列において停止する特許請求の範囲第９項記載の
    雑種ベクター。 １７．ＰＨＯ５遺伝子の転写停止信号を含有する特許請
    求の範囲第１６項記載の雑種ベクター。 １８．酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコー
    ドする領域の前方に信号配列が存在する特許請求の範囲
    第９項記載の雑種ベクター。 １９．酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコー
    ドする領域が、大酸性ホスファターゼｍＲＮＡ出発点及
    び酸性ホスファターゼコード領域のＡＴＧの間で酸性ホ
    スファターゼプロモーター領域に連結されている特許請
    求の範囲第９項記載の雑種ベクター。 ２０．次のプラスミド、すなわち、ｐ３０ＩＦＮ２
    （８′１）、ｐ３０ＩＦＮ２′（８′１）及びｐＪＤＢ
    ２０７／ＩＦＮ２′（８′１）から成る群から選ばれた
    特許請求の範囲第９項記載の雑種ベクター。 ２１．次のプラスミド、すなわち、ｐＪＤＢ２０７／Ｉ
    Ｆ（８′１）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）、ｐＪ
    ＤＢ２０７／ＩＦ２（１′ｂ）、ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ
    ２（５１）Δ７２、 ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）
    Δ８２、ｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ８２、 ｐ３１Ｒ
    ／ＩＦ（α−３）、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−３）、ｐ３１
    Ｒ／ＩＦ（α−２）、ｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ７
    ２、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−２）、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−
    ２）Δ７２、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ８２、ｐ３１
    Ｒ／ＩＦ（α−１）、ｐ３１Ｒ／ＩＦ（α−１）Δ、
    ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−１）、ｐ３１Ｙ／ＩＦ（α−１）
    Δ、 ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−３）、ｐＪＤＢ２
    ０７Ｒ／ＩＦ（α−２）、 ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ
    （α−２）Δ７２、ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−
    ２）、 ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ７２、ｐ
    ＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ８２、 ｐＪＤＢ２
    ０７Ｒ／ＩＦ（α−１）、ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α
    −１）Δ、 ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−１）及び
    ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−１）Δ から成る群か
    ら選ばれた特許請求の範囲第９項記載の雑種ベクター。 ２２．次のプラスミド、すなわち、 ｐＪＤＢ２０７／
    ＰＨＯ５／ＨＢＶｓΔ１４ 及び ｐＪＤＢ２０７／Ｐ
    ＨＯ５／ＨＢＶｓΔ１４ｔから成る群から選ばれた特許
    請求の範囲第９項記載の雑種ベクター。 ２３． ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−３）である特許
    請求の範囲第９項記載の雑種ベクター。 ２４． ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ８２であ
    る特許請求の範囲第９項記載の雑種ベクター。 ２５． 酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵
    母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードし該プ
    ロモーターにより制御される領域をベクターＤＮＡに導
    入することを特徴とする酵母酸性ホスファターゼプロモ
    ーター、及び酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチド
    をコードし該プロモーターにより制御される領域を含ん
    で成る雑種ベクターの製造方法。 ２６．酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵母
    ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードし該プロ
    モーターにより制御される領域を含んでなる雑種ベクタ
    ーにより形質転換された酵母。 ２７．酵母がサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃ
    ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である特
    許請求の範囲第２６項記載の形質転換された酵母。 ２８．サッカロミセス・セレビシエー ＲＨ９７１／ｐ３０ＩＦＮ２（８′１）、サッカロミセ
    ス・セレビシエー ＲＨ９７１／ｐ３０ＩＦＮ２′
    （８′１）、及びサッカロミセス・セレビシエー ＲＨ
    ９７１／ｐＪＤＢ２０７／ＩＦＮ２′（８′１）から成
    る群から選ばれた特許請求の範囲第２７項記載の形質転
    換された酵母。 ２９．サッカロミセス・セレビシエー ＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ（８′１）、サッカ
    ロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７／
    ＩＦ２（５１）、サッカロミセス・セレビシエーＡＨ２
    ２０／ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（１′ｂ）、サッカロミ
    セス・セレビシエー ＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／
    ＩＦ（α−３）、 サッカロミセス・セレビシエーＡＨ
    ２２０／ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）Δ７２、サッ
    カロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７
    ／ＩＦ２（５１）Δ８２、サッカロミセス・セレビシエ
    ーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）、サ
    ッカロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０
    ７Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ７２、サッカロミセス・セレビ
    シエー ＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ ＩＦ（α−
    ２）、サッカロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪ
    ＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ７２、 サッカロミセ
    ス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ
    （α−２）Δ８２、 サッカロミセス・セレビシエーＡ
    Ｈ２２０／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−１）、サッカ
    ロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７Ｒ
    ／ＩＦ（α−１）Δ、 サッカロミセス・セレビシエー
    ＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−１）、サッ
    カロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０７
    Ｙ／ＩＦ（α−１）Δ、サッカロミセス・セレビシエー
    ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＩＦ２（５１）Δ７２、
    サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ
    ２０７／ＩＦ２（５１）Δ８２、サッカロミセス・セレ
    ビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−
    ３）、サッカロミセス・セレビシエー ＧＲＦ１８／ｐ
    ＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）、 サッカロミセス・
    セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α
    −２）Δ７２、 サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ
    １８／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−２）、サッカロミ
    セス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／Ｉ
    Ｆ（α−２）Δ７２、 サッカロミセス・セレビシエー
    ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−２）Δ８
    ２、 サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪ
    ＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−１）、サッカロミセス・セレ
    ビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−
    １）Δ、 サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８
    ／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／ＩＦ（α−１）、及び サッカロ
    ミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｙ／
    ＩＦ（α−１）Δから成る群から選ばれた特許請求の範
    囲第２７項記載の形質転換された酵母。 ３０． サッカロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐ
    ＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５／ＨＢＶｓΔ１４、 及びサ
    ッカロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪＤＢ２０
    ７／ＰＨＯ５／ＨＢＶｓΔ１４ｔから成る群から選ばれ
    た特許請求の範囲第２７項記載の形質転換された酵母。 ３１．サッカロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪ
    ＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−３）である特許請求の範囲第
    ２７項記載の形質転換された酵母。 ３２．サッカロミセス・セレビシエーＡＨ２２０／ｐＪ
    ＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ８２である特許請求の
    範囲第２７項記載の形質転換された酵母。 ３３．サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪ
    ＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−３）である特許請求の範囲第
    ２７項記載の形質転換された酵母。 ３４．サッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ１８／ｐＪ
    ＤＢ２０７Ｒ／ＩＦ（α−２）Δ８２である特許請求の
    範囲第２７項記載の形質転換された酵母。 ３５．酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵母
    ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードし該プロ
    モーターによって制御される領域を含んで成る雑種ベク
    ターにより酵母を形質転換することを特徴とする形質転
    換された酵母の製造方法。 ３６．（１）酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及
    び酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードし
    該プロモーターにより制御される領域を含んで成る雑種
    ベクターにより形質転換された酵母を培養し、そして
    （２）ポリペプチド又はその誘導体を分離し、そして精
    製する段階を含んで成る酵母ポリペプチドもしくは非酵
    母ポリペプチド、又は天然に存在するこれらの誘導体の
    製造方法。 ３７．資化可能な炭素源及び窒素源、並びに無機塩を含
    有する栄養培地に形質転換された酵母を培養することを
    特徴とする特許請求の範囲第３６項記載の酵母ポリペプ
    チド又は非酵母ポリペプチドの製造方法。 ３８．ポリペプチドが酵素、ホルモン、免疫調節性、抗
    ウイルス性もしくは抗癌性ポリペプチド、抗体、ウイル
    ス抗原、ワクチン、又は凝血因子である特許請求の範囲
    第３６項記載の方法。 ３９．ポリペプチドがヒト−インターフェロンである特
    許請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０．ヒト−インターフェロンがヒト−リンパ芽球性イ
    ンターフェロンである特許請求の範囲第３９項記載の方
    法。 ４１．ヒト−リンパ芽球性インターフェロンがＩＦＮ−
    α−１である特許請求の範囲第４０項記載の方法。 ４２．ヒト−リンパ芽球性インターフェロンがＩＦＮ−
    α−２である特許請求の範囲第４０項記載の方法。 ４３．ヒト−リンパ芽球性インターフェロンがＩＦＮ−
    α−３である特許請求の範囲第４０項記載の方法。 ４４． ポリペプチドが肝炎Ｂウイルス抗原である特許
    請求の範囲第３８項記載の方法。 ４５．ポリペプチドが肝炎Ｂウイルス表面抗原である特
    許請求の範囲第４４項記載の方法。 ４６．酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び細菌
    プラスミド、バクテリオファージλ、酵母２μプラスミ
    ド及び／又は酵母染色体ＤＮＡから成る群から誘導され
    た追加のＤＮＡ配列を含んで成る雑種ベクター。 ４７．酵母酸性ホスファターゼプロモーターがＰＨＯ５
    プロモーターである特許請求の範囲第４６項記載の雑種
    ベクター。 ４８．プラスミドｐ３１、ｐ３１／Ｒ、及びｐ３１／Ｙ
    から成る群から選ばれた特許請求の範囲第４７項記載の
    雑種ベクター。 ４９．酵母酸性ホスファターゼプロモーターをベクター
    ＤＮＡに導入することを特徴とする酵母酸性ホスファタ
    ーゼプロモーター、並びに細菌プラスミド、バクテリオ
    ファージλ、酵母２μプラスミド及び／又は酵母染色体
    ＤＮＡから成る群から選ばれた追加のＤＮＡ配列を含ん
    で成る雑種ベクターの製造方法。
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