FI104497B - DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta - Google Patents

DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta Download PDF

Info

Publication number
FI104497B
FI104497B FI893109A FI893109A FI104497B FI 104497 B FI104497 B FI 104497B FI 893109 A FI893109 A FI 893109A FI 893109 A FI893109 A FI 893109A FI 104497 B FI104497 B FI 104497B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sequence
dna sequence
aox2
dna
regulatory region
Prior art date
Application number
FI893109A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI893109A (fi
FI893109A0 (fi
Inventor
James Michael Gregg
Original Assignee
Res Corp Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Res Corp Technologies Inc filed Critical Res Corp Technologies Inc
Publication of FI893109A0 publication Critical patent/FI893109A0/fi
Publication of FI893109A publication Critical patent/FI893109A/fi
Priority to FI952675A priority Critical patent/FI105825B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104497B publication Critical patent/FI104497B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

104497 DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-biotekniikan aluetta. Yhden näkökohdan mukaisesti keksintö koskee DNA-sekvenssejä, jotka säätelevät DNA:n kopiointia. 5 Toisen näkökohdan mukaisesti keksintö koskee vektoreita, jotka sisältävät edellä kuvailtuja DNA-sekvenssejä. Vielä toisen näkökohdan mukaisesti keksintö koskee uusia soluja, jotka on transformoitu edellä kuvailluilla vektoreilla.
Esillä oleva keksintö koskee yleisesti geneettisen materiaalin käsittelyä, erityisesti RNA:n DNA:sta kopioinnin frekvenssin säätelyä. Tämä keksintö koskee erityisesti 10 Pichia pastoriksen alkoholioksidaasi II -geenin säätelyaluetta.
Yhdistelmä-DNA-biotekniikan kehittyminen viime vuosina on tehnyt mahdolliseksi hyvin monenlaisten käyttökelpoisten polypeptidien hallitun tuottamisen solujen avulla. Monia eukarioottisia polypeptidejä, esimerkiksi ihmisen kasvuhormonia, leukosyytti-interferoneja, ihmisen insuliinia ja ihmisen proinsuliinia, on tuotettu eri 15 mikro-organismien avulla. Jo käytettävissä olevan tekniikan jatkuvan soveltamisen odotetaan tulevaisuudessa mahdollistavan useiden muiden käyttökelpoisten poly-peptidituotteiden yhdistelmätekniikkaan perustuvan tuotannon.
: : : Yhdistelmätekniikan alueella käytettävä perustekniikka on alaa tuntevien henkilöi- ;; den tiedossa. Yhdistelmä-DNA-biotekniikan käytäntöön soveltamisen kannalta edul- : 20 lisesti läsnä oleviin perustekijöihin kuuluvat, mutta eivät rajoitu niihin: (1) yhtä tai : v. useampaa tavoiteltavaa polypeptidiä koodittava geeni, joka on toiminnallisesti kyt- • · keytynyt (toiminnallisesti kytkeytynyt tarkoittaa vierekkäin asettumista, jossa kom- • · · I . ponenttien keskinäinen asema on niiden tavanomaisen toiminnan suorituksen mu- • · · ’·*·* kainen) riittävien kontrollisekvenssien kanssa, joita tarvitaan ilmentämistä varten 25 isäntäsolussa; (2) vektori, tavallisesti plasmidi, johon nukleotidisekvenssi voidaan : liittää; vektori on mikä tahansa nukleotidisekvenssin sisältävä rakenne, jolla isäntä • · · v : voidaan transformoida; (3) sopiva isäntä, johon tavoiteltava nukleotidisekvenssi . · · \ voidaan siirtää, jossa yhteydessä isäntä sisältää myös sellulaarisen mekanismin, jon- ka avulla on mahdollista ilmentää se informaatio, jota siirretty nukleotidisekvenssi 30 koodittaa.
.··*. Yhdistelmätekniikassa käytettävä perustekijä on plasmidi, joka koostuu ympyrän muotoisesta kaksijuosteisesta DNAista, jota ensiksi tavattiin mikro-organismeilla. Plasmidien on todettu esiintyvän moninkertaisina kopioina solua kohti. Luonnollisina esiintyvien plasmidien lisäksi on valmistettu monenlaisia tekoplasmideja. Plas- 104497 2 midi sisältää informaation, joka tarvitaan plasmidin lisääntymiseen, so. autonomisen replikointisekvenssin ja/tai replikoinnin aloituskohdan. Yksi tai useampi keino, valikoitaessa plasmidi fenotyyppisesti transformoiduista soluista voidaan myös sisällyttää plasmidiin koodattuun informaatioon. Fenotyyppinen tai markkeriin perustuva 5 valintaominaisuus, kuten esimerkiksi antibioottiresistenssi, mahdollistaa isäntäsolun kloonien, jotka sisältävät kiinnostuksen kohteena olevan plasmidin, tunnistamisen ja valikoinnin suosimalla solujen kasvua selektiivisissä alustoissa. Vektoreita tai plasmideja voidaan katkaista yhdellä tai useammalla restriktioendonukleaasilla tai restriktioentsyymillä, joista kukin tunnistaa spesifisen nukleotidisekvenssin. Säätely-10 alue, joka on toiminnallisesti kytkeytynyt heterologiseen geeniin, so. geeniin, joka ei esiinny luonnollisena säätelyalueen yhteydessä, tai muita nukleotidisekvenssejä voidaan liittää sen jälkeen kytkemällä haluttu geneettinen materiaali toiminnallisesti katkaisukohtaan tai katkaisukohdan molemminpuolin oleviin, uudelleen konstruoituihin päihin.
15 Vektori siirretään sen jälkeen isäntäsoluun, jossa sen nukleotidisekvenssi voi ohjata isäntää suorittamaan erilaisia prosesseja tai toimintoja. Joitakin esimerkkejä ovat heterologisten polypeptidien ilmentäminen tai homologisten tai heterologisten poly-peptidien yli-ilmentäminen. Nukleotidin siirtämisprosessia isäntäsoluun nimitetään yleisesti transformaatioksi. Suuria vektorimääriä voidaan saada aikaan siirtämällä 20 vektori sopivaan isäntään vektorin kopioluvun lisäämiseksi. Vektorin kopioluvun li- ' ' : säämiseen yleisesti käytetty isäntäsolu on E. coli. Vektorit eristetään sen jälkeen :...; ensimmäisestä isännästä ja siirretään toiseen isäntäsoluun, jossa halutut vektori- johteiset aktiviteetit tapahtuvat, esimerkiksi polypeptidin tuottaminen. Lopputuot-teen tuottamisesta tällä tavalla DNA:n avulla käytetään nimitystä ilmentäminen. 25 Silloin kun geeni sijoitetaan oikein vektoriin, koskien niitä vektorin osia, jotka oh-. *. ·. jaavat koodittavan nukleotidisekvenssin kopiointia ja luentaa, muodostunutta vekto ria voidaan käyttää sen polypeptidisekvenssin tuottamiseen, jota liitetty geeni koo- ... dittaa.
• · · » · · ; Ilmentymistä säätelee säätelyalue. Säätelyalueet ovat heterologisia nukleotidisek- .···. 30 venssejä, jotka reagoivat erilaisiin ärsykkeisiin ja vaikuttavat RNA:n kopioitumis- ,***,· frekvenssiin. Ilmentyminen voidaan kytkeä päälle tai pois vasteessa ärsykkeeseen.
Ilmentymistä, joka on kytkeytynyt päälle vasteessa ärsykkeeseen nimitetään yleisesti derepressioksi tai induktioksi. Joitakin esimerkkejä indusoituvista ilmentymissys-teemeistä ovat AOXl-systeemi Pichia pastoriksessa, estrogeenisysteemi Xenopus 35 laeviksessa, ja metallotioneiimsysteemit apinoissa, ihmisissä, hamstereissa, hiirissä ja rotissa. Indusoituvat ilmentymissysteemit ovat tavallisesti tiukemmassa ohjauk- 3 104497 sessa kuin konstitutiiviset systeemit. Nämä systeemit sopivat hyvin geenitekniikan tarkoituksiin.
Yhdistelmä-DNA-biotekniikan käyttö voi käytännössä saada aikaan soluja, jotka pystyvät ilmentämään heterologisia nukleotidisekvenssejä. Heterologiset nukleotidi-5 sekvenssit ovat nukleotidisekvenssejä, joita ei luonnostaan esiinny isännässä. Esimerkkejä niistä voisivat olla isännässä luonnostaan esiintyvien säätelyalueiden uudet yhdistelmät rakennegeenien kanssa, jotka eivät luonnostaan liity tähän säätelyalueeseen. Toisena esimerkkinä voisi olla säätelyalueen yhdistelmä geenin kanssa, joka ei luonnostaan esiinny isännässä. Heterologinen polypeptidi voidaan tuottaa fuusiopo-10 lypeptidinä, so. heterologinen polypeptidi yhdistettynä homologisen tai heterologi-sen aminohapposekvenssin osaan. Alunperin saatu fuusiopolypeptidituote tuotetaan joskus inaktiivisessa muodossa, kunnes fuusiopolypeptidi halkaistaan ekstrasellu-laarisessa ympäristössä.
Kuten aikaisemmin tuotiin esille EP-patentissa 226 752 (liitetty tässä yhteydessä 15 viitteenä), Pichia pastoriksen genomi koodittaa kahta toiminnallista alkoholioksi-daasigeeniä, AOX1 ja AOX2.
Keksinnön mukaisesti on nyt havaittu 5'-pään säätelyalue, joka on liittynyt AOX2-rakennegeeniin. Metanoli tai hiilenlähteen niukkuus indusoivat tämän säätelyalueen. . ·: ·. Ilmentymisen maksimaalinen taso AOX2-säätelyalueelta on kuitenkin vain noin 5- 20 11% AOXl-säätelyalueen tasosta (AOXl-geeni tuotiin esille EP-patent- ' \ tihakemuksessa 85201235,0, joka on liitetty tässä viitteenä).
AOX2-säätelyaluetta voidaan käyttää ilmentämään heterologisia geenejä, ja se on erityisen käyttökelpoinen niissä tilanteissa, joissa proteiinin korkea ilmenemistaso . *;; on epäedullista.
• · 25 Esillä olevan keksinnön mukaisesti on löydetty, eristetty ja karakterisoitu DNA-: sekvenssi, joka säätelee DNA:n kopiointifrekvenssiä RNA:ksi. Tämän keksinnön • · · : mukaiset DNA-sekvenssit ovat käyttökelpoisia polypeptidituotteiden tuottamisessa . *· ·. metylotrofisilla hiivoilla, kuten esimerkiksi Pichia pastons.
• · · ' ’ ' Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
‘; 30 Kuvio 1 antaa käyttöön AOX1 (a)- ja AOX2 (b) -geenien restriktiokartat.
• ♦
Kuvio 2 esittää pBR322:n restriktiokarttaa.
Kuvio 3 esittää pYJ8:n restriktiokarttaa.
4 104497
Kuvio 4 esittää plasmidin pYM5 restriktiokarttaa.
Kuvio 5 esittää plasmidin pMR4 restriktiokarttaa.
Kuvio 6 esittää pMR4:n konstruoinnin virtauskaaviota.
Kuvio 7 esittää plasmidin pBPfl :n restriktiokarttaa.
5 Kuvio 8 esittää plasmidin pYJ55 restriktiokarttaa.
Kuvio 9 esittää plasmidin pYJ55 konstruoinnin virtauskaaviota.
Kuvio 10 esittää plasmidin pSAOH5 restriktiokarttaa.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön uusi DNA-sekvenssi, joka sisältää säätelyalueen, joka reagoi vähintään yhteen seuraavista olosuhteista: metano-10 Iin läsnäolo isäntäympäristössä tai hiilenlähteen niukkuus, kun isäntäsolua kasvatetaan muilla substraateilla kuin metanolilla. Tämän keksinnön mukainen säätelyalue pystyy ohjaamaan RNA:n kopiointifrekvenssiä, kun se on toiminnallisesti kytketty DNA-sekvenssin 5'-päähän, joka koodittaa mRNA.n tuotantoa.
Nämä ja muut keksintöä koskevat kohteet tulevat selviksi tässä annettavassa selvi-15 tyksessä ja patenttivaatimuksissa.
I. Alkoholioksidaasi-säätelyalueen karakterisointi :Täydellinen AOX2-geeni sisältyy kuviossa 1(b) annettavaan restriktiokarttaan.
:'·': AOX2-säätelyalue sijaitsee 5-pään ensimmäisen EcoRI-paikan ja AOX2-rakenne- geenin aloituskodonin välissä, kuten on esitetty restriktiokartassa kuviossa 1(b). Sitä 20 osaa DNA-sekvenssistä, joka koodittaa alkoholioksidaasi II -proteiinia ilmaistaan paksulla pylväällä restriktiokartan alla. Alkoholioksidaasi I -geenin restriktiokartta ... annetaan kahden kyseisen geenin vertailun vuoksi, kuvio 1(a). Mitään merkittävää • « · I.. sekvenssihomologiaa ei havaittu geenien proteiinia koodittavan osan ulkopuolella.
• · · .*··. Lisäkarakterisoinnin perusteella IacZ-fuusiorakenteen avulla, AOX2-säätelyalue ei 25 tarvitse enempää kuin noin emäsparit - 1500 - noin -1 säätelyaktiivisuuteen (kuten on osoitettu taulukossa 1). Taulukossa 1 annetaan AOX2-säätelyalueen sisältävän DNA-palasen nukleotidisekvenssi.
104497 5
Taulukko 1 AOX2-säätelyalue ja 5’-pään ei-luettava alue -1750 -1730 -1710 GGATCTCAAAAACCTAAGTACTTCATTTGAATATAACTCTGCACCTAAATTTACACCTAA 5 -1690 -1670 -1650 CTCTCTATCTAGGCTCTAGATTTGATAGATTCTATAGCCTTTGGTTTGTTATAGTGTTCA -1630 -1610 -1590 CCAACTGGATGTCCTAACGAAATGGTTCTGTGGTCTAGTTGGTTATGGCATATGCTTAAC -1570 -1550 -1530 10 ACGCATAACGTCCCCAGTTCGATCCTGGGCAGAATCATTATTTTTTGACCGAATTCTTTT -1510 -1490 -1470 TTTCAGACCATATGACCGGTCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT -1450 -1430 -1410 CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT-15 -1390 -1370 -1350 TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA 1330 -1310 -1290 GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT -1270 -1250 -1230 20 CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG - 1210 -1190 -1170 TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG -1150 -1130 -1110 CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG 25 -1090 -1070 -1050 CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA -1030 -1010 -990 AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT -970 -950 -930 30 AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT -910 -890 -870
....: CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA
-850 -830 -810
: ‘ ‘: CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA
35 -790 -770 -750
V : AG CGAGTCAT CAT CAC CAC C CAACGATGGTGAAAAACTTTAAG CATAGATTGATGGAGGG
-730 -710 -690 TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG -670 -650 -630 40 AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA *·· : -610 -590 -570
: ·: ·; TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC
-550 -530 -510
.·*·. TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT
*·*\ 45 -490 -470 -450
:*·: TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC
-430 -410 -390
· · AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT
-370 -350 -330
:...: 50 CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG
-310 -290 -270 CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT -250 -230 -210
ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA
6 104497 -190 -170 -150 AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA -130 -110 -90 AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT 5 -70 -50 -30
CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA
-10
AACAAATCAACTGAGAAAA
10 AOX2-säätelyalue reagoi vähintään yhteen seuraavista olosuhteista: metanolin läsnäolo ainoana hiilenlähteenä metylotrofisille hiivaisännille, kuten esimerkiksi Pichia pastoris, tai hiilenlähteen niukkuus mainituilla isäntäsoluilla. AOX2-säätelyalue stimuloi lisäksi 5-11 % β-galaktosidaasiproteiinituotannosta kuten AOX1-säätely-alue.
15 II. Alkoholioksidaasi II -säätelyalueen eristäminen Pichia pastoriksesta AOX2-säätelyalue eristettiin transformoimalla Pichia-kanta MC 100-3 (arg4 his4-aoxlA:SARG4 aox2A:Phis4). Tämä kanta sisältää Pichia HIS4 -geenin mutanttiko-pion liitettynä AOX2-geeniin. MC 100-3 transformoitiin pYM5:llä, plasmidilla, joka koostuu 2,7 keitä sisältävästä Bglll-palasesta, joka sisältää Pichia HIS4 -geenin lii-20 tettynä pBR322:n BamHI-paikassa. Usean MCIOO-3 (pYM5) His+ -transformantin DNA:ta seulottiin Southem-suodinhybridisaation avulla, kohteena transformantit, jotka sisälsivät pYM5:n yhdistyneenä HIS4-palaseen, sijoittuneena MCI00-3:n : AOX2-lokukseen. DNA:ta yhdestä näistä kannoista hydrolysoitiin sen jälkeen : : Hindlllilla, josta oli seurauksena noin 12 keitä sisältävän genomisen palasen vapau- 25 tuminen, joka sisälsi 5,3 keitä sekvenssiä AOX2 Kpnl -paikan 5-puolelta, 2,7 keitä i"·': Pichia HIS4 -geenistä, ja 4,0 keitä pBR322:sta. Hindlllilla katkaistu DNA ligoitiin .1:·. ja transformoitiin E. coliin. Transformantteja valikoitiin ampisilliiniresistenssin pe- rusteella. Yksi plasmidi, pMR4, saatiin talteen, ja tämän plasmidin restriktiokartta • · · esitetään kuviossa 5.
· · v : 30 III. AOX2-säätelyalueen ominaisuuksia • Il • » ( I · · ' · AOX2-säätelyalueen ilmenemisen vertailemiseksi AOXlm ilmenemiseen konstruoi- :...: tiin AOX2-lacZ-ekspressiovektori, joka oli mahdollisimman samanlainen kuin pSAOH5 (esitetty kuviossa 10), AOXl-lacZ-fuusiovektori. AOX2-lacZ-vektorin, .:. pYJ55 :n, konstruoinnin virtauskaavio esitetään kuviossa 9. Alustavat DNA-sekvens- .··. 35 situlokset AOX2:n 5'-päästä osoittivat, että AOX2 sisältää kaksi BamHI-paikkaa täysin samanlaisissa rakennegeenin asemissa kuin AOXl-rakennegeenistä tavatut. pYJ55:n konstruoinnin ensimmäisessä vaiheessa liitettiin sen vuoksi 1,8 keitä sisältävä Bglll-BamHI -palanen, joka sisältää AOX2-säätelyalueen ja 45 emäsparia ami- 104497 7 noterminaalisesta proteiinia koodittavasta sekvenssistä, pBPfl:n BamHI-paikkaan pYJ38:n muodostamiseksi. Toisessa vaiheessa pYJ38 katkaistiin BamHIillä, ja sama adaptorioligonukleotidi liitettiin, kuin mikä liitettiin AOXl-lacZ-vektorin (5-GATCACCCGGGT-3') konstruoinnissa. Tämän adaptorin liittäminen tuhosi 5 pYJ38:n BamHI-paikan ja sai aikaan uuden Smal-paikan liittämiskohdassa. Tämä plasmidi, pYJ45, hydrolysoitiin Smalrllä, ja 1,6 ke:tä sisältävä Smal-palanen, joka sisälsi modifioidun AOX2-promoottorin, liitettiin pBPfl:een plasmidin pYJ46 muodostamiseksi. Plasmidi pYJ46 hydrolysoitiin EcoRIillä 0,3 ke:tä sisältävän palan poistamiseksi AOX2-palasen 5'-päästä pYJ46:ssa. Plasmidi ligoitiin uudelleen 10 plasmidin pYJ55 muodostamiseksi. Plasmidin pYJ55 restriktiokartta annetaan käyttöön kuviossa 8.
Plasmidi pYJ55 transformoitiin kantaan GS115 (his4), ja His+-transformanteista seulottiin pysyvä His+-fenotyyppi, jossa näkyi liittyneen plasmidin läsnäolo. Usean pysyvän His+-kannan genominen DNA analysoitiin Southem-suodinhybridisaation 15 avulla plasmidin läsnäolon varmistamiseksi ja sijainnin määrittämiseksi.
AOX1- ja AOX2-promoottorien suhteellisten tehokkuuksien estimoimiseksi β-ga- laktosidaasin tuotantoa pYJ55:n ja pSAOH5:n avulla vertailtiin transformoimalli nämä plasmidit kantaan GSI15. Transformoituja GS115-kantoja merkittiin koodeilla GS115 (pYJ55) ja GS115 (pSAOH5) vastaavasti. Kumpikin kanta sisältää plasmidin : V: 20 kiinnittyneenä HIS4-lokuksessa. Kummankin kannan soluja kasvatettiin glyseroli- alustassa, siirrettiin alustaan, jossa ei ollut typpilähdettä 24 tunnin ajaksi, ja siirret- ....: tiin sen jälkeen metanolia sisältävään alustaan vielä 50 tunniksi. Näytteitä otettiin : ·. ·. jokaisen viljelmän jokaisen kasvuvaiheen lopussa, ja uutteita valmistettiin, ja niistä ]·;·, määritettiin β-galaktosidaasi. Näiden määritysten tulokset esitetään taulukossa 2.
• * · 0.’·· 25 Taulukko 2 . ·;·. AOXI- ja AOX2-fuusiovektoreista ilmenevän β-galaktosidaasin vertailu • · · * · · : β-galaktosidaasin aktiivisuus (U/pg) hiilenlähteessä • · · • · *···) Kanta Promoottori Glyseroli Ei hiiltä1 Metanoli1 GS115 (pSAOH5) AOXI <10 955 6205 C.: 30 GS115 (pYJ55) AOX2 <10 109 739 8 104497 1) YNB-alusta
Merkittäviä määriä β-galaktosidaasia ei todettu glyserolissa kasvaneissa soluissa kummallakaan kannoista AOXl-lacZ tai AOX2-lacZ. Alustassa, jossa ei ollut lainkaan hiilen lähdettä, aktiivisuustaso AOX2-lacZ-kannalla oli suunnilleen yksi kym-5 menesosa siitä tasosta, joka havaittiin AOXl-lacZ-kannalla. Metanolin lisääminen AOX2-lacZ:n sisältävän soluihin johti β-galaktosidaasitasoihin, jotka saavuttivat noin yhden yhdeksäsosan AOXI-lacZ-solujen tasoista. AOX1- ja AOX2-geenejä säädellään siten samalla tavalla. Yksi erottuva ominaisuus on AOX2-säätelyaluee-seen liittyvä merkittävästi alhaisempi vaste metanolille ja hiilenlähteen niukkuuteen.
10 Vaikkakin AOX2-säätelyalue^-galaktosidaasigeenifuusion saattamista isäntähiiva-soluun kuvailtiin tässä, alaa tuntevat tietävät, että tämän keksinnön käytäntöön soveltamisen kannalta ei ole välttämätöntä käyttää renkaan muotoisia plasmideja eikä galaktosidaasin rakennegeeniä. Muita vektoreita, joita pystytään säilyttämään hiivoissa, voidaan siten käyttää hyödynnettäessä tätä säätelyaluetta muiden heterologis-15 ten geenien kanssa. Tämä toiminnallisesti muihin heterologisiin geeneihin kytkeytynyt säätelyalue voidaan vaihtoehtoisesti kiinnittää isäntähiivasolun kromosomiin käyttäen liittäviä vektoreita. Tässä kuvaillun AOX2-säätelyalueen toiminnallisia mutantteja, jotka käsittävät lyhemmän DNA-sekvenssin 5-päästä, voidaan lisäksi myös käyttää heterologisen geenin ilmentymisen säätelemiseksi.
20 Esimerkkejä
Esimerkkeihin liittyvä yleinen informaatio '••I Kannat • ♦ · • · · • :Y: Pichia pastoris NRRLY-11430
Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851 ... 25 Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) NRRL Y-18017 ** * Pichia pastoris KM7121 (arg4 his4 aoxlA: SARG4 aox2A: :V: PHIS4) NRRL Y-18019 E. coliMC1061 [F'araDi39 (ara ABDIC-leu) 7679 lacX74 * · · · * galU galK rpsL hsdR] ’: ‘: 30 Alustat, puskurit, ja liuokset \ M Tris-puskuri 121,1 g Tris-emästä 800 ml.ssa H2O; pH sää- • · · · detään haluttuun arvoon lisäämällä väkevöityä (35 %) vedellistä HCl:a; liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan ennen lopullista 35 pH:n säätämistä, laimennetaan 1 l:n lopputi- lavuuteen.
104497 9 TE-puskuri 1,0 mM EDTA 0,01 M (pH 7,4) Tris- puskurissa.
SSC 0,15 MNaCl 15 mM natriumsitraatti 5 pH säädettynä 7,0:ksi NaOH:lla.
TAE 40 mM etikkahappo
5 mM EDTA
0,02 M (pH 8,3) Tris-puskurissa Denhardt'in liuos 5 g Ficoll 10 (50x) 5 g polyvinyylipyrrolidoni 5 g naudan seerumin albumiini (BSA; Pentax Fraction V) lopputilavuus säädettynä 500 ml:ksi vedellä.
20X SSPE 20 mM EDTA
15 0,16 MNAOH
0,2 M NaH2P04.H20 3,6 M NaCl pH säädettynä 7,0:ksi NaOH:lla.
LB (Luria-Bertani)- 5 g Bactotryptonia 20 alusta 5 g Bacto-hiivauutetta 2,5 g NaCl:a 1 l:ssa vettä, pH säädettynä 7,5:ksi NaOH:lla.
YPD-alusta 1 % Bacto-hiivauutetta 2 % Bacto-peptonia . : . 25 2 % dekstroosia YNB-alusta 6,75 g hiivan typpiperusalustaa ilman amino- :... happoja (DIFCO) 1 l:ssa vettä.
•: ‘: SED 1M sorbitoli
25 mM EDTA
30 50 mM DTT
*·* * SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia 0,168 gEDTA:a 50mlH2O:ta 35 -pH 5,8 :ksi HCLllä.
: CaS 1M sorbitoli 10mMCaCl2 ’ · · · ] —steriloidaan suodattamalla.
PEG-liuos 20 %polyetyleeniglykoli-3350:a 40 10mMCaCl2 ;; I' 10 mM Tris.HC 1 (pH 7,4) \.. —steriloidaan suodattamalla SOS 1 M sorbitoli 0,3x YPD-alusta 45 10 mM CaCl2 10 104497
Formamidiväriseos 0,1 % ksyleenisylenoli FF:a
0,2 % bromifenolisinistä 10 mM EDTA
95 % ionivaihdettua formamidia 5 Pintageeli 76,8 g ureaa 24 ml akryyliamidi-kantaliuosta 8 ml lOx TBE:a säädetään lopputilavuuteen 160 ml. Akryyliamidi-kantaliuos 38 g akryyliamidia 10 2 g bis(N,N-metyleenibisakryyliamidia), lisä tään vettä kokonaistilavuuteen 100 ml. Pohjageeli 14,4 g ureaa 3,0 g sakkaroosia 7,5 ml lOx TBE.a 15 4,5 ml akryyliamidi-kantaliuosta 0,3 ml bromifenolisininen liuosta (0,01 g/ml) lisätään vettä kokonaistilavuuden saamiseksi 30 ml:ksi.
dideoksi:
20 ddATP 0,125 mM
ddCTP 0,10 mM
ddGTP 0,10 mM
dd TTP 0,80 mM
DNTP-kantaliuokset 0,5 mM DGTP
25 0,5 mM DCTP
0,5 mM TTP 0,5 mM DATP
: ·: 10X Klenow-laimennuspuskuri 70 mM Tris.HCl, pH 7,5 200 mM NaCl 30 70mMMgCl2
’ 1 mM EDTA
: Y: 10X TMD, pH 7,5 0,1 M Tris.HCl, pH 7,5 0,05 M MgCl2 0,075 M DTT.
• · · *·* ‘ 35 • · · v : Ellei toisin ole mainittu, edelliset liuokset tarkoittavat käytettyä peruspitoisuutta « ;**; (lx). Kautta esimerkkien, joissa käytetään erilaisia pitoisuustasoja, kyseinen seikka
IM
....: osoitetaan viittaamalla liuokseen perus (lx) -pitoisuuden kerrannaiseen.
• · u 104497
Regeneraatioagar 1) Agar-KCl: 9 g Bacto-agaria, 13,4 g kaliumkloridia, 240 ml H20:ta, autokla-voidaan.
2) lOx glukoosi: 20 g dekstroosia, 100 ml H20:ta, autoklavoidaan.
5 3) lOx YNB: 6,75 g Yeast Nitrogen Base'a (hiivan typpiperusalusta) ilman ami nohappoja, 100 ml H20:ta, autoklavoidaan. (Lisätään mitä tahansa haluttua aminohappoa tai nukleiinihappoa pitoisuuteen 200 pg/ml saakka ennen tai jälkeen autokla voinnin.) 4) Lisätään 30 ml lOx glukoosia ja 30 ml lOx YNB:A 240 ml:aan sulatettua 10 Agar-KCl-liuosta. Lisätään 0,6 ml biotiinia, 0,2 mg/ml, ja mitä tahansa haluttua aminohappoa tai nukleiinihappoa pitoisuudeksi 20 pg/ml. Pidetään sulatettua rege-neraatioagaria 55-60 °C:ssa.
Pichia pastoriksen kasvatus P. pastorista kasvatettiin YPD (rikas)- tai YNB (minimaalinen) -alustassa. Tarpeen 15 mukaan YNB-alustaan lisättiin hiilenlähde (2 % dekstroosia, 1 % glyserolia tai 0,5 % metanolia) ja 50 pg/ml aminohappoa.
• t I
’·* Sekvensointi • ·
; ·: DNA.n sekvensointi suoritettiin Sangerin et ai. ketjuterminaatiomenetelmällä, PNAS
74,5463 (1977).
*.* * 20 Seuraavia lyhenteitä käytetään kauttaaltaan esimerkeissä: • ♦ • · · • · · • · EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo • · · v : TEMED N,N,N\N'-tetrametyleenidiamiini • · · • · · • · ♦ DTT ditiotreitoli • · • · ··· *:··: BSA naudan seerumin albumiini 25 EtBr etidiumbromidi » «
Ci Curie DATP deoksiadenosiinitrifosfaatti 104497 12 DGTP deoksiguanosiinitrifosfaatti TTP tymidiinitrifosfaatti DCTP deoksisytidiinitrifosfaatti DXTP "yleis"deoksitrifosfaattinukleotidi 5 oligo(dT)12-i9 Lähde: Collaborative Research, Inc.
Zymolyase 60 000 Lähde: Miles Laboratories Alkoholioksidaasi II -säätelyalueen eristäminen Esimerkki 1 PPF1 X KM7121 -pariuttaminen ja MC100-3:n kehittäminen 10 Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) (NRRL Y-18017) ja KM7121 (arg4 his4 aoxlA::SARG4 aox2A::PHIS4 (NRRL Y-18019) siirrettiin kumpikin vasta kasvatetulta YPD-maljalta steriiliä vettä sisältävään putkeen. Noin 5 X 107 solua kumpaakin kantaa sekoitettiin, sonikoitiin lyhytaikaisesti soluklimppien rikkomiseksi, ja levitettiin GNAP-agarmaljalle (5 % dekstroosia, 2 % peptonia, 1 % hiivauutetta, . ·: . 15 0,5 % agaria, 2,3 % ravinto-agaria). Sekoittamatonta kontrollinäytettä kummastakin . . kannasta (suunnilleen 1 X 108 solua) käsiteltiin samalla tavalla. GNAP-maljoja in- kuboitiin 30 °C:ssa noin 24 tuntia ja toistomaljattiin sen jälkeen sporulointialusta-.. . agarmaljoille (0,5 % Na-asetaattia, 1 % KCl:a, 2 % agaria). Näitä maljoja inkuboi- \ tiin noin 20 tunnin ajan 30 °C:ssa ja toistomaljattiin sen jälkeen minimaalialusta- * · · '·' ’ 20 agarmaljoille, jotka eivät sisältäneet hiilenlähdettä. Metanoli syöytettiin soluille minimaalimaljoilla kaasufaasissa.
Viiden päivän kuluttua ilmestyi noin 200 pesäkettä minimaalimaljalle, jolle siirros- tettiin soluseos. Pesäkkeitä ei kehittynyt lainkaan sekoittamattomia kontrolleja sisäl- • · · + + + täville maljoille, tulos, joka viittaa siihen, että Arg His Mut -pesäkkeet sekamaljal- ··· 25 la olivat diploidisia, mikä oli tuloksena PPF1- ja KM7121-solujen pariutumisista (Mut+ = metanolin käyttäminen). Näiden Arg+ His+ Mut+-kantojen diploidisuus varmistettiin tarkastelemalla AOX-lokuksia neljällä näistä kannoista Southern- « suodinhybridisaation avulla. Spesifiset koettimet, joita käytettiin, olivat: pPG3,0 (NRRL B-18022), AOX2-spesifmen koetin; pYJ30 (NRRL B-15890), HIS4-30 spesifinen koetin; ja pPG4,0 (NRRL B-15868), AOX1-spesifinen koetin.
13 104497 PPF1 X KM7121 -diploidien itiöimistä varten poimittiin ensin pesäke (MC 100) metanolialustaa sisältävältä diploidinvalinta maljalta. Näistä soluista noin 1 X 106 levitettiin GNAP-maljoille, ja niitä käsiteltiin kuten on kuvailtu pariutumismenette-lyn kohdalla, paitsi että itiöimismaljaa inkuboitiin neljän päivän ajan 30 °C:ssa, an-5 tamalla solujen saattaa itiöinti päätökseen. Itiöt otettiin talteen maljoilta huuhtele-malla jokainen malja 5 ml.lla steriiliä vettä. Suspensio pestiin kahdesti 3 ml:lla fosfaattipuskuria (0,1 M Na3PC>4, pH 7,5). Hiivaa hajottavien entsyymien seosta, Glu-sulase (Endo Laboratories, NY) ja Zymolyase (60 000 yksikköä/g; Miles Laboratories), ja (β-merkaptoetanolia lisättiin loppupitoisuuksiin 2 % (v/v), 0,5 mg/ml, ja 10 0,1 %, vastaavasti, vegetatiivisolujen tuhoamiseksi. Seosta inkuboitiin 5 tunnin ajan 30 °C:ssa.
Itiövalmistetta pestiin sen jälkeen kahdesti steriilissä vedessä, joka sisälsi 0,2 % Tween 80:ä (v/v), ja se resuspendoitiin fosfaattipuskuriin. Valmistetta käsiteltiin sen jälkeen kolmessa 20 sekuntia kestävässä sonikointisyklissä itiökokkareiden hajot-15 tamiseksi. Itiövalmistenäyte laimennettiin sen jälkeen ja levitettiin ei-valikoiville, minimaalialustaa sisältäville esiviljelymaljoille, joka alusta sisälsi 2,0 % glukoosia ja 50 pg/ml sekä arginiinia että histidiiniä. Näitä inkuboitiin 48 tuntia 30 °C:ssa. Jokainen esiviljelymalja toistomaljattiin sen jälkeen seuraavalle minimaalimaljasarjal-le: 1) glukoosi, -arg, -his 2) glukoosi, -arg, +his 3)glukoosi, +arg, -his ja 4) glukoosi, 20 +arg, +his.
I » · : Kahdenkymmenenneljän tunnin inkuboinnin jälkeen 30 °C:ssa pesäkkeitä tarkas- . : teihin Arg- ja His-fenotyyppien suhteen. Pesäkkeet, jotka olivat Arg+ His', testattiin sen jälkeen kasvun osalta metanolilla, levittämällä YNB-metanoliagarmaljoille.
• ·
Maljoja tarkasteltiin Mut-fenotyypin suhteen noin yhden viikon huoneen lämpöti- . ·. ·. 25 lassa kuluttua. Yhtä Arg+ His' Mut -kantaa merkittiin koodilla MC 100-3.
• · > * ·
Esimerkki II
·«· • * · • · ·
Pichia pastoriksen transformointi • · · «
Hiivasoluja siirrostethin noin 10 mhaan YPD-alustaa, ja niitä viljeltiin ravistelussa • · · 30 °C:ssa 12-20 tunnin ajan. Solut laimennettiin sen jälkeen A^o-arvoon noin 0,01- ·, 30 0,1, ja niitä pidettiin log-vaiheessa YPD-alustassa 30 °C:ssa noin 6-8 tunnin ajan.
•»· •;;; 100 ml: aan YPD-alustaa siirrostethin 0,5 ml siirrosviljelmää A^oo-tasolla noin 0,1, ja *··.* sitä viljelriin ravistellen 30 °C:ssa noin 12-20 tuntia. Kasvusto otettiin sen jälkeen talteen sentrifugoimalla, kun A^oo oli noin 0,2-0,3 (suunnilleen 16-20 tunnin kulut- 104497 14 tua), käyttäen DAMON IEC DPR-6000 -sentrifugia nopeudella 1500 g 5 minuutin aikana.
Sferoplastien valmistamiseksi soluja pestiin kerran 10 ml :11a steriiliä vettä (sentrifu-gointi suoritettiin jokaisen pesun jälkeen kuten edellä on kuvailtu), kerran 10 ml :11a 5 juuri valmistettua SED:a, kerran 10 ml:lla steriiliä 1 M sorbitolia, ja ne suspendoi-tiin uudelleen 5 ml.aan SCE-puskuria. 5 Zymolyase 60 000 -liuosta (Miles Laboratories), 4 mg/ml, lisättiin, ja soluja inkuboitiin 30 °C:ssa noin 30 minuutin ajan.
Sferoplastien muodostumista seurattiin seuraavasti. 100 μ1:η solueriä lisättiin 900 pl:aan 5-prosenttista SDS:a ja 900 pl:aan 1 M sorbitolia ennen Zymolyase-10 lisäystä tai juuri sen jälkeen, ja eri ajankohtana inkubaatiojakson aikana. Inkubointi lopetettiin kohdassa, jolloin solut hajoavat SDS:ssä mutta eivät sorbitolissa. Muo-dostuttuaan sferoplasteja pestiin kerran 10 ml:ssa steriiliä 1 M sorbitolia sentrifu-goimalla nopeudessa 1000 g 5-10 minuutin aikana, niitä pestiin kerran 10 ml:ssa steriiliä CaS.a sentrifugoimalla, ja ne suspendoitiin uudelleen 0,6 ml:aan CaS:a.
15 Varsinaista transformaatiota varten, DNA-näytteitä vedessä tai TE-puskurissa lisättiin (20 μ1:η kokonaistilavuuteen saakka) 12 X 75 mm:n steriileihin polypropyleeni-putkiin. (Pienillä DNA-määrillä tapahtuu maksimaalista transformaatiota, kun käytetään noin 1 μΐ E. colin sonikoitua DNA:ta, 5 mg/ml, kussakin näytteessä.) 100 μΐ ;·. sferoplasteja lisättiin jokaiseen DNA-näytteeseen ja inkuboitiin huoneen lämpötilas- . . 20 sa noin 20 minuutin ajan. 1 ml PEG-liuosta lisättiin kuhunkin näytteeseen ja inku- , ': boitiin huoneen lämpötilassa noin 15 minuuttia. Näytteitä sentrifugoitiin nopeudessa • · .. . 1000 g 5-10 minuutin ajan, ja supematantti hylättiin. Pelletit resuspendoitiin 150 pl:aan SOS:a, ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan.
# ♦ · *·*/ 850 μΐ steriiliä 1 M sorbitolia lisättiin jokaiseen, ja näytteet maljaviljeltiin kuten *·ν 25 jäljempänä on kuvailtu.
10 ml regeneraatioagaria kaadettiin kullekin maljalle vähintään 30 minuuttia ennen kuin transformaationäytteet olivat valmiit. 10 ml:n eriä regeneraatioagaria jaettiin * · · ]· myös putkiin 45-50-celsiusasteisessa hauteessa sen ajanjakson aikana, kun trans- formaationäytteet olivat SOS:ssä. Näytteet lisättiin sen jälkeen putkiin, vaiettiin 30 maljoille, jotka sisälsivät kiinteän pohja-agarkerroksen, ja niitä inkuboitiin 30 °C:ssa 3-5 päivän ajan.
• · I I
* * » ·· ,44 444 '··' Sferoplastien laatu eri kohdissa määritettiin seuraavasti. 10 μ1:η näyte poistettiin ja laimennettiin 100 X:ksi lisäämällä näyte 990 pl:aan 1 M sorbitolia. 10 pl:aa laimennusta poistettiin, ja 990 pl:n lisäerä 1 M sorbitolia lisättiin. 100 pl:aa kumpaakin 15 104497 laimennusta levitysviljeltiin YPD-agaralustan pinnalle valmisteeseen jääneiden ei-sferoplastisten ehjien solujen pitoisuuden määrittämiseksi. 100 pl:aa kutakin laimennusta lisättiin 10 ml.aan regeneraatioagaria, johon oli lisätty 40 μΐ/ml kaikkia isännän tarvitsemia aminohappoja, regeneroitavissa olevien kokonaissferoplastien 5 määrittämiseksi. Hyviä arvoja transformaatiokokeeseen olivat 1-3 X 107 regeneroitavissa olevaa kokonaissferoplastia/ml, ja noin 1 X 103 kokonaista solua/ml.
Esimerkki III
MC 100-3:n (pYM5) konstruointi
Noin 10 μg pBR322:ta hydrolysoitiin BamHLllä ja defosforyloitiin. Noin 50 μg 10 pYJ8:aa (NRRL B-15889), joka sisältää Pichia HIS4 -geenin, hydrolysoitiin Bglll lla. 2,7 ke.tä sisältävä Bglll-palanen eristettiin 0,8-prosenttisesta preparatiivi-sesta agaroosigeelistä. 300 ng palasta ja 300 ng BamHI-hydrolysoitua pBR322:ta li-goitiin käyttäen 0,5 yksikköä T4 DNA -ligaasia 10 μ1:η kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 66 mM Tris.HCha, pH 7,4, 66 mM MgCtya, 10 mM DTT:a, ja 0,4 mM 15 ATP:a, 24 tunnin aikana 4 °C:ssa.
Ligaatioseosta käytettiin transformoitaessa E. coli MC 1061 ampisilliinille resistentiksi, kuten on kuvailtu esimerkissä V. Transformantit karakterisoitiin restriktiohyd-.,. rolyysien avulla, ja liitännäisen oikea koko ja orientaatio varmistettiin agaroosigee- ‘' lielektroforeesin avulla. Tätä plasmidia nimitettiin pYM5:ksi, ja se otettiin talteen E.
• « *··’ 20 colista käyttäen alkaliseen hajotukseen perustuvaa plasmidinvalmistustekniikkaa, ; *’ jota on kuvaillut Maniatis et ai. 1982) (Maniatis, T., Fritsch, E.F., ja Sambroox, J.
: V (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY.).
• · • * ♦ • · «
Noin 10 pg pYM5S:a hydrolysoitiin Stulillä ennen transformointia MC100-3:een.
... 25 Tämä vaihe ohjasi plasmidin kiinnittymään MC 100-3:ssa läsnä olevaan toiseen • · · *;[ * HIS4-geenisekvensseistä, joko natiiviin HIS4-lokukseen tai modifioituun AOX2- V ; lokukseen. Transformointi suoritettiin esimerkissä Π esitettyjen menettelyjen mukai- :***: sesti.
··· * Usean MC100-3(pYMS) His+ -transformantin DNA:ta eristettiin esimerkin IV mu- ,,; i' 30 kaisesti, ja seulottiin Southem-suodinhybridisaation avulla transformanttien suhteen, jotka sisälsivät pYMS:n yhdistyneenä AOX2:ssa sijaitsevaan HIS4-palaseen. Spesifiset koettimet, joita käytettiin, olivat: pPG 3,0 (NRRL B1802), AOX2-spesifinen koetin; pYJ30 (NRRL B-15890), HIS4-spesifinen koetin.
16 104497
Alkoholioksidaasi II -säätelyalueen ominaisuuksia Esimerkki IV Hiiva-DNA:n preparointi
Hiivasoluja kasvatettiin 100 ml:ssa YNB-alustaa, joka sisälsi 2 % dekstroosia,
5 30 °C:ssa, kunnes A^oo-arvo oli 1-2, ja pelletoitiin sen jälkeen käyttäen Damon IEC
DPR-6000 -sentrifugia nopeudessa 2000 g 5 minuutin aikana. Pelletti pestiin kerran tislatulla vedellä, kerran SED.llä, kerran 1 M sorbitolilla, ja resuspendoitiin sen jälkeen 5 ml:aan liuosta, joka sisälsi 0,1 M Tris.HCl.a, pH 7,0, ja 1 M sorbitolia. Solut sekoitettiin sen jälkeen 50-100 μ1:η kanssa Zymolyase 60 000 -liuosta, 4 mg/ml, 10 (Miles Laboratories), ja niitä inkuboitiin 30 °C:ssa 1 tunti. Muodostuneita sferoplas-teja sentrifugoitiin sen jälkeen nopeudessa 1000 g 5-10 minuutin ajan, ja ne suspen-doitiin 5 ml:aan hajotuspuskuria [0,1 % SDS:A, 10 mM Tris.HCka (pH 7,4), 5 mM EDTA:A ja 50 mM NaCl:al], Proteinase K:ta (Boehringer Mannheim) ja RNase A:ta (Sigma) lisättiin kumpaakin pitoisuuteen 100 pg/ml, ja liuosta inkuboitiin 37 15 °C:ssa 30 minuutin ajan. DNA:sta poistettiin proteiini sekoittamalla valmistetta kevyesti yhtä suuren kloroformitilavuuden kanssa, joka sisälsi isoamyylialkoholia (24:1, v/v), ja faasit erotettiin sentrifugoimalla nopeudessa 12 000 g 20 minuutin aikana. Ylempi (vedellinen) faasi imettiin pois uuteen putkeen ja uutettiin vastaavalla tilavuudella fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia. Faasit erotettiin kuten edellä, ja . 20 pintafaasi laitettiin putkeen, joka sisälsi 2-3 tilavuutta kylmää 100-prosenttista eta- « « , ‘ . nolia. Näytettä sekoitettiin kevyesti, ja DNA kerättiin talteen kiertämällä muovisau- • · ,, . van pintaan. DNA liuotettiin välittömästi 1 ml:aan TE-puskuria ja dialysoitiin yli yön 4 °C:ssa 100 tilavuusosaa vastaan TE-puskuria.
♦ · · • · ·
ϊ V: Esimerkki V
• · ... 25 pMR4:n konstruointi • · · • · · :T: DNA eristettiin esimerkissä IV olevan menetelmän mukaisesti esimerkissä III muo- • y..t dostetusta MC100-3(pYM5) His+ -transformantista. 10 pg tätä genomista DNA:ta
hydrolysoitiin HindlLlla ja ligoitiin. Ligaatioreaktio suoritettiin 4 °C:ssa 24 tunnin ’ aikana liuoksessa, joka sisälsi 66 mM Tris.HCLa, pH 7,4, 6,6 mM MgCl.a, 10 mM
,, j;' 30 DTT.A, 0,4 mM ATP:a, ja 0,5 yksikköä T4 DNA -ligaasia.
« « t < · « %
Ligaatioseos transformoitiin suoraan E. coli MC 1061 -soluihin, jotka oli tehty kompetenteiksi transformaatiota varten ja transformoitiin kuten Maniatis et ai. on kuvaillut (1982). Valikointi ampisilliiniresistenssin suhteen suoritettiin viljelemällä soluja 104497 17 joko LB-alustassa tai 2B-alustassa (0,2 % NRtPO^a, 1,2 %. Na2HP04ia, 0,013 % MgS04.7H20:a, 0,074 % CaCl2.2H20:a, 1 pg/ml tiamiinia, 0,4 % dekstroosia), joihin oli lisätty 50 pg/ml ampisilliiniä.
12,0 keitä sisältävä plasmidi, jota merkittiin koodilla pMR4, otettiin talteen Mania-5 tiksen et ai. mukaisesti (1982). Tämä plasmidi sisälsi 5,3 keitä DNAista AOX2 Kpnl -paikan5-puolelta, 2,7keitäPichiaHIS4-geenistäja4.,0keitäpBR322:sta.
Esimerkki VI
pYJ55:n konstruointi AOX2-promoottorin säätelyn ja ilmentämisen määrittämiseksi konstruoitiin vektori, 10 joka sisältää AOX2 5' -sekvenssin yhteenliittyneenä E. colin IacZ-geeniin. 50 pg plasmidia pMR4 (esimerkki V) hydrolysoitiin Bglllilla ja BamHIillä valmistajan ohjeiden mukaisesti. 1,8 keitä sisältävä Bglll - BamHI -palanen, joka sisälsi AOX2-promoottorin, eristettiin 0,8 %:sta preparatiivisesta agaroosigeelistä. 10 pg pBPfl.a (NRRL B-15892) hydrolysoitiin BamHIillä, ja fosfori poistettiin käyttäen alkaalista 15 fosfataasia 50 piin reaktiotilavuudessa (1 U entsyymiä 37 °C:ssa 1 tunnin aikana liuoksen sisältäessä 50 mM Tris.HClia, pH 9,0, 1 mM MgCl2:a, 100 μΜ ZnCl2:a, 1 mM spermidiiniä).
; 300 ng 1,8 keitä sisältävää palasta ja 300 ng pBPflia ligoitiin T4-ligaasin kanssa :>ff: seuraavasti. Ligaatioreaktio suoritettiin 23 °C:ssa 1 tunnin aikana 10 piin reaktioti- : · ·: 20 lavuudessa, joka sisälsi 66 mM Tris.HClia, pH 7,6, 5 mM MgCl2:a, 5 mM ditiotrei- tolia, 1 mM ATPia ja 1 Weissin yksikön T4-ligaasia. Muodostunutta vektoria nimi-tettiin koodilla pYJ38.
• · • I · *·*·* Uusi Smal-katkaisupaikka muodostettiin pYJ38issa seuraavasti. Adaptorioligonu- kleotidi syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems'in DNA-synteesilaitetta, Model ··· : 25 380 A, käyttäen syaanietyylifosforamidiittikemiaa: • · · • · · ’* ’ 5’ - GATCACCCGGGT -3’ • · · • · • ♦ ··· •: · · · 10 pg plasmidia p YJ3 8 hydrolysoitiin BamHIillä ja käsiteltiin alkalisella fosfataasil- la kuten edellä. 1 pg edellä olevaa adapteria ja 0,1 pg BamHIillä hydrolysoitua ·;;; pYJ38:a ligoitiin käyttäen T4-ligaasia, kuten edellä on kuvailtu. Modifioitua vekto- ‘ · · · 30 ria nimitettiin koodilla pYJ45. 1,8 keitä sisältävä Smal-palanen, joka sisälsi modifi oidun AOX2-promoottorin, saatiin hydrolysoimalla 50 pYJ45:a Smalillä. Palanen eristettiin 0,8-prosenttista preparatiivisesta agaroosigeelistä. 0,3 pg palasta ja 0,3 pg u 104497
Smal:llä hydrolysoitua pBPflia ligoitiin kuten edellä vektorin pYJ46 synnyttämiseksi. 0,3 ke:inen EcoRI-pala poistettiin AOX2-segmentin 5'-päästä plasmidissa pYJ46 seuraavasti. 10 pg plasmidia pYJ46 hydrolysoitiin EcoREllä ja käsiteltiin al-kalisen fosfataasin kanssa, kuten edellä on kuvailtu. Erillinen 50 pg:n erä pYJ46:a 5 hydrolysoitiin myös EcoRIillä, ja 1,5 ke: in en pala eristettiin 0,8-prosenttista prepa-ratiivisesta agaroosigeelistä. Noin 0,3 pg kumpaakin fosfataasilla käsiteltyä plasmidia pYJ46 ja eristetty pala ligoitiin ja transformoitiin E. coliin, kuten edellä on kuvailtu. Yksi plasmidi, jolla oli oikea rakenne, eristettiin, ja sitä merkittiin koodilla pYJ55.
10 Esimerkki VII
Kannan GS115 (pYJ55) kehittäminen
Pichia pastoris GS115, histidiiniauksotrofi (NRRL Y-15851; his4) transformoitiin plasmidilla PYJSS (esimerkki VI), kuten esimerkissä II on kuvailtu. Genomista DNA.ta pysyvistä His-kannoista analysoitiin Southem-suodinhybridisaation avulla 15 plasmidin sijainnin määrittämiseksi. Yhtä transformanttia, joka sisälsi pYJ55:n kiinnittyneenä HIS4-lokuksessa, merkittiin koodilla GS115(pYJSS).
Esimerkki VIII
AOX1- ja AOX2-promoottorien vertailu AOX1-ja AOX2-promoottorien säätelyä ja ilmenemistä on vertailtu määrittämällä .. . 20 kantojen GS115(pSAOH5) ja GS115(pYJ55) β-galaktosidaasiaktiivisuus. 100 ml:n viljelmiä kummastakin kannasta kasvatettiin YNB-alustassa, johon oli lisätty 1 % • · · ’·*/ glyserolia, 24 tuntia 30 °C:ssa, ne siirrettiin YNB-alustaan, jossa ei ole hiilenlahdet- :·*·* tä, 24 tunnin ajaksi 30 °C:ssa, sen jälkeen ne siirrettiin YNB-alustaan, joka sisälsi 0,5 % metanolia, 50 tunnin ajaksi 30 °C:ssa. Näytteitä otettiin kummastakin viljel- • · · ·.* : 25 mästä seuraavina ajankohtana: 1) 24 tunnin kuluttua glyserolialustassa, 2) 24 tunnin :T: kuluttua hiilettömässä alustassa, ja 3) 24 ja 50 tunnin kuluttua metanolialustassa.
,···. Uutteita valmistettiin, ja niistä määritettiin β-galaktosidaasin aktiivisuus, kuten jäi- • « ***. jempänä on kuvailtu. Näiden määritysten tulokset esitetään taulukossa 2.
19 104497 β-galaktosidaasimääritys 1) Tarvittava liuos: Z-puskuri: Loppupitoisuus
Na2HP04.7H20 16,1 g 0,06 M
5 NaH2P04 5,5 g 0,04 M
KC1 0,75 g 0,01 M
MgS04.7H20 0,246 g 0,001 M
2-merkaptoetanoli 2,7 ml 0,05 M
täytetään 1 l:ksi; pH:n tulisi olla 7.
10 O-nitrofenyyli-P-D-galaktosidi (ONPG):
Liuotetaan 400 mg ONPG:tä (Sigma N-1127) 100 ml:aan tislattua vettä 4 mg/ml:isen ONPG-liuoksen valmistamiseksi.
2) Soluvapaan proteiiniuutteen valmistaminen: < < i
Kutakin näytettä pestiin kerran tislatussa vedessä, kerran hajotuspuskurissa, ja sus- ... ] 15 pendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin pitoisuudessa 150 A^o/ml. 0,5 g lasihelmiä li- « « ;v sättiin 350 μ1:η näyte-erään, ja seosta pyörresekoitettiin neljä kertaa 60 sekunnin « t '..; ajan kerrallaan 1 minuutin välein jään päällä. Soluliete poistettiin lasihelmistä, ja *;1.1 suspensiota sentrifugoitiin 5 minuuttia mikrofugissa. Supematantti siirrettiin po- • · · ’·1·1 lypropyleeniseen mikrofugiputkeen määritystä varten. Proteiinin kokonaismäärä jo-
20 kaisesta uutteesta määritettiin Bradfordin määritysmenetelmällä (Bio-Rad). BSA
« « · v : toimi proteiinistandardina.
• ·« • · • · » • 3) Määritysmenettely: • · • · • · · ·:··? 1-50 μΐ soluvapaata proteiiniuutetta lisättiin 1 ml:aan Z-puskuria. Seosta pyörrese koitettiin sen jälkeen ja inkuboitiin 5 minuutin ajan 30 °C:ssa. Reaktio aloitettiin li-·;;; 25 säämällä 0,2 ml ONPG.tä (4 mg/ml). 0,5 ml 1 M Na2C03-liuosta lisättiin reaktion * · · · 1 pysäyttämiseksi sopivana aikana (A420 <1). Absorbanssi luettiin sen jälkeen aal lonpituudessa 420 nm.
104497 20 4) β-galaktosidaasiaktiivisuusyksikköjen laskeminen 1 U = 1 nmooli muodostunutta ortonitrofenolia (ONP) minuutin aikana 30 °C:ssa ja pH :ssa 7. 1 nmooli ONP.tä antaa absorbanssiksi aallonpituudessa 420 nm (A420) 0,0045 1 cm:n valotiepituudessa. Sen vuoksi absorbanssin arvo 1 aallonpituudessa 5 420 nm tarkoittaa 222 nmoolia ONP:tä/ml, tai 378 nmoolia ONP:tä/l,7 ml (analysoitavan supematantin kokonaistilavuuden ollessa 1,7 ml). Taulukossa 2 ilmoitetut yksiköt laskettiin seuraavasti: A420 X 378 10 u=-x 378 t (min) I I · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · · • · · • · · • · « • · · 1 · · • · • · • · ·

Claims (4)

104497
1. Puhdistettu DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa metylotrofisen hiivan alkoholioksidaasi Π -geenin 5-pään vieressä olevaa sekvenssiä, joka reagoi metanolin läsnäoloon ainoana hiilenlähteenä isäntäsoluille, ja että mainittu sek- 5 venssi sijaitsee AOX2-rakennegeenin aloituskodonin ja 5'-pään ensimmäisen EcoRI-paikan välissä, kuten on esitetty restriktiokartassa kuviossa 1(b), ja AOX2:n tässä kuvatun säätelyalueen toiminnallisia mutantteja, jotka käsittävät 5'-päästä lyhennetyn DNA-sekvenssin.
2. Renad DNA-sekvens som kodar alkoholoxidas Π-regleromradet av jäst, kän-netecknad av att nämnda DNA-sekvens är -1490 -1470 TCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT ^ -1450 -1430 1410 CTTGATTC7TTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT -1390 -1370 -1350 TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA -1330 -1310 -1290 GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGG7TGCACATTTGAGCCAGTAGGCT 10 -1270 -1250 -1230 CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG -1210 -1190 -1170 TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG -1150 -1130 -1110 CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG -1090 -1070 -1050
15 CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA -1030 -1010 -990 AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT -970 -950 -930 AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT -910 -890 -870 CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA 20 -850 -830 -810 CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA -790 -770 -750 AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG -730 -710 -690 TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG i : -670 -650 -630 ,.;.. 23 AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA f.’ -610 -590 -570 : :: ttatcgttgcaattcatcgtcttaaacagtacaagaaactttattcatgggtcattggac • · -550 -530 -510 tctgatgaggggcacatttccccaatgattttttgggaaagaaagccgtaagaggacagt • · C *;* * -490 -470 -450 ::: taagcgaaagagacaagacaacgaacagcaaaagtgacagctgtcagctacctagtggac -430 -410 -390 : : agttgggagtttccaattggttggttttgaatttttacccatgttgagttgtccttgctt • · · ...·: -370 -350 -330 ctccttgcaaacaatgcaagttgataagacatcaccttccaagataggctatttttgtcg -310 -290 -270 cataaatttttgtctcggagtgaaaaccccttttatgtgaacagattacagaagcgtcct 35 -250 -230 -210 acccttcaccggttgagatggggagaaaattaagcgatgaggagacgattattggtataa 24 104497 -190 -170 . -150 AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA -130 -110 -90 AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT -70 -50 -30
5 CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA -10 AACAAATCAACTGAGAAAA 10 och en funktionell mutant av nämnda DNA-sekvens innefattande en sekvens förkor-tad vid 5'-änden.
2. Puhdistettu DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi Π -sääte-10 lyaluetta, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi on -1490 -1470 TCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT -1450 -1430 1410 CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT -1390 -1370 -1350 iAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA -1330 ' -1310 -1290 GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT -1270 -1250 -1230 CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG 15 -1210 -1190 -1170 TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG -1150 -1130 -1110 CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG -1090 -1070 -1050 CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA -1030 -1010 -990 AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT V · -970 -950 -930 . · AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT • · · ' ’* _ -910 -890 -870
20 CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA -850 -830 -810 CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA • · t V : -790 -770 -750 AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG • · · -730 -710 -690 TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG -670 -650 -630 AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA -610 -590 -570 TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC 25 104497 -550 -530 -510 TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT -490 -470 -450 TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC -430 -410 -390 AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT -370 -350 -330 CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG 5 -310 -290 -270 CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT -250 -230 -210 ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA -190 -170 . -150 AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA -130 -110 -90 AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT -70 -50 -30 CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA ,. -i°
10 AACAAATCAACTGAGAAAA ja mainitun DNA-sekvenssin jokin toiminnallinen mutantti, joka käsittää 5'-päästä lyhennetyn sekvenssin.
3. DNA-sekvens enligt patentkrav 1, kännetecknad av att nämnda sekvens är funktionellt kopplad till en heterolog gen. 15
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että mainittu 15 sekvenssi on toiminnallisesti kytkeytynyt heterologiseen geeniin.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että mainittu I I I 99 . ·. ·. sekvenssi on toiminnallisesti kytkeytynyt heterologiseen geeniin. « · · • · • « I « · o • · · • : Vr 20 1. Renad DNA-sekvens, kännetecknad av att den kodar en sekvens angränsande tili 5’-änden av alkoholoxidas Π-gen av metylotrofisk jäst, varvid sekvensen reagerar • · ]**. pa närvaro av metanol som den enda kolkällan för värdceller, och att nämnda sek vens är belägen mellan begynnelsekoden för en AOX2-strukturgen och den forsta EcoRI-platsen av 5'-änden, säsom framställts pi restriktionskartan i figur 1(b), och 25 fimktionella mutanter i det här beskrivna regleromradet av AOX2, vilka innefattar en DNA-sekvens förkortad vid 5-änden. 104497
4. DNA-sekvens enligt patentkrav 2, kännetecknad av att nämnda sekvens är funktionellt kopplad till en heterolog gen. • · · • · • » · • · · « · Ml • · 1 III • · · « · 1 Ilf · · « · • · · * • · 1 I I I • · • ·
FI893109A 1988-06-24 1989-06-26 DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta FI104497B (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI952675A FI105825B (fi) 1988-06-24 1995-06-01 Pichia pastoris -kantoja

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/211,007 US5032516A (en) 1985-10-25 1988-06-24 Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
US21100788 1988-06-24

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI893109A0 FI893109A0 (fi) 1989-06-26
FI893109A FI893109A (fi) 1989-12-25
FI104497B true FI104497B (fi) 2000-02-15

Family

ID=22785222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI893109A FI104497B (fi) 1988-06-24 1989-06-26 DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5032516A (fi)
EP (1) EP0347928A3 (fi)
JP (1) JPH0773501B2 (fi)
KR (1) KR960010590B1 (fi)
CN (1) CN1039616A (fi)
AU (1) AU615078B2 (fi)
CA (1) CA1306211C (fi)
DD (1) DD284047A5 (fi)
DK (1) DK175822B1 (fi)
FI (1) FI104497B (fi)
HU (1) HUT51673A (fi)
IE (1) IE67039B1 (fi)
MX (1) MX16518A (fi)
NO (1) NO301285B1 (fi)
NZ (1) NZ229534A (fi)
PH (1) PH27314A (fi)
PT (1) PT90970A (fi)
YU (1) YU128789A (fi)
ZA (1) ZA894495B (fi)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
CA2063890C (en) * 1991-03-27 2007-03-13 Masami Miura Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism
JPH0829102B2 (ja) * 1991-03-27 1996-03-27 株式会社ミドリ十字 変異型ａｏｘ２プロモーター、当該プロモーターを担持する菌株、その取得方法およびその菌株を利用した異種蛋白質の製造方法
JPH07106153B2 (ja) * 1991-03-27 1995-11-15 株式会社ミドリ十字 変異型ａｏｘ２プロモーターを担持するプラスミド、形質転換体および異種蛋白質の製造方法
JP3505743B2 (ja) * 1993-07-27 2004-03-15 三菱ウェルファーマ株式会社 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法
IT1270196B (it) * 1994-06-09 1997-04-29 Enichem Spa Procedimento catalitico per la produzione di ossime
US5866542A (en) * 1994-10-18 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5866543A (en) * 1995-06-05 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5863894A (en) * 1995-06-05 1999-01-26 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5945275A (en) * 1994-10-18 1999-08-31 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5872098A (en) * 1995-06-05 1999-02-16 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
ATE346928T1 (de) * 1994-10-18 2006-12-15 Dendreon Corp Aus nematoden extrahierte serinprotease- inhibitoren und die koagulation hemmende proteine
CA2202351A1 (en) * 1994-10-18 1996-04-25 George Phillip Vlasuk Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
WO1997017450A2 (en) * 1995-11-09 1997-05-15 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
US7625756B2 (en) * 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
AU7684201A (en) 2000-06-28 2002-01-08 Glycofi Inc Methods for producing modified glycoproteins
US7863020B2 (en) 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
AU2002307504B2 (en) 2001-04-05 2006-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Alcohol oxidase 1 regulatory nucleotide sequences for heterologous gene expression in yeast
ATE494367T1 (de) * 2002-12-18 2011-01-15 Hoffmann La Roche Rekombinante desoxyribonuclease i aus rinder- pankreas mit hoher spezifischer aktivität
ATE387494T1 (de) * 2002-12-20 2008-03-15 Hoffmann La Roche Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten
US7332299B2 (en) * 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
JP4411192B2 (ja) * 2003-12-05 2010-02-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 組換えで発現されるカルボキシペプチダーゼｂおよびその精製
BRPI0616054B8 (pt) * 2005-09-14 2021-05-25 Sanofi Aventis Deutschland processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor
JP4216875B2 (ja) * 2006-09-29 2009-01-28 株式会社東芝 メタノール応答性プロモーター、プロモーターと外来遺伝子を発現可能な様式で連結した融合遺伝子、ベクター、形質転換体、およびタンパク質の生産方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173378B1 (en) * 1984-07-27 1991-06-12 Unilever N.V. Process for preparing a polypeptide by culturing a transformed microorganism, a transformed microorganism suitable therefor and dna sequences suitable for preparing such microorganism
US4855231A (en) * 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4882279A (en) * 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
IL82935A0 (en) * 1986-08-12 1987-12-20 Phillips Petroleum Co Secretion of heterologous proteins from yeast
NZ228948A (en) * 1988-05-13 1991-06-25 Phillips Petroleum Co Hbv particles containing s and pre-s 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells

Also Published As

Publication number Publication date
MX16518A (es) 1993-10-01
ZA894495B (en) 1990-03-28
DK175822B1 (da) 2005-03-14
FI893109A (fi) 1989-12-25
AU615078B2 (en) 1991-09-19
NZ229534A (en) 1991-04-26
DD284047A5 (de) 1990-10-31
KR960010590B1 (ko) 1996-08-06
DK313189D0 (da) 1989-06-23
CA1306211C (en) 1992-08-11
YU128789A (sh) 1992-07-20
JPH0773501B2 (ja) 1995-08-09
AU3700289A (en) 1990-01-04
EP0347928A2 (en) 1989-12-27
JPH0253489A (ja) 1990-02-22
EP0347928A3 (en) 1990-02-07
IE67039B1 (en) 1996-02-21
DK313189A (da) 1989-12-25
IE892055L (en) 1989-12-24
FI893109A0 (fi) 1989-06-26
HUT51673A (en) 1990-05-28
CN1039616A (zh) 1990-02-14
KR910001049A (ko) 1991-01-30
US5032516A (en) 1991-07-16
NO892634D0 (no) 1989-06-23
NO301285B1 (no) 1997-10-06
PH27314A (en) 1993-05-28
NO892634L (no) 1989-12-27
PT90970A (pt) 1989-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104497B (fi) DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta
KR0181179B1 (ko) 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법
FI94426B (fi) Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille
FI94427C (fi) Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa
US4808537A (en) Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use
US4666847A (en) Recombinant DNA means and method
FI81379C (fi) Anvaendning av kluyveromyces-jaest saosom vaerd foer transformering och uttryckning av fraemmande gener.
JP3583791B2 (ja) ピチア・パストリスにおけるヒト血清アルブミンの発現
GB2100737A (en) A process for the production of a polypeptide
DK175569B1 (da) Rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling deraf, transformeret vært indeholdende det rekombinante DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling af den transformerede vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid
JP3949734B2 (ja) プロテアーゼ阻害剤の生産方法
FI105825B (fi) Pichia pastoris -kantoja
JP2752092B2 (ja) Ｄｅｏプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主
US5496711A (en) Processes for producing pre-prorennin, prorennin and rennin
JPH06503718A (ja) メチロトローフ酵母細胞におけるヒトリゾチムの産生とその効率的な分泌
EP0374913A1 (en) Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene
CA2397494A1 (en) Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 promoter and terminator
IE67053B1 (en) Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
NO891485L (no) Fremgangsmaate til fremstilling av 22 kd sgh-protein og lineaer genevektor.
CA2384123A1 (en) Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 promoter and terminator
NO315206B1 (no) Nye celler inneholdende alkoholoksidase II regulatorisk område
JPH066060B2 (ja) 新規なプロモ−タ−

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC.

FG Patent granted

Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC.