JPS63152982A - 新規ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

新規ｄｎａおよびその用途

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JPS63152982A
JPS63152982A JP61188658A JP18865886A JPS63152982A JP S63152982 A JPS63152982 A JP S63152982A JP 61188658 A JP61188658 A JP 61188658A JP 18865886 A JP18865886 A JP 18865886A JP S63152982 A JPS63152982 A JP S63152982A
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JP
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dna
gene
pho81
promoter
transformant
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Application number
JP61188658A
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English (en)
Inventor
Taiji Oshima
大嶋　泰治
Hiroyuki Araki
弘之 荒木
Yoshinobu Kaneko
嘉信 金子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 痩ｌ裏度秩肚立夏 本発明は酵母から得られたプロモーターを含む新規ＤＮ
Ａおよびその遺伝子工学への用途に関する。
従速４す１遵 組み換えＤＮＡ技術が広く利用されるようになって、有
用なポリペプチドの原核生物や真核生物を用いた生産が
可能になってきた。これまでこれら物質の大量生産には
主として大腸菌が利用されてきたが、特に薬理学的に重
要なポリペプチドの生産には真核生物の利用が望まれる
。酵母は真植生物であり他の真核生物、特に哺乳動物細
胞と数々の共通点を有しているために哺乳動物由来の蛋
白質遺伝子を発現させるのに有利である。さらに酵母細
胞はエンドトキシンを含有しないこと、酵母は微生物で
あるために培養が容易であること、古くから大量培養が
工業的になされており、その安全性が確認されているこ
と、その遺伝生化学的解析が数多くなされていることな
どの理由から、酵母を宿主として利用することに注目が
集まっている。
現在、遺伝子クローニングのための酵母ベクターはいく
つか知られているが、異種遺伝子を効率よく発現させる
ための強力な酵母プロモーターはあまり知られていない
、。
酵母サッカロミセス・セレビシエの細胞破砕液中には二
種類の酸性ホスファターゼと二種類のアルカリ性ホスフ
ァターゼの存在が知られている。
酸性ホスファターゼは細胞壁表面にあり、その一つは無
機リン酸によってその生産が抑制され、他の一つは構成
的に産生される。アルカリ性ホスファターゼの一つは無
機リン酸によってその生産が抑制され、基質特異性の広
い抑制性アルカリ性ホスファターゼであり、他の一つは
ｐ−ニトロフェニルリン酸のみを基質にし、かつ構成的
に産生される特異的ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ
である。抑制性酸性ホスファターゼ活性を欠く突然変異
体としてｐｈｏ５．ｐｈｏ４．ｐｈｏ２．’ｐｈｏ８１
変異体が分離されており、ｐｈｏ５遺伝子は抑制性酸性
ホスファターゼの構造遺伝子である。ｐｈｏ４．ｐｈｏ
２．ｐｈｏ８１遺伝子は抑制性酸性ホスファターゼ構造
遺伝子ＰＨＯ５の発現調節を行うタンパク質を産生ずる
遺伝子であり、ＰＨＯ５の発現に対して必須のタンパク
因子をコードしている。さらにｐｈｏ４．ｐｈｏ８１遺
伝子は、ＰＨＯ５と同様に抑制性アルカリホスファター
ゼ構造遺伝子ＰＨＯ８の発鳴を調節している。
明が解　しようとする問題点 現在、遺伝子クローニングのための種々の酵母ベクター
が知られており、利用が可能である。しかし同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させるためには、用いる宿
主に適した強力な酵母プロモーターを選択する必要があ
る。
工題直を　　するための手 本発明者らは、酵母の抑制性ホスファターゼ構造遺伝子
に対する発現調節因子産生遺伝子ＰＨＯ８１のプロモー
ター（ＰＨＯ８１プロモーターと称する。）に着目し、
ＰＨＯ８１遺伝子をコードする領域をクローン化し、そ
の制限酵素切断地図を作成するとともに、そのプロモー
ター付近の塩基配列を決定したところ該プロモーターは
新規なりＮＡであること、これを用いて同種もしくは異
種遺伝子を効率よく発現させることができることを見出
し、これらに基づいて更に研究した結果。
本発明を完成したものである。
本発明は、サッカロミセス・セレビシエから得られ、ホ
スファターゼの生産を調節する遺伝子ＰＨＯ８１のプロ
モーター（ＰＨＯ８１プロモーター）活性を有するＤＮ
Ａ、該ＤＮＡが組み換えＤＮＡであるもの、上記ＰＨＯ
８１プロモーターの下流に抑制性ホスファターゼ産生調
節因子、あるいはそれ以外の構造遺伝子を有するＤＮＡ
、サッカロミセス・セレビシエから得られ、ホスファタ
ーゼの生産を調節する遺伝子ＰＨＯ８１のプロモーター
（ＰＨＯ８１プロモーター）活性を有するＤＮＡを含有
する形質転換体、上記ＤＮＡの下流に構造遺伝子を含有
する形質転換体、およびサッカロミセス・セレビシエか
ら得られ、ホスファターゼの生産を調節する遺伝子ＰＨ
Ｏ８１のプロモーター（ＰＨＯ８１プロモーター）活性
を有するＤＮＡを含有する形質転換体を培地に培養し、
培養物中に生成蓄積された遺伝子産物を採取することを
特徴とする遺伝子産物の製造法に関するものである。上
記のサッカロミセス・セレビシエから得られ、ホスファ
ターゼの生産を調節する遺伝子ＰＨ○８１のプロモータ
ー（ＰＨＯ８１プロモーター）活性を有するＤＮＡとし
ては、該遺伝子ＰＨ○８１の転写がリン酸による調節を
受けるものであるもの、或いは後述の第９図で示される
塩基配列のによる切断位置までの塩基配列を包含するも
のが好ましい。
本発明のＰＨＯ８１プロモ一ター活性部分および抑制性
ホスファターゼ産生調節因子をコードする構造遺伝子（
ＰＨＯ８１と称する。）を含むＤＮＡは、酵母菌体から
分離、採取することができる。
該酵母としては、いずれのものでもよいが、とくにサツ
カロミセス（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅＳ）属菌が好ま
しく、たとえばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられ、具体的にはたとえば市
販のパン酵母、ビール酵母が挙げられる。
酵母からＤＮＡを抽出するには、たとえばメソッズ　イ
ン　セル　バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌ
ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、　　に２，１３〜４４　　（１
９７５）に記載の方法あるいはこれに準じた方法によっ
て行われる。
次に得られたＤＮＡを適当な制限酵素で処理したのち、
同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵
素で処理したプラスミド、あるいはファージに、上記で
得られたＤＮＡ断片を組み込んでシーンバンクを作製す
る。該プラスミドとしては例えばｐＢＲ３２２や大腸菌
−酵母シャトルベクターＹＥｐ１３　（ジーン（Ｇｅｎ
ａ）　８　、　１２　Ｌ（１９７９）参照〕がまたファ
ージとしてはｃｈａ　ｒｏｎ系ファージ〔ジャーナル・
オブ・ウィロロジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　、　２９　
、５５５　（１９７９）参照〕などが用いられる。また
必要により、例えば大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥ
ｐ６　（ジーン（Ｇｅｎｅ）　、　８　、１７　（１９
７９）参照〕などを用いてさらにサブクローニングする
。
このようにしてクローン化されたＤＮＡを保持するベク
ターで５宿主微生物を形質転換する。
宿主微生物としては、酵母が好ましく、たとえばサツカ
ロミセス属菌が挙げられる。さらに具体的には、種サッ
カロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・セレビシエ
ＮＡ９５−４Ｂ株が挙げられる。
なお、上記宿主微生物は、ｐｈｏ８１変異体であること
が好ましい。
上記ＮＡ９５−４Ｂ株は、通常の交雑法〔ハンドブック
・オブ・ジェネティックス（Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）　、　ｐ　３６６　、　Ｐｌｅｎｕｍ
　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７４））に従っ
て得ることができる。すなわちＮＡ９５　４Ｂ株は、Ａ
Ｌ２１１−１２Ｂ株（ＭＡＴａ、ｐｈｏ３−１．ｐｈｏ
８．ａ　ｒｇ６）〔モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、　２
　、　１２７　（１９８２））。
ＡＨ２２株（ＭＡＴａ、Ｑｅｕ２．ｈｉｓ４．ｃａｎｌ
）（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８０．１（１９８３））、Ｄ１３−
ＩＡ株（ＭＡＴａ、ｔｒｐｌ、ｈｉｓ３．ｇａＱ２゜５
ＵＣ２）（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７６．１０３５（１９
７９））ＹＡＴ２２８株（ＭＡＴａ、Ｑｅｕ２．Ｑｙｓ
ｌＯ，ｃｙｈ、ｋａｒ！−１）（ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、　
１４５　。
１４２１　（１９８１））およびＷ７５５−ＩＣ株（Ｍ
ＡＴａ、ｐｈｏ８１．Ｑｅｕ２．ｈｉｓ３゜ｈｉｓ４）
を交雑することによって、取得できる。
このようにして得られたシーンバンクあるいはサブクロ
ーンを用いて、ｐｈｏ８１変異体を形質転換することに
よりＰＨＯ８１プロモーターおよびその下流に抑制性ホ
スファターゼ産生調節因子をコードする構造遺伝子が連
結されたベクターを保持する形質転換体が得られる。
形質転換するには、公知の方法たとえばプロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、
ユ互。
１９２９　（１９７８）、ネーチａｒ　−（Ｎａｔｕｒ
ｅ）　＊２７５、１０４　（１９７８）　、　Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　＊クオンティ
テイティブ・バイオロジー　（Ｑｕａｎｔ　Ｂｉｏｌ、
）、　　４３．　１３０５　　（１９７９）　　。
プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ
、ＵＳＡ）　。
ユ且、１０３５　（１９７９）に記載された方法あるい
はこれに準じた方法によって行われる。
上記方法で得られた形質転換体が、ＰＨＯ８１プロモー
ターおよび抑制性ホスファターゼ産生調節因子をコード
する構造遺伝子を保持するかと・うかは１次に記載の方
法により確認することができる。
すなわち、該形質転換体を例えばルーピン改変培地（Ｃ
，Ｍ、Ｒｕｂｉｎ、低リン酸完全培地）〔ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｂｉｏｃｈｅｓ、）　　＊土１，１９７　　（１９７
４））上にコロニーを形成させ、α−ナフチルリン酸お
よびファーストブルー塩Ｂとを含有する寒天を重層する
。
プロモーターおよび抑制性ホスファターゼ産生調節遺伝
子ＰＨＯ８１を含むＤＮＡがクローン化されていればコ
ロニーが赤色を示すことからＰＨＯ８１遺伝子の存在を
確認することができる０次にＰＨＯ８１遺伝子を含む形
質転換体からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限
酵素で切断後。
たとえばアガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって挿入された遺伝子を含むＤ
ＮＡを単離することができる。この一連の基本操作はす
でに公知であり、たとえばモレキュラー　クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙに詳しく記載されている。
抑制性ホスファターゼ産生調節遺伝子Ｐ）（０８１を含
むＤＮＡの塩基配列は、たとえばジデオキシヌクレオチ
ド合成鎖停止法〔プロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）　、　７４　、５４６３（
１９７７）　）　＋　Ｍａｘａｗ＋−Ｇｉｌｂｅｒｔ法
〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ）　、　７４　、５６０　（１９７７））な
どの方法を用いて決定できる。
上記のようにしてクローン化されたＤＮＡ中のＰＨＯ８
１構造遺伝子の位置は欠失プラスミドと活性相補能との
関係から推定される（第２図参照）。
この推定された第２図の白抜き部分をもつプラスミドを
用いてＰＨＯ８１転写産物を生成させ、その大きさく第
３図参照）と塩基配列決定の結果（第３．５．９図参照
）とからＰＨＯ８１プロモーターの位置を推定する。
この推定されたＰＨＯ８１プロモーターの近傍の塩基配
列を明らかにしく第５図）、該ＤＮＡの塩基配列に基づ
いて解読されるオープンリーディングフレームの存在か
ら、プロモーターはそのオープンリーディングフレーム
上流にあることが予想される。オープンリーディングフ
レーム上流のＰＨＯ８１プロモーター活性〔抑制性ホス
ファターゼ産生調節因子を産生させる能力あり（第１表
参照）〕を有する部分を調製（第７図参照）、該ＰＨＯ
８１プロモ一ター活性含有部分、必要に応じ更にその下
流に各種構造遺伝子をベクターに組み込み発現用ベクタ
ーを作製する（第８図参照）。
該ベクターで宿主の形質転換を行い、該形質転換体を培
養することによって目的とする遺伝子産物を製造するこ
とができる。
本発明のＰＨＯ８１プロモーター活性を有するＤＮＡと
しては全合成あるいは半合成したものも用いることがで
きる。
ＰＨＯ８１プロモーターを組み込むベクターとしては前
出のＹＥＰ６やＹＥｐ１３に加えｐＳＨ１９〔モレキュ
ラー・セルラー・オブ・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１
１．Ｂｉｏｌ、）　、　４　、７７１　（１９８４））
やｐＪＤＢ２１９　（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、
　２７旦、１０４　（１９７８））などが挙げられる。
ＰＨＯ８１プロモーターの下流に組み込む構造遺伝子と
しては抑制性酸性ホスファターゼ発現調節因子をコード
する調節遺伝子（ＰＨＯ８１）、ａｄｗ型やａｄｒ型な
どのＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子、
ヒトα−インターフェロン遺伝子、ヒトβ−インターフ
ェロン遺伝子。
ヒトチーインターフェロン遺伝子、ヒトリゾチーム遺伝
子、ヒトインターロイキン−２遺伝子などが挙げられる
。
ＰＨＯ８１プロモーターを含有するＤＮＡで形質転換す
る宿主としては酵母が好ましく１例えばサツカロミセス
属菌が挙げられ、さらに具体的には種サッカロミセス・
セレビシエ、サッカロミセス・セレビシエ　ＡＨ２２Ｒ
−（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ）　、　８０．１　（１９８３）〕や同Ｎ
Ａ９５−４Ｂ　（前出）などが挙げられる。
このようにして得られた形質転換体の培養に用いられる
培地としては、たとえばそれ自体公知のＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒ最小培地〔プロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　＋　７１，４
５０５　（１９８０））が挙げられる。
また培養温度、時間などの条件は、目的とする遺伝子産
物の産生が最高になるよう定められるが、一般に温度は
通常約１５℃〜４０℃、好ましくは約２４℃〜３７℃、
また時間は約１０時間〜９６時間、好ましくは約２４時
間〜７２時間であり。
必要により通気や撹拌を加えることもできる。
培養物中に蓄積された遺伝子産物は、当分野における通
常の方法、たとえばザイモリエース（キリンビール株式
会社製）など溶菌酵素を用いる方法、ガラスピーズを用
いる機械的破砕法などによって菌体を破砕して目的物を
抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ１００などの
界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加え、
目的物の抽出を容易にすることもできる。このようにし
て得られた抽出液からの目的物の分離精製は、通常知ら
れている蛋白質の精製方法、たとえば、沈殿剤による沈
殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹脂などによる
クロマトグラフ法、ゲルろ適法、抗体カラムを用いる方
法などを組み合せて行うことができる。
旦 真植生物たる酵母から新規で強力なプロモーターを得る
ことができたため、これを用いて薬理学的に重要な蛋白
質遺伝子の発現を効率よく行うことができる。
ス】１１及ｐ遂１艮 以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。
実施例１に開示する、原料として用いたサツカロミセス
　セレビシェ　Ｐ−２８−２４Ｇは、昭和６０年８月６
日から（財）発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ−１０１５
３として寄託されており、また本微生物は、ジ・アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔｈｅ　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ　、　Ａ　Ｔ　ＣＣ）　　（米国）にＡＴＣ
Ｃ−６０２０２として寄託されており、何人も分譲を受
けることができる。
実施例８に開示する形質転換体、エシェリヒアコリ　Ｄ
ＨＩ／ｐＡＣ４３０は、昭和６０年７月２４日からＩＦ
ＯにＩＦＯ−１４４５６として寄託され、また昭和６０
年８月９日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所（ＦＲＩ）にＦＥＲＭ　　Ｐ−８４１１として寄託
され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切換えら
れて、受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８９としてＦＲ
Ｉに保管されている。
実施例１２に開示する形質転換体、サツカロミセＸ−セ
レビシｚＡＨ２２Ｒ″″／ｐＡＣＺ４０３ハ、昭和６１
年５月２８日からＩＦＯにＩＦＯ−１０２０７として寄
託され、また昭和６１年６月２５日からＦＲＩにＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−１０９０として寄託されている。
塞腹五よ　ＰＨＯ８１遺伝子のクローニング（第１図参
照） ＮａｓｍｙｔｈとＲｅａｄの方法（Ｋ、Ａ、Ｎａｓｍｙ
ｔｈ＆　Ｓ、１．Ｒｅｅｄ、プロシージング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、　７７、２１１’９　
（１９８０））に従い、酵母−大腸菌シャトルベクター
ＹＥｐ１３（Ｊ、Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、ジ
ーン（Ｇａｎｇ）　、　８　、１２１（１９７９））の
ＢａｍＨＩ切断部位に互、見ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　Ｐ
−２８−２４Ｃ（ＩＦＯ−１０１５３）（ＭＡＴａ　　
ｐｈｏ３−１）（ＩＦＯ−１０１５３，ＡＴＣＣ−６０
２０２）から常法により得た染色体ＤＮＡの５ａｕ３Ａ
１部分分解断片を挿入して約２０００のアンピシリン耐
性（ＡｍｐＪテトラサイクリン感受性（Ｔｃ’）大腸菌
から成る酵母遺伝子バンクを作製した。この酵母遺伝子
バンクのプラスミドＤＮＡを用いてＳ、ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　　Ｎａ２Ｓ−４Ｂ　（ＭＡＴａ　　ｐｈｏ８１
Ｑｅｕ２　　ｈｉｓ３　　ｔｒｐｌｃ　ａ　ｎ　１）を
形質転換し、０．５ｍｇ／ｍＱのα−ナフチルリン酸、
５ｍｇ／ｍＱのファーストブルー塩Ｂ、０．０５Ｍトリ
ス−酢酸緩衝液で調製した１％寒天溶液を用いたコロニ
ー染色法（Ｄｏｒｎ　。
Ｇ、、ジェネティカル・リサーチ（Ｇａｎｓｔ、Ｒａｓ
、）、旦。
（１９６５）の改変法〕で、抑制性酸性ホスファターゼ
産生能を示すもの（ｒＡＣｐ”）をスクリーニングした
。約８　Ｘ　１０３個のロイシン非要求性（Ｌｓｕ＋）
形質転換体を調べたところ、５個のｒＡＣｐ＋形質転換
体が得られた。そのうちの１個のｒＡＣｐ＋形質転換体
からＣａｍｅｒｏｎらの方法（Ｊ、Ｒ，Ｃａｍｅｒｏｎ
　ａｔ、ａｌ、＊ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、　４　、１４
２９（１９７７））に従ってプラスミドＤＮＡを調製し
。
Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＡ２２１の形質転換に用いた。
得られた３５個のＡｍｐｒ形質転換体はすべてＴＣ″で
あり、また同一分子量のプラスミドを持っていた。この
プラスミドをｐＡｃ４と命名し、再び旦、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　　Ｎａ２Ｓ−４Ｂの形質転換に用いた。得ら
れたＬｅｕ＋形質転換体のうち１８個の抑制性酸性ホス
ファターゼ産生能を調べたところ、すべてｒＡＣｐ＋で
あった。
したがってＰＡＣ４にはＰＨＯ８１遺伝子を含むＤＮＡ
断片が挿入されていると考えられる。ＰＨＯ８１遺伝子
が含まれているならば、ｐＡＣ４はその相同性を利用し
て、染色体上のｐｈｏ８１遺伝子座に組み込まれること
が予想される。ｐＡＣ４をＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
　ＹＡＴ　　４０８（Ｑｅｕ２．ＱｙｓｌＯ，ｃａｎｌ
、ａｉｒ”　）に組み込んだ形質転換体が安定性試験の
際に得られたので、四分子分析を行い、組み込まれた位
置を決定した。ｐＡＣ４が組み込まれた形質転換体をＳ
、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　　ＹＡＴ６３７　　（ＭＡ
Ｔａ　　ｐｈｏ８１　　Ｑａｕ２）と交雑し、四分子分
析した結果、Ｌｅｕ”Ａｃｐ”：Ｌｅｕ″Ａｃｐ−の比
が４：０．３：１，２：２を示す子のうの数はそれぞれ
、０，２．２１であった。またｐＡＣ４が組み込まれた
形質転換体をＳ、ｃｅｒｅｙｉｓｉａｅ　　ＹＡＴ６１
　（ＭＡＴａ　　ＰＨＯ８１ＬＥＵ２）と交雑し、四分
子分析した結果、Ｌｅｕ”：Ｌ、ｅｕ−の比が４：０，
３：１，２：２を示す子のうの数はそれぞれ、２，３３
．４であった。以上の結果より、ＰＡＣ４はＰＨＯ８１
遺伝子座あるいはその近くに組み込まれており、ｐＡＣ
４にはＰＨＯ８１遺伝子がクローン化されていると結論
した。
尖ｕ　　ＰＨＯ８１遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素
地図作成（第１図参照） ＤＮＡ断片の制限酵素処理はｐＡＣ４ＤＮＡ（１〜５μ
ｇ）をＴＡ緩衝液ＣＰ、Ｈ，０’Ｆａｒｒｅｌｌ　ｅｔ
。
ａｌ、、　　（モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジェ
ネティクス（Ｍｏｌａｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　、
　１７９　、４２１　（１９８０））中で、４〜６ユニ
ツトの各種制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄＩ［［。
Ｐｓｔｌ、５ａＱｌ、Ｘｈｏｌ）単独または二種順組み
合わせ、３７℃で１時間作用させて行った。
反応液を１％アガロースゲル電気泳動あるいは７゜５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、切断パターン
を検品し、ＤＮＡ断片の分子量を推定し、制限酵素地図
を作成した（第１図）。制限酵素部位の略号は次のとお
りである。Ｅ：ＥｃｏＲｌ、Ｈ：Ｈｉｎｄｍ、Ｓａ　：
　ＳａＱ　Ｉ、Ｘ：Ｘｈｏｆ、Ｐ：Ｐｓｔｌ、Ｂ：Ｂａ
ｍＨｌ。
２　　クローン化されたＤＮＡ断片上のＰＨ○８１′ａ
伝子の位置の推定（第２図参照）クローン化されたＤＮ
Ａ断片上のＰＨＯ８１遺伝子の位置を推定するためＰＡ
Ｃ４の欠失誘導体を作成した。ｐＡＣ４（５μｇ）を６
ユニツトのＢ　ａ　ｍ　ＨＩを加えたＴＡ緩衝液５０μ
ｇ中で３７℃１分間反応させた後、６５℃で１０分間加
熱して反応を停止させ部分分解物を得た。この反応液２
５μＱを含むＴ４リガーゼ反応液（５ｍＭＭｇＣｎａｐ
　１０　ｍＭジチオスレイトール、０．０５ｍＭ　　Ａ
ＴＰ、Ｔ４リガーゼ３ユニット）５０μａを４℃で１８
時間反応させ、分解物を再結合させた０次に１０μＱの
上記Ｔ４リガーゼ反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉＪＡ２２
１を形質転換し、得られたＡｍｐ　　形質転換体からＢ
ｉｒｎｂｏｉｍとＤｏ１２ｙの方法［Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ　＆　Ｊ、Ｄｏｌｙｔヌクレイツク・アシズ・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ−）ｙユ
、１５１３　（１９７９）］に従ってプラスミドＤＮＡ
を分離し、欠失プラスミドｐＡＣ４−ＬＢ３を得た。ま
たＰＡＣ４から５ａＱＩ、Ｘｈｏｌをそれぞれ用いて前
述と同様な方法で欠失プラスミドＰＡＣ４−ＬＳＩおよ
びｐＡＣ４−ＬＸｌを作製した。またＰＡＣ４−ＬＢ３
からＨｉｎｄＩ［Ｉを用いて前述と同様な方法で欠失プ
ラスミドｐＡＣ４−ＬＢ３Ｈを作製した。得られた欠失
誘導体プラスミドＤＮＡでＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
　Ｎａ２Ｓ−４Ｂを形質転換し、得られたＬｅｕ＋形質
転換体１０株の抑制性酸性ホスファターゼ（ｒＡＣｐ”
）表現型を調べた。各欠失プラスミドのｐｈｏ８１変異
相補能を第２図に示した（各プラスミド右端の＋、−）
。
なおｐＡＣ４−ＬＸＩでＳ、ｃａｒａｖｉｓｉａｓ　　
Ｎａ２Ｓ−４Ｂを形質転換し、得られたＬｅｕ　　形質
転換体のｒ　Ａ　Ｃｐ生産能は、野生型のＳ、ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅのｒＡＣｐ生産能に比べて弱かった（第２
図では士で示した）１以上の結果から、ＰＨＯ８１遺伝
子は第２図の白抜きの断片領域（約３．Ｃ）ｋｂ）に存
在することがわかった。
実施例４　　ｐＡＣ４−ＬＢ３を保持する形質転換体の
酸性ホスファターゼの生産性 実施例３で得たｐＡＣ４−ＬＢ３を保持する酵母形質転
換体（サッカロミセス・セレビシエ　Ｎａ２Ｓ−４８／
ｐＡＣ４−ＬＢ３）をパークホルダー改変高リン酸培地
および低リン酸培地（Ａ。
Ｔｏｈ−ｅ　ｅｔ、ａｌ、、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、　　１１
３．７２７　（１９７３））５ｍＱで２０時時間上う培
養した後、菌体を集め、ドリアニーの方法（Ａ、Ｔｏｒ
ｒｉａｎｉ、バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・ア
クタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　
　、　　３８．　４６０　　（１９６０）　）を一部改
変して、酸性ホスファターゼ活性を測定した結果を第１
表に示す。
第１表から判るようにｐＡＣ４−ＬＢ３による酸性ホス
ファターゼの生産はリン酸によって抑制を受けており、
クローン化されたＰＨ○８１ｆｉ伝子は、ＰＨＯ５の発
現を調節するタンパク質（ＰＨＯ８１産物）をコードす
る領域およびそのプロモーター領域を含んでいると考え
られる。
実施例５　　ＰＨＯ８１遺伝子転写産物の同定ノザンハ
イブリダイゼーション法によってＰＨＯ８１転写産物の
同定を行った。ポリ（Ａ）”　ＲＮＡはＪｅｎｓｅｎら
の方法（Ｒ，Ｊａｎｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、。
プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ、）　。
見立、３０３５　（１９８３））に−って完全培地（十
Ｐ）と低リン酸培地（−Ｐ）で培養したサッカロミセス
・セレビシエ　Ｐ−２８−２４Ｇから全ＲＮＡを調製し
た後、５ｃｈＱａｉｆとＷｅｎｓｉｎｋの方法［Ｒ，Ｆ
、５ｃｈｌｅｉｆ　＆　Ｐ、Ｃ，Ｖｅｎｓｉｎｋ。
プラクティカル・メソッズ・イン・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｇｅｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ）＋　（１９８
１）　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）に従って
オリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニティ力ラムクロマト
グラフィーを行って精製した。ポリ（Ａ）ＲＮＡ試料は
文献〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｓｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ）、　　（１９８２）　ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）記載
のホルムアルデヒド変性ゲル電気泳動を行い、Ｔｈｏｍ
ａｓの方法（Ｐ、Ｓ、Ｔｈｏｍａｓ、プロシージング・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、）　、ニア、５２０１　（
１９８０））に従って、プロッティングおよびハイブリ
ダイゼーションを行った。オートラジオグラフィーはコ
ダックＸ−オーマットＲＰフィルムとコダックィンテン
シファイングスクリーンを用いて一８０’Ｃで行った。
転写産物の同定に使用したプローブＤＮＡはｐＡｃ４５
０　（クローン化された酵母染色体ＤＮＡ　（第１図）
上の９．２ｋｂｐ付近のＢａｍＨＩ切断部位から、ＹＥ
ｐ１３上の５ａｆｌｌ切断部位までの約３．２ｋｂのＢ
ａｍＨＩ−８ａｉｌ断片をＢａｍＨＩ、５ａｉｌで二重
消化したｐＢＲ３２２にサブクローニングしたプラスミ
ド〕　゛をニックトランスレーションして［Ｐ、１１．
Ｊ、Ｒｉｇｂｙｅｔ、ａｌ、、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、
　１１３　、２３７　（１９７７）〕作製した。
その結果を第３図に示したが、ＰＨＯ８１の転写物の大
きさは２．８ｋｂであり、その転写量がオロチジン５″
ホスフエートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子Ｕ
ＲＡ３　（ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ
・イースト・サツカロミセス、ライフ・サイクル・アン
ド・インへりタンス（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｅｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ、１ｉｆｅ　ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　１
ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｅｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂ、）　７３１頁（１９８１））の転写
産物の量よりきわめて多い事実はＰＨＯ８１プロモータ
ーの強さを示唆している。また高リン酸条件下（十Ｐ）
ではＰＨＯ８１の転写は抑制されており、ＰＨＯ８１プ
ロモーターはリン酸による抑制を受けていると考えられ
る。
ヌ」１阿」エ　ＰＨＯ８１遺伝子を含む３．０ｋｂＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図の作成 ＰＨＯ８１遺伝子を含むＢａｍＨＩ−８ａｕ３Ａｌ／Ｂ
ａｍＨＩＤＮＡ断片（第２図の白抜部分の領域）の制限
酵素地図を１４種類の制限酵素（Ａ！ｌｕｌ、ＢａｎＩ
Ｉ、ＢｓｔＮＩ、Ｄｄｅｌ。
ＥｃｏＲＩ、Ｈａｅｍ、Ｈｉｎｄｍ、Ｈｐａ　Ｉ。
Ｈｐ　ａ　ＩＩ　、　Ｒｓ　ａ　Ｉ　、　Ｓ　ａ　Ｑ　
Ｉ　、　Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａ　Ｉ　。
５ａｕ９６１．Ｘｈｏｌ）を用いて作成した（第４図）
、常法に従って各種制限酵素の単独あるいは二種類組み
合わせによって生じた反応物を７゜５％あるいは１２％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その切断パタ
ーンから各制限酵素の切断部位を推定した１分子量マー
カーとしてＰＢＲ３２２のＨａ　ｅｍ分解物あるいはＡ
　Ｑ　ｕ　１分解物を用いた。なお切断部位は確認でき
たもののみ記入した。
ス〕Ｌ剋３−　ＰＨＯ８１遺伝子を含むＤＮＡの塩基配
列の決定 ＰＨＯ８１遺伝子を含むと考えられるＢａｍＨ１＝Ｂａ
ｍＨＩ／５ａｕ３Ａ　３．０ｋｂのＤＮＡ断片（第２図
参照）の塩基配列をＭ　ａ　ｘ　ａ　ｍとＧｉＱｂｅｒ
ｔの方法（前出）に従って決定した（第５図）、この塩
基配列のうちにおよそ２．５ｋｂの翻訳可能領域が存在
した。このフレームより予想される転写方向は、Ｂ　ａ
　ｍ　ＨＩ切断部位からＢａｍＨＩ／５ａｕ３Ａ結合部
位への方向であり、ＢａｍＨＩ切断部位からおよそ５２
０塩基下流付近に翻訳開始コドン”ＡＴＧ”が出現する
。ＡＴＧより上流６７ｂｐにＴＡＴＴＡという配列が見
出され、これがＴ　Ａ　Ｔ　Ａ　ｂ　ｏ　ｘとして機能
していると考えられる。またＡＴＧより上流５７ｂｐに
ＴＣＡＴＣＡという配列が見出され、これはｃａｐｐｉ
ｎｇ　　５ｉｔｅと類似な配列である。
第５図にはＢａｍＨＩ切断部位より、７ｏＯ塩基下流ま
での塩基配列を示したが、この領域にＰＨＯ８１遺伝子
の５′上流非翻訳領域およびＰＨ○８１遺伝子の５′末
端領域が含まれていると考えられる。
実施例８　プラスミドｐＡｃ４３０の構築とその形質転
換体の製造 ５μｇのｐＡＣ４−ＬＢ３に５ユニツトのＢａｍＨＩお
よび５ユニツトの５ａ１２１を実施例２に記載の方法で
反応させ、その反応液を１％ローメルティングアガロー
ス電気泳動にかけた。
ゲルから３．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これを５ユ
ニツトのＢａｍＨＩと５ユニツトの５ａｆｉｌで切断し
たｐＢＲ３２２（５μｇ）と混合し。
実施例２に記載の方法に従ってＴ４リガーゼを作用させ
ｐ　ＡＣ４３０を得た（第６図参照）。
このｐＡｃ４３０でＥ、ｃｏＱｉ　　ＤＨＩを形質転換
してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃａｄｉＤＨＩ／ｐＡ
ｃ４３０（Ｉ　ＦＯ−１４４５６，ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
０８９）を得た。
実施例９　　ＰＨＯ８１プロモーターを利用するａｄｗ
型Ｂ型肝炎ウィつス表面抗ＪＩＰ２５遺伝子発現プラス
ミドの構築および 該プラスミドによる酵母の形質転換 プラスミドｐＡｃ４３０．０．５μｇに１ユニツトの制
限酵素Ａｃ　ｃ　１１にッポンジーン社製）を２０ｔｔ
Ｑの反応液（６ｍＭ　Ｔｒｉ　５−ＨＣＱ（ｐＨ７、５
）　、　６０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ　、　６　ｍ　Ｍ
　Ｍ　ｇ　ＣＱ　、　。
６ｍＭ　　２−メルカプトエタノール〕中で３７℃、２
時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノー
ルを加えてＤＮＡを沈殿させる。該ＤＮＡと５０ｎｇの
５′末端がリン酸化された５ａ１２Ｉリンカ−（５’−
Ｐ−ｄ（ＧＧＴＣＧＡＣＣ））（Ｎａｖ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とを混合し、２０μｍの反応
液（６６ｍＭ　Ｔｒｉ　５−ＨＣＱ（ｐＨ７，６）＝　
６−６ｍＭ　ＭｇＣＱｚ−１０ｒｎＭ　ジチオスレイト
ール、１ｍＭ　ＡＴＰ、２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）〕
中、１４℃で一夜作用させてＤＮＡを結合させる。
該反応液を用いて大腸菌Ｄ　Ｈ１（Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｔ、ら。
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　２５４−２５５（１９
８２））を形質転換させ、アンピシリン耐性を示す組み
換え体の中から、ｐＡｃ４３０のＡｃｃ１１部位が５ａ
ＱＩ部位に変換したプラスミドＰＡＣ４３０−１を取得
する（第７図参照）。該プラスミド１０μｇに各１０ユ
ニツトの制限酵素ＢａｍＨＩと５ａＱＩにッポンジーン
社製）とを５０）ｔＱの反応液（１０ｍ　Ｍ　　Ｔ　ｒ
　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）、７ｍＭ　　Ｍｇ
ＣＱ、、１００ｍＭＮａＣＱ、７ｍＭ　　２−メルカプ
トエタノール〕中で３７℃、２時間作用させた後、該反
応液を１゜２％アガロース・スラブゲルを用いて緩衝液
〔１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｎ、１００ｍＭホウ酸
、２ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，３））中、１４０ｖ
、２時間電気泳動にかける。泳動後、０．５ｋｂＤＮＡ
断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩
衝液内に沈め、該ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出す
る（ＭｃＤｏｎａｌｌ、Ｍ、１．ら、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、　１１０．１１９　（１９７７
）　）−透析チューブ内液をフェノール抽出さらにエー
テル抽出した後、ＮａＣＱを０．２Ｍになるように加え
、つづいて２倍量の冷エタノールを加えて、ＰＨＯ８１
プロモーターを含む該ＤＮＡを沈殿させる。
特願昭５９−１９３７６５号（出願臼：昭和５９年９月
１３日）明細書（特開昭６１−７０９８９号公報に対応
する。）の実施例に記載されているａｄｗ型Ｂ型肝炎ウ
ィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ　Ｐ　２５）遺伝子発現プ
ラスミドｐＰＨＯ１７−５８，５０μｇに５０ユニツト
の制限酵素Ｘｈ。
Ｉ　にツポンジーン社製）を１００μＱの反応液（１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）。
７　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＤ　、　、　　１００　ｍ　
Ｍ　　　Ｎ　ａ　ＣＱ　、　　７ｍＭ２−メルカプトエ
タノール〕中で３７℃、２０分間作用（部分分解）させ
た後、該プラスミド中に２箇所存在するＸｈｏ１部位の
うち１箇所だけが切断された９、１ｋｂ　　ＤＮＡを、
前記条件下アガロース・スラブゲルで分離し、ゲルから
該ＤＮＡを回収する。
該９．１ｋｂ　　ＤＮＡ、４μｇに４ユニツトの制限酵
素ＢａｍＨＩを２０μ悲の反応液（６ｍＭＴｒｉ　５−
ＨＣＱ　（ｐＨ７，９）、１５０ｍＭＮａＣＱ、６ｍＭ
　　ＭｇＣＱ、〕中で３７℃、２時間作用させた後、該
反応液を前記条件下で電気泳動にかけ８．５５ｋｂ　　
ＤＮＡを分取する。
２００ｎＨの該８．５５ｋｂ　　ＤＮＡと２０ｎｇの前
記ＰＨＯ８１プロモーターを含む０．５ｋｂＤＮＡとを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用により結合させる。該反応液
を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換させ、アンピシリン耐
性形質転換体の中からＰＨＯ８１プロモーターがＨＢ　
ｓ　Ａ　ｇ　Ｐ　２５遺伝子と順方向に挿入されたプラ
スミドｐＰＨＯ８１−Ｐ２５を含有する形質転換体ＤＨ
Ｉ／ＰＰＨＯ８１−Ｐ２５を分離する。さらに該形質転
換体からプラスミドｐＰＨＯ８１−Ｐ２５を単離する（
第７図参照）。
該プラスミドを用いて酵母宿主サッカロミセス・セレビ
シエ　ＡＨ２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体（ＡＨ２
２Ｒ−／ｐＰＨＯ８１−Ｐ２５）を取得する。
ｕ　　Ｐ　ＨＯ８１プロモーターを利用するａｄｒ型Ｂ
型肝炎ウィつス表面抗原Ｐ３ １遺伝子発現プラスミドの構築および 該プラスミドによる酵母の形質転換 ＰＣＴ／ＪＰ８４／４２３号（国際出願口：１９８４年
９月４日）特許出願明細書（特開昭６１　゛−４３９９
１号公報に対応する。）実施例３に記載のａｄｒ型Ｂ型
肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ　　Ｐ３１）遺伝子
発現プラスミドｐＰＨＯＰ３１−Ｒ，５０μｇに５０ユ
ニツトの制限酵素５ａＱＩを１００μｌｌの反応液（６
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，９）、１５０ｍ
Ｍ　　ＮａＣＱ、６ｍＭ　　ＭｇＣＱ、、６ｍＭ　　２
−メルカプトエタノール〕中で３７℃、２０分間作用（
部分分解）させた後、該プラスミド中に２箇所存在する
５ａｌＩ部位のうち１箇所だけが切断された９゜７ｋｂ
　　ＤＮＡを、前記条件下アガロース・スラブゲルで分
離し、ゲルから該ＤＮＡを回収する。
該９．７ｋｂ　　ＤＮＡ、４μｇに４ユニツトの制限酵
素ＢａｍＨＩを前記条件下で作用させ、該反応液を電気
泳動にかけ９．２ｋｂ　　ＤＮＡを分取する。
２００ｎｇの該９．２ｋｂ　　ＤＮＡと２０ｎＨの前記
ＰＨＯ８１プロモーターを含む０．５ｋｂＤＮＡとをＴ
４ＤＮＡリガーゼの作用により結合させる。該反応液を
用いて大腸菌ＤＨＩ株を形質転換させ、アンピシリン耐
性の形質転換体の中からＰＨＯ８１プロモーターがＨＢ
ｓＡｇ　　Ｐ３１遺伝子と順方向に挿入されたプラスミ
ドＰ　ＰＨＯ８１−ｐ３１を含有する形質転換体ＤＨＩ
／ＰＰＨＯ８１−Ｐ３１を分離する。さらに該形質転換
体からプラスミドｐＰＨｏ　　８ｌ−Ｐ３１を単離する
（第７図参照）。
該プラスミドを用いて酵母宿主サツカロミセスセレビシ
ェ・ＡＨ２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体（サツカロ
ミセス　セレビシェ・ＡＨ２２Ｒ／ｐＰＨｏ　　８ｌ−
Ｐ３１）を取得する。
叉胤匠上工　　ＨＢｓＡｇ遺伝子の酵母における発現 実施例９と１０で得られるＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子発
現プラスミドを保持するサッカロミセス・セレビシエ形
質転換体（ＡＨ２２Ｒ／ｐＰＨｏ　　Ｐ８１−Ｐ２５お
よびＡＨ２２Ｒ−／ｐＰＨｏ　　Ｐ８１−Ｐ３１）をＢ
ｕｒｋｈｏｌｄｅｒおよびその低リン酸培地で３０℃、
２日間培養した後、菌体を集め、生理食塩水で洗浄する
。Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａらの方法（プロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、　８０．　１　　（１９８３）　
）に従って、菌体をＺｙｍ、ｏｌｙａｓｅ［生化学工業
（株）製］によってスフェロプラストにした後、スフェ
ロプラストに０．１％トリトンＸ−１００を添加してＨ
Ｂ　ｓ　Ａ　ｇを抽出する。溶菌液を室温で１５，００
０ｒｐｍ、１５分間遠心分離にかけて上清液を得る。こ
の上清液のＨＢ　ｓ　Ａ　’ｇ活性をオースザイム■〔
ダイナボット（株）製〕を用いて測定すると、該活性が
検出される。
ス：、ｉｔｍエ　ＰＨＯ８１プロモーターを用いるＱａ
ｃＺ遺伝子の発現 ＰＨＯ８１遺伝子を含むｐＡｃ４３０　（第２図の白抜
部分〜ＹＥＰ１３上のＳａ　Ｑ　Ｉ）　１ｏμｇに各１
０ユニツトの制限酵素５ｃａｌ、ＳｍａＩ〔宝酒造（株
）製〕を１００μＱの反応液〔３３ｍＭＴｒｉｓ−酢酸
（ｐＨ７，９）、６６ｍＭＫ−酢酸、１０ｍＭ　　Ｍｇ
−酢酸ｖ　５ｍＭ　　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｏｔｈｏ
ｌ）中で３７℃、２時間作用させた後、４％アクリルア
ミドゲルを用いて緩衝液（８９ｍＭ　　Ｔｒｉｓ、８９
ｍＭホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ）中、１５０Ｖ、３時
間電気泳動を行った。泳動後、２１００ｂｐ　　ＤＮ、
Ａ断片（Ｓｃａ　Ｉ−Ｓｍａ　Ｉ断片）を含むゲル片を
コレツクスチューブ内に入れ、ゲルを破砕後、ＤＮＡ抽
出液（０−５Ｍ　　　（ＮＨ４）ＣＯＯＣＲ３，１０ｍ
ＭＭｇ−酢酸、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ
）ＳＤＳ）５ｍＭを加え、３７℃で一晩放置した。ゲル
を含む溶液をろ過し、ＤＮＡ断片を含むろ液にエタノー
ルを加えてＤＮＡ断片を沈澱として回収した。ｐＭＣ１
５８７１Ｍｇに１ユニツトの制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造
（株）製〕を５０μｍの反応液（１ｍＭ　　Ｔｒｉｓ、
１０ｍＭ　　Ｎａ　ＣＱ＋　０．６　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　
ＣＯ２）中で３７℃、２時間作用させた後、エタノール
を加えてＤＮＡ断片を沈澱として回収した。上記、Ｓｍ
ａ　Ｉ消化ＰＭＣ１５８７，Ｏ，ｔｕｇと、ＳｃａＩ−
Ｓｍａ１　２１００ｂｐＤＮＡ断片５μｇを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼの作用によって連結する（第８図）、
このようにして作成したプラスミ°ドは、ＳｃａＩ−Ｓ
ｍａＩ　　２１０Ｏｂｐ上に一部存在するＰＨＯ８１翻
訳配列と、ＰＭＣ１５８７上に存在する１ａｃＺ翻訳配
列が、ＳｍａＩ結合部位においてつながり、両遺伝子の
フレームが一致した（第８図参照）。
このようにして得たプラスミドｐＡｃＺ４０３を用いて
サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２Ｒ−を形質転換し
、その形質転換体サツカロミセス、・セレビシェＡＨ２
２Ｒ−／ｐＡＣＺ４０３（ＩＦＯ−１０２０７，ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−１０９０）を取得した。この形質転換体を
実施例１１記載の方法によって２０時間培養し、得られ
た菌体を実施例１１記載の方法で処理し、以下の結果を
得た。
高リン酸培地（Ｋ　Ｈ４Ｆ　Ｏ４１，５ｇ／　Ｑ　）　
　　６００低ＩＪ　’）酸培地（Ｋ　Ｈ，Ｐ　Ｏ４０，
３ｇ／　Ｑ　’）　　　２６００ＰＨＯ８１遺伝子を含
むと考えられるＢａｍＨｌ−ＢａｎＩＩ（約２．６ｋｂ
）のＤＮＡ断片の全基配列を実施例７記載のＭａｘａｍ
　　＆　　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法で決定した。その結果
は第９図に示す通りであった。
ストップコドンは２３３０ｂｐ附近に出現する。
【図面の簡単な説明】
第１図はＰＨＯ８１遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入され
たプラスミドＰＡＣ４の制限酵素地図であり、また第２
図は本発明でクローン化さ九たＰＨＯ８１構造遺伝子及
びＰ）１０８１プロモーターを含有するＤＮＡ断片およ
びその誘導体の制限酵素地図、およびそれらの活性相補
能を示す図である。 第３図はＰＨＯ８１転写産物の同定に関する図である。 第４図はＰＨＯ８１を含むクローン化されたＤＮＡ断片
の制限酵素切断地図であり、第５図はＰＨＯ８１プロモ
ーター近傍の塩基配列である。 第６図はプラスミドｐＡｃ４３０の構築図である。 第７図はａｄｗ型およびａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィルス表面
抗原遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子の構築図であ
り、第８図はＱａｃＺ発現プラスミドの構築図である。 第９図はＰＨＯ８１遺伝子を含む塩基配列を示す図であ
る。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）サッカロミセス・セレビシエから得られ、ホスフ
    ァターゼの生産を調節する遺伝子ＰＨＯ８１のプロモー
    ター（ＰＨＯ８１プロモーター）活性を有するＤＮＡ。
  2. （２）遺伝子ＰＨＯ８１が、その転写がリン酸による調
    節を受けるものである特許請求の範囲第１項記載のＤＮ
    Ａ。
  3. （３）第９図で示される塩基配列の第１番目から制限酵
    素Ｓｍａ I による切断位置までの塩基配列を包含する
    特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
  4. （４）組み換えＤＮＡである特許請求の範囲第１項、第
    ２項または第３項記載のＤＮＡ。
  5. （５）ＰＨＯ８１プロモーターの下流に構造遺伝子を有
    する特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４
    項記載のＤＮＡ。
  6. （６）構造遺伝子が抑制性ホスファターゼ産生調節因子
    の構造遺伝子以外の構造遺伝子である特許請求の範囲第
    ５項記載のＤＮＡ。
  7. （７）サッカロミセス・セレビシエから得られ、ホスフ
    ァターゼの生産を調節する遺伝子ＰＨＯ８１のプロモー
    ター（ＰＨＯ８１プロモーター）活性を有するＤＮＡを
    含有する形質転換体。
  8. （８）遺伝子ＰＨＯ８１が、その転写がリン酸による調
    節を受けるものである特許請求の範囲第７項記載の形質
    転換体。
  9. （９）第９図で示される塩基配列の第１番目から制限酵
    素Ｓｍａ I による切断位置までの塩基配列を包含する
    ＤＮＡである特許請求の範囲第７項記載の形質転換体。
  10. （１０）ＤＮＡの下流に構造遺伝子を有する特許請求の
    範囲第７項、第８項または第９項記載の形質転換体。
  11. （１１）宿主が酵母である特許請求の範囲第７項、第８
    項、第９項または第１０項記載の形質転換体。
  12. （１２）サッカロミセス・セレビシエから得られ、ホス
    ファターゼの生産を調節する遺伝子ＰＨＯ８１のプロモ
    ーター（ＰＨＯ８１プロモーター）活性を有するＤＮＡ
    およびその下流に構造遺伝子を有するＤＮＡを含有する
    形質転換体を培地に培養し、培養物中に生成蓄積された
    遺伝子産物を採取することを特徴とする遺伝子産物の製
    造法。
  13. （１３）遺伝子ＰＨＯ８１が、その転写がリン酸による
    調節を受けるものである特許請求の範囲第１２項記載の
    遺伝子産物の製造法。
  14. （１４）第９図で示される塩基配列の第１番目から制限
    酵素Ｓｍａ I による切断位置までの塩基配列を包含す
    るＤＮＡである特許請求の範囲第１２項記載の遺伝子産
    物の製造法。
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