FI113474B - Pichia pastoris-hiivan happaman fosfataasin geenin DNA-kappale - Google Patents

Description

113474

Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenin DNA-kappale Tämä hakemus on jakamalla erotettu kantahakemuksesta FI-915893.

5 Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-biotekniikan alaan, jossa käytetään hyväksi hiivaisäntäjärjestelmiä ja ilmentämisvektoreita. Keksinnön eräs piirre kohdistuu uusiin DNA-kappaleisiin, jotka sisältävät Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenin (SEQ ID NO:l) osittain. Edelleen, keksinnön eräs muu piirre koh-10 distuu mainittujen DNA-kappaleiden käyttöön heterologisten proteiinien erittämisen helpottamiseksi hiivassa.

Sen ansiosta, että yhdistelmä-DNA-biotekniikka on kehittynyt viime vuosina, mikro-organismien avulla voidaan tuottaa hallitusti hyvin erilaisia käyttökelpoisia poly-15 peptidejä. Monia polypeptidejä, esimerkiksi ihmisen kasvuhormonia, leukosyytti-interferoneja, ihmisen insuliinia sekä ihmisen proinsuliinia on jo tuotettu erilaisilla mikro-organismeilla. Tällä hetkellä jo käytettävissä olevien tekniikoiden jatkuvan soveltamisen odotetaan johtavan monien muiden käyttökelpoisten polypeptidituot-teiden tuotannon onnistumiseen.

20

Yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytetyt perustekniikat ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Elementeistä, joiden läsnäolo on toivottavaa yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käytäntöön sovellettaessa, voidaan mainita seuraavat, niihin kuitenkaan rajoittumatta: 25 (1) geeni, joka koodaa yhtä tai useampaa toivottua polypeptidiä ja joka on liitty- : nyt toimivasti sopiviin säätelysekvensseihin, jotka ovat välttämättömiä geenin : ilmentymiselle isäntäorganismissa; : (2) vektori, johon tämä geeni voidaan istuttaa; (3) sopiva isäntäorganismi, johon tätä geeniä kantava vektori voidaan transfor-’: 30 moida; ’; (4) mikäli heterologisen proteiinin erittyminen on toivottavaa, signaalisekvenssi, joka kykenee ohjaamaan heterologisen proteiinin erityspolulle isäntäsolussa, • · · ’ ja edelleen solusta ulos; ' ’ : (5) transformointijärjestelmä; sekä 35 (6) menetelmä transformanttien valikoimiseksi.

Yhdistelmägeenimuodosteet voidaan suunnitella siten, että yhdistelmäproteiini kulkee isännän erityspolkua pitkin ja erittyy kasvualustaan. Erittyminen on yhdistelmä- 11347'' 2 DNA-teknisen ilmentymisen toivottu tapa useista syistä. Ensinnäkin, eräillä hetero-logisilla proteiineilla on toksista vaikutusta isäntäorganismiin. Kun tällaiset hetero-logiset geenituotteet erittyvät, eivätkä keräänny isäntään, niin tällöin ne vähemmän todennäköisesti häiritsevät solun normaalitoimintoja. Toiseksi, eräät proteiinit, jotka 5 ovat inaktiivisia solun sisällä tuotettuina, ovat aktiivisia erittyneinä. Kolmanneksi, erittyminen alustaan tekee tarpeettomaksi isäntäsolujen rikkomisen tuotteen talteen-saamiseksi. Tuotteen puhdistaminen on paljon helpompaa ja halvempaa, kun tuote on läsnä kasvualustassa. Ja neljänneksi, koska yhdistelmä-DNA-tekninen tuote on läsnä elatusalustassa, niin toivottua tuotetta voidaan poistaa jatkuvasti ja alustaa 10 voidaan kierrättää.

Useimmat erittyvät proteiinit ilmentyvät alunperin solun sisällä esiasteena tai esipro-teiinimuodossa, joka sisältää aminopäätteeseen liittyneen, signaalipeptidinä tunnetun jatkeen. Tällä signaalipeptidillä on olennainen tehtävä siihen liittyneen polypeptidin 15 kuljettamiseksi solun rajakalvoihin ja/tai niiden läpi. Sitten signaalipeptidaasi pilkkoo signaalipeptidin proteolyyttisesti erittymisen aikana tai sen jälkeen, jolloin saadaan täysin kehittynyt proteiinituote.

Heterologisen tai vieraan proteiinin erittyminen voidaan saada aikaan liittämällä he-20 terologista DNA.ta oleva koodaava sekvenssi signaalipeptidiä koodaavaan DNA:han. Toivottavaa olisi kyetä eristämään tätä signaalipeptidiä koodaava signaa-lisekvenssi, mikä helpottaisi erittämistä.

Signaalisekvenssit ovat erityisen käyttökelpoisia muodostettaessa ilmentämisvekto-: 25 reita. Tällaisten vektoreiden käyttö tekisi mahdolliseksi sopivien isäntäsolujen trans- : formoinnin siten, että ne tuottaisivat ja erittäisivät heterologisia geenituotteita. Esi- : : merkkeinä johtosekvensseistä, joita on käytetty menestyksellisesti yhdistelmä-DNA- • teknisten proteiinien erittämiseen hiivaisännistä, voidaan mainita johtosekvenssit, jotka ovat peräisin Saccharomyces cerevisiae -hiivan alfa-parittelutekijän geenistä, 30 a-parittelutekijän geenistä sekä tappajatoksiinin geenistä. Alalla ei olla kuvattu sig- ·. naalisekvenssin eristämistä metylotrofisesta hiivasta, kuten Pichia pastoris -hiivasta. 1 · - ’ On tarkoituksenmukaista, että tällaisissa vektoreissa heterologisten geenituotteiden • : ilmentymisen säätelemiseksi käytetty promoottori on signaalisekvenssiin luontaisesti 35 liittynyt promoottori. Erityisen edullista olisi se, että signaalisekvenssiin luontaisesti .; liittynyt promoottori saisi aikaan tehokasta DNA-kopioitumista ja reagoisi ulkoisiin ympäristöärsykkeisiin. Esimerkkinä tällaisesta promoottorista voidaan mainita Pichia pastoris-hiivan happaman fosfataasin (PHOl) geenin (SEQ ID NO:2) 5'- 113474 3 säätelyalue, joka kopioituu tehokkaasti, kun alustassa ei ole läsnä fosfaattia, ja jota alustassa läsnä oleva fosfaatti tukahduttaa.

Usein on toivottavaa transformoida Pichia pastoris -isäntä sellaisella yhdistelmä-5 DNA-muodosteella, joka yhdentyy täsmälleen tiettyyn asemaan Pichia pastoris -hiivan perimässä. 5'- ja 3'-sekvenssit, jotka reunustavat Pichia pastoris PHOl -geeniä ja jotka tunnetaan myös ensimmäisenä ja toisena istutettavana DNA-kappaleena, vastaavasti, käytetään ilmentämisvektoreissa yhdistelmä-DNA-sekvens-sien yhdentymisen ohjaamiseksi PHOl-sijaintikohtaan. Kyky yhdentää yhdistelmä-10 DNA-sekvenssejä PHOl-kohtaan on edullista ainakin kahdesta syystä, jotka ovat: 1) PHOl-sijaintikohdassa tai Pichia-hiivan muussa sijaintikohdassa samanlaisten tai erilaisten ilmentämiskasettien moninkertaisia kopioita käsittävien Pichia pastoris -ilmentämiskantojen kehittäminen; tai 2) yhden tai useamman ilmentämiskasetin stabiili yhdentäminen vain PHOl-sijaintikohtaan isäntänä käytetyssä Pichia pastoris 15 -kannassa, jossa olennaisen geenin tai metanolimetaboliareittiin kuuluvan geenin rikkoutuminen on epätoivottavaa.

Soluissa, joiden PHOl-geeni on rikottu, todetaan samalla happaman fosfataasient-syymin aktiivisuuden häviäminen. Pho'-fenotyyppi, joka osoittaa PHOl-geenin rik-20 koutumisen, voidaan seuloa maljaamalla solut indikaattorimaljoille, joissa fosfaatti-pitoisuus on pieni, ja antamalla pesäkkeiden kasvaa yön yli. Pesäkkeiden, joissa PHOl-geeni on rikkoutunut, ovat valkoisia, kun taas ne pesäkkeet, joissa PHOl-geeni on ehyt, ovat vihreitä. Tämä kolorimetrinen seulonta on nopea ja helppo me-; ’ netelmä sellaisten solujen ilmaisemiseksi, joissa soluissa ilmentämiskasetit ovat yh- ; 25 dentyneet oikealla tavalla PHOl-sijaintikohtaan sen rikkoen.

• Niinpä alan merkittävä edistysaskel olisi saada eristetyksi sellainen signaalisekvens- si, joka helpottaisi proteiinien erittymistä isäntäsolusta.

• ‘: 30 Lisäksi olisi edullista saada eristetyksi sellainen 5 '-säätelyalue, joka johtaisi tehok- » ' ‘. kaaseen DNA-kopioitumiseen ja joka reagoisi ulkoisille ympäristöärsykkeille. Tällä ; I % hetkellä alalla ei tunneta mitään sellaista 5'-säätelyaluetta, joka kopioituisi tehok- • · ·' kaasti sen seurauksena, ettei alustassa ole läsnä fosfaattia, ja jota voitaisiin käyttää ‘ ‘ erittäin tuotteliaassa fermentointihiivassa Pichia pastoris.

:1· 35 I » 1 » .,.; Näin ollen oheisen keksinnön tavoitteena on saada aikaan signaalisekvenssi, joka helpottaa proteiinien erittymistä soluista.

11347·' 4

Keksinnön tavoitteena on myös saada aikaan 5'-säätelyalue, joka kopioituu fosfaatin puuttumisen seurauksena.

Oheisen keksinnön muut piirteet, tavoitteet ja edut ovat ilmeisiä seuraavat kuvauk-5 sen, esimerkkien ja patenttivaatimusten perusteella. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Oheisen keksinnön mukaisesti aikaan saadaan uusi DNA-kappale, joka käsittää sig-naalisekvenssin Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenistä (SEQ ID 10 NO:3), jossa mainittu DNA-kappale on toiminnallisesti kytketty heterologiseen DNA-sekvenssiin, joka koodaa ainakin yhtä polypeptidiä, joka polypeptidi ei ole kudosplasminogeeniaktivaattori (tPA) tai invertaasi ja joka sekvenssi helpottaa proteiinien erittymistä soluista.

15 Keksinnön erään toisen piirteen mukaisesti aikaan saadaan uusi DNA-kappale, joka käsittää Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin 5'-säätelyalueen (SEQ ID NO:2), jossa mainittu DNA-kappale on toiminnallisesti kytketty heterologiseen DNA-sekvenssiin, joka koodaa ainakin yhtä polypeptidiä, joka polypeptidi ei ole kudosplasminogeeniaktivaattori (tPA) tai invertaasi.

20

Kuvio 1 esittää Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenin (SEQ ID NO:l) restriktiokarttaa.

Oheisessa keksinnössä saadaan aikaan uudet eristetyt DNA-kappaleet, jotka käsittä-25 vät happaman fosfataasin geenin promoottorin (tai 5'-säätelyalueen) ja signaalisek-': venssin.

* » :: · Hapan fosfataasi (AP) on solun ulkopuolinen entsyymi, jota Pichia pastoris -hiiva sekä muut hiivat erittävät olosuhteissa, joista epäorgaaninen fosfaatti alkaa ehtyä. 30 Tämä erittynyt hapan fosfataasi katalysoi fosfaatin poistumista orgaanisista subst-.1 ‘ . raateista, jolloin fosfaattia saadaan vapautumaan solun kasvua ja elossapysymistä ,:. varten.

‘ ‘ Hapanta fosfaasia koodaava geeni on eristetty ja sitä on tutkittu monissa hiivalajeis- 35 sa, ja happaman fosfataasin geenin ilmentymisen säädeltävä luonne on kyetty pai- ....: kallistamaan happaman fosfataasin promoottorielementtiin. Olosuhteissa, joissa epä orgaanisen fosfaatin pitoisuus alustassa on pieni, happaman fosfataasin promoottori (tai 5'-säätelyalue) "käynnistyy", happaman fosfataasin geeni kopioituu ja sitten siitä 11347/’ 5 saadaan luennalla hapan fosfataasientsyymi. Tämä juuri syntetoitunut hapan fosfa-taasientsyymi vapauttaa fosfaattia orgaanisista substraateista, jolloin fosfaattia saadaan solun käyttöön. Tämän seurausta oleva fosfaattipitoisuuden suureneminen moduloi happaman fosfataasin promoottoria, johtaen happaman fosfataasin geenin vä-5 häisempään kopioitumiseen samalla kun happaman fosfataasiproteiinin tarve pienenee. Täten happaman fosfataasin promoottoria voidaan indusoida tai tukahduttaa vastaavasti pienellä tai suurella fosfaattipitoisuudella. Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin promoottorin tunnistaminen ja eristäminen on merkittävää. Koska happaman fosfataasin ilmentämisen säätely vaihtelee niiden hiivalajien keskuudessa, 10 joissa lajeissa tätä ilmentymistä on analysoitu, niin on odotettavaa, että Pichia pastoris -hiivassa havaittu happaman fosfataasin ilmentymisen tiukka säätely riippuu homologisten promoottorisekvenssien saatavuudesta ja käytöstä.

Pichia pastoris -hiivan PHOl-geenin signaalisekvenssin (SEQ ID NO: 3) tunnista-15 minen ja eristäminen on, sen lisäksi, että se on ensimmäinen Pichia pastoris -geenistä eristetty signaalisekvenssi, sikäli merkittävää, että se on ensimmäinen me-tylotrofisesta hiivasta eristetty signaalisekvenssi. Se on todettu yhtä hyväksi tai paremmaksi kuin geenin luontainen signaalisekvenssi, esimerkiksi tPA-geenistä (tPA = kudoksen plasminogeeniaktivaattori) tai invertaasigeenistä peräisin oleva sig-20 naalipeptidi, ajatellen kykyä ohjata heterologisten proteiinien kuten tPA:n tai inver-taasin erittymistä Pichia pastoris -hiivasta.

Usein on toivottavaa yhdentää yhdistelmä-DNA-tekniset ilmentämisvektorit isännän perimään sen sijaan, että ne jätettäisiin autonomisesti replikoituviksi elementeiksi. 25 Yhdennetyt vektorit ovat merkittävästi stabiilimpia kuin autonomiset vektorit, ja ne •: ovat edullisia oheisen keksinnön käytännön sovelutuksissa. Erityisen edullisia ovat : lineaariset, kohtaspesifiset yhdennetyt vektorit, joita on kuvattu US-patenttijulkai- sussa 4 882 279, joka liitetään oheen tällä viittauksella. Tällaiset vektorit käsittävät peräkkäin vähintään 1) ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen; 2) valikoitavan '. ‘; 30 merkitsingeenin; sekä 3) toisen istutettavan DNA-kappaleen.

* ] Ensimmäinen ja toinen istutettava DNA-kappale ovat kumpikin vähintään noin 200 nukleotidin pituisia, ja niissä on nukleotidisekvenssejä, jotka ovat homologisia * transformoitavan lajin perimä-DNA:n osien kanssa. Yhdentävän vektorin eri kom-:’.i# 35 ponentit sijaitsevat peräkkäin muodostaen lineaarisen DNA-kappaleen siten, että il- mentämiskasetti sekä valikoitava merkitsingeeni sijaitsevat ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen 3’-pään ja toisen istutettavan DNA-kappaleen 5'-pään välissä. Ensimmäinen ja toinen istutettava DNA-kappale ovat suuntautuneet toisiinsa näh- 6 115474 den tässä peräkkäisessä lineaarisessa kappaleessa samalla tavalla, kuin ne ovat suuntautuneet lähtöperimässä.

Ensimmäisenä ja toisena istutettavana DNA-kappaleena käyttökelpoisia nukleoti-5 disekvenssejä ovat sellaiset nukleotidisekvenssit, jotka ovat homologisia sen luonnollisen perimäkohdan, jossa perimämuokkauksen on tarkoitus tapahtua, erillisten osien kanssa. Täten, esimerkiksi, jos perimämuokkauksen on tarkoitus tapahtua happaman fosfataasin geenin sijaintikohdassa, niin tällöin käytettyjen ensimmäisen ja toisen istutettavan DNA-kappaleen on oltava sekvenssejä, jotka ovat homologisia 10 hapaman fosfataasin geenin sijaintikohdan erillisten osien kanssa. Perimämuokkauksen toteuttamiseksi tässä lineaarisessa kappaleessa näiden kahden istutettavan DNA-kappaleen on suuntauduttava toistensa suhteen samalla suhteellisella tavalla kuin lähtöperimässä. Esimerkkeinä nukleotidisekvensseistä, joita voidaan käyttää ensimmäisenä ja toisena istutettavana DNA-kappaleena, ovat happaman fosfataasin 15 PHOl-geenin, alkoholioksidaasin AOX1 -geenin, histidinoli-dehydrogenaasin HIS4-geenin sekä dihydroksiasetoni-syntetaasin DHAS-geenin joukosta valitut nukleotidisekvenssit.

Ensimmäinen istutettava DNA-kappale voi sisältää toimintakykyisen säätelyalueen, 20 joka voi käsittää ilmentämiskasetissa käytetyn säätelyalueen. Tämän ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen käyttö ilmentämiskasetin säätelyalueena on keksinnön edullinen suoritusmuoto. Istutuskohta tai -kohdat sekä 3'-päättäjäsekvenssi voidaan valinnaisesti sijoittaa välittömästi 3' ensimmäiseen istutettavaan DNA-kappaleeseen ; nähden. Lineaarisen, kohtaspesifisen yhdentävän vektorin tähän konformaatioon liit- ; 25 tyvänä lisäetuna on se, että aikaan saadaan valmis kohta rakennegeenin istuttami- » ': seksi tarvitsematta lisätä yhteensopivaa 3'-päättäjäsekvenssiä.

* : DNA-kappaleeseen, jota käytetään isäntäkannan transformointiin, on myös sisälly tettävä vähintään yksi valikoitava merkitsingeeni. Se helpottaa niiden organismien, · ’: 30 joihin transformoiva DNA on sisältynyt, valikointia ja eristämistä. Tämä merkitsin- ’': geeni saa transformoidussa organismissa aikaan sellaisen fenotyyppisen piirteen, jo ta isännällä ei ollut, ja josta esimerkkinä voidaan mainita sellaisen erityisen aminohapon, jonka biosynteettinen polku on puutteellinen transformoimattomassa isännässä, tuotantokyvyn palautuminen tai antibiootin vastustuskyky tai muu vastaava.

• ‘ . 35 Valikoitava merkitsingeeni voidaan valita esimerkiksi Pichia pastoris- ja Saccharo- myces cerevisiae -hiivasta peräisin olevan HIS4-geenin ja ARG4-geenin, Sac-charomyces cerevisiae -hiivasta peräisin olevan invertaasigeenin (SUC2) sekä E. co- 113474 7 li -bakteerin siirrettävistä elementeistä Tn601 tai Tn903 peräisin olevan, kanamysii-nin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin joukosta.

Mikäli ensimmäinen istutettava DNA-kappale ei sisällä säätelyaluetta, niin sopiva 5 säätelyalue täytyy istuttaa toimivasti kytkeytyneenä rakennegeeniin toimintakykyisen ilmentämiskasetin aikaansaamiseksi. Samoin, mikäli istutuskohta ei käsitä täydellisen ilmentämiskasetin edellyttämää 3'-päättäjäsekvenssiä, niin tällöin 3'-päättä-jäsekvenssi on kytkettävä toimivasti istutettavaan rakennegeeniin.

10 On tärkeätä, että yhdentyminen tapahtuu perimän sellaisessa asemassa, joka ei häiritse isäntäsolua. Yllättävä havainto oli se, ettei yhdistelmä-DNA-teknisen ilmentä-mismuodosteen yhdentäminen Pichia pastoris-hiivan happaman fosfataasin geenin sijaintipaikkaan (PHOl) ollut haitallista Pichia-isännälle, vaan johti yhdistelmä-DNA-sekvenssien pysyvään yhdentymiseen. PHOl-sijaintikohtaan kohdistettu yh-15 dentäminen toteutetaan käyttämällä yhdistelmä-DNA-teknisissä vektoreissa Pichia pastoris -hiivan PHOl-geeniä reunustavia 5'- ja 3'-sekvenssejä (joita kutsutaan myös ensimmäiseksi ja toiseksi istutettavaksi DNA-kappaleeksi).

Toisena havaintona oli menetelmä transformoitujen solujen seulomiseksi siten, että 20 kyettiin tunnistamaan ne solut, joihin ilmentämisvektorin sekvenssit olivat yhdentyneet PHOl-sijaintikohtan rikkoen. Niissä soluissa, joissa PHOl-geeni oli rikkoutunut, happaman fosfataasientsyymin aktiivisuus oli samalla menetetty. Pho -fenotyyp-% pi, joka osoittaa PHOl-geenin rikkoutumisen, voidaan seuloa maljaamalla solut in- , ; dikaattorimaljoille, joissa fosfaattipitoisuus on pieni, ja antamalla pesäkkeiden kas- : ; 25 vaa yön yli. Ne pesäkkeet, joissa PHOl-geeni on rikkoutunut, ovat valkoisia, kun '· ': taas ne pesäkkeet, joissa PHOl-geeni on ehyt, ovat vihreitä. Tämä kolorimetrinen • seulonta on nopea ja vaivaton menetelmä niiden solujen ilmaisemiseksi, joihin so luihin ilmentämiskasetit ovat yhdentyneet oikealla tavalla PHO 1 -sijaintikohtaan.

·'*: 30 Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenin (SEQ ID NO.l) osittainen re- ;"·; striktiokartta on esitetty kuviossa 1. Tämän geenin tunnusomaisia piirteitä on ha- .:, vainnollistettu edelleen nukleotidisekvenssillä, joka on esitetty taulukossa 1.

‘ * Oheisessa keksinnössä saadaan aikaan uudet DNA-kappaleet, jotka käsittävät Pichia 35 pastoris-hiivan happaman fosfataasin 5'-säätelyalueen (SEQ ID NO:2) ja signaali-....: sekvenssin (SEQ ID NO:3).

g 1 1347/'

Seuraavissa taulukoissa on esitetty Pichia pastoris-hiivan happaman fosfataasin geenin (SEQ ID NO:l) sekä siitä peräisin olevien kappaleiden sekvenssit.

Taulukko 1 5 Happaman fosfataasin geeni SEQ ID NO:1:

BamHI -390 -370 -350

GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC

-330 -310 -290

ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA

-270 -250 -230

AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC

-210 -190 -170

TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG

-150 -130 -110

TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG

-90 -70 -50

TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA

-30 -10 10 acttgtacaacgaccaataagtctttcaaggcatcagacatgttttctcctattctaagt ”, MetPheSerProlleLeuSer » » » ' ;* ; 30 50 70 •. i ctggaaattattctcgctttggctactctccaatcagtctttgcggttgagttgcagcac •> LeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlaValGluLeuGlnHis * · • *’ * 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG • >, ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu i · 150 170 190

; * AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG

ArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu :··: 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA 1’ *.. SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg • 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 9 1 1347'' 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGInGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGInGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850

,! TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA

,, * TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspVaILeuSerArg i I * : 870 890 910

' ·, i GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC

;GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn • · 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGlnLeuLeu I V 990 1010 1030

. ’' *; GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC

Ί' GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr » ♦ · » · ’···* 1050 1070 1090

•: · ·! GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC

. AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp

t I

: 1110 1130 Ncol

: : CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG

GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 113474 ίο 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu 1410 1430 1450 TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA SerEnd 1470 1490 1510

ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA

1530 1550 1570

ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BaroHI

GTTCAATGGATCC

TAULUKKO 2 5'-säätelyalue SEQ ID NO:2: • ·. BamHI -390 -370 -350

:' ; GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC

/ -330 -310 -290

: ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA

» -270 -250 -230

AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC

-210 -190 -170

1. TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG

-150 -130 -110

• ·' TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG

-90 -70 -50

>’ .. TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA

-30 -lo

ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC

π 11347- TAULUKKO 3 Signaalisekvenssi SEQ ID NO;3: 10 ATGTTTTCTCCTATTCTAAGT PH01 signaalisekvenssi-> MetPheSerProlleLeuSer 30 50

CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCG

LeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAla TAULUKKO 4

Happaman fosfataasin rakennegeeni SEQ ID NO:4: 70 GTTGAGTTGCAGCAC Va1GluLeuGInHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu ! 210 230 250

* * TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA

;SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla * 330 350 370

; ‘ _ [: GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT

AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430

':‘: GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT

,,1 AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla • » · 450 470 490

* ‘ TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA

PheAspPheG lyThrThrLeuArgG luArgTyrG luH IsLeu 1 leAsnAsnSerG luG lu 11347^ 12 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgG lyG luS erSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr > » • ’ 1050 1070 1090

1. ί GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC

.. AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulloValProMetGlyAlaArgLeu ; 1170 1190 1210

.‘. CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC

LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluG lyGluGl\iLysTyrTyrValArgThrlle I i 1 » » 1230 1250 1270

! ·:1: CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG

LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro t · * · • I » » 11347/' 13 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390

5 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG

CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu

TCATAA

SerEnd 10 TAULUKKO 5 3' kopioitumisen päättäjäketju SEQ IP NO:5: ^ 1410 1430 1450

AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA

1470 1490 1510

ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA

1530 1550 1570

20 ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BamHI

GTTCAATGGATCC 1 : 25 ; ; Happaman fosfataasin geeni otetaan talteen Pichia pastoris -hiivan, esimerkiksi

Pichia pastoris NRRL Y-l 1430 -kannan viljelmistä menetelmillä, jotka on kuvattu ::: seuraavissa esimerkeissä. Yleisessä menetelmässä Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenin (SEQ ID NO:l) talteenottamiseksi käytetään happaman fosfataa-30 sin koetinta, esimerkiksi seuraavissa esimerkeissä kuvattuja, fosfaattipitoisuudeltaan pieniä koettimia (low phosphate probes; LP-koettimet) Pichia pastoris DNA-kir-- jaston seulomiseen. Myös muita koettimia voitaisiin valita tai syntetoida taulukossa 1 esitetyn sekvenssin perusteella. Koettimien hybridisoiminen voidaan toteuttaa mil-:: lä tahansa, alan asiantuntijalle tutulla toimenpiteellä. Pichia pastoris -kirjastoja voi- 35 daan valmistaa alalla tunnetuilla tekniikoilla, mukaan lukien menetelmä, joka on kuvattu julkaisussa Cregg et ai. (1985), Mol. Cell Bio., 5, 3376-3385, tähän kuiten-* . kaan rajoittumatta.

11347/' 14

Vaihtoehtoisesti, happaman fosfataasin 5-säätelyalue (SEQ ID NO:2), signaalisek-venssi (SEQ ID NO:3), rakennegeeni (SEQ ID NO:4) sekä 3'-säätelyalue (SEQ ID N0:5) voidaan saada syntetoimalla sopiva, taulukoissa 1-5 määritelty sekvenssi käyttäen tunnettuja entsymaattisia tai kemiallisia menetelmiä. Näistä sopivista me-5 netelmistä voidaan mainita fosfotriesteri-, fosfiitti- tai syanoetyylifosforamidiittike-miaan perustuvat kemialliset menetelmät, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

Alan asiantuntijoille on myös ilmeistä, että Pichia pastoris -hiivan eristetyt happaman fosfataasin 5'-säätelyalue (SEQ ID NO:2), signaalisekvenssi (SEQ ID NO:3), 10 rakennegeeni (SEQ ID NO:4) ja 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssi (SEQ ID NO:5) voivat sisältää de minimis lukumäärän nukleotidieroja klonaalisen vaihtelun tai tapahtuneiden sekvenssivirheiden seurauksena Pichia pastoris -hiivasta myöhemmin eristettyyn happaman fosfataasin 5'-säätelyalueeseen, signaalisekvenssiin, rakenne-geeniin ja 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssiin verrattuna.

15

Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin 5'-säätelyaluetta (SEQ ID NO:2), sig-naalisekvenssiä (SEQ ID NO:3), rakennegeeniä (SEQ ID NO:4) ja 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssiä (SEQ ID NO:5) voidaan myös muokata esimerkiksi lisäämällä kytkijä-DNA tai toteuttamalla mutageneesi (esimerkiksi M13-mutageneesi) restrik-20 tiokohtien ja muiden vastaavien aikaansaamiseksi tai poistamiseksi.

Kun Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geeni on saatu talteen, sitä voi- daan ylläpitää tai replikoida eukaryoottisissa tai prokaryoottisissa plasmidi-isäntä- ; järjestelmissä, esimerkiksi E. coli -bakteerissa säilytetyssä plasmidissa pBR322, tai ; 25 missä tahansa sopivassa, alalla tunnetussa järjestelmässä.

• *

• I

Alan asiantuntijoille on myös selvää, että käytettyyn vektoriin voidaan sisällyttää » t monia muita DNA-sekvenssejä, esimerkiksi bakteeriperäistä plasmidi-DNA:ta, eri- * · ·' ’ laisia merkitsingeenejä, bakteriofagi-DNA:ta, autonomisesti replikoituvia sekvens- 30 sejä ja sentromeerista DNA:ta, vain muutama käyttökelpoinen esimerkki mainiten.

I f I I *

Happaman fosfataasin 5'-säätelyalue (SEQ ID NO:2) sisältyy tähän DNA-kappalee-,··. seen alkaen nukleotidistä -399 ja päättyen noin nukleotidiin 0, kuten kuviosta 1 ja taulukosta 2 nähdään. Tämä kappale kykenee toteuttamaan DNA:n kopioitumisen » · . 35 RNA:ksi vähintään yhtä polypeptidiä koodaavan heterologisen DNA-ketjun 5'-pää- : ’ · * hän sijoitettuna ja toimivasti liitettynä.

11347·'’ 15

Ohessa kuvatun happaman fosfataasin 5'-säätelyalueen (SEQ ID NO:2) hyväksikäyttöä varten kuviossa 1 ja taulukossa 2 kuvattu kappale voidaan liittää toimivasti vähintään yhtä polypeptidiä koodaaviin heterologisiin DNA-ketjuihin. Oheisessa kuvauksessa heterologiset DNA-sekvenssit ovat sellaisten DNA-sekvenssien yhdistel-5 miä, joita ei esiinny luonnossa isännässä eikä mainitun säätelyalueen yhteydessä. Sopivista, vähintään yhtä polypeptidiä koodaavista heterologisista DNA-sekvens-seistä, jotka voitaisiin liittää toimivasti happaman fosfataasin 5'-säätelyalueeseen (SEQ ID NO:2), voidaan mainita kudoksen plasminogeeniaktivaattori, ihmisen seerumin albumiini ja invertaasi, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

10

Oheisessa keksinnössä käytettyjen heterologisten DNA-sekvenssien tulisi sisältää 5' ATG-aloituskodoni, 3'-pysäytyskodoni ja ne voivat lisäksi sisältää nukleotidiketjuja, joiden tehtävänä on stabiloida mRNA tai ohjata polyadenylaatiota.

15 Yhdistelmä, jossa happaman fosfataasin 5'-säätelyalue (SEQ ID NO:2) on yhdistetty toimivasti heterologiseen DNA-sekvenssiin, voidaan istuttaa sopivaan vektoriin. Lukuisat hiivavektori-isäntä-yhdistelmät ovat mahdollisia ja tuttuja alan asiantuntijalle. Läsnä voi myös olla sellaisia ylimääräisiä sekvenssejä, kuten merkitsingeene-jä tai muita sellaisia sekvenssejä, joiden ansiosta vektori kykenee kasvumonistumi-20 seen ja nopeaan lisääntymiseen bakteereissa tai hiivassa.

Sopivista isäntäsoluista, jotka voidaan transformoida happaman fosfataasin 5'-; säätelyalueen sisältävällä vektorilla, voidaan mainita esimerkiksi sellaiset hiivat ku ten Saccharomyces-, Pichia- ja Hansenula-sukujen hiivat, edullisimmin Pichia pas-25 toris.

Sopivan isäntäsolun transformointi happaman fosfataasin 5'-säätelyalueen (SEQ ID NO:2) sisältävällä vektorilla voidaan toteuttaa millä tahansa, alan asiantuntijan tun-‘ ’ temalla transformointitekniikalla.

30

',: Alustan fosfaattipitoisuus säätelee happaman fosfataasin 5-säätelyaluetta (SEQ ID

: NO:2). Erityisesti pienet fosfaattipitoisuudet tukahduttavat tämän säätelyalueen.

*·, Niinpä 5'-säätelyaluetta voidaan säätää muuttamalla alustassa läsnä olevaa fos- . faattipitoisuutta.

35 ’·· Happaman fosfataasin signaalisekvenssi (SEQ ID NO:3) sisältyy siihen DNA-kap- :1 ·: paleeseen, joka ulottuu nukleotidistä 1 noin nukleotidiin 66, kuten kuviosta 1 ja tau

lukosta 3 todetaan. Ohessa kuvatun happaman fosfataasin signaalisekvenssin (SEQ

16 1 1347-' ID NO:3) hyväksikäyttöä varten kuviossa 1 ja taulukossa 3 kuvattu kappale voidaan liittää toimivasti vähintään yhtä polypeptidiä koodaaviin heterologisiin DNA-sekvensseihin. Sopivista heterologisista sekvensseistä voidaan mainita kudoksen plasminogeeniaktivaattorin, ihmisen seerumin albumiinin ja invertaasin joukosta va-5 litut DNA-sekvenssit, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

Tämän jälkeen yhdistelmä, jossa happaman fosfataasin signaalisekvenssi SEQ ID NO:3) on kytketty toimivasti heterologiseen DNA-sekvenssiin, voidaan kytkeä sopivaan promoottoriin. Käytettävä promoottori voi olla tarkoituksenmukaisesti joh-10 tosekvenssiin liittynyt promoottori. Vaihtoehtoisesti, luonnossa esiintyvä PHOl-pro-moottori voidaan korvata muilla heterologisilla promoottoreilla, jotka tekevät kopioinnin säätelyn mahdolliseksi. Esimerkkinä sopivasta heterologisesta promoottorista voidaan mainita Pichia pastoris -hiivan alkoholioksidaasi-(AOXl-) promoottori (tai 5-säätelyalue), joka on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 808 537, joka liitetään 15 oheen tällä viittauksella.

Sopivia vektoreita, joihin tämä happaman fosfataasin signaalisekvenssin (SEQ ID NO:3) sisältävä DNA-kappale voitaisiin istuttaa, voidaan saada edellä kuvatulla tavalla. Lisäksi sopivista isäntäsoluista, jotka voidaan transformoida tuloksena oleval-20 la vektorilla, jonka sisältämään DNA-kappaleeseen on koodautunut signaalisekvenssi, voidaan mainita esimerkiksi sellaiset hiivat kuten Saccharomyces-, Pichia-ja Hansenula-sukujen hiivat, edullisimmin Pichia pastoris. Isäntäsolujen transfor-mointi voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla, alan asiantuntijalle tutulla mene-. telmällä. Signaalisekvenssi, joka on kytkeytynyt toimivasti jonkin tällaisen vekto- 25 ri/isäntä-järjestelmän tuottamaan proteiiniin, voi ohjata mainitun proteiinin eritty-| mistä ulos isäntäsolusta.

Happaman fosfataasin rakennegeeni (SEQ ID NO:4) sisältyy DNA-kappaleeseen, joka ulottuu nukleotidistä 67 nukleotidiin 1407, kuten kuviosta 1 ja taulukosta 4 30 nähdään. Tätä happaman fosfataasin rakennegeeniä (SEQ ID NO:4) voidaan käyttää yhdistelmä-DNA-biotekniikassa erilaisiin tarkoituksiin, joista voidaan mainita (a) ,,· DNA-muodosteet rikkovan homologisen yhdistämisen toteuttamiseksi (prosessi, ·, jossa heterologisia DNA-sekvenssejä istutetaan Pichia pastoris-hiivan perimässä happaman fosfataasin sijaintikohtaan, jolloin happaman fosfataasin geenin aktiivi- » · , 35 suus rikkoutuu), sekä (b) happaman fosfataasiproteiinin tuotanto erilaisia biologisia ; * · * määrityksiä varten, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

• · 113474 17

Happaman fosfataasin 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssi (SEQ ID NO:5) päättää mRNA:n kopioitumisen tai stabiloi mRNA:n, kun se on kytketty toimivasti polypep-tidin tuotantoa koodaavan DNA-sekvenssin 3'-päähän. Tämä happaman fosfataasin 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssi (SEQ ID NO:5) sisältyy siihen DNA-kappalee-5 seen, joka ulottuu nukleotidistä 1408 suunnilleen nukleotidiin 1594 saakka, kuten kuviosta 1 ja taulukosta 5 nähdään. Tämä happaman fosfataasin 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssi (SEQ ID NO:5) voi olla kytkeytynyt toimivasti polypeptidiä koo-daavaan heterologiseen DNA-sekvenssiin, ja sitä voidaan käyttää mRNA:n kopioitumisen päättämiseen tai mRNA.n stabiloimiseen esimerkiksi sellaisissa hiivoissa 10 kuten Saccharomyces-, Pichia- ja Hansenula-sukujen hiivoissa, sen soveltuessa erityisen hyvin Pichia pastoris -hiivaan.

Seuraavilla, keksintöä rajoittamattomilla esimerkeillä pyritään havainnollistamaan oheisen keksinnön soveltamista käytäntöön.

15 Esimerkit

Kannat

Esimerkeissä on käytetty seuraavia kantoja: 20 Pichia pastoris KM71 (AOX1, his4)

Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851 Pichia pastoris GS190 (arg4) NRRL Y-18014 ’: Pichia pastoris GS247 (Ade') ': Pichia pastoris KM71: GS102 (Mut') :. 25 Pichia pastoris GS 115:GS 102 (Mut+) : Pichia pastoris MD 100-20 (his4, Ade-) . ‘ Pichia pastoris MB 102-26 (pho-, his4, ade-)

Pichia pastoris MB 102-28 Pichia pastoris MB 102-51 30 Pichia pastoris KM71 :pPSU216 (Mut )

Pichia pastoris GS115:pPSU216 (Mut+) .,.: E. coli JM 103 delta (lac pro) thi rpsl

, · *. (strA) supE end A sbcB hsdR

Bowes-melanooma tPA yli-ilmentyvä solulinja ATCC# CRL9607 (ihmisen mela-. 35 noomasoluja).

113474 18

Alustat, puskurit ja liuokset

Seuraavissa esimerkeissä käytetyillä alustoilla, puskureilla ja liuoksilla oli alla esitetyt koostumukset: 5 LP-alusta (pieni fosfaattipitoisuus) biotiini 2 μg/l kalsiumpantotenaatti 400 μg/l foolihappo 2 μg/l nikotiinihappo 400 μg/l 10 p-aminobentsoehappo 2 μg/l pyridoksiini-hydrokloridi 400 μg/l riboflaviini 200 μg/l tiamiini-HCl 400 μg/l boorihappo 500 μg/l 15 kupari(II)sulfaatti 40 μg/l kaliumjodidi 100 μg/l ferri(III)kloridi 200 μg/l mangaanisulfaatti 400 μg/l sinkkisulfaatti 400 μg/l 20 inositoli 2 mg/1 natriummolybdaatti 200 μg/l ammoniumsulfaatti 5 g/1 yksiemäksinen kaliumfosfaatti 30 mg/1 kaliumkloridi 1,5 g/1

25 natriumkloridi 1,7 mM

; kalsiumkloridi 0,68 mM

‘: magnesiumsulfaatti 4,2 mM

: TE-puskuri

30 Tris-HCL, pH 8,0 10 mM

• ’: EDTA 1 mM

sspe(ix)

:···; NaCl 180 mM

35 Na3P04, pH 7,7 10 mM

!*·.. EDTA 1 mM

* I

19 11347/! SSC (IX)

NaCl 150 mM

Na-sitraatti 15 mM

5 Denhardt’in liuos (IX)

Ficoll 200 mg/1 polyvinyylipyrrolidoni 200 mg/1 naudan seerumin albumiini 200 mg/1

10 REB

LiCl 100 mM

Tris-HCl, pH 7,4 100 mM

EDTA 0,1 mM

15 PCI

fenoli 500 ml/1 kloroformi 480 ml/1 isoamyylialkoholi 20 ml/1 20 Cl kloroformi 960 ml/1 isoamyylialkoholi 40 ml/1 LP-indikaattorimaljat . 25 1 litra IX LP-alustaa ; 22,5 mM sitruunahappoa, pH 4,8 20 g dekstroosia 60 mg 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaattia (Sigma) 25 g Noble-agaria (Difco) 30 SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia 0,168 g EDTA 35 pH arvoon 5,8 HCldlä “ 50 mhssa dH20 ja autoklavointi 20 1 13474 YNB-alusta

6,75 g hiivan typpiperustaa ilman aminohappoja (Difco) 1 l:ssa vettä Esimerkki I

5 pLP24:n muodostaminen

Seuraavat kokeet toteutettiin happaman fosfataasin geenin (SEQ ID NO:l) eristämiseksi Pichia pastoris-hiivasta ja sen tunnusomaisten piirteiden selvittämiseksi. Pichia pastoris GS115-kantaa (NRRL Y-15851) kasvatettiin sekä ympäristössä, jossa fos-10 faattipitoisuus oli suuri (HP-ympäristö) [käsittäen hiivan typpiperustaa ilman aminohappoja (DIFCO), 2 % dekstroosia ja 20 ml/1 histidiiniä], että ympäristössä, jossa fosfaattipitoisuus oli pieni (LP-ympäristö) [käsittäen LP-alustaa, 2 % dekstroosia ja 20 mg/1 histidiiniä], kummankin ympäristön kokonaistilavuuden ollessa 300 ml. Solut kasautettiin, pestiin kertaalleen 10 ml:lla BEB-liuosta ja suspendoitiin uudestaan 15 4 mkaan REB-liuokseen 30 ml:n Corex-putkessa. Sitten putkiin lisättiin 8 g lasi- helmiä ja 4 ml PCI-liuosta. Suspensiota sekoitettiin pyörresekoittajassa suurella nopeudella, kahdeksan kertaa kulloinkin 20 sekunnin ajan, jäähdyttäen jäissä 20 sekunnin ajan jokaisen sekoituskerran välillä. Sitten suspensiota sentrifugoitiin nopeudella 10000xg 10 minuutin ajan. Vesikerros (päällimmäinen kerros) uutettiin kah-20 desti 4 ml:lla PCI-liuosta ja 4 ml:lla CI-liuosta. RNA saostettiin vesifaasista -20 °C:n lämpötilassa 0,1 tilavuudella 3M kaliumasetaattia, pH 5,2, sekä 2,5 tilavuudella etanolia. Poly A+ RNA valikoitiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Maniatis et ah, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, siten, että NaCl oli korvattu LiChllä. LP tai HP mRNA-merkittyjen cDNA-koettimien synteesi, käyttä-'' 25 en 2 μg kutakin poly A+ RNA-tyyppiä, toteutettiin myös edellä mainitun Maniatis et ai. julkaisun mukaisesti.

E. coli MC1061-kannan (Mandel ja Higa, 1970, J. Mol. Biol. 53:154) transformoin-: tiin käytettiin 60 ng YEP13:ssa olevaa puhdistettua Pichia pastoris plasmidikirjastoa 30 [Broach et ai., Gene: 8121 (1979)]. Tuloksena saatiin noin 8000 pesäkettä. Nämä pesäkkeet replikoitiin kahdelle nitroselluloosasuodattimelle, monistettiin LB-mal-joilla, jotka sisälsivät 100 μg/ml ampisilliinia ja 170 μg/ml kloramfenikolia, hajo- i.!.t tettiin tavanomaisella tavalla (Grunstein ja Wallis, 1979, Methods in Enzymology 68, 379-389), lämpökäsiteltiin 80 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan, ja erilliset 35 suodattimet hybridisoitiin joko LP tai HP cDNA-koettimen kanssa. Hybridisointi to-; '·. teutettiin käyttäen 2X SSPE, IX Denhardt’in liuosta, 0,2 % natriumdodekyylisul- ·:*: faattia (SDS) ja 2,5x105 cmp merkittyjä cDNA-koettimia yhdessä mhssa hybridi- sointialustaa. Hybridisointi toteutettiin 55 °C:n lämpötilassa 40 tunnin ajan, koko- 21 1 1347/' naistilavuuden ollessa 25 ml. Hybridisoinnin jälkeen suodattimet pestiin kahdesti 2xSSC, 0,1 % SDS huoneen lämpötilassa ja kahdesti 0,2x SSC, 0,1 % SDS 65 °C:ssa, minkä jälkeen ne kuivattiin ja niiden annettiin valottaa röntgensädefilmiä.

5 Tällä tavalla saatiin tunnistetuksi 24 perimäkloonia, jotka hybridisoituivat voimakkaammin LP cDNA-koettimeen kuin HP cDNA-koettimeen, ja näin ollen niiden voitiin olettaa sisältävän istutteita, joihin oli koodautunut happaman fosfataasin geeni. Nämä 24 kloonia seulottiin uudestaan edellä esitetyllä tavalla LP- ja HP-koettimilla, minkä jälkeen 14 tällaista uudestaan seulottua kloonia hybridisoitui jäl-10 leen voimakkaammin LP cDNA-koettimeen. Plasmidi-DNA eristettiin kustakin näistä 14 kloonista, pilkottiin EcoRI-entsyymillä, erotettiin elektroforeettisesti aga-roosigeelillä, siirrettiin imeyttämällä kahdelle nitroselluloosasuodattimelle ja kumpikin suodatin hybridisoitiin joko LP tai HP cDNA:n kanssa edellä kuvatuissa olosuhteissa. Neljästä erillisestä kloonista peräisin olevat geenikappaleet hybridisoitui-15 vat voimakkaasti LP cDNA-koettimeen ja heikosti, mikäli lainkaan HP cDNA-koettimeen. Sitten nämä kappaleet kartoitettiin restriktioentsyymeillä käyttäen Eco-RI + Hindlll-, EcoRI + Sali- ja EcoRI + BamHI-kaksoispilkkeitä, minkä jälkeen ne hybridisoitiin jälleen LP cDNA-koettimen kanssa. Näihin kappaleisiin oli koodautunut asiaan liittymättömiä, fosfaatin säätelemiä geenilohkoja, mikä voitiin määrittää 20 niiden restriktiokartoissa todettujen erojen perusteella.

Alueet, joiden tunnistettiin tällä menetelmällä koodaavan LP-säätelyn alaisia geenejä, alikloonattiin plasmidiin pUC8 tai pUC19 (New England Biolabs). Tuloksena saadut plasmidit leimattiin 32P-isotoopilla "nick"-luennalla (Maniatis). Näitä lei-25 mattuja plasmideja käytettiin LP ja HP RNA:n RNA-täplien koettimina (5 μ-g/täplä). Yksi alkuperäisistä 24 kloonista, josta käytettiin merkintää pLP24, valittiin lisätutkimuksia varten.

Esimerkki II

30 pLP2411:n muodostaminen * ,. * Esimerkissä I muodostetun plasmidin pLP24, jonka oletettiin sisältävän Pichia pas- ; toris -hiivan happaman fosfataasin geeni (SEQ ID NO:l) tai sen kappale, tunnus- .,,.: omaisia piirteitä selvitettiin edelleen seuraavalla tavalla. 10 pg plasmidia pLP24 pil- 35 kottiin entsyymeillä EcoRI/Sall ja 2,1 kb:n kappale puhdistettiin geelin avulla.

I # '10 pg plasmidia pYM25 (NRRL B-18015) pilkottiin entsyymeillä SphI/Sall, ja 3,1 kb:n kappale puhdistettiin geelin avulla. 5 pg plasmidia pUC19 pilkottiin ent- 113474 22 syymeillä EcoRI/Sall, uutettiin PCI-liuoksella, uutettiin Cl-liuoksella ja saostettiin EtOH:lla. 100 ng EcoRI/Sall-linearisoitua pUC19-plasmidia ligatoitiin 200ng:aan plasmidista pLP24 saatua 2,1 kb:n EcoRI/Sall-kappaletta ja 450 ng:aan plasmidista pYM25 saatua, 3,1 kb:n SphI/Sall-kappaletta 3-osaisella ligaatiolla, 20 pkssa ligaa-5 tiopuskuria + 1 mM ATP + 1U T4 DNA-ligaasia. E. coli-kanta MC 1061 transformoitiin ja asianmukainen plasmidi tunnistettiin 2,1 kb:n EcoRI/Sall-kappaleen ja 3,1 kb:n SphI/Sall-kappaleen läsnäolon perusteella. Tästä asiannmukaisesta plasmidista käytettiin merkintää pLP2411.

10 Esimerkki III

pLP2412 PHOl-hajotusvektorin muodostaminen ja GS190:pLP2412:n kehittäminen

Plasmidista pLP24 (katso esimerkki II) peräisin oleva plasmidi pLP2411 pilkottiin 15 entsyymillä Xbal, käsiteltiin Klenow DNA-polymeraasilla tylppien päiden muodostamiseksi ja ligatoitiin plasmidista pYM25 peräisin olevan 2,1 kb Hpal-kappaleen kanssa. Tämä kappale sisälsi Saccharomyces cerevisiae ARG4-geenin. (Plasmidi pYM25 on saatavana talletuksena NRRL B-18015). Tuloksena saadusta plasmidista käytettiin merkintää pLP2412. Sitten pLP2412 pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja 20 BamHI. Tuloksena ollut 3,3 kb:n kappale eristettiin ja sillä transformoitiin Pichia pastoris GS190 (NRRL Y-18014) Arg+-prototropian aikaansaamiseksi (transformoinein käytetty menetelmä on kuvattu esimerkissä IV). Arginiiniprototrofit tunnistettiin sen perusteella, että ne kykenivät kasvamaan arginiinia sisältämättömällä alustalla. Ne eristettiin ja seulottiin LP-indikaattorimaljoilla happaman fosfataasin 25 läsnäolon toteamiseksi. Pesäkkeet toistomaljattiin LP-indikaattorimaljoille ja niiden annettiin kasvaa yön yli 30 °C:n lämpötilassa. LP-indikaattorimaljoilla olevat pesäkkeet olivat joko vihreitä (PHOl) tai valkoisia (phol). Valkoiset pesäkkeet olivat transformantteja, jotka sisälsivät edellä kuvatun 3,3 kb ilmentämiskasetin stabiilisti yhdentyneinä Pichia pastoris-perimässä PHOl-sijaintikohtaan sen rikkoen.

30 ,: Stabiilien Arg+-kantojen perimän DNA analysoitiin Southern’in suodatinhybridisaa- : i tiolla ilmentämiskasetin sijaintikohdan määrittämiseksi. 3,3 kb EcoRI-BamHI- kappale, joka sisälsi Saccharomyces cerevisiae ARG4-geenin, oli yhdentynyt spesi-. fisesti ja rikkonut sen perimäsekvenssin, joka oli analoginen plasmidin pLP2411 si- . 35 sältämän DNA-kappaleen kanssa, vahvistaen sen, että tähän sijaintikohtaan oli koo- : ’· dautunut hapan fosfataasi (PHOl). Tästä transformantista käytettiin merkintää ; GS190:pLP2412.

23 11247'

Esimerkki IV

Pichia pastoris -hiivan transformointi

Seuraavaa menettelytapaa käytettiin Pichia pastoris -hiivan transformoimiseksi.

5

Hiivasoluja siirrostettiin noin 10 ml:aan YPD-alustaa ja niitä viljeltiin ravisteluvil-jelmänä 30 °C:n lämpötilassa 16-20 tunnin ajan. Sitten solut laimennettiin siten, että A600 oli noin 0,01-0,1, ja log-vaihetta ylläpidettiin YPD-alustassa 30 °C:n lämpötilassa 6-8 tunnin ajan. 100 ml.aan YPD-alustaa siirrostettiin 0,5 ml siirrosteviljelmää 10 siten, että A600:ksi saatiin noin 0,1, ja niitä kasvatettiin ravisteluviljelmänä 30 °C:ssa noin 16-20 tuntia. Sitten, kun A600 oli noin 0,2-0,3 (noin 16-20 tunnin kuluttua), solut otettiin talteen sentrifugoimalla, käyttäen DAMON IEC DPR-6000-sentrifugia, 5 minuutin ajan nopeudella 1500 x g.

15 Sferoplastien valmistamiseksi solut pestiin kertaalleen 10 ml:lla steriiliä vettä (solut sentrifugoitiin kunkin pesun jälkeen edellä kuvatulla tavalla), kertaalleen 10 ml:11a juuri valmistettua SED-liuosta, kertaalleen 10 ml.lla steriiliä IM sorbitolia, ja ne suspendoitiin uudestaan 5 ml:aan SCE-puskuria. 5 μΐ Zymolyase 60,000 (4 mg/ml; saatu yhtiöstä Miles Laboratories) lisättiin ja soluja inkuboitiin 30 °C:ssa noin 30 20 minuutin ajan.

Sferoplastien muodostumista seurattiin seuraavalla tavalla. 100 μ1:η suuruisia solunäytteitä lisättiin 900 pl:aan 5 % SDS-liuosta ja 900 pkaan IM sorbitolia juuri ennen Zymolyase-entsyymin lisäystä tai juuri tämän lisäyksen jälkeen, sekä eri ajan-25 hetkillä inkubointijakson aikana. Inkubointi lopetettiin pisteessä, jossa solut hajosivat SDS-liuoksessa, mutta eivät hajonneet sorbitolissa. Muodostetut sferoplastit pestiin kertaalleen 10 ml:11a steriiliä IM sorbitolia, sentrifugoiden nopeudella 1000xg 5-10 minuutin ajan, pestiin kertaalleen 10 ml:lla steriiliä CaS-liuosta sentrifugoiden, ja suspendoitiin uudestaan 0,6 ml:aan CaS-liuosta.

30

Varsinaista transformointia varten vedessä tai TE-puskurissa olevat DNA-näytteet ; lisättiin (kokonaistilavuus korkeintaann 20 μΐ) 12 x 75 mm steriileihin polypropy- leeniputkiin. (Pienten DNA-määrien tapauksessa tehokkaimpaan transformaatioon päästään käyttämällä noin 1 μΐ sonikoitua E. coli-DNA:ta (5 mg/ml) kussakin näyt-35 teessä.) Kuhunkin DNA-näytteeseen lisättiin 100 μΐ sferoplasteja, ja näytteitä inku-: · · boitiin huoneen lämpötilassa noin 20 minuuttia. Jokaiseen näytteeseen lisättiin 1 ml > : PEG-liuosta ja näytteitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa noin 15 minuutin ajan.

Näytteitä sentrifugoitiin nopeudella lOOOxg 5-10 minuutin ajan ja supematantti hy- 11347/ 24 lättiin. Kasaumat suspendoitiin uudestaan 150 μΐ^η SOS-liuosta ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Kuhunkin näytteeseen lisättiin 850 μΐ steriiliä IM sorbitolia ja näytteet maljattiin edellä kuvatulla tavalla.

5 10 ml regenerointiagaria kaadettiin kuhunkin maljaan vähintään 30 minuuttia ennen transformointinäytteiden valmistumista. 10 ml:n suuruisia annoksia regenerointiagaria annosteltiin myös putkiin 45-50 °C:n hauteessa sinä aikana, kun transformointi-näytteet olivat SOS-liuoksessa. Sitten näytteet lisättiin putkiin, kaadettiin maljoille, jotka sisälsivät jähmeän pohja-agarkerroksen, ja maljoja inkuboitiin 30 °C:ssa 3-5 10 vuorokaudenajan.

Sferoplastien laatu eri ajanhetkillä määritettiin seuraavasti. 10 μ1:η näyte otettiin ja laimennettiin lOOx lisäämällä se 990 μΐ^η IM sorbitolia. Tästä laimennoksesta otettiin 10 μΐ ja se lisättiin uudestaan 990 μ1:η suuruiseen annokseen IM sorbitolia. 15 100 μΐ kumpaakin laimennosta levitettiin YPD-agaralustaa sisältävään maljaan, mil lä toimenpiteellä pyrittiin määrittämään valmisteessa jäljellä olevien, sferoplasteiksi muuttumattomien kokonaisten solujen pitoisuus. 100 μΐ kutakin laimennosta lisättiin 10 ml:aan regenerointiagaria, johon oli lisätty täydennökseksi 40 μg/ml kaikkia isännän tarvitsemia aminohappoja regeneroituvien sferoplastien kokonaismäärän 20 määrittämiseksi. Tämän transformointikokeen hyvät arvot olivat yhteensä 1-3x107 regeneroituvaa sferoplastia/ml ja noin 1x103 kokonaista solua/ml.

; Esimerkki V

Hiivan DNA:n valmistus 25 5 Seuraavaa menetelmää käytettiin Pichia pastoris -hiivan DNA:n valmistamiseksi.

Hiivasoluja kasvatettiin 100 ml:ssa YNB-alustaa, johon oli lisätty 2 % dekstroosia, 30 °C:ssa kunnes arvoksi A600 saatiin 1-2, minkä jälkeen solut kasautettiin käyttäen 30 Damon IEC DPR-6000-sentrifugia, nopeudella 2000xg 5 minuutin ajan. Kasauma pestiin kertaalleen dH20:lla, kertaalleen SED:llä, kertaalleen IM sorbitolilla ja sit-: , t: ten se suspendoitiin uudestaan 5 ml:aan liuosta, joka sisälsi 0,1M Tris-HCl, pH 7,0, ·. ja IM sorbitolia. Sitten soluihin sekoitettiin 50-100 μΐ Zymolyase 60 000-entsyymiä \ (Miles Laboratories) 4 mg/ml pitoisena liuoksena, ja seosta inkuboitiin 30 °C:ssa 1 * . 35 tunnin ajan. Sitten tuloksena saatuja sferoplasteja sentrifugoitiin nopeudella 1000xg ·» 5-10 minuutin ajan ja ne suspendoitiin 5 inhaan hajotuspuskuria [0,1 % SDS, 10

'; ': mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA ja 50 mM NaCl], Sekä tuotetta Proteinase K

(Boehringer Mannheim) että tuotetta RNase A (Sigma) lisättiin pitoisuudeksi 100 25 1 1347.·' μg/ml ja liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. DNAista poistettiin proteiinit sekoittamalla saatuun valmisteeseen varovasti yhtä suuri tilavuus CI-liuosta, ja faasit erotettiin sentrifugoimalla nopeudella 12000xg 20 minuutin ajan. Ylempi (vesi-) faasi imettiin puhtaaseen putkeen ja se uutettiin yhtä suurella tilavuudella PCI-5 liuosta. Faasit erotettiin edellä kuvatulla tavalla, ja ylempi faasi laitettiin putkeen, joka sisälsi 2-3 tilavuutta kylmää, 100 % etanolia. Näytettä sekoitettiin varovasti ja DNA otettiin talteen kiertämällä se muovisauvan päälle. DNA liuotettiin välittömästi 1 ml:aan TE-puskuria, ja sitä dialysoitiin yön yli 4 °C:ssa TE-puskurin 100 tilavuutta vastaan.

10

Esimerkki VI

Täysipituisen PHOl-geenin eristäminen

Plasmidin, joka sisältää koko Pichia pastoris PHOl-geenin (SEQ ID NO:l), eristä-15 miseksi MC1061:ssä oleva alkuperäinen Pichia pastoris -perimäkirjasto hybridisoi-tiin edellä kuvatuissa olosuhteissa plasmidista pLP24 peräisin olevan 600 emäsparin pituisen BamHI-kappaleen kanssa. Tällä menetelmällä tunnistettiin viisi positiivista kloonia. Plasmidi-DNA:ta valmistettiin näistä klooneista, pilkottiin entsyymillä BamHI, imeytettiin nitroselluloosasuodattimille ja hybridisoitiin saman 600 emäs-20 parin pituisen koettimen kanssa. Kukin näistä viidestä kloonista käsitti 2,0 kb:n BamHI-kappaleen, joka sisälsi Pichia pastoris PHOl-geenin. Eräs näistä klooneista valittiin lisäanalyysiä varten, ja siitä käytettiin merkintää pLP2420.

« : Kloonin pLP2420 2,0 kb:n BamHI-kappaleen sekvenssi määritettiin restriktioent- : 25 syymeillä pilkottujen ja M13:een (saatavana yhtiöstä New England Biolabs) alikloo- : nattujen kappaleiden tavanomaisella dideoksi-sekvenssimäärityksellä. Sekvenssi- analyysi paljasti 468 aminohapon pituisen avoimen lukukehyksen, joka sisältyi täydellisesti tähän 2,0 kb:n BamHI-kappaleeseen.

30 Esimerkki VII

Kantojen MB102-26:pLP2430-Tl ja MB102-26:pLP2430-T3 kehittäminen '; Plasmidista pLP2420 peräisin oleva, PHOl-geenin sisältävä 2,0 kb:n BamHI-kappa- le ligatoitiin plasmidin pYM8 BamHI-kohtaan, joka plasmidi pYM8 sisältää Sac-35 charomyces cerevisiae HIS4-geenin sekä pBR322-sekvenssit. [pYM8 voidaan valmistaa seuraavasti: 10 pg pYA2:ta (NRRL B-15874) pilkottiin entsyymeillä : SphI/ThaI ja 3,4 kb:n kappale geelipuhdistettiin. 10 pg pBR322:tä pilkottiin entsyy meillä SphI/NruI ja 3,95 kb:n kappale geelipuhdistettiin. 100 ng tätä 3,95 kb:n 11347/ 26 pBR322-kappaletta ja 250 ng 3,4 kb:n pYA2-kappaletta ligatoitiin keskenään tavanomaisissa olosuhteissa. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin 3,1 kb:n Xhol/Sphl-kappaleen perusteella ja siitä käytettiin merkintää pYM8.] Tuloksena olleesta plas-midista käytettiin merkintää pLP2430, ja se kykeni replikoitumaan autonomisesti 5 Pichia pastoris -hiivassa satunnaisen ARS-toiminnon ansiosta (autonominen repli-kointisekvenssi), joka ARS sijaitsi Saccharomyces cerevisiae HIS4-geenisekvenssis-sä.

GS190:pLP2412 (Pho-):n, joka on Pichia pastoris-kanta, josta puuttuu happaman 10 fosfataasin aktiivisuus (katso esimerkki III), annettiin pariutua Pichia pastoris -kannan MD100-20 (his4, Ade) kanssa. Käytetty parittelumenetelmä oli US-patenttijul-kaisussa 4 812 405 kuvatun menetelmän mukainen, joka julkaisu liitetään oheen tällä viittauksella. Kanta MD 100-20 kehitettiin seuraavasti: Pichia pastoris -kannan GS115 (his4) NRRL Y-15851 soluja sekoitettiin kannan GS247 (Ade-) soluihin olo-15 suhteissa, joiden tiedetään edistävän zygoottien muodostumista ja diploidisaatiota (tämän menetelmän kuvaus on löydettävissä US-patenttijulkaisusta 4 812 405, joka liitetään oheen tällä viittauksella) ja maljattiin YNB + dekstroosimaljoille prototro-fisten diploidien valikoimiseksi. Diploidia kantaa kutsuttiin MD100:ksi. MD 100-kantaa viljeltiin olosuhteissa, joiden tiedetään indusoivan Pichia pastoris -diploidien 20 itiönmuodostusta (sporulaaatiota) (ja jotka on samoin kuvattu julkaisussa US 4 812 405) ja itiötuotteita viljeltiin maljoilla, jotka sisälsivät YNB dekstroosia + adeniinia + histidiiniä. Yksittäisten pesäkkeiden kyky kasvaa ilman adeniini- tai his-; tidiinitäydennöstä testattiin. Kanta, joka kykeni kasvamaan ilman histidiinitäyden- . nöstä, muttei kyennyt kasvamaan ilman adeniinitäydennöstä, tunnistettiin ja siitä 25 käytettiin merkintää MD100-20.

Tästä risteytyksestä peräisin oleva diploidi kanta MB 102 Pho+/Pho-, HIS4/his4, Ade+/Ade-, saatettiin tuottamaan itiöitä (US-4 812 405) haploidien jälkeläisten tuottamiseksi. Nämä jälkeläiset seulottiin LP-indikaattorimaljoilla sekä YNB-dekst-30 roosimaljoilla, joihin joko oli tai ei oltu lisätty täydennökseksi histidiiniä tai adenii-,: nia, kannan MB 102-26 (Pho-, his4, Ade-) eristämiseksi.

>, Kanta MB 102-26 transformoitiin plasmidilla pLP2430 esimerkissä IV kuvatulla ta- ‘. valla. His+-transformantit valikoitiin ja seulottiin happaman fosfataasin ilmentymi- 35 sen suhteen LP-indikaattorimaljoilla (katso esimerkki III). Viisi transformanttia oli positiivisia happaman fosfataasin ilmentämisen suhteen.

27 1 1347 '

Kahdesta näistä transformantista, MB102-26:pLP2430-Tl ja MB102-26:pLP2430-T3 analysoitiin happaman fosfataasin ilmentymisen asianmukainen säätely. Kumpaakin kantaa kasvatettiin HP- tai LP-alustalla 24 tuntia siten, että arvoksi A600 saatiin 2,0. Molempien viljelmien soluista määritettiin happaman fosfataasin ilmen-5 tyminen (Bostian et ai. 1980; Proc. Natl. Acad. Sei. 77: 4504-4508) käyttäen rinnakkain transformoimattomia HIS4-soluja (MB 102-28), jotka kantavat Pho-fenotyyp-piä, sekä HIS4-soluja (MB 102-51), jotka kantavat Pho+-villityypin fenotyyppiä (taulukko I). pLP2430-transformanttien induktiotaso oli käytännöllisesti katsoen yhtä suuri kuin villityypin kannan induktiotaso. Täten PHOl-geenin sisältävä 2,0 kb:n 10 BamHI-kappale, joka on istutettu plasmidiin pLP2430, sisälsi koko hapanta fosfa-taasia koodaavan alueen sekä sekvenssit, jotka riittivät saamaan aikaan asianmukaisella tavalla fosfaatin säätelemän happaman fosfataasin ilmentymisen.

Taulukko I

15

Yksikköä -kertainen

Kanta Genotyyppi AP/OD600 induktio MB 102-26:pLP2430-Tl ade, HIS4, PHOl 707 30244 43 MB 102-26:pLP2430-T3 ade, HIS4, PHOl 852 28198 33 20 MB 102-51 ade, HIS4, PHOl 61,4 1975 32 MB 102-28 ade, HIS4, phol 0,02 0,03 1,5

: Esimerkki VIII

: Invertaasin eritys : 25 ; Tässä esimerkissä osoitetaan, että PHOl-signaalisekvenssi (SEQ ID NO:3) toimii, . kun se on kytketty toimivasti heterologisiin geeneihin. Saccharomyces cerevisiae SUC2-geenin sisältävä 2,2 kb:n Smal-PvuII-kappale eristettiin plasmidista pSEYC306 [Johnson et ai., Cell 48, 875 (1987)] ja se kloonattiin joko pA0810:n tai 30 pPSV218:n Smal-kohtaan (nämä lähtöplasmidit on kuvattu esimerkeissä XI ja XII).

Tällä toimenpiteellä saatiin vastaaavsti plasmidit pAPINVl ja pAPINV2. Niissä käytettiin Pichia pastoris AOX1 -promoottoria, joka sääteli avoimen lukukehyksen ’: kopioitumista PHOl-signaaliketjusta (SEQ ID NO:3) SUC2-rakennegeeniin: *

35 PHOl-sekvenssi ...GTGTTCGCT

28 1 1647 *

pSEYC306:sta peräisin olevat kytkijäsekvenssit CGA GAA TCC CCC GGG GAT CCG ACC TGC AGC CCA GCT TTG

5 SUC2-sekvenssi ACA AAC GAA...

Kymmenen μg kumpaakin plasmidia pAPINVl tai pAPINV2 pilkottiin entsyymillä Bglll ja käytettiin GS115:n transformointiin esimerkissä IV kuvatulla tavalla. Transit) formantit, jotka sisälsivät Bglll-kappaleen plasmidista pAPINVl, ja joista käytettiin merkintää GS115:pAPINVl, valikoitiin histisiiniprototrofian suhteen ja niistä seulottiin Mut -fenotyyppi, mikä osoittaa asianmukaisen yhdentymisen ja rikkoutumisen AOXl-sijaintikohdassa. Mut-seulonta toteutettiin toistomaljaamalla glukoosia sisältävältä alustalta peräisin olevat pesäkkeet metanolia sisältävälle alustalle ja ar-15 vioimalla metanolilla saavutettu kasvunopeus. Metanolilla saavutettu hidas kasvu osoitti Mut -fenotyypin. Transformantit, jotka sisälsivät Bglll-kappaleen plasmidista pAPINV2, ja joista käytettiin merkintää GS115:pAPINV2, valikoitiin myös histidii-niprototrofian suhteen, mutta niistä seulottiin Phol -fenotyyppi, joka osoittaa asianmukaisen yhdentymisen ja rikkoutumisen PHOl-sijaintikohdassa (katso esimerkki 20 III).

Kummankin luokan transformantit tunnistettiin ja niitä viljeltiin alustassa YNB + 2% glyserolia rinnan Pichia pastoris -kantojen KM71:GS102(Muf) ja GS115:GS102(Mut+) kanssa, joiden sisältämät yhdentyneet plasmidit ovat muuten 25 samanlaisia kuin pAPINVl, paitsi että SUC2-geeni sisältää luonnollisen signaali-; sekvenssinsä ja että siitä puuttuu PHOl-signaalisekvenssi. Nämä kaksi kantaa on : kuvattu patenttijulkaisussa EP 256 421. Rinnakkain viljeltiin samoin kantoja : KM71:pPSV216(Muf) ja GS115:pPSV216(Mut+), joiden sisältämät yhdentyneet : plasmidit ovat muuten samanlaisia kuin pAPINV2, paitsi että SUC2-sekvenssit 30 puuttuvat.

» »

Kutakin viljelmää kasvatettiin alustalla YNB+2 % glyserolia siten, että arvoksi :. A600 saatiin noin 3,0. Kustakin viljelmästä otettiin näyte, joka pestiin steriilillä ve dellä ja suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan YNB+0,5 % MeOH. Mut+-viljelmät sus-35 pendoitiin uudestaan siten, että arvoksi A600 saatiin 0,02, ja Muf-viljelmät suspendoitiin uudestaan siten, että arvoksi A600 saatiin 0,2, ja niiden annettiin kasvaa ·· 30 °C:ssa 24 tunnin ajan siten, että arvoksi A600 saatiin noin 0,3-0,4. Sitten inver- taasiaktiivisuus määritettiin noin 1,0 mOD600:sta. Tulokset on esitetty taulukossa II.

11347t 5 29

Taulukko II

Signaali- Erittynyt Kokonais- Erityksen Viljelmä Mut sekvenssi invertaasi3 invertaasib tehokkuus0 GS115: - PHOl 20,3 30,5 0,67

pAPIN VI

KM71: - SUC2 12,5 18,9 0,66 10 GS102 KM71: - PH01d 0 0 pPSV216 15 GS115: + PHOl 6,1 6,7 0,91 pAPINV2 GS115: + SUC2 5,3 5,7 0,93 GS102 20 GS115: + PH01d 0 0 pPSV216 a Erittynyt invertaasi, määritetty Goldstein’in ja Lampen’in menetelmän (Gold-25 stein ja Lampen, Methods in Enzymology, 42:504-511, 1975) mukaisesti ilman Tritonia, ja se on esitetty muodossa invertaasiyksikköä/A600 analysoitua viljelmää. 1 yksikkö = 1 pmoolia vapautunutta glukoosia minuutissa, 37 °C:n lämpötilassa.

; b Kokonaisinvertaasi määritettiin siten, että läsnä oli 0,2 % Triton X-100.

' 30 c Erityksen tehokkuus = erittynyt invertaasi/määritetty kokonaisinvertaasi.

d PHOl-signaali oli läsnä, ei SUC2-sekvenssejä.

Nämä tulokset osoittavat selvästi, että PHOl-signaalisekvenssi toimii yhtä tehok-: kaasti kuin SUC2-signaalisekvenssi ajatellen niiden kykyä edistää invertaasin eritys- ‘: 35 tä Pichia pastoris -hiivasta. 1 » » t ; I » „ 11«7':

Esimerkki IX

tPA:n (kudoksen plasminogeeniaktivaattorin) eritys Tämä esimerkki osoittaa, että PHOl-signaalisekvenssi (SEQ ID NO:3) toimii, kun 5 se on kytketty toimivasti heterologisiin geeneihin.

1. tPA:ta koodaavan cDNA:n eristäminen

Bovves-melanooman yli-ilmentyvä tPA-solulinja, ATCC CRL9607, oli RNA-lähde, jota käytettiin cDNA-kirjaston muodostamiseen. Muut ovat käyttäneet tätä solulin-10 jaa tPA-sekvenssien kloonaamiseen (Pennica et ai., Nature, 301:214, 1983; Edlund et ai., PNAS 80:349, 1983; Lemontt et ai., DNA 4:419, 1985). Poly A+ RNA eristettiin ja oligo dT-alustettiin noudattaen yleisesti menetelmää, joka on kuvattu teoksessa Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Tätä RNA:ta käytettiin cDNA:n valmistamiseen käyttäen kaupallista 15 cDNA-kloonauspakkausta (saatavana yhtiöstä Amersham) ja se istutettiin gtll-kloonausvektoriin. Istutteita sisältävä gtll-faagi infektoitiin E. coli-isäntään Y1088, käyttäen kaupallista pakkausseosta (saatavana yhtiöstä Stratagene).

Tämä kirjasto maljattiin kolminkertaisesti ja sen koettimina käytettiin kolmea eri-20 laista oligonukleotidiä, jotka oli suunniteltu ihmis-tPA:n cDNA:n julkaistujen sekvenssien perusteella (Pennica et ai., edellä). Nämä oligonukleotidit vastasivat cDNA.n 5'-lohkoa, keskilohkoa ja 3'-lohkoa, ja niiden sekvenssit olivat seuraavat: 3’-koetin: 5' gac tgg att cgt gac aac atg cga ccg tga 3' 25 keskikoetin: 5 1 TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGC CTG CGG TTC 3 ' ; 5'-koetin: 51 gag ccc tct ctt cat tgc atc cat gat tgc t 3 ' Tällöin tunnistettiin kolme plakkia, jotka hybridisoituivat kaikkiin kolmeen koetti-: meen. Näissä klooneissa olevien istutteiden pilkkominen restriktioentsyymeillä 30 osoitti niiden koodaavan tPA:ta julkaistujen restriktiokuvioiden perusteella (Pennica et ai., edellä). Kloonit erosivat toisistaan ainoastaan läsnä olevan koodaamattoman ': 5’-sekvenssin suuruuden suhteen. Kloonit 4 ja 5 poimittiin muiden tunnusomaisten piirteiden selvittämiseksi, koska ne sisälsivät EcoRI-pilkkomisen perusteella 0,8 kb:n (5'-pää), 0,47 kb:n (keskusta) ja 1,3 kb:n (3'-pää) DNA-istutteita, minkä perus-35 teella voidaan olettaa, että läsnä on täysipituista tPA:ta koodaava sekvenssi. Kloo-nista 4 peräisin oleva Bglll-kappale alikloonattiin BamHI-leikattuun plasmidiin • pUC18, ja tämä ligaatio siirrettiin E. coli MC 1061-soluihin. Positiiviset transfor- mantit tunnistettiin EcoRI-pilkonnalla. Klooni, joka käsitti istutteen "sense"-suun- 31 113474 tautuneena, tunnistettiin 420 emäsparin, 624 emäsparin, 760 emäsparin ja 2,7 kilo-emäsparin kappaleita sisältävän Pstl-restriktiokuvion perusteella ja siitä käytettiin merkintää pUC18#3. Klooni, joka käsitti istutteen "antisense"-suuntautuneena, tunnistettiin 420 emäsparin, 624 emäsparin ja 3,46 kiloemäsparin kappaleita sisältävän 5 Pstl-restriktiokuvion perusteella, ja siitä käytettiin merkintää pUC18#2. Tämän istutteen koodaus alkaa kaksi nukleotidiä ennen kypsän tPA:n ensimmäistä aminohappoa, jatkuen koodaamattoman 3'-sekvenssin 1972 nukleotidin läpi.

2. Vektorin pT37 (PHOls-tPA-pUC) muodostaminen 10 Muodosteesta pUC18#2 peräisin oleva tPA-istute kloonattiin Pichia pastoris ilmen-tämisplasmidiin pAO810. Tämä plasmidi pAO810 koostuu Pichia pastoris AOX1-promoottorista, Pichia pastoris PHOl-signaalisekvenssistä, AOX1-kopioinnin päättäjästä, Pichia pastoris HIS4-geenistä valikointia varten, fl-replikaation aloituskohdasta, sekä sekvensseistä, jotka ovat välttämättömiä bakteereissa tapahtuvaa repli- 15 koitumista ja valintaa ajatellen. pAO810 muodostaminen on kuvattu esimerkissä XI.

2 μg muodosteesta pUC18#2 saatua 1600 emäsparin Sall/Smal-kappaletta, joka oli ensin puhdistettu 1 % agaroosigeelillä, ja johon on koodautunut tPA:n 5'-osa, liga-toitiin 300 ng:aan XhoI/Smal-pilkottua pAO810:ta. Tämä ligaatioreaktio transfor- 20 moitiin E. coli MC 1061-soluihin ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Positiiviset pesäkkeet tunnistettiin 420 bp.n, 620 bp.n, 2 kb.n ja 6,3 kb:n kappaleista koostuvan kuvion perusteella Pstl-entsyymillä pilkottaessa. Tuloksena saadusta vektorista käytettiin • merkintää pTl. Sitten toteutettiin kohtaohjattu mutageneesi noudattaen fl-replikaa- • tion aloituskohdan käsittäville vektoreille tavanomaisia toimenpiteitä kypsää tPA:ta ; 25 koodaavan sekvenssin 5'-puolella sijaitsevien kahden ylimääräisen nukleotidin hä- • vittämiseksi. Tällä mutagenoidulla oligonukleotidillä oli seuraava sekvenssi: i . 5’ CAA TCT GTC TTC GCT TCT TAC CAA GTG ATC 3’ 30 Asianmukainen plasmidi tunnistettiin seulomalla Sall/Xbal-pilkottuja miniprepa-* raatteja. Alkuperäisen vektorin pTl restriktiokuvio oli 1,2, 2,3 ja 6,6 kb. Oikealla ’ ’ tavalla mutagenoituneen plasmidin kuvio oli 1,2 ja 9,8 kb ja siitä käytettiin merkin- tääpT2-3.

35 50 pg muodostetta pUC18#3 pilkottiin yhdistelmällä SmaI/Sau3A. Kolme 72 ja 118 : ’ emäsparin välissä sijaitsevaa vyöhykettä (75, 90 ja 110 bp), joihin oli koodautunut tPA:n 3'-osa, puhdistettiin 8 % polyakryyliamidigeelillä ja ligatoitiin 0,5 pg:aan Smal/BamHI-leikattua plasmidia pT2-3. Tämä ligaatio transformoitiin E. coli 11347/ 32 MC 1061-soluihin ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Positiiviset pesäkkeet tunnistettiin PvuII/Apal-pilkottujen minipreparaattien avulla. Asianmukaisessa plasmidissa todettiin 421 bp:n kappale (epäasianmukaisessa todettiin 225 bp:n kappale). Asianmukaisesta vektorista käytettiin merkintää pT37. 5’-mutageneesi todettiin sekvens-5 siltään oikeaksi, mutta kuitenkin sekvenssin määritys paljasti, että tämä plasmidi sisälsi pUC18-sekvenssejä koodaamattoman tPA 3' sekvenssin jälkeen; plasmidin pT37 todettiin käsittävän plasmidin pUC18 asemista 1894-2004 peräisin oleva Sau3 A-kappale välittömästi tPA-sekvenssin jälkeen.

10 10 pg plasmidia pT37 pilkottiin entsyymillä Stul ja sillä transformoitiin Pichia pas- toris -kanta KM71 (aoxl, his4). Transformantit valikoitiin histidiiniprototrofian perusteella. Erästä transformanttia, KM71:pT37, viljeltiin YNB + 2 % glyseroli-alustassa rinnan kannan KM71:pT7 kanssa, jonka kannan sisältämä plasmidi (pT7) oli lähes samanlainen kuin pT37 lukuunottamatta sitä, että PHOl-signaalisekvenssi oli 15 korvautunut luonnollisella ihmis-tPA:n signaalisekvenssillä, ja että pUC18-sekvens-sit olivat hävinneet 3-päästä. Kuvaus pT7:stä on esitetty jäljempänä. 50 ml kummankin kannan viljelmää, joka oli saatu YNB +2 % glyseroli-alustalla kasvattaen, siirrostettiin yhden litran fermentoreihin ja kasvatettiin joko jatkuvana kasvatuksena tai syöttöä hyväksikäyttävänä panoskasvatuksena. Tästä kokeeesta saadut tulokset 20 on esitetty taulukossa III.

Taulukko III . 1tPA, pg/1 25 Kasvatus- Sisäi- Ulkoi- Tehok-

Ajo Kanta Signaali tapa nen nen Yht. kuus2 ! 1 KM71 :pT7 tPA jatkuva 255 60 315 0,19 2 KM71:pT7 tPA panos 651 30 681 0,04 3 KM71 :pT37 PHOl jatkuva 840 420 1260 0,33 30 4 KM71 :pT37 PHOl panos 1856 1200 3056 0,39 1 - 1 1 ELIS A-menetelmällä määritetty tPA käyttäen standardina ihmisen tPA:ta.

2 :' ': 2 tPA-erityksen tehokkuus = ulkoinen tPA/tPA:n kokonaistuotanto.

.;. · I panos = syöttöä hyväksikäyttävä panoskasvatus.

* 35 » »I t 11347/' 33 Tämän kokeen tulokset osoittavat, että fermentointitavasta riippumatta PHOl-signaalisekvenssi (SEQ ID NO:3) edisti tehokkaammin tPA-eritystä Pichia pastoris-hiivassa kuin luonnollinen signaalisekvenssi.

5 Lisäksi mikro-Edman hajotusanalyysi varmisti sen, että PHOl-signaalisekvenssiä (SEQ ID NO:3) käytettäessä tämän yhdistelmä-DNA-teknisen, kannasta KM71:pT3 erittyneen tPA:n N-päätteen aminohapposekvenssi oli sama kuin luonnollisessa tPA-proteiinissa, joka oli puhdistettu viljellystä ihmiskudoksesta (melanoomakudokses-ta).

10 3. pT7:n (tPAss-tPA-no pUC) muodostaminen 5 pg muodosteesta pUC18#3 peräisin olevaa, noin 100 bp:n SmaI/Sau3A-kappaletta ligatoitiin 500 ng:aan Smal/BamHI-leikattua muodostetta pTl. Tämä ligaatioseos transformoitiin E. coli MC 1061-soluihin ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Positiiviset 15 pesäkkeet tunnistettiin siitä, että läsnä oli 360 bp:n vyöhyke 260 bp:n vyöhykkeen sijasta yhdistelmällä Apal/PvuII pilkottaessa. Muokatun 3'-pään sekvenssi määritettiin, ja sen todettiin olevan asianmukainen sekvenssi ilman ylimääräisiä pUC18-sekvenssejä. Tästä plasmidista käytettiin merkintää pT49.

20 Autenttista tPA-signaalisekvenssiä koodaavat oligonukleotidit lisättiin plasmidin pT49 Xbal-kohtaan, minkä jälkeen toteutettiin kaksi mutageneesiä 1) tPA-signaali-sekvenssin ja kypsää tPA.ta koodaavan sekvenssin väliin jääneen sekvenssin 8 yli-; määräisen nukleotidin hävittämiseksi, sekä 2) PHOl-signaalisekvenssin hävittämi seksi. Nämä manipuloinnit toteutettiin seuraavasti.

25 ! Ensin syntetoitiin oligonukleotidi, jolla oli seuraava sekvenssi (109 nukleotidiä): > *

5 ’ CTA GAT GGA TGC AAT GAA GAG AGG GCT CTG CTG TGT GCT GCT

' : GCT GTG TGG AGC AGT CTT GCT TTC GCC CAG CCA GGA AAT CCA TGC

30 CCG ATT CAG AAG AGG AGC CAG A3 ' .

» · t i i : Toista juostetta varten välttämätön täydentävä vastinoligonukleotidi syntetoitiin • ·. kolmena oligonukleotidinä, joiden pituudet olivat vastaavasti 33, 37 ja 39 nukleoti diä, ja joilla oli seuraavat sekvenssit: 35 f**· 5' CTG GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG 3' ':' · I 5' CTA GTC TGG CTC CTC TTC TGA ATC GGG CAT GGA TTT C 3' 5' CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT 31 11347/' 34 Täysipituinen oligonukleotidi ja nämä kolme täydentävää vastinoligonukleotidiä ki-nasoitiin ja liitettiin yhteen kuumentamalla kiehuvassa vesihauteessa 3 minuuttia ja jäähdyttämällä sitten hitaasti huoneen lämpötilaan. Yhdistetty oligonukleotidi erotettiin ja eristettiin 5 % polyakryyliamidigeeliltä.

5 200 ng osittain Xbal-linearisoitua muodostetta pT49 ligatoitiin 1 pg-.aan tätä yhdistettyä kaksijuosteista oligonukleotidiä. Tämä ligaatioreaktio transformoitiin E. coli MC 1061-soluihin ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Oikealla tavalla muuntuneen plasmidin sisältävät kloonit tunnistettiin ylimääräisestä 700 bp:n vyöhykkeestä Asu-10 II-entsyymillä pilkottaessa. Tästä oikeasta plasmidista käytettiin merkintää pT544.

Ensimmäinen mutageneesi toteutettiin tavanomaisena f 1-perustuvana kohtaohjattu-na mutageeneesinä käyttäen pT544 DNA:ta (5 pg) sekä oligonukleotidiä (1 pg), jolla oli seuraava sekvenssi: 15 5' GA TTC AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AG 3'.

Asianmukainen plasmidi seulottiin Bglll-entsyymillä pilkkomalla. Oikea restrik-tiokuvio (1,1, 2,8 ja 5,3 kb) osoitti asianmukaisen plasmidin, josta käytettiin merkin-20 tää pT64. (Epäasianmukaisen plasmidin kuvio muodostui 2,8 ja 6,3 kb:n vyöhykkeistä.)

Toinen mutageneesi toteutettiin plasmidilla pT64 PHOl-signaalisekvenssin hävit- . ·. tämiseksi. Sekvenssiltään seuraavanlaista oligonukleotidiä käytettiin: : \ 25 » ! 5' ACT AAT TAT TCG AAA CGA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G 3' 9 » 3 pg muodostetta pT64 ja 0,4 pg edellä kuvattua oligonukleotidiä käytettiin muta-geneesiin. Minipreparaatit seulottiin Bglll.lla pilkkomalla. Asianmukainen plasmidi 30 tunnistettiin kolmesta DNA-kappaleesta, joiden koko oli 1, 28 ja 5,3 kb (epäasian-: V mukaisessa plasmidissa todettiin pienimmäksi vyöhykkeeksi 1,1 kb 1 kb:n sijasta).

’ _: Mutageneesi varmistettiin määrittämällä sekvenssi, ja asianmukaisesta plasmidista • ’ , käytettiin merkintää pT7.

» » »· t » « » > · < » 11347*· 35

Esimerkki X

pAPBIOI: PHOl-promoottori-IacZ-ilmentämisplasmidin muodostaminen Tämä esimerkki osoittaa, että PHOl-promoottori (tai 5'-säätelyalue) (SEQ ID NO:2) 5 toimii, kun se on kytketty toimivasti heterologisiin geeneihin. 1 pg IacZ-sisältävää plasmidia pSAOH5 (NRRL B-15862) pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja BamHI, ja 10,1 kb:n vektorikappale eristettiin 0,8 % agaroosigeeliltä. 5 μg plasmidia pLP2420 pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Bell ja 1 % agaroosigeeliltä eristettiin 1,6 kb:n kappale, joka sisälsi 375 emäsparia pBR322 DNA:ta, noin 1075 emäsparia PHOl 5' 10 reunustavasta DNA:sta, PHOl-promoottori (SEQ ID NO:2) mukaan lukien, sekä 123 emäsparia PHOl-koodausketjusta. 100 ng pSAOH5:n EcoRI-BamHI-kappaletta ja 60 ng pLP2420:stä saatua 1,6 kb:n EcoRI-BclI-kappaletta ligatoitiin 20 pl:ssa seosta, joka sisälsi ligaasipuskuria ja 1 mM ATP sekä 1U T4 DNA-ligaasia (saatavana yhtiöstä Boehringer Mannheim). Ligaatioseos transformoitiin E. coli JM 103-15 kantaan ja nämä transformoidut solut maljattiin LB Amp-maljoille, jotka sisälsivät 40 pg/ml X-gal. Sinisiksi värjäytyneet pesäkkeet valittiin, kasvatettiin LB Amp-alustalla ja plasmidi-DNA eristettiin. DNA pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Smal ja asianmukainen plasmidi tunnistettiin sen perusteella, että siitä vapautui 1450 kb:n kappale. Oikeasta plasmidista käytettiin merkintää pAPBIOI. Tämä plasmidin 20 pAPBIOI sisältämä ilmentämiskasetti koostui E. coli IacZ-geenistä, joka oli Pichia pastoris PHOl-promoottorielementin (SEQ ID NO:2) säätelyn alaisuudessa.

10 pg leikkaamatonta plasmidia pAPBIOI transformoitiin GS115-sferoplasteihin ja histidiiniprototrofit valikoitiin. 12 His+-pesäkettä valttiin, kantoja kasvatettiin run-| 25 säästi fosfaattia (HP) sisältävässä nestemäisessä alustassa ja LP-alustassa, ja niistä ,· määritettiin β-galaktosidaasiaktiivisuus. Positiiviset transformanttikannat tunnistet- tiin β-galaktosidaasin ilmentymisen perusteella LP-alustalla kasvattamisen jälkeen, sekä β-galaktosidaasin puuttumisen perusteella HP-alustalla kasvattamisen jälkeen. β-galaktosidaasi analysoitiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa J.H. Miller, . . 30 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, NY, 1972. Sinisiä pesäkkeitä ilmaantui LP-X-gal-maljoille ja valkoisia pesäkkeitä *;** ilmaantui HP-X-gal-maljoille.

• » #» »

·:·· Esimerkki XI

35 * , Seuraavat plasmidit muodostettiin tämän hakemuksen muissa esimerkeissä käyttöä varten.

36 1 1347/’ 1. Plasmidin pAO810 muodostaminen M13mpl9ARI muodostettiin pilkkomalla 1 pg M13mpl9-faagia EcoRI-entsyymillä, täyttämällä Klenow-reagenssilla ja ligatoimalla täytetty kappale itsensä kanssa; tällä ligaatiolla transformoitiin E. coli JM103-soluja ja asianmukainen faagi tunnistettiin 5 eristämällä DNA ja pilkkomalla se entsyymillä EcoRI. EcoRI ei pilkkonut tätä asianmukaista faagia, josta käytettiin nimitystä M13mpl9ARI. Plasmidi pAO804 (jonka muodostaminen on kuvattu patenttijulkaisussa W089/04320, joka liitetään oheen tällä viittauksella) pilkottiin entsyymeillä SstI ja EcoRI ja arviolta noin 1,2 kb:n kappale eristettiin 0,8 % agaroosigeeliltä. (Tässä muodostuksessa kaikki 10 kappaleet eristettiin 0,8-1,0 % agaroosigeeleiltä.) 100 ng tätä kappaletta ligatoitiin 500 ng:aan SstI- ja Smal-pilkottua M13mpl9ARI-faagia. Tällä ligaatiolla transformoitiin E. coli JM103-soluja, ja asianmukainen faagi tunnistettiin eristämällä DNA ja pilkkomalla se entsyymeillä SstI ja PvuII. Asianmukainen faagi tunnistettiin 950 emäsparin kappaleen läsnäolosta, ja siitä käytettiin merkintää pPSVIOl.

15

Yhdellä pikomoolilla faagia pPSVIOl toteutettiin in vitro oligonukleotidilla ohjattu kohtaspesifinen mutageneesi käyttäen 20 pikomoolia oligonukleotidiä, jolla oli seu-raava sekvenssi; 20 5' CGA GGA ATT CCC CGG GAT CCT TAG ACA T 3’ Tällä reaktioseoksella transformoitiin E. coli JM103-soluja. Asianmukainen faagi ,· tunnistettiin pilkkomalla mini-prep-DNA Bglll- ja BamHI-entsyymillä, mikä osoitti ,·’ 1,4 kb:n ja 0,5 kb:n DNA-kappaleiden läsnäolon. Asianmukaisesta faagista käytet- ’ | 25 tiin merkintää pPS V102.

- ·

Plasmidi pPSV102 pilkottiin EcoRI-entsyymillä ja 500 ng 8,5 kb:n kappaletta ligatoitiin 50 ngtaan seuraavaa kaksijuosteista synteettistä DNA-kappaletta, johon oli koodautunut Pichia pastoris PHOl-signaalisekvenssi /SEQ ID NO:3), käyttäen seu-30 raavia optimoituja Pichia-kodoneita: t

;1 ‘ 5'-AATTC ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT

3'-G TAC AAG AGA GGT TAA AAC AGG AAC CTT TAA TAA AAT CGA

i 35 TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT CGA G-3' I | : ’ AAC CGA TGA AAC GTT AGA CAG AAG CGA GCT C TTAA-5' 11347/! 37 Tällä ligaatioseoksella transformoitiin E. coli CJ236-soluja, ja asianmukainen faagi-DNA tunnistettiin plakkihybridisaatiolla hiivan signaalisekvenssin yhden koodaavan juosteen kanssa, joka oli merkitty 32P-isotoopilla, ja pilkkomalla hybridisoituva DNA entsyymeillä SstI ja BamHI 700 bp:n kappaleen paljastaen. Tästä plasmidista 5 käytettiin merkintää pPS V103.

Yksi pikomooli plasmidia pPSV103 mutagenoitiin in vitro 20 pikomoolilla oligo-nukleotidiä, jonka sekvenssi oli: 10 5' CTAA TTA TTC GAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT 3’

Asianmukainen faagi-DNA tunnistettiin plakkihybridisaatiolla saman, edellä käytetyn oligonukleotidin kanssa. Asianmukaisesta plasmidista käytettiin merkintää pPSV104.

15

Plasmidi pAO810 valmistettiin pilkkomalla 10 pg plasmidia pPSV104 entsyymillä Hindlll, ja eristämällä 400 bp:n DNA-kappale 1,2 % agaroosigeeliltä. 50 ng tätä kappaletta ligatoitiin 250 ng:aan muodosteesta pAO807 saatua 7,9 kb:n Hindlll-pilkkomistuotetta, joka eristettiin 0,8 % agaroosigeeliltä (pAO807:n valmistus on 20 kuvattu jäljempänä). Tämä ligaatio transformoitiin E. coli MC 1061-soluihin ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin sen perusteella, että läsnä oli 450 bp:n vyöhyke entsyymeillä BamHI ja EcoRV pilkottaessa, ja siitä käytettiin merkintää pAO810.

25 2. pAO807:n muodostus a. fl-ori DNA:n valmistus fl bakteeriofaagi-DNA (50 pg) pilkottiin 50 yksiköllä entsyymejä RsaI ja Dral • (valmistajan ohjeiden mukaan), jolloin saatiin vapautumaan noin 458 bp:n DNA- 30 kappale, joka sisälsi fl-replikaation alkamiskohdan (ori). Pilkkomisseos uutettiin : yhtäsuurella tilavuudella PCI-liuosta, mitä seurasi vesikerroksen uuttaminen yhtä *, suurella tilavuudella CI-liuosta ja lopuksi vesifaasissa ollut DNA saostettiin asetta- ;, maila NaCl-pitoisuus arvoon 0,2M ja lisäämällä 2,5 tilavuutta absoluuttista etanolia.

··’ Seoksen annettiin seisoa jäissä (4 °C) 10 minuutin ajan, minkä jälkeen saostunut 35 DNA otettiin talteen sentrifugoimalla 30 minuuttia nopeudella 10000xg mikrofugis-sa, 4 °C:ssa.

i t I ä » i » 11347/ 38 DNA-kasauma pestiin kahdesti 70 % etanolin vesiliuosta. Pesty kasauma kuivattiin vakuumissa ja liuotettiin 25 pl:aan TE-puskuria. DNA käsiteltiin elektroforeettisesti 1,5 % agaroosigeelilllä ja se geeliosa, joka sisälsi tämän -458 bp:n fl-ori-kappaleen, leikattiin erilleen ja tässä geeliosassa ollut DNA eluoitiin sähköisesti DE81-paperille 5 (Whatman) ja se eluoitiin paperilta IM NaCl-liuokseen. DNA-liuos saostettiin edellä kuvatulla tavalla ja saostunut DNA liuotettiin 25 pl:aan TE-puskuria (fl-ori-kappale).

b. fl-ori:n kloonaaminen plasmidin pBR322 Dral-kohtiin 10 pBR322 (2 pg) pilkottiin osittain 2 yksiköllä entsyymiä Dral (valmistajan ohjeiden mukaan). Reaktio päätettiin PCI-uutolla, minkä jälkeen DNA-saostettiin edellisessä vaiheessa kuvatulla tavalla. DNA-kasauma liuotettiin 20 pltaan TE-puskuria. Noin 100 ng tätä DNA:ta ligatoitiin 100 ng:aan fl-ori-kappaletta (vaihe a) 20 pl:ssa ligaa-tiopuskuria inkuboimalla 14 °C:ssa yön yli yhdessä T4 DNA-ligaasin 1 yksikön 15 kanssa. Ligaatio päätettiin kuumentamalla 70 °C:n lämpötilaan 10 minuutiksi, minkä jälkeen sillä transformoitiin E. coli-kanta JM103 pBRfl-ori:n saamiseksi, joka sisältää fl-ori:n kloonattuna plasmidin pBR322 Dral-kohtiin (nukleotidiasemat 3232 ja 3251).

20 c. pAO807:n muodostus

Muodostetta pBRfl-ori (10 pg) pilkottiin 4 tunnin ajan 37 °C:ssa kulloinkin 10 yksiköllä entsyymejä PstI ja Ndel. Pilkottu DNA PCI-uutettiin, saostettiin ja liuotettiin 25 pl.lla TE-puskuria edellä vaiheessa 1 esitetyllä tavalla. Tämä materiaali käsitel-; tiin elektroforeettisesti 1,2 % agaroosigeelillä ja fl-ori:n sisältävä Ndel-Pstl-kappale : ; 25 (noin 0,8 kb) eristettiin ja liuotettiin 20 pl:aan TE-puskuria edellä vaiheessa a kuva- , : tulla tavalla. Noin 100 ng tätä DNA:ta sekoitettiin 100 ng:aan muodostetta pAO804, joka oli pilkottu entsyymeillä PstI ja Ndel ja käsitelty fosfataasilla. pAO804 on ku-!.. vattu julkaisussa W089/04320. Tämä seos ligatoitiin 20 pl:aan ligaatiopuskuria in kuboimalla yön yli 14 °C:n lämpötilassa siten, että läsnä oli 1 yksikkö T4 DNA-30 ligaasia. Ligaatioreaktio päätettiin kuumentamalla 70 °C:ssa 10 minuuttia. Tällä ·' ·' DNA:lla transformoitiin E. coli-kanta JM103, jolloin saatiin pAO807.

* t t » »

; Esimerkki XII

,..,: pPSV218:n muodostus ’· ’ 35 : 1 ‘ 200 ng pLP2420:sta saatua 1,6 kb:n EcoRI/BclI-kappaletta, 100 ng pPG2.5:stä saa- ‘ : tua 0,8 kb:n Bglll/Hindlll-kappaletta (katso alla oleva kuvaus) ja 100 ng pUC8:sta saatua 2,6 kb:n EcoRI/Hindlll-kappaletta (New England Biolabs, Inc.) ligatoitiin 39 1 1347'! kolmiosaisena ligaationa 20 μ1:η tilavuudessa ligaatiopuskuria, 1 mM ATP, 1U T4-ligaasia, ja transformoitiin E. coli-kantaan MC 1061 Amp-vastustuskyvyn aikaansaamiseksi. [Plasmidi pPG2.5 on pPG4.0:sta (NRRL B-15868) saatu 2,5 kb:n Eco-RI-SalI-kappale sijoitettuna plasmidiin pBR322, joka sisältää alkoholioksidaasipro-5 moottorin.] Vastustuskykyiset kloonit analysoitiin sellaisten plasmidien löytämiseksi, jotka sisälsivät 2,4 kb:n EcoRI+Hindlll-kappaleen; asianmukaisesta plasmidista käytettiin merkintää pPSV201. 50 ng pPSV201 pilkottiin entsyymillä BamHI, defos-foryloitiin ja ligatoitiin oligonukleotidin, jolla on seuraava sekvenssi, 50-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa: 10 5'-GATCAGATCT-31 jolloin BamHI-kohta muuttuu Bglll-kohdaksi. Positiiviset kloonit tunnistettiin tällä perusteella ja plasmidista käytettiin merkintää pPSV203. 10 ng plasmidia pPSV203 15 pilkottiin osittain rajoittavalla määrällä entsyymiä Hindlll ja päät tehtiin tylpiksi Klenow-reagenssilla. Lineaariset täysipituiset plasmidikappaleet geelipuhdistettiin ja ligatoitiin itsensä kanssa 100 μ1:η tilavuudessa. Asianmukaiset kloonit tunnistettiin 1350 bp:n Bglll/Hindlll-kappaleen sisältävän plasmidi-DNA:n perusteella ja asianmukaisista plasmideista käytettiin nimitystä pPSV210.

20 60 ng plasmidista pLP2420 saatua 500 bp:n Bglll-BamHI-kappaletta ligatoitiin 100 ng.aan entsyymillä BamHI-pilkottua plasmidia pUC8. Asianmukaiset plasmidit : tunnistettiin niissä läsnäolevan 422 bp:n NcoI-BamHI-kappaleen perusteella; tulok sena saadusta plasmidista käytettiin merkintää pPSV202. 50 ng plasmidia pPSV202 ; 25 pilkottiin entsyymillä BamHI, defosforyloitiin ja ligatoitiin oligonukleotidin, jolla '. on seuraava sekvenssi, 50-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa: • » ‘ f ’ 5’-GATCAGATCT-31 30 jolloin BamHI-kohta muuttui Bglll-kohdaksi. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin ', · läsnäolevan 422 bp:n NcoI/Bglll-kappaleen perusteella, ja siitä käytettiin merkintää ;;;.· ppsv204.

10 pg plasmidia pPSV210 pilkottiin entsyymeillä Bglll ja Sacl, ja 700 bp:n kappale 35 geelipuhdistettiin. 25 ng tätä kappaletta ligatoitiin 100 ng:aan muodosteesta • *·· pAO810 saatua, geelipuhdistettua 8200 bp:n Bglll/SacI-kappaletta. Asianmukaiset ; ; plasmidit tunnistettiin läsnäolevan 700 bp:n BglH/SacI-kappaleen perusteella, ja niistä käytettiin merkintää pPSV212. 10 pg plasmidia pPSV212 pilkottiin entsyymil- 11347'; 40 lä Sphl, päät tehtiin tylpiksi T4 DNA-polymeraasilla (katso julkaisu Maniatis et ai.), pilkottiin osittain entsyymillä Bglll, ja 8000 bp:n kappale geelipuhdistettiin. 10 μg plasmidia pPSV204 pilkottiin entsyymillä Ncol, päät tehtiin tylpiksi Klenow-rea-genssilla, pilkottiin entsyymillä Bglll, ja 440 bp:n kappale geelipuhdistettiin. 100 ng 5 edellä kuvattua, pPSV212:sta saatua 8 kb:n kappaletta ligatoitiin 15 ng:aan pPSV204:stä saatua 440 bp:n kappaletta. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin 5500 bp:n Bglll-kappaleen läsnäolon perusteella, ja siitä käytettiin nimitystä pPSV218.

Esitettyjen esimerkkien tarkoituksena on pelkästään havainnollistaa oheisen keksin-10 non soveltamista käytäntöön, eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa keksintöä tai liitteenä olevia patenttivaatimuksia millään tavalla. Kohtuullisten muunnosten ja muokkausten, jotka eivät kuitenkaan poikkea keksinnön hengestä ja tavoitteista, katsotaan kuuluvan tavoitellun patenttisuojan piiriin.

15 I I « » » • f · k e • » » « » » * • » t · • · · 4i 11347-4 LUETTELO SEKVENSSEISTÄ (1) YLEISTIETOA 5 Sekvenssien lukumäärä: 5 (2) SEG ID NO:1—SEKVENSSIIN LIiTtyVai iituOi

Ci) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (A) PITUUS: 1994 bp CB) TYYPPI: nukleiinihappo •;C) JUOSTEISUUS: yksi juosteinen <D3 TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYF:,PI: perimän DNA

(Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1 GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 . * * .'· 1 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC ATG TTT TCT 'CCT ATT CTA 417 * ·

Met Phe Ser Pro lie Leu ::: -20 2 2 t M t * · 42 1 15474 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG GTT 468

Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Vai Phe Ala Val -15 -10 -5 1 GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC TAT CCT CAG AGG ACA 519

Glu Leu Gin His Val Leu Gly Val Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 570

Asp Asp Gin Tyr Asn lie Leu Arg His Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lie 20 25 30 35 GGT TAC ΛΑΤ GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 621

Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Ser Cys Thr 40 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 672 lie Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 723

Asn Val Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 774

Val Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 825

Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 GGG TTA AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 876

Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 125 130 135 • I · t 1 · » * » » t 11347/' 43 CAT TTG ΑΤΑ AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 927

His Leu lie Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 140 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 978

Ser Gin Glu Arg Val Val Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 1029

Lys Ser Asn Tyr Thr Val Met Val Glu Val Val Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 1080

Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 1131

Ser His lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 1182

Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 1233 *· lie Pro Thr lie Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu 240 245 250 255 -- » TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 1284

Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr » 260 265 270 : CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC AAT GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 1335

Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Val Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290

• · I

» ► » » » » 44 1 1347-·: AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 1386

Lys Thr lie Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 1437

Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1488

Thr Asp Leu Leu Gin Vai Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Val Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA ΤΤΛ GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1539

Leu Pro Leu Asp Gin lie Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lys Ser Thr Glu lie 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1590

Val Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Val Glu 360 365 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1641

Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Val Arg Thr lie Leu Asn Asp Ala Val Phe Pro 375 380 385 390 > 9 • CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1692 » Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 395 400 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1743 "·. Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys ;[ 410 415 420 425 » GGA GTT CCT AAA AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1794

Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp » 430 435 440 45 11347/ GAC TTG TCA TAAAAATGGT AAGGAATGTT TTGCATCAGA TACGAGTTCA AAACGATTAA 1853 Asp Leu Ser 445 GAAGAGAATG CTCTTTTTTT TGTTTCTATC CAATTGGACT ATTTTCGTTT ΛΤΤΤΤΑΛΑΤΑ 1913 GCGTACAACT TTAACTAGAT GATATCTTCT TCTTCAAACG ATACCACTTC TCTCATACTA 1973 GGTGGAGGTT CAATGGATCC 1993

(2) SEQ ID NO:2-SEKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (ft) PITUUS: 400 bp (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(>;i ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 2 : GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 : ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 / TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 ' » * ; . TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT'CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC 399 46 1 1347*''

(2) SEG ID NO:3-3EKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (A) PITUUS: 66 bp (B) TYYPPI: nukleiinihappo (O JUOSTEISUUS: yksi juostei nsn (D) T0P0L05IA: lineaarinen

:ii) MQLEKY'YL ITYYPPI: per i man DNA

(xi > SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3 ATG TTT TCT CCT ATT CTA 18 Met Phe Ser Pro lie Leu -20 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG 66 Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Vai Phe Ala -15 -10 -5

(2) SEQ ID N 0:4—SEKVEN5S11N LIITTYVÄT TIEDOT

: Ci) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (A) PITUUS: 1341 bp (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C> JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii> MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

* » (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEO ID NO: 4 t • I 1 » 47 1 13474 GTT 3 Vai 1 GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC TAT CCT CAG AGG ACA 54

Glu Leu Gin His Val Leu Gly Val Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 105

Asp Asp Gin Tyr Asn lie Leu Arg His Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lie 20 25 30 35 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 156

Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Ser Cys Thr 40 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 207 lie Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 258

Asn Val Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 » / GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 309

Val Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe t · 90 95 100

It I

V GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 360 » · t ·,,,· Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser /··. 105 110 115 120 • · * » » » »

Ml· 113474 48 GGG TTA AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 411

Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 125 130 135 CAT TTG ΑΤΛ AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 462

His Leu lie Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 140 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 513

Ser Gin Glu Arg Val Val Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 564

Lys Ser Asn Tyr Thr Val Met Val Glu Val Val Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 615

Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 666

Ser His lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 : GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 717 « • Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ♦ ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 768 ,, . lie Pro Thr lie Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu 240 245 250 255 I · :'t”: TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 819 *:1’i Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 • · • > » 1 > ·

I I

49 113474 CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC ΛΛΤ GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 870

Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Vai Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 921

Lys Thr lie Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 972

Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1023

Thr Asp Leu Leu Gin Val Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Val Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA TTA GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1074-

Leu Pro Leu Asp Gin lie Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lys Ser Thr Glu lie 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1125

Val Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Val Glu 360 365 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1176

Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Val Arg Thr lie Leu Asn Asp Ala' Val Phe Pro 375 380 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1227 p t

Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Fhe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 1 ‘ 395 400 405 » # GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1278

Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys 410 415 420 425 11347/ 50 GGA GTT CCT ΑΑΛ AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1329 Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu I.eu Ser Phe Phe Trp Asp 430 435 440 GAC TTG TCA TAA 1341 Asp Leu Ser 445

<2) SEQ ID NO:5—SEKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (A) PITUUS: 187 bp (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen <D) TOPOLOSIA: lineaarinen

<ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(>: i) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 5 AAATGGTAAG GAATGTTTTG CATCAGATAC GAGTTCAAAA CGATTAAGAA GAGAATGCTC 60 ; TTTTTTTTGT TTCTATCCAA TTGGACTATT TTCGTTTATT TTAAATAGCG TACAACTTTA 120 • » ACTAGATGAT ATCTTCTTCT TCAAACGATA CCACTTCTCT CATACTAGGT GGAGGTTCAA 180 TGGATCC 187 I i • « » · * » * i ·

Claims (6)

1. DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoriksen happaman fosfataasin 5’-säätelyalueen, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 2, jossa 5 mainittu DNA-kappale on toiminnallisesti kytketty heterologiseen DNA-sekvens-siin, joka koodaa ainakin yhtä polypeptidiä, joka polypeptidi ei ole kudosplasmino-geeniaktivaattori (tPA) tai invertaasi.

2. DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoriksen happaman 10 fosfataasin signaalisekvenssin, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 3, jossa mainittu DNA-kappale on toiminnallisesti kytketty heterologiseen DNA-sekvens-siin, joka koodaa ainakin yhtä polypeptidiä, joka polypeptidi ei ole kudosplasmino-geeniaktivaattori (tPA) tai invertaasi.

3. Eristetty DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoriksen hap paman fosfataasin signaalisekvenssin (SEQ ID NO 3) toiminnallisesti kytkeytyneenä 5'-säätelyalueeseen ja että 5'-säätelyalue on Pichia pastoriksen happaman fosfataasin 5'-säätelyalue (SEQ ID NO 2) tai Pichia pastoriksen alkoholioksidaasin (AOX1) säätelyalue. 20

4. Menetelmä polypeptidin erittämiseksi Pichia pastoris -solusta, tunnettu siitä, että tätä erittymistä ohjaa Pichia pastoriksen happaman fosfataasin geenistä peräisin ; olevan signaalisekvenssin (SEQ ID NO 3) läsnäolo. ♦ | 25

5. DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoriksen happaman fosfataasin 5’-säätelyalueen, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 2, jossa : mainittu DNA-kappale on toiminnallisesti kytketty heterologiseen DNA-sekvens- • ·1 siin, joka koodaa ainakin ihmisen seerumin albumiinia.

6. DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoriksen happaman • *. fosfataasin signaalisekvenssin, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 3, jossa mainittu DNA-kappale on toiminnallisesti kytketty heterologiseen DNA-sekvens- * siin, joka koodaa ainakin ihmisen seerumin albumiinia. * 1 1 1 11347*