JPH066060B2 - 新規なプロモ−タ− - Google Patents
新規なプロモ−タ−Info
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- JPH066060B2 JPH066060B2 JP61280748A JP28074886A JPH066060B2 JP H066060 B2 JPH066060 B2 JP H066060B2 JP 61280748 A JP61280748 A JP 61280748A JP 28074886 A JP28074886 A JP 28074886A JP H066060 B2 JPH066060 B2 JP H066060B2
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- JP
- Japan
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- plasmid
- ecori
- dna
- fragment
- xhoi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なプロモーターに関する。
本発明のプロモーターは、適当なベクターに挿入され宿
主中で外来性遺伝子の発現に使用される。
主中で外来性遺伝子の発現に使用される。
（従来の技術と問題点） 遺伝子組換え技術の進歩に伴ない、大腸菌等の原核生物
あるいは酵母、動物細胞等の真核生物宿主中で、有用な
種々のポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現させ
て、これ等ポリペプチドを商業的に生産する試みがなさ
れている。
あるいは酵母、動物細胞等の真核生物宿主中で、有用な
種々のポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現させ
て、これ等ポリペプチドを商業的に生産する試みがなさ
れている。
この場合、ベクター中に挿入された異種遺伝子の上流
に、強力な活性を有する転写開始制御領域（プロモータ
ー）を存在させることが、上記ポリペプチドを効率よく
生産するうえで好ましい。
に、強力な活性を有する転写開始制御領域（プロモータ
ー）を存在させることが、上記ポリペプチドを効率よく
生産するうえで好ましい。
（問題点を解決するための手段） 本発明は、酵母サッカロマイセス・セレビシエ(Sacchar
omyces cerevisiae)のαフェロモン（性フェロモン）を
生産する遺伝子であるMFα１の詳細な解析に基づいて種
々検討の結果、達成されたものである。
omyces cerevisiae)のαフェロモン（性フェロモン）を
生産する遺伝子であるMFα１の詳細な解析に基づいて種
々検討の結果、達成されたものである。
本発明を以下詳細に説明するに、サッカロマイセス・セ
レビシエのαフェロモンは、α細胞が生産する13アミノ
酸からなるペプチドであり、αフェロモンがａ細胞上の
αフェロモン受容体に結合することにより、ａ細胞は細
胞分裂を止め、接合過程に入る。このαフェロモンは酵
母では極めて稀な分泌性ペプチドであるため、その遺伝
子は異種蛋白質の分泌生産に広く利用されている。
レビシエのαフェロモンは、α細胞が生産する13アミノ
酸からなるペプチドであり、αフェロモンがａ細胞上の
αフェロモン受容体に結合することにより、ａ細胞は細
胞分裂を止め、接合過程に入る。このαフェロモンは酵
母では極めて稀な分泌性ペプチドであるため、その遺伝
子は異種蛋白質の分泌生産に広く利用されている。
αフェロモンの遺伝子は、染色体上にMFα１及びMFα２
の２個が存在し、このうちMFα１の活性がとくに強いこ
とが知られている［Cell,39巻、933〜943頁（198
2）］。
の２個が存在し、このうちMFα１の活性がとくに強いこ
とが知られている［Cell,39巻、933〜943頁（198
2）］。
αフェロモンの遺伝子MFα１は、サッカロマイセス・セ
レビシエの染色体から1.75kbのEcoRI断片として単離さ
れ、963 bpのプロモーターと５′の非翻訳領域を含み、
その後に165アミノ酸をコードする領域と316 bpの３′
非翻訳領域から成る。
レビシエの染色体から1.75kbのEcoRI断片として単離さ
れ、963 bpのプロモーターと５′の非翻訳領域を含み、
その後に165アミノ酸をコードする領域と316 bpの３′
非翻訳領域から成る。
本発明者等は、上記963 bpのプロモーターと５′非翻訳
領域を含む領域を解析した結果、該領域中に2個の転写
促進配剤（upstream Activating Seqence、ＵＳＡ）の
存在を確認した。
領域を含む領域を解析した結果、該領域中に2個の転写
促進配剤（upstream Activating Seqence、ＵＳＡ）の
存在を確認した。
即ち、αフェロモン前駆体の翻訳開始点から上流−415
から−336までの次の80個のＤＮＡ配列：ＴＧＣＡＡＴ
ＡＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴ
ＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＴ
ＡＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴ （ＵＡＳ１という） と、その下流−313から−273までの次の41個のＤＮＡ配
列： ＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＴＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣ
ＡＴＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＡ （ＵＡＳ２という） の配列が本遺伝子の効率の良い転写に必要であることを
認めた。
から−336までの次の80個のＤＮＡ配列：ＴＧＣＡＡＴ
ＡＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴ
ＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＴ
ＡＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴ （ＵＡＳ１という） と、その下流−313から−273までの次の41個のＤＮＡ配
列： ＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＴＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣ
ＡＴＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＡ （ＵＡＳ２という） の配列が本遺伝子の効率の良い転写に必要であることを
認めた。
更に研究の結果、上記ＵＡＳ２の配列を、ＴＡＴＡ領域
（−128から−122）の上流に、更に少なくとも２個を付
加することによって、プロモーター活性を著しく増強す
ることができることを知り本発明を達成したものであ
る。
（−128から−122）の上流に、更に少なくとも２個を付
加することによって、プロモーター活性を著しく増強す
ることができることを知り本発明を達成したものであ
る。
以下にヒトのβ-エンドルフィンの遺伝子をマーカーと
して使用し、本発明のプロモーターの有用性について詳
細に説明する。
して使用し、本発明のプロモーターの有用性について詳
細に説明する。
［ベクターの構築］ (1)酵母のα因子DNAを含むプラスミドpLS01(4.4kb)の調
製 酵母の染色体DNAをEcoRIで切断し２kb前後のDNA断片を
プラスミドpUC13(Pharmacia社カタログ、P−L Biochemi
cals、27頁、27-4973記載）のEcoRI部位に挿入して大腸
菌を形質転換し、挿入DNAを含む白色のコロニーを集
め、上記酵母のα因子DNAMFα１及びMFα２と相同な下
記の16塩基のヌクレオチド ５′GGCCAACCAATGTACT３′ （α因子のC末端側の-Gly-Cln-Pro-Met-Tyrに相当す
る） をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを
行ない、陽性のコロニーを選択する。次いでプラスミド
DNAを分離し、酵母のα因子DNAを含むプラスミドpLS01
(4.4kb)を選択採取する。
製 酵母の染色体DNAをEcoRIで切断し２kb前後のDNA断片を
プラスミドpUC13(Pharmacia社カタログ、P−L Biochemi
cals、27頁、27-4973記載）のEcoRI部位に挿入して大腸
菌を形質転換し、挿入DNAを含む白色のコロニーを集
め、上記酵母のα因子DNAMFα１及びMFα２と相同な下
記の16塩基のヌクレオチド ５′GGCCAACCAATGTACT３′ （α因子のC末端側の-Gly-Cln-Pro-Met-Tyrに相当す
る） をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを
行ない、陽性のコロニーを選択する。次いでプラスミド
DNAを分離し、酵母のα因子DNAを含むプラスミドpLS01
(4.4kb)を選択採取する。
(2)プラスミドpREI032(5.8kb)の調製 プラスミドYRp7(5.7kb酵母のTRP1とARS1を含むDNA断片
とpBR322を結合したプラスミド）［Nature、282巻、39〜
43頁(1979)記載］をEcoRIで部分切断し粘着末端を充填
した後、連結してYRp7の一方のEcoRIサイトが除去され
たpREI032(5.8kb)を調製する。
とpBR322を結合したプラスミド）［Nature、282巻、39〜
43頁(1979)記載］をEcoRIで部分切断し粘着末端を充填
した後、連結してYRp7の一方のEcoRIサイトが除去され
たpREI032(5.8kb)を調製する。
(3)プラスミドpUC8-βE(2.9kb)の調製 プラスミドpYT-3-24(特開昭58-92696号公報、２頁記
載）をHaeIIIで切断して、ヒトのβ-エンドルフィン遺
伝子(93 bp、以下βＥDNAという）を含む160 bpのHaeII
I〜HaeIII断片を採取する。一方、ファージM13mp7(Nucl
eic Acids Research 9巻、309〜321頁記載）のRFI DNA
(二本鎖 DNA）をHincIIで切断し、エタノールに溶解す
るHincII〜HincII断片 ５′GACCTGCAGGTC ３′を除い
たHincII部位に、上記βＥ DNAを含む160 bpのDNA断片
を連結し大腸菌を形質転換した。形質転換株からRFI DN
Aを調製し、これをBamH Iで切断して得られた172 bpのB
amH I〜BamH I断片をプラスミドpUC8[Bethesda Researc
h Laboratories,Inc.発行のBRLカタログ(August 1,198
3)、Cat/No.5359SA記載］のBamH I切断部位に挿入してp
UC8-βE(2.9 kb)を得る。
載）をHaeIIIで切断して、ヒトのβ-エンドルフィン遺
伝子(93 bp、以下βＥDNAという）を含む160 bpのHaeII
I〜HaeIII断片を採取する。一方、ファージM13mp7(Nucl
eic Acids Research 9巻、309〜321頁記載）のRFI DNA
(二本鎖 DNA）をHincIIで切断し、エタノールに溶解す
るHincII〜HincII断片 ５′GACCTGCAGGTC ３′を除い
たHincII部位に、上記βＥ DNAを含む160 bpのDNA断片
を連結し大腸菌を形質転換した。形質転換株からRFI DN
Aを調製し、これをBamH Iで切断して得られた172 bpのB
amH I〜BamH I断片をプラスミドpUC8[Bethesda Researc
h Laboratories,Inc.発行のBRLカタログ(August 1,198
3)、Cat/No.5359SA記載］のBamH I切断部位に挿入してp
UC8-βE(2.9 kb)を得る。
(4)プラスミドpREI046(7.4 kb)の調製 pLS01(4.4 kb)のプロモーター配列及びリーダー配列を
含むEcoRI〜HindIII断片(1.4kb)とpUC8−βＥ(2.9 kb)
のHindIII〜EcoRI断片(0.2kb,βＥDNAを含む）とをpREI
032(5.8kb)のEcoRI切断部位に連結してpREI046(7.4kb)
を得る（第１図）。
含むEcoRI〜HindIII断片(1.4kb)とpUC8−βＥ(2.9 kb)
のHindIII〜EcoRI断片(0.2kb,βＥDNAを含む）とをpREI
032(5.8kb)のEcoRI切断部位に連結してpREI046(7.4kb)
を得る（第１図）。
(5)プラスミドpREI052(5.2kb)の調製 pREI032(5.8kb)のTEP1を含むEcoRI〜PstI断片(0.8kb)
と、２μｍプラスミドの複製開始点を含むPstI〜EcoRI
断片（２kb)とを、PBR322のPvuII〜EcoRI断片(2.3kb)NI
連結してpREI051(5.1kb)を作製した後EcoRIで部分切断
し、粘着末端を充填後連結して、pREI051の一方のEcoRI
切断部位を欠いたpREI052(5.2kb)を得る（第２図）。
と、２μｍプラスミドの複製開始点を含むPstI〜EcoRI
断片（２kb)とを、PBR322のPvuII〜EcoRI断片(2.3kb)NI
連結してpREI051(5.1kb)を作製した後EcoRIで部分切断
し、粘着末端を充填後連結して、pREI051の一方のEcoRI
切断部位を欠いたpREI052(5.2kb)を得る（第２図）。
(6)プラスミドPREIo59(6.8kb)の調製 前記(4)で得たpREI046のプロモーター配列、リーダー配
列及びβＥDNA配列を含むEcoRI〜SmaI断片(1.6kb)と、p
LS01(4.4kb)のターミネーター配列を含むHincII〜EcoRI
断片(0.3kb)とを採取する。
列及びβＥDNA配列を含むEcoRI〜SmaI断片(1.6kb)と、p
LS01(4.4kb)のターミネーター配列を含むHincII〜EcoRI
断片(0.3kb)とを採取する。
一方、pREI052(5.2kb)をEcoRIで切断し、次いでバクテ
リアルアルカリンフォスファターゼ(Bacterial alkalin
e phosphatase,BAP)を加えて末端のリン酸基を外した
後、これを上記二つのDNA断片と連結することにより、
αフェロモンのプロモーター、分泌シグナル、β-エン
ドルフィンの遺伝子（βＥDNA）及びターミネーターを
含むプラスミドPREI059(6.8kb)を得る（第３図）。
リアルアルカリンフォスファターゼ(Bacterial alkalin
e phosphatase,BAP)を加えて末端のリン酸基を外した
後、これを上記二つのDNA断片と連結することにより、
αフェロモンのプロモーター、分泌シグナル、β-エン
ドルフィンの遺伝子（βＥDNA）及びターミネーターを
含むプラスミドPREI059(6.8kb)を得る（第３図）。
(7)プラスミドpINK002(4.4kb)の調製 pREI059のMFα１とβＥDNAを含むEcoRI断片をプラスミ
ドpUC9に挿入したプラスミドpINK002を調製する。
ドpUC9に挿入したプラスミドpINK002を調製する。
即ちpREI059をEcoRIで切断したEcoRI〜EcoRI断片を、プ
ラスミドpUC9(2.7)[Bethesda Research Labo-ratories,
Inc.発行のBRLカタログ(August 1,1983)，Cat/No.5360S
A記載］をEcoRIで切断し、次いでBAP処理した断片と連
結してpINK002を得る（第４図）。
ラスミドpUC9(2.7)[Bethesda Research Labo-ratories,
Inc.発行のBRLカタログ(August 1,1983)，Cat/No.5360S
A記載］をEcoRIで切断し、次いでBAP処理した断片と連
結してpINK002を得る（第４図）。
(8)プラスミドpINK A49(4.3kb)及びpINK A40(4.3kb)の
調製 pINK002に含まれるMFα１遺伝子のＵＡＳ２（以下便宜
上UAS2で示す）配列とＴＡＴＡ（以下便宜上TATAで示
す）配列の間に65bpの欠失を持つプラスミドpINK-A49と
NsiI部位からTATA配列を含む111bpの欠失を持つpINK-A4
0(4.3kb)を調製する。
調製 pINK002に含まれるMFα１遺伝子のＵＡＳ２（以下便宜
上UAS2で示す）配列とＴＡＴＡ（以下便宜上TATAで示
す）配列の間に65bpの欠失を持つプラスミドpINK-A49と
NsiI部位からTATA配列を含む111bpの欠失を持つpINK-A4
0(4.3kb)を調製する。
即ちpINK002をNsiIで切断し、ヌクレアーゼBAL31で末端
領域を消化した後、クレノウ酵素で末端を充填し、次い
でXhoIリンカー（pCCTCGAGG)を継ぎXhoIとAstIIで切断
し、MFのTATA領域、分泌シグナル、ターミネーターとβ
Ｅの前駆体領域及びpUC9の一部を含むXhoI−AatII断片
を得る。
領域を消化した後、クレノウ酵素で末端を充填し、次い
でXhoIリンカー（pCCTCGAGG)を継ぎXhoIとAstIIで切断
し、MFのTATA領域、分泌シグナル、ターミネーターとβ
Ｅの前駆体領域及びpUC9の一部を含むXhoI−AatII断片
を得る。
一方、pINK002をNsiIで切断し、ヌクレアーゼS1で処理
して平滑末端にした後、前記XhoIリンカーを結合し、Xh
oIとAatIIで切断して、MFのUAS1及びUAS2配列とpUC9の
の大部分の領域を含むXhoI−AatII断片を得る。両断片
を連結して、NsiI切断部位から下流に65bpの欠失を有す
るpINK A49(4.3kb)と、111bpの欠失を有するpINK A40
(4.3kb)を得る（第４図）。
して平滑末端にした後、前記XhoIリンカーを結合し、Xh
oIとAatIIで切断して、MFのUAS1及びUAS2配列とpUC9の
の大部分の領域を含むXhoI−AatII断片を得る。両断片
を連結して、NsiI切断部位から下流に65bpの欠失を有す
るpINK A49(4.3kb)と、111bpの欠失を有するpINK A40
(4.3kb)を得る（第４図）。
(9)プラスミドpAKI A49(6.7kb)の調製 MFα１遺伝子のUAS1及びUAS2配列とTATA配列の間の65bp
が欠失し、そこにXhoI切断部位を有する、βＥの発現ベ
クターpAKI A49(6.7kb)を調製する。
が欠失し、そこにXhoI切断部位を有する、βＥの発現ベ
クターpAKI A49(6.7kb)を調製する。
即ち、前記(5)で得たpREI052をEcoRIで切断しBAP処理し
て得られたEcoRI−EcoRI断片と、pINK A49をEcoRIで切
断して得られた、MFα１とβＥ遺伝子を含むEcoRI−Eco
RI断片とを連結してプラスミドpAKI A49(6.7kb)を得る
（第５図）。
て得られたEcoRI−EcoRI断片と、pINK A49をEcoRIで切
断して得られた、MFα１とβＥ遺伝子を含むEcoRI−Eco
RI断片とを連結してプラスミドpAKI A49(6.7kb)を得る
（第５図）。
(10)プラスミドpAKI036-30(6.9kb)及びpAKI036-20(6.8k
b)の調製 前記に得たpINK A40(4.3kb)とpAKI A49(6.7kb)とから、
MFα１のTATA領域の上流にUAS2配列が3個挿入された、
即ち全体として4個のUAS2配列を含んだpAKI036-30(6.9k
b)と、MFα１のTATA領域の上流にUAS2配列が1個挿入さ
れた、即ち全体として2個のUAS2配列を含んだpAKI036-2
0(6.8kb)とを得る。
b)の調製 前記に得たpINK A40(4.3kb)とpAKI A49(6.7kb)とから、
MFα１のTATA領域の上流にUAS2配列が3個挿入された、
即ち全体として4個のUAS2配列を含んだpAKI036-30(6.9k
b)と、MFα１のTATA領域の上流にUAS2配列が1個挿入さ
れた、即ち全体として2個のUAS2配列を含んだpAKI036-2
0(6.8kb)とを得る。
即ち、pINK A40をXmnI次いでXhoIで切断し、UAS2を含む
XmnI−XhoI断片のXmnI部位にXhoIリンカー（pCCTCGAGG)
を付加してXhoI−XhoI断片とする。
XmnI−XhoI断片のXmnI部位にXhoIリンカー（pCCTCGAGG)
を付加してXhoI−XhoI断片とする。
一方、pAKI A49を同様にXhoIで切断し、次いでBAPで処
理することによりXhoI−XhoI断片を得、これと上記pINK
A40からのUAS2配列を含むXhoI−XhoI断片を連結する。
得られたプラスミドの中から、UAS2配列を含むXhoI−Xh
oI断片が3個並列に挿入されたプラスミドpAKI036-30(6.
9kb)と、1個挿入されたプラスミドpAKI036-20(6.8kb)を
得る（第６図）。
理することによりXhoI−XhoI断片を得、これと上記pINK
A40からのUAS2配列を含むXhoI−XhoI断片を連結する。
得られたプラスミドの中から、UAS2配列を含むXhoI−Xh
oI断片が3個並列に挿入されたプラスミドpAKI036-30(6.
9kb)と、1個挿入されたプラスミドpAKI036-20(6.8kb)を
得る（第６図）。
以上の方法によって得られたpAKI036-30(6.9kb)は、MF
α１遺伝子に通常含まれるUAS1とUAS2の配列に加えて、
UAS2の配列を更に3個付加した発現ベクターである。
α１遺伝子に通常含まれるUAS1とUAS2の配列に加えて、
UAS2の配列を更に3個付加した発現ベクターである。
また、pAKI036-20(6.8kb)は、MFα１遺伝子に通常含ま
れるUAS1とUAS2の配列に加えて、UAS2の配列を更に1個
付加した発現ベクターである。
れるUAS1とUAS2の配列に加えて、UAS2の配列を更に1個
付加した発現ベクターである。
プラスミドpAKI036-30及びpAKI036-20を、夫々適当な酵
母宿主中に導入して発現させた場合、βエンドルフィン
の培地中への分泌量は、後記実施例に示すように、プロ
モーターとしてαフェロモンの遺伝子MFα１自体のプロ
モーターを用いた前記pREI059の場合に比し、pAKI036-3
0の場合約2.6倍に増大し、またpAKI036-20の場合は約1.
6倍に増大する。
母宿主中に導入して発現させた場合、βエンドルフィン
の培地中への分泌量は、後記実施例に示すように、プロ
モーターとしてαフェロモンの遺伝子MFα１自体のプロ
モーターを用いた前記pREI059の場合に比し、pAKI036-3
0の場合約2.6倍に増大し、またpAKI036-20の場合は約1.
6倍に増大する。
（実施例） 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。
なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次のＩ〜IXの方法によった。
を除き、次のＩ〜IXの方法によった。
Ｉ［制限酵素によるDNAの切断と回収］ 制限酵素による切断用緩衝液は、下記4種類を用い(1)〜
(3)の使い分けは、Advanced Bacterial Genetics(1981)
(Cold spring Harbor,New York)に従った。また切断条
件は2単位／μｇDNAの制限酵素を用い37℃または65℃で
30分間処理する。
(3)の使い分けは、Advanced Bacterial Genetics(1981)
(Cold spring Harbor,New York)に従った。また切断条
件は2単位／μｇDNAの制限酵素を用い37℃または65℃で
30分間処理する。
次いで、TE緩衝液(10mMのトリス塩酸pH8.0及び１mMのED
TAからなる）で飽和したフェノールで１回抽出し、エー
テルでフェノールを除き、2倍容のエタノールを加えて
−20℃で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回収す
る。
TAからなる）で飽和したフェノールで１回抽出し、エー
テルでフェノールを除き、2倍容のエタノールを加えて
−20℃で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回収す
る。
(1)低塩濃度緩衝液 10mMのトリス塩酸(pH7.4)、10mMの硫酸マグネシウム及
び１mMのジチオスレイトールからなる。
び１mMのジチオスレイトールからなる。
(2)中塩濃度緩衝液 50mMのNaCl、10mMのトリス塩酸(pH7.4)、10mMの硫酸マ
グネシウム及び１mMのジチオスレイトールからなる。
グネシウム及び１mMのジチオスレイトールからなる。
(3)高塩濃度緩衝液 100mMのNaCl、50mMのトリス塩酸(pH7.4)及び10mM＞の硫
酸マグネシウムからなる。
酸マグネシウムからなる。
II［大腸菌(E.coli)YO160 recAからのプラスミドDNAの
調製］ (1)ミニ調製法（mini prep法）Nucleic Acids Res.7
巻、1513〜1523頁(1979)］ 大腸菌YO160 recAを宿主とし、0.5mlのＬ−ブロス（10
ｇのペプトン、5gのイースト・エキス、１ｇのグルコー
ス、５ｇのNaCl/1からなるpH7.2）を用いて一夜間培養
し、遠心分離して集菌した菌体を100μｌの溶液A(50mM
のグルコース、10mMのEDTA，25mMのトリス塩酸(pH8.0)
及びリゾチーム2mg/mlからなる）に懸濁し室温で30分間
放置する。
調製］ (1)ミニ調製法（mini prep法）Nucleic Acids Res.7
巻、1513〜1523頁(1979)］ 大腸菌YO160 recAを宿主とし、0.5mlのＬ−ブロス（10
ｇのペプトン、5gのイースト・エキス、１ｇのグルコー
ス、５ｇのNaCl/1からなるpH7.2）を用いて一夜間培養
し、遠心分離して集菌した菌体を100μｌの溶液A(50mM
のグルコース、10mMのEDTA，25mMのトリス塩酸(pH8.0)
及びリゾチーム2mg/mlからなる）に懸濁し室温で30分間
放置する。
次いで、氷水中で200μｌの溶液Ｂ［１％の SDS(ドデ
シル硫酸ナトリウム）を含む0.2 NのNaOH］を加えて振
盪して同時にDNAの変性を行う。150μｌの3M酢酸ソーダ
溶液を加え氷冷後、遠心分離し、上清に冷エタノールを
加え、−20℃に冷却して遠心分離し沈澱を集める。
シル硫酸ナトリウム）を含む0.2 NのNaOH］を加えて振
盪して同時にDNAの変性を行う。150μｌの3M酢酸ソーダ
溶液を加え氷冷後、遠心分離し、上清に冷エタノールを
加え、−20℃に冷却して遠心分離し沈澱を集める。
沈澱を溶液C(50mMのトリス塩酸及び0.1Mの酢酸ソーダか
らなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エタノールを加
え、沈澱するDNAを洗浄し、減圧下乾燥し−20℃で保存
する。
らなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エタノールを加
え、沈澱するDNAを洗浄し、減圧下乾燥し−20℃で保存
する。
(2)大量調製法 200mlのL−ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬剤を
含む）に大腸菌YO160 recAを植菌し、一夜間培養し、集
菌後15mlのSTES緩衝液［TES緩衝液（10mMのトリス塩酸
(pH7.4)、１mMのEDTA及び50mMのNaClからなる）に25％
のサッカロースを添加したもの］に懸濁し、EDTA、リゾ
チーム及びリボヌクレアーゼA(シグマ社製）を夫々30m
M、600μg/ml及び50μg/ml加え、更に氷水中でプロナー
ゼEを500μg/mlを添加する。次いで、SDSを１％となる
ように加えて37℃で振盪後氷水中に戻し、Naclを終濃度
１Mとなるように添加した後、遠心分離し、上清に2倍容
の冷エタノールを加え、−20℃に保持し遠心分離してDN
Aを沈澱として回収し、減圧下乾燥し−20℃で保存す
る。
含む）に大腸菌YO160 recAを植菌し、一夜間培養し、集
菌後15mlのSTES緩衝液［TES緩衝液（10mMのトリス塩酸
(pH7.4)、１mMのEDTA及び50mMのNaClからなる）に25％
のサッカロースを添加したもの］に懸濁し、EDTA、リゾ
チーム及びリボヌクレアーゼA(シグマ社製）を夫々30m
M、600μg/ml及び50μg/ml加え、更に氷水中でプロナー
ゼEを500μg/mlを添加する。次いで、SDSを１％となる
ように加えて37℃で振盪後氷水中に戻し、Naclを終濃度
１Mとなるように添加した後、遠心分離し、上清に2倍容
の冷エタノールを加え、−20℃に保持し遠心分離してDN
Aを沈澱として回収し、減圧下乾燥し−20℃で保存す
る。
III［T4DNAリガーゼによる連結］ 連結する2個のDNA断片は、１μｇ／10μｌになるよう
に、連結用緩衝液［66mMのトリス塩酸(pH7.5)、6.6mMの
塩化マグネシウム、10mMのジチオスレイトールからな
る］に溶解し65℃で10分間処理した後、4℃で66μMのAT
P（アデノシントリフォスフェート）を加え、更にT4リ
ガーゼを粘着末端の場合は0.1単位／μｇDNA、また平滑
末端の場合は1単位／μｇDNAになるように加えて4℃で1
8時間反応させた後、65℃で10分間処理する。
に、連結用緩衝液［66mMのトリス塩酸(pH7.5)、6.6mMの
塩化マグネシウム、10mMのジチオスレイトールからな
る］に溶解し65℃で10分間処理した後、4℃で66μMのAT
P（アデノシントリフォスフェート）を加え、更にT4リ
ガーゼを粘着末端の場合は0.1単位／μｇDNA、また平滑
末端の場合は1単位／μｇDNAになるように加えて4℃で1
8時間反応させた後、65℃で10分間処理する。
IV［大腸菌の形質転換（Advanced Bacteril Genetics(1
981)(Cold Spring Havor,New York)］ ５mlのL−ブロスに、大腸菌YO160 recAを植菌し、一夜
間培養する。この0.2mlを20mlのL−ブロスに植え、37℃
でクレットユニットが60に達するまで振盪培養する。菌
体を集め氷冷した50mMの塩化カルシウムと10mMのトリス
塩酸(pH8.0)とからなる緩衝液10mlに懸濁し30分間氷冷
する。遠心分離した菌体を１mlの塩化カルシウム溶液に
懸濁し、この0.1mlを10μｌのDNA溶液と混合し、０℃で
30分間、42℃で2分間インキュベートした後、1.5mlのL
−ブロスを加え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天
培地に植える。
981)(Cold Spring Havor,New York)］ ５mlのL−ブロスに、大腸菌YO160 recAを植菌し、一夜
間培養する。この0.2mlを20mlのL−ブロスに植え、37℃
でクレットユニットが60に達するまで振盪培養する。菌
体を集め氷冷した50mMの塩化カルシウムと10mMのトリス
塩酸(pH8.0)とからなる緩衝液10mlに懸濁し30分間氷冷
する。遠心分離した菌体を１mlの塩化カルシウム溶液に
懸濁し、この0.1mlを10μｌのDNA溶液と混合し、０℃で
30分間、42℃で2分間インキュベートした後、1.5mlのL
−ブロスを加え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天
培地に植える。
Ｖ［S1ヌクレアーゼによるDNA粘着末端の除去］ 粘着末端を持つDNAを、200μｌの高塩濃度緩衝液［30mM
の酢酸ソーダ(pH4.25)、0.3MのNaCl及び4mMの硫酸亜鉛
からなる］に溶解し、S1ヌクレアーゼを20単位／μgDNA
加え、22℃で40分間処理し、TE緩衝液で飽和したフェノ
ールで抽出処理した後、エーテルでフェノールを除き、
冷エタノールを加え−20℃に冷却し、遠心分離により沈
澱したDNAを回収する。
の酢酸ソーダ(pH4.25)、0.3MのNaCl及び4mMの硫酸亜鉛
からなる］に溶解し、S1ヌクレアーゼを20単位／μgDNA
加え、22℃で40分間処理し、TE緩衝液で飽和したフェノ
ールで抽出処理した後、エーテルでフェノールを除き、
冷エタノールを加え−20℃に冷却し、遠心分離により沈
澱したDNAを回収する。
VI［XhoIリンカーのリン酸化］ XhoIリンカー（B.R.L社製） ′5CCTCGAGG3′ ′3GGAGCTCC5′ は、末端にリン酸基が付いていないので、T4キナーゼで
リン酸化を行なった。
リン酸化を行なった。
３nmolのXhoIリンカーを、41μｌの80mMトリス塩酸(pH
7.5)及び12mMの塩化マグネシウムに溶解し、60℃で10分
間インキュベートした後、37℃で10mMの2-メルカプトエ
タノールと、20mMのATPを加え更に10単位のT4キナーゼ
を添加して37℃で30分間処理した後、−20℃で保存す
る。
7.5)及び12mMの塩化マグネシウムに溶解し、60℃で10分
間インキュベートした後、37℃で10mMの2-メルカプトエ
タノールと、20mMのATPを加え更に10単位のT4キナーゼ
を添加して37℃で30分間処理した後、−20℃で保存す
る。
VII［XhoIリンカーの平滑末端への連結］ 平滑末端のDNA断片(1.2 p mol末端）と上記VIでリン酸
化したXhoIリンカー（100 pmol末端）を連結用緩衝液
［66mMのトリス塩酸(pH7.5)、6.6mMの塩化マグネシウ
ム、10mMのジチオスレイトールからなる］に溶解し1単
位のT4リガーゼを加え4℃で18時間反応後、XhoIで処理
して余分のXhoIリンカーを除き、TE緩衝液で飽和したフ
ェノールでDNAを抽出し、エーテルでフェノールを除去
後エタノール沈殿でDNAを回収する。
化したXhoIリンカー（100 pmol末端）を連結用緩衝液
［66mMのトリス塩酸(pH7.5)、6.6mMの塩化マグネシウ
ム、10mMのジチオスレイトールからなる］に溶解し1単
位のT4リガーゼを加え4℃で18時間反応後、XhoIで処理
して余分のXhoIリンカーを除き、TE緩衝液で飽和したフ
ェノールでDNAを抽出し、エーテルでフェノールを除去
後エタノール沈殿でDNAを回収する。
VIII［プラスミドDNAのバクテリアルアルカリンフォス
ファターゼ(BAP)処理］ プラスミドDNAの自己連結を阻止するため、プラスミドD
NAの制限酵素部位とDNA断片との連結に先だってプラス
ミドDNAを予めBAPで処理する。
ファターゼ(BAP)処理］ プラスミドDNAの自己連結を阻止するため、プラスミドD
NAの制限酵素部位とDNA断片との連結に先だってプラス
ミドDNAを予めBAPで処理する。
制限酵素で切断したプラミスドDNA(10pmol 5′末端）
を、200μｌのBAP緩衝液［10mMのトリス塩酸(pH8.0)及
び0.1mMのEDTAからなる］に溶解し100単位のBAPを加え6
5℃で1時間反応後、TE緩衝液で飽和したフェノールで抽
出処理し、エーテルでフェノールを除去し、エタノール
沈澱によりプラスミドDNAを回収する。
を、200μｌのBAP緩衝液［10mMのトリス塩酸(pH8.0)及
び0.1mMのEDTAからなる］に溶解し100単位のBAPを加え6
5℃で1時間反応後、TE緩衝液で飽和したフェノールで抽
出処理し、エーテルでフェノールを除去し、エタノール
沈澱によりプラスミドDNAを回収する。
IX［BAL31処理］ DNAの両端から2本鎖とも消化するため、BAL31処理を行
う。
う。
エタノール沈澱した15μｇのDNAを、20μｌの5×BAL緩
衝液［3Mの塩化ナトリウム、60mMの塩化カルシウム、60
mMの塩化マグネシウム及び5mMのEDTA］に溶解し、水79
μｌとBAL酵素を1μｌ1(2単位）加え20℃で30分間保温
する。反応後フェノールで3回、エーテルで3回抽出した
後エタノール沈澱を行う。
衝液［3Mの塩化ナトリウム、60mMの塩化カルシウム、60
mMの塩化マグネシウム及び5mMのEDTA］に溶解し、水79
μｌとBAL酵素を1μｌ1(2単位）加え20℃で30分間保温
する。反応後フェノールで3回、エーテルで3回抽出した
後エタノール沈澱を行う。
実施例 (1)プラスミドpLS01(4.4kb)の調製 サッカロミセス・セレビシエ(IFO 1136)の染色体DNA 50
0μｇを500μｌの緩衝液［100mMのトリス塩酸(pH7.5)、
50mMのNaCl、10mMの塩化マグネシウム及び1mMのジチオ
スレイトールからなる］中で15単位のEcoRIで37℃、1夜
間処理して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾配遠心にか
け、２kb前後のDNA断片を集めた。これをプラスミドpUC
13をEcoRIを用いて切断した断片１μｇとT4リガーゼ2単
位を用いて連結し、得られたプラスミドで大腸菌JM83株
を形質転換し、アンピシリン(Ap)耐性株を選択した。
0μｇを500μｌの緩衝液［100mMのトリス塩酸(pH7.5)、
50mMのNaCl、10mMの塩化マグネシウム及び1mMのジチオ
スレイトールからなる］中で15単位のEcoRIで37℃、1夜
間処理して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾配遠心にか
け、２kb前後のDNA断片を集めた。これをプラスミドpUC
13をEcoRIを用いて切断した断片１μｇとT4リガーゼ2単
位を用いて連結し、得られたプラスミドで大腸菌JM83株
を形質転換し、アンピシリン(Ap)耐性株を選択した。
合成オリゴヌクレオチド ′5GGCCAACCAATGTACT3′ をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行
ない、陽性のコロニーを選択し、プラスミドDNAを分離
し、制限酵素による解析と塩基配列の決定により、Cel
l，30巻、937頁(1982)の記載と一致する塩基配列を有す
るα因子DNAを含むプラスミドpLS01(4.4kb)を選択採取
した。
ない、陽性のコロニーを選択し、プラスミドDNAを分離
し、制限酵素による解析と塩基配列の決定により、Cel
l，30巻、937頁(1982)の記載と一致する塩基配列を有す
るα因子DNAを含むプラスミドpLS01(4.4kb)を選択採取
した。
(2)プラスミドpREI032(5.8)の調製 プラスミドYRp7(5.7kb)をEcoRIで部分切断し、粘着末端
を充填した後T4リガーゼで連結してYRp7の一方のEcoRI
サイトが除去されたpREI032(5.8kb)を調製した。
を充填した後T4リガーゼで連結してYRp7の一方のEcoRI
サイトが除去されたpREI032(5.8kb)を調製した。
(3)プラスミドpUC8-βE(2.9kb)の調製 プラスミドpYT3-24をHaeIIIで切断してβＥDNA(93 bp)
を含む160bpのHaeIII−HaeIII断片を採取した。
を含む160bpのHaeIII−HaeIII断片を採取した。
一方、ファージM13mp7のRFI DNAを HincIIで切断し、
エタノールを添加してエタノールに溶解する断片 ′5G
ACCTGCAGGTC3′（HincII-HincII）を除去した後、HincI
I部位に、上記βＥ DNAを含む160bpのHaeIII−HaeIII
断片をT4リガーゼで連結し、これを大腸菌に導入した。
形質転換株からDNAを調製しこれをBamHIで切断し、得ら
れたBamHI−BamHI断片を、プラスミドpUC8のBamHI部位
に挿入してpUC8−βＥ(2.9kb)を得た。
エタノールを添加してエタノールに溶解する断片 ′5G
ACCTGCAGGTC3′（HincII-HincII）を除去した後、HincI
I部位に、上記βＥ DNAを含む160bpのHaeIII−HaeIII
断片をT4リガーゼで連結し、これを大腸菌に導入した。
形質転換株からDNAを調製しこれをBamHIで切断し、得ら
れたBamHI−BamHI断片を、プラスミドpUC8のBamHI部位
に挿入してpUC8−βＥ(2.9kb)を得た。
(4)プラスミドpREI046(7.4kb)の調製 （イ）pLS01(4.4kb)をEcoRI及びHindlIIIで切断してプ
ロモーター配列及びリーダー配列を含むEcoRI−HindIII
断片(1.4kb)を得た。
ロモーター配列及びリーダー配列を含むEcoRI−HindIII
断片(1.4kb)を得た。
（ロ）pUC8-E(2.9kb)をHindIII及びEcoRIで切断してHin
dIII〜EcoRI断片(0.2kb)を得た。
dIII〜EcoRI断片(0.2kb)を得た。
（ハ）pREI032(5.8kb)をEcoRIで切断し、これを上記
（イ）及び（ロ）で得たDNA断片とT4リガーゼを用いて
連結してpREI046(7.4kb)を得た。
（イ）及び（ロ）で得たDNA断片とT4リガーゼを用いて
連結してpREI046(7.4kb)を得た。
(5)プラスミドpREI052(5.2kb)の調製 （イ）pREI032(5.8kb)をEcoRI及びPstIで切断してTRP1
を含むEcoRI−PstI断片(0.8kb)を得た。
を含むEcoRI−PstI断片(0.8kb)を得た。
（ロ）２μｍプラスミドをEcoRIで切断し、その粘着末
端を充填して平滑末端とした後、PstIで切断して複製開
始点を含むPstI−EcoRI断片(2kb)を得た。
端を充填して平滑末端とした後、PstIで切断して複製開
始点を含むPstI−EcoRI断片(2kb)を得た。
（ハ）上記（イ）及び（ロ）で得たDNA断片を、pBR322
をEcoRI及びPvuIIで切断したPvuII−EcoRI断片(2.3kb)
と共にT4DNAリガーゼによって連結してpREI051(5.1kb)
を作製し、EcoRIで部分切断した後、粘着末端を充填し
て平滑末端としてT4リガーゼで連結し一方のEcoRI切断
部位を欠失したpREI052(5.2kb)を得た。
をEcoRI及びPvuIIで切断したPvuII−EcoRI断片(2.3kb)
と共にT4DNAリガーゼによって連結してpREI051(5.1kb)
を作製し、EcoRIで部分切断した後、粘着末端を充填し
て平滑末端としてT4リガーゼで連結し一方のEcoRI切断
部位を欠失したpREI052(5.2kb)を得た。
(6)プラスミドpREI059(6.8kb)の調製 （イ）pREI046(7.4kb)をEcoRI及びSmaIで切断し、得ら
れたプロモーター配列、リーダー配列及びβＥ DNA配
列を含むEcoRI−SmaI断片（1.6kb)を採取した。
れたプロモーター配列、リーダー配列及びβＥ DNA配
列を含むEcoRI−SmaI断片（1.6kb)を採取した。
（ロ）pLS01(4.4kb)をHincII及びEcoRIで切断し、ター
ミネーター配列を含むHincII−EcoRI断片(0.3kb)を採取
した。
ミネーター配列を含むHincII−EcoRI断片(0.3kb)を採取
した。
（ハ）pREI052(5.2kb)をEcoRIで切断し、BAPを加えて末
端のリン酸基を外した後、上記（イ）及び（ロ）で得た
DNA断片とT4リガーゼを用いて連結してプラスミドpREI0
59(6.8kb)を得た。
端のリン酸基を外した後、上記（イ）及び（ロ）で得た
DNA断片とT4リガーゼを用いて連結してプラスミドpREI0
59(6.8kb)を得た。
(7)プラスミドPINK002(4.4kb)の調製 pREI059をEcoRIで切断したEcoRI〜EcoRI断片を、プラス
ミドpUC9(2.7kb)をEcoRIで切断し次いでBAP処理して得
た断片と連結してpINK002(4.4kb)を得た。
ミドpUC9(2.7kb)をEcoRIで切断し次いでBAP処理して得
た断片と連結してpINK002(4.4kb)を得た。
(8)プラスミドpINK-A49(4.3kb)及びpINK-A40(4.3kb)の
調製 pINK002をNsiIで切断し、ヌクレアーゼBAL31で末端領域
を消化した後、クレノウ酵素で末端を充填し、次いでXh
oIリンカー(pCCTCGAGG)を継ぎ、XhoIとAatIIで切断し、
MFα1のTATA領域、分泌シグナル、ターミネーターとβ
Ｅの前駆体領域及びpUC9の一部を含むXhoI−AatII断片
を得た。
調製 pINK002をNsiIで切断し、ヌクレアーゼBAL31で末端領域
を消化した後、クレノウ酵素で末端を充填し、次いでXh
oIリンカー(pCCTCGAGG)を継ぎ、XhoIとAatIIで切断し、
MFα1のTATA領域、分泌シグナル、ターミネーターとβ
Ｅの前駆体領域及びpUC9の一部を含むXhoI−AatII断片
を得た。
一方、pINK002をNsiIで切断し、ヌクレアーゼS1で処理
して平滑末端にした後、前記XhoIリンカーを結合し、Xh
oIとAatIIで切断して、MFα１のUAS1及びUAS2配列とpUC
9のの大部分の領域を含むXhoI−AatII断片を得た。この
両断片を連結してNsiI切断部位から下流に65bpの欠失を
有するpINK A49(4.3kb)と、111bpの欠失を有するpINK A
40(4.3kb)を得た（第４図）。
して平滑末端にした後、前記XhoIリンカーを結合し、Xh
oIとAatIIで切断して、MFα１のUAS1及びUAS2配列とpUC
9のの大部分の領域を含むXhoI−AatII断片を得た。この
両断片を連結してNsiI切断部位から下流に65bpの欠失を
有するpINK A49(4.3kb)と、111bpの欠失を有するpINK A
40(4.3kb)を得た（第４図）。
(9)プラスミドpAKI A49(6.7kb)の調製 前記(5)で得たpREI052をEcoRIで切断しBAP処理して得ら
れたEcoRI−EcoRI断片と、pINK A49をEcoRIで切断して
得られた、MFα１とβＥ遺伝子を含むEcoRI−EcoRI断片
とを連結してプラスミドpAKI A49(6.7kb)を得た（第５
図）。
れたEcoRI−EcoRI断片と、pINK A49をEcoRIで切断して
得られた、MFα１とβＥ遺伝子を含むEcoRI−EcoRI断片
とを連結してプラスミドpAKI A49(6.7kb)を得た（第５
図）。
(10)プラスミドpAKI036-30(6.9kb)及びpAKI036-20(6.8k
b)の調製 PINK-A40をXmnI次いでXhoIで切断し、UAS2を含むXmnI−
XhoI断片のXmnI部位にXhoIリンカー(pCCTCGAGG)を付加
してXhoI−XhoI断片とした。
b)の調製 PINK-A40をXmnI次いでXhoIで切断し、UAS2を含むXmnI−
XhoI断片のXmnI部位にXhoIリンカー(pCCTCGAGG)を付加
してXhoI−XhoI断片とした。
一方、pAKI A49を同様にXhoIで切断し、次いでBAPで処
理することによりXhoI−XhoI断片を得、これと上記pINK
A40からのUAS2配列を含むXhoI−XhoI断片を連結した。
得られたプラスミドの中から、UAS2配列を含むXhoI−Xh
oI断片が3個並列に挿入されたプラスミドpAKI036-30(6.
9kb)と、1個挿入されたプラスミドpAKI036-20(6.8kb)を
得た（第６図）。
理することによりXhoI−XhoI断片を得、これと上記pINK
A40からのUAS2配列を含むXhoI−XhoI断片を連結した。
得られたプラスミドの中から、UAS2配列を含むXhoI−Xh
oI断片が3個並列に挿入されたプラスミドpAKI036-30(6.
9kb)と、1個挿入されたプラスミドpAKI036-20(6.8kb)を
得た（第６図）。
(11)プラスミドpAKI036-30及びpAKI036-20によるサッカ
ロマイセス・セレビシエ20B-12株の形質転換 サッカロミセス・セレビシエ20B-12株を、YPD培地（１
％の酵母エキス、２％のペプトン及び２％のグルコース
からなる）で一夜間培養した培養液0.5mlを20mlのＹＰ
Ｄ培地に植え、30℃でクレットユニット60まで振盪培養
した。この10mlを遠心分離して得た菌体を10mlのTE緩衝
液で洗浄し、１mlのTE緩衝液に懸濁した。この0.5ml
に、0.5mlの0.2M酢酸リチウム、10mMのトリス塩酸(pH7.
5)及び１mMのEDTAを加え、30℃で1時間保持した後、氷
水中で冷却した。
ロマイセス・セレビシエ20B-12株の形質転換 サッカロミセス・セレビシエ20B-12株を、YPD培地（１
％の酵母エキス、２％のペプトン及び２％のグルコース
からなる）で一夜間培養した培養液0.5mlを20mlのＹＰ
Ｄ培地に植え、30℃でクレットユニット60まで振盪培養
した。この10mlを遠心分離して得た菌体を10mlのTE緩衝
液で洗浄し、１mlのTE緩衝液に懸濁した。この0.5ml
に、0.5mlの0.2M酢酸リチウム、10mMのトリス塩酸(pH7.
5)及び１mMのEDTAを加え、30℃で1時間保持した後、氷
水中で冷却した。
得られた菌体懸濁液100μｌにDNA溶液10μｌを加え、０
℃で30分間保持した後、200μｌの70％ポリエチレング
リコール4000溶液を加え30℃で1時間、次いで42℃で5分
間保持した後、集菌し、0.5mlの水で洗浄後0.3mlの水に
懸濁し、プレート１枚に0.1ml植えた。
℃で30分間保持した後、200μｌの70％ポリエチレング
リコール4000溶液を加え30℃で1時間、次いで42℃で5分
間保持した後、集菌し、0.5mlの水で洗浄後0.3mlの水に
懸濁し、プレート１枚に0.1ml植えた。
(12)β−エンドルフィンの分泌量 上記(10)で得たプラスミドpAKI036-30及びpAKI036-20を
夫々含む酵母を2日間培養した後遠心分離し、上清につ
いて、β−エンドルフィン[RIA]キット、New England N
uclear社、カタログ番号NEK−003を使用し、カタログ記
載の方法に従ってラジオイムノアッセイを行なった結
果、上清中のβ−エンドルフィンの分泌量は、プラスミ
ドpAKI036-30を含む酵母では1,413μg/mlであり、ま
た、pAKI036-20を含む酵母では888μg/mlであった。
夫々含む酵母を2日間培養した後遠心分離し、上清につ
いて、β−エンドルフィン[RIA]キット、New England N
uclear社、カタログ番号NEK−003を使用し、カタログ記
載の方法に従ってラジオイムノアッセイを行なった結
果、上清中のβ−エンドルフィンの分泌量は、プラスミ
ドpAKI036-30を含む酵母では1,413μg/mlであり、ま
た、pAKI036-20を含む酵母では888μg/mlであった。
なお前記のプラスミドpREI059により、同様にサッカロ
マイセス・セレビシエ20B-12株を形質転換し、培養後、
遠心分離した上清について、上記と同一方法により測定
したβ−エンドルフィンの分泌量は544μg/mlであっ
た。
マイセス・セレビシエ20B-12株を形質転換し、培養後、
遠心分離した上清について、上記と同一方法により測定
したβ−エンドルフィンの分泌量は544μg/mlであっ
た。
（発明の効果） 本発明のプロモーターを含有するプラスミドを導入した
サッカロマイセス・セレビシエは、従来のMFα1自体の
プロモーターを含有するプラスミドを導入した場合に比
して、前記実施例に示すように、高い効率で異種蛋白質
を培養液中に分泌させることができる。
サッカロマイセス・セレビシエは、従来のMFα1自体の
プロモーターを含有するプラスミドを導入した場合に比
して、前記実施例に示すように、高い効率で異種蛋白質
を培養液中に分泌させることができる。
第１図〜第６図は、夫々プラスミドpREI046、pREI052、
pREI059、pINK A40及びpINK A49、pAKI A49、pAKI036-3
0及びpAKI036-20の構成ルートを示す模式図である。
pREI059、pINK A40及びpINK A49、pAKI A49、pAKI036-3
0及びpAKI036-20の構成ルートを示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (1)
- 【請求項１】酵母サッカロマイセス・セレビシエのαフ
ェロモン遺伝子ＭＦα１の翻訳開始点の上流−３１３か
ら−２７３までのＤＮＡ配列 ＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＴＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣ
ＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＡ を、ＴＡＴＡ領域（−１２８から−１２２）の上流に少
なくとも２個挿入してなるプロモーター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61280748A JPH066060B2 (ja) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | 新規なプロモ−タ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61280748A JPH066060B2 (ja) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | 新規なプロモ−タ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63133987A JPS63133987A (ja) | 1988-06-06 |
| JPH066060B2 true JPH066060B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=17629405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61280748A Expired - Lifetime JPH066060B2 (ja) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | 新規なプロモ−タ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066060B2 (ja) |
-
1986
- 1986-11-27 JP JP61280748A patent/JPH066060B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．［８１（１９８４）Ｐ．４６４２−４６４６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63133987A (ja) | 1988-06-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |