JP3437850B2 - ピキア・パストリスの酸ホスファターゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵母宿主システムおよ
び発現ベクターを用いる組換えバイオテクノロジーの分
野に関する。一つの態様において、本発明は、酵母ピキ
ア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の
酸ホスファターゼ遺伝子（配列確認番号：１）の一部分
または全部を含む新規なＤＮＡ断片に関する。もう一つ
の態様において、本発明は、ピキア・パストリスの酸ホ
スファターゼ遺伝子（配列確認番号：１）に由来するＤ
ＮＡ断片を含む新規なベクターに関する。更にもう一つ
の態様において、本発明は、ピキア・パストリスの酸ホ
スファターゼ遺伝子（配列確認番号：１）に由来する断
片を含むベクターによって形質転換された宿主細胞に関
する。もう一つの態様において、本発明は、前記に記載
したＤＮＡ断片を用いて酵母での異種タンパク質の発現
および／または分泌を促進することに関する。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡバイオテクノロジーが近年
発達するに従い、莫大な種類の有用なポリペプチドの微
生物による制御生産が可能になってきた。多くのポリペ
プチド、例えばヒト成長ホルモン、白血球インターフェ
ロン、ヒトインシュリンおよびヒトプロインシュリンな
どが種々の微生物によって既に生産されている。すでに
掌中にある技法を引続き用いることにより、他の種々の
有用なポリペプチド製品の生産が可能になると予想され
る。

【０００３】組換えＤＮＡ技術の分野で用いられる基本
的技法は、当業者によって周知である。組換えＤＮＡ技
術の実施に与えられる好ましい要素としては、制限され
ないが、 （１）１種類またはそれ以上の望ましいポリペプチドを
コードし且つ宿主生物において遺伝子の発現に必要な適
当な調節配列と機能的に関係した遺伝子； （２）遺伝子を挿入することができるベクター； （３）遺伝子を有するベクターを形質転換させることが
できる適当な宿主生物；（４）異種タンパク質の分泌が
望まれる場合に、異種タンパク質を宿主細胞の分泌経路
に、そして次に細胞外へ方向付けることが可能なシグナ
ル配列； （５）形質転換システム；および （６）形質転換体を選択する方法； が挙げられる。

【０００４】組換え体遺伝子の構築は、組換え体タンパ
ク質が宿主の分泌経路を通過し且つ増殖培地中に分泌さ
れるように設計することができる。分泌は、いくつかの
理由により組換え体発現の望ましい様式である。第一
に、ある種の異種タンパク質は宿主生物に対する毒性作
用がある。このような異種遺伝子生成物が宿主内に蓄積
されるよりもむしろ分泌される場合には、それらは通常
の細胞機能をほとんど妨げないと考えられる。第二に、
細胞内に産生された場合に不活性であるある種のタンパ
ク質は、分泌された場合には活性である。第三に、培地
への分泌は生成物を回収するために細胞を破壊して開放
する必要をなくする。生成物の精製は、生成物が増殖培
地中に存在する場合には、極めて容易であり且つ原価効
率がよい。そして第四に、組換え体生成物は栄養培地中
に存在するので、所望の生成物を連続的に取り出すこと
ができるし、しかも培地を再使用することができる。

【０００５】大部分の分泌されたタンパク質は、シグナ
ルペプチドと称される付加されたアミノ末端延長部分を
含む前駆物質またはプレ−タンパク質の形で細胞内部に
最初に発現される。シグナルペプチドは、付加されたペ
プチドを、限定的な細胞膜中におよび／またはそれを介
して輸送する本質的な役割を果たす。次に、シグナルペ
プチドは、成熟タンパク質生成物を生じる分泌中または
分泌後に、シグナルペプチドによるタンパク質加水分解
によって開裂する。

【０００６】異種または外来のタンパク質の分泌は、シ
グナルペプチドをコードするＤＮＡに対して異種ＤＮＡ
のコード配列を結合させることによって達成することが
できる。このシグナルペプチドをコードするシグナル配
列を単離することが望ましく、それが分泌を容易にする
と考えられる。

【０００７】シグナル配列は、発現ベクターの生成にお
いて特に有用である。このようなベクターを用いること
によって、適合した宿主細胞を形質転換することが可能
に成り、その結果、それらは異種遺伝子生成物を産生し
且つ分泌する。酵母宿主から組換え体タンパク質を首尾
よく分泌させるのに用いられてきたリーダー配列の例と
しては、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα型接合因
子、ａ型接合因子およびキラー毒素遺伝子からのものが
挙げられる。ピキア・パストトリスのようなメチロトロ
ーフ酵母からのシグナル配列の単離は記載されていなか
った。

【０００８】好都合に、このようなベクターを用いて異
種遺伝子生成物の発現を調節するプモーターは、シグナ
ル配列と本来的に関係したプロモーターであることがで
きる。シグナル配列と本来的に関係したプロモーターが
高水準のＤＮＡ転写を与え且つ外因性環境刺激に対して
反応するならば、それは特に好都合であろう。このよう
なプロモーターの例は、ピキア・パストリスの酸ホスフ
ァターゼ（ＰＨＯ１）遺伝子の５′調節領域であり（配
列確認番号：２）、それは培地中のリン酸（ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）塩不存在に対して反応して高水準で転写さ
れ、培地中のリン酸塩の存在によって抑制される。

【０００９】ピキア・パストリスのゲノムの正確な位置
で組込みする組換え体ＤＮＡの構築によってピキア・パ
ストリス宿主を形質転換するのが望ましいことが多い。
第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片としてもそれぞ
れ知られているピキア・パストリスＰＨＯ１遺伝子を側
面に位置している５′および３′配列を発現ベクターで
用いてＰＨＯ１遺伝子座での組換え体配列の組込みを促
す。組換え体ＤＮＡをＰＨＯ１遺伝子座で組込む能力は
少なくとも二つの理由で好都合であり、すなわち、
（Ｉ）ピキア・パストリスの発生において、発現菌株が
ＰＨＯ１遺伝子座または別のピキア属遺伝子座で同じま
たは異なる発現カセットの多数のコピーを有すること、
または（２）本来の遺伝子またはメタノール代謝経路の
遺伝子の分断が望ましくない宿主ピキア・パストリス菌
株において、ＰＨＯ１遺伝子座のみで１種類以上の発現
カセットが安定に挿入されることである。

【００１０】ＰＨＯ１遺伝子が分断された細胞は、付随
して酸ホスファターゼ酵素活性の欠損を示す。ＰＨＯ１
遺伝子の分断を示すものであるＰｈｏ⁻表現型は、その
細胞を低リン酸塩指示プレート上で平板培養し且つコロ
ニーを一晩中増殖させることによってスクリーンするこ
とができる。ＰＨＯ１遺伝子が分断されているコロニー
は白色であるが、完全なままのＰＨＯ１遺伝子を有する
このようなコロニーは緑色である。この測色法スクリー
ンにより、発現カセットが正確にＰＨＯ１遺伝子座で組
込まれ、それによって遺伝子が分断されている細胞を検
出するための速やかで且つ容易な方法が提供される。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】したがって、宿主細胞
からのタンパク質の分泌を促進させるシグナル配列を単
離することは当該技術分野にかなり貢献すると考えられ
る。

【００１２】更に、高水準のＤＮＡ転写のために用意さ
れていると考えられ且つ外因性環境刺激に対して反応す
る５′調節領域を単離することは好都合であると考えら
れる。現在のところ、培地中のリン酸塩不存在に対して
反応して高水準で転写され且つ高生産性発酵酵母ピキア
・パストリスと一緒に用いることができる５′調節領域
は当該技術分野で知られていない。

【００１３】更に、酸ホスファターゼ（ＡＰ）構造遺伝
子を単離することは好都合であると考えられる。

【００１４】酸ホスファターゼ遺伝子の断片を含む新規
なベクターを提供することも好都合であると考えられ
る。

【００１５】更に、３′転写終結配列を単離することは
好都合であると考えられる。

【００１６】ピキア・パストリスＰＨＯ１遺伝子座での
組込みを指示するインテグレイティブベクターを提供す
ることも好都合であると考えられる。

【００１７】更に、断片を同定する方法を提供すること
は好都合であると思われる。

【００１８】したがって、本発明の一つの態様により、
細胞からのタンパク質の分泌を促進させるシグナル配列
を提供する。

【００１９】更に別の態様は、リン酸塩不存在に反応し
て転写された５′調節領域である。本発明のもう一つの
態様は、ピキア・パストリス酸ホスファターゼ構造遺伝
子（配列確認番号：４）のＤＮＡ配列である。

【００２０】本発明のまた更に別の態様は、少なくとも
１個のポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に対し
て操作可能に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅ
ｄ）調節領域および／またはシグナル配列を含む新規な
ベクターであり、前記の調節領域を誘発して前記の異種
ＤＮＡ配列の発現を促進させることを意味する。

【００２１】他の態様として、酸ホスファターゼ遺伝子
からの３′転写終結配列、ピキア・パストリスＰＨＯ１
遺伝子座での組込みを指示すると考えられるインテグレ
イティブベクターおよび断片を同定する方法が上げられ
る。

【００２２】本発明の他の態様、目的および利点は、以
下の説明、実施例および請求の範囲から明らかになるも
のである。

【００２３】

【課題を解決するための手段】本発明により、細胞から
のタンパク質の分泌を促進させるピキア・パストリス酸
ホスファターゼ遺伝子（配列確認番号：３）からのシグ
ナル配列を含む新規なＤＮＡ断片を提供する。

【００２４】本発明の更に別の態様により、ピキア・パ
ストリス酸ホスファターゼ５′調節領域（配列確認番
号：２）を含む新規なＤＮＡ断片を提供する。

【００２５】本発明の更にもう一つの態様において、ピ
キア・パストリス酸ホスファターゼ（ＡＰ）構造遺伝子
（配列確認番号：４）のＤＮＡ配列を含む新規なＤＮＡ
断片を提供する。

【００２６】本発明の更に別の態様により、少なくとも
１個のポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に対し
て操作可能に結合した調節領域および／またはシグナル
配列を含む新規なベクターを提供し、前記の調節領域を
誘発して前記の異種ＤＮＡ配列の発現を促進させること
を意味する。

【００２７】本発明のもう一つの態様において、ピキア
・パストリスの酸ホスファターゼ遺伝子からの３′転写
終結配列（配列確認番号：５）を含む新規なＤＮＡベク
ターを提供する。

【００２８】本発明の別の態様により、ピキア・パスト
リスＰＨＯ１遺伝子座でのベクターの組込みを促すイン
テグレイティブベクターを提供する。

【００２９】本発明の更に別の態様は、断片を同定する
方法を提供することである。

【００３０】本発明は、ピキア・パストリスに由来する
酸ホスファターゼ遺伝子にそのプロモーターを含むもの
（または５′調節領域）、転写ターミネーターおよびフ
ランキング配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）を含む新規な単離されたＤＮＡ断片（配列確認番
号：１）を提供する。

【００３１】酸ホスファターゼ（ＡＰ）は、ピキア・パ
ストリスおよび他の酵母によって無機リン酸塩飢餓の条
件下で分泌される細胞外酵素である。分泌された酸ホス
ファターゼは有機物質からのリン酸塩の放出を触媒し、
それによってそのリン酸塩は細胞の増殖および生存に役
立つ。

【００３２】酸ホスファターゼをコードする遺伝子が単
離され且ついくつかの酵母種で研究が行われ、酸ホスフ
ァターゼ遺伝子発現の調節可能な性質は、酸ホスファタ
ーゼプロモーター因子に局限されてきた。無機リン酸塩
の培地濃度が低い条件において、酸ホスファターゼプロ
モーター（または５′調節領域）は刺激され、酸ホスフ
ァターゼ遺伝子は転写され、そして引き続き酸ホスファ
ターゼ酵素に翻訳される。新規に合成された酸ホスファ
ターゼ酵素は有機物質からリン酸塩を放出し且つそのリ
ン酸塩を細胞に対して利用可能にする。リン酸塩濃度の
引き続きの増加は酸ホスファターゼプロモーターを変調
し、酸ホスファターゼタンパク質の必要性の減少と同時
に、酸ホスファターゼ遺伝子の転写が減少する結果とな
る。したがって、酸ホスファターゼプロモーターは、低
いまたは高いリン酸塩濃度によって、それぞれ誘発また
は抑制することができる。ピキア・パストリス酸ホスフ
ァターゼプロモーターの同定および単離は重要である。
酸ホスファターゼ発現の調節は、この発現ついて分析さ
れた酵母種の中で変化するので、ピキア・パストリスで
の酸ホスファターゼ発現について観察された厳密な調節
は、同種のプロモーター配列の利用可能性および使用に
依存することが予想される。

【００３３】ピキア・パストリスＰＨＯ１遺伝子シグナ
ル配列（配列確認番号：３）の同定および単離は、ピキ
ア・パストリス遺伝子から単離された最初のシグナル配
列であることに加えて、それがメチロトローフ性（ｍｅ
ｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母から単離された最初の
シグナル配列を示すという点で重要である。それは、ピ
キア・パストリスからの異種タンパク質、例えばｔＰＡ
またはインベルターゼの分泌を促すことにおいて、本来
の遺伝子シグナル配列、例えばｔＰＡ（組織プラスミノ
ーゲン活性化因子）またはインベルターゼ遺伝子からの
シグナル配列と同等であるかまたはそれより優れている
ことが発見された。

【００３４】自律的複製因子として組換え体発現ベクタ
ーを保持する代りにそれらを宿主ゲノムへ組込むことが
望ましいことが多い。組込まれたベクターは、自律的ベ
クターよりも有意に安定であり、しかも本発明の実施に
好ましい。具体的には、本明細書に参考文献として記述
される米国特許第４，８８２，２７９号明細書に記載の
線状部位特異性インテグレイティブベクターが好まし
い。このようなベクターは、少なくとも（１）第一の挿
入可能なＤＮＡ断片；（２）選択可能な標識遺伝子；お
よび（３）第二の挿入可能なＤＮＡ断片；を有する連続
的に配置された配列を含む。

【００３５】第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は
それぞれ、ヌクレオチドが少なくとも約２００個の長さ
であり且つ形質転換される種のゲノムＤＮＡの位置に対
して相同性であるヌクレオチド配列を有する。インテグ
レイティブベクターの各種成分は、連続的に配置され
て、発現カセットおよび選択可能な標識遺伝子が第一の
挿入可能なＤＮＡ断片の３′末端と第二の挿入可能なＤ
ＮＡ断片の５′の間に位置するようにＤＮＡの線状断片
を形成する。第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片
は、それらが親ゲノムで位置が定められているように、
連続的に配置された線状断片での互いの関係によって位
置が定められている。

【００３６】第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片と
して有用なヌクレオチド配列は、ゲノムの変異が生じる
べき本来のゲノム部位の単独の部分と相同であるヌクレ
オチド配列である。したがって、例えば、ゲノム変異が
酸ホスファターゼ遺伝子の座で生じるべきである場合、
用いられる第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は酸
ホスファターゼ遺伝子座の単独の部分に対して相同の配
列でなければならない。ゲノム変異が生じるためには、
２種類の挿入可能なＤＮＡ断片は、それらが親ゲノムで
存在しているのと同じ相対的な配置で、線状断片での互
いの関係によって位置が定められなければならない。第
一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片として用いること
ができるヌクレオチド配列の例は、酸ホスファターゼＰ
ＨＯ１遺伝子、アルコールオキシダーゼＡＯＸ１遺伝
子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼＨＩＳ４遺伝子お
よびジヒドロキシアセトンシンテターゼＤＨＡＳ遺伝子
から成る群より選択されるヌクレオチド配列である。

【００３７】第一の挿入可能なＤＮＡ断片は、発現カセ
ットで用いられる調節領域を含むことができる操作可能
な調節領域を含むことができる。第一の挿入可能なＤＮ
Ａ断片を発現カセットの調節領域として用いることは本
発明の好ましい実施態様である。所望により、１か所ま
たは複数の挿入部位および３′終結配列を第一の挿入可
能なＤＮＡ断片に対して直接３′に置いてもよい。線状
部位特異性インテグレイティブベクターのこのコンホー
メーションには、適合した３′終結配列の追加を必要と
せずに構造遺伝子を挿入するのに用意された部位を与え
るという更に別の利点がある。

【００３８】更に、宿主菌株を形質転換するのに用いら
れるＤＮＡには少なくとも１個の選択可能な標識遺伝子
が含まれる必要がある。これにより、形質転換するＤＮ
Ａが組み込まれたこのような生物の選択および単離が容
易になる。標識遺伝子は、形質転換生物に対して、非形
質転換宿主が特異的アミノ酸生合成経路での欠点または
抗生物質等に対する耐性を有する場合に宿主が有してい
なかった表現型形質、例えば特異的アミノ酸を産生する
元の能力を与える。代表的な選択可能な標識遺伝子は、
ピキア・パストリスおよびサッカロミセス・セレビシエ
ーからのＨＩＳ４遺伝子およびＡＲＧ４遺伝子；サッカ
ロミセス・セレビシエーからのインベルターゼ遺伝子
（ＳＵＣ２）；および大腸菌転位因子Ｔｎ６０１または
Ｔｎ９０３からのＧ４１８Ｒカナマイシン耐性遺伝子；
から成る群より選択することができる。

【００３９】第一の挿入可能なＤＮＡ断片が調節領域を
含まない場合、操作可能な発現カセットを与えるため
に、適当な調節領域を挿入して構造遺伝子に操作可能に
結合させる必要がある。同様に、発現カセットを完全に
するのに挿入部位で３′終結配列が与えられていなけれ
ば、３′終結配列を、挿入が行われる構造遺伝子に対し
て操作可能に結合させなければならない。

【００４０】宿主細胞に対して有害に作用しないゲノム
の位置で組込みが生じることが重要である。組換え体発
現構築物のピキア・パストリス酸ホスファターゼ遺伝子
座（ＰＨＯ１）での組込みがピキア属宿主に対して有害
ではなく且つその組換え体配列の安定な組込みを導いた
ということは意外な発見であった。ＰＨＯ１遺伝子座で
促される組込みは、組換え体発現ベクターにおいて（第
一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片とも称される）ピ
キア・パストリスＰＨＯ１遺伝子を側面に位置する５′
および３′配列を用いることによって行われる。

【００４１】もう一つの発見は、形質転換された細胞を
スクリーンするために、ＰＨＯ１遺伝子座を分断するこ
とによって発現ベクター配列を組込んだものを同定する
方法であった。ＰＨＯ１遺伝子が分断された細胞は、付
随して酸ホスファターゼ酵素活性の損失を示す。ＰＨＯ
１の分断を示すものであるＰｈｏ⁻表現型は、その細胞
を低リン酸塩指示プレート上で平板培養し且つコロニー
を一晩中増殖させることによってスクリーンすることが
できる。ＰＨＯ１遺伝子が分断されているコロニーは白
色であるが、そのままのＰＨＯ１遺伝子を有するこのよ
うなコロニーは緑色である。この測色法スクリーンによ
り、発現カセットが正確にＰＨＯ１遺伝子座で組込まれ
た細胞を検出する速やかで且つ容易な方法が与えられ
る。

【００４２】ピキア・パストリス酸ホスファターゼ遺伝
子（配列確認番号：１）の部分制限地図を図１に示す。
この遺伝子は、表１に示しているヌクレオチド配列を更
に特徴とする。

【００４３】更に、本発明により、ピキア・パストリス
酸ホスファターゼ５′調節領域（配列確認番号：２）、
シグナル配列（配列確認番号：３）、構造遺伝子（配列
確認番号：４）および３′転写終結配列（配列確認番
号：５）を含む新規なＤＮＡ断片を提供する。

【００４４】下記の表に、ピキア・パストリス酸ホスフ
ァターゼ遺伝子（配列確認番号：１）の配列およびそれ
らの断片を示す。

【００４５】 酸ホスファターゼ遺伝子はピキア・パストリス培養物、
例えばピキア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０か
ら、下記の実施例に記載の方法によって回収される（ピ
キア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０は、１９７
９年１月３０日に米国農務省北部地域研究所に寄託され
たものであり、そこから入手可能である）。ピキア・パ
ストリス酸ホスファターゼ遺伝子（配列確認番号：１）
を回収する一般的な方法は、酸ホスファターゼプロー
ブ、例えば、下記の実施例で記載した低リン酸塩（Ｌ
Ｐ）プローブを用いてピキア・パストリスＤＮＡのライ
ブラリーをスクリーンすることから成る。他のプローブ
は、表１で開示した配列に基づいて選択且つ合成するこ
とができる。プローブのハイブリダイセーションは、当
業者に既知の任意の適当なプロトコルによって行うこと
ができる。ピキア・パストリスライブラリーは当該技術
分野で既知の技法によって調製することができ、制限さ
れないが、グレッグ（Ｇｒｅｇｇ）らによるＭｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏ．，５，３３７６〜３３８５に記載され
た方法が挙げられる。

【００４６】或いは、酸ホスファターゼ５′調節領域
（配列確認番号：２）、シグナル配列（配列確認番号：
３）、構造遺伝子（配列確認番号：４）および３′調節
領域（配列確認番号：５）を、表１〜５に定義の適当な
配列を既知の酵素的手段または化学的手段を用いて合成
することによって得ることができる。適当な手段とし
て、制限されないが、ホスホトリエステル、亜リン酸エ
ステルまたはシアノエチルホスホルアミダイト化学に基
づく化学的方法が挙げられる。

【００４７】当業者は、更に、本発明の単離されたピキ
ア・パストリス酸ホスファターゼ５′調節領域（配列確
認番号：２）、シグナル配列（配列確認番号：３）、構
造遺伝子（配列確認番号：４）および３′転写終結配列
（配列確認番号：５）が、引続き単離されたピキア・パ
ストリス酸ホスファターゼ５′調節領域、シグナル配
列、構造遺伝子および３′転写終結配列と比較すると、
生じることがあるクローン変異または配列の誤りによる
極僅かにヌクレオチド数が減少した相違を含むことがあ
ることを認めている。

【００４８】ピキア・パストリス酸ホスファターゼ５′
調節領域（配列確認番号：２）、シグナル配列（配列確
認番号：３）、構造遺伝子（配列確認番号：４）および
３′転写終結配列（配列確認番号：５）の変異も行うこ
とができ、例えばリンカーＤＮＡを加えるかまたは突然
変異誘発（例えば、Ｍ１３突然変異誘発）を行って１か
所または複数の制限部位を与えるかまたは除去すること
等ができる。

【００４９】ピキア・パストリス酸ホスファターゼ遺伝
子はいったん回収されると、それを真核性または原核性
プラスミド宿主システムで保持または複製することがで
き、例えばｐＢＲ３２２は大腸菌でまたは当該技術分野
で既知の他の任意の適当なシステムで保持される。

【００５０】当業者は、更に、多数の別のＤＮＡ配列を
用いられるベクターに組み込むこともできることを認め
ており、例えば、少数の代表的な例だけを挙げると、細
菌のプラスミドＤＮＡ、種々の標識遺伝子、バクテリオ
ファージＤＮＡ、自律的複製配列および動原体ＤＮＡで
ある。

【００５１】酸ホスファターゼ５′調節領域（配列確認
番号：２）は、図１および表２に示したように、ヌクレ
オチド ３９９からおよそヌクレオチド０まで延長して
いるＤＮＡ断片内に含まれる。この断片は、少なくとも
１個のポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列の５′
末端に操作可能に結合し且つそこに位置した場合に、Ｒ
ＮＡに対するＤＮＡの転写を行うことができる。

【００５２】本明細書中で開示された酸ホスファターゼ
５′調節領域（配列確認番号：２）を用いるために、図
１および表２に記載した断片を、少なくとも１個のポリ
ペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に対して操作可能
に結合することができる。本明細書の目的上、異種ＤＮ
Ａ配列は、宿主でまたは前記の調節領域との関係で本来
生じないＤＮＡ配列の組合わせである。酸ホスファター
ゼ５′調節領域（配列確認番号：２）と操作可能に結合
することができる少なくとも１個のポリペプチドをコー
ドする適当な異種ＤＮＡ配列として、制限されないが、
組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト血清アルブミン
およびインベルターゼが挙げられる。本発明によって用
いられる異種ＤＮＡ配列は、５′ＡＴＧ開始コドンおよ
び３′終結コドンを含んでいなければならないし、更に
ｍＲＮＡを安定化させるかまたはポリアデニル化を促す
作用をするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

【００５３】異種ＤＮＡ配列に操作可能に結合した酸ホ
スファターゼ５′調節領域（配列確認番号：２）の組合
わせを、適当なベクターに挿入してもよい。多数の酵母
ベクター 宿主組合わせが可能であり且つ当業者に知ら
れている。更に別の配列、例えば細菌または酵母での増
殖増幅または急速な増殖が可能なベクターを与える標識
遺伝子または他の配列も存在することができる。

【００５４】酸ホスファターゼ５′調節領域を含むベク
ターによって形質転換することができる適当な宿主細胞
として、酵母、例えばサッカロミセス属、ピキア属およ
びハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、好ましくはピ
キア属からのもの、最も好ましくはピキア・パストリス
が挙げられる。

【００５５】酸ホスファターゼ５′調節領域（配列確認
番号：２）を含むベクターによる適当な宿主細胞の形質
転換は、当業者に既知の任意の適当な形質転換技法によ
って行うことができる。

【００５６】酸ホスファターゼ５′調節領域（配列確認
番号：２）は、培地中のリン酸塩濃度によって制御され
る。具体的には、この調節領域は低濃度のリン酸塩によ
って抑制解除される。したがって、５′調節領域は培地
中に存在するリン酸塩濃度を変化させることによって調
節される。

【００５７】酸ホスファターゼシグナル配列（配列確認
番号：３）は、図１および表３に示したようなヌクレオ
チド１からおよそヌクレオチド６６まで延長しているＤ
ＮＡ断片内に含まれる。本明細書で開示された酸ホスフ
ァターゼシグナル配列（配列確認番号：３）を用いるの
に、図１および表３に記載した断片を、少なくとも１個
のポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に対して操
作可能に結合させることができる。適当な異種ＤＮＡ配
列として、制限されないが、組織プラスミノーゲン活性
化因子、ヒト血清アルブミンおよびインベルターゼから
成る群より選択されるこのようなＤＮＡ配列が挙げられ
る。

【００５８】次に、異種ＤＮＡ配列に操作可能に結合し
た酸ホスファターゼシグナル配列（配列確認番号：３）
の組合わせを適当なプロモーターに結合することができ
る。便宜上、用いられるプロモーターは、リーダー配列
に関係したプロモーターであってもよい。或いは、天然
に存在するＰＨＯ１プロモーターを、転写調節に用意さ
れていると考えられる他の異種プロモーターと置き換え
てもよい。適当な異種プロモーターの例は、本明細書中
に参考文献として記述される米国特許第４，８０８，５
３７号明細書で開示されたピキア・パストリスアルコー
ルオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーター（または５′
調節領域）であると考えられる。

【００５９】酸ホスファターゼシグナル配列（配列確認
番号：３）を含むこのＤＮＡ断片を挿入することができ
る適当なベクターは、前記に記載したように得ることが
できる。更に、シグナル配列をコードするＤＮＡ断片を
含んで得られるベクターを用いて形質転換することがで
きる適当な宿主細胞として酵母、例えばサッカロミセス
属、ハンセヌラ属およびピキア属からのものが挙げら
れ、ピキア・パストリスが好ましい。これらの宿主細胞
の形質転換は、当業者に既知の任意の適当な手段によっ
て行うことができる。これらのベクター／宿主システム
の一つによって産生されたタンパク質に対して操作可能
に結合しているシグナル配列は、宿主細胞からの前記の
タンパク質の分泌を促すことができる。

【００６０】酸ホスファターゼ構造遺伝子（配列確認番
号：４）は、図１および表４に示したようなヌクレオチ
ド６７からヌクレオチド１４０７まで延長しているＤＮ
Ａ断片内に含まれる。酸ホスファターゼ構造遺伝子（配
列確認番号：４）は、組換えバイオテクノロジーにおい
て様々な目的に用いることができ、例えば、制限されな
いが、（ａ）分断性相同性組換え（異種ＤＮＡ配列を酸
ホスファターゼ遺伝子座でピキア・パストリスゲノムに
挿入し、それによって酸ホスファターゼ遺伝子活性を破
壊するための方法）を行うためのＤＮＡ構造および
（ｂ）様々な生物検定で用いるための酸ホスファターゼ
タンパク質の製造用である。

【００６１】酸ホスファターゼ３′転写終結配列（配列
確認番号：５）は、ポリペプチドの産生をコードするＤ
ＮＡ配列の３′末端に操作可能に結合した場合に、ｍＲ
ＮＡの転写を終結させるかまたはｍＲＮＡを安定化させ
る。この酸ホスファターゼ３′転写終結配列（配列確認
番号：５）は、図１および表５に示したようなヌクレオ
チド１４０８からヌクレオチド１５９４まで延長してい
るＤＮＡ断片内に含まれる。酸ホスファターゼ３′転写
終結配列（配列確認番号：５）はポリペプチドをコード
する異種ＤＮＡ配列に操作可能に結合させることがで
き、そしてそれを用いて酵母、例えばサッカロミセス
属、ハンセヌラ属およびピキア属からの酵母のｍＲＮＡ
の転写を終結させるまたはｍＲＮＡを安定化させること
ができるが、それはピキア・パストリスで用いるのに特
に十分に適している。

【００６２】下記の非制限実施例を、本発明の実施を更
に例証するために提供する。

【００６３】

【実施例】菌株 これらの実施例において下記の菌株を用いた。

【００６４】ピキア・パストリスＫＭ７１（ＡＯＸ１，
ｈｉｓ４） ピキア・パストリスＧＳ１１５（ｈｉｓ４）ＮＲＲＬ
Ｙ １５８５１ ピキア・パストリスＧＳ１９０（ａｒｇ４）ＮＲＲＬ
Ｙ １８０１４ ピキア・パストリスＧＳ２４７（Ａｄｅ） ピキア・パストリスＫＭ７１：ＧＳ１０２（Ｍｕｔ） ピキア・パストリスＧＳ１１５：ＧＳ１０２（Ｍｕｔ
＋） ピキア・パストリスＭＤ１００ ２０（ｈｉｓ４，Ａｄ
ｅ） ピキア・パストリスＭＢ１０２ ２６（ｐｈｏ，ｈｉｓ
４，Ａｄｅ） ピキア・パストリスＭＢ１０２ ２８ピキア・パストリ
スＭＢ１０２ ５１ ピキア・パストリスＫＭ７１：ｐＰＳＵ２１６（Ｍｕ
ｔ） ピキア・パストリスＧＳ１１５：ｐＰＳＵ２１６（Ｍｕ
ｔ＋） 大腸菌ＪＭ１０３デルタ（ｌａｃ ｐｒｏ）ｔｈｉ ｒｐ
ｓｌ（ｓｔｒＡ） ｓｕｐＥ ｅｎｄＡ ｓｂｃＢ ｈｓｄＲ ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫ｔＰＡ過発現細胞系ＡＴＣ
Ｃ＃ＣＲＬ９６０７（ヒト黒色腫細胞）は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
から入手可能である。ピキア・パストリス菌株ＧＳ１１
５およびＧＳ１９０は、米国農務省北部地域研究所に寄
託番号ＮＲＲＬ Ｙ １５８５１およびＹ １８０１４
として、それぞれ１９８４年８月３１日および１９８５
年１０月１７日に寄託された。それらの微生物の寄託は
ブダペスト条約に基づく国際寄託である。それらはこの
源から入手可能である。

【００６５】培地、緩衝液および溶液 下記の実施例で用いた培地、緩衝液および溶液は下記に
示した組成を有する。 ＬＰ培地（低リン酸塩） ビオチン ２μｇ／リットル パントテン酸カルシウム ４００μｇ／リットル 葉酸 ２μｇ／リットル ニコチン酸 ４００μｇ／リットル ｐ−アミノ安息香酸 ２μｇ／リットル ピリドキシン塩酸塩 ４００μｇ／リットル リボフラビン ２００μｇ／リットル チアミン−ＨＣｌ ４００μｇ／リットル ホウ酸 ５００μｇ／リットル 硫酸第二銅 ４０μｇ／リットル ヨウ化カリウム １００μｇ／リットル 塩化第二鉄 ２００μｇ／リットル 硫酸マンガン ４００μｇ／リットル 硫酸亜鉛 ４００μｇ／リットル イノシトール ２ｍｇ／リットル モリブデン酸ナトリウム ２００μｇ／リットル 硫酸アンモニウム ５ ｇ／リットル 一塩基性リン酸カリウム ３０ｍｇ／リットル 塩化カリウム １．５ ｇ／リットル 塩化ナトリウム １．７ ミリモル 塩化カルシウム ０．６８ミリモル 硫酸マグネシウム ４．２ ミリモル ＴＥ緩衝液 トリスＨＣｌ，ｐＨ８．０ １０ ミリモル ＥＤＴＡ １ ミリモル ＳＳＰＥ（×１） ＮａＣｌ １８０ ミリモル Ｎａ_３ＰＯ_４，ｐＨ７．７ １０ ミリモル ＥＤＴＡ １ ミリモル ＳＳＣ（×１） ＮａＣｌ １５０ ミリモル クエン酸ナトリウム １５ ミリモル デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（×１） フィコール ２００ｍｇ／リットル ポリビニルピロリドン ２００ｍｇ／リットル ウシ血清アルブミン ２００ｍｇ／リットル ＲＥＢ ＬｉＣｌ １００ ミリモル トリスＨＣｌ，ｐＨ７．４ １００ ミリモル ＥＤＴＡ ０．１ ミリモル ＰＣＩ フェノール ５００ｍｌ／リットル クロロホルム ４８０ｍｌ／リットル イソアミルアルコール ２０ｍｌ／リットル ＣＩ クロロホルム ９６０ｍｌ／リットル イソアミルアルコール ４０ｍｌ／リットルＬＰ指示プレート 、１リットル ＬＰ培地 ×１ クエン酸 ２２．５ミリモル ｐＨ４．８ デキストロース ２０ｇ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］ ６０ｍｇ ノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天［ディフコ（Ｄｉｆｃ
ｏ）］ ２５ｇＳＣＥ緩衝液 ｄＨ_２０５０ｍｌ中、 ソルビトール ９．１ｇ クエン酸ナトリウム １．４７ｇ ＥＤＴＡ ０．１６８ｇ ＨＣｌでｐＨ５．８に調整、オートクレーブＹＮＢ培地 水１リットル中、 アミノ酸不含酵母窒素基剤（ディフコ） ６．７５ｇ

【００６６】

【実施例Ｉ】ｐＬＰ２４の構築 ピキア・パストリスからの酸ホスファターゼ遺伝子（配
列確認番号：１）を単離し且つ確認するために、下記の
実験を行った。ピキア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲ
Ｌ Ｙ−１５８５１）を高リン酸塩（ＨＰ）［アミノ酸
不含酵母窒素基剤（ディフコ）、２％デキストロースお
よびヒスチジン２０ｍｇ／リットルから成る］環境およ
び低リン酸塩（ＬＰ）［ＬＰ培地、２％デキストロース
およびヒスチジン２０ｍｇ／リットルから成る］環境の
双方においてそれぞれの全容量３００ｍｌ中で増殖させ
た。細胞をペレットにし、ＲＥＢ１０ｍｌで１回洗浄
し、そして３０ｍｌのコレックス（Ｃｏｒｅｘ）管中で
ＲＥＢ４ｍｌに懸濁させた。次に、ガラスビーズ８ｇお
よびＰＣＩ４ｍｌを加えた。懸濁液を高速のボルテック
スミキサーでそれぞれ２０秒間で８回混合し、混合の合
間に氷上で２０秒間冷却した。次に、懸濁液を１０，０
００×ｇで１０分間遠心分離した。水性（上部）層をＰ
ＣＩ４ｍｌおよびＣＩ４ｍｌで２回抽出した。−２０℃
で、ｐＨ５．２の３モル酢酸カリウム０．１容量および
エタノール２．５容量を用いて、ＲＮＡを水性層から沈
殿させた。ポリＡ^＋ＲＮＡを、マニアティス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）によって、Ｎ
ａＣｌの代りにＬｉＣｌを置換させて選択した。ポリＡ
^＋ＲＮＡの各種類を２μｇ用いるＬＰまたはＨＰのｍＲ
ＮＡ標識ｃＤＮＡプローブの合成も、マニアティスらに
従った。

【００６７】ＹＥＰ１３の精製されたピキア・パストリ
スプラスミドライブラリー［ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）
ら、Ｇｅｎｅ：８１２１（１９７９）］６０ｎｇを用い
て大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換した［マンデル（Ｍａ
ｎｄｅｌ）およびヒガ（Ｈｉｇａ）、１９７０，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３：１５４］。約８，０００個の
コロニーが得られた。コロニーを二重のニトロセルロー
スフィルターに移し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌお
よびクロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌを含むＬＢ
プレート上で増幅させ、標準プロトコルによって溶解し
［グルンステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）およびワリス
（Ｗａｌｌｉｓ）、１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３７９〜３８９）、８０
℃で９０分間熱処理し、そしてそれぞれのフィルターで
ＬＰかまたはＨＰのｃＤＮＡプローブを用いてハイブリ
ッド形成を行った。ハイブリダイセーションは、ハイブ
リダイセーション溶液１ｍｌ当り、２×ＳＳＰＥ、１×
デンハルト溶液、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）および標識ｃＤＮＡプローブ２．５×１０^５ｃｐ
ｍを用いて行った。ハイブリダイセーションは全容量２
５ｍｌ中５５℃で４０時間行った。ハイブリダイセーシ
ョンに続いて、フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ中室温で２回および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６
５℃で２回洗浄した後、乾燥させ、そしてＸ線フィルム
に露出させた。

【００６８】ＨＰｃＤＮＡプローブによるよりもＬＰｃ
ＤＮＡプローブによって強くハイブリッド形成し、した
がって、酸ホスファターゼ遺伝子をコードした挿入部分
を含む可能な目的物である２４個のゲノムクローンを同
定した。これらの２４個のクローンを、ＬＰおよびＨＰ
のプローブを用いる前と同様に再度スクリーンして、再
度スクリーンされたクローンの内１４個がＬＰｃＤＮＡ
プローブに一層強く再度ハイブリッド形成した。プラス
ミドＤＮＡをこれらの１４個のクローンそれぞれから単
離し、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に
よって分離し、二重のニトロセルロースフィルターにブ
ロットし、そして各フィルターをＬＰかまたはＨＰのｃ
ＤＮＡを用いて前と同じ条件下でハイブリッド形成させ
た。４個の別個のクローンからの遺伝子断片は、ＬＰｃ
ＤＮＡプローブに対しては強くハイブリッド形成した
が、ＨＰｃＤＮＡプローブに対しては弱いかまたは全く
ハイブリッド形成しなかった。次に、これらの断片を、
ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ＋ＳａｌＩ、
およびＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩの二重消化を用いて制限
地図に示し、ＬＰｃＤＮＡプローブを用いて再度ハイブ
リッド形成させた。その断片は、それらの制限地図での
相違によって確認されたように、リン酸塩調節遺伝子と
は無関係の部分をコードした。

【００６９】この方法によってＬＰ調節遺伝子をコード
すると確認された領域を、ｐＵＣ８またはｐＵＣ１９
［ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）］にサブクローン化し
た。結果として生じたプラスミドを^３２Ｐを用いてニッ
クトランスレーションによって標識した（マニアティ
ス）。標識プラスミドを用いてＬＰおよびＨＰのＲＮＡ
のＲＮＡブロット（５μｇ／ブロット）をプローブし
た。ｐＬＰ２４と同定された元の２４個のクローンの内
の一つを、更に別の研究用に選択した。

【００７０】

【実施例ＩＩ】ｐＬＰ２４１１の構築 実施例Ｉで生じ且つピキア・パストリス酸ホスファター
ゼ遺伝子（配列確認番号：１）またはその断片を含むと
考えられるプラスミドｐＬＰ２４を、下記の方法で更に
確認した。１０μｇのｐＬＰ２４をＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ
Ｉで消化し、その２．１ｋｂの断片をゲル精製した。

【００７１】ｐＹＭ２５（ＮＲＲＬ Ｂ−１８０１５）
１０μｇをＳｐｈＩ／ＳａｌＩで消化し、３．１ｋｂの
断片をゲル精製した。ＮＲＲＬ Ｂ−１８０１５は米国
農務省北部地域研究所に１９８５年１０月１７日に寄託
されたものであり、そこから入手可能である。５μｇの
ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで消化し、ＰＣＩ抽
出し、ＣＩ抽出し、そしてＥｔＯＨ沈殿させた。Ｅｃｏ
ＲＩ／ＳａｌＩで線状化したｐＵＣ１９の１００μｇ
を、ｐＬＰ２４の２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断
片２００ｎｇおよびｐＹＭ２５の３．１ｋｂのＳｐｈＩ
／ＳａｌＩ断４５０ｎｇと一緒に３部分の連結で、連結
反応用緩衝液２０μｌ＋１ｍｍＡＴＰ＋Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼ１単位中で連結させた。大腸菌株ＭＣ１０６１を
形質転換させ、正確なプラスミドを、２．１ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ／ＳａｌＩ断片および３．１ｋｂのＳｐｈＩ／Ｓ
ａｌＩ断片の存在によって確認した。

【００７２】

【実施例ＩＩＩ】ｐＬＰ２４１２ ＰＨＯ１分断ベクタ
ーの構築およびＧＳ１９０：ｐＬＰ２４１２の発生プラ
スミドｐＬＰ２４に由来するプラスミドｐＬＰ２４１１
（実施例ＩＩを参照されたい）をＸｂａＩで消化し、ク
レノウＤＮＡポリメラーゼで処理してブラント末端を生
じ、そしてプラスミドｐＹＭ２５からの２．１ｋｂのＨ
ｐａＩ断片と連結させた。この断片にはサッカロミセス
・セレビシエーＡＲＧ４遺伝子が含まれた。（プラスミ
ドｐＹＭ２５はＮＲＲＬ Ｂ １８０１５として入手可
能である）。得られるプラスミドをｐＬＰ２４１２と称
した。次に、ｐＬＰ２４１２をＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化した。３．３ｋｂの断片を単離し且つ用いて
ピキア・パストリスＧＳ１９０（ＮＲＲＬ Ｙ １８０
１４）をＡｒｇ＋原栄養株に形質転換させた（形質転換
方法は実施例ＩＶに記載している）。アルギニン原栄養
株を、アルギニンを欠いている培地で増殖するそれらの
能力によって確認した。それらを単離し且つＬＰ指示プ
レート上で酸ホスファターゼの存在についてスクリーン
した。コロニーをＬＰ指示プレートにレプリカ培養し且
つ３０℃で一晩中増殖させた。ＬＰ指示プレート上のコ
ロニーは緑色（ＰＨＯ１）かまたは白色（ｐｈｐ１）で
あった。白色コロニーは、前記からのピキア・パストリ
スゲノムのＰＨＯ遺伝子座での分断によって安定に組込
まれた３．３ｋｂの発現カセットを含む形質転換体であ
った。

【００７３】安定なＡｒｇ^＋菌株からのゲノムＤＮＡ
を、サザン法フィルターハイブリダイセーションによっ
て分析して発現カセットの位置を決定した。サッカロミ
セス・セレビシエーＡＲＧ４遺伝子を含む３．３ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片は、特異的に組込まれ、そ
してｐＬＰ２４１１に含まれたＤＮＡ断片に類似したゲ
ノム配列を分断し、それによってこの遺伝子座が酸ホス
ファターゼ（ＰＨＯ１）をコードしたことが確認され
た。この形質転換体をＧＳ１９０：ｐＬＰ２４１２と称
した。

【００７４】

【実施例ＩＶ】ピキア・パストリスの形質転換 下記のプロトコルをピキア・パストリスの形質転換で用
いた。

【００７５】酵母細胞をＹＰＤ培地約１０ｍｌ中に接種
し且つ３０℃で１６〜２０時間振とう培養した。次に、
細胞をＡ_６００が約０．０１〜０．１になるまで稀釈
し、ＹＰＤ培地中３０℃で約６〜８時間対数期で保持し
た。ＹＰＤ培地１００ｍｌに、Ａ_６００が約０．１の種
培養物０．５ｍｌを接種し且つ３０℃で約１６〜２０時
間振とう培養した。次に、Ａ_６００が約０．２〜０．３
での（約１６〜２０時間後の）培養物を、ダモン（ＤＡ
ＭＯＮ）ＩＥＣ ＤＰＲ−６０００遠心機を用いて１５
００ｇで５分間遠心分離することによって採取した。

【００７６】スフェロプラストを調製するのに、細胞を
滅菌水１０ｍｌ中で１回洗浄し（前記に記載したように
各洗浄後に遠心分離を行った）、新たに調製したＳＥＤ
１０ｍｌ中で１回、滅菌１モルソルビトール１０ｍｌ中
で１回洗浄し、そしてＳＣＥ緩衝液５ｍｌに再懸濁させ
た。４ｍｇ／ｍｌのチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓ
ｅ）６０，０００［マイルス・ラボラトリーズ（Ｍｉｌ
ｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可能］５μ
ｌを加え、細胞を３０℃で約３０分間インキュベートし
た。

【００７７】スフェロプラスト生成を下記のように監視
した。細胞１００μｌずつを、５％ＳＤＳ９００μｌお
よび１モルソルビトール９００μｌに対して、チモリア
ーゼを加える前かまたは直後におよびインキュベーショ
ン時間中の種々の時間に加えた。細胞がＳＤＳ中には溶
解したがソルビトールには溶解しない時点でインキュベ
ーションを停止した。いったん生成されたスフェロプラ
ストを滅菌１モルソルビトール１０ｍｌ中で１回、１，
０００ｇで５〜１０分間遠心分離することによって洗浄
し、滅菌ＣａＳ１０ｍｌ中で１回、遠心分離によって洗
浄し、そしてＣａＳ０．６ｍｌに再懸濁させた。

【００７８】実際の形質転換には、水またはＴＥ緩衝液
中のＤＮＡ試料（全容量が最大２０μｌまで）を、１２
×７５ｍｍの滅菌ポリプロピレン試験管に加えた。（少
量のＤＮＡには、各試料中に５ｍｇ／ｍｌの音波処理し
た大腸菌ＤＮＡを約１μｌ用いて最大の形質転換が生じ
る）。スフェロプラスト１００μｌを各ＤＮＡ試料に加
え、室温で約２０分間インキュベートした。ＰＥＧ溶液
１ｍｌを各試料に加え、室温で約１５分間インキュベー
トした。試料を１，０００ｇで５〜１０分間遠心分離
し、その上澄みを捨てた。ペレットをＳＯＳ１５０μｌ
に再懸濁させ、室温で３０分間インキュベートした。滅
菌１モルソルビトール８５０μｌをそれぞれに加え、そ
の試料を下記に記載したように平板培養した。

【００７９】形質転換試料を用意する少なくとも３０分
前に、再生寒天１０ｍｌをプレート毎に注加した。再生
寒天１０ｍｌずつを、形質転換試料がＳＯＳ中にある間
中、４５〜５０℃の浴中で試験管に更に分配した。次
に、試料を試験管に加え、固形底部寒天層を含むプレー
ト上に注加し、そして３０℃で３〜５日間インキュベー
トした。

【００８０】種々の時点でのスフェロプラスト品質を下
記のように決定した。試料１０μｌを取出し、１モルソ
ルビトール９９０μｌに加えることによって１００倍に
稀釈した。稀釈液１０μｌを取出し、１モルソルビトー
ルを更に９９０μｌずつ加えた。双方の稀釈液１００μ
ｌをＹＰＤ寒天培地上に塗布培養して、調製試料中に残
っている非スフェロプラストの全細胞の濃度を決定し
た。各稀釈液１００μｌを、宿主によって必要とされる
全アミノ酸４０μｇ／ｍｌを補給した再生寒天１０ｍｌ
に加えて再生可能な全スフェロプラストを決定した。形
質転換実験に十分な値は、再生可能な全スフェロプラス
トが１〜３×１０^７／ｍｌおよび全細胞数約１×１０^３
／ｍｌであった。

【００８１】

【実施例Ｖ】酵母ＤＮＡの調製 下記のプロトコルをピキア・パストリスＤＮＡの調製で
用いた。

【００８２】酵母細胞を、２％デキストロースを加えた
ＹＢＮ培地１００ｍｌ中、３０℃で、Ａ_６００が１〜２
になるまで増殖させた後、ダモンＩＥＣ ＤＰＲ−６０
００遠心機を２，０００ｇで５分間用いてペレットにし
た。ペレットをｄＨ_２Ｏ中で１回、ＳＥＤ中で１回、１
モルソルビトール中で１回洗浄した後、０．１モルトリ
ス−Ｃｌ、ｐＨ７．０および１モルソルビトールの溶液
５ｍｌ中に再懸濁させた。次に、細胞をチモリアーゼ６
０，０００（マイルス・ラボラトリーズ）の４ｍｇ／ｍ
ｌの溶液５０〜１００μｌと混合し、３０℃で１時間イ
ンキュベートした。次に、得られるスフェロプラストを
１，０００ｇで５〜１０分間遠心分離し、リシスバッフ
ァー［０．１％ＳＤＳ、１０ミリモルトリス−Ｃｌ（ｐ
Ｈ７．４）、５ミリモルＥＤＴＡおよび５０ミリモルＮ
ａＣｌ］５ｍｌ中に懸濁させた。プロテイナーゼＫ［ベ
ーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｈｅｉｍ）］およびＲＮアーゼＡ（シグマ）をそれぞれ
１００μｌ／ｍｌまで加え、その溶液を３７℃で３０分
間インキュベートした。調製試料と等量のＣＩとを静か
に混合することによってＤＮＡを除タンパク質し、その
相を１２，０００ｇで２０分間遠心分離することによっ
て分離した。上部（水性）相を新しい試験管に取出し、
等量のＰＣＩで抽出した。前と同様にその相を分離し、
上部相を、冷１００％エタノールが２〜３容量入ってい
る試験管に入れた。試料を静かに混合し、プラスチック
ロッドにスプールすることによってＤＮＡを採取した。
ＤＮＡをＴＥ緩衝液１ｍｌに速やかに溶解させ、１００
容量のＴＥ緩衝液に対して４℃で一晩中透析した。

【００８３】

【実施例ＶＩ】完全な長さのＰＨＯ１遺伝子の単離 完全ピキア・パストリスＰＨＯ１遺伝子（配列確認番
号：１）を含むプラスミドを単離するために、ＭＣ１０
６１の最初のピキア・パストリスゲノムライブラリー
を、前記に記載した条件下で、ｐＬＰ２４からの６００
ｂｐのＢａｍＨＩ断片を用いてハイブリッド形成させ
た。この方法で５種類の明確なクローンが確認された。
プラスミドＤＮＡをこれらのクローンから調製し、Ｂａ
ｍＨＩで消化し、ニトロセルロースフィルターにブロッ
トし、そして同じ６００ｂｐのプローブとハイブリッド
形成させた。５種類のクローンはそれぞれ２．０ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片を有し、ピキア・パストリスＰＨＯ１遺
伝子を含んでいた。クローンの一つを更に別の分析用に
選択し、ｐＬＰ２４２０と称した。

【００８４】ｐＬＰ２４２０の２．０ｋｂのＢａｍＨＩ
断片を、制限酵素で消化された断片をＭ１３（ニュー・
イングランド・バイオラブズから入手可能）にサブクロ
ーン化したものを配列させる標準ジデオキシ法によって
配列させた。その配列を分析することにより、２．０ｋ
ｂのＢａｍＨＩ断片内に完全に含まれた４６８個のアミ
ノ酸の読み取り枠が示された。

【００８５】

【実施例ＶＩＩ】ＭＢ１０２−２６：ｐＬＰ２４３０−Ｔ１菌株およびＭ
Ｂ１０２−２６：ｐＬＰ２４３０−Ｔ３菌株の発生 ＰＨＯ１遺伝を含む２．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、サ
ッカロミセス・セレビシエーＨＩＳ４遺伝子およびｐＢ
Ｒ３２２配列を含むプラスミドであるｐＹＭ８のＢａｍ
ＨＩ部位に連結させた。［ｐＹＭ８は下記のように調製
することができる。すなわち、ｐＹＡ２（ＮＲＲＬ Ｂ
−１５８７４）１０μｇをＳｐｈＩ／ＴｈａＩで消化
し、３．４ｋｂの断片をゲル精製した。１０μｇのｐＢ
Ｒ３２２をＳｐｈＩ／ＮｒｕＩで消化し、３．９５ｋｂ
の断片をゲル精製した。ＮＲＲＬＢ−１５８７４は１９
８４年８月３１日に米国農務省北部地域研究所に寄託さ
れたものであり、そこから入手可能である。３．９５ｋ
ｂのｐＢＲ３２２断片１００ｎｇと３．４ｋｂのｐＹＡ
２断片２５０ｎｇとを標準条件下で連結させた。正確な
プラスミドを３．１ｋｂのＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ断片基準
で確認し、ｐＨＭ８と称した］。得られるプラスミドを
ｐＬＰ２４３０と称し、サッカロミセス・セレビシエー
ＨＩＳ４遺伝子配列に与えられている偶発的なＡＲＳ機
能（自律的複製配列）によってピキア・パストリスで自
律的に複製するコンピテントであった。 酸ホスファタ
ーゼ活性を欠いているピキア・パストリス菌株であるＧ
Ｓ１９０：ｐＬＰ２４１２（Ｐｈｏ⁻）（実施例ＩＩＩ
を参照されたい）を、ピキア・パストリス菌株ＭＤ１０
０−２０（ｈｉｓ４，Ａｄｅ⁻）と交配した。用いた交
配プロトコルは、本明細書中に参考文献として記述され
る米国特許第４，８１２，４０５号明細書に開示された
ものと同様であった。菌株ＭＤ１００−２０を下記のよ
うに発生させた。すなわち、ピキア・パストリス菌株Ｇ
Ｓ１１５（ｈｉｓ４）ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１の細胞
を菌株ＧＳ２４７（Ａｄｅ⁻）の細胞と一緒に接合体形
成および二倍体化を促進する既知の条件下で混合し（こ
の方法のプロトコルは、本明細書中に参考文献として記
述される米国特許第４，８１２，４０５号明細書で見出
されている）、原栄養性二倍体を選択するためのＹＮＢ
＋デキストロースプレート上で平板培養した。二倍体菌
株をＭＤ１００と称した。ＭＤ１００を、ピキア・パス
トリス二倍体の胞子形成を誘発させる既知の条件下で培
養し（米国特許第４，８１２，４０５号明細書でも開示
されている）、その胞子子孫をＹＮＢデキストロース＋
アデニン＋ヒスチジンプレート上で培養した。個々のコ
ロニーのアデニンまたはヒスチジン補給なしで増殖する
能力を試験した。ヒスチジン補給なしで増殖することが
できるが、アデニン補給なしでは増殖することができな
い菌株を確認し且つＭＤ１００−２０と称した。

【００８６】この交雑からの二倍体菌株であるＭＢ１０
２（Ｐｈｏ^＋／Ｐｈｏ⁻，ＨＩＳ４／ｈｉｓ４，Ａｄｅ
^＋／Ａｄｅ⁻）を胞子形成させて（米国特許第４，８１
２，４０５号明細書）半数体子孫を生じた。これらの子
孫を、ヒスチジンまたはアデニンを補給したまたは補給
しないＬＰ指示プレート上およびＹＮＢデキストロース
プレート上でスクリーンして、ＭＢ１０２−２６（Ｐｈ
ｏ⁻，ｈｉｓ４，Ａｄｅ⁻）菌株を単離した。

【００８７】菌株ＭＢ１０２−２６を、実施例ＩＶに記
載したようにｐＬＰ２４３０を用いて形質転換させた。
Ｈｉｓ^＋形質転換体を選択し且つＬＰ指示プレート上で
酸ホスファターゼ発現についてスクリーンした（実施例
ＩＩＩを参照されたい）。５種類の形質転換体は酸ホス
ファターゼ発現に対して陽性であった。

【００８８】これらの形質転換体の内の二つ、すなわ
ち、ＭＢ１０２−２６：ｐＬＰ２４３０−Ｔ１およびＭ
Ｂ１０２−２６：ｐＬＰ２４３０−Ｔ３の酸ホスファタ
ーゼ発現の適当な調節について分析した。各菌株をＨＰ
またはＬＰ培地でＡ^６００が２．０になるまで２４時間
増殖させた。各培養物からの細胞の酸ホスファターゼ発
現について、Ｐｈｏ⁻表現型を有する非形質転換ＨＩＳ
４細胞（ＭＢ１０２−２８）およびＰｈｏ^＋の野生型表
現型を有するＨＩＳ４細胞（ＭＢ１０２−５１）（表
Ｉ）と比較して分析した［ボスチャン（Ｂｏｓｔｉａ
ｎ）ら、１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，７７，４５０４〜４５０８）。形質転換体ｐＬ
Ｐ２４３０の誘発水準は野生型菌株の水準と実質的に同
一であった。したがって、ｐＬＰ２４３０に挿入された
ＰＨＯ１遺伝子を含む２．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片に
は、完全な酸ホスファターゼコード領域並びに適当なリ
ン酸塩で調節される酸ホスファターゼの発現を与えるの
に十分な配列が含まれた。

【００８９】

【００９０】

【実施例ＶＩＩＩ】インベルターゼの分泌この実施例
で、ＰＨＯ１シグナル配列（配列確認番号：３）は、異
種遺伝子に対して操作可能に結合した場合に機能するこ
とを実証する。サッカロミセス・セレビシエーのＳＵＣ
２遺伝子を含む２．２ｋｂのＳｍａＩＰｖｕＩＩ断片を
ｐＳＥＹＣ３０６から単離し［ジョンソン（Ｊｏｈｎｓ
ｏｎ）ら、Ｃｅｌｌ，４８，８７５（１９８７）］、ｐ
ＡＯ８１０かまたはｐＰＳＶ２１８のＳｍａＩ部位にク
ローン化した（これらの親プラスミドについては実施例
ＸＩおよびＸＩＩを参照されたい）。この方法によりプ
ラスミドｐＡＰＩＮＶ１およびｐＡＰＩＮＶ２がそれぞ
れ生じた。これらはピキア・パストリスＡＯＸ１プロモ
ーターを用いて、ＳＵＣ２構造遺伝子へのＰＨＯ１シグ
ナル配列（配列確認番号：３）からの読み取り枠の転写
を調節する。

【００９１】 プラスミドｐＡＰＩＮＶ１またはｐＡＰＩＮＶ２のそれ
ぞれ１０μｇをＢｇｌＩＩで消化し且つ用いて実施例Ｉ
ＶでのようにＧＳ１１５を形質転換した。ＧＳ１１５：
ｐＡＰＩＮＶ１と称されるｐＡＰＩＮＶ１のＢｇｌＩＩ
断片を含む形質転換体をヒスチジン原栄養株として選択
し、そしてＡＯＸ１遺伝子座での適当な組込みおよび分
断を示すＭｕｔ⁻表現型についてスクリーンした。Ｍｕ
ｔのスクリーンは、グルコース含有培地からのコロニー
をメタノール含有培地へレプリカ培養し且つメタノール
上での増殖速度を評価することによって行われた。メタ
ノール上での遅い増殖はＭｕｔ⁻表現型を示すものであ
った。ＧＳ１１５：ｐＡＰＩＮＶ２と称されるｐＡＰＩ
ＮＶ２のＢｇｌＩＩ断片を含む形質転換体もヒスチジン
原栄養株として選択したが、ＰＨＯ１遺伝子座での適当
な組込みおよび分断を示すＰｈｏｌ⁻表現型についてス
クリーンした（実施例ＩＩＩを参照されたい）。

【００９２】各クラスの形質転換体を同定し、そしてＳ
ＵＣ２遺伝子がその本来のシグナル配列を含み且つＰＨ
Ｏ１シグナル配列を欠いていること以外はｐＡＰＩＮＶ
１と一致する組込まれたプラスミドを含むピキア・パス
トリス菌株ＫＭ７１：ＧＳ１０２（Ｍｕｔ⁻）およびＧ
Ｓ１１５：ＧＳ１０２（Ｍｕｔ^＋）と対比させて、ＹＮ
Ｂ＋２％グリセロール中で培養した。これらの２種類の
菌株は欧州特許第２５６，４２１号明細書に記載されて
いる。更に、ＳＵＣ２配列を欠いていること以外はｐＡ
ＰＩＮＶ２と一致する組込まれたプラスミドを含む菌株
ＫＮ７１：ｐＰＳＶ２１６（Ｍｕｔ⁻）およびＧＳ１１
５：ｐＰＳＶ２１６（Ｍｕｔ^＋）も同時に培養した。

【００９３】各培養物をＹＢＮ＋２％グリセロール中で
Ａ^６００が約３．０になるまで増殖させた。それぞれの
一部分を取出し、滅菌水で洗浄し、そして１０ｍｌずつ
のＹＢＮ＋０．５％ＭｅＯＨ中に再懸濁させた。Ｍｕｔ
^＋の培養物をＡ^６００＝０．０２でおよびＭｕｔ⁻の培
養物をＡ^６００＝０．２で再懸濁させ、３０℃で、およ
そＡ^６００＝０．３〜０．４まで２４時間増殖させた。
この時点で、インベルターゼ活性について約１．０ｍの
ＯＤ^６００が検定された。結果を表ＩＩに示す。

【００９４】 結果により、ＰＨＯ１シグナル配列はＳＵＣ２シグナル
配列と同程度に有効に機能してピキア・パストリスから
のインベルターゼ分泌を促進することが明らかに示され
る。

【００９５】

【実施例ＩＸ】ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性因
子）の分泌この実施例で、ＰＨＯ１シグナル配列（配列
確認番号：３）は、異種遺伝子に対して操作可能に結合
した場合に機能することを実証する。

【００９６】１．ｔＰＡをコードするｃＤＮＡの単離 ボウズ黒色腫ｔＰＡ過発現細胞系であるＡＴＣＣ＃ＣＲ
Ｌ９６０７が、ｃＤＮＡライブラリーを構築するのに用
いられたＲＮＡ源であった。この細胞系は、ｔＰＡ配列
をクローン化する他のもので用いられた［ペニカ（Ｐｅ
ｎｎｉｃａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０１：２１４，１９
８３；エドルンド（Ｅｄｌｕｎｄ）ら、ＰＮＡＳ，８
０：３４９、１９８３；レモント（Ｌｅｍｏｎｔｔ）
ら、ＤＮＡ，４：４１９，１９８５］。ＰｏｌｙＡ＋Ｒ
ＮＡを単離し、概してマニアティスの方法にしたがって
オリゴｄＴプライマーにした［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、１９８２］。ＲＮＡを用いて、市販のｃ
ＤＮＡクローニングキット［アマーシャム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）から入手可能］を用いてｃＤＮＡを製造し、λ
ｇｔｌｌクローニングベクターに挿入した。挿入部分を
含むλｇｔｌｌファージを、市販の包装混合物［ストラ
タジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能］を用
いて大腸菌宿主Ｙ１０８８に感染させた。

【００９７】ライブラリーを三通りに平板培養し、ヒト
ｔＰＡｃＤＮＡの公表された配列から設計された３種類
の異なるオリゴヌクレオチドを用いてプローブした（ペ
ニカら、前記）。ｃＤＮＡの５′部分、中間部分および
３′部分に対応するオリゴヌクレオチドは下記の配列か
ら構成された。

【００９８】 ３種類全部のプローブにハイブリッド形成した５種類の
プラークを確認した。これらのクローンの挿入部分の制
限消化物は、公表された制限パターンに基づいてｔＰＡ
をコードするものとして同定された（ペニカら、前
記）。クローンは存在する５′非コード配列の程度だけ
が異なった。クローン４およびクローン５を、それらに
ＥｃｏＲＩ消化による０．８ｋｂ（５′末端）、０．４
７ｋｂ（中間）および１．３ｋｂ（３′末端）のＤＮＡ
挿入部分が含まれていたので、更に確認するために選択
し、それによって完全な長さのｔ−ＰＡコード配列の存
在が示唆された。クローン４からのＢｇｌＩＩ断片をＢ
ａｍＨＩ切断ｐＵＣ１８にサブロクーン化し、その連結
を大腸菌ＭＣ１０６１細胞に形質転換させた。明確な形
質転換体をＥｃｏＲＩ消化によって確認した。読取りの
方向付け（ｓｅｎｓｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で挿入
部分を有するクローンを、４２０ｂｐ、６２４ｂｐ、７
６０ｂｐおよび２．７ｋｂの断片のＰｓｔＩ制限パター
ンによって確認し且つｐＵＣ１８＃３と称した。反対の
読取り方向付け（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｒｉｅｎｔａｔ
ｉｏｎ）で挿入部分を有するクローンを、４２０ｂｐ、
６２４ｂｐおよび３．４６ｋｂの断片のＰｓｔＩ制限パ
ターンによって確認し且つｐＵＣ１８＃２と称した。挿
入部分は、成熟ｔＰＡの最初のアミノ酸の前の２個のヌ
クレオチドから３′非コード配列の１９７２個のヌクレ
オチドまでをコードしている。

【００９９】２．ベクターｐＴ３７（ＰＨＯ１ｓｓ−ｔ
ＰＡ−ｐＵＣ）の構築 ｐＵ１８＃２からのｔＰＡ挿入をピキア・パストリス発
現プラスミドｐＡＯ８１０にクローン化した。プラスミ
ドｐＡＯ８１０は、ピキア・パストリスＡＯＸ１プロモ
ーター、ピキア・パストリスＰＨＯ１シグナル配列、Ａ
ＯＸ１転写ターミネーター、選択用ピキア・パストリス
ＨＩＳ４遺伝子、複製開始点ｆ１並びに細菌の複製およ
び選択に必要な配列から成る。ｐＡＯ８１０の構築を実
施例ＸＩに記載する。

【０１００】１％アガロースゲル上で予め精製したｔＰ
Ａの５′部分をコードするｐＵＣ１８＃２の１６００ｂ
ｐのＳａｌＩ／ＳａｍＩ断片２μｇを、ＸｈｏＩ／Ｓａ
ｍＩで消化したｐＡＯ８１０の３００ｎｇに連結した。
連結反応を大腸菌ＭＣ１０６１細胞に形質転換させ、ａ
ｍｐＲコロニーを選択した。陽性のものがＰｓｔＩでの
消化による４２０ｂｐ、６２０ｂｐ、２ｋｂおよび６．
３ｋｂの断片のパターンによって確認された。得られる
ベクターをｐＴ１と称した。特定部位の突然変異誘発を
複製開始点ｆ１ベクターのための標準方法にしたがって
行い、成熟ｔＰＡコード配列に対する５′の２個の余分
のヌクレオチドを削除した。突然変異誘発性オリゴヌク
レオチドは配列させると下記であった。

【０１０１】 正確なプラスミドは、ＳａｌＩ／ＳｂａＩで消化したミ
ニプレプ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ）をスクリーニングす
ることによって確認された。元のベクターｐＴ１の制限
パターンは１．２ｋｂ、２．３ｋｂおよび６１６ｋｂで
あった。正確に突然変異が誘発されたプラスミドのパタ
ーンは１．２ｋｂおよび９．８ｋｂであり且つそれをｐ
Ｔ２−３と称した。

【０１０２】ｐＵＣ１８＃３の５０μｇをＳｍａＩ／Ｓ
ａｕ３Ａで消化した。ｔＰＡの３′部分をコードする７
２ｂｐおよび１１８ｂｐの間の３種類のバンド（７５ｂ
ｐ、９０ｂｐ、１１０ｂｐ）を８％ポリアクリルアミド
ゲル上で精製し、０．５μｇのＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ切
断プラスミドｐＴ２−３に連結した。連結を大腸菌ＭＣ
１０６１細胞に形質転換させ、ａｍｐＲコロニーを選択
した。陽性のものがＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩで消化したミ
ニプレプによって確認された。正確なプラスミドは４２
１ｂｐの断片を示した（２２５ｂｐの断片は不正確であ
った）。正確なベクターをｐＴ３７と称した。５′突然
変異誘発は、正確な配列から成ることが示されたが、し
かしながら、配列順序により、プラスミドにはｔＰＡ
３′非コード配列の末端に続くｐＵＣ１８配列が含まれ
ることが示され；プラスミドｐＴ３７は、ｐＵＣ１８か
らのＳａｕ３Ａ断片、位置１８９４〜２００４、すぐに
続くｔ−ＰＡ配列を有することが示された。

【０１０３】プラスミドｐＴ３７の１０μｇをＳｔｕＩ
で消化し且つ用いてピキア・パストリス菌株ＫＭ７１
（ａｏｘ１、ｈｉｓ４）を形質転換した。形質転換体を
ヒスチジン原栄養株について選択した。形質転換体であ
るＫＭ７１：ｐＴ３７を、ＰＨＯ１シグナル配列が本来
のヒトｔＰＡシグナル配列によって複製され且つ３′末
端でのｐＵＣ１８配列が除去されたこと以外はｐＴ３７
とほぼ一致するプラスミド（ｐＴ７）が含まれる菌株Ｋ
Ｍ７１：ｐＴ３７と対比して、ＹＮＢ＋２％グリセロー
ル中で培養した。ｐＴ７の説明を本明細書中下記に記載
する。ＹＮＢ＋２％グリセロール中で増殖する各菌株の
培養物５０ｍｌを１リットルの発酵器中に播種し且つ連
続方式かまたはバッチ供給方式で増殖させた。この実験
の結果を表ＩＩＩに示す。

【０１０４】 この実験の結果により、発酵方式とは無関係に、ＰＨＯ
１シグナル配列（配列確認番号：３）は、ピキア・パス
トリスでのｔＰＡ分泌を促進することでは、本来のシグ
ナル配列よりも有効であったということが示される。

【０１０５】さらに、ミクロエドマン（ｍｉｃｒｏ−Ｅ
ｄｍａｎ）分解分析法により、ＰＨＯ１シグナル配列
（配列確認番号：３）を用いて菌株ＫＭ７１：ｐＴ３か
らの分泌されたｔＰＡである組換え体のＮ末端アミノ酸
配列は、培養されたヒト組織（黒色腫）源から精製され
た本来のｔＰＡに一致した。

【０１０６】３．ｐＴ７（ｔＰＡｓｓ−ｔＰＡ−ｎｏ
ｐＵＣ）の構築 ｐＵＣ１８＃３からの約１００ｂｐのＳｍａＩ／Ｓａｕ
３Ａ断片５μｇを５００ｎｇのＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ切
断ｐＴ１に連結させた。連結反応を大腸菌ＭＣ１０６１
細胞に形質転換させ、ａｍｐＲコロニーを選択した。陽
性のものが、ＡｐａＩ／ＰｖｕＩＩでの消化による２６
０ｂｐのバンドよりもむしろ３６０ｂｐのバンドの存在
によって確認された。変異した３′末端を配列させ、そ
れによって余分なｐＵＣ１８配列を含まない正確な配列
から成ることが示された。このプラスミドをｐＴ４９と
称した。

【０１０７】真のｔＰＡシグナル配列をコードするオリ
ゴヌクレオチドをプラスミドｐＴ４９のＸｂａＩ部位に
加えた後、２種類の突然変異誘発を行って、（１）ｔＰ
Ａシグナル配列と成熟ｔＰＡをコードする配列との間に
残っている配列の余分の８個のヌクレオチドを削除し且
つ（２）ＰＨＯ１シグナル配列を削除した。これらの操
作を下記のように行った。

【０１０８】下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを
合成した（ヌクレオチド１０９個）。

【０１０９】 第二のストランドに必要な相補的オリゴヌクレオチド
を、長さがヌクレオチド３３個、３７個および３９個の
３種類のオリゴヌクレオチドとして合成し、それぞれ下
記の配列から成った。

【０１１０】 完全な長さのオリゴヌクレオチドおよび３種類の相補的
オリゴヌクレオチドにキナーゼを作用させた後、沸騰水
浴中で３分間加熱することによって一緒にアニーリング
し、次に、室温まで徐々に冷却した。アニーリングした
オリゴヌクレオチドを５％ポリアクリルアミドゲルから
分離し且つ単離した。

【０１１１】ＸｂａＩで部分的に線状化したｐＴ４９の
２００ｎｇを、アニーリングした二重鎖オリゴヌクレオ
チド１μｇに連結した。連結反応を大腸菌ＭＣ１０６１
細胞に形質転換させ、ａｍｐＲコロニーを選択した。正
確に変換されたプラスミドを含むクローンを、ＡｓｕＩ
Ｉでの消化による追加の７００ｂｐのバンドによって確
認した。正確なプラスミドをｐＴ５４４と称した。

【０１１２】最初の突然変異誘発を、ｐＴ５４４ＤＮＡ
（５μｇ）および下記の配列を有するオリゴヌクレオチ
ド（１μｇ）を用いる標準ｆ１起点特定部位の突然変異
誘発によって行った。

【０１１３】 正確なプラスミドをＢｇｌＩＩ消化によってスクリーン
した。正確な制限パターン（１．１ｋｂ、２．８ｋｂお
よび５．３ｋｂ）は正確なプラスミドを示すものであ
り、ｐＴ６４と称した（不正確なプラスミドでは２．８
ｋｂおよび６．３ｋｂのバンドのパターンを示した）。

【０１１４】第二回目の突然変異誘発を、プラスミドｐ
Ｔ６４を用いて行ってＰＨＯ１シグナル配列を削除し
た。下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。

【０１１５】 ３μｇのｐＴ６４および前記のオリゴヌクレオチド０．
４μｇで突然変異誘発を行った。ミニプレプをＢｇｌＩ
Ｉによる消化によってスクリーンした。正確なプラスミ
ドを、寸法が１ｋｂ、２．８ｋｂおよび５．３ｋｂの３
種類のＤＮＡ断片によって確認した（不正確なプラスミ
ドでは１ｋｂの代わりに１．１ｋｂの最小バンドが示さ
れた）。突然変異誘発を配列順序によって確認し、正確
なプラスミドをｐＴ７と称した。

【０１１６】

【実施例Ｘ】ｐＡＰＢ１０１：ＰＨＯ１プロモーター
ｌａｃＺ発現プラスミドの構築この実施例で、ＰＨＯ１
プロモーター（または５′調節領域）（配列確認番号：
２）は、異種遺伝子に操作可能に結合した場合に機能す
ることを実証する。ｌａｃＺ含有プラスミドｐＳＡＯＨ
５（ＮＲＲＬ Ｂ １５８６２）１μｇをＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、１０．１ｋｂのベクター断片
を０．８％アガロースゲルから単離した。５μｇのｐＬ
Ｐ２４２０をＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩで消化し、３７
５ｂｐのｐＢＲ３２２ＤＮＡを含む１．６ｋｂの断片
と、ＰＨＯ１プロモーター（配列確認番号：２）を含む
１０７５ｂｐのＰＨＯ１５′フランキングＤＮＡと、１
２３ｂｐのＰＨＯ１コード配列とを１％アガロースゲル
から単離した。ｐＳＡＯＨ５のＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩ
断片１００ｎｇおよびｐＬＰ２４２０の１．６ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ ＢｃｌＩ断片６０ｎｇを、１ミリモルＡＴＰ
およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
から入手可能）１単位を含むリガーゼ緩衝液の混合物２
０μｌ中で連結させた。連結反応混合物を大腸菌ＪＭ１
０３に形質転換させ、形質転換した細胞を、４０μｇ／
ｍｌのＸ ｇａｌを含んだＬＢ Ａｍｐプレート上に平
板培養した。青色に着色したコロニーを選択し且つＬＢ
Ａｍｐ中で増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離した。
ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化し、正確なプ
ラスミドを１４５０ｂｐの断片の放出によって確認し
た。正確なプラスミドをｐＡＰＢ１０１と称した。ピキ
ア・パストリスＰＨＯ１プロモーター因子（配列確認番
号：２）の調節下に置かれた大腸菌ｌａｃＺ遺伝子から
成る発現カセットはｐＡＰＢ１０１に含まれた。

【０１１７】非切断ｐＡＰＢ１０１の１０μｇをＧＳ１
１５スフェロプラストに形質転換させ、ヒスチジン原栄
養株を選択した。１２種類のＨｉｓ^＋コロニーを選択
し、その菌株を高リン酸塩（ＨＰ）液およびＬＰ培地で
増殖させ、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について検
定した。陽性の形質転換菌株を、ＬＰ培地で増殖後のβ
−ガラクトシダーゼ発現およびＨＰ培地中で増殖後のβ
−ガラクトシダーゼ欠損の基準で同定した。β−ガラク
トシダーゼは、ジェイ・エイチ・ミラー（Ｊ．Ｈ．Ｍｉ
ｌｌｅｒ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、コールド・スプリング
・ハーバー・ラブズ、コールドスプリングハーバー、ニ
ューヨーク、１９７２によって検定された。青色コロニ
ーはＬＰ−Ｘ−ｇａｌプレートで見られ、白色コロニー
はＨＰ−Ｘ−ｇａｌプレートで見られた。

【０１１８】

【実施例ＸＩ】下記のプラスミドを本出願の他の実施例
で用いるのに構築した。

【０１１９】１．プラスミドｐＡＯ８１０の構築 Ｍ１３ｍｐ１９ΔＲＩを、ＥｃｏＲＩで１μｇのＭ１３
ｍｐ１９を消化し、クレノウを用いて完成させ、そして
完成した断片をそれ自体で連結させることによって構築
し、その連結を用いて大腸菌ＪＭ１０３細胞を形質転換
し、そしてＤＮＡを単離し且つそれをＥｃｏＲＩで消化
することによって正確なファージを同定した。正確なフ
ァージはＥｃｏＲＩでは切断されず、それをＭ１３ｍｐ
１９ΔＲＩと称した。プラスミドｐＡＯ８０４（その構
築については、参考文献として本明細書中に記述される
ＷＯ８９／０４３２０に記載されている）をＳｓｔＩお
よびＥｃｏＲＶで消化し、約１．２ｋｂの断片を０．８
％アガロースゲルから単離した。（この構築での断片は
全部０．８〜１％アガロースゲルから単離された）。断
片１００ｎｇをＳｓｔＩで消化し且つＳｍａＩたＭ１３
ｍｐ１９ΔＲＩの５００ｎｇに連結した。連結を用いて
大腸菌ＪＭ１０３細胞を形質転換し、ＤＮＡを単離し且
つＳｓｔＩおよびＰｖｕＩＩでそれを消化することによ
って正確なファージを同定した。正確なファージを９５
０ｂｐの断片の存在によって同定し、ｐＰＳＶ１０１と
称した。

【０１２０】１ピコモルのｐＰＳＶ１０１に、下記の配
列を有するオリゴヌクレオチド２０ピコモルを用いて、
インビトロでのオリゴヌクレオチドに向けられた特定部
位の突然変異誘発を行った。

【０１２１】 反応混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０３細胞を形質転換し
た。ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによるミニプレプＤＮ
Ａの消化によって正確なファージを同定し、１．４ｋｂ
および０．５ｋｂのＤＮＡ断片の存在が示された。正確
なファージをｐＰＳＶ１０２と称した。

【０１２２】プラスミドｐＰＳＶ１０２をＥｃｏＲＩで
消化し、８．５ｋｂの断片５００ｎｇを、ピキア・パス
トリスＰＨＯ１シグナル配列（配列確認番号：３）をコ
ードする下記の二重鎖合成ＤＮＡ断片５０ｎｇに対して
下記の最適化したピキア属コドンを用いて連結した。

【０１２３】 連結反応混合物を大腸菌ＣＪ２３６細胞に形質転換さ
せ、正確なファージＤＮＡを、^３２Ｐで標識された酵母
シグナル配列の一つのコードストランドを用いるプラー
クハイブリダイセーションによっておよびＳｓｔＩおよ
びＢａｍＨＩによるハイブリッド形成ＤＮＡの消化によ
って同定し、７００ｂｐの断片が示された。そのプラス
ミドをｐＰＳＶ１０３と称した。

【０１２４】１ピコモルのｐＰＳＶ１０３で、配列 を有する２０ピコモルのオリゴヌクレオチドを用いてイ
ンビトロで突然変異誘発を行った。正確なファージＤＮ
Ａを前記で用いた同じオリゴヌクレオチドによるプラー
クハイブリダイセーションによって同定した。正確なプ
ラスミドをｐＰＳＶ１０４と称した。

【０１２５】プラスミドｐＰＡＯ８１０を、ＨｉｎｄＩ
ＩＩによって１０μｇのｐＰＳＶ１０４を消化し且つ
１．２％アガロースゲルから４００ｂｐのＤＮＡ断片を
単離することによって調製した。この断片５０ｎｇをｐ
ＡＯ８０７（この調製試料は下記に記載される）の０．
８％アガロースゲルから単離される７．９ｋｂのＨｉｎ
ｄＩＩＩ消化生成物２５０ｎｇと連結させた。連結を大
腸菌ＭＣ１０６１細胞に形質転換させ、ａｍｐＲコロニ
ーを選択した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶでの消化に
よる４５０ｂｐのバンドの存在によって正確なプラスミ
ドを同定し、ｐＡＯ８１０と称した。

【０１２６】２．ｐＡＯ８０７の生成 ａ．ｆ１−ｏｒｉＤＮＡの調製 ｆ１バクテリオファージＤＮＡ（５０μｇ）を、５０単
位のＲｓａＩおよびＤｒａＩで（製造者の使用説明書に
したがって）消化してｆ１複製開始点（ｏｒｉ）を含む
４５８ｂｐのＤＮＡ断片を放出させた。消化混合物を等
量のＰＣＩで抽出した後、水性層を等量のＣＩで抽出
し、最後に、水性相のＤＮＡを、ＮａＣｌ濃度を０．２
モルに調整し且つ２．５容量の無水エタノールを加える
ことによって沈殿させた。混合物を氷上（４℃）で１０
分間放置し、そしてミクロ遠心機中４℃、１０，０００
ｇで３０分間遠心分離することによってＤＮＡ沈殿を採
取した。 ＤＮＡペレットを７０％水性エタノールで２
回洗浄した。洗浄したペレットを真空乾燥し且つＴＥ緩
衝液２５μｌに溶解させた。このＤＮＡに１．５％アガ
ロースゲル上の電気泳動を行って、４５８ｂｐのｆ１−
ｏｒｉ断片を含むゲル部分を摘出し、そしてゲル中のＤ
ＮＡをＤＥ８１［ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）］紙上
に電気溶離させ且つ１モルＮａＣｌ中でその紙から溶離
した。ＤＮＡ溶液を前記に詳述したように沈殿させ、そ
のＤＮＡ沈殿をＴＥ緩衝液２５μｌに溶解させた（ｆ１
−ｏｒｉ断片）。

【０１２７】ｂ．ｐＢＲ３２２のＤｒａＩ部位へのｆ１
−ｏｒｉのクローニング ｐＢＲ３２２（２μｇ）を２単位のＤｒａＩで（製造者
の使用説明書にしたがって）部分的に消化した。ＰＣＩ
抽出に続いて前記の段階で詳述したようなＤＮＡの沈殿
によって反応を終結させた。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝
液２０μｌに溶解させた。このＤＮＡの約１００ｎｇ
を、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと一緒に、連結反応用
緩衝液２０μｌ中、１４℃で一晩中インキュベートする
ことによってｆ１−ｏｒｉ断片（段階ａ）１００ｎｇと
連結させた。７０℃まで１０分間加熱することによって
連結反応を終結させた後、それを用いて大腸菌株ＪＭ１
０３を形質転換して、ｐＢＲ３２２のＤｒａＩ部位（３
２３２位および３２５１位のヌクレオチド）にクローン
化したｆ１−ｏｒｉを含むｐＢＲｆ１−ｏｒｉが得られ
た。

【０１２８】ｃ．ｐＡＯ８０７の生成 ｐＢＲｆｌ−ｏｒｉ（１０μｇ）を、それぞれ１０単位
のＰｓｔＩおよびＮｄｅＩを用いて３７℃で４時間消化
した。消化したＤＮＡを、前記の段階１で詳述したよう
に、ＰＣＩで抽出し、沈殿させ、そしてＴＥ緩衝液２５
μｌに溶解させた。この材料に、前記の段階ａで詳述し
たように、１．２％アガロースゲル上の電気泳動を行っ
て、ｆｌ−ｏｒｉを含むＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ断片（約
０．８ｋｂ）を単離し且つＴＥ緩衝液２０μｌに溶解さ
せた。このＤＮＡの約１００ｎｇを、ＰｓｔＩおよびＮ
ｄｅＩで消化され且つホスファターゼで処理された１０
０ｎｇのｐＡＯ８０４と混合した。ｐＡＯ８０４の説明
はＷＯ８９／０４３２０に記載されている。この混合物
を、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと一緒に連結反応用緩
衝液２０μｌ中、１４℃で一晩中インキュベートするこ
とによって連結させた。７０℃まで１０分間加熱するこ
とによって連結反応を終結させた。このＤＮＡを用いて
大腸菌菌株ＪＭ１０３を形質転換してｐＡＯ８０７が得
られた。

【０１２９】

【実施例ＸＩＩ】ｐＰＳＶ２１８の構築 ｐＬＰ２４２０の１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｃｌＩ断
片２００ｎｇと、ｐＰＧ２．５（下記の説明を参照され
たい）の０．８ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片
１００ｎｇと、ｐＵＣ８（ニュー・イングランド・バイ
オラブズ・インコーボレーテッド）の２．６ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片１００ｎｇとを、連結反応
用緩衝液２０μｌ容量、１ｍｍＡＴＰ、Ｔ４リガーゼ１
単位中で三つの連結部分で連結し、大腸菌菌株ＭＣ１０
６１にＡｍｐ耐性について形質転換させた。［プラスミ
ドｐＰＧ２．５は、アルコールオキシダーゼプロモータ
ーを含むｐＢＲ３２２に配置されたｐＰＧ４．０（ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１５８６８）の２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｌＩ断片である］。耐性クローンを、２．４ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ断片が含まれたプラスミドに
ついて分析し、正確なプラスミドをｐＰＳＶ２０１と称
した。ｐＰＳＶ２０１の５０ｎｇをＢａｍＨＩで消化
し、脱リン酸化し、そしてＢａｍＨＩ部位をＢｇｌＩＩ
部位に変換する下記の配列 を有する５０倍モル過剰のオリゴヌクレオチドと連結さ
せた。陽性のクローンを、この基準で確認し、そのプラ
スミドをｐＰＳＶ２０３と称した。ｐＰＳＶ２０３の１
０ｎｇを制限量のＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化し、ク
レノウを用いてブラント末端にした。線状の完全な長さ
のプラスミド断片をゲル精製し且つ１００μｌ容量で自
己連結させた。正確なクローンを、１３５０ｂｐのＢｇ
ｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むプラスミドＤＮＡ基
準で同定し、正確なプラスミドをｐＰＳＶ２１０と称し
た。

【０１３０】ｐＰＬ２４２０の５００ｂｐのＢｇｌＩＩ
−ＢａｍＨＩ断片６０ｎｇを、ＢａｍＨＩで消化したｐ
ＵＣ８の１００ｎｇと連結した。正確なプラスミドを、
４２２ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片基準で同定し、
得られるプラスミドをｐＰＳＶ２０２と称した。ｐＰＳ
Ｖ２０２の５０ｎｇをＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化
し、そしてＢａｍＨＩ部位をＢｇｌＩＩ部位に変換する
下記の配列 を有する５０倍モル過剰のオリゴヌクレオチドと連結さ
せた。正確なプラスミドを、４２２ｂｐのＮｃｏＩ／Ｂ
ｇｌＩＩ断片基準で同定し、ｐＰＳＶ２０４と称した。

【０１３１】ｐＰＳＶ２１０の１０μｇをＢｇｌＩＩお
よびＳａｃＩで消化し、７００ｂｐの断片をゲル精製し
た。この断片２５ｎｇを、ｐＡＯ８１０のゲル精製され
た８２００ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＳａｃＩ断片１００ｎｇ
に連結させた。正確なプラスミドを、７００ｂｐのＢｇ
ｌＩＩ／ＳａｃＩ断片の存在によって確認し、ｐＰＳＶ
２１２と称した。ｐＰＳＶ２１２の１０μｇをＳｐｈＩ
で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（マイアティスらに
よる）を用いてブラント末端にし、ＢｇｌＩＩで部分的
に消化し、そして８００ｂｐの断片をゲル精製した。ｐ
ＰＳＶ２０４の１０μｇをＮｃｏＩで消化し、クレノウ
を用いてブラント末端にし、ＢｇｌＩＩで消化し、そし
て４４０ｂｐの断片をゲル精製した。前記に記載したｐ
ＰＳＶ２１２からの８ｋｂの断片１００ｎｇをｐＰＳＶ
２０４からの４４０ｂｐの断片１５ｎｇに連結させた。
正確なプラスミドを、５５００ｂｐのＢｇｌＩＩ断片基
準で同定し、ｐＰＳＶ２１８と称した。

【０１３２】実施例は、本発明の実施を単に例証するた
めに記載したものであり、いずれの方法でも、発明の範
囲または添付の請求の範囲を制限するように読取るべき
ではない。発明の本質および精神から逸脱しない正当な
変更および修正は、望まれる且つ必要とされる特許権保
護の範囲内であると考えられる。

【０１３３】

【配列表】

（１）一般情報 （ｉ）出願人：リチャード・ジー・バックホルツ（Ｒｉ
ｃｈａｒｄ Ｇ．Ｂｕｃｋｈｏｌｚ） （ｉｉ）発明の名称：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酸ホスファターゼ遺伝子 （ｉｉｉ）配列の数：５ （ｉｖ）宛先： （Ａ）住所：リッチモンド、フィリップス、ヒッチコッ
ク・アンド・アンフレット（ＲＩＣＨＭＮＤ，ＰＨＩＬ
ＬＩＰＳ，ＨＩＴＨＣＯＣＫ ＆ ＵＭＰＨＬＥＴＴ） （Ｂ）地区：私書箱２４４３ （Ｃ）市名：バートルズビル （Ｄ）州名：オクラホマ （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：７４００５ （ｖ）コンピューター読取り形式： （Ａ）中型：小型ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ディスプレイライト（Ｄｉｓｐｌ
ａｙ Ｗｒｉｔｅ）４ （ｖｉ）最近の出願資料 （Ａ）出願番号：０７／６２７，５３９ （Ｂ）出願日：１９９０年１２月１４日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ジャック・イー・フィリップス（Ｊａｃｋ
Ｅ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ） （Ｂ）登録番号：１９，９０３ （Ｃ）照会／事件整理番号：３２４２７ （ｉｘ）通信情報 （Ａ）電話：１−９１８−６６１−０５２０ （２）配列確認番号：１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１９９４ｂｐ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド：一重 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列確認番号：１ （２）配列確認番号：２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４００ｂｐ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド：一重 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列確認番号：２ （２）配列確認番号：３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：６６ｂｐ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド：一重 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列確認番号：３ （２）配列確認番号：４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１３４１ｂｐ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド：一重 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列確認番号：４ （２）配列確認番号：５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１８７ｂｐ （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランド：一重 （Ｄ）位相：線状 （ｉｉ）分子種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列確認番号：５

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ピキア・パストリス酸ホスファターゼ
遺伝子（配列確認番号：１）の制限地図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/19 C12P 21/02 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (26)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐ
   ａｓｔｏｒｉｓ）の酸ホスファターゼ遺伝子（配列確認
   番号：１）を含む単離されたＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 前記のＤＮＡ断片が以下の制限地図 【化１】 を有する請求項１に記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 前記のＤＮＡ断片が下記のヌクレオチド
   配列 【化２】 【化３】 【化４】 を有する請求項１に記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 ピキア・パストリスの酸ホスファターゼ
   ５′調節領域（配列確認番号：２）を含む単離されたＤ
   ＮＡ断片。
5. 【請求項５】 ピキア・パストリスの酸ホスファターゼ
   シグナル配列（配列確認番号：３） 【化５】 を含む単離されたＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】 前記のＤＮＡ断片が、少なくとも１個の
   ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に対して操作
   可能に結合している請求項５に記載のＤＮＡ断片。
7. 【請求項７】 前記の異種ＤＮＡ配列が組織プラスミノ
   ーゲン活性化因子をコードする請求項６に記載のＤＮＡ
   断片。
8. 【請求項８】 タンパク質の分泌を、ピキア・パストリ
   スの酸ホスファターゼ遺伝子由来のシグナル配列（配列
   確認番号：３）の存在によって指示する、真核細胞から
   タンパク質を分泌させる方法。
9. 【請求項９】 前記の真核細胞が酵母細胞である請求項
   ８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記の酵母がピキア・パストリスであ
    る請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記のタンパク質が組織プラスミノー
    ゲン活性化因子である請求項８、９および１０のいずれ
    か１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 ピキア・パストリスの酸ホスファター
    ゼ構造遺伝子（配列確認番号：４）を含む単離されたＤ
    ＮＡ断片。
13. 【請求項１３】 前記のＤＮＡ断片が以下の制限地図 【化６】 を有する請求項１２に記載のＤＮＡ断片。
14. 【請求項１４】 前記のＤＮＡ断片が下記のヌクレオチ
    ド配列（配列確認番号：４） 【化７】 【化８】 【化９】 を有する請求項１２に記載のＤＮＡ断片。
15. 【請求項１５】 ピキア・パストリスの酸ホスファター
    ゼ３′転写終結配列（配列確認番号：５）を含む単離さ
    れたＤＮＡ断片。
16. 【請求項１６】 前記のＤＮＡ断片が以下の制限地図 【化１０】 を有する請求項１５に記載のＤＮＡ断片。
17. 【請求項１７】 前記のＤＮＡ断片が下記のヌクレオチ
    ド配列（配列確認番号：５） 【化１１】 を有する請求項１５に記載のＤＮＡ断片。
18. 【請求項１８】 異種ポリペプチドコードＤＮＡ配列に
    操作可能に結合した、配列確認番号２に記載のピキア・
    パストリス由来の酸ホスファターゼ５′調節領域で形質
    転換された適当な宿主細胞を、リン酸塩濃度が発現をも
    たらす媒質と接触させることを含む、宿主細胞からポリ
    ペプチドを発現させるための方法。
19. 【請求項１９】 前記の宿主細胞がピキア・パストリス
    である請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記の異種ＤＮＡが、それに対して操
    作可能に結合したシグナル配列を更に含む請求項１８ま
    たは１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記のシグナル配列がピキア・パスト
    リスの酸ホスファターゼシグナル配列（配列確認番号：
    ３）である請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 ５′調節領域に対して操作可能に結合
    したピキア・パストリスの酸ホスファターゼシグナル配
    列（配列確認番号：３）を含む単離されたＤＮＡ断片。
23. 【請求項２３】 前記の５′調節領域がピキア・パスト
    リスの酸ホスファターゼ５′調節領域（配列確認番号：
    ２）である請求項２２に記載のＤＮＡ断片。
24. 【請求項２４】 前記の５′調節領域がピキア・パスト
    リスのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）５′調節領
    域である請求項２２に記載のＤＮＡ断片。
25. 【請求項２５】 前記のＤＮＡ断片が少なくとも１個の
    ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列に対して操作
    可能に結合している請求項２２、２３または２４に記載
    のＤＮＡ断片。
26. 【請求項２６】 前記の異種ＤＮＡが組織プラスミノー
    ゲン活性化因子をコードする請求項２５に記載のＤＮＡ
    断片。