JPH062063B2 - 新規ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
新規ｄｎａおよびその用途Info
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- JPH062063B2 JPH062063B2 JP60287860A JP28786085A JPH062063B2 JP H062063 B2 JPH062063 B2 JP H062063B2 JP 60287860 A JP60287860 A JP 60287860A JP 28786085 A JP28786085 A JP 28786085A JP H062063 B2 JPH062063 B2 JP H062063B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pho8
- gene
- dna
- yeast
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は酵母から得られたプロモーターを含む新規ＤＮ
Ａおよびその遺伝子工学への用途に関する。
Ａおよびその遺伝子工学への用途に関する。
従来の技術 組み換えＤＮＡ技術が広く利用されるようになって、有
用なポリペプチドの原核生物や真核生物を用いた生産が
可能になってきた。これまでこれら物質の大量生産には
主として大腸菌が利用されてきたが、特に薬理学的に重
要なポリペプチドの生産には真核生物の利用が望まれ
る。酵母は真核生物である他の真核生物、特に哺乳動物
細胞と数々の共通点を有しているために哺乳動物由来の
蛋白質遺伝子を発現させるのに有利である。さらに酵母
細胞はエンドトキシンを含有しないこと、酵母は微生物
であるために培養が容易であること、古くから大量培養
が工業的になされており、その安全性が確認されている
こと、その遺伝生化学的解析が数多くなされていること
などの理由から、酵母を宿主として利用することに注目
が集まっている。
用なポリペプチドの原核生物や真核生物を用いた生産が
可能になってきた。これまでこれら物質の大量生産には
主として大腸菌が利用されてきたが、特に薬理学的に重
要なポリペプチドの生産には真核生物の利用が望まれ
る。酵母は真核生物である他の真核生物、特に哺乳動物
細胞と数々の共通点を有しているために哺乳動物由来の
蛋白質遺伝子を発現させるのに有利である。さらに酵母
細胞はエンドトキシンを含有しないこと、酵母は微生物
であるために培養が容易であること、古くから大量培養
が工業的になされており、その安全性が確認されている
こと、その遺伝生化学的解析が数多くなされていること
などの理由から、酵母を宿主として利用することに注目
が集まっている。
現在、遺伝子クローニングのための酵母ベクターはいく
つか知られているが、異種遺伝子を効率よく発現させる
ための強力な酵母プロモーターはあまり知られていな
い。
つか知られているが、異種遺伝子を効率よく発現させる
ための強力な酵母プロモーターはあまり知られていな
い。
酵母サッカロミセス・セレビシエの細胞破砕液中には二
種類のアルカリ性ホスファターゼの存在が知られてい
る。その一つは無機リン酸によってその生産が抑制さ
れ、基質特異性の広い抑制性アルカリ性ホスファターゼ
であり、他の一つはｐ−ニトロフェニルリン酸のみを基
質にし、かつ構成的に産生される特異的ｐ−ニトロフェ
ニルホスファターゼである。抑制生アルカリ性ホスファ
ターゼ活性を欠く突然変異体としてｐｈｏ８変異体とｐ
ｈｏ９変異体が分離されており、ｐｈｏ８遺伝子は抑制
性アルカリ性ホスファターゼの構造遺伝子であり、ｐｈ
ｏ９遺伝子はｐｈｏ８転写以後に必須で液胞内加水分解
酵素群の前駆体を活性化させると考えられている。
種類のアルカリ性ホスファターゼの存在が知られてい
る。その一つは無機リン酸によってその生産が抑制さ
れ、基質特異性の広い抑制性アルカリ性ホスファターゼ
であり、他の一つはｐ−ニトロフェニルリン酸のみを基
質にし、かつ構成的に産生される特異的ｐ−ニトロフェ
ニルホスファターゼである。抑制生アルカリ性ホスファ
ターゼ活性を欠く突然変異体としてｐｈｏ８変異体とｐ
ｈｏ９変異体が分離されており、ｐｈｏ８遺伝子は抑制
性アルカリ性ホスファターゼの構造遺伝子であり、ｐｈ
ｏ９遺伝子はｐｈｏ８転写以後に必須で液胞内加水分解
酵素群の前駆体を活性化させると考えられている。
発明が解決しようとする問題点 現在、遺伝子クローニングのための種々の酵母ベクター
が知られており、利用が可能である。しかし同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させるためには、用いる宿
主に適した強力な酵母プロモーターを選択する必要があ
る。
が知られており、利用が可能である。しかし同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させるためには、用いる宿
主に適した強力な酵母プロモーターを選択する必要があ
る。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、酵母の抑制性アルカリ性ホスファターゼ
プロモーター（ＰＨＯ８プロモーターと称する。）に着
目し、抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする領
域をクローン化し、その制限酵素切断地図を作成すると
ともに、その全塩基配列を決定したところ該プロモータ
ーは新規なＤＮＡであること、これを用いて同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させることができることを
見出し、これらに基づいて更に研究した結果、本発明を
完成した。
プロモーター（ＰＨＯ８プロモーターと称する。）に着
目し、抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする領
域をクローン化し、その制限酵素切断地図を作成すると
ともに、その全塩基配列を決定したところ該プロモータ
ーは新規なＤＮＡであること、これを用いて同種もしく
は異種遺伝子を効率よく発現させることができることを
見出し、これらに基づいて更に研究した結果、本発明を
完成した。
本発明は、塩基配列 GAATTCAATGTTAGGAGTAGAACAATAACCGCACCTGCGATGACGGTA AATCTCAACAGTCTCTTACTGAGAAAGAGGGCCATGCTTTCGAGTGGA ACTACTTGCGAATATGGATATCACTTCCAGTATTATAGATTCATAAAA TGTATAAACGAATTAAATCGCAAATTATCTCCTTTTCAGACTGTTTCT TCACCAAATTTCTTTTTTTTTTCCTACTAGAAGAAGGCGTAGCAGATA AGAAGAAAAATTATATTAAGCGTGCGGGTAAAGGCAAGGAAGAATCAA GTAAGACCTTAAGAATGGCACTATAAGTGTGGTATTATAATCTGTGTA ATCCTAATTTGAGCTCGACACAATACCATTCGACGGTTAACAGCTACT GCATCACCGTCCAGTCATGTCGTACAACGGAATAGGGCTCAAGTCGGC AAAAGGGTCATCTACGTCGGGCCACGTGCAGCGATCACTTGCTAGCAA CAATAGGCGCAGACCACAGGGTAGTCAACAGCAGCGGCAACAACGACA AAATGCGATCAAAAAGGCCAGCCATGACAAGGGAAGCAGGCCTCTTGC TGTGCAGAAACAGATAGAGAATCATATGGAGAAACGTGAGATTGAAGT ACAAGTCAGTGAGCTACGGGACCGACTGGAGGAGGAAGAAACGCTCTC GGAAGAGCAGATTGACAAGAAATGTGAAGCGTTGAGGGCAAAACTGAC GAACGAGTGGCAAGAACAGCAGCGGATGTCCTCTTTGTACACCCCTCG TAAGGCGCGTCTAACGGAAGAGCAGCATCGACATGAATAGCAGCATTG ACGATAGCGATAAGCTTCGCGCGTAGAGGAAAAGTAAAGGGATTTTAG TATATAAAGAAAGAAGTGTATCTAAACGTTTATATATTTTCGTGCTCC ACATTTTGCCAGCAAGTGGCTACATAAACATTTACATACCAGCATTAC GGGACATTATTTGAACGCGCATTAGCAGC で示されるＰＨＯ８プロモーターを含有する組み換えＤ
ＮＡ、該ＰＨＯ８プロモーターの下流に構造遺伝子が組
み込まれた組み換えＤＮＡ、塩基配列 GAATTCAATGTTAGGAGTAGAACAATAACCGCACCTGCGATGACGGTA AATCTCAACAGTCTCTTACTGAGAAAGAGGGCCATGCTTTCGAGTGGA ACTACTTGCGAATATGGATATCACTTCCAGTATTATAGATTCATAAAA TGTATAAACGAATTAAATCGCAAATTATCTCCTTTTCAGACTGTTTCT TCACCAAATTTCTTTTTTTTTTCCTACTAGAAGAAGGCGTAGCAGATA AGAAGAAAAATTATATTAAGCGTGCGGGTAAAGGCAAGGAAGAATCAA GTAAGACCTTAAGAATGGCACTATAAGTGTGGTATTATAATCTGTGTA ATCCTAATTTGAGCTCGACACAATACCATTCGACGGTTAACAGCTACT GCATCACCGTCCAGTCATGTCGTACAACGGAATAGGGCTCAAGTCGGC AAAAGGGTCATCTACGTCGGGCCACGTGCAGCGATCACTTGCTAGCAA CAATAGGCGCAGACCACAGGGTAGTCAACAGCAGCGGCAACAACGACA AAATGCGATCAAAAAGGCCAGCCATGACAAGGGAAGCAGGCCTCTTGC TGTGCAGAAACAGATAGAGAATCATATGGAGAAACGTGAGATTGAAGT ACAAGTCAGTGAGCTACGGGACCGACTGGAGGAGGAAGAAACGCTCTC GGAAGAGCAGATTGACAAGAAATGTGAAGCGTTGAGGGCAAAACTGAC GAACGAGTGGCAAGAACAGCAGCGGATGTCCTCTTTGTACACCCCTCG TAAGGCGCGTCTAACGGAAGAGCAGCATCGACATGAATAGCAGCATTG ACGATAGCGATAAGCTTCGCGCGTAGAGGAAAAGTAAAGGGATTTTAG TATATAAAGAAAGAAGTGTATCTAAACGTTTATATATTTTCGTGCTCC ACATTTTGCCAGCAAGTGGCTACATAAACATTTACATACCAGCATTAC GGGACATTATTTGAACGCGCATTAGCAGC で示されるＰＨＯ８プロモーターを含有する組み換えＤ
ＮＡを有する形質転換酵母に関するものである。上記Ｐ
ＨＯ８プロモーターの塩基配列は第５図における−９８
９〜−１で示される塩基配列に相当する。
ＮＡ、該ＰＨＯ８プロモーターの下流に構造遺伝子が組
み込まれた組み換えＤＮＡ、塩基配列 GAATTCAATGTTAGGAGTAGAACAATAACCGCACCTGCGATGACGGTA AATCTCAACAGTCTCTTACTGAGAAAGAGGGCCATGCTTTCGAGTGGA ACTACTTGCGAATATGGATATCACTTCCAGTATTATAGATTCATAAAA TGTATAAACGAATTAAATCGCAAATTATCTCCTTTTCAGACTGTTTCT TCACCAAATTTCTTTTTTTTTTCCTACTAGAAGAAGGCGTAGCAGATA AGAAGAAAAATTATATTAAGCGTGCGGGTAAAGGCAAGGAAGAATCAA GTAAGACCTTAAGAATGGCACTATAAGTGTGGTATTATAATCTGTGTA ATCCTAATTTGAGCTCGACACAATACCATTCGACGGTTAACAGCTACT GCATCACCGTCCAGTCATGTCGTACAACGGAATAGGGCTCAAGTCGGC AAAAGGGTCATCTACGTCGGGCCACGTGCAGCGATCACTTGCTAGCAA CAATAGGCGCAGACCACAGGGTAGTCAACAGCAGCGGCAACAACGACA AAATGCGATCAAAAAGGCCAGCCATGACAAGGGAAGCAGGCCTCTTGC TGTGCAGAAACAGATAGAGAATCATATGGAGAAACGTGAGATTGAAGT ACAAGTCAGTGAGCTACGGGACCGACTGGAGGAGGAAGAAACGCTCTC GGAAGAGCAGATTGACAAGAAATGTGAAGCGTTGAGGGCAAAACTGAC GAACGAGTGGCAAGAACAGCAGCGGATGTCCTCTTTGTACACCCCTCG TAAGGCGCGTCTAACGGAAGAGCAGCATCGACATGAATAGCAGCATTG ACGATAGCGATAAGCTTCGCGCGTAGAGGAAAAGTAAAGGGATTTTAG TATATAAAGAAAGAAGTGTATCTAAACGTTTATATATTTTCGTGCTCC ACATTTTGCCAGCAAGTGGCTACATAAACATTTACATACCAGCATTAC GGGACATTATTTGAACGCGCATTAGCAGC で示されるＰＨＯ８プロモーターを含有する組み換えＤ
ＮＡを有する形質転換酵母に関するものである。上記Ｐ
ＨＯ８プロモーターの塩基配列は第５図における−９８
９〜−１で示される塩基配列に相当する。
本発明のＰＨＯ８プロモーターおよび抑制性アルカリ性
ホスファターゼをコードする構造遺伝子（ＰＨＯ８と称
する。）を含むＤＮＡは、酵母菌体から分離、採取する
ことができる。
ホスファターゼをコードする構造遺伝子（ＰＨＯ８と称
する。）を含むＤＮＡは、酵母菌体から分離、採取する
ことができる。
該酵母としては、いずれのものでもよいが、とくにサツ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌が好ま
しく、たとえばサツカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられ、具体的にはたとえば市
販のパン酵母が挙げられる。
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌が好ま
しく、たとえばサツカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられ、具体的にはたとえば市
販のパン酵母が挙げられる。
酵母からＤＮＡを抽出するには、たとえばメソッズ・イ
ン・セルラー・バイオロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ），ｖｏｌ．１２，ｐ．１３〜４
４（１９７５）に記載の方法あるいはこれに準じた方法
によって行われる。
ン・セルラー・バイオロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ），ｖｏｌ．１２，ｐ．１３〜４
４（１９７５）に記載の方法あるいはこれに準じた方法
によって行われる。
次に得られたＤＮＡを適当な制限酵母で処理したのち、
同じ制限酵母あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵
母で処理したプラスミド、あるいはファージに、上記で
得られたＤＮＡ断片を組み込んでジーンバンクを作製す
る。該プラスミドとしては例えばｐＢＲ３２２や大腸菌
−酵母シャトルベクターＹＥｐ１３〔ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）８，１２１（１９７９）参照〕がまたファージとし
てはｃｈａｒｏｎ系ファージ〔ジャーナル・オブ・ウィ
ロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．），２９，５５５（１９７
９）参照〕などが用いられる。また必要により、例えば
大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ１６〔ジーン（Ｇ
ｅｎｅ），８，１７（１９７９）参照〕などを用いてさ
らにサブクローニングする。
同じ制限酵母あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵
母で処理したプラスミド、あるいはファージに、上記で
得られたＤＮＡ断片を組み込んでジーンバンクを作製す
る。該プラスミドとしては例えばｐＢＲ３２２や大腸菌
−酵母シャトルベクターＹＥｐ１３〔ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）８，１２１（１９７９）参照〕がまたファージとし
てはｃｈａｒｏｎ系ファージ〔ジャーナル・オブ・ウィ
ロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．），２９，５５５（１９７
９）参照〕などが用いられる。また必要により、例えば
大腸菌−酵母シャトルベクターＹＥｐ１６〔ジーン（Ｇ
ｅｎｅ），８，１７（１９７９）参照〕などを用いてさ
らにサブクローニングする。
このようにしてクローン化されたＤＮＡを保持するベク
ターで、宿主微生物を形質転換する。
ターで、宿主微生物を形質転換する。
宿主微生物としては、酵母が好ましく、たとえばサツカ
ロミセス属菌などが挙げられる。さらに具体的には、サ
ツカロミセス・セレビシエＮＡ７９−１０Ｃ株などが挙
げられる。
ロミセス属菌などが挙げられる。さらに具体的には、サ
ツカロミセス・セレビシエＮＡ７９−１０Ｃ株などが挙
げられる。
なお、上記宿主微生物は、ｐｈｏ８の変異体であること
が好ましい。
が好ましい。
上記ＮＡ７９−１０Ｃ株は、通常の交雑法（ハンドブッ
ツ・オブ・ジェネティックス（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），ｐ．３６６Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７４）に従って得るこ
とができる。すなわちＮＡ７９−１０Ｃ株は、ＡＬ２１
１−１２Ｂ株（α，ｐｈｏ３−１，ｐｈｏ８，ａｒｇ
６）〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，１２７（１９
８２）〕，ＡＨ２２株（ａ，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａ
ｎ１）〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８０，１（１９８３）〕，Ｄ１
３−１Ａ株（ａ，ｔｒｐ１，ｈｉｓ３，ｇａｌ２，ＳＵ
Ｃ２）〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，１０３５（１９７９）〕
およびＹＡＴ２２８株（ａ，ｌｅｕ２，ｌｙｓ１０，ｃ
ｙｈ，ｋａｒｌ−１）〔（ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），１４５，１４
２１（１９８１）〕を交雑することによって、取得でき
る。
ツ・オブ・ジェネティックス（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），ｐ．３６６Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７４）に従って得るこ
とができる。すなわちＮＡ７９−１０Ｃ株は、ＡＬ２１
１−１２Ｂ株（α，ｐｈｏ３−１，ｐｈｏ８，ａｒｇ
６）〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，１２７（１９
８２）〕，ＡＨ２２株（ａ，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａ
ｎ１）〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８０，１（１９８３）〕，Ｄ１
３−１Ａ株（ａ，ｔｒｐ１，ｈｉｓ３，ｇａｌ２，ＳＵ
Ｃ２）〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，１０３５（１９７９）〕
およびＹＡＴ２２８株（ａ，ｌｅｕ２，ｌｙｓ１０，ｃ
ｙｈ，ｋａｒｌ−１）〔（ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），１４５，１４
２１（１９８１）〕を交雑することによって、取得でき
る。
このようにして得られたジーンバンクあるいはサブクロ
ーンを用いて、ｐｈｏ８の酵母を形質転換することによ
りＰＨＯ８プロモーターおよびその下流に抑制性アルカ
リ性ホスファターゼをコードする構造遺伝子が連結され
たベクターを保持する形質転換体が取られる。
ーンを用いて、ｐｈｏ８の酵母を形質転換することによ
りＰＨＯ８プロモーターおよびその下流に抑制性アルカ
リ性ホスファターゼをコードする構造遺伝子が連結され
たベクターを保持する形質転換体が取られる。
形質転換するには、公知の方法たとえばプロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），
７５，１９２９（１９７８），ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ），２７５，１０４（１９７８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．，クオンティテイテ
ブ・バイオロジー（Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．），４３，
１３０５（１９７９），プロシージング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ），７６，１０３５
（１９７９に記載にされた方法あるいはこれに準じた方
法によって行われる。
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），
７５，１９２９（１９７８），ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ），２７５，１０４（１９７８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．，クオンティテイテ
ブ・バイオロジー（Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．），４３，
１３０５（１９７９），プロシージング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ），７６，１０３５
（１９７９に記載にされた方法あるいはこれに準じた方
法によって行われる。
上記方法で得られた形質転換体が、ＰＨＯ８プロモータ
ーおよび抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする
構造遺伝子を保持するかどうかは、次に記載の方法によ
り確認することができる。すなわち、該形質転換体を例
えばバークホルダー改変培地〔ジャーナル・オブバクテ
リオロジー（Ｊ．Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ．），１１３，
７２７（１９７３）〕上にコロニーを形成させる。次に
これらコロニーをクロロホルム蒸気で処理したのち、α
−ナフチルリン酸およびファーストレッドＴＲ塩とを含
有する寒天を重層する。プロモーターおよび抑制性アル
カリ性ホスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡがクローン化
されていればコロニーが赤色を示すことからＰＨＯ８遺
伝子の存在を確認することができる。次にＰＨＯ８遺伝
子を含む形質転換体からプラスミドを抽出し、これをた
とえば制限酵母で切断後、たとえばアガロースゲル電気
泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
挿入された遺伝子を含むＤＮＡを単離することができ
る。この一連の基本操作はすでに公知であり、たとえば
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに詳しく記載され
ている。
ーおよび抑制性アルカリ性ホスファターゼをコードする
構造遺伝子を保持するかどうかは、次に記載の方法によ
り確認することができる。すなわち、該形質転換体を例
えばバークホルダー改変培地〔ジャーナル・オブバクテ
リオロジー（Ｊ．Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ．），１１３，
７２７（１９７３）〕上にコロニーを形成させる。次に
これらコロニーをクロロホルム蒸気で処理したのち、α
−ナフチルリン酸およびファーストレッドＴＲ塩とを含
有する寒天を重層する。プロモーターおよび抑制性アル
カリ性ホスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡがクローン化
されていればコロニーが赤色を示すことからＰＨＯ８遺
伝子の存在を確認することができる。次にＰＨＯ８遺伝
子を含む形質転換体からプラスミドを抽出し、これをた
とえば制限酵母で切断後、たとえばアガロースゲル電気
泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
挿入された遺伝子を含むＤＮＡを単離することができ
る。この一連の基本操作はすでに公知であり、たとえば
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに詳しく記載され
ている。
抑制性アルカリ性ホスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡの
塩基配列は、たとえばジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７４，５４６３（１９７７）〕，Ｍ
ａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法〔プロシージング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７４，５
６０（１９７７）〕などの方法を用いて決定できる。
塩基配列は、たとえばジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７４，５４６３（１９７７）〕，Ｍ
ａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法〔プロシージング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７４，５
６０（１９７７）〕などの方法を用いて決定できる。
上記のようにしてクローン化されたＤＮＡ中のＰＨＯ８
構造遺伝子の位置は欠失プラスミドと活性補能との関係
から推定される（第１図参照）。この推定された第１図
の白抜き部分（制限酵素地図：第４図参照）をもつプラ
スミドを用いてＰＨＯ８転写産物を検出し、その大きさ
（第２図参照）と方向性（第３図参照）とからＰＨＯ８
プロモーターの位置を推定する。
構造遺伝子の位置は欠失プラスミドと活性補能との関係
から推定される（第１図参照）。この推定された第１図
の白抜き部分（制限酵素地図：第４図参照）をもつプラ
スミドを用いてＰＨＯ８転写産物を検出し、その大きさ
（第２図参照）と方向性（第３図参照）とからＰＨＯ８
プロモーターの位置を推定する。
この推定されたＰＨＯ８プロモーターを含むＰＨＯ８の
全塩基配列を明らかにし（第８図）、該ＤＮＡの塩基配
列に基づいて解読されるオープンリーディングフレーム
の存在から、プロモーターはそのオープンリーディング
フレーム上流にあることが予想される。オープンリーデ
ィングフレーム上流のＰＨＯ８プロモーター活性〔抑制
性アルカリ性ホスファターゼを産生させる能力あり（第
１図参照）〕を有する部分調製（第９図参照）、該ＰＨ
Ｏ８プロモーター活性含有部分、必要に応じ更にその下
流に各種構造遺伝子をベクターに組み込み発現用ベクタ
ー作製する（第１０図参照）。該ベクターで宿主の形質
転換を行い（第１０図参照）、該形質転換体を培養する
ことによって目的とする遺伝子産物を製造することがで
きる。
全塩基配列を明らかにし（第８図）、該ＤＮＡの塩基配
列に基づいて解読されるオープンリーディングフレーム
の存在から、プロモーターはそのオープンリーディング
フレーム上流にあることが予想される。オープンリーデ
ィングフレーム上流のＰＨＯ８プロモーター活性〔抑制
性アルカリ性ホスファターゼを産生させる能力あり（第
１図参照）〕を有する部分調製（第９図参照）、該ＰＨ
Ｏ８プロモーター活性含有部分、必要に応じ更にその下
流に各種構造遺伝子をベクターに組み込み発現用ベクタ
ー作製する（第１０図参照）。該ベクターで宿主の形質
転換を行い（第１０図参照）、該形質転換体を培養する
ことによって目的とする遺伝子産物を製造することがで
きる。
本発明のＰＨＯ８プロモーター活性を有するＤＮＡとし
ては全合成あるいは半合成したものも用いることができ
る。
ては全合成あるいは半合成したものも用いることができ
る。
ＰＨＯ８プロモーターを組み込むベクターとしては前出
のＹＥｐ６やＹＥｐ１３に加えｐＳＨ１９〔モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．），４，７７１（１９８４）〕やｐＪＤ
Ｂ２１９〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７５，１０
４（１９７８）〕などが挙げられる。ＰＨＯ８プロモー
ターの下流に組み込む構造遺伝子としては抑制性アルカ
リ性ホスファターゼをコードする構造遺伝子（ＰＨＯ
８）、ａｄｗ型やａｄｒ型などのＢ他肝炎ウィルス表面
抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子、ヒトα−インターフェロン
遺伝子、ヒトβ−インターフェロン遺伝子、ヒトγ−イ
ンターフェロン遺伝子、ヒトリゾチーム遺伝子、ヒトイ
ンターロイキン−２遺伝子などが挙げられる。
のＹＥｐ６やＹＥｐ１３に加えｐＳＨ１９〔モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．），４，７７１（１９８４）〕やｐＪＤ
Ｂ２１９〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７５，１０
４（１９７８）〕などが挙げられる。ＰＨＯ８プロモー
ターの下流に組み込む構造遺伝子としては抑制性アルカ
リ性ホスファターゼをコードする構造遺伝子（ＰＨＯ
８）、ａｄｗ型やａｄｒ型などのＢ他肝炎ウィルス表面
抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子、ヒトα−インターフェロン
遺伝子、ヒトβ−インターフェロン遺伝子、ヒトγ−イ
ンターフェロン遺伝子、ヒトリゾチーム遺伝子、ヒトイ
ンターロイキン−２遺伝子などが挙げられる。
ＰＨＯ８プロモーターを含有するＤＮＡで形質転換する
宿主としては酵母が好ましく、例えばサツカロミセス・
セレビシエ ＡＨ２２Ｒ−〔プロシージング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），ＵＳＡ ８０，１
（１９８３）〕や同ＮＡ７９−１０Ｃ（前出）などが挙
げられる。
宿主としては酵母が好ましく、例えばサツカロミセス・
セレビシエ ＡＨ２２Ｒ−〔プロシージング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），ＵＳＡ ８０，１
（１９８３）〕や同ＮＡ７９−１０Ｃ（前出）などが挙
げられる。
このようにして得られた形質転換体の培養に用いられる
倍地としては、たとえばそれ自体公知のＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒ最小培地〔プロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７，４５０５（１９８
０）〕が挙げられる。
倍地としては、たとえばそれ自体公知のＢｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒ最小培地〔プロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７，４５０５（１９８
０）〕が挙げられる。
また培養温度、時間などの条件は、目的とする遺伝子産
物の産生が最高になるように定められるが、一般に温度
は通常約１５℃〜４０℃、好ましくは約２４℃〜３７
℃、または時間は約１０時間〜９６時間、好ましくは約
２４時間〜７２時間であり、必要により通気や撹拌を加
えることもできる。
物の産生が最高になるように定められるが、一般に温度
は通常約１５℃〜４０℃、好ましくは約２４℃〜３７
℃、または時間は約１０時間〜９６時間、好ましくは約
２４時間〜７２時間であり、必要により通気や撹拌を加
えることもできる。
培養物中に蓄積された遺伝子産物は、当分野における通
常の方法、たとえばザイモリエース（キリンビール株式
会社製）など溶菌酵素を用いる方法、ガラスビースを用
いる機械的破砕法などによって菌体を破砕して目的物を
抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ１００などの
界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加え、
目的物の抽出を容易にすることもできる。このようにし
て得られた抽出液からの目的物の分離精製は、通常知ら
れている蛋白質の精製方法，たとえば、沈殿剤による沈
殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹脂などによる
クロマトグラフ法、ゲルろ過法、抗体カラムを用いる方
法などを組み合せて行うことができる。
常の方法、たとえばザイモリエース（キリンビール株式
会社製）など溶菌酵素を用いる方法、ガラスビースを用
いる機械的破砕法などによって菌体を破砕して目的物を
抽出する。なお必要により、トリトン−Ｘ１００などの
界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を加え、
目的物の抽出を容易にすることもできる。このようにし
て得られた抽出液からの目的物の分離精製は、通常知ら
れている蛋白質の精製方法，たとえば、沈殿剤による沈
殿法、透析法、電気泳動法、イオン交換樹脂などによる
クロマトグラフ法、ゲルろ過法、抗体カラムを用いる方
法などを組み合せて行うことができる。
作用 真核生物たる酵母から新規で強力なプロモーターを得る
ことができたため、これを用いて薬理学的に重要な蛋白
質遺伝子の発現を効率よく行うことができる。
ことができたため、これを用いて薬理学的に重要な蛋白
質遺伝子の発現を効率よく行うことができる。
実施例及び効果 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
なお、実施例１に開示するサツカロミセス・セレビシエ
Ｐ−２８−２４Ｃは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
にＩＦＯ−１０１５３として寄託され、又アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴ
ＣＣ−６０２０２として寄託されており、何人も分譲を
受けることができる。
Ｐ−２８−２４Ｃは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
にＩＦＯ−１０１５３として寄託され、又アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴ
ＣＣ−６０２０２として寄託されており、何人も分譲を
受けることができる。
実施例４で開示するサツカロミセス・セレビシエＮＡ７
９−１０Ｃ／ｐＡＬ１０９は、財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）にＩＦＯ−１０１４１として、通商産業省工業技
術院微生物工業研究所（ＦＲＩ）に昭和５９年１２月２
１日からＦＥＲＭ Ｐ−８０１６として寄託されてい
る。
９−１０Ｃ／ｐＡＬ１０９は、財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）にＩＦＯ−１０１４１として、通商産業省工業技
術院微生物工業研究所（ＦＲＩ）に昭和５９年１２月２
１日からＦＥＲＭ Ｐ−８０１６として寄託されてい
る。
実施例１２で開示するエシェリヒア コリＤＨ1/pＴＦ
１０３−５８は、ＩＦＯにＩＦＯ−１４４０９として、
ＦＲＩに昭和５９年１２月２６日からＦＥＲＭ Ｐ−８
０３６として寄託されている。
１０３−５８は、ＩＦＯにＩＦＯ−１４４０９として、
ＦＲＩに昭和５９年１２月２６日からＦＥＲＭ Ｐ−８
０３６として寄託されている。
実施例１２で開示するサツカロミセス・セレビシエＡＨ
２２Ｒ−は、ＩＦＯにＩＦＯ−１０１３４として、ＦＲ
Ｉに昭和５９年９月４日からＦＥＲＭ Ｐ−８０４とし
て寄託されている。
２２Ｒ−は、ＩＦＯにＩＦＯ−１０１３４として、ＦＲ
Ｉに昭和５９年９月４日からＦＥＲＭ Ｐ−８０４とし
て寄託されている。
実施例１２で開示するサツカロミセス・セレビシエＡＨ
２２Ｒ−／ｐＴＦ１０３−５８は、ＩＦＯ−１０１４３
として、ＦＲＩに昭和６０年３月１８日からＦＥＲＭ
Ｐ−８１５８として寄託されている。
２２Ｒ−／ｐＴＦ１０３−５８は、ＩＦＯ−１０１４３
として、ＦＲＩに昭和６０年３月１８日からＦＥＲＭ
Ｐ−８１５８として寄託されている。
実施例１ ＰＨＯ８遺伝子のクローニング ＮａｓｍｙｔｈとＲｅｅｄの方法〔Ｋ．Ａ．Ｎａｓｍｙ
ｔｈ ＆ Ｓ．Ｉ．Ｒｅｅｄ，「プロシージング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，７７，
２１１９（１９８０）〕に従い、酵母−大腸菌シャトル
ベクターＹＥｐ１３．〔Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈｅｔ ａ
ｌ．，「ジーン（Ｇｅｎｅ）」，８，１２１（１９７
９）〕のＢａｍＨＩ切断部位にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ Ｐ−２８−２４Ｃ（ＭＡＴａ ｐｈｏ３−１）から
得られる染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分分解断片を挿
入して約２００のアンピシリン耐性（Ａｍｐγ）テトラ
サイクリン感受性（ＴｃＳ）大腸菌から成る酵母遺伝子
バンクを作製した。この酵母遺伝子バンクのプラスミド
ＤＮＡを用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−
１０Ｃ（ＭＡＴα ｐｈｏ８−２ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３
ｔｒｐ１ ｃａｎ１）を形質転換し、０．５ｍｇ／ｍ
ｌのα−ナフチルリン酸、５ｍｇ／ｍｌのファーストレ
ッドＴＲ塩、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む０．５Ｍトリ
スー塩酸緩衝液で調製した１％寒天溶液を用いたコロニ
ー染色法〔Ａ．Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ．ａｌ．，「バイオヒ
ミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）」，４２８，１８２
（１９７６）の改変法〕で、抑制性アルカリ性ホスファ
ターゼ産生能を示すもの（ｒＡｌｐ＋）をスクリーニン
グした。約１．６×１０４個のロイシン非要求性（Ｌｅ
ｕ＋）形質転換体を調べたところ、２６個のｒＡｌｐ＋
形質転換体が得られた。そのうちの２個のｒＡｌｐ＋形
質転換体からＣａｍｅｒｏｎらの方法〔Ｊ．Ｒ．Ｃａｍ
ｅｒｏｎ ｅｔ．ａｌ．，「ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）」，４，１４２９（１９７７）〕に従ってプラス
ミドＤＮＡを調製し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１の形質
転換に用いた。得られた３３個のＡｍｐγ形質転換体は
すべてＴｃＳであり、また同一分子量のプラスミドを持
っていた。プラスミドをｐＡＬ１０１と命名し、再び
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−１０Ｃの形質転
換に用いた。得られたＬｅｕ＋形質転換体のうち１５個
の抑制性アルカリ性ホスファターゼ産性能を調べたとこ
ろ、すべてｒＡｌｐ＋であった。したがってｐＡＬ１０
１にはＰＨＯ８遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されてい
ると考えられる。ＰＨＯ８遺伝子が含まれているなら
ば、ｐＡＬ１０１はその相同性を利用して、染色体上ｐ
ｈｏ８遺伝子座に組み込まれることが予想される。ｐＡ
Ｌ１０１が組み込まれた形質転換体が安定性試験の際に
得られたので、四分子分析を行い、組み込まれた位置を
決定した。ｐｈｏ８遺伝子座は第４番染色体上のａｄｅ
８遺伝子座から３０センチモルガン（ｃＭ）、ｒｎａ３
遺伝子座から８ｃＭの位置にある〔Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ
ｅｔ．ａｌ．，モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）」，２，１
２７（１９８２）〕。ｐＡＬ１０１が組み込まれた形質
転換体、２株をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍ４９−５
Ｄ（ＭＡＴａ ｐｈｏ８−２ ｌｅｕ２ ａｄｅ８ｒｎ
ａ３）と交雑し、四分子分析した結果、ｐＡＬ１０１の
持つＬＥＵ２＋とａｄｅ８の両親側（ＰＤ）：非両親型
（ＮＰＤ）：テトラ型（Ｔ）の比は３０：０：９を示
し、ｒｎａ３とのＰＤ：ＮＰＤ：Ｔの比は３６：０：３
示した。この値からＰｅｒｋｉｎｓの式〔Ｄ．Ｄ．Ｐｅ
ｒｋｉｎｓ，「ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ）」，３４，６０７（１９４９）〕を用いてｐＡＬ１
０１の組み込まれた位置を計算するとａｄｅ８遺伝子座
から１２ｃＭ，ｒｎａ３遺伝子座から４ｃＭの位置にな
った。したがって、ｐＡＬ１０１はｐｈｏ８遺伝子座あ
るいはその近くに組み込まれており、ｐＡＬ１０１には
ＰＨＯ８遺伝子がクローン化されていると結論した。
ｔｈ ＆ Ｓ．Ｉ．Ｒｅｅｄ，「プロシージング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，７７，
２１１９（１９８０）〕に従い、酵母−大腸菌シャトル
ベクターＹＥｐ１３．〔Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈｅｔ ａ
ｌ．，「ジーン（Ｇｅｎｅ）」，８，１２１（１９７
９）〕のＢａｍＨＩ切断部位にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ Ｐ−２８−２４Ｃ（ＭＡＴａ ｐｈｏ３−１）から
得られる染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分分解断片を挿
入して約２００のアンピシリン耐性（Ａｍｐγ）テトラ
サイクリン感受性（ＴｃＳ）大腸菌から成る酵母遺伝子
バンクを作製した。この酵母遺伝子バンクのプラスミド
ＤＮＡを用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−
１０Ｃ（ＭＡＴα ｐｈｏ８−２ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３
ｔｒｐ１ ｃａｎ１）を形質転換し、０．５ｍｇ／ｍ
ｌのα−ナフチルリン酸、５ｍｇ／ｍｌのファーストレ
ッドＴＲ塩、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む０．５Ｍトリ
スー塩酸緩衝液で調製した１％寒天溶液を用いたコロニ
ー染色法〔Ａ．Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ．ａｌ．，「バイオヒ
ミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）」，４２８，１８２
（１９７６）の改変法〕で、抑制性アルカリ性ホスファ
ターゼ産生能を示すもの（ｒＡｌｐ＋）をスクリーニン
グした。約１．６×１０４個のロイシン非要求性（Ｌｅ
ｕ＋）形質転換体を調べたところ、２６個のｒＡｌｐ＋
形質転換体が得られた。そのうちの２個のｒＡｌｐ＋形
質転換体からＣａｍｅｒｏｎらの方法〔Ｊ．Ｒ．Ｃａｍ
ｅｒｏｎ ｅｔ．ａｌ．，「ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）」，４，１４２９（１９７７）〕に従ってプラス
ミドＤＮＡを調製し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１の形質
転換に用いた。得られた３３個のＡｍｐγ形質転換体は
すべてＴｃＳであり、また同一分子量のプラスミドを持
っていた。プラスミドをｐＡＬ１０１と命名し、再び
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−１０Ｃの形質転
換に用いた。得られたＬｅｕ＋形質転換体のうち１５個
の抑制性アルカリ性ホスファターゼ産性能を調べたとこ
ろ、すべてｒＡｌｐ＋であった。したがってｐＡＬ１０
１にはＰＨＯ８遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されてい
ると考えられる。ＰＨＯ８遺伝子が含まれているなら
ば、ｐＡＬ１０１はその相同性を利用して、染色体上ｐ
ｈｏ８遺伝子座に組み込まれることが予想される。ｐＡ
Ｌ１０１が組み込まれた形質転換体が安定性試験の際に
得られたので、四分子分析を行い、組み込まれた位置を
決定した。ｐｈｏ８遺伝子座は第４番染色体上のａｄｅ
８遺伝子座から３０センチモルガン（ｃＭ）、ｒｎａ３
遺伝子座から８ｃＭの位置にある〔Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ
ｅｔ．ａｌ．，モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）」，２，１
２７（１９８２）〕。ｐＡＬ１０１が組み込まれた形質
転換体、２株をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍ４９−５
Ｄ（ＭＡＴａ ｐｈｏ８−２ ｌｅｕ２ ａｄｅ８ｒｎ
ａ３）と交雑し、四分子分析した結果、ｐＡＬ１０１の
持つＬＥＵ２＋とａｄｅ８の両親側（ＰＤ）：非両親型
（ＮＰＤ）：テトラ型（Ｔ）の比は３０：０：９を示
し、ｒｎａ３とのＰＤ：ＮＰＤ：Ｔの比は３６：０：３
示した。この値からＰｅｒｋｉｎｓの式〔Ｄ．Ｄ．Ｐｅ
ｒｋｉｎｓ，「ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ）」，３４，６０７（１９４９）〕を用いてｐＡＬ１
０１の組み込まれた位置を計算するとａｄｅ８遺伝子座
から１２ｃＭ，ｒｎａ３遺伝子座から４ｃＭの位置にな
った。したがって、ｐＡＬ１０１はｐｈｏ８遺伝子座あ
るいはその近くに組み込まれており、ｐＡＬ１０１には
ＰＨＯ８遺伝子がクローン化されていると結論した。
ＨＯ８遺伝子を含むＤＮＡ断片の制 限酵素地図作成 ＤＮＡ断片の制限酵素処理はｐＡＬ１０１ＤＮＡ（１〜
５μｇ）をＴＡ緩衝液〔Ｐ．Ｈ．Ｏ′Ｆａｒｒｅｌｌ
ｅｔ．ａｌ．，「モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジ
ェネティックス（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）」，１７９，４２１（１９８０）」中で、４〜６
ユニットの各種制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII，Ｅｃ
ｏＲＩ，ＨｉｎｄIII，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，Ｘｈｏ
Ｉ）単独または二種類組み合わせ、３７℃で１時間作用
させて行った。反応液を１％アガロースゲル電気泳動あ
るいは７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、切断パターンを検出し、ＤＮＡ断片の分子量を推定
し、制限酵素地図を作成した（第１図）。第１図中、細
実線はベクターＹＥｐ１３部分、太実線はクローン化さ
れたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤＮＡ部分を各々示す。
制限酵素部位の略号は次のとおりである。Ｂ／Ｓａ，Ｓ
ａ／Ｂ：ＢａｍＨＩとＳａｕ３ＡＩの連結部位，Ｂｇ：
ＢｇｌII，Ｅ：ＥｃｏＲＩ，Ｈ：ＨｉｎｄIII，Ｓ：Ｓ
ａｌＩ，Ｘ：ＸｈｏＩ。
５μｇ）をＴＡ緩衝液〔Ｐ．Ｈ．Ｏ′Ｆａｒｒｅｌｌ
ｅｔ．ａｌ．，「モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジ
ェネティックス（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）」，１７９，４２１（１９８０）」中で、４〜６
ユニットの各種制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII，Ｅｃ
ｏＲＩ，ＨｉｎｄIII，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，Ｘｈｏ
Ｉ）単独または二種類組み合わせ、３７℃で１時間作用
させて行った。反応液を１％アガロースゲル電気泳動あ
るいは７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、切断パターンを検出し、ＤＮＡ断片の分子量を推定
し、制限酵素地図を作成した（第１図）。第１図中、細
実線はベクターＹＥｐ１３部分、太実線はクローン化さ
れたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤＮＡ部分を各々示す。
制限酵素部位の略号は次のとおりである。Ｂ／Ｓａ，Ｓ
ａ／Ｂ：ＢａｍＨＩとＳａｕ３ＡＩの連結部位，Ｂｇ：
ＢｇｌII，Ｅ：ＥｃｏＲＩ，Ｈ：ＨｉｎｄIII，Ｓ：Ｓ
ａｌＩ，Ｘ：ＸｈｏＩ。
実施例３ クローン化されたＤＮＡ断片上のＰＨ
Ｏ８遺伝子の位置の推定 クローン化されたＤＮＡ断片上のＰＨＯ８遺伝子の位置
を推定するためｐＡＬ１０１の欠失誘導体を作成した。
ｐＡＬ１０１（５μｇ）を６ユニットのＨｉｎｄIIIを
加えたＴＡ緩衝液５０μｌ中で３７℃１分間反応させた
後、６５℃で１０分間加熱して反応を停止させ部分分解
物を得た。この反応液２５μｌを含むＴ４リガーゼ反応
液（５ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，
０．０５ｍＭＡＴＰ，Ｔ４リガーゼ３ユニット）５０μ
ｌを４℃で１８時間反応させ、分解物を再結合させた。
次に１０μｌの上記Ｔ４リガーゼ反応液を用いてＥ．ｃ
ｏｌｉＪＡ２２１を形質転換し、得られたＡｍｐγ形質
転換体からＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法〔Ｈ．
Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆ Ｊ．Ｄｏｌｙ，「ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．），７，１５１３（１９７９）〕に従ってプ
ラスミドＤＮＡを分離し、欠失プラスミドｐＡＬ１０９
とｐＡＬ１１８とを得た。またｐＡＬ１０９からＥｃｏ
ＲＩを用いて前述と同様な方法で欠失プラスミドｐＡＬ
１１９を作製した。得られた欠失誘導体プラスミドＤＮ
ＡでＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−１０Ｃを形
質転換し、得られたＬｅｕ＋形質転換体１０株のｒＡｌ
ｐ表現型を調べた。各欠失プラスミドのｐｈｏ８変異相
補能を第１図に示した（各プラスミド右端の＋，−）。
Ｏ８遺伝子の位置の推定 クローン化されたＤＮＡ断片上のＰＨＯ８遺伝子の位置
を推定するためｐＡＬ１０１の欠失誘導体を作成した。
ｐＡＬ１０１（５μｇ）を６ユニットのＨｉｎｄIIIを
加えたＴＡ緩衝液５０μｌ中で３７℃１分間反応させた
後、６５℃で１０分間加熱して反応を停止させ部分分解
物を得た。この反応液２５μｌを含むＴ４リガーゼ反応
液（５ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，
０．０５ｍＭＡＴＰ，Ｔ４リガーゼ３ユニット）５０μ
ｌを４℃で１８時間反応させ、分解物を再結合させた。
次に１０μｌの上記Ｔ４リガーゼ反応液を用いてＥ．ｃ
ｏｌｉＪＡ２２１を形質転換し、得られたＡｍｐγ形質
転換体からＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法〔Ｈ．
Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆ Ｊ．Ｄｏｌｙ，「ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．），７，１５１３（１９７９）〕に従ってプ
ラスミドＤＮＡを分離し、欠失プラスミドｐＡＬ１０９
とｐＡＬ１１８とを得た。またｐＡＬ１０９からＥｃｏ
ＲＩを用いて前述と同様な方法で欠失プラスミドｐＡＬ
１１９を作製した。得られた欠失誘導体プラスミドＤＮ
ＡでＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＡ７９−１０Ｃを形
質転換し、得られたＬｅｕ＋形質転換体１０株のｒＡｌ
ｐ表現型を調べた。各欠失プラスミドのｐｈｏ８変異相
補能を第１図に示した（各プラスミド右端の＋，−）。
またｐＡＬ１２３とｐＡＬ１２５とは（第１図）それぞ
れｐＡＬ１０９のＥｃｏＲＩ処理とｐＡＬ１０１のＳａ
ｌＩ処理後、低融点アガロース電気泳動で分離、回収
し、酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ６〔Ｄ．Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ ｅｔ．ａｌ．，「ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）」，８，１７（１９７９）〕にサブクローニングし
て作製した。ｐＡＬ１２３とｐＡＬ１２５についても前
述の欠失プラスミドと同様にして、その相補能を調べ
た。第１図に示したようにｐＡＬ１２３は相補能をもち
ｒＡｌｐ＋であったが、ｐＡＬ１２５はｒＡｌｐ−であ
った。以上の結果から、ＰＨＯ８遺伝子は第１図の白抜
きの断片領域（約２．７ｋｂ）に存在することがわかっ
た。
れｐＡＬ１０９のＥｃｏＲＩ処理とｐＡＬ１０１のＳａ
ｌＩ処理後、低融点アガロース電気泳動で分離、回収
し、酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ６〔Ｄ．Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ ｅｔ．ａｌ．，「ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）」，８，１７（１９７９）〕にサブクローニングし
て作製した。ｐＡＬ１２３とｐＡＬ１２５についても前
述の欠失プラスミドと同様にして、その相補能を調べ
た。第１図に示したようにｐＡＬ１２３は相補能をもち
ｒＡｌｐ＋であったが、ｐＡＬ１２５はｒＡｌｐ−であ
った。以上の結果から、ＰＨＯ８遺伝子は第１図の白抜
きの断片領域（約２．７ｋｂ）に存在することがわかっ
た。
実施例４ ｐＡＬ１０９を保持する形質転換体の アルカリ性ホスファターゼの生産性 実施例３で得たｐＡＬ１０９を保持する酵母形質転換体
（サツカロミセス・セレジシェ ＮＡ７９−１０Ｃ／ｐ
ＡＬ１０９）をバークホルダー改変高リン酸培地および
低リン酸培地〔Ａ．Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ．ａｌ．，「ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．）」，１１３，７２７（１９７３）〕５ｍｌで２
０時間振とう培養した後、菌体を集め、東江らの方法
〔Ａ．Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ．ａｌ．，「バイオヒミカ・エ
ト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）」，４２８，１８２（１９７
６）〕に従って菌体の透過処理を行いアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性を測定した。結果を第１表に示す。
（サツカロミセス・セレジシェ ＮＡ７９−１０Ｃ／ｐ
ＡＬ１０９）をバークホルダー改変高リン酸培地および
低リン酸培地〔Ａ．Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ．ａｌ．，「ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．）」，１１３，７２７（１９７３）〕５ｍｌで２
０時間振とう培養した後、菌体を集め、東江らの方法
〔Ａ．Ｔｏｈ−ｅ ｅｔ．ａｌ．，「バイオヒミカ・エ
ト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）」，４２８，１８２（１９７
６）〕に従って菌体の透過処理を行いアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性を測定した。結果を第１表に示す。
第１表から判るようにｐＡＬ１０９によるアルカリ性ホ
スファターゼの生産はリン酸によって抑制を受けてお
り、クローン化されたＰＨＯ８遺伝子は調節遺伝子産物
の働く制御領域を正常に含んでいると考えられる。
スファターゼの生産はリン酸によって抑制を受けてお
り、クローン化されたＰＨＯ８遺伝子は調節遺伝子産物
の働く制御領域を正常に含んでいると考えられる。
実施例５ＰＨＯ８遺伝子転写産物の同定と転写 方向の決定 ノザンハイブリダイゼーション法によってＰＨＯ８転写
産物の同定と転写方向の決定を行った。ポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡはＪｅｎｓｅｎらの方法〔Ｒ．Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，「プロシージング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，８０，３０３５（１９８
３）〕に従って完全培地（＋Ｐ）と低リン酸培地（−
Ｐ）で培養したサツカロミセス・セレビシエ Ｐ−２８
−２４Ｃから全ＲＮＡを調製した後、Ｓｃｈｌｅｉｆと
Ｗｅｎｓｉｎｋの方法〔Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｌｅｉｆ＆Ｐ．
Ｃ．Ｗｅｎｓｉｎｋ，「プラクティカル・メソッズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）」，（１９８１），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ〕に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニ
ティカラムクロマトグラフイーを行って精製した。ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡ試料は文献〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ〕記載のホルムアルデヒド変性ゲル電気泳
動を行い、Ｔｈｏｍａｓの方法〔Ｐ．Ｓ．Ｔｈｏｍａ
ｓ，「プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，７７，５２０１（１９８０）〕に
従って、ブロツティングおよびハイブリダイゼーション
を行った。オートラジオグラフィーはコダックＸ−オー
マットＲＰフィルムとコダックインテンシファイングス
クリーンを用いて−８０℃で行った。転写産物の同定に
使用したプローブＤＮＡはｐＡＬ２０１（第１図に示さ
れた約２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片をｐＢＲ
３２２にサブクローニングしたプラスミド）をニックト
ランスレーションして〔Ｐ．Ｗ．Ｊ．Ｒｉｇｂｙ ｅ
ｔ．ａｌ．，「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」，１１３，２３
７（１９７７）〕作製した。転写方向決定に用いた二種
類のプローブＤＮＡはｐＡＬ２０１をＢｇｌIIで処理し
た後、Ｔ４ポリメラーゼを用いた片鎖特異的ラベル化法
〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ），（１９８２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ〕に従ってラ
ベルをし、ＳａｌＩとＸｈｏＩ処理してポリアクリルア
ミド電気泳動を行い、調製した。第２図に示すようにｐ
ＢＲ３２２のＲｓａＩ分解物をサイズマーカーとしてＰ
ＨＯ８転写産物の大きさを推定すると約１，８００ヌク
レオチドとなった。転写方向は、低リン酸完全培地で培
養した野性型株Ｐ−２８−２４Ｃからポリ（Ａ）＋ＲＡ
Ｎを調製し、上記の片鎖を特異的にラベルしたプローブ
ＤＮＡを用いてノザンハイブリダイゼーションを行った
ところ、第３図に示すＳａｌＩ−ＢｇｌIIＤＮＡ断片
（０．９５ｋｂ）のプローブでＰＨＯ８転写産物が検出
され、ＸｈｏＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片（０．４ｋｂ）の
プローブでは検出されなかったことから、第１図の波形
矢印で示すように左方向である。以上の結果と参考例３
の結果を合わせて考えると、ＰＨＯ８遺伝子のプロモー
ター領域は１．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断
片に存在すると予想される。
産物の同定と転写方向の決定を行った。ポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡはＪｅｎｓｅｎらの方法〔Ｒ．Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，「プロシージング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，８０，３０３５（１９８
３）〕に従って完全培地（＋Ｐ）と低リン酸培地（−
Ｐ）で培養したサツカロミセス・セレビシエ Ｐ−２８
−２４Ｃから全ＲＮＡを調製した後、Ｓｃｈｌｅｉｆと
Ｗｅｎｓｉｎｋの方法〔Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｌｅｉｆ＆Ｐ．
Ｃ．Ｗｅｎｓｉｎｋ，「プラクティカル・メソッズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）」，（１９８１），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ〕に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニ
ティカラムクロマトグラフイーを行って精製した。ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡ試料は文献〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ〕記載のホルムアルデヒド変性ゲル電気泳
動を行い、Ｔｈｏｍａｓの方法〔Ｐ．Ｓ．Ｔｈｏｍａ
ｓ，「プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，７７，５２０１（１９８０）〕に
従って、ブロツティングおよびハイブリダイゼーション
を行った。オートラジオグラフィーはコダックＸ−オー
マットＲＰフィルムとコダックインテンシファイングス
クリーンを用いて−８０℃で行った。転写産物の同定に
使用したプローブＤＮＡはｐＡＬ２０１（第１図に示さ
れた約２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片をｐＢＲ
３２２にサブクローニングしたプラスミド）をニックト
ランスレーションして〔Ｐ．Ｗ．Ｊ．Ｒｉｇｂｙ ｅ
ｔ．ａｌ．，「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」，１１３，２３
７（１９７７）〕作製した。転写方向決定に用いた二種
類のプローブＤＮＡはｐＡＬ２０１をＢｇｌIIで処理し
た後、Ｔ４ポリメラーゼを用いた片鎖特異的ラベル化法
〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ），（１９８２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ〕に従ってラ
ベルをし、ＳａｌＩとＸｈｏＩ処理してポリアクリルア
ミド電気泳動を行い、調製した。第２図に示すようにｐ
ＢＲ３２２のＲｓａＩ分解物をサイズマーカーとしてＰ
ＨＯ８転写産物の大きさを推定すると約１，８００ヌク
レオチドとなった。転写方向は、低リン酸完全培地で培
養した野性型株Ｐ−２８−２４Ｃからポリ（Ａ）＋ＲＡ
Ｎを調製し、上記の片鎖を特異的にラベルしたプローブ
ＤＮＡを用いてノザンハイブリダイゼーションを行った
ところ、第３図に示すＳａｌＩ−ＢｇｌIIＤＮＡ断片
（０．９５ｋｂ）のプローブでＰＨＯ８転写産物が検出
され、ＸｈｏＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片（０．４ｋｂ）の
プローブでは検出されなかったことから、第１図の波形
矢印で示すように左方向である。以上の結果と参考例３
の結果を合わせて考えると、ＰＨＯ８遺伝子のプロモー
ター領域は１．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断
片に存在すると予想される。
実施例６ ＰＨＯ８遺伝子を含む２．７ｋｂＤＮ Ａ断片の制限酵素地図の作成 ＰＨＯ８遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｓａｕ３ＡＩ／Ｂａ
ｍＨＩＤＮＡ断片（第１図の白抜部分の領域）の制限酵
素地図を１１種類の制限酵素（ＡＬＵＩ，ＢｇｌII，Ｃ
ｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨａｅIII，ＨｉｎｄIII，Ｈｉｎ
ｆＩ，ＳａｌＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，ＴａｑＩ，ＸｈｏＩ）
を用いて作成した（第４図）。常法に従って各種制限酵
素の単独あるいは二種類組み合わせによって生じた反応
物を７．５％あるいは１２％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、その切断パターンから各制限酵素の切断
部位を推定した。分子量マーカーとしてｐＢＲ３２２の
ＨａｅIII分解物あるいはＳａｕ３ＡＩ分解物を用い
た。なお切断部位は確認できたもののみ記入した。
ｍＨＩＤＮＡ断片（第１図の白抜部分の領域）の制限酵
素地図を１１種類の制限酵素（ＡＬＵＩ，ＢｇｌII，Ｃ
ｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨａｅIII，ＨｉｎｄIII，Ｈｉｎ
ｆＩ，ＳａｌＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，ＴａｑＩ，ＸｈｏＩ）
を用いて作成した（第４図）。常法に従って各種制限酵
素の単独あるいは二種類組み合わせによって生じた反応
物を７．５％あるいは１２％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、その切断パターンから各制限酵素の切断
部位を推定した。分子量マーカーとしてｐＢＲ３２２の
ＨａｅIII分解物あるいはＳａｕ３ＡＩ分解物を用い
た。なお切断部位は確認できたもののみ記入した。
実施例７ ＰＨＯ８遺伝子を含む２．７ｋｂ ＤＮＡ断片の塩基配列決定 実施例６で作成した制限地図に基づいてＤＮＡ塩基配列
をＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法とＭ１３ファージ
を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法（いずれ
も前出）によって決定した。その結果を第５図に示し
た。番号はＡＴＧのＡを１として付けてある。ＰＨＯ８
遺伝子のコーディング領域と考えられる１６３３塩基
（＋１から＋１６３３）のオープンリーディングフレー
ムが見出された。しかし、終止コドンが出現していな
い。このことから、ｐＡＬ１０１にクローン化されたＰ
ＨＯ８遺伝子は３’−末端側を欠いたことになる。ｐＡ
Ｌ１０１の示した相補能はベクター内まで転写が続き、
＋１６８４から出現する終止コドン（ＴＡＧ）を使用す
ることにより生じたと考えられる。また第５図に示すよ
うにＸｈｏＩ切断部位の上流およそ１７０〜１８０塩基
に“ＴＡＴＡＴＡＡＡ”というＴＡＴＡ配列と考えられ
る配列が出現し、ＸｈｏＩ切断部位の上流およそ５０塩
基付近に翻訳開始コドン“ＡＴＧ”が出現する。これら
のことはこの領域がＰＨＯ８遺伝子の５’上流非翻訳領
域およびＰＨＯ８遺伝子の５’末端領域を含んでいるこ
とを示唆している。
をＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法とＭ１３ファージ
を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法（いずれ
も前出）によって決定した。その結果を第５図に示し
た。番号はＡＴＧのＡを１として付けてある。ＰＨＯ８
遺伝子のコーディング領域と考えられる１６３３塩基
（＋１から＋１６３３）のオープンリーディングフレー
ムが見出された。しかし、終止コドンが出現していな
い。このことから、ｐＡＬ１０１にクローン化されたＰ
ＨＯ８遺伝子は３’−末端側を欠いたことになる。ｐＡ
Ｌ１０１の示した相補能はベクター内まで転写が続き、
＋１６８４から出現する終止コドン（ＴＡＧ）を使用す
ることにより生じたと考えられる。また第５図に示すよ
うにＸｈｏＩ切断部位の上流およそ１７０〜１８０塩基
に“ＴＡＴＡＴＡＡＡ”というＴＡＴＡ配列と考えられ
る配列が出現し、ＸｈｏＩ切断部位の上流およそ５０塩
基付近に翻訳開始コドン“ＡＴＧ”が出現する。これら
のことはこの領域がＰＨＯ８遺伝子の５’上流非翻訳領
域およびＰＨＯ８遺伝子の５’末端領域を含んでいるこ
とを示唆している。
実施例８ ＰＨＯ８の３’末領域の回収 Ｗｉｎｓｔｏｎらの”ｅｖｉｃｔｉｏｎ”法〔Ｆ．Ｗｉ
ｎｓｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，メソッズ・イン・エンザイ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ），１０１，２１１（１９８３）〕によってＰＨＯ８
の３’末領域を回収した。
ｎｓｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，メソッズ・イン・エンザイ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ），１０１，２１１（１９８３）〕によってＰＨＯ８
の３’末領域を回収した。
まず、第１図の白抜き部分を含むＥｃｏＲＩをｐＢＲ３
２２のＥｃｏＲＩサイトに挿入したｐＡＬ１２７を材料
にして、第６図に示した通り、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII
断片約４７０ｂｐをＹＩｐ５〔プロシージング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，１
０３５（１９７９）〕にサブクローニングしてｐＡＬ１
３４を作製した。このプラスミドはＰＨＯ８の一部を持
っている。次にｐＡＬ１３４をＢｇｌIIで処理して直線
状にした後、ＰＨＯ８＋株（Ｋ７７−６Ｄ）の形質転換
を行なった（第７図）。ｐＡＬ１３４はＰＨＯ８の両末
端を欠いているので染色体上のＰＨＯ８座に組み込まれ
ると、５’末端を欠いた遺伝子（’ＰＨＯ８）と３’末
端を欠いた遺伝子（ＰＨＯ８’）が生じる。その結果、
形質転換体はｐｈｏ８変異体となる。得られた形質転換
体のｒＡｌｐ表現型およびｐｈｏ８変異体との相補性試
験により、ｐＡＬ１３４の組み込み位置を確認した後、
形質転換体の一つから全ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ処
理し、Ｔ４リガーゼ連結反応を行なった。次にその反応
液を用いて大腸菌ＪＡ２２１の形質転換を行ない、アン
ピシリン耐性株からＰＨＯ８ ３’末両位を持つプラス
ミドｐＡＬ１３８を得た。
２２のＥｃｏＲＩサイトに挿入したｐＡＬ１２７を材料
にして、第６図に示した通り、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII
断片約４７０ｂｐをＹＩｐ５〔プロシージング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，１
０３５（１９７９）〕にサブクローニングしてｐＡＬ１
３４を作製した。このプラスミドはＰＨＯ８の一部を持
っている。次にｐＡＬ１３４をＢｇｌIIで処理して直線
状にした後、ＰＨＯ８＋株（Ｋ７７−６Ｄ）の形質転換
を行なった（第７図）。ｐＡＬ１３４はＰＨＯ８の両末
端を欠いているので染色体上のＰＨＯ８座に組み込まれ
ると、５’末端を欠いた遺伝子（’ＰＨＯ８）と３’末
端を欠いた遺伝子（ＰＨＯ８’）が生じる。その結果、
形質転換体はｐｈｏ８変異体となる。得られた形質転換
体のｒＡｌｐ表現型およびｐｈｏ８変異体との相補性試
験により、ｐＡＬ１３４の組み込み位置を確認した後、
形質転換体の一つから全ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ処
理し、Ｔ４リガーゼ連結反応を行なった。次にその反応
液を用いて大腸菌ＪＡ２２１の形質転換を行ない、アン
ピシリン耐性株からＰＨＯ８ ３’末両位を持つプラス
ミドｐＡＬ１３８を得た。
実施例９ ＰＨＯ８遺伝子の全塩基配列 ｐＡＬ１３８から常法により約１．４ｋｂのＳａｌＩ−
ＰｓｔＩ断片を調製し、Ｍ１３ファージを用いたジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法によるＤＮＡ塩基配列決
定に用いた。
ＰｓｔＩ断片を調製し、Ｍ１３ファージを用いたジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法によるＤＮＡ塩基配列決
定に用いた。
ＳａｌＩ末端側から１２４６塩基の配列を決定した。そ
の結果を実施例２で得られた結果と結合して第８図に示
した。この結果からＰＨＯ８遺伝子のオープンリーディ
ングフレームは１７０１塩基（＋１から＋１７０１）
で、５６６個のアミノ酸からなる分子量６３，０５１の
蛋白質をコードしていることになる。
の結果を実施例２で得られた結果と結合して第８図に示
した。この結果からＰＨＯ８遺伝子のオープンリーディ
ングフレームは１７０１塩基（＋１から＋１７０１）
で、５６６個のアミノ酸からなる分子量６３，０５１の
蛋白質をコードしていることになる。
実施例１０ ＰＨＯ８プロモーター単離（第９図） 実施例７の結果に従い、プロモーター領域を含むＤＮＡ
を単離した。実験には第１図の白抜き部分を含むＥｃｏ
ＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトに挿入した
ｐＡＬ１２７を出発材料として用いた。
を単離した。実験には第１図の白抜き部分を含むＥｃｏ
ＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトに挿入した
ｐＡＬ１２７を出発材料として用いた。
ＰＨＯ８遺伝子がクローニングされたプラスミドｐＡＬ
１２７，５０μｇに５０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩ
〔宝酒造（株）製〕を１００μｌの反応液〔１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ２，７ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール〕中で３７℃、２時間作用させた後、１％アガロ
ース（Ｓｉｇｍａ社製）・スラブゲルを用いて緩衝液
〔１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．１００ｍＭ ホウ
酸，２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）〕中、１４０Ｖ、
２時間電気泳動にかけた。泳動後、３ｋｂＤＮＡ断片を
含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内
に沈め、該ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出した〔Ｍ
ｃＤｏｎｅｌｌ，Ｍ．Ｗ．ら，「ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）」，１１０，１１９（１９７７）〕。透析チュー
ブ内液をフェノール抽出さらにエーテル抽出した後、Ｎ
ａＣｌを０．２Ｍになるように加え、つづいて２倍量の
冷エタノールを加えて−２０℃で３ｋｂＤＮＡを沈殿さ
せた。
１２７，５０μｇに５０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩ
〔宝酒造（株）製〕を１００μｌの反応液〔１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ２，７ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール〕中で３７℃、２時間作用させた後、１％アガロ
ース（Ｓｉｇｍａ社製）・スラブゲルを用いて緩衝液
〔１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．１００ｍＭ ホウ
酸，２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）〕中、１４０Ｖ、
２時間電気泳動にかけた。泳動後、３ｋｂＤＮＡ断片を
含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内
に沈め、該ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出した〔Ｍ
ｃＤｏｎｅｌｌ，Ｍ．Ｗ．ら，「ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）」，１１０，１１９（１９７７）〕。透析チュー
ブ内液をフェノール抽出さらにエーテル抽出した後、Ｎ
ａＣｌを０．２Ｍになるように加え、つづいて２倍量の
冷エタノールを加えて−２０℃で３ｋｂＤＮＡを沈殿さ
せた。
該３ｋｂＤＮＡ１μｇに５ユニットのＤＮＡポリメラー
ゼＩラージ・フラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３０μｌの反応液〔４０ｍＭ
リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５），６．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール，３３
μＭ ｄＡＴＰ，３３μＭ ｄＴＴＰ〕中で１２℃、３
０分間作用させて、接着末端を平滑末端にした後、フェ
ノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させ
た。該ＤＮＡ断片５０ｎｇとリン酸化されたＢａｍＨＩ
リンカー〔５’−Ｐ−ｄ（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）〕〔宝酒
造（株）製〕５０ｎｇとを混合し、２０μｌの反応液
〔６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），６．６
ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ジチオスレイル，１ｍＭ
ＡＴＰ，２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
（株）製）〕中、１４℃で一夜作用させてＤＮＡを結合
させた。反応後、過剰量の制限酵素ＢａｍＨＩ〔宝酒造
（株）製〕を加え３７℃、４時間作用させ、フェノール
で除蛋白した後、ＴＥＮ緩衝液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ
ＥＤＴＡ〕で平衡化したセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）・カラム（０．２５×２５ｃｍ）にか
けてｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ付近に溶出されるＤＮＡを
集めて、２倍量の冷エタノールを添加した該ＤＮＡを沈
殿させた（ＢａｍＨＩ消化３ｋｂＤＮＡ）。
ゼＩラージ・フラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３０μｌの反応液〔４０ｍＭ
リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５），６．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール，３３
μＭ ｄＡＴＰ，３３μＭ ｄＴＴＰ〕中で１２℃、３
０分間作用させて、接着末端を平滑末端にした後、フェ
ノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させ
た。該ＤＮＡ断片５０ｎｇとリン酸化されたＢａｍＨＩ
リンカー〔５’−Ｐ−ｄ（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）〕〔宝酒
造（株）製〕５０ｎｇとを混合し、２０μｌの反応液
〔６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），６．６
ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ジチオスレイル，１ｍＭ
ＡＴＰ，２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
（株）製）〕中、１４℃で一夜作用させてＤＮＡを結合
させた。反応後、過剰量の制限酵素ＢａｍＨＩ〔宝酒造
（株）製〕を加え３７℃、４時間作用させ、フェノール
で除蛋白した後、ＴＥＮ緩衝液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ
ＥＤＴＡ〕で平衡化したセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）・カラム（０．２５×２５ｃｍ）にか
けてｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ付近に溶出されるＤＮＡを
集めて、２倍量の冷エタノールを添加した該ＤＮＡを沈
殿させた（ＢａｍＨＩ消化３ｋｂＤＮＡ）。
ベクターｐＢＲ３２２，１μｇに２ユニットの制限酵素
ＢａｍＨＩを２０μｌの反応液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中
で３７℃、２時間作用させた後、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させた（ＢａｍＨＩ消
化ｐＢＲ３２２）。ＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２，０．
１μｇと、上記ＢａｍＨＩ消化３ｋｂＤＮＡ０．１μｇ
とを混合しＴ４ＤＮＡリガーゼの作用によって結合させ
た。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１〔Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．ら，「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５４〜
２５５（１９８２）〕を形質転換させ、アンピシリン耐
性でテトラサイクリン感受性を示す組み換え体の中か
ら、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位にＰＨＯ８遺伝子を
含む３ｋｂＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴＦ１
４を取得した（第９図参照）。
ＢａｍＨＩを２０μｌの反応液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中
で３７℃、２時間作用させた後、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールでＤＮＡを沈殿させた（ＢａｍＨＩ消
化ｐＢＲ３２２）。ＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２，０．
１μｇと、上記ＢａｍＨＩ消化３ｋｂＤＮＡ０．１μｇ
とを混合しＴ４ＤＮＡリガーゼの作用によって結合させ
た。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１〔Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．ら，「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５４〜
２５５（１９８２）〕を形質転換させ、アンピシリン耐
性でテトラサイクリン感受性を示す組み換え体の中か
ら、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位にＰＨＯ８遺伝子を
含む３ｋｂＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴＦ１
４を取得した（第９図参照）。
次に、ＰＨＯ８遺伝子の構造遺伝子を取り除くために、
まずｐＴＦ１４、１０μｇに１０ユニットの制限酵素Ｘ
ｈｏＩを３０μｌの反応液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ
ＮａＣｌ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３
７℃、３時間作用させ、フェノールで除蛋白し、冷エタ
ノールでＤＮＡを沈殿させた（ＸｈｏＩ消化ｐＴＦ１
４）。つづいてＸｈｏＩ消化ｐＴＦ１４，１μｇに１０
ユニットのＢＡＬ３１ヌクエアーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
を５０μの反応液〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．１），１２ｍＭ ＣａＣｌ２，１２ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で３０℃、２分間作用させた
後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈
殿させた。
まずｐＴＦ１４、１０μｇに１０ユニットの制限酵素Ｘ
ｈｏＩを３０μｌの反応液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ
ＮａＣｌ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３
７℃、３時間作用させ、フェノールで除蛋白し、冷エタ
ノールでＤＮＡを沈殿させた（ＸｈｏＩ消化ｐＴＦ１
４）。つづいてＸｈｏＩ消化ｐＴＦ１４，１μｇに１０
ユニットのＢＡＬ３１ヌクエアーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
を５０μの反応液〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．１），１２ｍＭ ＣａＣｌ２，１２ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で３０℃、２分間作用させた
後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでＤＮＡを沈
殿させた。
５０ｎｇの５’末端がリン酸化されたＳａｌＩリンカー
〔５’−Ｐ−ｄ（ＧＧＴＣＧＡＣＣ）〕（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と４００ｎｇの上述
のＢＡＬ−３１で処理されたｐＴＦ１４とを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで結合させた。この反応液を用いて大
腸菌ＤＨ１を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換
体の中から制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳａｌＩ〔宝酒造
（株）製〕による二重消化によって１４０〜１６３ｂｐ
の断片が生じるプラスミドｐＴＦ１４−４を選択した
（第９図参照）。このプラスミドではＢＡＬ−３１ヌク
レアーゼ処理によってＰＨＯ８の構造遺伝子が完全に取
り除かれプロモーター領域が保存されている（第５図参
照）。
〔５’−Ｐ−ｄ（ＧＧＴＣＧＡＣＣ）〕（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と４００ｎｇの上述
のＢＡＬ−３１で処理されたｐＴＦ１４とを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで結合させた。この反応液を用いて大
腸菌ＤＨ１を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換
体の中から制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳａｌＩ〔宝酒造
（株）製〕による二重消化によって１４０〜１６３ｂｐ
の断片が生じるプラスミドｐＴＦ１４−４を選択した
（第９図参照）。このプラスミドではＢＡＬ−３１ヌク
レアーゼ処理によってＰＨＯ８の構造遺伝子が完全に取
り除かれプロモーター領域が保存されている（第５図参
照）。
このｐＴＦ１４−４からＰＨＯプロモーター中のＢａｍ
ＨＩ−ＳａｌＩ断片を製造し、ジヌクレオチド合成鎖停
止法（前出）によってＳａｌＩリンカーの挿入個所付近
の塩基配列を調べた。その結果、該リンカーは で示されるとおり、−３５番目のＣの下流に挿入されて
いることが確認された。
ＨＩ−ＳａｌＩ断片を製造し、ジヌクレオチド合成鎖停
止法（前出）によってＳａｌＩリンカーの挿入個所付近
の塩基配列を調べた。その結果、該リンカーは で示されるとおり、−３５番目のＣの下流に挿入されて
いることが確認された。
実施例１１ ＰＨＯ８プロモーターを利用する酵 母発現用ベクターの作製（第１０図 参照） Ｈａｒａｓｈｉｍａ，Ｓら「モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌ．Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）」，４，７７１（１９８４）に記載の大腸
菌−酵母シャトルベクターｐＳＨ１９，１０μｇに各１
０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩとを５０μ
ｌの反応液〔１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，７
ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３７℃、２時間
作用させた後、該反応液を０．８％アガロース・スラブ
ゲルを用いて前記条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
８．０ｋｂＤＮＡ断片を前記の方法によってゲルから分
取した。
ルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌ．Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）」，４，７７１（１９８４）に記載の大腸
菌−酵母シャトルベクターｐＳＨ１９，１０μｇに各１
０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩとを５０μ
ｌの反応液〔１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，７
ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３７℃、２時間
作用させた後、該反応液を０．８％アガロース・スラブ
ゲルを用いて前記条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
８．０ｋｂＤＮＡ断片を前記の方法によってゲルから分
取した。
実施例１０で得られたプラスミドｐＴＦ１４−４，１０
μｇに各々１０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌ
Ｉとを上記条件下で反応させた後、電気泳動にかけてＰ
ＨＯ８プロモーターを含む１．０５ｋｂＤＮＡ断片を単
離した。
μｇに各々１０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌ
Ｉとを上記条件下で反応させた後、電気泳動にかけてＰ
ＨＯ８プロモーターを含む１．０５ｋｂＤＮＡ断片を単
離した。
該１．０５ｋｂＤＮＡ断片２００ｎｇと上述の８．０ｋ
ｂＤＮＡ断片５００ｎｇとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼの作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ１を形質転換させ、アンピシリン耐性形質転換体の中
からｐＳＨ１９のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位にｐＴＦ１
４−４から単離された１．０５ｋｂ断片が挿入されたプ
ラスミドｐＴＦ１０３を分離した（第１０図参照）。
ｂＤＮＡ断片５００ｎｇとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼの作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ１を形質転換させ、アンピシリン耐性形質転換体の中
からｐＳＨ１９のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位にｐＴＦ１
４−４から単離された１．０５ｋｂ断片が挿入されたプ
ラスミドｐＴＦ１０３を分離した（第１０図参照）。
実施例１２ ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原 遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分 子の構築および該ＤＮＡ分子による 酵母の形質転換 特願昭５９−１９３７６５号（出願日：昭和５９年９月
１３日）明細書の実施例に記載されているａｄｗ型Ｂ型
肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子発現プラス
ミドｐＰＨＯ１７−５８，５０μｇに５０ユニットの制
限酵素ＸｈｏＩを１００μｌの反応液〔１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１
００ｍＭ ＮａＣｌ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル〕中で３７℃、２時間作用させた後、１．０％アガロ
ース・スラブゲルを用いて前記記載の条件下で電気泳動
にかけた。泳動後、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子を含む８
２３ｂｐＤＮＡ断片を前記の方法でゲルから分取した
（第１０図参照）。
１３日）明細書の実施例に記載されているａｄｗ型Ｂ型
肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子発現プラス
ミドｐＰＨＯ１７−５８，５０μｇに５０ユニットの制
限酵素ＸｈｏＩを１００μｌの反応液〔１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍＭ ＭｇＣｌ２，１
００ｍＭ ＮａＣｌ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル〕中で３７℃、２時間作用させた後、１．０％アガロ
ース・スラブゲルを用いて前記記載の条件下で電気泳動
にかけた。泳動後、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子を含む８
２３ｂｐＤＮＡ断片を前記の方法でゲルから分取した
（第１０図参照）。
実施例１１で得られた発現用ベクターｐＴＦ１０３，１
μｇに２ユニットの制限酵素ＳａｌＩを２０μｌの反応
液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２，１７５ｍＭ ＮａＣｌ，０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３
７℃、２時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷
エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた（ＳａｌＩ消化
ｐＴＦ１０３）。
μｇに２ユニットの制限酵素ＳａｌＩを２０μｌの反応
液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２，１７５ｍＭ ＮａＣｌ，０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕中で３
７℃、２時間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷
エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた（ＳａｌＩ消化
ｐＴＦ１０３）。
２００ｎｇのＳａｌＩ消化ｐＴＦ１０３と２００ｎｇの
前記８２３ｂｐＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼの作
用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１株
を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中か
ら８２３ｂｐＤＮＡ断片中のＨＢｓＡｇ遺伝子がＰＨＯ
８プロモーターと順方法に挿入されたプラスミドｐＴＦ
１０３−５８を含有する形質転換体、エシェリヒア コ
リＤＨ１／ｐＴＦ１０３−５８を分離した。さらに該形
質転換体からプラスミドｐＴＦ１０３−５８を単離した
（第１０図参照）。
前記８２３ｂｐＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼの作
用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ１株
を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中か
ら８２３ｂｐＤＮＡ断片中のＨＢｓＡｇ遺伝子がＰＨＯ
８プロモーターと順方法に挿入されたプラスミドｐＴＦ
１０３−５８を含有する形質転換体、エシェリヒア コ
リＤＨ１／ｐＴＦ１０３−５８を分離した。さらに該形
質転換体からプラスミドｐＴＦ１０３−５８を単離した
（第１０図参照）。
該プラスミドを用いて酵母宿主サツカロミセス・セレビ
シエ・ＡＨ２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体（サツカ
ロミセス セレビシエ・ＡＨ２２Ｒ−／ｐＴＦ１０３−
５８）を分取した。
シエ・ＡＨ２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体（サツカ
ロミセス セレビシエ・ＡＨ２２Ｒ−／ｐＴＦ１０３−
５８）を分取した。
実施例１３ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子の酵母に
おける発現 実施例１２で得られたａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子発現プ
ラスミドを保持するサツカロミセス・セレビシエ形質転
換体（ＡＨ２２Ｒ−／ｐＴＦ１０３−５８）をＢｕｒｋ
ｈｏｌｄｅｒおよびその低リン酸培地で３０℃、２日間
培養した後、菌体を集め、生理食塩水で洗浄した。Ｍｉ
ｙａｎｏｈａｒａ，Ａらの方法〔プロシージング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８０，１
（１９８３）〕に従って、菌体をＺｙｍｏｌｙａｓｅ
〔生化学工業（株）製〕によってスフェロプラストにし
た後、スフェロプラストに０．１％トリトンＸ−１００
を添加してＨＢｓＡｇを抽出した。溶菌液を室温で１
５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心分離にかけて上清液を
得た。この上清液のＨＢｓＡｇ活性をオースザイムII
〔ダイナボット（株）製〕を用いて測定した。その結
果、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇの生成量はブロス１ｌあたり１
５０μｇであった。
おける発現 実施例１２で得られたａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子発現プ
ラスミドを保持するサツカロミセス・セレビシエ形質転
換体（ＡＨ２２Ｒ−／ｐＴＦ１０３−５８）をＢｕｒｋ
ｈｏｌｄｅｒおよびその低リン酸培地で３０℃、２日間
培養した後、菌体を集め、生理食塩水で洗浄した。Ｍｉ
ｙａｎｏｈａｒａ，Ａらの方法〔プロシージング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８０，１
（１９８３）〕に従って、菌体をＺｙｍｏｌｙａｓｅ
〔生化学工業（株）製〕によってスフェロプラストにし
た後、スフェロプラストに０．１％トリトンＸ−１００
を添加してＨＢｓＡｇを抽出した。溶菌液を室温で１
５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心分離にかけて上清液を
得た。この上清液のＨＢｓＡｇ活性をオースザイムII
〔ダイナボット（株）製〕を用いて測定した。その結
果、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇの生成量はブロス１ｌあたり１
５０μｇであった。
第１図は本発明でクローン化されなＰＨＯ８構造遺伝子
及びＰＨＯ８プロモーターを含有するＤＮＡ断片および
その誘導体の制限酵素地図、およびそれらの活性相補能
を示す図である。 第２図及び第３図は、第１図の白抜き部分を持つプラス
ミドを用いてＰＨＯ８転写産物を同定、及び転写方向を
決定するのに用いたノザンハイブリダイゼーションの結
果である。 第４図は第１図の白抜き部分のＤＮＡ断片の制限酵素切
断地図であり、第５図はＰＨＯ８プロモーターを含むＰ
ＨＯ８の部分を塩基配列である。 第６図はｐＡＬ１３４の構築図であり、第７図はＰＨＯ
８の３’末端領域を回収することを示す図である。 第８図はＰＨＯ８を含むＤＮＡの全塩基配列であり、第
９図はＰＨＯ８プロモーターの調製を示すプラスミド構
築図であり、第１０図はａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス表面
抗原遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子の構築図であ
る。
及びＰＨＯ８プロモーターを含有するＤＮＡ断片および
その誘導体の制限酵素地図、およびそれらの活性相補能
を示す図である。 第２図及び第３図は、第１図の白抜き部分を持つプラス
ミドを用いてＰＨＯ８転写産物を同定、及び転写方向を
決定するのに用いたノザンハイブリダイゼーションの結
果である。 第４図は第１図の白抜き部分のＤＮＡ断片の制限酵素切
断地図であり、第５図はＰＨＯ８プロモーターを含むＰ
ＨＯ８の部分を塩基配列である。 第６図はｐＡＬ１３４の構築図であり、第７図はＰＨＯ
８の３’末端領域を回収することを示す図である。 第８図はＰＨＯ８を含むＤＮＡの全塩基配列であり、第
９図はＰＨＯ８プロモーターの調製を示すプラスミド構
築図であり、第１０図はａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス表面
抗原遺伝子を発現する組み換えＤＮＡ分子の構築図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/81 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−８１５８
Claims (3)
- 【請求項１】塩基配列 GAATTCAATGTTAGGAGTAGAACAATAACCGCACCTGCGATGACGGTA AATCTCAACAGTCTCTTACTGAGAAAGAGGGCCATGCTTTCGAGTGGA ACTACTTGCGAATATGGATATCACTTCCAGTATTATAGATTCATAAAA TGTATAAACGAATTAAATCGCAAATTATCTCCTTTTCAGACTGTTTCT TCACCAAATTTCTTTTTTTTTTCCTACTAGAAGAAGGCGTAGCAGATA AGAAGAAAAATTATATTAAGCGTGCGGGTAAAGGCAAGGAAGAATCAA GTAAGACCTTAAGAATGGCACTATAAGTGTGGTATTATAATCTGTGTA ATCCTAATTTGAGCTCGACACAATACCATTCGACGGTTAACAGCTACT GCATCACCGTCCAGTCATGTCGTACAACGGAATAGGGCTCAAGTCGGC AAAAGGGTCATCTACGTCGGGCCACGTGCAGCGATCACTTGCTAGCAA CAATAGGCGCAGACCACAGGGTAGTCAACAGCAGCGGCAACAACGACA AAATGCGATCAAAAAGGCCAGCCATGACAAGGGAAGCAGGCCTCTTGC TGTGCAGAAACAGATAGAGAATCATATGGAGAAACGTGAGATTGAAGT ACAAGTCAGTGAGCTACGGGACCGACTGGAGGAGGAAGAAACGCTCTC GGAAGAGCAGATTGACAAGAAATGTGAAGCGTTGAGGGCAAAACTGAC GAACGAGTGGCAAGAACAGCAGCGGATGTCCTCTTTGTACACCCCTCG TAAGGCGCGTCTAACGGAAGAGCAGCATCGACATGAATAGCAGCATTG ACGATAGCGATAAGCTTCGCGCGTAGAGGAAAAGTAAAGGGATTTTAG TATATAAAGAAAGAAGTGTATCTAAACGTTTATATATTTTCGTGCTCC ACATTTTGCCAGCAAGTGGCTACATAAACATTTACATACCAGCATTAC GGGACATTATTTGAACGCGCATTAGCAGC で示されるＰＨＯ８プロモーターを含有する組み換えＤ
ＮＡ。 - 【請求項２】ＰＨＯ８プロモーターの下流に構造遺伝子
が組み込まれた特許請求の範囲第１項記載の組み換えＤ
ＮＡ。 - 【請求項３】塩基配列 GAATTCAATGTTAGGAGTAGAACAATAACCGCACCTGCGATGACGGTA AATCTCAACAGTCTCTTACTGAGAAAGAGGGCCATGCTTTCGAGTGGA ACTACTTGCGAATATGGATATCACTTCCAGTATTATAGATTCATAAAA TGTATAAACGAATTAAATCGCAAATTATCTCCTTTTCAGACTGTTTCT TCACCAAATTTCTTTTTTTTTTCCTACTAGAAGAAGGCGTAGCAGATA AGAAGAAAAATTATATTAAGCGTGCGGGTAAAGGCAAGGAAGAATCAA GTAAGACCTTAAGAATGGCACTATAAGTGTGGTATTATAATCTGTGTA ATCCTAATTTGAGCTCGACACAATACCATTCGACGGTTAACAGCTACT GCATCACCGTCCAGTCATGTCGTACAACGGAATAGGGCTCAAGTCGGC AAAAGGGTCATCTACGTCGGGCCACGTGCAGCGATCACTTGCTAGCAA CAATAGGCGCAGACCACAGGGTAGTCAACAGCAGCGGCAACAACGACA AAATGCGATCAAAAAGGCCAGCCATGACAAGGGAAGCAGGCCTCTTGC TGTGCAGAAACAGATAGAGAATCATATGGAGAAACGTGAGATTGAAGT ACAAGTCAGTGAGCTACGGGACCGACTGGAGGAGGAAGAAACGCTCTC GGAAGAGCAGATTGACAAGAAATGTGAAGCGTTGAGGGCAAAACTGAC GAACGAGTGGCAAGAACAGCAGCGGATGTCCTCTTTGTACACCCCTCG TAAGGCGCGTCTAACGGAAGAGCAGCATCGACATGAATAGCAGCATTG ACGATAGCGATAAGCTTCGCGCGTAGAGGAAAAGTAAAGGGATTTTAG TATATAAAGAAAGAAGTGTATCTAAACGTTTATATATTTTCGTGCTCC ACATTTTGCCAGCAAGTGGCTACATAAACATTTACATACCAGCATTAC GGGACATTATTTGAACGCGCATTAGCAGC で示されるＰＨＯ８プロモーターを含有する組み換えＤ
ＮＡを有する形質転換酵母。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27445684 | 1984-12-28 | ||
| JP59-274456 | 1984-12-28 | ||
| JP60-73493 | 1985-04-09 | ||
| JP7349385 | 1985-04-09 | ||
| JP19848085 | 1985-09-10 | ||
| JP60-198480 | 1985-09-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62151181A JPS62151181A (ja) | 1987-07-06 |
| JPH062063B2 true JPH062063B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=27301232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60287860A Expired - Lifetime JPH062063B2 (ja) | 1984-12-28 | 1985-12-23 | 新規ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062063B2 (ja) |
-
1985
- 1985-12-23 JP JP60287860A patent/JPH062063B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62151181A (ja) | 1987-07-06 |
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|---|---|---|---|
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