JPS62151181A - 新規ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
新規ｄｎａおよびその用途Info
- Publication number
- JPS62151181A JPS62151181A JP60287860A JP28786085A JPS62151181A JP S62151181 A JPS62151181 A JP S62151181A JP 60287860 A JP60287860 A JP 60287860A JP 28786085 A JP28786085 A JP 28786085A JP S62151181 A JPS62151181 A JP S62151181A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- dna
- promoter
- yeast
- alkaline phosphatase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【ｌ直Δ■皿水更
本発明は酵母から得られたプロモーターを含む新規ＤＮ
Ａおよびその遺伝子工学への用途に関する。 盗】ぼり１権 組み換えＤＮＡ技術が広く利用されるようになって、有
用なポリペプチドの原核生物や真植生物を用いた生産が
可能になってきた。これまでこれら物質の大量生産には
主として大腸菌が利用されてきたが、特に薬理学的に重
要なポリペプチドの生産には真植生物の利用が望まれる
。酵母は真核生物であり他の真核生物、特に哺乳動物細
胞と数々の共通点を有しているために哺乳動物由来の蛋
白質遺伝子を発現させるのに有利である。さらに酵母細
胞はエンドトキシンを含有しないこと、酵母は微生物で
あるために培養が容易であること、古くから大量培養が
工業的になされており、その安全性が確認されているこ
と、その遺伝生化学的解析が数多くなされていることな
どの理由から、酵母を宿主として利用することに注目が
集まっている。 現在、遺伝子クローニングのための酵母ベクターはいく
つか知られているが、異種遺伝子を効率よく発現させる
ための強力な酵母プロモーターはあまり知られていない
。 酵母サツカロミセス・セレビシェの細胞破砕液中には二
種類のアルカリ性ホスファターゼの存在が知られている
。その一つは無機リン酸によってその生産が抑制され、
基質特異性の広い抑制性アルカリ性ホスファターゼであ
り、他の一つはｐ −二トロフェニルリン酸のみを基質
にし、かつ構成的に産生される特異的ｐ−ニトロフェニ
ルホスファターゼである。抑制性アルカリ性ホスファタ
ーゼ活性を欠く突然変異体としてｐｈｏ８変異体とｐｈ
ｏ９変異体が分離されており、ｐｈｏ３遺伝子は抑制性
アルカリ性ホスファターゼの構造遺伝子であり、ｐｈｏ
９遺伝子はｐｈｏ８転写以後に必須で液胞的加水分解酵
素群の前駆体を活性化させると考えられている。 、口が解′ しようとする間 々 現在、遺伝子クローニングのための種々の酵母ベクター
が知られており、利用が可能である。しかし同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させるためには、用いる宿
主に適した強力な酵母プロモーターを選択する必要があ
る。 。 色を解決するための手 本発明者らは、酵母の抑制性アルカリ性ホスファターゼ
プロモーター（ＰＨ０８プロモーターと称する。）に着
目し、抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする領
域をクローン化し、その制限酵素切断地図を作成すると
ともに、その全塩基配列を決定したところ該プロモータ
ーは新規なりＮＡであること、これを用いて同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させることができることを
見出し、これらに基づいて更に研究した結果、本発明を
完成したものである。 本発明はＰＨ０８プロモーターを含有する組み換えＤＮ
Ａ、ＰＨ○８プロモーターの下流に構造遺伝子が組み込
まれた組み換えＤＮＡ、ＰＨ０８プロモーターを含有す
る組み換えＤＮＡを有する形質転換体、およびＰＨ０８
プロモーターの下流に構造遺伝子を含有するＤＮＡで形
質転換された形質転換体を培地に培養し、培養物中に生
成蓄積された遺伝子産物を採取することを特徴とする遺
伝子産物の製造法に関するものである。 上記プロモーターとしては、好ましくは例えば第５図に
おいて−９８９〜−１で示される塩基配列やプロモータ
ー活性を有するその断片が挙げられる。 本発明のＰＨ０８プロモーターおよび抑制性アルカリ性
ホスブアターゼをコードする構造遺伝子（ＰＨ０８と称
する。）を含むＤＮＡは、酵母菌体から分離、採取する
ことができる。 該酵母としては、いずれのものでもよいが、とくにサツ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ、ｏｍｙｃｅＳ）属菌が好
ましく、たとえばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられ、具体的にはたとえば
市販のパン酵母が挙げられる。 酵母からＤＮＡを抽出するには、たとえばメソッズ・イ
ン・セルラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈ。 ｄｓ ｉｎ Ｃａｌ １．Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖ。 １．１２．ｐ、１３〜４４ （１９７５）に記載の方
法あるいはこれに準じた方法によって行われる。 次に得られたＤＮＡを適当な制限酵素で処理したのち、
同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵
素で処理したプラスミド、あるいはファージに、上記で
得られたＤＮＡ断片を組み込んでシーンバンクを作製す
る。該プラスミドとしては例えばｐＢＲ，３２２や大腸
菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ１３（ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、３゜１２１ （１９７９）参照〕がまたファー
ジとしてはｃｈａｒｏｎ系ファージ〔ジャーナル・オブ
・ウィロロジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、２旦、５５５（
１９７９）参照〕などが用いられる。また必要により１
例えば大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ６（ジーン
（Ｇｅｎｅ）、８．１７ （１９７９）参照〕などを
用いてさらにサブクローニングする。 このようにしてクローン化されたＤＮＡを保持するベク
ターで、宿主微生物を形質転換する。 宿主微生物としては、酵母が好ましく、たとえばサツカ
ロミセス属菌が挙げられる。さらに具体的には、サツカ
ロミセス・セレビシェＮＡ７９−１０Ｃ株が挙げられる
。 なお、上記宿主微生物は、ｐｈｏ８変異体であることが
好ましい。 上記ＮＡ７９−１０Ｃ株は、通常の交雑法（ハンドブッ
ク・オブ・ジエネテイツクス（Ｈａ ｎ ｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｇｅｎｅｔ １ｃｓ）ｔ ｐ、３６６Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７４
）に従って得ることができる。すなわちＮＡ７９−１０
Ｃ株は、ＡＬ２１１−１２Ｂ株（払。 ｐｈｏ３−１．ｐｈｏ８．ａｒｇ６）（モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ。 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、２，１２７（１９８２））＝
Ａ８２２株（ａ、１ｅｕ２．ｈｉｓ４．ｃａｎｌ）〔プ
ロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｅ
ｔ、ＵＳＡ）、８０．１（１９８３）） 。 Ｄ１３−ＩＡ株（ａ、ｔｒｐｌ、ｈｉｓ３．ｇａ１２．
５ＵＣ２）（プロシージング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。 、Ｎａ ｔ Ｌ、Ａｃ ａ ｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）、
７６＋１０３５ （１９７９））およびＹＡＴ２２８株
（ａ、１ｅｕ２，１ｙｓｌｏ、ｃｙｈ、ｋａ、ｒｌ−１
）（（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、）、１４５，１４２１（１９８１））
を交雑することによって、取得できる。 このようにして得られたシーンバンクあるいはサブクロ
ーンを用いて、ｐｈｏ８変異体を形質転換することによ
りＰＨ０８プロモーターおよびその下流に抑制性アルカ
リ性ホスファターゼをコードする構造遺伝子が連結され
たベクターを保持する形質転換体が得られる。 形質転換するには、公知の方法たとえばプロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ｔＪｓＡ
）、７５．１９２９ （１９７８）＝ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、２７５，１０４ （１９７８）、Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＳ ｙｍ Ｐ
−＋ クオンティテイティブ・バイオロジー（Ｑｕａｎ
ｔ、Ｂｉｏｌ、）、土３．１３０５（１９７９）、プロ
シージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｔ
、ＵＳＡ）＋ ７６＋ １０３５ （１９７９）に記
載された方法あるいはこれに準じた方法によって行われ
る。 上記方法で得られた形質転換体が、ＰＨ０８プロモータ
ーおよび抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする
構造遺伝子を保持するかどうかは、次に記載の方法によ
り確認することができる。すなわち、該形質転換体を例
えばパークホルダー改変培地〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１１３＋ ７２７ （１９７
３）〕上にコロニーを形成させる。次にこれらコロニー
をクロロホルム蒸気で処理したのち、メーナフチルリン
酸およびファーストレッドＴＲ塩とを含有する寒天を重
層する。プロモーターおよび抑制性アルカリ性ホスファ
ターゼ遺伝子を含むＤＮＡがクローン化されていればコ
ロニーが赤色を示すことからＰＨ０８遺伝子の存在を確
認することができる１次にＰＨ０８遺伝子を含む形質転
換体からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限酵素
で切断後、たとえばアガロースゲル電気泳動あるいはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって挿入された遺伝
子を含むＤＮＡを単離することができる。この一連の基
本操作はすでに公知であり、たとえばモレキュラー・ク
ローニング（Ｍ。 １ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ。 ｒａｔｏｒｙに詳しく記載されている。 抑制性アルカリ性ホスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡの
塩基配列は、たとえばジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ １．Ａｃ
ａ ｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）。 ７４．５４６３ （１９７７））、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ法〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐ ｒ ｏ ｃ 。 Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）、７↓。 ５６０ （１９７７））などの方法を用いて決定できる
。 上記のようにしてクローン化されたＤＮＡ中のＰＨ０８
構造遺伝子の位置は欠失プラスミドと活性相補能との関
係から推定される（第１図参照）。 この推定された第１図の白抜き部分（制限酵素地図：第
４図参照）をもつプラスミドを用いてＰＨｏ８転写産物
を検出し、その大きさく第２図参照）と方向性（第３図
参照）とからＰＨ０８プロモーターの位置を推定する。 この推定されたＰ Ｈ０８プロモーターを含むＰＨ０８
の全塩基配列を明らかにしく第８図）、該ＤＮＡの塩基
配列に基づいて解読されるオープンリーディングフレー
ムの存在から、プロモーターはそのオープンリーディン
グフレーム上流にあることが予想される。オープンリー
ディングフレーム上流のＰＨ０８プロモーター活性〔抑
制性アルカリホスファターゼを産生させる能力あり（第
１表参照）〕を有する部分を調製（第９図参照）、該Ｐ
Ｈ○８プロモーター活性含有部分、必要に応じ更にその
下流に各種構造遺伝子をベクターに組み込み発現用ベク
ターを作製する（第１０図参照）。 該ベクターで宿主の形質転換を行い（第１０図参照）、
該形質転換体を培養することによって目的とする遺伝子
産物を製造することができる。 本発明のＰＨ０８プロモーター活性を有するＤＮＡとし
ては全合成あるいは半合成したものも用いることができ
る。 ＰＨ０８プロモーターを組み込むベクターとしては前出
（７）ＹＥ ｐ ６やＹＥｐ１３に加えｐｓＨ１９〔モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１
．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、土、７７１ （１９８４
））やｐＪＤＢ２１９ （ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、２７５，１０４ （１９７８）］などが挙げられる。 ＰＨ０８プロモーターの下流に組み込む構造遺伝子と
しては抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする構
造遺伝子（ＰＨ０８）、ａｄｗ型やａｄｒ型などのＢ型
肝炎つィルス表面抗［（ＨＢｓＡｇ）遺伝子、ヒトベー
インターフェロン遺伝子、ヒトβ−インターフェロン遺
伝子、ヒト７−インターフェロン遺伝子、ヒトリゾチー
ム遺伝子、ヒトインターロイキン−２遺伝子などが挙げ
られる。 ＰＨ○８プロモーターを含有するＤＮＡで形質転換する
宿主としては酵母が好ましく、例えばサツカロミセス・
セレビシェ ＡＨ２２Ｒ（プロシージング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）、ＵＳＡ ８０．
１ （１９８３））や同ＮＡ７９−Ｉ ＯＣ（前出）
などが挙げられる。 このようにして得られた形質転換体の培養に用いられる
培地としては、たとえばそれ自体公知のＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒ最小培地〔プロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７７．４５０５（１９８
０））が挙げられる。 また培養温度、時間などの条件は、目的とする遺伝子産
物の産生が最高になるよう定められるが、一般に温度は
通常約１５℃〜４０”Ｃ，好ましくは約２４℃〜３７℃
、また時間は約１０時間〜９６時間、好ましくは約２４
時間〜７２時間であり、必要により通気や撹拌を加える
こともできる。 培養物中に蓄積された遺伝子産物は、当分野における通
常の方法、たとえばザイモリエース（キリンビール株式
会社１りなど溶菌酵素を用いる方法、ガラスピーズを用
いる機械的破砕法などによって菌体を破砕して目的物を
抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ１００などの
界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加え、
目的物の抽出を容易にすることもできる。このようにし
て得られた抽出液からの目的物の分離精製は１通常知ら
れている蛋白質の精製方法、たとえば、沈殿剤による沈
殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹脂などによる
クロマトグラフ法、ゲルろ適法。 抗体カラムを用いる方法などを組み合せて行うことがで
きる。 詐」− 真核生物たる酵母から新規で強力なプロモーターを得る
ことができたため、これを用いて薬理学的に重要な蛋白
質遺伝子の発現を効率よく行うことができる。 実１日１玖ｍ 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。 なお、実施例１に開示するサツカロミセス・セレビシェ
Ｐ−２８−２４Ｃは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
にＩＦＯ−１０１５３として寄託され、又アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴ
ＣＣ−６０２０２として寄託されており、何人も分譲を
受けることができる。 実施例４で開示するサツカロミセス・セレビシェＮＡ７
９−Ｉ ＯＣ／ｐＡＬ１０９は、財団法人発酵研究所（
ＩＦＯ）にＩＦＯ−１０１４１として１通商産業省工業
技術院微生物工業硬究所（ＦＲｌ）に昭和５９年１２月
２１日からＦＥＲＭＰ−８０１６として寄託されている
。 実施例１２で開示するエシェリヒアコリＤＨ１／ｐＴＦ
１０３−５８は、ＩＦＯにＩＦＯ−１４４０９として
、ＦＲＩに昭和５９年１２月２６日からＦＥＲＭ Ｐ
−８０３６として寄託されている。 実施例１２で開示するサツカロミセス・セレビシェＡＨ
２２Ｒ−は、ＩＦＯにＩ ＦＯ−１０１３４として、Ｆ
ＲＴに昭和５９年９月４日からＦＥＲＭ ＢＰ−８０
４として寄託されている。 実施例１２で開示するサツカロミセス・セレビシェＡＨ
２２Ｒ／ｐＴＦ１０３−５８は、ＩＦＯニＩ ＦＯ−１
０１４３トして、Ｆ ＲＩ ニ昭和６０年３月１８日か
らＦＥＲＭ Ｐ−８１５８として寄託されている。 笑１１上 ＰＨ０８遺伝子のクローニングＮａ ｓｍｙ
ｔ ｈとＲｅｅｄの方法（Ｋ、Ａ、Ｎａｓｍｙｔｈ
＆ Ｓ、１．Ｒｅｅｄ、ｒプロシージング・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ 、 Ｕ Ｓ Ａ）
Ｊ ｙユニ、２１１９ （１９８０））に従い、酵母−
大腸菌シャトルベクターＹＥｐ１３ （Ｊ、Ｒ，Ｂｒｏ
ａｃｈｅｔ ａ Ｌ、、ｒジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ 、
８，１２１（１９７９））のＢａ ｍ ＨＩ切断部位に
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰ−２８−２４Ｃ（ＭＡＴａ
ｐｈｏ３−１）から得られる染色体ＤＮＡの５ａｕ
３Ａ１部分分解断片を挿入して約２０００のアンピシリ
ン耐性（Ａｍｐｖ′）テトラサイクリン感受性（Ｔｃ’
）大腸菌から成る酵母遺伝子バンクを作製した。この酵
母遺伝子バンクのプラスミドＤＮＡを用いてＳ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｔａｅ ＮＡ７９−１０Ｃ（ＭＡＴａ ｐ
ｈｏ８−２ １ｅｕ２ ｈｉｓ３ｔｒｐｌ ｃａｎ
ｌ）を形質転換し、０．５ｍｇ ／ ｍ １のベーナフ
チルリン酸、５ｍｇ／ｍｌのファーストレッドＴＲ塩、
２５ｍＭ Ｍｇ５Ｏ。 を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液で調製した１％寒天
溶液を用いたコロニー染色法（Ａ、Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ
、ａｌ、、ｒバイオヒミカ・エト・パイオフィジ力・ア
クタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）Ｊ
、４２８，１８２（１９７６）の改変法〕で、抑制性
アルカリ性ホスファターゼ産生能を示すもの（ｒＡｌｐ
”）をスクリーニンダ グした。約１．６Ｘ１０ 個のロイシン非要求性（Ｌｅ
ｕ＋）形質転換体を調べたところ、２６個のｒＡｌ ｐ
＋形質転換体が得られた。そのうちの２個のｒＡｌｐ＋
形質転換体からＣａ ｍ ｅ ｒ ｏ ｎらの方法（Ｊ
、Ｒ，Ｃａｍｅｒｏｎ ａｔ＋ａ１．。 「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｔｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）Ｊ 、土、１４２９（１
９７７）］に従ってプラスミドＤＮＡを調製し。 Ｅ、ｃｏｌ ｉ ＪＡ２２１の形質転換に用いた。 得られた３３個のＡｍｐ 形質転換体はすべてＴｃ石
であり、また同一分子量のプラスミドを持っていた。こ
のプラスミドをｐＡＬ １０１と命名し、再びＳ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−１０Ｃの形質転換に用
いた。得られたＬｅｕ形質転換体のうち１５個の抑制性
アルカリ性ホスファターゼ産生能を調べたところ、すべ
てｒＡｌｐ であった。したがってｐＡＬ １０１に
はＰＨ０８遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されていると
考えられる。 Ｐ Ｈ０８遺伝子が含まれているならば、ｐＡＬ １０
１はその相同性を利用して、染色体上のｐＨ。 ８遺伝子座に組み込まれることが予想される。ｐＡＬＩ
ＯＩが組み込まれた形質転換体が安定性試験の際に得ら
れたので、四分子分析を行い２組み込まれた位置を決定
した。ｐｈｏ８遺伝子座は第４番染色体上のａｄｅ８遺
伝子座から３０センチモルガン（ｃＭ）、ｒｎａ３遺伝
子座から８ｃＭの位置にある（Ｙ、Ｋａｎｅｋｏ ａ
ｔ、ａｌ、。 モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）Ｊ、２，１２７ （１９８
２））。ｐＡＬｌｏｌが組み込まれた形質転換体、２株
をＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＭ４９−５Ｄ（ＭＡＴａ
ｐｈｏ８−２ １ｅｕ２ ａｄｅ８ｒｎａ３）と交
雑し、四分子分析し＋ た結果、ｐＡＬ １０１の持つＬＥＵ２ とａｄｓ８
の両親型（ＰＤ）：非両親型（ＮＰＤ）：テトラ型（Ｔ
）の比は３０：Ｏ：９を示し、ｒｎａ３とのＰＤ ：
ＮＰＤ ： Ｔの比は３６：０：３を示した。この値か
らＰｅｒｋｉｎｓの式（Ｄ、Ｄ、Ｐｅｒｋｉｎｓ、ｒジ
エネテイツクス（Ｇｅｎａｔｉｃｓ）Ｊ、■、６０７（
１９４９））を用いてｐＡＬ １０１の組み込まれた位
置を計算するとａｄｅ８遺伝子座からＬ２ｃＭ、ｒｎａ
３遺伝子座から４ｃＭの位置になった。したがって、ｐ
ＡＬｌｏｌはｐｈｏ８遺伝子座あるいはその近くに組み
込まれており、ｐＡＬ １０１にはＰＨ○８遺伝子がク
ローン化されていると結論した。 ｍ Ｐ Ｈ０８遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地
図作成 りＮＡ断片の制限酵素処理はｐＡＬｌｏｌＤＮＡ（１〜
５ 、” ｇ ）をＴＡ、ｉｌＪ液（Ｐ、Ｈ，○′Ｆａ
ｒｒｅｌｌ ｅｔ、ａｌ、、ｒモレキュラー・アンド
・ゼネラル・ジェネテイックス（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、）Ｊ ｒ １７９＋ ４２１（１９８０）
）中で、４〜６ユニツトの各種制限酵素（ＢａｍＨＩ、
ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩｆｆ、Ｐｓ ｔ
Ｉ、Ｓａ ｌ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ）単独または二種類組み
合わせ、３７°Ｃで１時間作用させて行った。反応液を
１％アガロースゲル電気泳動あるいは７．５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、切断パターンを検出し
、ＤＮＡ断片の分子量を推定し、制限酵素地図を作成し
た（第１図）。第１図中、細実線はベクターＹＥｐ１３
部分、太実線はクローン化されたー≦−、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅＤＮＡ部分を各々示す。制限酵素部位の略号は
次のとおりである。Ｂ／Ｓ ａ、 Ｓ ａ／Ｂ ：Ｂａ
ｍＨＩとＳ ａ ｕ ３ Ａ Ｉの連結部位、Ｂｇ：Ｂ
ｇ ｌ ＩＩ 、 Ｅ ： Ｅ ｃ ｏ ＲＩ 、 Ｈ
： Ｈｉ ｎ ｄ ｍ 、 Ｓ ：Ｓａｌ Ｉ、Ｘ：Ｘ
ｈｏＩ。 実施例３ クローン化されたＤＮＡ断片上のＰＨ○８遺
伝子の位置の推定 クローン化されたＤＮＡ断片上のＰ）（０８遺伝子の位
置を推定するためｐＡＬ １０１の欠失誘導体を作成し
た。ＰＡＬ ｔ ｏ ｔ （５，−ｇ）を６ユニツトの
ＨｉｎｄＩＩｒを加えたＴＡ緩衝液５０μｌ中で３７℃
１分間反応させた後、６５°Ｃで１０分間加熱して反応
を停止させ部分分解物を得た。この反応液２５．、、、
ｌを含むＴ４リガーゼ反応液（５ｍＭＭ ｇ ＣＩ ２
＋ １０ ｒｎ Ｍジチオスレイトール、０゜０５
ｍＭＡＴＰ、Ｔ４リガーゼ３ユニット）５０、−１を４
℃で１８時間反応させ、分解物を再結合させた。次に１
０．、、ｌの上記Ｔ４リガーゼ反応液を用いて旦、ｅｏ
ｌｉＪＡ２２１を形質転換し、得られたＡｍｐ′ｒ形質
転換体からＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法（Ｈ，Ｃ
，Ｂ ｉ ｒｎｂｏ ｉｍ＆ Ｊ、Ｄｏｌｙ、ｒヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）。 ７．１５１３（１９７９））に従ってプラスミドＤＮＡ
を分離し、欠失プラスミドｐＡＬ１０９とｐＡＬ１１８
とを得た。またｐＡＬ１０９からＥｃｏ ＲＩを用いて
前述と同様な方法で欠失プラスミドｐＡＬｉ１９を作製
した。得られた欠失誘導体プラスミドＤＮＡでＳ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅＮＡ７９−１０Ｃを形質転換し、得ら
れたＬ ｅ ｕ＋形質転換体１０株のｒＡｌ ｐ表現型
を調べた。各欠失プラスミドのｐｈｏ＋３変異相補能を
第１図に示した（各プラスミド右端の＋、−）。 またｐＡＬ１２３とｐＡＬ１２５とは（第１図）それぞ
れｐＡＬ ｌ ０９のＥｃ ｏＲＩ処理とｐＡＬｌｏｌ
の５ａｌｌ処理後、低融点アガロース電気泳動で分離、
回収し、酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ６ （Ｄ
、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ、ａ■、、「ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）Ｊ 、８．１７（１９７９）〕にサブクローニン
グして作製した。ｐＡＬｌ ２３とｐＡＬ１２５につい
ても前述の欠失プラスミドと同様にして、その相補能を
調べた。第１図に示したようにｐＡＬ１２３は相補能を
もちｒＡＩｐ＋であったが、ｐＡＬ１２５はｒＡｌ ｐ
−であった。以上の結果から、ＰＨ０８遺伝子は第１図
の白抜きの断片領域（約２．７ｋｂ）に存在することが
わかった。 実施例４ ｐＡＬ１０９を保持する形質転換体のアル
カリ性ホスファターゼの生産性 実施例３で得たｐＡＬ１０９を保持する酵母形質転換体
（サツカロミセス・セレビシェ ＮＡ７９−Ｉ ＯＣ／
ｐＡＬ１０９）をパークホルダー改変高リン酸培地およ
び低リン酸培地（Ａ、Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ、ａｌ、、ｒ
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、）Ｊ 。 １１３．７２７ （１９７３））５ｍｌで２０時間振ど
う培養した後、菌体を集め、東江らの方法（Ａ、Ｔｏｈ
−ｅ ｅｔ、ａｌ、、ｒバイオヒミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Ｂ ｉ ｏ ｃ ｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ）Ｊ ＋ ４２８＋１８２ （１９７
６））に従って菌体の透過処理を行いアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性を測定した。 結果を第１表に示す。 （以下、余白） 第１表から判るようにｐＡＬ１０９によるアルカリ性ホ
スファターゼの生産はリン酸によって抑制を受けており
、クローン化されたＰＨ０８遺伝子は調節遺伝子産物の
働く制御領域を正常に含んでいると考えられる。 実施例５ Ｐ）１０８遺伝子転写産物の同定と転写方
向の決定 ノザンハイブリダイゼーション法によってＰＨ０８転写
産物の同定と転写方向の決定を行った。 ＋ ポリ（Ａ）ＲＮＡはＪａｎｓｅｎらの方法（Ｒ。 Ｊｅｎｓａｎ ｅｔ ａｌ、、ｒプロシージングロ
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 Ｕ
ＳＡ、）Ｊ、８０，３０３５ （１９８３））に従っ
て完全培地（十Ｐ）と低リン酸培地（−Ｐ）で培養した
サツカロミセス・セレビシェ Ｐ−２８−２４Ｃから全
ＲＮＡｔ＆調製した後、５ｃｈｌｅｉｆとＷｅｎｓｉｎ
ｋの方法（Ｒ，Ｆ、 Ｓｃ ｈ ｌ ｅｉ ｆ ＆
Ｐ、Ｃ，Ｖａｎｓ ｉｎｋ、ｒプラクティカル・メソ
ッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｊ＋（１９８１）、Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）に従ってオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースアフィニティ力ラムクロマトグラフィー
を行って精製した。ポ＋ す（Ａ）ＲＮＡ試料は文献（モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ〕記載のホルムアルデヒド変性ゲル
電気泳動を行い、Ｔｈｏｍａｓの方法（Ｐ、Ｓ、Ｔｈｏ
ｍａｓ、ｒプロシージング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、）Ｊ 、７７．５２０１ （
１９８０））に従っ゛て、プロッティングおよびハイブ
リダイゼーションを行った。オートラジオグラフィーは
コダックＸ−オーマットＲＰフィルムとコダックインテ
ンシファイングスクリーンを用いて一８０℃で行った。 転写産物の同定に使用したプローブＤＮＡはｐＡＬ２０
１ （第１図に示された約２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−
３ａｌＩ断片をｐＢＲ３２２にサブクローニングしたプ
ラスミド）をニックトランスレーションして（Ｐ、Ｗ、
Ｊ、Ｒｉｇｂｙ ｅｔ。 ａｌ、、ｒジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）Ｊｙ上上３．２３７（
１９７７））作製した。転写方向決定に用いた二種類の
プローブＤＮＡはＰＡｔ、、２０１をＢｇｌｎで処理し
た後、Ｔ４ポリメラーゼを用いた片鎖特異的ラベル化法
〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）。 （１９８２）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に従ってラベルをし、
５ａｌＩとＸｈｏｌ処理してポリアクリルアミド電気泳
動を行い、調製した。第２図に示すようにＰＢＲ３２２
のＲｓ ａ Ｉ分解物をサイズマーカーとしてＰＨ０８
転写産物の大きさを推定すると約１，８００ヌクレオチ
ドとなった。転写方向は、低リン酸完全培地で培養した
野性型株Ｐ−２８−２４Ｃからポリ（Ａ）ＲＮＡを調製
し、上記の片鎖を特異的にラベルしたプローブＤＮＡを
用いてノザンハイブリダイゼーションを行ったところ、
第３図に示すようにＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩＤＮＡ断片（
０，９５ｋｂ）のプローブでＰＨ０８転写産物が検出さ
れ、Ｘｈｏ Ｉ−Ｘｈｏ ｌＤＮＡ断片（０，４ｋｂ）
のプローブでは検出されなかったことから、第１図の波
形矢印で示すように左方向である。以上の結果と参考例
３の結果を合わせて考えると、ＰＨ０８遺伝子のプロモ
ーター領域は１．ｌｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏｌＤＮＡ
断片に存在すると予想される。 失慮■亙 ＰＨ０８遺伝子を含む２．７ｋｂＤＮＡ断片
の制限酵素地図の作成 ＰＨ○８遺伝子を含むＥ ｃ ｏ ＲＩ −Ｓ ａ ｕ
３ ＡＩ／ＢａｍＨＩＤＮＡ断片（第１図の白抜部分
の領域）の制限酵素地図を１１種類の制限酵素（Ａｌｕ
Ｉ、Ｂｇｌｎ、Ｃ１ａＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈａｅｍ、Ｈｉ
ｎｄｍ、Ｈｉｎｆ Ｉ、Ｓａ Ｉ Ｉ、５ａｕ３ＡＩ、
Ｔａｑ■、ＸｈｏＩ）を用いて作成した（第４図）。常
法に従って各種制限酵素の単独あるいは二種類組み合わ
せによって生じた反応物を７．５％あるいは１２％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その切断パターン
から各制限酵素の切断部位を推定した。分子量マーカー
としてｐＢＲ３２２のＨａｅｍ分解物あるいは５ａｕ３
ＡＩ分解物を用いた。なお切断部位は確認できたものの
み記入した。 叉凰孤７ ＰＨ０８遺伝子を含む２．７ｋｂＤＮ
Ａ断片の塩基配列決定 実施例６で作成した制限地図に基づいてＤＮＡ塩基配列
をＭａｘａｍとＧ ｉ １ ｂ ｅ ｒ ｔの方法とＭ
１３ファージを用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法（いずれも前出）によって決定した。 その結果を第５図に示した０番号はＡＴＧのＡを１とし
て付けである。ＰＨ０８遺伝子のコーディング領域と考
えられる１６３３塩基（＋１から＋１６３３）のオープ
ンリーディングフレームが見出された。しかし、終止コ
ドンが出現していない。 このことから、ｐＡＬ １０１にクローン化されたＰＨ
○８遺伝子は３′−末端側を欠いたことになる。ｐＡＬ
ｌｏｌの示した相補能はベクター内まで転写が続き、＋
１６８４から出現する終止コドン（ＴＡＧ）を使用する
ことにより生じたと考えられる。また第５図に示すよう
にＸ ｈ ｏ Ｉ切断部位の上流およそ１７０〜１８０
塩基に”ＴＡＴＡＴＡＡＡ”というＴＡＴＡ配列と考え
られる配列が出現し、ＸｈｏＩ切断部位の上流およそ５
０塩基付近に翻訳開始コドン”ＡＴＧ”が出現する。こ
れらのことはこの領域がＰＨ０８遺伝子の５′上流非翻
訳領域およびＰＨ０８遺伝子の５′末端領域を含んでい
ることを示唆している。 実施例８ ＰＨ０８の３″末領域の回収Ｗ ｔ ｎ
ｓ ｔ ｏ ｎらの”ｅｖｉｃｔｉｏｎ”法（Ｆ。 Ｗｉｎｓｔｏｎ ｅｔ、ａｌ、、メソクズ０イン６エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）、１０１，２１１（１９８３））によっ
てＰＨ０８の３′末領域を回収した。 まず、第１図の白抜き部分を含むＥ ｃ ｏ ＲＩをｐ
ＢＲ３２２のＥ ｃ ｏ ＲＩサイトに挿入したＰＡＬ
１２７を材料にして、第６図に示した通り、ＸｈｏＩ−
Ｈｉｎｄｍ断片約４７０ｂｐをＹＩｐ５〔プロシージン
グ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａ ｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ
ＳＡ）、７６．１０３５ （１９７９）〕にサブクロー
ニングしてｐＡＬ１３４を作製した。このプラスミドは
ＰＨ０８の一部を持っている。次にｐＡＬ１３４をＢｇ
ＩＩＩで処理して直線状にした後、ＰＨ０８＋株（Ｋ
７７−６Ｄ）の形質転換を行なった（第７図）、ｐＡＬ
１３４はＰＨ０８の両末端を欠いているので染色体上の
ＰＨ０８座に組み込まれると、５′末端を欠いた遺伝子
（’ Ｐ Ｈ２Ｓ）と３′末端を欠いた遺伝子（ＰＩ］
０８′）が生じる。その結果、形質転換体はＰｈｏ８変
異体となる。得られた形質転換体のｒＡｌｐＡｌ型およ
びｐｈｏ８変異体との相補性試験により、ｐＡＬ１３４
の組み込み位置を確認した後、形質転換体の一つから全
ＤＮＡを調製し、Ｅｃ ｏＲＩ処理し、Ｔ４リガーゼ連
結反応を行なった。次にその反応液を用いて大腸菌ＪＡ
２２１の形質転換を行ない、アンピシリン耐性株からＰ
Ｈ０８３′末領域を持つプラスミドｐＡＬ１３８を得た
。 実施例９ ＰＨ０８遺伝子の全塩基配列ｐＡＬ１３８
から常法により約１．４ｋｂの５ａｌＩ−ＰｓｔＩ断片
を調製し１Ｍ１３フアージを用いたジデオキシヌクレオ
チド合成鎖停止法によるＤ Ｎ Ａ塩基配列決定に用い
た。 ５ａｌＩ末端側から１２４６塩基の配列を決定した。そ
の結果を実施例２で得られた結果と結合して第８図に示
した。この結果からＰ Ｈ０８遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームは１７０１塩基（＋１から＋１７０１）
で、５６６個のアミノ酸からなる分子量６３，０５１の
蛋白質をコードしていることになる。 実施例１０ ＰＨ０８プロモーター単離（第９図）実
施例７の結果に従い、プロモーター領域を含むＤＮＡを
単離した。実験には第１図の白抜き部分を含むＥ ｃ
ｏ ＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃ。 ＲＩサイトに挿入したｐＡＬ１２７を出発材料として用
いた。 ＰＨ０８遺伝子がクローニングさ九たプラスミドｐ Ａ
Ｌ １２７ 、５０、− ｇに５０ユニツトの制限酵
素ＥｃｏＲＩ［全酒造（株）ｙ５］を１００．、．１の
反応液（１００ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐ
Ｈ７，５）、５０ｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２．７ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３７
°Ｃ，２時間作用させた後、１％アガロース（Ｓｉｇｍ
ａ社製）・スラブゲルを用いて緩衝液［１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１００ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ （ｐＨ８，３））中。 １４０ｖ、２時間電気泳動にかけた。泳動後、３ｋｂＤ
ＮＡ断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動
用緩衝液内に沈め、該ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶
出した（ＭｃＤｏｎｅｌｌ。 Ｍ、Ｗ、ら、［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）Ｊｙ±±０．１１
９（１９７７）］。透析チューブ内液をフェノール抽出
さらにエーテル抽出した後、ＮａＣ１を０．２Ｍになる
ように加え、つづいて２倍量の冷エタノールを加えて一
２０℃で３ｋｂＤＮＡを沈殿させた。 該３ｋｂＤＮＡＩＰｇに５ユニツトのＤＮＡポリメラー
ゼＩラージ・フラグメント（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３０１１の反応液Ｃ４０ｍＭ
リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
３３．、−Ｍ ｄＡＴ Ｐ 、 ３３ ＰＭ ｄ
Ｔ Ｔ Ｐ ）中で１２°Ｃ１３０分間作用させて、接
着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、冷
エタノールでＤＮＡを沈殿させた。該ＤＮＡ断片５００
ｎｇとリン酸化されたＢ、ａｍＨＩリンカ−（５’−Ｐ
−ｄ （ＣＧＧＡＴＣＣＧ））（全酒造（株）製）５
０ｎｇとを混合し、２０，１の反応液（６６ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、６．６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 。 １０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ。 ２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造（株）製）〕
中、１４℃で一夜作用させてＤＮＡを結合させた。反応
後、過剰量の制限酵素ＢａｍＨＩ〔全酒造（株）製〕を
加え３７℃、４時間作用させ、フェノールで除蛋白した
後、ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−
ＨＣＩ （ｐＨ８，０）＝２００ｍＭ ＮａＣ１，
１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したセファロース４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）・カラム（０、２５Ｘ ２
５ ｃ ｍ）にかけてｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ付近に
溶出されるＤＮＡを集めて、２倍量の冷エタノールを添
加して該ＤＮＡを沈殿させた（ＢａｍＨＩ消化３ｋｂＤ
ＮＡ）。 ベクターｐ Ｂ Ｒ３２２、１、、−ｇに２ユニツトの
制限酵素Ｂ ａ ｍ Ｈｒを２０ 、、 ｌの反応液（
１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）
、７ｍＭＭｇＣ１２，１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ
２−メルカプトエタノール〕中で３７℃、２時間作用
させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮ
Ａを沈殿させた（ＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２）、Ｂａ
ｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２，０，１，−ｇと、上記Ｂａｍ
ＨＩ消化３ｋｂＤＮＡＯ，ｌ、−ｇとを混合しＴ４ＤＮ
Ａリガーゼの作用によって結合させた。該反応液を用い
て大腸菌ＤＨＩ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、「モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）Ｊ ＋Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂ。 ｒａｔｏｒｙ、２５４〜２５５ （１９８２））を形質
転換させ、アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性
を示す組み換え体の中から、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ
部位にＰＨ０８遺伝子を含む３ｋｂＤＮＡ断片が挿入さ
れたプラスミドｐＴＦ １４を取得した（第９図参照）
。 次に、ＰＨ０８遺伝子の構造遺伝子を取り除くために、
まずｐＴＦ１４．１０Ｐｇに１０ユニツトの制限酵素Ｘ
ｈ ｏ Ｉを３０Ｐ１の反応液〔１０ｍＭ Ｔｒ
１ｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ１２，
１００ｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール〕中で３７℃、３時間作用させ、フェノールで
除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させた（Ｘｈｏ
Ｉ消化ｐＴＦ１４）。 つづいてＸｈｏＩ消化ｐ Ｔ Ｆ １４，１ 、Ｌａ
ｇに１０ユニツトのＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（Ｂａｔｈ
ｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社ｍ）を５０．、、ｌの反応液（２０ｍＭ Ｔ
ｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐＨ８，１）、１２ｍＭ
ＣａＣＩ２． １２ｍＭ ＭｇＣｌ２．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ〕中で３０°Ｃ１２分間作用させた後、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させた。 ５０ｎｇの５′末端がリン酸化された５ａｌＩリンカ−
（５’−Ｐ−ｄ （ＧＧＴＣＧＡＣＣ））（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社￥！１）と４００
ｎｇの上述のＢＡＬ−３１で処理されたｐＴＦ１４とを
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。この反応液
を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、アンピシリン耐性
の形質転換体の中から制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと５ａｔ
Ｉ（全酒造（株）製〕による二重消化によって１４０〜
１６３ｂｐの断片が生じるプラスミドｐＴＦ１４−４を
選択した（第９図参照）。このプラスミドではＢＡＬ−
３１ヌクレアーゼ処理によってＰＨ０８の構造遺伝子が
完全に取り除かれプロモーター領域が保存されている（
第５図参照）。 このｐＴＦ １４−４からＰＨＯプロモーター中のＢａ
ｍＨＩ−５ａｌＩ断片を製造し、ジヌクレオチド合成鎖
停止法（前出）によって５ａｌＩリンカ−の挿入個所付
近の塩基配列を調べた。その結果、該リンカ−は ・・・ＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＣ・
・ａｌＩ で示されるとおり、−３５番目のＣの下流に挿入されて
いることが確認された。 ヌｕ級准Ｌ↓」エ ＰＨ０８プロモーターを利用する酵
母発現用ベクターの作ｆｆ！５（第１０図参照） Ｈａｒａｓｈｉｍａ、Ｓら［モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．ａｎｄＣｅｌ、Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）Ｊ 、４，７７１ （１９８４）に記載の
大腸菌−酵母シャトルベクターｐ Ｓ Ｈ１９ｚ １
０Ｐｇに各１０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩと５ａｌ
Ｉとを５０戸１の反応液（１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５）、７ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１２、
１００ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１、７ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール〕中で３７℃、２時間作用させた後、該反
応液を０．８％アガロース・スラブゲルを用いて前記条
件下で電気泳動にかけた。泳動後、８．０ｋｂＤＮＡ断
片を前記の方法によってゲルから分取した。 実施例１０で得られたプラスミドｐＴＦ１４−４．１０
．、ｇに各々１０ユニツトの制限酵素Ｂａｍ ＨＩと５
ａｌＩとを上記条件下で反応させた後、電気泳動にかけ
てＰＨ０８プロモーターを含む１゜０５ｋｂＤＮＡ断片
を単離した。 該１．０５ｋｂＤＮＡ断片２００ｎｇと上述の８．０ｋ
ｂＤＮＡ断片５００ｎｇとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼの作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌Ｄ
ＨＩを形質転換させ、アンピシリン耐性形質転換体の中
からｐｓＨ１９のＢａｍＨＩ−３ａｌＩ部位にｐＴＦ１
４−４から単離された１、０５ｋｂ断片が挿入されたプ
ラスミドｐＴＦ１０３を分離した（第１Ｏ図参照）。 ｍ±２ ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子を
発現する組み換えＤＮＡ分 子の構築および該ＤＮＡ分子による 酵母の形質転換 特願昭５９−１９３７６５号（出願臼：昭和５９年９月
１３日）明細書の実施例に記載されているａｄｗ型Ｂ型
肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子発現プラス
ミドｐＰＨ○１７−５８゜５０ Ｐｇに５０ユニツトの
制限酵素Ｘ ｈ ｏ Ｉを１００Ｐｌの反応液（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）＋ ７ｍＭ
ＭｇＣｌ２．ＬｏｏｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ ２−
メルカプトエタノール〕中で３７°Ｃ１２時間作用させ
た後、１．０％アガロース・スラブゲルを用いて前記記
載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、ａｄｗ型ＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む８２３ｂｐＤＮＡ断片を前記の方法
でゲルから分取した（第１０図参照）。 実施例１１で得られた発現用ベクターｐＴＦ １０３＋
１．”ｇに２ユニツトの制限酵素５ａｌＴを２０、−１
の反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ Ｈ７，
５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１７５ｍＭ ＮａＣ１
，０，２ｍＭ ＥＤＴＡ、７ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール〕中で３７°Ｃ，２時間作用させた後、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ
た（ＳａｌＩ消化ＰＴＦ１０３）。 ２００ｎｇの５ａｌＩ消化ｐＴＦ１０３と２００ｎｇの
前記８２３ｂｐＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼの作
用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨＩ株
を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中か
ら８２３ｂｐＤＮＡ断片中のＨＢｓＡｇ遺伝子がＰＨ０
８プロモーターと順方向に挿入されたプラスミドｐＴＦ
１０３−５８を含有する形質転換体、エシェリヒア コ
リＤＨＩ／ｐＴＦ１０３−５８を分離した。さらに該形
質転換体からプラスミドｐＴＦ １０３−５８を単離し
た（第１０図参照）。 該プラスミドを用いて酵母宿主サツカロミセスセレビシ
ェ・ＡＨ２２Ｒを形質転換し、形質転換体（サツカロミ
セス セレビシェ・ＡＨ２２Ｒ−／ｐＴＦ １０３−５
８）を取得した。 叉１涯上３ ａｄｗ型ＨＢ ｓ Ａ ｇ遺伝子の酵母
における発現 実施例１２で得られたａｄｗ型ＨＢ ｓ Ａ ｇ遺伝子
発現プラスミドを保持するサツカロミセス・セレビシェ
形質転換体（ＡＨ２２Ｒ／ｐＴＦ１０３−５８）をＢｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒおよびその低リン酸培地で３０°Ｃ，
２日間培養した後、菌体を集め、生理食塩水で洗浄した
。Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａらの方法〔プロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｅ ｔ、ＵＳＡ）、８０゜１
（１９８３）］に従って、菌体をＺｙｍｏ ｌ ｙａＳ
ｅ（生化学工業（株）：ａ）によってスフェロプラスト
にした後、スフェロプラストに０．１％トリトンＸ−１
００を添加してＨＢｓＡｇを抽出した。溶菌液を室温で
１５．ＯＯＯｒｐｍ、１５分間遠心分踵にかけて上清液
を得た。この上清液のＨＢｓＡｇ活性をオースザイム■
〔ダイナボット（株）製〕を用いて測定した。その結果
、ａｄＷ型ＨＢｓＡｇの生成量はブロスｌｌあたり１５
０）４ｇであった。
Ａおよびその遺伝子工学への用途に関する。 盗】ぼり１権 組み換えＤＮＡ技術が広く利用されるようになって、有
用なポリペプチドの原核生物や真植生物を用いた生産が
可能になってきた。これまでこれら物質の大量生産には
主として大腸菌が利用されてきたが、特に薬理学的に重
要なポリペプチドの生産には真植生物の利用が望まれる
。酵母は真核生物であり他の真核生物、特に哺乳動物細
胞と数々の共通点を有しているために哺乳動物由来の蛋
白質遺伝子を発現させるのに有利である。さらに酵母細
胞はエンドトキシンを含有しないこと、酵母は微生物で
あるために培養が容易であること、古くから大量培養が
工業的になされており、その安全性が確認されているこ
と、その遺伝生化学的解析が数多くなされていることな
どの理由から、酵母を宿主として利用することに注目が
集まっている。 現在、遺伝子クローニングのための酵母ベクターはいく
つか知られているが、異種遺伝子を効率よく発現させる
ための強力な酵母プロモーターはあまり知られていない
。 酵母サツカロミセス・セレビシェの細胞破砕液中には二
種類のアルカリ性ホスファターゼの存在が知られている
。その一つは無機リン酸によってその生産が抑制され、
基質特異性の広い抑制性アルカリ性ホスファターゼであ
り、他の一つはｐ −二トロフェニルリン酸のみを基質
にし、かつ構成的に産生される特異的ｐ−ニトロフェニ
ルホスファターゼである。抑制性アルカリ性ホスファタ
ーゼ活性を欠く突然変異体としてｐｈｏ８変異体とｐｈ
ｏ９変異体が分離されており、ｐｈｏ３遺伝子は抑制性
アルカリ性ホスファターゼの構造遺伝子であり、ｐｈｏ
９遺伝子はｐｈｏ８転写以後に必須で液胞的加水分解酵
素群の前駆体を活性化させると考えられている。 、口が解′ しようとする間 々 現在、遺伝子クローニングのための種々の酵母ベクター
が知られており、利用が可能である。しかし同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させるためには、用いる宿
主に適した強力な酵母プロモーターを選択する必要があ
る。 。 色を解決するための手 本発明者らは、酵母の抑制性アルカリ性ホスファターゼ
プロモーター（ＰＨ０８プロモーターと称する。）に着
目し、抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする領
域をクローン化し、その制限酵素切断地図を作成すると
ともに、その全塩基配列を決定したところ該プロモータ
ーは新規なりＮＡであること、これを用いて同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させることができることを
見出し、これらに基づいて更に研究した結果、本発明を
完成したものである。 本発明はＰＨ０８プロモーターを含有する組み換えＤＮ
Ａ、ＰＨ○８プロモーターの下流に構造遺伝子が組み込
まれた組み換えＤＮＡ、ＰＨ０８プロモーターを含有す
る組み換えＤＮＡを有する形質転換体、およびＰＨ０８
プロモーターの下流に構造遺伝子を含有するＤＮＡで形
質転換された形質転換体を培地に培養し、培養物中に生
成蓄積された遺伝子産物を採取することを特徴とする遺
伝子産物の製造法に関するものである。 上記プロモーターとしては、好ましくは例えば第５図に
おいて−９８９〜−１で示される塩基配列やプロモータ
ー活性を有するその断片が挙げられる。 本発明のＰＨ０８プロモーターおよび抑制性アルカリ性
ホスブアターゼをコードする構造遺伝子（ＰＨ０８と称
する。）を含むＤＮＡは、酵母菌体から分離、採取する
ことができる。 該酵母としては、いずれのものでもよいが、とくにサツ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ、ｏｍｙｃｅＳ）属菌が好
ましく、たとえばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられ、具体的にはたとえば
市販のパン酵母が挙げられる。 酵母からＤＮＡを抽出するには、たとえばメソッズ・イ
ン・セルラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈ。 ｄｓ ｉｎ Ｃａｌ １．Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖ。 １．１２．ｐ、１３〜４４ （１９７５）に記載の方
法あるいはこれに準じた方法によって行われる。 次に得られたＤＮＡを適当な制限酵素で処理したのち、
同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵
素で処理したプラスミド、あるいはファージに、上記で
得られたＤＮＡ断片を組み込んでシーンバンクを作製す
る。該プラスミドとしては例えばｐＢＲ，３２２や大腸
菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ１３（ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、３゜１２１ （１９７９）参照〕がまたファー
ジとしてはｃｈａｒｏｎ系ファージ〔ジャーナル・オブ
・ウィロロジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、２旦、５５５（
１９７９）参照〕などが用いられる。また必要により１
例えば大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ６（ジーン
（Ｇｅｎｅ）、８．１７ （１９７９）参照〕などを
用いてさらにサブクローニングする。 このようにしてクローン化されたＤＮＡを保持するベク
ターで、宿主微生物を形質転換する。 宿主微生物としては、酵母が好ましく、たとえばサツカ
ロミセス属菌が挙げられる。さらに具体的には、サツカ
ロミセス・セレビシェＮＡ７９−１０Ｃ株が挙げられる
。 なお、上記宿主微生物は、ｐｈｏ８変異体であることが
好ましい。 上記ＮＡ７９−１０Ｃ株は、通常の交雑法（ハンドブッ
ク・オブ・ジエネテイツクス（Ｈａ ｎ ｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｇｅｎｅｔ １ｃｓ）ｔ ｐ、３６６Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７４
）に従って得ることができる。すなわちＮＡ７９−１０
Ｃ株は、ＡＬ２１１−１２Ｂ株（払。 ｐｈｏ３−１．ｐｈｏ８．ａｒｇ６）（モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ。 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、２，１２７（１９８２））＝
Ａ８２２株（ａ、１ｅｕ２．ｈｉｓ４．ｃａｎｌ）〔プ
ロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｅ
ｔ、ＵＳＡ）、８０．１（１９８３）） 。 Ｄ１３−ＩＡ株（ａ、ｔｒｐｌ、ｈｉｓ３．ｇａ１２．
５ＵＣ２）（プロシージング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。 、Ｎａ ｔ Ｌ、Ａｃ ａ ｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）、
７６＋１０３５ （１９７９））およびＹＡＴ２２８株
（ａ、１ｅｕ２，１ｙｓｌｏ、ｃｙｈ、ｋａ、ｒｌ−１
）（（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、）、１４５，１４２１（１９８１））
を交雑することによって、取得できる。 このようにして得られたシーンバンクあるいはサブクロ
ーンを用いて、ｐｈｏ８変異体を形質転換することによ
りＰＨ０８プロモーターおよびその下流に抑制性アルカ
リ性ホスファターゼをコードする構造遺伝子が連結され
たベクターを保持する形質転換体が得られる。 形質転換するには、公知の方法たとえばプロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ｔＪｓＡ
）、７５．１９２９ （１９７８）＝ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、２７５，１０４ （１９７８）、Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＳ ｙｍ Ｐ
−＋ クオンティテイティブ・バイオロジー（Ｑｕａｎ
ｔ、Ｂｉｏｌ、）、土３．１３０５（１９７９）、プロ
シージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｔ
、ＵＳＡ）＋ ７６＋ １０３５ （１９７９）に記
載された方法あるいはこれに準じた方法によって行われ
る。 上記方法で得られた形質転換体が、ＰＨ０８プロモータ
ーおよび抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする
構造遺伝子を保持するかどうかは、次に記載の方法によ
り確認することができる。すなわち、該形質転換体を例
えばパークホルダー改変培地〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１１３＋ ７２７ （１９７
３）〕上にコロニーを形成させる。次にこれらコロニー
をクロロホルム蒸気で処理したのち、メーナフチルリン
酸およびファーストレッドＴＲ塩とを含有する寒天を重
層する。プロモーターおよび抑制性アルカリ性ホスファ
ターゼ遺伝子を含むＤＮＡがクローン化されていればコ
ロニーが赤色を示すことからＰＨ０８遺伝子の存在を確
認することができる１次にＰＨ０８遺伝子を含む形質転
換体からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限酵素
で切断後、たとえばアガロースゲル電気泳動あるいはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって挿入された遺伝
子を含むＤＮＡを単離することができる。この一連の基
本操作はすでに公知であり、たとえばモレキュラー・ク
ローニング（Ｍ。 １ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ。 ｒａｔｏｒｙに詳しく記載されている。 抑制性アルカリ性ホスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡの
塩基配列は、たとえばジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ １．Ａｃ
ａ ｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）。 ７４．５４６３ （１９７７））、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ法〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐ ｒ ｏ ｃ 。 Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）、７↓。 ５６０ （１９７７））などの方法を用いて決定できる
。 上記のようにしてクローン化されたＤＮＡ中のＰＨ０８
構造遺伝子の位置は欠失プラスミドと活性相補能との関
係から推定される（第１図参照）。 この推定された第１図の白抜き部分（制限酵素地図：第
４図参照）をもつプラスミドを用いてＰＨｏ８転写産物
を検出し、その大きさく第２図参照）と方向性（第３図
参照）とからＰＨ０８プロモーターの位置を推定する。 この推定されたＰ Ｈ０８プロモーターを含むＰＨ０８
の全塩基配列を明らかにしく第８図）、該ＤＮＡの塩基
配列に基づいて解読されるオープンリーディングフレー
ムの存在から、プロモーターはそのオープンリーディン
グフレーム上流にあることが予想される。オープンリー
ディングフレーム上流のＰＨ０８プロモーター活性〔抑
制性アルカリホスファターゼを産生させる能力あり（第
１表参照）〕を有する部分を調製（第９図参照）、該Ｐ
Ｈ○８プロモーター活性含有部分、必要に応じ更にその
下流に各種構造遺伝子をベクターに組み込み発現用ベク
ターを作製する（第１０図参照）。 該ベクターで宿主の形質転換を行い（第１０図参照）、
該形質転換体を培養することによって目的とする遺伝子
産物を製造することができる。 本発明のＰＨ０８プロモーター活性を有するＤＮＡとし
ては全合成あるいは半合成したものも用いることができ
る。 ＰＨ０８プロモーターを組み込むベクターとしては前出
（７）ＹＥ ｐ ６やＹＥｐ１３に加えｐｓＨ１９〔モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１
．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、土、７７１ （１９８４
））やｐＪＤＢ２１９ （ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、２７５，１０４ （１９７８）］などが挙げられる。 ＰＨ０８プロモーターの下流に組み込む構造遺伝子と
しては抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする構
造遺伝子（ＰＨ０８）、ａｄｗ型やａｄｒ型などのＢ型
肝炎つィルス表面抗［（ＨＢｓＡｇ）遺伝子、ヒトベー
インターフェロン遺伝子、ヒトβ−インターフェロン遺
伝子、ヒト７−インターフェロン遺伝子、ヒトリゾチー
ム遺伝子、ヒトインターロイキン−２遺伝子などが挙げ
られる。 ＰＨ○８プロモーターを含有するＤＮＡで形質転換する
宿主としては酵母が好ましく、例えばサツカロミセス・
セレビシェ ＡＨ２２Ｒ（プロシージング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）、ＵＳＡ ８０．
１ （１９８３））や同ＮＡ７９−Ｉ ＯＣ（前出）
などが挙げられる。 このようにして得られた形質転換体の培養に用いられる
培地としては、たとえばそれ自体公知のＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒ最小培地〔プロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７７．４５０５（１９８
０））が挙げられる。 また培養温度、時間などの条件は、目的とする遺伝子産
物の産生が最高になるよう定められるが、一般に温度は
通常約１５℃〜４０”Ｃ，好ましくは約２４℃〜３７℃
、また時間は約１０時間〜９６時間、好ましくは約２４
時間〜７２時間であり、必要により通気や撹拌を加える
こともできる。 培養物中に蓄積された遺伝子産物は、当分野における通
常の方法、たとえばザイモリエース（キリンビール株式
会社１りなど溶菌酵素を用いる方法、ガラスピーズを用
いる機械的破砕法などによって菌体を破砕して目的物を
抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ１００などの
界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加え、
目的物の抽出を容易にすることもできる。このようにし
て得られた抽出液からの目的物の分離精製は１通常知ら
れている蛋白質の精製方法、たとえば、沈殿剤による沈
殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹脂などによる
クロマトグラフ法、ゲルろ適法。 抗体カラムを用いる方法などを組み合せて行うことがで
きる。 詐」− 真核生物たる酵母から新規で強力なプロモーターを得る
ことができたため、これを用いて薬理学的に重要な蛋白
質遺伝子の発現を効率よく行うことができる。 実１日１玖ｍ 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。 なお、実施例１に開示するサツカロミセス・セレビシェ
Ｐ−２８−２４Ｃは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
にＩＦＯ−１０１５３として寄託され、又アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴ
ＣＣ−６０２０２として寄託されており、何人も分譲を
受けることができる。 実施例４で開示するサツカロミセス・セレビシェＮＡ７
９−Ｉ ＯＣ／ｐＡＬ１０９は、財団法人発酵研究所（
ＩＦＯ）にＩＦＯ−１０１４１として１通商産業省工業
技術院微生物工業硬究所（ＦＲｌ）に昭和５９年１２月
２１日からＦＥＲＭＰ−８０１６として寄託されている
。 実施例１２で開示するエシェリヒアコリＤＨ１／ｐＴＦ
１０３−５８は、ＩＦＯにＩＦＯ−１４４０９として
、ＦＲＩに昭和５９年１２月２６日からＦＥＲＭ Ｐ
−８０３６として寄託されている。 実施例１２で開示するサツカロミセス・セレビシェＡＨ
２２Ｒ−は、ＩＦＯにＩ ＦＯ−１０１３４として、Ｆ
ＲＴに昭和５９年９月４日からＦＥＲＭ ＢＰ−８０
４として寄託されている。 実施例１２で開示するサツカロミセス・セレビシェＡＨ
２２Ｒ／ｐＴＦ１０３−５８は、ＩＦＯニＩ ＦＯ−１
０１４３トして、Ｆ ＲＩ ニ昭和６０年３月１８日か
らＦＥＲＭ Ｐ−８１５８として寄託されている。 笑１１上 ＰＨ０８遺伝子のクローニングＮａ ｓｍｙ
ｔ ｈとＲｅｅｄの方法（Ｋ、Ａ、Ｎａｓｍｙｔｈ
＆ Ｓ、１．Ｒｅｅｄ、ｒプロシージング・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ 、 Ｕ Ｓ Ａ）
Ｊ ｙユニ、２１１９ （１９８０））に従い、酵母−
大腸菌シャトルベクターＹＥｐ１３ （Ｊ、Ｒ，Ｂｒｏ
ａｃｈｅｔ ａ Ｌ、、ｒジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ 、
８，１２１（１９７９））のＢａ ｍ ＨＩ切断部位に
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰ−２８−２４Ｃ（ＭＡＴａ
ｐｈｏ３−１）から得られる染色体ＤＮＡの５ａｕ
３Ａ１部分分解断片を挿入して約２０００のアンピシリ
ン耐性（Ａｍｐｖ′）テトラサイクリン感受性（Ｔｃ’
）大腸菌から成る酵母遺伝子バンクを作製した。この酵
母遺伝子バンクのプラスミドＤＮＡを用いてＳ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｔａｅ ＮＡ７９−１０Ｃ（ＭＡＴａ ｐ
ｈｏ８−２ １ｅｕ２ ｈｉｓ３ｔｒｐｌ ｃａｎ
ｌ）を形質転換し、０．５ｍｇ ／ ｍ １のベーナフ
チルリン酸、５ｍｇ／ｍｌのファーストレッドＴＲ塩、
２５ｍＭ Ｍｇ５Ｏ。 を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液で調製した１％寒天
溶液を用いたコロニー染色法（Ａ、Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ
、ａｌ、、ｒバイオヒミカ・エト・パイオフィジ力・ア
クタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）Ｊ
、４２８，１８２（１９７６）の改変法〕で、抑制性
アルカリ性ホスファターゼ産生能を示すもの（ｒＡｌｐ
”）をスクリーニンダ グした。約１．６Ｘ１０ 個のロイシン非要求性（Ｌｅ
ｕ＋）形質転換体を調べたところ、２６個のｒＡｌ ｐ
＋形質転換体が得られた。そのうちの２個のｒＡｌｐ＋
形質転換体からＣａ ｍ ｅ ｒ ｏ ｎらの方法（Ｊ
、Ｒ，Ｃａｍｅｒｏｎ ａｔ＋ａ１．。 「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｔｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）Ｊ 、土、１４２９（１
９７７）］に従ってプラスミドＤＮＡを調製し。 Ｅ、ｃｏｌ ｉ ＪＡ２２１の形質転換に用いた。 得られた３３個のＡｍｐ 形質転換体はすべてＴｃ石
であり、また同一分子量のプラスミドを持っていた。こ
のプラスミドをｐＡＬ １０１と命名し、再びＳ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−１０Ｃの形質転換に用
いた。得られたＬｅｕ形質転換体のうち１５個の抑制性
アルカリ性ホスファターゼ産生能を調べたところ、すべ
てｒＡｌｐ であった。したがってｐＡＬ １０１に
はＰＨ０８遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されていると
考えられる。 Ｐ Ｈ０８遺伝子が含まれているならば、ｐＡＬ １０
１はその相同性を利用して、染色体上のｐＨ。 ８遺伝子座に組み込まれることが予想される。ｐＡＬＩ
ＯＩが組み込まれた形質転換体が安定性試験の際に得ら
れたので、四分子分析を行い２組み込まれた位置を決定
した。ｐｈｏ８遺伝子座は第４番染色体上のａｄｅ８遺
伝子座から３０センチモルガン（ｃＭ）、ｒｎａ３遺伝
子座から８ｃＭの位置にある（Ｙ、Ｋａｎｅｋｏ ａ
ｔ、ａｌ、。 モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）Ｊ、２，１２７ （１９８
２））。ｐＡＬｌｏｌが組み込まれた形質転換体、２株
をＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＭ４９−５Ｄ（ＭＡＴａ
ｐｈｏ８−２ １ｅｕ２ ａｄｅ８ｒｎａ３）と交
雑し、四分子分析し＋ た結果、ｐＡＬ １０１の持つＬＥＵ２ とａｄｓ８
の両親型（ＰＤ）：非両親型（ＮＰＤ）：テトラ型（Ｔ
）の比は３０：Ｏ：９を示し、ｒｎａ３とのＰＤ ：
ＮＰＤ ： Ｔの比は３６：０：３を示した。この値か
らＰｅｒｋｉｎｓの式（Ｄ、Ｄ、Ｐｅｒｋｉｎｓ、ｒジ
エネテイツクス（Ｇｅｎａｔｉｃｓ）Ｊ、■、６０７（
１９４９））を用いてｐＡＬ １０１の組み込まれた位
置を計算するとａｄｅ８遺伝子座からＬ２ｃＭ、ｒｎａ
３遺伝子座から４ｃＭの位置になった。したがって、ｐ
ＡＬｌｏｌはｐｈｏ８遺伝子座あるいはその近くに組み
込まれており、ｐＡＬ １０１にはＰＨ○８遺伝子がク
ローン化されていると結論した。 ｍ Ｐ Ｈ０８遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地
図作成 りＮＡ断片の制限酵素処理はｐＡＬｌｏｌＤＮＡ（１〜
５ 、” ｇ ）をＴＡ、ｉｌＪ液（Ｐ、Ｈ，○′Ｆａ
ｒｒｅｌｌ ｅｔ、ａｌ、、ｒモレキュラー・アンド
・ゼネラル・ジェネテイックス（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、）Ｊ ｒ １７９＋ ４２１（１９８０）
）中で、４〜６ユニツトの各種制限酵素（ＢａｍＨＩ、
ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩｆｆ、Ｐｓ ｔ
Ｉ、Ｓａ ｌ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ）単独または二種類組み
合わせ、３７°Ｃで１時間作用させて行った。反応液を
１％アガロースゲル電気泳動あるいは７．５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、切断パターンを検出し
、ＤＮＡ断片の分子量を推定し、制限酵素地図を作成し
た（第１図）。第１図中、細実線はベクターＹＥｐ１３
部分、太実線はクローン化されたー≦−、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅＤＮＡ部分を各々示す。制限酵素部位の略号は
次のとおりである。Ｂ／Ｓ ａ、 Ｓ ａ／Ｂ ：Ｂａ
ｍＨＩとＳ ａ ｕ ３ Ａ Ｉの連結部位、Ｂｇ：Ｂ
ｇ ｌ ＩＩ 、 Ｅ ： Ｅ ｃ ｏ ＲＩ 、 Ｈ
： Ｈｉ ｎ ｄ ｍ 、 Ｓ ：Ｓａｌ Ｉ、Ｘ：Ｘ
ｈｏＩ。 実施例３ クローン化されたＤＮＡ断片上のＰＨ○８遺
伝子の位置の推定 クローン化されたＤＮＡ断片上のＰ）（０８遺伝子の位
置を推定するためｐＡＬ １０１の欠失誘導体を作成し
た。ＰＡＬ ｔ ｏ ｔ （５，−ｇ）を６ユニツトの
ＨｉｎｄＩＩｒを加えたＴＡ緩衝液５０μｌ中で３７℃
１分間反応させた後、６５°Ｃで１０分間加熱して反応
を停止させ部分分解物を得た。この反応液２５．、、、
ｌを含むＴ４リガーゼ反応液（５ｍＭＭ ｇ ＣＩ ２
＋ １０ ｒｎ Ｍジチオスレイトール、０゜０５
ｍＭＡＴＰ、Ｔ４リガーゼ３ユニット）５０、−１を４
℃で１８時間反応させ、分解物を再結合させた。次に１
０．、、ｌの上記Ｔ４リガーゼ反応液を用いて旦、ｅｏ
ｌｉＪＡ２２１を形質転換し、得られたＡｍｐ′ｒ形質
転換体からＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法（Ｈ，Ｃ
，Ｂ ｉ ｒｎｂｏ ｉｍ＆ Ｊ、Ｄｏｌｙ、ｒヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）。 ７．１５１３（１９７９））に従ってプラスミドＤＮＡ
を分離し、欠失プラスミドｐＡＬ１０９とｐＡＬ１１８
とを得た。またｐＡＬ１０９からＥｃｏ ＲＩを用いて
前述と同様な方法で欠失プラスミドｐＡＬｉ１９を作製
した。得られた欠失誘導体プラスミドＤＮＡでＳ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅＮＡ７９−１０Ｃを形質転換し、得ら
れたＬ ｅ ｕ＋形質転換体１０株のｒＡｌ ｐ表現型
を調べた。各欠失プラスミドのｐｈｏ＋３変異相補能を
第１図に示した（各プラスミド右端の＋、−）。 またｐＡＬ１２３とｐＡＬ１２５とは（第１図）それぞ
れｐＡＬ ｌ ０９のＥｃ ｏＲＩ処理とｐＡＬｌｏｌ
の５ａｌｌ処理後、低融点アガロース電気泳動で分離、
回収し、酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ６ （Ｄ
、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ、ａ■、、「ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）Ｊ 、８．１７（１９７９）〕にサブクローニン
グして作製した。ｐＡＬｌ ２３とｐＡＬ１２５につい
ても前述の欠失プラスミドと同様にして、その相補能を
調べた。第１図に示したようにｐＡＬ１２３は相補能を
もちｒＡＩｐ＋であったが、ｐＡＬ１２５はｒＡｌ ｐ
−であった。以上の結果から、ＰＨ０８遺伝子は第１図
の白抜きの断片領域（約２．７ｋｂ）に存在することが
わかった。 実施例４ ｐＡＬ１０９を保持する形質転換体のアル
カリ性ホスファターゼの生産性 実施例３で得たｐＡＬ１０９を保持する酵母形質転換体
（サツカロミセス・セレビシェ ＮＡ７９−Ｉ ＯＣ／
ｐＡＬ１０９）をパークホルダー改変高リン酸培地およ
び低リン酸培地（Ａ、Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ、ａｌ、、ｒ
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、）Ｊ 。 １１３．７２７ （１９７３））５ｍｌで２０時間振ど
う培養した後、菌体を集め、東江らの方法（Ａ、Ｔｏｈ
−ｅ ｅｔ、ａｌ、、ｒバイオヒミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Ｂ ｉ ｏ ｃ ｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ）Ｊ ＋ ４２８＋１８２ （１９７
６））に従って菌体の透過処理を行いアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性を測定した。 結果を第１表に示す。 （以下、余白） 第１表から判るようにｐＡＬ１０９によるアルカリ性ホ
スファターゼの生産はリン酸によって抑制を受けており
、クローン化されたＰＨ０８遺伝子は調節遺伝子産物の
働く制御領域を正常に含んでいると考えられる。 実施例５ Ｐ）１０８遺伝子転写産物の同定と転写方
向の決定 ノザンハイブリダイゼーション法によってＰＨ０８転写
産物の同定と転写方向の決定を行った。 ＋ ポリ（Ａ）ＲＮＡはＪａｎｓｅｎらの方法（Ｒ。 Ｊｅｎｓａｎ ｅｔ ａｌ、、ｒプロシージングロ
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 Ｕ
ＳＡ、）Ｊ、８０，３０３５ （１９８３））に従っ
て完全培地（十Ｐ）と低リン酸培地（−Ｐ）で培養した
サツカロミセス・セレビシェ Ｐ−２８−２４Ｃから全
ＲＮＡｔ＆調製した後、５ｃｈｌｅｉｆとＷｅｎｓｉｎ
ｋの方法（Ｒ，Ｆ、 Ｓｃ ｈ ｌ ｅｉ ｆ ＆
Ｐ、Ｃ，Ｖａｎｓ ｉｎｋ、ｒプラクティカル・メソ
ッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｊ＋（１９８１）、Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）に従ってオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースアフィニティ力ラムクロマトグラフィー
を行って精製した。ポ＋ す（Ａ）ＲＮＡ試料は文献（モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ〕記載のホルムアルデヒド変性ゲル
電気泳動を行い、Ｔｈｏｍａｓの方法（Ｐ、Ｓ、Ｔｈｏ
ｍａｓ、ｒプロシージング・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、）Ｊ 、７７．５２０１ （
１９８０））に従っ゛て、プロッティングおよびハイブ
リダイゼーションを行った。オートラジオグラフィーは
コダックＸ−オーマットＲＰフィルムとコダックインテ
ンシファイングスクリーンを用いて一８０℃で行った。 転写産物の同定に使用したプローブＤＮＡはｐＡＬ２０
１ （第１図に示された約２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−
３ａｌＩ断片をｐＢＲ３２２にサブクローニングしたプ
ラスミド）をニックトランスレーションして（Ｐ、Ｗ、
Ｊ、Ｒｉｇｂｙ ｅｔ。 ａｌ、、ｒジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）Ｊｙ上上３．２３７（
１９７７））作製した。転写方向決定に用いた二種類の
プローブＤＮＡはＰＡｔ、、２０１をＢｇｌｎで処理し
た後、Ｔ４ポリメラーゼを用いた片鎖特異的ラベル化法
〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）。 （１９８２）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に従ってラベルをし、
５ａｌＩとＸｈｏｌ処理してポリアクリルアミド電気泳
動を行い、調製した。第２図に示すようにＰＢＲ３２２
のＲｓ ａ Ｉ分解物をサイズマーカーとしてＰＨ０８
転写産物の大きさを推定すると約１，８００ヌクレオチ
ドとなった。転写方向は、低リン酸完全培地で培養した
野性型株Ｐ−２８−２４Ｃからポリ（Ａ）ＲＮＡを調製
し、上記の片鎖を特異的にラベルしたプローブＤＮＡを
用いてノザンハイブリダイゼーションを行ったところ、
第３図に示すようにＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩＤＮＡ断片（
０，９５ｋｂ）のプローブでＰＨ０８転写産物が検出さ
れ、Ｘｈｏ Ｉ−Ｘｈｏ ｌＤＮＡ断片（０，４ｋｂ）
のプローブでは検出されなかったことから、第１図の波
形矢印で示すように左方向である。以上の結果と参考例
３の結果を合わせて考えると、ＰＨ０８遺伝子のプロモ
ーター領域は１．ｌｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏｌＤＮＡ
断片に存在すると予想される。 失慮■亙 ＰＨ０８遺伝子を含む２．７ｋｂＤＮＡ断片
の制限酵素地図の作成 ＰＨ○８遺伝子を含むＥ ｃ ｏ ＲＩ −Ｓ ａ ｕ
３ ＡＩ／ＢａｍＨＩＤＮＡ断片（第１図の白抜部分
の領域）の制限酵素地図を１１種類の制限酵素（Ａｌｕ
Ｉ、Ｂｇｌｎ、Ｃ１ａＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈａｅｍ、Ｈｉ
ｎｄｍ、Ｈｉｎｆ Ｉ、Ｓａ Ｉ Ｉ、５ａｕ３ＡＩ、
Ｔａｑ■、ＸｈｏＩ）を用いて作成した（第４図）。常
法に従って各種制限酵素の単独あるいは二種類組み合わ
せによって生じた反応物を７．５％あるいは１２％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その切断パターン
から各制限酵素の切断部位を推定した。分子量マーカー
としてｐＢＲ３２２のＨａｅｍ分解物あるいは５ａｕ３
ＡＩ分解物を用いた。なお切断部位は確認できたものの
み記入した。 叉凰孤７ ＰＨ０８遺伝子を含む２．７ｋｂＤＮ
Ａ断片の塩基配列決定 実施例６で作成した制限地図に基づいてＤＮＡ塩基配列
をＭａｘａｍとＧ ｉ １ ｂ ｅ ｒ ｔの方法とＭ
１３ファージを用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法（いずれも前出）によって決定した。 その結果を第５図に示した０番号はＡＴＧのＡを１とし
て付けである。ＰＨ０８遺伝子のコーディング領域と考
えられる１６３３塩基（＋１から＋１６３３）のオープ
ンリーディングフレームが見出された。しかし、終止コ
ドンが出現していない。 このことから、ｐＡＬ １０１にクローン化されたＰＨ
○８遺伝子は３′−末端側を欠いたことになる。ｐＡＬ
ｌｏｌの示した相補能はベクター内まで転写が続き、＋
１６８４から出現する終止コドン（ＴＡＧ）を使用する
ことにより生じたと考えられる。また第５図に示すよう
にＸ ｈ ｏ Ｉ切断部位の上流およそ１７０〜１８０
塩基に”ＴＡＴＡＴＡＡＡ”というＴＡＴＡ配列と考え
られる配列が出現し、ＸｈｏＩ切断部位の上流およそ５
０塩基付近に翻訳開始コドン”ＡＴＧ”が出現する。こ
れらのことはこの領域がＰＨ０８遺伝子の５′上流非翻
訳領域およびＰＨ０８遺伝子の５′末端領域を含んでい
ることを示唆している。 実施例８ ＰＨ０８の３″末領域の回収Ｗ ｔ ｎ
ｓ ｔ ｏ ｎらの”ｅｖｉｃｔｉｏｎ”法（Ｆ。 Ｗｉｎｓｔｏｎ ｅｔ、ａｌ、、メソクズ０イン６エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）、１０１，２１１（１９８３））によっ
てＰＨ０８の３′末領域を回収した。 まず、第１図の白抜き部分を含むＥ ｃ ｏ ＲＩをｐ
ＢＲ３２２のＥ ｃ ｏ ＲＩサイトに挿入したＰＡＬ
１２７を材料にして、第６図に示した通り、ＸｈｏＩ−
Ｈｉｎｄｍ断片約４７０ｂｐをＹＩｐ５〔プロシージン
グ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａ ｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ
ＳＡ）、７６．１０３５ （１９７９）〕にサブクロー
ニングしてｐＡＬ１３４を作製した。このプラスミドは
ＰＨ０８の一部を持っている。次にｐＡＬ１３４をＢｇ
ＩＩＩで処理して直線状にした後、ＰＨ０８＋株（Ｋ
７７−６Ｄ）の形質転換を行なった（第７図）、ｐＡＬ
１３４はＰＨ０８の両末端を欠いているので染色体上の
ＰＨ０８座に組み込まれると、５′末端を欠いた遺伝子
（’ Ｐ Ｈ２Ｓ）と３′末端を欠いた遺伝子（ＰＩ］
０８′）が生じる。その結果、形質転換体はＰｈｏ８変
異体となる。得られた形質転換体のｒＡｌｐＡｌ型およ
びｐｈｏ８変異体との相補性試験により、ｐＡＬ１３４
の組み込み位置を確認した後、形質転換体の一つから全
ＤＮＡを調製し、Ｅｃ ｏＲＩ処理し、Ｔ４リガーゼ連
結反応を行なった。次にその反応液を用いて大腸菌ＪＡ
２２１の形質転換を行ない、アンピシリン耐性株からＰ
Ｈ０８３′末領域を持つプラスミドｐＡＬ１３８を得た
。 実施例９ ＰＨ０８遺伝子の全塩基配列ｐＡＬ１３８
から常法により約１．４ｋｂの５ａｌＩ−ＰｓｔＩ断片
を調製し１Ｍ１３フアージを用いたジデオキシヌクレオ
チド合成鎖停止法によるＤ Ｎ Ａ塩基配列決定に用い
た。 ５ａｌＩ末端側から１２４６塩基の配列を決定した。そ
の結果を実施例２で得られた結果と結合して第８図に示
した。この結果からＰ Ｈ０８遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームは１７０１塩基（＋１から＋１７０１）
で、５６６個のアミノ酸からなる分子量６３，０５１の
蛋白質をコードしていることになる。 実施例１０ ＰＨ０８プロモーター単離（第９図）実
施例７の結果に従い、プロモーター領域を含むＤＮＡを
単離した。実験には第１図の白抜き部分を含むＥ ｃ
ｏ ＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃ。 ＲＩサイトに挿入したｐＡＬ１２７を出発材料として用
いた。 ＰＨ０８遺伝子がクローニングさ九たプラスミドｐ Ａ
Ｌ １２７ 、５０、− ｇに５０ユニツトの制限酵
素ＥｃｏＲＩ［全酒造（株）ｙ５］を１００．、．１の
反応液（１００ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐ
Ｈ７，５）、５０ｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２．７ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３７
°Ｃ，２時間作用させた後、１％アガロース（Ｓｉｇｍ
ａ社製）・スラブゲルを用いて緩衝液［１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１００ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ （ｐＨ８，３））中。 １４０ｖ、２時間電気泳動にかけた。泳動後、３ｋｂＤ
ＮＡ断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動
用緩衝液内に沈め、該ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶
出した（ＭｃＤｏｎｅｌｌ。 Ｍ、Ｗ、ら、［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）Ｊｙ±±０．１１
９（１９７７）］。透析チューブ内液をフェノール抽出
さらにエーテル抽出した後、ＮａＣ１を０．２Ｍになる
ように加え、つづいて２倍量の冷エタノールを加えて一
２０℃で３ｋｂＤＮＡを沈殿させた。 該３ｋｂＤＮＡＩＰｇに５ユニツトのＤＮＡポリメラー
ゼＩラージ・フラグメント（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３０１１の反応液Ｃ４０ｍＭ
リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
３３．、−Ｍ ｄＡＴ Ｐ 、 ３３ ＰＭ ｄ
Ｔ Ｔ Ｐ ）中で１２°Ｃ１３０分間作用させて、接
着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、冷
エタノールでＤＮＡを沈殿させた。該ＤＮＡ断片５００
ｎｇとリン酸化されたＢ、ａｍＨＩリンカ−（５’−Ｐ
−ｄ （ＣＧＧＡＴＣＣＧ））（全酒造（株）製）５
０ｎｇとを混合し、２０，１の反応液（６６ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、６．６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 。 １０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ。 ２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造（株）製）〕
中、１４℃で一夜作用させてＤＮＡを結合させた。反応
後、過剰量の制限酵素ＢａｍＨＩ〔全酒造（株）製〕を
加え３７℃、４時間作用させ、フェノールで除蛋白した
後、ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−
ＨＣＩ （ｐＨ８，０）＝２００ｍＭ ＮａＣ１，
１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したセファロース４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）・カラム（０、２５Ｘ ２
５ ｃ ｍ）にかけてｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ付近に
溶出されるＤＮＡを集めて、２倍量の冷エタノールを添
加して該ＤＮＡを沈殿させた（ＢａｍＨＩ消化３ｋｂＤ
ＮＡ）。 ベクターｐ Ｂ Ｒ３２２、１、、−ｇに２ユニツトの
制限酵素Ｂ ａ ｍ Ｈｒを２０ 、、 ｌの反応液（
１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）
、７ｍＭＭｇＣ１２，１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ
２−メルカプトエタノール〕中で３７℃、２時間作用
させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮ
Ａを沈殿させた（ＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２）、Ｂａ
ｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２，０，１，−ｇと、上記Ｂａｍ
ＨＩ消化３ｋｂＤＮＡＯ，ｌ、−ｇとを混合しＴ４ＤＮ
Ａリガーゼの作用によって結合させた。該反応液を用い
て大腸菌ＤＨＩ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、「モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）Ｊ ＋Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂ。 ｒａｔｏｒｙ、２５４〜２５５ （１９８２））を形質
転換させ、アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性
を示す組み換え体の中から、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ
部位にＰＨ０８遺伝子を含む３ｋｂＤＮＡ断片が挿入さ
れたプラスミドｐＴＦ １４を取得した（第９図参照）
。 次に、ＰＨ０８遺伝子の構造遺伝子を取り除くために、
まずｐＴＦ１４．１０Ｐｇに１０ユニツトの制限酵素Ｘ
ｈ ｏ Ｉを３０Ｐ１の反応液〔１０ｍＭ Ｔｒ
１ｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣ１２，
１００ｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール〕中で３７℃、３時間作用させ、フェノールで
除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させた（Ｘｈｏ
Ｉ消化ｐＴＦ１４）。 つづいてＸｈｏＩ消化ｐ Ｔ Ｆ １４，１ 、Ｌａ
ｇに１０ユニツトのＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（Ｂａｔｈ
ｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社ｍ）を５０．、、ｌの反応液（２０ｍＭ Ｔ
ｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐＨ８，１）、１２ｍＭ
ＣａＣＩ２． １２ｍＭ ＭｇＣｌ２．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ〕中で３０°Ｃ１２分間作用させた後、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させた。 ５０ｎｇの５′末端がリン酸化された５ａｌＩリンカ−
（５’−Ｐ−ｄ （ＧＧＴＣＧＡＣＣ））（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社￥！１）と４００
ｎｇの上述のＢＡＬ−３１で処理されたｐＴＦ１４とを
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。この反応液
を用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換し、アンピシリン耐性
の形質転換体の中から制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと５ａｔ
Ｉ（全酒造（株）製〕による二重消化によって１４０〜
１６３ｂｐの断片が生じるプラスミドｐＴＦ１４−４を
選択した（第９図参照）。このプラスミドではＢＡＬ−
３１ヌクレアーゼ処理によってＰＨ０８の構造遺伝子が
完全に取り除かれプロモーター領域が保存されている（
第５図参照）。 このｐＴＦ １４−４からＰＨＯプロモーター中のＢａ
ｍＨＩ−５ａｌＩ断片を製造し、ジヌクレオチド合成鎖
停止法（前出）によって５ａｌＩリンカ−の挿入個所付
近の塩基配列を調べた。その結果、該リンカ−は ・・・ＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＣ・
・ａｌＩ で示されるとおり、−３５番目のＣの下流に挿入されて
いることが確認された。 ヌｕ級准Ｌ↓」エ ＰＨ０８プロモーターを利用する酵
母発現用ベクターの作ｆｆ！５（第１０図参照） Ｈａｒａｓｈｉｍａ、Ｓら［モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．ａｎｄＣｅｌ、Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）Ｊ 、４，７７１ （１９８４）に記載の
大腸菌−酵母シャトルベクターｐ Ｓ Ｈ１９ｚ １
０Ｐｇに各１０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩと５ａｌ
Ｉとを５０戸１の反応液（１０ｍＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５）、７ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１２、
１００ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１、７ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール〕中で３７℃、２時間作用させた後、該反
応液を０．８％アガロース・スラブゲルを用いて前記条
件下で電気泳動にかけた。泳動後、８．０ｋｂＤＮＡ断
片を前記の方法によってゲルから分取した。 実施例１０で得られたプラスミドｐＴＦ１４−４．１０
．、ｇに各々１０ユニツトの制限酵素Ｂａｍ ＨＩと５
ａｌＩとを上記条件下で反応させた後、電気泳動にかけ
てＰＨ０８プロモーターを含む１゜０５ｋｂＤＮＡ断片
を単離した。 該１．０５ｋｂＤＮＡ断片２００ｎｇと上述の８．０ｋ
ｂＤＮＡ断片５００ｎｇとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼの作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌Ｄ
ＨＩを形質転換させ、アンピシリン耐性形質転換体の中
からｐｓＨ１９のＢａｍＨＩ−３ａｌＩ部位にｐＴＦ１
４−４から単離された１、０５ｋｂ断片が挿入されたプ
ラスミドｐＴＦ１０３を分離した（第１Ｏ図参照）。 ｍ±２ ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子を
発現する組み換えＤＮＡ分 子の構築および該ＤＮＡ分子による 酵母の形質転換 特願昭５９−１９３７６５号（出願臼：昭和５９年９月
１３日）明細書の実施例に記載されているａｄｗ型Ｂ型
肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子発現プラス
ミドｐＰＨ○１７−５８゜５０ Ｐｇに５０ユニツトの
制限酵素Ｘ ｈ ｏ Ｉを１００Ｐｌの反応液（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）＋ ７ｍＭ
ＭｇＣｌ２．ＬｏｏｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ ２−
メルカプトエタノール〕中で３７°Ｃ１２時間作用させ
た後、１．０％アガロース・スラブゲルを用いて前記記
載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、ａｄｗ型ＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む８２３ｂｐＤＮＡ断片を前記の方法
でゲルから分取した（第１０図参照）。 実施例１１で得られた発現用ベクターｐＴＦ １０３＋
１．”ｇに２ユニツトの制限酵素５ａｌＴを２０、−１
の反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ Ｈ７，
５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１７５ｍＭ ＮａＣ１
，０，２ｍＭ ＥＤＴＡ、７ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール〕中で３７°Ｃ，２時間作用させた後、フェノー
ルで除蛋白し、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ
た（ＳａｌＩ消化ＰＴＦ１０３）。 ２００ｎｇの５ａｌＩ消化ｐＴＦ１０３と２００ｎｇの
前記８２３ｂｐＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼの作
用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨＩ株
を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中か
ら８２３ｂｐＤＮＡ断片中のＨＢｓＡｇ遺伝子がＰＨ０
８プロモーターと順方向に挿入されたプラスミドｐＴＦ
１０３−５８を含有する形質転換体、エシェリヒア コ
リＤＨＩ／ｐＴＦ１０３−５８を分離した。さらに該形
質転換体からプラスミドｐＴＦ １０３−５８を単離し
た（第１０図参照）。 該プラスミドを用いて酵母宿主サツカロミセスセレビシ
ェ・ＡＨ２２Ｒを形質転換し、形質転換体（サツカロミ
セス セレビシェ・ＡＨ２２Ｒ−／ｐＴＦ １０３−５
８）を取得した。 叉１涯上３ ａｄｗ型ＨＢ ｓ Ａ ｇ遺伝子の酵母
における発現 実施例１２で得られたａｄｗ型ＨＢ ｓ Ａ ｇ遺伝子
発現プラスミドを保持するサツカロミセス・セレビシェ
形質転換体（ＡＨ２２Ｒ／ｐＴＦ１０３−５８）をＢｕ
ｒｋｈｏｌｄｅｒおよびその低リン酸培地で３０°Ｃ，
２日間培養した後、菌体を集め、生理食塩水で洗浄した
。Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａらの方法〔プロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｅ ｔ、ＵＳＡ）、８０゜１
（１９８３）］に従って、菌体をＺｙｍｏ ｌ ｙａＳ
ｅ（生化学工業（株）：ａ）によってスフェロプラスト
にした後、スフェロプラストに０．１％トリトンＸ−１
００を添加してＨＢｓＡｇを抽出した。溶菌液を室温で
１５．ＯＯＯｒｐｍ、１５分間遠心分踵にかけて上清液
を得た。この上清液のＨＢｓＡｇ活性をオースザイム■
〔ダイナボット（株）製〕を用いて測定した。その結果
、ａｄＷ型ＨＢｓＡｇの生成量はブロスｌｌあたり１５
０）４ｇであった。
第１図は本発明でクローン化されたＰＨ０８構造遺伝子
及びＰＨ０８プロモーターを含有するＤＮＡ断片および
その誘導体の制限酵素地図、およびそれらの活性相補能
を示す図である。 第２図及び第３図は、第１図の白抜き部分を持つプラス
ミドを用いてＰ Ｈ○８転写産物を同定、及び転写方向
を決定するのに用いたノザンハイブリダイゼーシ目ンの
結果である。 第４図は第１図の白抜き部分のＤＮＡ断片の制限酵素切
断地図であり、第５図はＰＨ０８プロモーターを含むＰ
Ｈ０８の部分の塩基配列である。 第６図はｐＡＬ１３４の構築図であり、第７図はＰＨ０
８の３′末端領域を回収することを示す図である。 第８図はＰＨ０８を含むＤＮＡの全塩基配列であり、第
９図はＰ Ｈ○８プロモーターの調製を示すプラスミド
構築図であり、第１０図はａｄｗ型Ｂ型計炎ウィルス表
面抗原遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子の構築図で
ある。
及びＰＨ０８プロモーターを含有するＤＮＡ断片および
その誘導体の制限酵素地図、およびそれらの活性相補能
を示す図である。 第２図及び第３図は、第１図の白抜き部分を持つプラス
ミドを用いてＰ Ｈ○８転写産物を同定、及び転写方向
を決定するのに用いたノザンハイブリダイゼーシ目ンの
結果である。 第４図は第１図の白抜き部分のＤＮＡ断片の制限酵素切
断地図であり、第５図はＰＨ０８プロモーターを含むＰ
Ｈ０８の部分の塩基配列である。 第６図はｐＡＬ１３４の構築図であり、第７図はＰＨ０
８の３′末端領域を回収することを示す図である。 第８図はＰＨ０８を含むＤＮＡの全塩基配列であり、第
９図はＰ Ｈ○８プロモーターの調製を示すプラスミド
構築図であり、第１０図はａｄｗ型Ｂ型計炎ウィルス表
面抗原遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子の構築図で
ある。
Claims (5)
- （１）ＰＨＯ８プロモーターを含有する組み換えＤＮＡ
。 - （２）ＰＨＯ８プロモーターの下流に構造遺伝子が組み
込まれた特許請求の範囲第１項記載の組み換えＤＮＡ。 - （３）ＰＨＯ８プロモーターを含有する組み換えＤＮＡ
を有する形質転換体。 - （４）宿主が酵母である特許請求の範囲第３項記載の形
質転換体。 - （５）ＰＨＯ８プロモーターの下流に構造遺伝子を含有
するＤＮＡを有する形質転換体を培地に培養し、培養物
中に生成蓄積された遺伝子産物を採取することを特徴と
する遺伝子産物の製造法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59-274456 | 1984-12-28 | ||
| JP27445684 | 1984-12-28 | ||
| JP7349385 | 1985-04-09 | ||
| JP60-73493 | 1985-04-09 | ||
| JP19848085 | 1985-09-10 | ||
| JP60-198480 | 1985-09-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62151181A true JPS62151181A (ja) | 1987-07-06 |
| JPH062063B2 JPH062063B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=27301232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60287860A Expired - Lifetime JPH062063B2 (ja) | 1984-12-28 | 1985-12-23 | 新規ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062063B2 (ja) |
-
1985
- 1985-12-23 JP JP60287860A patent/JPH062063B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH062063B2 (ja) | 1994-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH02476A (ja) | 宿主細胞としてのクルイベロミセス | |
| EP0096430B1 (en) | Cloning system for kluyveromyces species | |
| US4784949A (en) | Universal dominant selectable marker cassette | |
| US4943529A (en) | Kluyveromyces as a host strain | |
| USRE37767E1 (en) | Highly stable recombinant yeasts for the production of recombinant proteins | |
| JP3072993B2 (ja) | Ｄｎａ分子 | |
| JPH0515379A (ja) | 酵母雑種ベクター及び該ベクターを使用するポリペプチドの製造方法 | |
| JPS61268193A (ja) | 融合蛋白質をコードするｄｎａ | |
| JP2614314B2 (ja) | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびｐｒｅＳ▲下２▼タンパク質の発現 | |
| WO1984004535A1 (en) | Heat regulated production of selected and fused proteins in yeast | |
| CA1327330C (en) | Expression system comprising aspergillus niger pectin lyase i gene sequences | |
| US5627046A (en) | Yeast promoter and its use | |
| US4940661A (en) | Metallothionein transcription control sequences and use thereof | |
| JP2973430B2 (ja) | 誘導可能な系を用いた酵母による蛋白質の製造方法、ベクター及びその形質転換株 | |
| JP2905921B2 (ja) | 細菌中に含まれるプラスミドの安定化方法 | |
| CA1341306C (en) | Yeast expression of urokinase-type plasminogen activator and mutants thereof | |
| EP0399455B1 (en) | Stably transformed yeast host cells and their use for the production of albumin | |
| JPS62151181A (ja) | 新規ｄｎａおよびその用途 | |
| CN113056554A (zh) | 重组酵母细胞 | |
| JPH08500008A (ja) | Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）リボソームタンパク質ＲＰ２８の遺伝子のプロモーターおよびその使用 | |
| JPS63152982A (ja) | 新規ｄｎａおよびその用途 | |
| US4757021A (en) | Recombinant plasmid and microbial strain transformed by said plasmid | |
| CA1272142A (en) | Mammalian promoters useful in yeast expression | |
| CA2128794C (en) | Mutant aox2 promoter, vector carrying same, transformant, and production of heterologous protein | |
| JP3012664B2 (ja) | ベクターによる糸状菌類の形質転換方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |