JPH0712312B2 - 改良された抗生物質耐性遺伝子 - Google Patents
改良された抗生物質耐性遺伝子Info
- Publication number
- JPH0712312B2 JPH0712312B2 JP15194384A JP15194384A JPH0712312B2 JP H0712312 B2 JPH0712312 B2 JP H0712312B2 JP 15194384 A JP15194384 A JP 15194384A JP 15194384 A JP15194384 A JP 15194384A JP H0712312 B2 JPH0712312 B2 JP H0712312B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- gene
- coli
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、改良されたハイグロマイシンＢ耐性付与遺伝
子に関するものである。本発明の改良遺伝子は、プロモ
ーターのクローニング、単離および識別、並びに適当な
宿主内で優勢な選択マーカーとして機能する遺伝子融合
物（gene fusion）の組立てに有用である。本発明はま
た、上記DNAを含むベクターおよび形質転換体に関する
ものでもある。
子に関するものである。本発明の改良遺伝子は、プロモ
ーターのクローニング、単離および識別、並びに適当な
宿主内で優勢な選択マーカーとして機能する遺伝子融合
物（gene fusion）の組立てに有用である。本発明はま
た、上記DNAを含むベクターおよび形質転換体に関する
ものでもある。
従来技術 イギリス特許出願公開番号第2,100,735号には、本発明
に有用な出発物質（プラスミドpKC222およびハイグロマ
イシンＢ耐性付与DNAセグセントを含有するもの）が開
示されている。しかしながら、上記の出願公開明細書
は、本発明に係る改良遺伝子を開示するものでないばか
りか、選択可能な遺伝子融合物の主要な成分としてのそ
の有用性を示唆するものでもない。
に有用な出発物質（プラスミドpKC222およびハイグロマ
イシンＢ耐性付与DNAセグセントを含有するもの）が開
示されている。しかしながら、上記の出願公開明細書
は、本発明に係る改良遺伝子を開示するものでないばか
りか、選択可能な遺伝子融合物の主要な成分としてのそ
の有用性を示唆するものでもない。
発明の目的および構成 優勢で選択可能なマーカーとの遺伝子融合は、転写また
は翻訳に関する活性素配列（アクチベーター配列）を単
離し、外来性の系内でこの優勢な選択マーカーを発現せ
しめるのに有用な方法である。広範な微生物類がアミノ
グリコシツド系抗生物質のハイグロマイシンＢに感受性
を有するので（Ahmadら、1980、Antimicrob.Agents Che
mother.18:789;Mannら、1953、Antibiot.and Chemothe
r.3:1279;Pettingerら、1953、Antibiot.and Chemothe
r.3:1268;およびSinghら、1979、Nature277:146）、本
発明の改良されたハイグロマイシンＢ耐性付与遺伝子
は、種々の宿主系に有効に用い得る優勢な選択マーカー
である。
は翻訳に関する活性素配列（アクチベーター配列）を単
離し、外来性の系内でこの優勢な選択マーカーを発現せ
しめるのに有用な方法である。広範な微生物類がアミノ
グリコシツド系抗生物質のハイグロマイシンＢに感受性
を有するので（Ahmadら、1980、Antimicrob.Agents Che
mother.18:789;Mannら、1953、Antibiot.and Chemothe
r.3:1279;Pettingerら、1953、Antibiot.and Chemothe
r.3:1268;およびSinghら、1979、Nature277:146）、本
発明の改良されたハイグロマイシンＢ耐性付与遺伝子
は、種々の宿主系に有効に用い得る優勢な選択マーカー
である。
本発明に於いて、ハイグロマイシンＢホスホトランスフ
エラーゼの後方の338、339または340個のアミノ酸群と
は、天然に存在するハイグロマイシンＢホスホトランス
フエラーゼ分子のＮ末端から、第１番目、第１と第２番
目、または第１、第２および第３番目のアミノ酸を除く
天然の配列の、ハイグロマイシンＢホスホトランスフエ
ラーゼの全アミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する
ものとする。更に、本明細書で使用する用語は以下の定
義に従うものとする。
エラーゼの後方の338、339または340個のアミノ酸群と
は、天然に存在するハイグロマイシンＢホスホトランス
フエラーゼ分子のＮ末端から、第１番目、第１と第２番
目、または第１、第２および第３番目のアミノ酸を除く
天然の配列の、ハイグロマイシンＢホスホトランスフエ
ラーゼの全アミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する
ものとする。更に、本明細書で使用する用語は以下の定
義に従うものとする。
組換えDNAクローニングベクター−１または１以上の追
加のDNAセグメントを付加せしめることができる、ある
いは付加せしめたDNA分子であつて、自律的自己複製能
力を有する全てのものを指し、プラスミドを含むがこれ
に限定されるものではない。
加のDNAセグメントを付加せしめることができる、ある
いは付加せしめたDNA分子であつて、自律的自己複製能
力を有する全てのものを指し、プラスミドを含むがこれ
に限定されるものではない。
形質転換−DNAを受容体宿主に導入し、その遺伝子形質
を変化させ、その結果、受容体細胞に変化をもたらすこ
とをいう。
を変化させ、その結果、受容体細胞に変化をもたらすこ
とをいう。
機能的ポリペプチド−回収可能な、生物学的に活性であ
りかつ全体がヘテロローガス（外来性）なポリプペチド
または前駆体、あるいはヘテロローガスなポリペプチド
とホモローガス（内性）なポリペプチドの一部または全
部とから成る、回収可能で生物学的に活性なポリペプチ
ド、あるいはヘテロローガスなポリペプチドと生物学的
に不活性な、特異的に開裂できるホモローガスなポリペ
プチドとから成る、回収可能な生物学的に不活性な融合
ポリペプチド。
りかつ全体がヘテロローガス（外来性）なポリプペチド
または前駆体、あるいはヘテロローガスなポリペプチド
とホモローガス（内性）なポリペプチドの一部または全
部とから成る、回収可能で生物学的に活性なポリペプチ
ド、あるいはヘテロローガスなポリペプチドと生物学的
に不活性な、特異的に開裂できるホモローガスなポリペ
プチドとから成る、回収可能な生物学的に不活性な融合
ポリペプチド。
融合遺伝子産物−ホモローガスなポリペプチドの一部ま
たは全部と融合した、回収可能なヘテロローガスなポリ
ペプチド。
たは全部と融合した、回収可能なヘテロローガスなポリ
ペプチド。
構造遺伝子−機能的ポリペプチドを暗号化（コード）し
ている遺伝子であるが、転写または翻訳に関する活性素
配列は含まないもの。
ている遺伝子であるが、転写または翻訳に関する活性素
配列は含まないもの。
本発明は、pKC222の〜1.45kb EcoRI 制限フラグメント
をEcoRI−消化プラスミドpIT122にライゲーシヨン（結
合）させてプラスミドpIT123を得ることからなる、ハイ
グロマイシンＢホスホトランスフエラーゼの後方の338
個のアミノ酸配列を暗号化しているDNA、あるいは翻訳
解読相内において転写および翻訳活性素配列−含有遺伝
子または遺伝子部分と共にある該DNAを含有しているプ
ラスミドの調製法を提供するものである。本発明は更
に、上記DNAを含有している形質転換体を提供するもの
である。
をEcoRI−消化プラスミドpIT122にライゲーシヨン（結
合）させてプラスミドpIT123を得ることからなる、ハイ
グロマイシンＢホスホトランスフエラーゼの後方の338
個のアミノ酸配列を暗号化しているDNA、あるいは翻訳
解読相内において転写および翻訳活性素配列−含有遺伝
子または遺伝子部分と共にある該DNAを含有しているプ
ラスミドの調製法を提供するものである。本発明は更
に、上記DNAを含有している形質転換体を提供するもの
である。
さらに詳しくは、本発明のDNAは、デオキシリボヌクレ
オチド配列翻訳活性素配列含有−遺伝子または遺伝子部
分を含有するものである。さらに本発明は、上記DNAを
含有する組換えDNAクローニングベクターおよび形質転
換体を提供するものである。
オチド配列翻訳活性素配列含有−遺伝子または遺伝子部
分を含有するものである。さらに本発明は、上記DNAを
含有する組換えDNAクローニングベクターおよび形質転
換体を提供するものである。
より具体的には、本発明は、式： 〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニジ
ル、Ｃはデオキシシチジル（deoxycytisyl）、Ｔはチミ
ジルであり、 ＲおよびR2は、独立してリジンを暗号化しているデオキ
シリボヌクレオチドトリプレツトであり、 R1およびR3、その含窒素塩基が、それぞれＲおよびR2の
対応する塩基と相補的であるデオキシリボヌクレオチド
トリプレツトであり、 ｍおよびｎは０または１であり（ただしｎが０のときは
ｍも０であり、ｍが１のときはｎも１である）、 R4は翻訳停止コドンを暗号化しているデオキシリボヌク
レオチドトリプレツトであり、 R5はその含窒素塩基が、R4の対応する塩基と相補的であ
るデオキシリボヌクレオチドトリプレツトである。〕 で示されるデオキシリボヌクレオチド配列からなるDNA
である。
ル、Ｃはデオキシシチジル（deoxycytisyl）、Ｔはチミ
ジルであり、 ＲおよびR2は、独立してリジンを暗号化しているデオキ
シリボヌクレオチドトリプレツトであり、 R1およびR3、その含窒素塩基が、それぞれＲおよびR2の
対応する塩基と相補的であるデオキシリボヌクレオチド
トリプレツトであり、 ｍおよびｎは０または１であり（ただしｎが０のときは
ｍも０であり、ｍが１のときはｎも１である）、 R4は翻訳停止コドンを暗号化しているデオキシリボヌク
レオチドトリプレツトであり、 R5はその含窒素塩基が、R4の対応する塩基と相補的であ
るデオキシリボヌクレオチドトリプレツトである。〕 で示されるデオキシリボヌクレオチド配列からなるDNA
である。
上記DNAによつて暗号化されている、適当なヌクレオチ
ドトリプレツトに対応するアミノ酸は以下の記号で表わ
される。即ち、METはメチオニン、LYSはリジン、PROは
プロリン、GLUはグルタミン酸、LEUはロイシン、THRは
スレオニン、ALAはアラニン、SERはセリン、VALはバリ
ン、PHEはフエニルアラニン、ILEはイソロイシン、GLY
はグリシン、ASPはアスパラギン酸、GLNはグルタミン、
ARGはアルギニン、CYSはシステイン、TRPはトリプトフ
アン、ASNはアスパラギン、HISはヒスチジンそしてTYR
はチロシンを表わす。
ドトリプレツトに対応するアミノ酸は以下の記号で表わ
される。即ち、METはメチオニン、LYSはリジン、PROは
プロリン、GLUはグルタミン酸、LEUはロイシン、THRは
スレオニン、ALAはアラニン、SERはセリン、VALはバリ
ン、PHEはフエニルアラニン、ILEはイソロイシン、GLY
はグリシン、ASPはアスパラギン酸、GLNはグルタミン、
ARGはアルギニン、CYSはシステイン、TRPはトリプトフ
アン、ASNはアスパラギン、HISはヒスチジンそしてTYR
はチロシンを表わす。
そのＲ、R1、R2、R3、R4およびR5が遺伝暗号（Watson,
J.O.、1976、Molecular Biology of uhe Gene、W.A.Ben
jamin Inc.、Menlo Park、California）に従つて定めら
れる本発明のDNA配列は、完全に保護されたトリデオキ
シリボヌクレオチド組立てブロツクを用いて、改良ホス
ホトリエステル法により、常法に従つて合成することが
できる。その様な合成法は当該技術分野で周知であり、
Itakuraら（1977、Science198:1056）およびCreaら（19
78、Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:5765）の方法を実質上踏
襲して行うことができる。当業者ならば、先に例示した
DNA配列によつて暗号化されているアミノ酸と同じアミ
ノ酸を暗号化している他のDNA配列も合成することがで
きるということが理解できよう。この様な他のDNA配列
は遺伝暗号の縮重を反映するものであり、それらもまた
本発明に包含されるものである。
J.O.、1976、Molecular Biology of uhe Gene、W.A.Ben
jamin Inc.、Menlo Park、California）に従つて定めら
れる本発明のDNA配列は、完全に保護されたトリデオキ
シリボヌクレオチド組立てブロツクを用いて、改良ホス
ホトリエステル法により、常法に従つて合成することが
できる。その様な合成法は当該技術分野で周知であり、
Itakuraら（1977、Science198:1056）およびCreaら（19
78、Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:5765）の方法を実質上踏
襲して行うことができる。当業者ならば、先に例示した
DNA配列によつて暗号化されているアミノ酸と同じアミ
ノ酸を暗号化している他のDNA配列も合成することがで
きるということが理解できよう。この様な他のDNA配列
は遺伝暗号の縮重を反映するものであり、それらもまた
本発明に包含されるものである。
上で定義したDNAにおいて、ｍが０、R4がTAGそしてR5が
ATCであるものは、プラスミドpKC222を適当に消化する
ことによつても組立てることができる。この目的のため
には、pKC222のハイグロマイシンＢホスホトランスフエ
ラーゼ遺伝子の暗号領域の開始部位に近接したHphI制限
サイト（部位）が極めて有用である。即ち、プラスミド
pKC222をHph I−Pst I消化することにより、325bp（塩
基対）（プラス一本鎖延長部）からなり、ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフエラーゼポリペプチドの４−11
2アミノ酸を暗号化している、先端を切断されたハイグ
ロマイシンＢホスホトランスフエラーゼ遺伝子が得られ
る。Hph I制限酵素によつて生成したこの３′方向伸長
部を除去した後、このフラグメントにBam HI分子リンカ
ーを結合させ、Eco RI制限酵素で消化した後、BamHI−E
co RI消化プラスミドpBR322と結合させることができ
る。こうして得たpIT122と呼称されるプラスミドは、ハ
イグロマイシンＢホスホトランスフエラーゼ遺伝子の一
部分のみを含有しており、出発物質として用いられる。
ATCであるものは、プラスミドpKC222を適当に消化する
ことによつても組立てることができる。この目的のため
には、pKC222のハイグロマイシンＢホスホトランスフエ
ラーゼ遺伝子の暗号領域の開始部位に近接したHphI制限
サイト（部位）が極めて有用である。即ち、プラスミド
pKC222をHph I−Pst I消化することにより、325bp（塩
基対）（プラス一本鎖延長部）からなり、ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフエラーゼポリペプチドの４−11
2アミノ酸を暗号化している、先端を切断されたハイグ
ロマイシンＢホスホトランスフエラーゼ遺伝子が得られ
る。Hph I制限酵素によつて生成したこの３′方向伸長
部を除去した後、このフラグメントにBam HI分子リンカ
ーを結合させ、Eco RI制限酵素で消化した後、BamHI−E
co RI消化プラスミドpBR322と結合させることができ
る。こうして得たpIT122と呼称されるプラスミドは、ハ
イグロマイシンＢホスホトランスフエラーゼ遺伝子の一
部分のみを含有しており、出発物質として用いられる。
ハイグロマイシンＢホスホトランスフエラーゼの113〜3
41番目までのアミノ酸のための暗号情報は、プラスミド
pKC222の〜1.45kb Eco RIフラグメントを、適切に切り
開いたプラスミドpIT122にライゲート（結合することに
より得られる。こうして得られたpIT123と呼称されるプ
ラスミドは、最初の９個のヌクレオチド対がBamHIリン
カーで置換されていることを除いて、全てのハイグロマ
イシンＢホスホトランスフエラーゼ構造遺伝子を含むも
のである。即ち、この頭部切断遺伝子は、天然の遺伝子
によつて暗号化されている最初の３個のアミノ酸を欠く
ハイグロマイシンＢホスホトランスフエラーゼを暗号化
している。このプラスミドpIT123の制限サイト地図（制
限酵素切断地図）を添付の第１図に示す。
41番目までのアミノ酸のための暗号情報は、プラスミド
pKC222の〜1.45kb Eco RIフラグメントを、適切に切り
開いたプラスミドpIT122にライゲート（結合することに
より得られる。こうして得られたpIT123と呼称されるプ
ラスミドは、最初の９個のヌクレオチド対がBamHIリン
カーで置換されていることを除いて、全てのハイグロマ
イシンＢホスホトランスフエラーゼ構造遺伝子を含むも
のである。即ち、この頭部切断遺伝子は、天然の遺伝子
によつて暗号化されている最初の３個のアミノ酸を欠く
ハイグロマイシンＢホスホトランスフエラーゼを暗号化
している。このプラスミドpIT123の制限サイト地図（制
限酵素切断地図）を添付の第１図に示す。
本発明のDNAを調製するのに使用することができるプラ
スミドpKC222は、〜6.8kbであり、プラスミドpKC203〜
2.75kb Sal I−Bgl IIフラグメントを、プラスミドpKC7
の〜4.1kb Sal I−Bgl IIフラグメントにライゲートす
ることにより得ることができる。このプラスミドpKC203
は〜15kbであり、American Type Culture Collection、
Rockville、Marylandに寄託されており、その永久スト
ツク・カルチヤーコレクシヨンの一部となつている菌株
エシエリシア・コリ（E.coli）JR225から常法に従つて
単離することができる。この菌株は、寄託番号ATCC3191
2の下、プラスミドpKC203の好ましい供給源並びに保管
源として、誰もが利用できる。プラスミドpKC7は当業者
によく知られれており（ATCC37084）、これもまた、Rao
およびRogersの方法（1979、Gene7:79）に従つて組立て
ることができる。プラスミドpKC222およびpKC203の各々
の制限サイト地図を添付の第１図並びに第２図にそれぞ
れ示す。
スミドpKC222は、〜6.8kbであり、プラスミドpKC203〜
2.75kb Sal I−Bgl IIフラグメントを、プラスミドpKC7
の〜4.1kb Sal I−Bgl IIフラグメントにライゲートす
ることにより得ることができる。このプラスミドpKC203
は〜15kbであり、American Type Culture Collection、
Rockville、Marylandに寄託されており、その永久スト
ツク・カルチヤーコレクシヨンの一部となつている菌株
エシエリシア・コリ（E.coli）JR225から常法に従つて
単離することができる。この菌株は、寄託番号ATCC3191
2の下、プラスミドpKC203の好ましい供給源並びに保管
源として、誰もが利用できる。プラスミドpKC7は当業者
によく知られれており（ATCC37084）、これもまた、Rao
およびRogersの方法（1979、Gene7:79）に従つて組立て
ることができる。プラスミドpKC222およびpKC203の各々
の制限サイト地図を添付の第１図並びに第２図にそれぞ
れ示す。
本発明のDNAは、転写および翻訳活性素配列含有遺伝子
または遺伝子部分と翻訳読みとり相内で含有させること
により、優勢で選択可能なマーカーとして役立つ。この
遺伝子または遺伝子部分によつて暗号化されているアミ
ノ酸の数は、本発明の目的を達成するのに臨界的なもの
ではない。
または遺伝子部分と翻訳読みとり相内で含有させること
により、優勢で選択可能なマーカーとして役立つ。この
遺伝子または遺伝子部分によつて暗号化されているアミ
ノ酸の数は、本発明の目的を達成するのに臨界的なもの
ではない。
細菌性遺伝子の場合には、上記の様な融合は、プラスミ
ドpIT123の先端を欠くaph（４）遺伝子をプラスミドpUC
7にライゲートすることによつて行なわれる。プラスミ
ドpUC7は市販品から入手可能であり、VieiraおよびMess
ing（1982、Gene9:259の示した方法と実質的に同様にし
て組立てられるが、E.coli.のlac Z遺伝子の１部分およ
びそのlacオペレーターおよび翻訳開始信号の下流に単
一のBam HI制限部位を有している。このlac Z遺伝子フ
ラグメント内のBam HI部位における解読枠は、プラスミ
ドpIT123の先端切断aph（４）遺伝子に必要とされる解
読枠と同じである。従つて、プラスミドpIT123の〜1.3k
b Bam HI−Bgl IIフラグメントを、BamHI消化プラスミ
ドpUC7にライゲートしてこれら２個の遺伝子をBamHI部
位で連結すると、ハイグロマイシンＢ耐性を付与するこ
とができる雑種遺伝子が得られる。この例示組立て物
は、先端切断aph（４）遺伝子と融合したlac Zの最初の
12個のアミノ酸に関する暗号配列を含有している。こう
して得られた遺伝子含有プラスミド（pIT144と命名）の
制限サイト地図を添付の第２図に示す。平滑末端を有す
るHph I−消化プラスミドpIT104を、同じく平滑末端を
有するHinc II−消化プラスミドpUC8にライゲートする
ことにより、同様のプラスミド（pKC307と命名）を組立
てた。プラスミドpUC8はpUC7と類似しており、これもま
た市販されており、VieiraおよびMessing（1982）の方
法に従つて組立てられる。
ドpIT123の先端を欠くaph（４）遺伝子をプラスミドpUC
7にライゲートすることによつて行なわれる。プラスミ
ドpUC7は市販品から入手可能であり、VieiraおよびMess
ing（1982、Gene9:259の示した方法と実質的に同様にし
て組立てられるが、E.coli.のlac Z遺伝子の１部分およ
びそのlacオペレーターおよび翻訳開始信号の下流に単
一のBam HI制限部位を有している。このlac Z遺伝子フ
ラグメント内のBam HI部位における解読枠は、プラスミ
ドpIT123の先端切断aph（４）遺伝子に必要とされる解
読枠と同じである。従つて、プラスミドpIT123の〜1.3k
b Bam HI−Bgl IIフラグメントを、BamHI消化プラスミ
ドpUC7にライゲートしてこれら２個の遺伝子をBamHI部
位で連結すると、ハイグロマイシンＢ耐性を付与するこ
とができる雑種遺伝子が得られる。この例示組立て物
は、先端切断aph（４）遺伝子と融合したlac Zの最初の
12個のアミノ酸に関する暗号配列を含有している。こう
して得られた遺伝子含有プラスミド（pIT144と命名）の
制限サイト地図を添付の第２図に示す。平滑末端を有す
るHph I−消化プラスミドpIT104を、同じく平滑末端を
有するHinc II−消化プラスミドpUC8にライゲートする
ことにより、同様のプラスミド（pKC307と命名）を組立
てた。プラスミドpUC8はpUC7と類似しており、これもま
た市販されており、VieiraおよびMessing（1982）の方
法に従つて組立てられる。
本発明のDNAは真核性遺伝子または遺伝子部分、例えばI
ngoliaら（1982）、Mol.and Cellular Biol.2:1388）が
開示したイースト（酵母）・ヒート・ショック同族遺伝
子（YG101）と融合することもできる。YG101の転写およ
び翻訳活性素配列をプラスミドpIT118の750bp Bam HI−
Bal IIフラグメント上に移動させることができるので、
この融合は時に有用である。そのためには、まず前述の
転写および翻訳活性素配列含有フラグメントをBamHI制
限プラスミドpMC1587にライゲートした中間体プラスミ
ドpIT207を組立てる。次いでプラスミドpIT123の〜1.3k
b Bam HI−Bgl IIフラグメントをBamHI−消化プラスミ
ドpIT207にライゲートし、２機能性プラスミドpIT208を
得る。プラスミドpIT208はE.coli内で選択可能であり、
酵母に抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与
することができる。この様に、このプラスミドは本発明
の代表例である。このプラスミドpIT208の制限サイト地
図を添付の第３図に示す。
ngoliaら（1982）、Mol.and Cellular Biol.2:1388）が
開示したイースト（酵母）・ヒート・ショック同族遺伝
子（YG101）と融合することもできる。YG101の転写およ
び翻訳活性素配列をプラスミドpIT118の750bp Bam HI−
Bal IIフラグメント上に移動させることができるので、
この融合は時に有用である。そのためには、まず前述の
転写および翻訳活性素配列含有フラグメントをBamHI制
限プラスミドpMC1587にライゲートした中間体プラスミ
ドpIT207を組立てる。次いでプラスミドpIT123の〜1.3k
b Bam HI−Bgl IIフラグメントをBamHI−消化プラスミ
ドpIT207にライゲートし、２機能性プラスミドpIT208を
得る。プラスミドpIT208はE.coli内で選択可能であり、
酵母に抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与
することができる。この様に、このプラスミドは本発明
の代表例である。このプラスミドpIT208の制限サイト地
図を添付の第３図に示す。
同じくIngoliaらの開示（1982）したヒート・シヨツク
遺伝子（YG100）も、同様に有用な翻訳融合物の組立て
に用いることができる。これはプラスミドpIT120の、転
写および翻訳活性素配列含有〜1kb Bam HI−Bgl IIフラ
グメントを、Bam HI−消化プラスミドpIT213にライゲー
トすることによつて行われる。後者のプラスミドは、既
知のプラスミドpRB5、カナマイシン耐性遺伝子、および
前述したプラスミドpIT123の先端切断ハイグロマイシン
Ｂ耐性遺伝子含有〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグメント
を含有している。また、hs100の転写および翻訳活性素
配列を得ることができるプラスミドpIT120は、Northern
Regional Research Laboratory、Peoria、Illinoisに
寄託されその永久ストツクカルチヤー・コレクシヨンの
一部となつている菌株E.coli K12 JA221/pIT120から常
法通りに単離することができる。この菌株は、該プラス
ミドの好ましい供給源および保管源として寄託番号NRRL
Ｂ−15603の下に誰でも入手することができる。上記
の、pIT120とpIT213フラグメントとのライゲーシヨンに
よつて代表的プラスミドである２機能性プラスミドpIT2
17が得られる。このプラスミドpIT217はE.coli内で選択
可能であり、酵母にハイグロマイシンＢ耐性を付与する
ことができ、かくしてこれもまた本発明を例示するもの
である。
遺伝子（YG100）も、同様に有用な翻訳融合物の組立て
に用いることができる。これはプラスミドpIT120の、転
写および翻訳活性素配列含有〜1kb Bam HI−Bgl IIフラ
グメントを、Bam HI−消化プラスミドpIT213にライゲー
トすることによつて行われる。後者のプラスミドは、既
知のプラスミドpRB5、カナマイシン耐性遺伝子、および
前述したプラスミドpIT123の先端切断ハイグロマイシン
Ｂ耐性遺伝子含有〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグメント
を含有している。また、hs100の転写および翻訳活性素
配列を得ることができるプラスミドpIT120は、Northern
Regional Research Laboratory、Peoria、Illinoisに
寄託されその永久ストツクカルチヤー・コレクシヨンの
一部となつている菌株E.coli K12 JA221/pIT120から常
法通りに単離することができる。この菌株は、該プラス
ミドの好ましい供給源および保管源として寄託番号NRRL
Ｂ−15603の下に誰でも入手することができる。上記
の、pIT120とpIT213フラグメントとのライゲーシヨンに
よつて代表的プラスミドである２機能性プラスミドpIT2
17が得られる。このプラスミドpIT217はE.coli内で選択
可能であり、酵母にハイグロマイシンＢ耐性を付与する
ことができ、かくしてこれもまた本発明を例示するもの
である。
当業者ならば、前述のBam HI−消化プラスミドpIT213と
プラスミドpIT118の750bp Bam HI−Bgl IIフラグメント
のライゲーシヨンによつても、本発明の技術的範囲内に
ある代表的な融合物が得られるということが理解されよ
う。こうして得られたpIT215と呼称されるプラスミドは
E.coli内で選択可能であり、酵母にハイグロマイシンＢ
耐性を付与する。さらに様々な遺伝子を用いて組立てを
行うことができる。例えば、プラスミドpIT143の転写お
よび翻訳活性素配列−含有230bp Bam HIフラグメントを
Bam HI−消化プラスミドpIT213にライゲートすることに
より、真核性ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PG
K）と本発明の先端切断ハイグロマイシンＢ耐性付与DNA
とを融合することができる。PKG転写および翻訳活性素
配列の供給源であるプラスミドpIT143は、プラスミドpI
T141の958bp Cla I−Hinc IIフラグメントを制限酵素Mh
o IIで消化し、生じた延長部分をDNAポリメラーゼのク
レナウ（Klenow）フラグメントで切断し、配列:TGGATCC
Aを持つたBam HIリンカーを結合させ、次いで、このリ
ンガー含有フラグメントをBma HI−消化プラスミドpUC8
にライゲートすることによつて組立てられる。プラスミ
ドpIT143の組立てに用いられるこの全PGK遺伝子を持つ
たプラスミドpIT141は、Northern Regional Research L
aboratory、Peoria、Illinoisに寄託され、その永久ス
トツク・カルチヤー・コレクシヨンの一部となつている
菌株、E.coli K12 JA221/pIT141から常法通り、分離す
ることができる。この菌株は、該プラスミドの好ましい
供給源および保管源として、寄託番号NRRL Ｂ−15602
の下、誰でも利用することができる。
プラスミドpIT118の750bp Bam HI−Bgl IIフラグメント
のライゲーシヨンによつても、本発明の技術的範囲内に
ある代表的な融合物が得られるということが理解されよ
う。こうして得られたpIT215と呼称されるプラスミドは
E.coli内で選択可能であり、酵母にハイグロマイシンＢ
耐性を付与する。さらに様々な遺伝子を用いて組立てを
行うことができる。例えば、プラスミドpIT143の転写お
よび翻訳活性素配列−含有230bp Bam HIフラグメントを
Bam HI−消化プラスミドpIT213にライゲートすることに
より、真核性ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PG
K）と本発明の先端切断ハイグロマイシンＢ耐性付与DNA
とを融合することができる。PKG転写および翻訳活性素
配列の供給源であるプラスミドpIT143は、プラスミドpI
T141の958bp Cla I−Hinc IIフラグメントを制限酵素Mh
o IIで消化し、生じた延長部分をDNAポリメラーゼのク
レナウ（Klenow）フラグメントで切断し、配列:TGGATCC
Aを持つたBam HIリンカーを結合させ、次いで、このリ
ンガー含有フラグメントをBma HI−消化プラスミドpUC8
にライゲートすることによつて組立てられる。プラスミ
ドpIT143の組立てに用いられるこの全PGK遺伝子を持つ
たプラスミドpIT141は、Northern Regional Research L
aboratory、Peoria、Illinoisに寄託され、その永久ス
トツク・カルチヤー・コレクシヨンの一部となつている
菌株、E.coli K12 JA221/pIT141から常法通り、分離す
ることができる。この菌株は、該プラスミドの好ましい
供給源および保管源として、寄託番号NRRL Ｂ−15602
の下、誰でも利用することができる。
以上の各例で示した細菌性lac Z、並びに真菌性のPGK、
YG100およびYG101遺伝子を、広範な種類の遺伝子または
遺伝子部分と置き換えることができるということは、当
業者には理解されよう。その様な遺伝子または遺伝子部
分に暗号化されているアミノ酸の数は本発明の目的を達
成する上で重要な問題ではない。その他の遺伝子には、
以下の供給源から得られる遺伝子が含まれる:1）E.coli
から、例えばtrpE遺伝子およびリポタンパク遺伝子;2）
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）から、例えばα因子遺伝子;3）バチルス（Bacillu
s）から、例えばα−アミラーゼ遺伝子およびspoVG遺伝
子;4）ストレプトミセス（Streptomyces）から、例えば
チオストレプトン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子、およびバイオマイシン耐性遺伝子;5）ウイルスまた
はバクテリオフアージから、例えばλPLプロモーターお
よびλRRプロモーターによつて転写される遺伝子;6）哺
乳動物から、例えばチミジン・キナーゼ遺伝子およびジ
ヒドロフオレート・リダクターゼ遺伝子;7）植物から、
例えばオクトピン合成酵素遺伝子およびノパリン合成酵
素遺伝子。
YG100およびYG101遺伝子を、広範な種類の遺伝子または
遺伝子部分と置き換えることができるということは、当
業者には理解されよう。その様な遺伝子または遺伝子部
分に暗号化されているアミノ酸の数は本発明の目的を達
成する上で重要な問題ではない。その他の遺伝子には、
以下の供給源から得られる遺伝子が含まれる:1）E.coli
から、例えばtrpE遺伝子およびリポタンパク遺伝子;2）
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）から、例えばα因子遺伝子;3）バチルス（Bacillu
s）から、例えばα−アミラーゼ遺伝子およびspoVG遺伝
子;4）ストレプトミセス（Streptomyces）から、例えば
チオストレプトン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子、およびバイオマイシン耐性遺伝子;5）ウイルスまた
はバクテリオフアージから、例えばλPLプロモーターお
よびλRRプロモーターによつて転写される遺伝子;6）哺
乳動物から、例えばチミジン・キナーゼ遺伝子およびジ
ヒドロフオレート・リダクターゼ遺伝子;7）植物から、
例えばオクトピン合成酵素遺伝子およびノパリン合成酵
素遺伝子。
上記の遺伝子群は、適当な制限酵素および／またはBal3
1ヌクレアーゼで処理して先端を切断し、次いで、便利
さおよび所望する融合に応じて、分子リンカーを結合さ
せる。分子リンカーは市販品から入手できるが、特殊
な、または一般的でない遺伝子融合を希望する場合に
は、Itakuraら（1977）、およびCreaら（1978）の方法
に従つて組立てることができる。特に有用な融合産物
は、プラスミドpIT123の〜1.3kb先端切断aph（４）遺伝
子含有フラグメントを、プラスミドpIA7△４△１の〜4.
5kb Bam HI−Bgl II フラグメントにライゲートするこ
とによつて得られる。後者のフラグメントは、転写およ
び翻訳活性素配列、並びに細菌性trpLE′遺伝子の15個
のアミノ酸の暗号領域を含有している。上記のライゲー
シヨンにより、代表的な〜5.8kbプラスミドpIT125が得
られる。前述の、その他の先端切断遺伝子を、分子リン
カーを使用、または使用することなく、本発明の先端切
断abh（４）遺伝子と融合させると本発明の範囲に含ま
れる代表的なベクターが得られることは、当業者ならば
理解できるであろう。
1ヌクレアーゼで処理して先端を切断し、次いで、便利
さおよび所望する融合に応じて、分子リンカーを結合さ
せる。分子リンカーは市販品から入手できるが、特殊
な、または一般的でない遺伝子融合を希望する場合に
は、Itakuraら（1977）、およびCreaら（1978）の方法
に従つて組立てることができる。特に有用な融合産物
は、プラスミドpIT123の〜1.3kb先端切断aph（４）遺伝
子含有フラグメントを、プラスミドpIA7△４△１の〜4.
5kb Bam HI−Bgl II フラグメントにライゲートするこ
とによつて得られる。後者のフラグメントは、転写およ
び翻訳活性素配列、並びに細菌性trpLE′遺伝子の15個
のアミノ酸の暗号領域を含有している。上記のライゲー
シヨンにより、代表的な〜5.8kbプラスミドpIT125が得
られる。前述の、その他の先端切断遺伝子を、分子リン
カーを使用、または使用することなく、本発明の先端切
断abh（４）遺伝子と融合させると本発明の範囲に含ま
れる代表的なベクターが得られることは、当業者ならば
理解できるであろう。
本発明のDNAを含有するベクター類は以下の条件を満た
す限り、あらゆるハイグロマイシンＢ感受性宿主細胞に
使用することができる:1）該ベクターが宿主細胞内で複
製されるか、もしくは宿主細胞の染色体に組み込まれる
こと;2）先端切断aph（４）遺伝子と融合した遺伝子が
宿主細胞内で発現されること；および３）宿主細胞が形
質転換され得ること。代表的な、特に重要な宿主細胞に
は、例えば、エシエリシア・コリ（E.coli）、エシエリ
シア・コリ K12（E.coli K12）、エシエリシア・コリ K
12 JA221（E.coli K12 JA221）、エシエリシア・コリ K
12 HB101（E.coli K12 HB101）、エシエリシア・コリ K
12 RR1（E.COli K12 RR1）、ストレプトミセス（Strept
omyces）、ストレプトミセス・アムボファシエンス（St
rpeptomyces ambofaciens）、バチルス（Bacillus）、
バチルス・サブチリス（Bacillussubtilis）、サッカロ
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、哺
乳類の細胞および植物細胞、特にAngiospermous細胞が
含まれる。さらに、本発明のDNAを含むベクター類で形
質転換されたその他の宿主細胞もまた本発明に包含され
ることは、当業者ならば容易に理解し得るであろう。
す限り、あらゆるハイグロマイシンＢ感受性宿主細胞に
使用することができる:1）該ベクターが宿主細胞内で複
製されるか、もしくは宿主細胞の染色体に組み込まれる
こと;2）先端切断aph（４）遺伝子と融合した遺伝子が
宿主細胞内で発現されること；および３）宿主細胞が形
質転換され得ること。代表的な、特に重要な宿主細胞に
は、例えば、エシエリシア・コリ（E.coli）、エシエリ
シア・コリ K12（E.coli K12）、エシエリシア・コリ K
12 JA221（E.coli K12 JA221）、エシエリシア・コリ K
12 HB101（E.coli K12 HB101）、エシエリシア・コリ K
12 RR1（E.COli K12 RR1）、ストレプトミセス（Strept
omyces）、ストレプトミセス・アムボファシエンス（St
rpeptomyces ambofaciens）、バチルス（Bacillus）、
バチルス・サブチリス（Bacillussubtilis）、サッカロ
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、哺
乳類の細胞および植物細胞、特にAngiospermous細胞が
含まれる。さらに、本発明のDNAを含むベクター類で形
質転換されたその他の宿主細胞もまた本発明に包含され
ることは、当業者ならば容易に理解し得るであろう。
本発明においては、あらゆる態様が有用であるが、その
内いくつかのDNA配列、クローニングベクター、および
形質転換体が特に好ましい。すなわち、好ましいDNA配
列はプラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグ
メントであつて、式： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニジ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示されるものであり、好ましいプラスミドは、プラス
ミドpIT123、pIT125、pKC307、pIT208、pIT215、pIT21
7、pIT219、およびpIT144であり、好ましい形質転換体
は、E.COli K12 JA221/pIT123、E.coli K12 12 JA221/p
IT125、E.coli K12 JA221/pKC307、E.coli K12 JA221/p
IT208、E.coli 12 JA221/pIT215、E.coli K12JA221/pIT
217、E.coli K12 JA221/pIT219、E.coli K12 JA221/pIT
144およびSaccharomyces cerevisiae/pIT208、Saccharo
myces cerevisiae/pIT215、Saccharomyces cerevisiae/
pIT217およびSaccharomyces cerevisiae/pIT219であ
る。
内いくつかのDNA配列、クローニングベクター、および
形質転換体が特に好ましい。すなわち、好ましいDNA配
列はプラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグ
メントであつて、式： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニジ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示されるものであり、好ましいプラスミドは、プラス
ミドpIT123、pIT125、pKC307、pIT208、pIT215、pIT21
7、pIT219、およびpIT144であり、好ましい形質転換体
は、E.COli K12 JA221/pIT123、E.coli K12 12 JA221/p
IT125、E.coli K12 JA221/pKC307、E.coli K12 JA221/p
IT208、E.coli 12 JA221/pIT215、E.coli K12JA221/pIT
217、E.coli K12 JA221/pIT219、E.coli K12 JA221/pIT
144およびSaccharomyces cerevisiae/pIT208、Saccharo
myces cerevisiae/pIT215、Saccharomyces cerevisiae/
pIT217およびSaccharomyces cerevisiae/pIT219であ
る。
本発明のDNAは、ホモローガス（E.coli）な系、並びに
ヘテロローガス（非E.coli）な系のいずれにおいても選
択マーカーとして有用であり、従つて、これにより種々
の異なる性質の宿主細胞に遺伝子をクローンするための
選択可能なビヒクル（vehicle）を組立てることができ
る。本発明に係るDNAの、抗生物質ハイグロマイシンＢ
耐性を付与し得る能力は、形質転換体を選択するための
機能テストに役立つ。このことは、ベクターDNAを獲得
した特定の細胞を決定し、選択するという実用上の必要
性から、重要な点である。その存在に関する機能試験法
のない他のDNAセグメントをベクターに挿入し、この非
選択性のDNAを含有する形質転換体を抗生物質ハイグロ
マイシンＢ選別法に従つて分離することができる。その
様な非選択的なDNAセグメントには、以下の物質を指定
している遺伝子が含まれる：ヒトインシユリンＡ鎖、ヒ
トインシユリンＢ鎖、ヒトプロインシユリン、ヒトプレ
プロインシユリン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモ
ン、ブタ成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒトインタ
ーフエロン並びに非−ヒトインターフエロン（ただしこ
れらに限定されるものではない）。
ヘテロローガス（非E.coli）な系のいずれにおいても選
択マーカーとして有用であり、従つて、これにより種々
の異なる性質の宿主細胞に遺伝子をクローンするための
選択可能なビヒクル（vehicle）を組立てることができ
る。本発明に係るDNAの、抗生物質ハイグロマイシンＢ
耐性を付与し得る能力は、形質転換体を選択するための
機能テストに役立つ。このことは、ベクターDNAを獲得
した特定の細胞を決定し、選択するという実用上の必要
性から、重要な点である。その存在に関する機能試験法
のない他のDNAセグメントをベクターに挿入し、この非
選択性のDNAを含有する形質転換体を抗生物質ハイグロ
マイシンＢ選別法に従つて分離することができる。その
様な非選択的なDNAセグメントには、以下の物質を指定
している遺伝子が含まれる：ヒトインシユリンＡ鎖、ヒ
トインシユリンＢ鎖、ヒトプロインシユリン、ヒトプレ
プロインシユリン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモ
ン、ブタ成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒトインタ
ーフエロン並びに非−ヒトインターフエロン（ただしこ
れらに限定されるものではない）。
より詳しくは、ある遺伝子を含む選択不可能なDNAセグ
メントをプラスミド、例えば代表的なプラスミドである
pIT144またはpIT208に挿入する。選択不可能なDANは、p
IT144をSal Iで部分消化した後、該pIT144のEcoR I部位
に挿入するか、あるいはpIT208のSma I部位に挿入する
ことができる。所望の形質転換体の同定は、ライゲーシ
ヨン混合物によつて形質転換された細胞を、ニツク翻訳
プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーシヨンによ
つて行なう。選択不可能なDNAの存在を確認した後、該
ベクターをE.coli内でさらに増幅させ、次いで、例えば
プラスミドpIT208の場合には、酵母に導入する。酵母形
質転換体は、抗生物質ハイグロマイシンＢの選択によつ
て容易に同定することができる。従つて、この抗生物質
耐性に基づく選択能により興味の対象である特定の選択
不可能なDNAを含有する極めて稀有な細胞を効果的に単
離することができる。
メントをプラスミド、例えば代表的なプラスミドである
pIT144またはpIT208に挿入する。選択不可能なDANは、p
IT144をSal Iで部分消化した後、該pIT144のEcoR I部位
に挿入するか、あるいはpIT208のSma I部位に挿入する
ことができる。所望の形質転換体の同定は、ライゲーシ
ヨン混合物によつて形質転換された細胞を、ニツク翻訳
プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーシヨンによ
つて行なう。選択不可能なDNAの存在を確認した後、該
ベクターをE.coli内でさらに増幅させ、次いで、例えば
プラスミドpIT208の場合には、酵母に導入する。酵母形
質転換体は、抗生物質ハイグロマイシンＢの選択によつ
て容易に同定することができる。従つて、この抗生物質
耐性に基づく選択能により興味の対象である特定の選択
不可能なDNAを含有する極めて稀有な細胞を効果的に単
離することができる。
上記のハイグロマイシンＢ耐性についての機能試験は、
遺伝子の発現を指令するためのコントロール要素として
作用し得るDNAセグメントの同定にも利用することがで
きる。その様なセグメント類は、プロモーター、アテニ
ユエイター、リプレツサー、インデユーサー、リボソー
ム結合部位などを含み（ただしこれらに限定されな
い）、経済的に重要性のある遺伝子の発現をコントロー
ルするのに使用される。加えて、本発明は、複製起源の
単離並びに同定にも有用である。この利用方法は、DNA
フラグメントを本発明のaph（４）遺伝子融合物を含有
するベクターにクローニングし、次いでハイグロマイシ
ンＢを選別しうる条件下で、適当な宿主細胞に形質転換
することによつて実施される。ハイグロマイシンＢ耐性
細胞を選択することができ、かくして、E.coliの形質転
換に用いたこのDNAは、事実上懸案のどの様な微生物の
中からも、レプリコンを容易に単離せしめるのに役立
つ。
遺伝子の発現を指令するためのコントロール要素として
作用し得るDNAセグメントの同定にも利用することがで
きる。その様なセグメント類は、プロモーター、アテニ
ユエイター、リプレツサー、インデユーサー、リボソー
ム結合部位などを含み（ただしこれらに限定されな
い）、経済的に重要性のある遺伝子の発現をコントロー
ルするのに使用される。加えて、本発明は、複製起源の
単離並びに同定にも有用である。この利用方法は、DNA
フラグメントを本発明のaph（４）遺伝子融合物を含有
するベクターにクローニングし、次いでハイグロマイシ
ンＢを選別しうる条件下で、適当な宿主細胞に形質転換
することによつて実施される。ハイグロマイシンＢ耐性
細胞を選択することができ、かくして、E.coliの形質転
換に用いたこのDNAは、事実上懸案のどの様な微生物の
中からも、レプリコンを容易に単離せしめるのに役立
つ。
本発明の耐性付与ベクターは、結合したDNAフラグメン
トがE.coli、イースト、その他の形質転換体中に安定に
保持されていることを保証するのにも有用である。本発
明のabh（４）遺伝子融合物に共有結合によつて結合し
たこれらの遺伝子またはDNAフラグメントは、その形質
転換体を、形質転換されていない細胞にとつては毒性を
示す様な濃度のハイグロマイシンＢにさらすことによつ
て保持される。それ故、このベクターを欠く形質転換
体、従つて共有結合で結合しているこのDNAを失なつた
ものは増殖できず、培地から消失してしまう。このこと
は、最大現の生産発現効率が望まれる大規模発酵の場合
に、特に重要である。
トがE.coli、イースト、その他の形質転換体中に安定に
保持されていることを保証するのにも有用である。本発
明のabh（４）遺伝子融合物に共有結合によつて結合し
たこれらの遺伝子またはDNAフラグメントは、その形質
転換体を、形質転換されていない細胞にとつては毒性を
示す様な濃度のハイグロマイシンＢにさらすことによつ
て保持される。それ故、このベクターを欠く形質転換
体、従つて共有結合で結合しているこのDNAを失なつた
ものは増殖できず、培地から消失してしまう。このこと
は、最大現の生産発現効率が望まれる大規模発酵の場合
に、特に重要である。
発明の作用効果 本発明のDNA、クローニングベクター、並びに形質転換
体は、例えば、ヒトインシユリンＡ鎖、ヒトインシユリ
ンＢ鎖、ヒトプロインシユリン、ヒトプレプロインシユ
リン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホルモン、ヒトお
よび非ヒトインターフエロンなど；商業的に重要な行程
または化合物を生ぜしめるような代謝経路における酵素
様機能物質；遺伝子の発現またはベクター類の複製を改
良するコントロール要素；あるいは、学問上のまたは商
業上の価値ある、生理的に活性な酵素類、などの、特定
の機能を有するポリペプチドまたは遺伝子融合物を直接
または間接的に暗号化している遺伝子をクローニングす
るのに、特に有用である。酵素様機能物質を暗号化して
いるDNA配列の例として、セフアロスポリン系抗生物
質、アクタプラニン、ペニシリン、ペニシリン誘導体お
よびチロシンの合成において触媒作用を示す酵素類の暗
号配列などが含まれる（ただしこれらに限定されるもの
ではない）。当業者ならば、本発明は広範囲に適用し得
るものであり、上で明示した特定の遺伝子のクローニン
グに限定されるものでないということを容易に理解する
であろう。以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明する。本発明の解説並びにその組立て方法は、そ
れぞれ適当な箇所に記述されている。
体は、例えば、ヒトインシユリンＡ鎖、ヒトインシユリ
ンＢ鎖、ヒトプロインシユリン、ヒトプレプロインシユ
リン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホルモン、ヒトお
よび非ヒトインターフエロンなど；商業的に重要な行程
または化合物を生ぜしめるような代謝経路における酵素
様機能物質；遺伝子の発現またはベクター類の複製を改
良するコントロール要素；あるいは、学問上のまたは商
業上の価値ある、生理的に活性な酵素類、などの、特定
の機能を有するポリペプチドまたは遺伝子融合物を直接
または間接的に暗号化している遺伝子をクローニングす
るのに、特に有用である。酵素様機能物質を暗号化して
いるDNA配列の例として、セフアロスポリン系抗生物
質、アクタプラニン、ペニシリン、ペニシリン誘導体お
よびチロシンの合成において触媒作用を示す酵素類の暗
号配列などが含まれる（ただしこれらに限定されるもの
ではない）。当業者ならば、本発明は広範囲に適用し得
るものであり、上で明示した特定の遺伝子のクローニン
グに限定されるものでないということを容易に理解する
であろう。以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明する。本発明の解説並びにその組立て方法は、そ
れぞれ適当な箇所に記述されている。
実施例１ プラスミドpKC222出発物質の組立て A. プラスミドpKC203の単離、並びにE.coli K12 BE827
/pKC203の組立て バクテリアのE.coli JR225（ATCC No.31912）を、100μ
g/mlの抗生物質ハイグロマイシンＢを含んだTYブロス
（１％トリプトン、.5％酵母エキス、.5％塩化ナトリウ
ム、pH7）中、通常の微生物学的手法に従つて培養し
た。18時間インキユベートした後、培養物約.5mlを1.5m
lのエツペンドルフチユーブに移し、約15秒間遠心し
た。特に明記しない限り、全ての操作は周囲温度で行な
つた。生成した上澄液を先端の細いアスピレーターを用
いて注意深く取り除き、細胞ペレツトを、2mg/mlのリゾ
チーム、50mMグルコース、10mM CDTA（シクロヘキサン
ジアミンテトラアセテート）および25mMトリス塩酸（pH
8.0）を含有する調製したばかりのリゾチーム溶液約100
μに懸濁した。０℃で約30分間インキユベートした
後、アルカリ性SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液（.
2N NaOH、１％SDS）約200μを加え、チユーブをゆつ
くり回転させ、15分間０℃に保つた。次いで、酢酸ナト
リウム３モルを最少量の水に溶かし、氷酢酸でpH4.8に
調節し、容量を１に調節することにより調製した3M酢
酸ナトリウム150mlを加え、次いでチユーブの内容物
を、該チユーブを数秒間静かに転倒させることにより混
合した。この間にDNAの固まりが形成した。
/pKC203の組立て バクテリアのE.coli JR225（ATCC No.31912）を、100μ
g/mlの抗生物質ハイグロマイシンＢを含んだTYブロス
（１％トリプトン、.5％酵母エキス、.5％塩化ナトリウ
ム、pH7）中、通常の微生物学的手法に従つて培養し
た。18時間インキユベートした後、培養物約.5mlを1.5m
lのエツペンドルフチユーブに移し、約15秒間遠心し
た。特に明記しない限り、全ての操作は周囲温度で行な
つた。生成した上澄液を先端の細いアスピレーターを用
いて注意深く取り除き、細胞ペレツトを、2mg/mlのリゾ
チーム、50mMグルコース、10mM CDTA（シクロヘキサン
ジアミンテトラアセテート）および25mMトリス塩酸（pH
8.0）を含有する調製したばかりのリゾチーム溶液約100
μに懸濁した。０℃で約30分間インキユベートした
後、アルカリ性SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液（.
2N NaOH、１％SDS）約200μを加え、チユーブをゆつ
くり回転させ、15分間０℃に保つた。次いで、酢酸ナト
リウム３モルを最少量の水に溶かし、氷酢酸でpH4.8に
調節し、容量を１に調節することにより調製した3M酢
酸ナトリウム150mlを加え、次いでチユーブの内容物
を、該チユーブを数秒間静かに転倒させることにより混
合した。この間にDNAの固まりが形成した。
チユーブを60分間０℃に保ち、５分間遠心するとほとん
ど澄明な上澄液が得られた。この上澄液約.4mlを第２の
遠心管に移し、それに冷エタノール1mlを加えた。遠心
管を30分間、−20℃に保つた後、生成した沈殿を遠心分
離して（２分間）集め、上澄液をアスピレーターで除去
した。この様にして集めたペレツトを、.1M酢酸ナトリ
ウム/.05Mトリス塩酸（pH8）100μに溶かし、２倍量
の冷エタノールを加えて再沈殿させた。20℃で10分間保
つた後、生じた沈殿を遠心して集めたところ、上記の、
所望のE.coli JR225プラスミドDNAが得られた。
ど澄明な上澄液が得られた。この上澄液約.4mlを第２の
遠心管に移し、それに冷エタノール1mlを加えた。遠心
管を30分間、−20℃に保つた後、生成した沈殿を遠心分
離して（２分間）集め、上澄液をアスピレーターで除去
した。この様にして集めたペレツトを、.1M酢酸ナトリ
ウム/.05Mトリス塩酸（pH8）100μに溶かし、２倍量
の冷エタノールを加えて再沈殿させた。20℃で10分間保
つた後、生じた沈殿を遠心して集めたところ、上記の、
所望のE.coli JR225プラスミドDNAが得られた。
このE.coli JR225プラスミドDNAペレツトを水または希
釈した緩衝液約40μに溶かし、次いで、これをWensin
k（1974、Cell 3:315）の形質転換法と実質的に同様に
して、E.coli K12BE827の形質転換に用いた。E.coli K1
2 BE827はAmerican Type Culture Collection、Rockvil
le、Marylandに寄託されてその永久ストツクカルチヤー
コレクシヨンの一部となつており、寄託番号ATCC31911
の下で誰でも利用できる。得られた形質転換体を、抗生
物質ハイグロマイシンB200μg/mlを含有しているTY寒天
（１％トリプトン、.5％酵母エキス、.5％の塩化ナトリ
ウム、1.5％の寒天、pH7.4）上で選別した。形質転換体
のうちあるものは、ゲル電気泳動分析法（RaoおよびRog
ers、1978、Gene 3:247）やその他のテストの結果、大
きいプラスミドと小さいプラスミド（〜15kb）の両方を
持ち、抗生物質のアンピシリンおよびハイグロマイシン
Ｂの両方に耐性を有していることがわかつた。その他の
形質転換体は、小さい〜15kbプラスミドのみを持ち、抗
生物質ハイグロマイシンＢとG418には耐性を有するがア
ンピシリンには感受性を示すことがわかつた。後者の型
の形質転換体を抗生物質ハイグロマイシンB0.1mg/mlを
含有するTY寒天平板上にのばし、微生物学上の標準的手
法に従つて培養した。得られた細胞を、以後プラスミド
pKC203と命名した、上記の〜15kbハイグロマイシンＢお
よびG414耐性−付与プラスミドの単離に用いた。プラス
ミドpKC203上に抗生物質ハイグロマイシンＢおよびG418
耐性遺伝子が存在していることは、形質転換法、および
選択分析法によつて確認した。
釈した緩衝液約40μに溶かし、次いで、これをWensin
k（1974、Cell 3:315）の形質転換法と実質的に同様に
して、E.coli K12BE827の形質転換に用いた。E.coli K1
2 BE827はAmerican Type Culture Collection、Rockvil
le、Marylandに寄託されてその永久ストツクカルチヤー
コレクシヨンの一部となつており、寄託番号ATCC31911
の下で誰でも利用できる。得られた形質転換体を、抗生
物質ハイグロマイシンB200μg/mlを含有しているTY寒天
（１％トリプトン、.5％酵母エキス、.5％の塩化ナトリ
ウム、1.5％の寒天、pH7.4）上で選別した。形質転換体
のうちあるものは、ゲル電気泳動分析法（RaoおよびRog
ers、1978、Gene 3:247）やその他のテストの結果、大
きいプラスミドと小さいプラスミド（〜15kb）の両方を
持ち、抗生物質のアンピシリンおよびハイグロマイシン
Ｂの両方に耐性を有していることがわかつた。その他の
形質転換体は、小さい〜15kbプラスミドのみを持ち、抗
生物質ハイグロマイシンＢとG418には耐性を有するがア
ンピシリンには感受性を示すことがわかつた。後者の型
の形質転換体を抗生物質ハイグロマイシンB0.1mg/mlを
含有するTY寒天平板上にのばし、微生物学上の標準的手
法に従つて培養した。得られた細胞を、以後プラスミド
pKC203と命名した、上記の〜15kbハイグロマイシンＢお
よびG414耐性−付与プラスミドの単離に用いた。プラス
ミドpKC203上に抗生物質ハイグロマイシンＢおよびG418
耐性遺伝子が存在していることは、形質転換法、および
選択分析法によつて確認した。
B. プラスミドpKC222および形質転換体E.coli K12 JA2
21/pKC222の組立て １） 〜2.75kb Sal I/Bgl IIフラグメントプラスミドp
KC203の単離 約５μｇのプラスミドpKC203DNAを、供給者の明記した
指示に従い、同じく明記されている条件の下でSal Iお
よびBgl II制限酵素で処理した。有用な制限酵素による
消化法は、Maniatisら（1982、Molecular Cloning、Col
d Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、Ne
w York）によつて開示されている。抗生物質ハイグロマ
イシンＢおよびG418に対する耐性遺伝子、およびコント
ロール要素を含有する〜2.75kbフラグメントを常法に従
つて回収した（Maniatisら、1982）。
21/pKC222の組立て １） 〜2.75kb Sal I/Bgl IIフラグメントプラスミドp
KC203の単離 約５μｇのプラスミドpKC203DNAを、供給者の明記した
指示に従い、同じく明記されている条件の下でSal Iお
よびBgl II制限酵素で処理した。有用な制限酵素による
消化法は、Maniatisら（1982、Molecular Cloning、Col
d Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、Ne
w York）によつて開示されている。抗生物質ハイグロマ
イシンＢおよびG418に対する耐性遺伝子、およびコント
ロール要素を含有する〜2.75kbフラグメントを常法に従
つて回収した（Maniatisら、1982）。
＊特に明記しない限り、制限酵素類、T4DNAリガーゼ、D
NAポリメラーゼおよびクレナウフラグメント（それらの
使用方法を含めて）は、次の供給者から入手できる。
NAポリメラーゼおよびクレナウフラグメント（それらの
使用方法を含めて）は、次の供給者から入手できる。
New England Biolabs.32 Tozer Road Beverly、MA01915 ２） ライゲーシヨンおよび最終的な組立て RaOおよびRogers（1979、Gene 7:79）の教示に従つて組
立てられるプラスミドpKC7（ATCC37084）約５μｇを、S
al IおよびBgl II制限酵素で処理した。70℃で５分間加
熱して酵素を不活化した後、このDNA約１μｇをpKC203
の〜2.75kb Sal I/Bgl IIフラグメントと1:1の比率で混
合した。これらのフラグメントを、実施例1B−１に記載
した如く供給者の教示した方法および規定条件の下でT4
DNAリガーゼを用いて連結した。制限酵素による消化並
びにライゲーシヨンの両者に関する有用な方法がManiat
isら（1982）によつても開示されている。得られたプラ
スミドpKC222により、実施例1Aと実質的に同様にしてE.
coli K12 JA221（NRRL B−15211）を形質転換した。得
られた形質転換体を、抗生物質アンピシリン50μg/mlを
含んだTY寒天（１％トリプトン、.5％酵母エキス、.5％
NaCl、1.5％寒天）上で選択した。次いで、形質転換体
を所望のプラスミドに関してスクリーニングした。
立てられるプラスミドpKC7（ATCC37084）約５μｇを、S
al IおよびBgl II制限酵素で処理した。70℃で５分間加
熱して酵素を不活化した後、このDNA約１μｇをpKC203
の〜2.75kb Sal I/Bgl IIフラグメントと1:1の比率で混
合した。これらのフラグメントを、実施例1B−１に記載
した如く供給者の教示した方法および規定条件の下でT4
DNAリガーゼを用いて連結した。制限酵素による消化並
びにライゲーシヨンの両者に関する有用な方法がManiat
isら（1982）によつても開示されている。得られたプラ
スミドpKC222により、実施例1Aと実質的に同様にしてE.
coli K12 JA221（NRRL B−15211）を形質転換した。得
られた形質転換体を、抗生物質アンピシリン50μg/mlを
含んだTY寒天（１％トリプトン、.5％酵母エキス、.5％
NaCl、1.5％寒天）上で選択した。次いで、形質転換体
を所望のプラスミドに関してスクリーニングした。
３） プラスミドpKC222の単離 純化（精製）形質転換体を、50μg/mlの抗生物質アンピ
シリンを含むTYブロス（１％トリプトン、.5％酵母エキ
ス、.5％の塩化ナトリウム、pH7.4）中、通常の微生物
学的手法に従つて培養した。18時間インキユベートした
後、約.5mlの培養物を1.5mlのエツペンドルフチユーブ
に移し約15秒間遠心した。特に明記しない限り、全ての
操作は周囲温度で行なつた。生成した上澄液を先端の細
いアスピレーターを用いて注意深く除き、細胞ペレツト
を、2mg/mlのリゾチーム、50mMのグリコース、10mMのCD
TA（シクロヘキサンジアミンテトラアセテート）および
25mMのトリス塩酸（pH8）を含有する調製したばかりの
リゾチーム溶液約100μに懸濁した。０℃で30分間イ
ンキユベートした後、アルカリ性SDS（ドデシル硫酸ナ
トリウム）溶液（.2N NaOH、１％SDS）約200μを加
え、チユーブをゆつくり回転させ、15分間０℃に保つ
た。次いで、酢酸ナトリウム３モルを最少量の水に溶か
し、氷酢酸でpH4.8に調節し、容量を１に調節するこ
とにより調製した3M酢酸ナトリウム約150μを加え、
チユーブの内容物を数秒間転倒させることにより混合し
た。するとDNAのかたまりが生成した。次いでこの混合
物を０℃で60時間保つた後、５分間遠心すると、殆んど
澄明な上澄み液を得た。この上澄み約.4mlを第２の遠心
管に移し、それに冷エタノール1mlを加えた。遠心管を3
0分間−20℃に保つた後、得られた沈殿を遠心分離（２
分間）して集め、上澄液をアスピレーターで除去した。
この様にして集めたペレツトを、.1M酢酸ナトリウム/.0
5Mトリス塩酸（pH8）100μに溶かし、２倍量の冷エタ
ノールを加えて再沈殿させた。10分間、−20℃に放置し
た後、上記の如く沈殿を遠心して集めたところ、これは
アガロースゲル電気泳動分析（RaoおよびRogers、197
8）によつて所望のpKC222DNAであることがわかつた。
シリンを含むTYブロス（１％トリプトン、.5％酵母エキ
ス、.5％の塩化ナトリウム、pH7.4）中、通常の微生物
学的手法に従つて培養した。18時間インキユベートした
後、約.5mlの培養物を1.5mlのエツペンドルフチユーブ
に移し約15秒間遠心した。特に明記しない限り、全ての
操作は周囲温度で行なつた。生成した上澄液を先端の細
いアスピレーターを用いて注意深く除き、細胞ペレツト
を、2mg/mlのリゾチーム、50mMのグリコース、10mMのCD
TA（シクロヘキサンジアミンテトラアセテート）および
25mMのトリス塩酸（pH8）を含有する調製したばかりの
リゾチーム溶液約100μに懸濁した。０℃で30分間イ
ンキユベートした後、アルカリ性SDS（ドデシル硫酸ナ
トリウム）溶液（.2N NaOH、１％SDS）約200μを加
え、チユーブをゆつくり回転させ、15分間０℃に保つ
た。次いで、酢酸ナトリウム３モルを最少量の水に溶か
し、氷酢酸でpH4.8に調節し、容量を１に調節するこ
とにより調製した3M酢酸ナトリウム約150μを加え、
チユーブの内容物を数秒間転倒させることにより混合し
た。するとDNAのかたまりが生成した。次いでこの混合
物を０℃で60時間保つた後、５分間遠心すると、殆んど
澄明な上澄み液を得た。この上澄み約.4mlを第２の遠心
管に移し、それに冷エタノール1mlを加えた。遠心管を3
0分間−20℃に保つた後、得られた沈殿を遠心分離（２
分間）して集め、上澄液をアスピレーターで除去した。
この様にして集めたペレツトを、.1M酢酸ナトリウム/.0
5Mトリス塩酸（pH8）100μに溶かし、２倍量の冷エタ
ノールを加えて再沈殿させた。10分間、−20℃に放置し
た後、上記の如く沈殿を遠心して集めたところ、これは
アガロースゲル電気泳動分析（RaoおよびRogers、197
8）によつて所望のpKC222DNAであることがわかつた。
実施例２ プラスミドpIT123およびE.coli K12 JA221/p
IT123の組立て A. プラスミドpKC222のHph I−Pst Iフラグメントの単
離 プラスミドpKC222DNA約50μｇを１×Hph I塩類（6mM Kc
l、10mMトリス塩酸、pH7.4、10mM MgCl2、1mMジチオト
レイツト）中に入れ、全量100μとし、20New England
Biolab単位のHph I制限エンドヌクレアーゼで消化し
た。完全に消化されたことを、アガロース上に反応混合
物（２％）を置き電気泳動分析にかけて調べた。適量の
5M NaClを加えてNaCl濃度を60mMに調節した後、Pst I制
限エンドヌクレアーゼ約20単位を加えた。この場合もア
ガロースゲル電気泳動分析によつて消化の完了を監視し
た。所望の325bp（プラス１本鎖延長部分）Hph I−Pst
Iフラグメントを常法（SchliefおよびWensink、1981、P
ractical Methods in Molecular Biology、Springer−V
erlag、NY）に従つてアクリルアミドから精製した。
IT123の組立て A. プラスミドpKC222のHph I−Pst Iフラグメントの単
離 プラスミドpKC222DNA約50μｇを１×Hph I塩類（6mM Kc
l、10mMトリス塩酸、pH7.4、10mM MgCl2、1mMジチオト
レイツト）中に入れ、全量100μとし、20New England
Biolab単位のHph I制限エンドヌクレアーゼで消化し
た。完全に消化されたことを、アガロース上に反応混合
物（２％）を置き電気泳動分析にかけて調べた。適量の
5M NaClを加えてNaCl濃度を60mMに調節した後、Pst I制
限エンドヌクレアーゼ約20単位を加えた。この場合もア
ガロースゲル電気泳動分析によつて消化の完了を監視し
た。所望の325bp（プラス１本鎖延長部分）Hph I−Pst
Iフラグメントを常法（SchliefおよびWensink、1981、P
ractical Methods in Molecular Biology、Springer−V
erlag、NY）に従つてアクリルアミドから精製した。
純化325bpフラグメントをE.coli DNAポリメラーゼＩラ
ージフラグメント（New England Biolabs）で処理し
た。すなわち、約1.5μ（１μｇ）のフラグメント.5
μの10×緩衝液（.5Mトリス、pH7.5、.1M MgCl2）、
各々.5μの200mM dCTP、dATP、TTPおよびdGTP、並び
に１μ（１単位含有）のDNAポリメラーゼＩラージ
（クレナウ）フラグメントを37℃で15分間、インキユベ
ートした。ポリメラーゼを熱不活化処理した後、Robert
sとLauer（1979、Methods in Enzymology68:473）の方
法と実質的に同様にしてBam HIリンカー含有DNAを加え
た。得られたBamHIリンカー含有DNAを１×Bam HI塩（.1
5M NaCl、6mMトリス塩酸、pH7.9、6mM MgCl2）中、BamH
I制限酵素で常法通り消化した。次いで、最適の2Mトリ
ス塩酸、pH7.4を加えてトリス塩酸の濃度を100mMに高め
た後、DNAをさらにEco RI制限酵素で消化した。得られ
た消化DNAを７％アクリルアミドゲルにのせて電気泳動
し、所望の250bpフラグメントを前記と同様にして精製
した。
ージフラグメント（New England Biolabs）で処理し
た。すなわち、約1.5μ（１μｇ）のフラグメント.5
μの10×緩衝液（.5Mトリス、pH7.5、.1M MgCl2）、
各々.5μの200mM dCTP、dATP、TTPおよびdGTP、並び
に１μ（１単位含有）のDNAポリメラーゼＩラージ
（クレナウ）フラグメントを37℃で15分間、インキユベ
ートした。ポリメラーゼを熱不活化処理した後、Robert
sとLauer（1979、Methods in Enzymology68:473）の方
法と実質的に同様にしてBam HIリンカー含有DNAを加え
た。得られたBamHIリンカー含有DNAを１×Bam HI塩（.1
5M NaCl、6mMトリス塩酸、pH7.9、6mM MgCl2）中、BamH
I制限酵素で常法通り消化した。次いで、最適の2Mトリ
ス塩酸、pH7.4を加えてトリス塩酸の濃度を100mMに高め
た後、DNAをさらにEco RI制限酵素で消化した。得られ
た消化DNAを７％アクリルアミドゲルにのせて電気泳動
し、所望の250bpフラグメントを前記と同様にして精製
した。
B. プラスミドpIT122とE.coli K12 JA221/pIT122の組
立て pBR322DNA約20μｇを、実施例2Aに記載した方法と実質
上同様にしてBam HIおよびEcoR I制限酵素で順次消化し
た。70℃で５分間加熱して酵素を不活化した後、pBR322
DNA約１μ（１μｇ）を、純化250bpフラグメント約１
μ（１μｇ）、水37μ、ATP（10mM）５μ、ライ
ゲーシヨンミツクス（.5Mトリス塩酸、pH7.8、.1Mジチ
オトレイツト、.1M MgCl2）５μ、およびT4DNAリガー
ゼ１μ（約100,000New England Biolabs単位）と混合
した。この混合物を15℃で約２時間インキユベートした
後、70℃で５分間インキユベートすることにより反応を
終結させた。氷上で冷却した後、このライゲートして得
た混合物を、Wensink（1974）の形質転換法に実質上従
つて、アンピシリン200μg/mlを含んだTYプレート上で
E.coli K12 JA221（NRRL B−15211）を形質転換するの
に用いた。所望の形質転換体であることは、予想される
発現形質（AmpR、TetS）をテストすること、並びに適切
なEco RI−Bam HI挿入をテストすることによつて常法通
り確認した。得られたE.coli K12 JA221/pIT122形質転
換体を、続いてプラスミドpIT122を生産し、単離するた
めに通常の方法で培養した。
立て pBR322DNA約20μｇを、実施例2Aに記載した方法と実質
上同様にしてBam HIおよびEcoR I制限酵素で順次消化し
た。70℃で５分間加熱して酵素を不活化した後、pBR322
DNA約１μ（１μｇ）を、純化250bpフラグメント約１
μ（１μｇ）、水37μ、ATP（10mM）５μ、ライ
ゲーシヨンミツクス（.5Mトリス塩酸、pH7.8、.1Mジチ
オトレイツト、.1M MgCl2）５μ、およびT4DNAリガー
ゼ１μ（約100,000New England Biolabs単位）と混合
した。この混合物を15℃で約２時間インキユベートした
後、70℃で５分間インキユベートすることにより反応を
終結させた。氷上で冷却した後、このライゲートして得
た混合物を、Wensink（1974）の形質転換法に実質上従
つて、アンピシリン200μg/mlを含んだTYプレート上で
E.coli K12 JA221（NRRL B−15211）を形質転換するの
に用いた。所望の形質転換体であることは、予想される
発現形質（AmpR、TetS）をテストすること、並びに適切
なEco RI−Bam HI挿入をテストすることによつて常法通
り確認した。得られたE.coli K12 JA221/pIT122形質転
換体を、続いてプラスミドpIT122を生産し、単離するた
めに通常の方法で培養した。
C. プラスミドpKC222の〜1.45kb Eco RIフラグメントのEco RI消化プラスミドpIT122への
ライゲーシヨン 約20μｇのpKC222とpIT222とを全く別個に、反応容量20
0μｇで、１×Eco RI反応ミツクス（.1Mトリス塩酸、pH
7.5、.05M NaCl、.005M MgCl2）中、Eco RI制限酵素40
単位を用いてそれぞれ開裂させた。所望の〜1.45kb Eco
RIフラグメントを通常通り、７％アクリルアミドゲル
で精製し、EcoRI消化pIT122にライゲートした。pIT123
と命名されたこのライゲート産物のDNAを、E.coli K12
JA221（NRRL B−15211）の形質転換に用いた。これら、
ライゲーシヨンおよび形質転換における操作はいずれ
も、実質上、実施例2Bの方法に従つて行なつた。アンピ
シリン耐性形質転換体を、その構成プラスミドの制限酵
素分析並びにアガロースゲル電気泳動分析により、〜1.
45kb Eco RIフラグメントの存在とその正しい方向性
（オリエンテーシヨン）に関してスクリーニングした。
最初の９塩基対を除く全aph（４）遺伝子を含有するプ
ラスミドが、所望のプラスミド123である。この様にし
て同定したE.coli K12 JA221/pIT123形質転換体を、以
後のプラスミドpIT123の生産および単離のために培養し
た。プラスミドpIT123制限サイト地図を添付の第１図に
示す。
ライゲーシヨン 約20μｇのpKC222とpIT222とを全く別個に、反応容量20
0μｇで、１×Eco RI反応ミツクス（.1Mトリス塩酸、pH
7.5、.05M NaCl、.005M MgCl2）中、Eco RI制限酵素40
単位を用いてそれぞれ開裂させた。所望の〜1.45kb Eco
RIフラグメントを通常通り、７％アクリルアミドゲル
で精製し、EcoRI消化pIT122にライゲートした。pIT123
と命名されたこのライゲート産物のDNAを、E.coli K12
JA221（NRRL B−15211）の形質転換に用いた。これら、
ライゲーシヨンおよび形質転換における操作はいずれ
も、実質上、実施例2Bの方法に従つて行なつた。アンピ
シリン耐性形質転換体を、その構成プラスミドの制限酵
素分析並びにアガロースゲル電気泳動分析により、〜1.
45kb Eco RIフラグメントの存在とその正しい方向性
（オリエンテーシヨン）に関してスクリーニングした。
最初の９塩基対を除く全aph（４）遺伝子を含有するプ
ラスミドが、所望のプラスミド123である。この様にし
て同定したE.coli K12 JA221/pIT123形質転換体を、以
後のプラスミドpIT123の生産および単離のために培養し
た。プラスミドpIT123制限サイト地図を添付の第１図に
示す。
実施例３ プラスミドpIT144およびE.coli K12 RR1△M1
5/pIT144の組立て A. プラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグメントの組立ておよび単離 所望の消化、および単離は、Hph IおよびPst I制限酵素
および塩類の代りに、Bam HIおよびBgl II制限酵素およ
び塩類を用いることを除き、実施例2Aで示した方法と実
質上同様にして行つた。
5/pIT144の組立て A. プラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグメントの組立ておよび単離 所望の消化、および単離は、Hph IおよびPst I制限酵素
および塩類の代りに、Bam HIおよびBgl II制限酵素およ
び塩類を用いることを除き、実施例2Aで示した方法と実
質上同様にして行つた。
B. プラスミドpUC7のBam HI消化 BamHIリンカー含有DNAの代りにプラスミドpUC7（Bethes
da Research Laboratories、8717 Grovement Circle、
P.O.BOX6009、Gaithersburg、MD20877から入手可能）１
μｇを用いることを除き、実施例2Aの方法と実質的に同
様にして所望の消化を行つた。
da Research Laboratories、8717 Grovement Circle、
P.O.BOX6009、Gaithersburg、MD20877から入手可能）１
μｇを用いることを除き、実施例2Aの方法と実質的に同
様にして所望の消化を行つた。
C. ライゲーシヨンと形質転換 プラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグメン
ト約１μｇを、Bam HI消化pUC7約１μｇにライゲートし
た後、得られた混合物をE.coli K12 RR1△M15（Nationa
l Regional Research Laboratory、Peoria、Illinoisに
寄託され、その永久ストツクカルチヤーコレクシヨンの
一部となつており、寄託番号NRRL−B15440の下に入手す
ることができる）の形質転換に用いた。上記の操作はい
ずれも実施例2Bで示したライゲーシヨン並びに形質転換
の方法と実質的に同様にして行つた。形質転換細胞を、
50μg/mlのアンピシリン、100mMイソプロピルチオ−β
−Ｄ−ガラクトシツド（IPTG）および.02％５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（Ｘ−ガル）を含んだTYプレート上においた。白色のア
ンピシリン耐性コロニーを、アンピシリン（50μg/m
l）、ハイグロマイシンＢ（200μg/ml）およびIPTG（10
0mM）を含んだTY上においた。ハイグロマイシンＢ耐性
株が所望のE.coli K12 RR1△M15/pIT144形質転換体であ
り、これは、構成プラスミドの制限酵素分析並びにアガ
ロースゲル電気泳動分析で確認した。得られたE.coli K
12 RR1△M15/pIT144形質転換体を、引き続きプラスミド
pIT144の生産、単離のために常法に従つて培養した。プ
ラスミドpIT144は、実施例2Bで示した形質転換法と実質
的に同様にして通常のE.coli菌株、例えばE.coli K12、
E.coli K12 RR1、E.coli K12 JA221およびE.coli K12HB
101を形質転換することができる。プラスミドpIT144の
制限サイト（部位）地図を添付の第２図に示す。
ト約１μｇを、Bam HI消化pUC7約１μｇにライゲートし
た後、得られた混合物をE.coli K12 RR1△M15（Nationa
l Regional Research Laboratory、Peoria、Illinoisに
寄託され、その永久ストツクカルチヤーコレクシヨンの
一部となつており、寄託番号NRRL−B15440の下に入手す
ることができる）の形質転換に用いた。上記の操作はい
ずれも実施例2Bで示したライゲーシヨン並びに形質転換
の方法と実質的に同様にして行つた。形質転換細胞を、
50μg/mlのアンピシリン、100mMイソプロピルチオ−β
−Ｄ−ガラクトシツド（IPTG）および.02％５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（Ｘ−ガル）を含んだTYプレート上においた。白色のア
ンピシリン耐性コロニーを、アンピシリン（50μg/m
l）、ハイグロマイシンＢ（200μg/ml）およびIPTG（10
0mM）を含んだTY上においた。ハイグロマイシンＢ耐性
株が所望のE.coli K12 RR1△M15/pIT144形質転換体であ
り、これは、構成プラスミドの制限酵素分析並びにアガ
ロースゲル電気泳動分析で確認した。得られたE.coli K
12 RR1△M15/pIT144形質転換体を、引き続きプラスミド
pIT144の生産、単離のために常法に従つて培養した。プ
ラスミドpIT144は、実施例2Bで示した形質転換法と実質
的に同様にして通常のE.coli菌株、例えばE.coli K12、
E.coli K12 RR1、E.coli K12 JA221およびE.coli K12HB
101を形質転換することができる。プラスミドpIT144の
制限サイト（部位）地図を添付の第２図に示す。
実施例４ プラスミドpIT208およびE.coli K12 JA221/p
IT208の組立て A. プラスミドpIT207の組立て １） プラスミドpIT118の〜750bp Bam HI−Bgl IIフラグメントの組立ておよび単離 ａ） プラスミドpIT118の単離 プラスミドpIT118は、実施例1Aに示した方法に実質上従
つて、E.coli K12 JA221/pIT118から単離することがで
きる。上記の菌株はNorthern Regional Research Labor
atory、Peoria、Illinoisに寄託番号NRRLB−15441の下
に寄託され、その永久ストツクカルチヤーコレクシヨン
の一部となつている。
IT208の組立て A. プラスミドpIT207の組立て １） プラスミドpIT118の〜750bp Bam HI−Bgl IIフラグメントの組立ておよび単離 ａ） プラスミドpIT118の単離 プラスミドpIT118は、実施例1Aに示した方法に実質上従
つて、E.coli K12 JA221/pIT118から単離することがで
きる。上記の菌株はNorthern Regional Research Labor
atory、Peoria、Illinoisに寄託番号NRRLB−15441の下
に寄託され、その永久ストツクカルチヤーコレクシヨン
の一部となつている。
ｂ） 消化 Hph IおよびPst I制限酵素の代りにBam HIおよびBgl II
制限酵素を用いて、実施例2Aで示した方法と実質的に同
様にして、所望の消化および単離を行つた。
制限酵素を用いて、実施例2Aで示した方法と実質的に同
様にして、所望の消化および単離を行つた。
２） プラスミドpMC1587のBamHI消化BamHIリンカー含
有DNAの代りにプラスミドpMC1587 ２μｇを用いて、実
施例2Aの方法と実質的に同様にして所望の消化を行つ
た。プラスミドpMC1587は、Northern Regional Researc
h Laboratory、Peoria Illinoisに、寄託番号NRRL Ｂ
−15442の下に寄託され、その永久ストツクカルチヤー
コレクシヨンの一部となつている菌株、E.coli K12 JA2
21/pMC1587から、実施例1Aに示した方法と実質的に同様
にして常法通り単離できる。このプラスミドpMC1587は
１個のBam HI部位を有するので、その消化を、アガロー
スゲル電気泳動分析により、容易に監視できる。約15kb
に現われたシングルバンドは、消化の完了を意味する。
有DNAの代りにプラスミドpMC1587 ２μｇを用いて、実
施例2Aの方法と実質的に同様にして所望の消化を行つ
た。プラスミドpMC1587は、Northern Regional Researc
h Laboratory、Peoria Illinoisに、寄託番号NRRL Ｂ
−15442の下に寄託され、その永久ストツクカルチヤー
コレクシヨンの一部となつている菌株、E.coli K12 JA2
21/pMC1587から、実施例1Aに示した方法と実質的に同様
にして常法通り単離できる。このプラスミドpMC1587は
１個のBam HI部位を有するので、その消化を、アガロー
スゲル電気泳動分析により、容易に監視できる。約15kb
に現われたシングルバンドは、消化の完了を意味する。
３） E.coli K12 JA221のライゲーシヨンおよび形質転
換 プラスミドpIT118の〜750bp BamHI−Bgl IIフラグメン
ト約１μｇをBamHI消化プラスミドpMC1587約１μｇにラ
イゲートし、次いで、得られたライゲーシヨン混合物を
E.coli K12 JA221（NRRL Ｂ−15211）の形質転換に用
いた。これらの操作は実施例2Bの方法と実質的に同様に
して行つた。アンピシリン耐性形質転換体を、構成プラ
スミドの制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分
析により常法通り、〜750bpフラグメントの存在並びに
正しい方向性に関してスクリーニングした。leu2遺伝子
に極めて接近した位置にBam HI/Bgl III接続部（ジヤン
クシヨン）（〜750bpフラグメントのライゲーシヨンで
形成された）を持つたプラスミドが所望のプラスミドpI
T207である。このE.coli K12 JA221/pIT207形質転換体
を引き続き、プラスミドpIT207の生産および単離のため
に培養した。
換 プラスミドpIT118の〜750bp BamHI−Bgl IIフラグメン
ト約１μｇをBamHI消化プラスミドpMC1587約１μｇにラ
イゲートし、次いで、得られたライゲーシヨン混合物を
E.coli K12 JA221（NRRL Ｂ−15211）の形質転換に用
いた。これらの操作は実施例2Bの方法と実質的に同様に
して行つた。アンピシリン耐性形質転換体を、構成プラ
スミドの制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分
析により常法通り、〜750bpフラグメントの存在並びに
正しい方向性に関してスクリーニングした。leu2遺伝子
に極めて接近した位置にBam HI/Bgl III接続部（ジヤン
クシヨン）（〜750bpフラグメントのライゲーシヨンで
形成された）を持つたプラスミドが所望のプラスミドpI
T207である。このE.coli K12 JA221/pIT207形質転換体
を引き続き、プラスミドpIT207の生産および単離のため
に培養した。
B. プラスミドpIT208の最終的な組立て 1. プラスミドpIT207のBam HI消化 Bam HIリンカー含有DNAの代りにプラスミドpIT207 １
μｇを使用するほかは、実施例2Aと実質的に同様にして
所望の消化を行つた。
μｇを使用するほかは、実施例2Aと実質的に同様にして
所望の消化を行つた。
2. E.coli K12 JA221/pIT208のライゲーシヨンおよび
組立て プラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグメン
ト（実施例3Aで調製）約２μｇをBam HI−消化プラスミ
ドpIT207約２μｇにライゲートし、次いで、得られたラ
イゲーシヨン混合物をE.coli K12 JA221（NRRL Ｂ−15
211）の形質転換に用いた。これらの操作は、いずれも
実施例2Bのライゲーシヨンおよび形質転換の方法と実質
的に同様にして行つた。このアンピシリン耐性形質転換
体を、構成プラスミドの制限酵素分析およびアガロース
ゲル電気泳動分析により常法通り、〜1.3kbフラグメン
トの存在および正しい方向性に関してスクリーニングし
た。leu ２遺伝子に極めて接近した位置に〜1.3kbフラ
グメントの内性E.coRI部位を持つたプラスミドが所望の
pIT208プラスミドである。E.coli K12 JA221/pIT208形
質転換体を、プラスミドpIT208の生産および単離のため
に培養した。
組立て プラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグメン
ト（実施例3Aで調製）約２μｇをBam HI−消化プラスミ
ドpIT207約２μｇにライゲートし、次いで、得られたラ
イゲーシヨン混合物をE.coli K12 JA221（NRRL Ｂ−15
211）の形質転換に用いた。これらの操作は、いずれも
実施例2Bのライゲーシヨンおよび形質転換の方法と実質
的に同様にして行つた。このアンピシリン耐性形質転換
体を、構成プラスミドの制限酵素分析およびアガロース
ゲル電気泳動分析により常法通り、〜1.3kbフラグメン
トの存在および正しい方向性に関してスクリーニングし
た。leu ２遺伝子に極めて接近した位置に〜1.3kbフラ
グメントの内性E.coRI部位を持つたプラスミドが所望の
pIT208プラスミドである。E.coli K12 JA221/pIT208形
質転換体を、プラスミドpIT208の生産および単離のため
に培養した。
プラスミドpIT208は、１）翻訳解読相内で本発明のDNA
に融合している先端を切断されたYG101遺伝子、２）酵
母leu2遺伝子（leu2栄養要求体を補充することにより、
このプラスミドを選択可能なものとする）３）酵母２ミ
クロン配列（酵母内での自律的自己複製を容易にす
る）、４）プラスミドpBR322の複製起源（E.coli内での
自律的自己複製を容易にする）、および５）pBR322から
のβ−ラクタマーゼ遺伝子（E.coli内でのプラスミドの
選択を容易にする）の各成分を含有している。プラスミ
ドpIT208の制限サイト地図を添付の第３図に示す。
に融合している先端を切断されたYG101遺伝子、２）酵
母leu2遺伝子（leu2栄養要求体を補充することにより、
このプラスミドを選択可能なものとする）３）酵母２ミ
クロン配列（酵母内での自律的自己複製を容易にす
る）、４）プラスミドpBR322の複製起源（E.coli内での
自律的自己複製を容易にする）、および５）pBR322から
のβ−ラクタマーゼ遺伝子（E.coli内でのプラスミドの
選択を容易にする）の各成分を含有している。プラスミ
ドpIT208の制限サイト地図を添付の第３図に示す。
実施例５ Saccharomyces cerevisiae/pIT208の組立て Hinnenら（1978、Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:1929）の方
法と実質的に同様にしてプラスミドpIT208によりSaccha
romyces cerevisiae細胞を形質転換した。あらゆる酵母
を用いることができるが、本明細書では、特にSaccharo
myces cerevisiae DBY746を例示の菌株とする。この菌
株は、Yeast Genetics Stock Center、Department of B
iophysics and Medical Physics、University of Calif
ornia、Berkley、California94720から、誰でも入手す
ることができる。
法と実質的に同様にしてプラスミドpIT208によりSaccha
romyces cerevisiae細胞を形質転換した。あらゆる酵母
を用いることができるが、本明細書では、特にSaccharo
myces cerevisiae DBY746を例示の菌株とする。この菌
株は、Yeast Genetics Stock Center、Department of B
iophysics and Medical Physics、University of Calif
ornia、Berkley、California94720から、誰でも入手す
ることができる。
所望の組立ては、酵母細胞約100mlをYPD倍地（１％バク
トー酵母エキス、２％バクトーペプトンおよび２％ Ｄ
−グルコース）中、30℃において、A600が約１となるま
で増殖させて行なった。無菌条件下で細胞を遠心分離
し、1.2Mソルビトール15ml内で２回洗浄し、次いでソル
ビトール溶液15ml中に再懸濁した。2.5mg/mlのサイモリ
エース＊（5mM kPO4、pH7.6、1.2Mソルビトール中に60,
000単位）約100μを加えた後、この細胞を30℃でイン
キユベートした。プロトラスト化の程度を、10％SDS180
μをこの細胞液20μ部に加えて位相差顕微鏡で観察
することによつて監視した。約90％の細胞が黒く見える
ようになれば、穏やかに遠心分離して細胞を集め、1.2M
ソルビトール15mlで２回洗浄し、1.2Mソルビトール−.5
×YPD溶液10ml中に再懸濁し、室温で40分間インキユベ
ートした。再び穏やかに遠心分離して細胞を集め、.5×
YPD、1.2Mソルビトール、10mM CaCl2および10mMトリス
塩酸（pH7.5）からなる溶液600μ中に再懸濁した。こ
れらの細胞のうち一部（.2ml）をとり、1.2Mソルビトー
ル中にDNAを含有する20μの溶液に加えた。この混合
物を室温で10分間インキユベートし、その時点で20％の
PEG4,000＊＊、10mM CaCl2、10mMトリス塩酸（pH7.5）
からなる溶液1mlを加えた。この混合物を室温で60分間
インキユベートした後、４つに分けた。それぞれを、３
％の寒天、.67％Difco酵母窒素塩基（アミノ酸を含ま
ず）、1.2Mソルビトール、２％グルコース、２％YPD、
その他通常の栄養源を含む25mlを入れたチユーブに加え
た。さらに、ロイシンプロトトロフイーを選別するため
にヒスチジン、ウラシルおよびトリプトフアンをも加え
た。細胞を静かに混合し、即座に空の無菌ペトリ皿に入
れ、寒天が固化した後、加湿条件下、30℃でインキユベ
ートした。約３日後、ロイシンプロトトロフを拾い上
げ、500μg/mlのハイグロマイシンＢを含んだYPDプレー
ト上に画線接種した。得られたハイグロマイシンＢ耐性
酵母細胞が所望のSaccharomyces cervisiae/pIT208形質
転換体であつた。この形質転換体を、構成プラスミドの
制限酵素およびアガロースゲル電気泳動分析法で同定し
た。
トー酵母エキス、２％バクトーペプトンおよび２％ Ｄ
−グルコース）中、30℃において、A600が約１となるま
で増殖させて行なった。無菌条件下で細胞を遠心分離
し、1.2Mソルビトール15ml内で２回洗浄し、次いでソル
ビトール溶液15ml中に再懸濁した。2.5mg/mlのサイモリ
エース＊（5mM kPO4、pH7.6、1.2Mソルビトール中に60,
000単位）約100μを加えた後、この細胞を30℃でイン
キユベートした。プロトラスト化の程度を、10％SDS180
μをこの細胞液20μ部に加えて位相差顕微鏡で観察
することによつて監視した。約90％の細胞が黒く見える
ようになれば、穏やかに遠心分離して細胞を集め、1.2M
ソルビトール15mlで２回洗浄し、1.2Mソルビトール−.5
×YPD溶液10ml中に再懸濁し、室温で40分間インキユベ
ートした。再び穏やかに遠心分離して細胞を集め、.5×
YPD、1.2Mソルビトール、10mM CaCl2および10mMトリス
塩酸（pH7.5）からなる溶液600μ中に再懸濁した。こ
れらの細胞のうち一部（.2ml）をとり、1.2Mソルビトー
ル中にDNAを含有する20μの溶液に加えた。この混合
物を室温で10分間インキユベートし、その時点で20％の
PEG4,000＊＊、10mM CaCl2、10mMトリス塩酸（pH7.5）
からなる溶液1mlを加えた。この混合物を室温で60分間
インキユベートした後、４つに分けた。それぞれを、３
％の寒天、.67％Difco酵母窒素塩基（アミノ酸を含ま
ず）、1.2Mソルビトール、２％グルコース、２％YPD、
その他通常の栄養源を含む25mlを入れたチユーブに加え
た。さらに、ロイシンプロトトロフイーを選別するため
にヒスチジン、ウラシルおよびトリプトフアンをも加え
た。細胞を静かに混合し、即座に空の無菌ペトリ皿に入
れ、寒天が固化した後、加湿条件下、30℃でインキユベ
ートした。約３日後、ロイシンプロトトロフを拾い上
げ、500μg/mlのハイグロマイシンＢを含んだYPDプレー
ト上に画線接種した。得られたハイグロマイシンＢ耐性
酵母細胞が所望のSaccharomyces cervisiae/pIT208形質
転換体であつた。この形質転換体を、構成プラスミドの
制限酵素およびアガロースゲル電気泳動分析法で同定し
た。
＊ザイモリエースは下記の供給者から得られる:Miles L
aboratory P.O.Box 2000 Elkhart、IN46515 ＊＊PEG400は下記の供給者から得られる:Baker Biochem
icals 222 Red School Lane Phillipsburg、NJ08865 実施例６ プラスミドpKC307およびE.coli K12 RR1△M1
5/pKC307の組立て A. プラスミドpIT104およびE.coli K12 RR1/pIT104の
組立て Sac Iカツト（切断）プラスミドpKC222約1.5μ（１μ
ｇ、10×バツフアー（.5Mトリス、pH7.5、.1M MgCl2）.
5μ、各.5μの200mM dCTP、dATP、TTPおよびdGTP、
およびフラグメント〔DNAポリメラーゼＩラージ（クレ
ナウ）１単位含有〕１μを37℃で15分間インキユベー
トした。ポリメラーゼを熱的に不活化した後、Bam HIリ
ンカー＊をRobertsおよびLauer（1979）の方法と実質的
に同様にして加えた。得られたBam HIリンカー含有DNA
を常法通りBam HI制限酵素で消化し、次いで実施例2Bの
方法と実質的に同様にしてライゲートした。親プラスミ
ドの数を減少するためにSacI制限酵素で消化した後、得
られたプラスミドpIT104DNAを用いてWensink（1974）の
方法と実質的に同様にしてE.coli K12 RR1（NRRL Ｂ−
15210）の形質転換を行なつた。この形質転換体細胞を
アンピシリン50μg/mlを含んだLBプレート（Rosenberg
and Court、1979、Ann.Rev.Genet13:319）上においた。
得られたアンピシリン耐性E.coli K12 RR1/pIT104細胞
を、pIT104を生産、単離するために、常法通り単離し、
培養した。プラスミドpIT104の構造を形質転換法、選択
法、制限酵素分析および配列分析により確認した。
aboratory P.O.Box 2000 Elkhart、IN46515 ＊＊PEG400は下記の供給者から得られる:Baker Biochem
icals 222 Red School Lane Phillipsburg、NJ08865 実施例６ プラスミドpKC307およびE.coli K12 RR1△M1
5/pKC307の組立て A. プラスミドpIT104およびE.coli K12 RR1/pIT104の
組立て Sac Iカツト（切断）プラスミドpKC222約1.5μ（１μ
ｇ、10×バツフアー（.5Mトリス、pH7.5、.1M MgCl2）.
5μ、各.5μの200mM dCTP、dATP、TTPおよびdGTP、
およびフラグメント〔DNAポリメラーゼＩラージ（クレ
ナウ）１単位含有〕１μを37℃で15分間インキユベー
トした。ポリメラーゼを熱的に不活化した後、Bam HIリ
ンカー＊をRobertsおよびLauer（1979）の方法と実質的
に同様にして加えた。得られたBam HIリンカー含有DNA
を常法通りBam HI制限酵素で消化し、次いで実施例2Bの
方法と実質的に同様にしてライゲートした。親プラスミ
ドの数を減少するためにSacI制限酵素で消化した後、得
られたプラスミドpIT104DNAを用いてWensink（1974）の
方法と実質的に同様にしてE.coli K12 RR1（NRRL Ｂ−
15210）の形質転換を行なつた。この形質転換体細胞を
アンピシリン50μg/mlを含んだLBプレート（Rosenberg
and Court、1979、Ann.Rev.Genet13:319）上においた。
得られたアンピシリン耐性E.coli K12 RR1/pIT104細胞
を、pIT104を生産、単離するために、常法通り単離し、
培養した。プラスミドpIT104の構造を形質転換法、選択
法、制限酵素分析および配列分析により確認した。
＊Bam HIリンカー〔ｄ（CCGGATCCGG）１〕は、下記の供
給者から入手することができる:Collaborative Researc
h、128 Spring Street、Lexington、Massachusetts0217
3 B. プラスミドpIT104のHph I消化 プラスミドpKC222の代りにプラスミドpIT104を用いるこ
と、および、その後のPstI消化を行なわないこと、を除
き、実施例2Aと実質的に同様にして所望の消化を行なつ
た。得られたプラスミドpIT104Hph I消化物は、精製せ
ずにそのまま使用した。
給者から入手することができる:Collaborative Researc
h、128 Spring Street、Lexington、Massachusetts0217
3 B. プラスミドpIT104のHph I消化 プラスミドpKC222の代りにプラスミドpIT104を用いるこ
と、および、その後のPstI消化を行なわないこと、を除
き、実施例2Aと実質的に同様にして所望の消化を行なつ
た。得られたプラスミドpIT104Hph I消化物は、精製せ
ずにそのまま使用した。
C. プラスミドpUC8のHinc II消化 プラスミドpKC222、Hph IおよびpSTI制限酵素、並びに
塩類の代りにプラスミドpUC8（Bethesda Research Labo
ratories、8717 Grovement Circle、P.O.Box6009、Gait
herburg、MD20877から市販のものを入手できる）、およ
びHinc II制限酵素並びに反応ミツクス＊を用いること
を除き、実施例2Aと実質的に同様にして所望の消化を行
なつた。得られたプラスミドpUC8Hinc II消化物は、精
製せずにそのまま使用した。
塩類の代りにプラスミドpUC8（Bethesda Research Labo
ratories、8717 Grovement Circle、P.O.Box6009、Gait
herburg、MD20877から市販のものを入手できる）、およ
びHinc II制限酵素並びに反応ミツクス＊を用いること
を除き、実施例2Aと実質的に同様にして所望の消化を行
なつた。得られたプラスミドpUC8Hinc II消化物は、精
製せずにそのまま使用した。
＊Hinc II制限酵素用の反応ミツクスは以下の成分で調
製した:50mM NaCl、10mMトリス塩酸（pH7.5）、10mM Mg
Cl2および1mMジチオトレイツト D. T4DNAポリメラーゼによる３′延長鎖の除去 実施例6BのHph I消化によつて残存した３′延長鎖を、
続いて平滑末端ライゲーシヨンするために除去した。す
なわち、プラスミドpIT104Hph I消化物約１μｇを、33m
Mトリス塩酸（pH7.8）67mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグ
ネシウム、.5mMジチオトレイツト、.1mg/mlのBSA、各15
0μＭのdCTP、dATP、dGTPおよびTTP並びにT4DNAポリメ
ラーゼ３単位を含有する溶液10μ中、37℃で約５分間
インキユベートした。反応を、50mM EDTA約１μを加
えた後、65℃でインキユベートすることにより常法通り
終結させた。
製した:50mM NaCl、10mMトリス塩酸（pH7.5）、10mM Mg
Cl2および1mMジチオトレイツト D. T4DNAポリメラーゼによる３′延長鎖の除去 実施例6BのHph I消化によつて残存した３′延長鎖を、
続いて平滑末端ライゲーシヨンするために除去した。す
なわち、プラスミドpIT104Hph I消化物約１μｇを、33m
Mトリス塩酸（pH7.8）67mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグ
ネシウム、.5mMジチオトレイツト、.1mg/mlのBSA、各15
0μＭのdCTP、dATP、dGTPおよびTTP並びにT4DNAポリメ
ラーゼ３単位を含有する溶液10μ中、37℃で約５分間
インキユベートした。反応を、50mM EDTA約１μを加
えた後、65℃でインキユベートすることにより常法通り
終結させた。
E. E.coli K12 RR1△M15/pKC307のライゲーシヨンおよ
び組立て 平滑末端を有するプラスミドpIT104とプラスミドpUC8消
化物とを、Maniatisら（1982）の方法に実質的に従つ
て、常法通りライゲーシヨンさせた。こうして得たpKC3
07と称されるプラスミドを用いて実質的に実施例2Bの形
質転換法および実施例3Cの選択法に従い、E.coli K12 R
R1△M15を形質転換させた。得られたE.coli K12 RR1△M
15/pKC307形質転換体を、プラスミドpKC307の生産およ
び単離のために常法通り培養した。プラスミドpKC307は
通常のE.coli菌株、例えばE.coli K12、E.coli K12 RR
1、E.coli K12 JA221およびE.coli K12 HB101などを、
実施例2Bの形質転換法に実質的に従つて形質転換するこ
とができる。プラスミドpKC307の制限サイト地図を添付
の第４図に示す。
び組立て 平滑末端を有するプラスミドpIT104とプラスミドpUC8消
化物とを、Maniatisら（1982）の方法に実質的に従つ
て、常法通りライゲーシヨンさせた。こうして得たpKC3
07と称されるプラスミドを用いて実質的に実施例2Bの形
質転換法および実施例3Cの選択法に従い、E.coli K12 R
R1△M15を形質転換させた。得られたE.coli K12 RR1△M
15/pKC307形質転換体を、プラスミドpKC307の生産およ
び単離のために常法通り培養した。プラスミドpKC307は
通常のE.coli菌株、例えばE.coli K12、E.coli K12 RR
1、E.coli K12 JA221およびE.coli K12 HB101などを、
実施例2Bの形質転換法に実質的に従つて形質転換するこ
とができる。プラスミドpKC307の制限サイト地図を添付
の第４図に示す。
前述したプラスミドから〜1.7kb Hind IIIフラグメント
を常法に従つて欠失（欠落）せしめることにより、プラ
スミドpKC307と機能的に同等である誘導体を得た。この
プラスミドpKC308と命名され、E.coli K12 JA221の形質
転換に用いられており、本発明を例示するものである。
を常法に従つて欠失（欠落）せしめることにより、プラ
スミドpKC307と機能的に同等である誘導体を得た。この
プラスミドpKC308と命名され、E.coli K12 JA221の形質
転換に用いられており、本発明を例示するものである。
実施例７ プラスミドpIT125およびE.coli K12 JA221/p
IT125の組立て 1. プラスミドpIT7△４△１の組立て A. プラスミドpBRHtrpの組立て プラスミドpGM1は△LE1413欠損を含むE.coliトリプトフ
アンオペロン（Miozzariら、1978、J.Bacteriology、14
57〜1466）を担持しており、従つて、trpリーダー配列
の最初の６個のアミノ酸およびtrpEポリペプチドの終り
の３分の１を含んでいる融合蛋白質（以後これらを合せ
てLE′という）、並びにtrpDポリペプチドの全配列を、
いずれもtrpプロモーター／オペレーター系のコントロ
ールの下で発現せしめるのである。E.coli K12 W3110 t
na2 trp△102/pGM1は、American Type Culture Collect
ionに寄託され（ATCC No.31622）ており、pGM1はこの菌
株から下記の如く、常法に従つて分離することができ
る。
IT125の組立て 1. プラスミドpIT7△４△１の組立て A. プラスミドpBRHtrpの組立て プラスミドpGM1は△LE1413欠損を含むE.coliトリプトフ
アンオペロン（Miozzariら、1978、J.Bacteriology、14
57〜1466）を担持しており、従つて、trpリーダー配列
の最初の６個のアミノ酸およびtrpEポリペプチドの終り
の３分の１を含んでいる融合蛋白質（以後これらを合せ
てLE′という）、並びにtrpDポリペプチドの全配列を、
いずれもtrpプロモーター／オペレーター系のコントロ
ールの下で発現せしめるのである。E.coli K12 W3110 t
na2 trp△102/pGM1は、American Type Culture Collect
ionに寄託され（ATCC No.31622）ており、pGM1はこの菌
株から下記の如く、常法に従つて分離することができ
る。
約20μｇのこのプラスミドを、このプラスミドを５箇所
で切断する制限酵素Pvu IIで消化した。次いでこの遺伝
子フラグメントを、後にEcoRI開裂部位を含有するプラ
スミドヘクローンするために、Eco RIリンカー（配列
式:pCATGAATTCATGで示される自己相補性（self complem
entary）オリゴヌクレオチド）とでEco RI開裂部位を作
成した。pGM1から得たDNAフラグメント20μｇを、５′
−リン酸化合成オリゴヌクレオチドpCATGAATTCATG（200
ピコモル）の存在下、20μのT4DNAリガーゼ緩衝液（2
0mMトリス、pH7.6、.5mMATP、10mM MgCl2、5mMジチオト
レイツト）中、４℃で一夜、T4DNAリガーゼ（10単位）
で処理した。次いで、溶液を70℃で10分間加熱してライ
ゲーシヨンを停止させた。このリンカーをEco RI消化に
よつて開裂し、そのEco RI末端を有するフラグメントを
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以後「PAGE」
と呼称）で分離した。まず最初にエチジウムブロマイド
により染色し、次いで紫外線によつてフラグメントの位
置を定め、所望の部分をゲルから切り取ることにより、
３つの最も大きいフラグメントをゲルから分離した。各
ゲルフラグメントを300μの、.1×TBEと共に透析袋に
入れ、.1×TBE緩衝液中（TBE緩衝液：水１中にトリス
塩基10.8g、ホウ酸5.5gおよびNa2EDTA.09gを含有）１時
間、100Vにおける電気泳動に付した。透析袋中の水溶液
を集め、フエノール抽出並びにクロロホルム抽出を行な
い、塩化ナトリウム濃度を、.2Mに調節した。次いで、
エタノール沈殿の後、DNAを水中に回収した。このEco R
I粘着末端を持つたtrpプロモーター／オペレーター−含
有遺伝子は後述する方法で同定した。この方法は、テト
ラサイクリン感受性プラスミドにフラグメントを挿入
し、これにより、プロモーター／オペレーターの挿入に
よつてテトラサイクリン感受性プラスミドをテトラサイ
クリン耐性プラスミドにするのである。以後に述べるDN
Aフラグメントの単離は全て上記の如く、PAGEを行な
い、次いで電気溶出する方法で行なつた。
で切断する制限酵素Pvu IIで消化した。次いでこの遺伝
子フラグメントを、後にEcoRI開裂部位を含有するプラ
スミドヘクローンするために、Eco RIリンカー（配列
式:pCATGAATTCATGで示される自己相補性（self complem
entary）オリゴヌクレオチド）とでEco RI開裂部位を作
成した。pGM1から得たDNAフラグメント20μｇを、５′
−リン酸化合成オリゴヌクレオチドpCATGAATTCATG（200
ピコモル）の存在下、20μのT4DNAリガーゼ緩衝液（2
0mMトリス、pH7.6、.5mMATP、10mM MgCl2、5mMジチオト
レイツト）中、４℃で一夜、T4DNAリガーゼ（10単位）
で処理した。次いで、溶液を70℃で10分間加熱してライ
ゲーシヨンを停止させた。このリンカーをEco RI消化に
よつて開裂し、そのEco RI末端を有するフラグメントを
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以後「PAGE」
と呼称）で分離した。まず最初にエチジウムブロマイド
により染色し、次いで紫外線によつてフラグメントの位
置を定め、所望の部分をゲルから切り取ることにより、
３つの最も大きいフラグメントをゲルから分離した。各
ゲルフラグメントを300μの、.1×TBEと共に透析袋に
入れ、.1×TBE緩衝液中（TBE緩衝液：水１中にトリス
塩基10.8g、ホウ酸5.5gおよびNa2EDTA.09gを含有）１時
間、100Vにおける電気泳動に付した。透析袋中の水溶液
を集め、フエノール抽出並びにクロロホルム抽出を行な
い、塩化ナトリウム濃度を、.2Mに調節した。次いで、
エタノール沈殿の後、DNAを水中に回収した。このEco R
I粘着末端を持つたtrpプロモーター／オペレーター−含
有遺伝子は後述する方法で同定した。この方法は、テト
ラサイクリン感受性プラスミドにフラグメントを挿入
し、これにより、プロモーター／オペレーターの挿入に
よつてテトラサイクリン感受性プラスミドをテトラサイ
クリン耐性プラスミドにするのである。以後に述べるDN
Aフラグメントの単離は全て上記の如く、PAGEを行な
い、次いで電気溶出する方法で行なつた。
B. Trpプロモーター／オペレーターのコントロール下
でテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドpBRHtrp
の組立て、並びに上記「Ａ」で単離したTrpプロモータ
ー／オペレーター含有DNAフラグメントの同定および増
幅 プラスミドpBRH1（Rodriguezら、1979、Nucleic Acids
Research6、3267−3287およびWestら、1979、Gene7:271
−288、に記載された方法で組み立てられたもの。これ
は、American Type Culture Collectionに、寄託番号AT
CC37070の下に寄託されている）は、アンピシリン耐性
を発現すると共に、テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
しているが、これはプロモーターを伴なつていないの
で、その耐性を発現することはない。従つて、このプラ
スミドはテトラサイクリン感受性である。そのEco RI部
位にプロモーター／オペレーター系を導入してこのプラ
スミドをテトラサイクリン耐性にすることができる。
でテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドpBRHtrp
の組立て、並びに上記「Ａ」で単離したTrpプロモータ
ー／オペレーター含有DNAフラグメントの同定および増
幅 プラスミドpBRH1（Rodriguezら、1979、Nucleic Acids
Research6、3267−3287およびWestら、1979、Gene7:271
−288、に記載された方法で組み立てられたもの。これ
は、American Type Culture Collectionに、寄託番号AT
CC37070の下に寄託されている）は、アンピシリン耐性
を発現すると共に、テトラサイクリン耐性遺伝子を含有
しているが、これはプロモーターを伴なつていないの
で、その耐性を発現することはない。従つて、このプラ
スミドはテトラサイクリン感受性である。そのEco RI部
位にプロモーター／オペレーター系を導入してこのプラ
スミドをテトラサイクリン耐性にすることができる。
プラスミドpBRH1（ATCC37070）をEco RIで消化した。酵
素をフエノール抽出、次いでクロロホルム抽出すること
により除去し、エタノール沈殿の後、DNAを水中に回収
した。得られたDNA分子を、実施例7Aで得た３種のDNAフ
ラグメントの各々と、別々の反応混合物で混合し、前述
の如くにしてT4DNAリガーゼでライゲートした。この反
応混合物中のDNAを用いて標準的手法（Hershfieldら、1
974、Proc.Nat.Acad.Sci.USA71:3455−3459）に従い、
コンピテントE.coli K12菌株294（Backmanら、1976、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA73:4174−4198、ATCC No.31446）
を形質転換し、次いでこの細菌を、アンピシリン20μg/
mlおよびテトラサイクリン５μg/mlを含んだLBプレート
上においた。
素をフエノール抽出、次いでクロロホルム抽出すること
により除去し、エタノール沈殿の後、DNAを水中に回収
した。得られたDNA分子を、実施例7Aで得た３種のDNAフ
ラグメントの各々と、別々の反応混合物で混合し、前述
の如くにしてT4DNAリガーゼでライゲートした。この反
応混合物中のDNAを用いて標準的手法（Hershfieldら、1
974、Proc.Nat.Acad.Sci.USA71:3455−3459）に従い、
コンピテントE.coli K12菌株294（Backmanら、1976、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA73:4174−4198、ATCC No.31446）
を形質転換し、次いでこの細菌を、アンピシリン20μg/
mlおよびテトラサイクリン５μg/mlを含んだLBプレート
上においた。
数個のテトラサイクリン耐性コロニーを選択し、そのプ
ラスミドDNAを分離してpBRHtrpと命名した。所望のフラ
グメントの存在を制限酵素分析で確認した。プラスミド
pBRHtrpはβ−ラクタマーゼを発現し、アンピシリン耐
性を与え、さらにtrpプロモーター／オペレーターを含
むDNAフラグメントを含有している。このDNAフラグメン
トはまた、trpリーダー配列の最初の６個のアミノ酸とt
rpEポリペプチドの後方のおよそ３分の１の融合物であ
る第１番目のタンパク質（LE′と呼称）、trpDポリペプ
チドのおよそ前半分に対応する第２番目のタンパク質
（Ｄ′と呼称）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子に
よつて暗号化された第３番目のタンパク質、をも暗号化
している。
ラスミドDNAを分離してpBRHtrpと命名した。所望のフラ
グメントの存在を制限酵素分析で確認した。プラスミド
pBRHtrpはβ−ラクタマーゼを発現し、アンピシリン耐
性を与え、さらにtrpプロモーター／オペレーターを含
むDNAフラグメントを含有している。このDNAフラグメン
トはまた、trpリーダー配列の最初の６個のアミノ酸とt
rpEポリペプチドの後方のおよそ３分の１の融合物であ
る第１番目のタンパク質（LE′と呼称）、trpDポリペプ
チドのおよそ前半分に対応する第２番目のタンパク質
（Ｄ′と呼称）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子に
よつて暗号化された第３番目のタンパク質、をも暗号化
している。
C. プラスミドpSOM7△２の組立て プラスミドpBRHtrpをEco RI制限酵素で消化し、得られ
たフラグメントをPAGEおよび電気溶出法で単離し、Eco
RI消化プラスミドpSOM11（Itakuraら、1977、Sci.、19
8:1056、イギリス特許出願公告番号第2,007,676A号）と
混合した。この混合物をT4DNAリガーゼでライゲートし
そのDNAで前述の如くにしてE.coli K12菌株294形質転換
した。形質転換した細菌をアンピシリン含有プレート上
で選択し、得られたアンピシリン耐性コロニーを、コロ
ニーハイブリダイゼーシヨン（Gruensteinら、1975、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA72:39513965）によつてスクリーニ
ングした。pBRHtrpから単離し、32Pで放射活性を示すべ
くラベルしたtrpプロモーター／オペレーター含有フラ
グメントを上記の実験でプローブとして用いた。コロニ
ーハイブリダイゼーシヨンで陽性を示した数個のコロニ
ーを選択した。プラスミドDNAを単離し、Bgl IIおよびB
am HI酵素を用いて二重消化して行なう制限酵素分析に
より、挿入フラグメントの方向性を決定した。適切な方
向性のtrpプロモーター／オペレーターフラグメントを
持つた所望のプラスミドを含むコロニーを10μg/mlのア
ンピシリンを含んだLB培地で増殖させた。所望のプラス
ミドをpSOM7△２と命名し、以下に述べる組立てに用い
た。
たフラグメントをPAGEおよび電気溶出法で単離し、Eco
RI消化プラスミドpSOM11（Itakuraら、1977、Sci.、19
8:1056、イギリス特許出願公告番号第2,007,676A号）と
混合した。この混合物をT4DNAリガーゼでライゲートし
そのDNAで前述の如くにしてE.coli K12菌株294形質転換
した。形質転換した細菌をアンピシリン含有プレート上
で選択し、得られたアンピシリン耐性コロニーを、コロ
ニーハイブリダイゼーシヨン（Gruensteinら、1975、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA72:39513965）によつてスクリーニ
ングした。pBRHtrpから単離し、32Pで放射活性を示すべ
くラベルしたtrpプロモーター／オペレーター含有フラ
グメントを上記の実験でプローブとして用いた。コロニ
ーハイブリダイゼーシヨンで陽性を示した数個のコロニ
ーを選択した。プラスミドDNAを単離し、Bgl IIおよびB
am HI酵素を用いて二重消化して行なう制限酵素分析に
より、挿入フラグメントの方向性を決定した。適切な方
向性のtrpプロモーター／オペレーターフラグメントを
持つた所望のプラスミドを含むコロニーを10μg/mlのア
ンピシリンを含んだLB培地で増殖させた。所望のプラス
ミドをpSOM7△２と命名し、以下に述べる組立てに用い
た。
D. プラスミドpTrp24の組立て １） LE′ポリペプチドの遠位領域に関するコドンを含
む遺伝子フラグメントであつて、その暗号鎖の５′並び
に３′末端にそれぞれBgl IIおよびEco RI制限部位を有
するフラグメントの組立て プラスミドpSOM7△２をHind III消化した後、LE′暗号
領域内のBgl II制限部位を越えて消化が行なわれる様な
条件を選んでラムダエキソヌクレアーゼ（５′から３′
へのエキソヌクレアーゼ）で消化した。約20μｇのHind
III消化pSOM7△２を緩衝液（20mMグリシン緩衝液、pH
9.6、1mM MgCl2、1mM β−メルカプトエタノール）に溶
かした。得られた混合物をラムダエキソヌクレアーゼ５
単位により、室温で60分間処理した。得られた反応混合
物をフエノール抽出、クロロホルム抽出した後、エタノ
ール沈殿を行なつた。
む遺伝子フラグメントであつて、その暗号鎖の５′並び
に３′末端にそれぞれBgl IIおよびEco RI制限部位を有
するフラグメントの組立て プラスミドpSOM7△２をHind III消化した後、LE′暗号
領域内のBgl II制限部位を越えて消化が行なわれる様な
条件を選んでラムダエキソヌクレアーゼ（５′から３′
へのエキソヌクレアーゼ）で消化した。約20μｇのHind
III消化pSOM7△２を緩衝液（20mMグリシン緩衝液、pH
9.6、1mM MgCl2、1mM β−メルカプトエタノール）に溶
かした。得られた混合物をラムダエキソヌクレアーゼ５
単位により、室温で60分間処理した。得られた反応混合
物をフエノール抽出、クロロホルム抽出した後、エタノ
ール沈殿を行なつた。
LE′遺伝子フラグメントの遠位末端にEco RI残分（resi
due）を形成するために、改良ホスホトリエステル法（G
reaら、1978）に従つてプライマー、32p CCTGTGCATGAT
を合成し、ラムダエキソヌクレアーゼ消化によつて生成
したLE′遺伝子フラグメントの一本鎖末端にハイブリダ
イズさせた。このハイブリダイゼーシヨンは、エキソヌ
クレアーゼ処理したプラスミドpSOM7△２のHind III消
化物20μｇを水20μに溶解し、上記の５′−りん酸化
オリゴヌクレオチドを約80ピコモル含有する６μの溶
液と混合することにより行なつた。合成フラグメントは
LE′暗号配列の３′末端に結合し、残るLE′フラグメン
トの１本鎖を、dATP、TTp、dGTPおよびdCTPを用てクレ
ナウポリメラーゼＩで充填した。クレナウポリメラーゼ
ＩはDNAポリメラーゼＩのタンパク分解的開裂で得られ
るフラグメントである。これは５′T3′（５′から３′
への）ポリメラーゼ作用および３′→５′エキソヌクレ
アーゼ作用を有するが、親酵素の有する５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ作用は持たない（Kornberg、1974、W.H.
Freeman and co.、San Fransisco、California）。
due）を形成するために、改良ホスホトリエステル法（G
reaら、1978）に従つてプライマー、32p CCTGTGCATGAT
を合成し、ラムダエキソヌクレアーゼ消化によつて生成
したLE′遺伝子フラグメントの一本鎖末端にハイブリダ
イズさせた。このハイブリダイゼーシヨンは、エキソヌ
クレアーゼ処理したプラスミドpSOM7△２のHind III消
化物20μｇを水20μに溶解し、上記の５′−りん酸化
オリゴヌクレオチドを約80ピコモル含有する６μの溶
液と混合することにより行なつた。合成フラグメントは
LE′暗号配列の３′末端に結合し、残るLE′フラグメン
トの１本鎖を、dATP、TTp、dGTPおよびdCTPを用てクレ
ナウポリメラーゼＩで充填した。クレナウポリメラーゼ
ＩはDNAポリメラーゼＩのタンパク分解的開裂で得られ
るフラグメントである。これは５′T3′（５′から３′
への）ポリメラーゼ作用および３′→５′エキソヌクレ
アーゼ作用を有するが、親酵素の有する５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ作用は持たない（Kornberg、1974、W.H.
Freeman and co.、San Fransisco、California）。
すなわち、反応混合物を50℃に加熱し、徐々に10℃まで
冷却し、その後４μのクレナウ酵素を加えた。室温で
15分間インキユベーシヨンした後、37℃で30分間インキ
ユベーシヨンし、.25MEDTA 5μを加えて反応を停止さ
せた。反応混合物をフエノール抽出、クロロホルム抽出
した後、エタノール沈殿に付した。次いでDNAを制限酵
素Bgl IIで開裂させ、フラグメントをPAGEで分離した。
ゲルをオートラジオグラムにかけたところ、約470bpと
いう予測された長さの32pラベル−フラグメントが存在
することがわかつた。これの電気溶出法で回収した。概
説した様に、このフラグメントLE′（ｄ）はBgl II末端
と、プライマーの開始点に符号する平滑末端とを有して
いる。
冷却し、その後４μのクレナウ酵素を加えた。室温で
15分間インキユベーシヨンした後、37℃で30分間インキ
ユベーシヨンし、.25MEDTA 5μを加えて反応を停止さ
せた。反応混合物をフエノール抽出、クロロホルム抽出
した後、エタノール沈殿に付した。次いでDNAを制限酵
素Bgl IIで開裂させ、フラグメントをPAGEで分離した。
ゲルをオートラジオグラムにかけたところ、約470bpと
いう予測された長さの32pラベル−フラグメントが存在
することがわかつた。これの電気溶出法で回収した。概
説した様に、このフラグメントLE′（ｄ）はBgl II末端
と、プライマーの開始点に符号する平滑末端とを有して
いる。
２） プラスミドpThα１の組立て プラスミトpThα１は、チモシンアルフア１のための合
成遺伝子をプラスミドpBR322に挿入することにより、組
立てた。チモシンアルフア１暗号DNAは、添付の第５図
において両頭矢印（）で指示した16個のオリゴヌクレ
オチド（T1〜T16）の合成、およびそれらのライゲーシ
ヨンにより合成した。Ｎ末端にMet（メチオニン）コド
ンATGを挿入し、５′末端を、Eco RIとBam HIで開裂し
たプラスミドに結合し易くするために、一本鎖粘着末端
を持つ様に調整した。容易に理解されるであろうが、組
換えプラスミドの分析（同定）には、遺伝子の中心にあ
るBgl II部位が役立つ。
成遺伝子をプラスミドpBR322に挿入することにより、組
立てた。チモシンアルフア１暗号DNAは、添付の第５図
において両頭矢印（）で指示した16個のオリゴヌクレ
オチド（T1〜T16）の合成、およびそれらのライゲーシ
ヨンにより合成した。Ｎ末端にMet（メチオニン）コド
ンATGを挿入し、５′末端を、Eco RIとBam HIで開裂し
たプラスミドに結合し易くするために、一本鎖粘着末端
を持つ様に調整した。容易に理解されるであろうが、組
換えプラスミドの分析（同定）には、遺伝子の中心にあ
るBgl II部位が役立つ。
オリゴデオキシリボヌクレオチドT1〜T16は、完全に保
護されたトリデオキシボヌクレオチド組立てブロツクを
用いて、改良ホスホトリエステル法（Itakuraら、1977
およびCreaら、1978）に従つて合成された。種々のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを表１に示す。
護されたトリデオキシボヌクレオチド組立てブロツクを
用いて、改良ホスホトリエステル法（Itakuraら、1977
およびCreaら、1978）に従つて合成された。種々のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを表１に示す。
上記の化合物の合成は、添付の第６図に総括した。下記
のフラグメントT15に関する合成方法で代表される。T15
の合成に用いた種々のヌクレオチドフラグメントを、図
面に数字で表わした。また、採用した略号は次の通りで
ある:TPSTe＝2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホ
ニルテトラゾール;BSA＝ベンゼンスルホン酸;TLC＝薄層
クロマトグラフイー;HPLC＝高速液体クロマトグラフイ
ー;DMT＝4,4′−ジメトキシトリチル;CE＝２−シアノエ
チル;R＝ｐ−クロロフエニル;BZ＝ベンゾイル;An＝アニ
ソイル;iBu＝イソブチリル;Py＝ピリジン;AcOH＝酢酸;E
t3N＝トリエチルアミン。
のフラグメントT15に関する合成方法で代表される。T15
の合成に用いた種々のヌクレオチドフラグメントを、図
面に数字で表わした。また、採用した略号は次の通りで
ある:TPSTe＝2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホ
ニルテトラゾール;BSA＝ベンゼンスルホン酸;TLC＝薄層
クロマトグラフイー;HPLC＝高速液体クロマトグラフイ
ー;DMT＝4,4′−ジメトキシトリチル;CE＝２−シアノエ
チル;R＝ｐ−クロロフエニル;BZ＝ベンゾイル;An＝アニ
ソイル;iBu＝イソブチリル;Py＝ピリジン;AcOH＝酢酸;E
t3N＝トリエチルアミン。
完全に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド（４）
（85mg、.05mM）および（２）（180mg、.1mM）を、7:3
（v/v）のクロロホルム／メタノール中の２％BSA（それ
ぞれ10および20ml）により、０℃で10分間処理し、５′
の水酸基を脱保護した。重炭酸アンモニウム飽和水溶液
（2ml）を加えて反応を止め、クロロホルム（25ml）で
抽出した後、水洗した（２×10ml）。有機層を硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、少量（約5ml）になるまで濃縮した
後、石油エーテル（35゜〜60℃留分）を加えて沈殿させ
た。無色の沈殿を遠心分離して集め、真空デシケーター
内で乾燥すると、いずれもシリカゲルTLC（Merck60 F25
4、クロロホルム／メタノール、9:1）でホモジーニアス
（均一）な（６）および（８）を得た。
（85mg、.05mM）および（２）（180mg、.1mM）を、7:3
（v/v）のクロロホルム／メタノール中の２％BSA（それ
ぞれ10および20ml）により、０℃で10分間処理し、５′
の水酸基を脱保護した。重炭酸アンモニウム飽和水溶液
（2ml）を加えて反応を止め、クロロホルム（25ml）で
抽出した後、水洗した（２×10ml）。有機層を硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、少量（約5ml）になるまで濃縮した
後、石油エーテル（35゜〜60℃留分）を加えて沈殿させ
た。無色の沈殿を遠心分離して集め、真空デシケーター
内で乾燥すると、いずれもシリカゲルTLC（Merck60 F25
4、クロロホルム／メタノール、9:1）でホモジーニアス
（均一）な（６）および（８）を得た。
トリマー（三量体）（１）および（３）（270mg、.15m
M;145mg、.075mM）をトリエチルアミン／ピリジン／水
（1:3:1、v/v、10ml）により室温で25分間処理すること
により、ホスホジエステル、（５）および（７）に変換
した。ロータリーエバポレーターを用いて反応剤を留去
し、残留物を無水ピリジンと共に繰返し蒸留することに
より（３×10ml）乾燥した。トリマー（８）（.05mM）
とトリマー（７）とを無水ピリジン（3ml）中でTPSTe
（50mg、15mM）と混合し、この反応混合物を、減圧下
に、室温で２時間放置した。TLC分析の結果、トリマー
（８）の95％ヘキサマー生成物に変換していることがわ
かつた（10％硫酸水溶液を噴霧し、60℃に加熱すること
により、DMT基を検出して観察した）。この反応物に水
（1ml）を加えてクエンチングし、溶媒を減圧蒸留し
た。トルエンと共に共沸蒸留してピリジンを除いた後、
トリマー（４）および（２）に関して記述した如く、２
％BSA（8ml）でこのヘキサマーの５′位を脱保護した。
この生成物（10）をシリカゲルカラム（Merck60H、3.5
×5cm）にかけ、クロロホルム／メタノール（98:2〜95:
5、v/v）による段階的傾斜溶出により精製した。生成物
（10）を含む画分を蒸発乾固した。
M;145mg、.075mM）をトリエチルアミン／ピリジン／水
（1:3:1、v/v、10ml）により室温で25分間処理すること
により、ホスホジエステル、（５）および（７）に変換
した。ロータリーエバポレーターを用いて反応剤を留去
し、残留物を無水ピリジンと共に繰返し蒸留することに
より（３×10ml）乾燥した。トリマー（８）（.05mM）
とトリマー（７）とを無水ピリジン（3ml）中でTPSTe
（50mg、15mM）と混合し、この反応混合物を、減圧下
に、室温で２時間放置した。TLC分析の結果、トリマー
（８）の95％ヘキサマー生成物に変換していることがわ
かつた（10％硫酸水溶液を噴霧し、60℃に加熱すること
により、DMT基を検出して観察した）。この反応物に水
（1ml）を加えてクエンチングし、溶媒を減圧蒸留し
た。トルエンと共に共沸蒸留してピリジンを除いた後、
トリマー（４）および（２）に関して記述した如く、２
％BSA（8ml）でこのヘキサマーの５′位を脱保護した。
この生成物（10）をシリカゲルカラム（Merck60H、3.5
×5cm）にかけ、クロロホルム／メタノール（98:2〜95:
5、v/v）による段階的傾斜溶出により精製した。生成物
（10）を含む画分を蒸発乾固した。
同様に、トリマー（５）を（６）につなぎ、完全に保護
された生成物を直接、シリカゲルで精製した。この生成
物の３′末端を、トリエチルアミン／ピリジン／水を用
いて前述の如く脱保護してフラグメント（９）を得た。
された生成物を直接、シリカゲルで精製した。この生成
物の３′末端を、トリエチルアミン／ピリジン／水を用
いて前述の如く脱保護してフラグメント（９）を得た。
最後に、ヘキサマー（９）と（10）とを、無水ピリジン
（2ml）中、TPSTe（75mg、.225mM）を縮合剤として用い
て結合させた。反応完了後（周囲温度で４時間）、混合
物をロータリーエバポレーターで蒸留し、残留物をシリ
カゲルクロマトグラフイーにかけた。石油エーテルを加
えると生成物（11）（160mg）が析出した。こうして得
たものはTLCでホモジーニアスであつた。化合物（11）
の一部（20mg）をピリジン（.5ml）に入れ、濃水酸化ア
ンモニウム処理（7ml,8時間、60℃）および80％酢酸処
理（15分間、周囲温度）をこの順序で行なうことによ
り、完全に脱保護した。酢酸を留去した後、固型残留物
を４％水酸化アンモニウム水溶液（v/v、4ml）に溶か
し、エチルエーテル（３×2ml）で抽出した。水層を１
〜2mlに濃縮し、その一部をHPLCにかけて（12）を精製
した。主ピークに相当する画分をプールし（O.D.254約
2.0単位）、約5mlに濃縮した。この最終生成物（12）
を、Bio−gel Ｐ−２（1.5×100cm）にかけ、20％エタ
ノール水溶液で溶離して脱塩処理し、蒸発乾固した後、
水（200μ）に再懸濁してA254＝10の溶液とした。化
合物（12）の配列は２次元配列決定法で確認した。
（2ml）中、TPSTe（75mg、.225mM）を縮合剤として用い
て結合させた。反応完了後（周囲温度で４時間）、混合
物をロータリーエバポレーターで蒸留し、残留物をシリ
カゲルクロマトグラフイーにかけた。石油エーテルを加
えると生成物（11）（160mg）が析出した。こうして得
たものはTLCでホモジーニアスであつた。化合物（11）
の一部（20mg）をピリジン（.5ml）に入れ、濃水酸化ア
ンモニウム処理（7ml,8時間、60℃）および80％酢酸処
理（15分間、周囲温度）をこの順序で行なうことによ
り、完全に脱保護した。酢酸を留去した後、固型残留物
を４％水酸化アンモニウム水溶液（v/v、4ml）に溶か
し、エチルエーテル（３×2ml）で抽出した。水層を１
〜2mlに濃縮し、その一部をHPLCにかけて（12）を精製
した。主ピークに相当する画分をプールし（O.D.254約
2.0単位）、約5mlに濃縮した。この最終生成物（12）
を、Bio−gel Ｐ−２（1.5×100cm）にかけ、20％エタ
ノール水溶液で溶離して脱塩処理し、蒸発乾固した後、
水（200μ）に再懸濁してA254＝10の溶液とした。化
合物（12）の配列は２次元配列決定法で確認した。
ソマトスタシン（Itakuraら、1977）および成長ホルモ
ン（Goeddelら、1979、Nature281:544）に関して既に詳
細に述べられている方法に従つて、16個の合成ポリゴヌ
クレオチドから、完全なチモシンα１遺伝子を組立て
た。10μｇづつのオリゴヌクレオチドT2〜T15を、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Goeddelら、1979）の存在
下、〔γ−32P〕−ATP（New England Nuclear）で定量
的にリン酸化し、比活性約1Ci/mmolのものを得た。この
放射性同位元素でラベルしたフラグメントを20％ポリア
クリルアミド/7M尿素ゲル電気泳動法で精製し、溶出し
たフラグメントの配列を、二次元電気泳動法／部分的ヘ
ビ毒消化物のホモクロマトグラフイー法（Jayら、197
4、Nucleic Acidsn Res.1:331）に従って確認した。フ
ラグメントT1およびT16は、以後のライゲーシヨン反応
に伴なう望ましくない重合反応を最少限度にとどめるた
め、りん酸化せずにおいた。これらのオリゴヌクレオチ
ド（各２μｇ）を、公知の手法（Goeddelら、1979）に
従い、T4DNAリガーゼによつて、４フラグメントからな
る４つのグループに組立てた（第７図参照）。こうして
得た生成物を7Mの尿素を含んだ15％ポリアクリルアミド
ゲルによるゲル電気泳動法で精製（Maxam and Gilber
t、1977、Proc.Nat.Acad.Sci.USA71:3455）。単離した
４種の生成物をライゲートし、反応混合物を10％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で解析した。チモシンアル
フア１遺伝子の大きさ（90〜105塩基対）のDNAを電気溶
出して得た。
ン（Goeddelら、1979、Nature281:544）に関して既に詳
細に述べられている方法に従つて、16個の合成ポリゴヌ
クレオチドから、完全なチモシンα１遺伝子を組立て
た。10μｇづつのオリゴヌクレオチドT2〜T15を、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Goeddelら、1979）の存在
下、〔γ−32P〕−ATP（New England Nuclear）で定量
的にリン酸化し、比活性約1Ci/mmolのものを得た。この
放射性同位元素でラベルしたフラグメントを20％ポリア
クリルアミド/7M尿素ゲル電気泳動法で精製し、溶出し
たフラグメントの配列を、二次元電気泳動法／部分的ヘ
ビ毒消化物のホモクロマトグラフイー法（Jayら、197
4、Nucleic Acidsn Res.1:331）に従って確認した。フ
ラグメントT1およびT16は、以後のライゲーシヨン反応
に伴なう望ましくない重合反応を最少限度にとどめるた
め、りん酸化せずにおいた。これらのオリゴヌクレオチ
ド（各２μｇ）を、公知の手法（Goeddelら、1979）に
従い、T4DNAリガーゼによつて、４フラグメントからな
る４つのグループに組立てた（第７図参照）。こうして
得た生成物を7Mの尿素を含んだ15％ポリアクリルアミド
ゲルによるゲル電気泳動法で精製（Maxam and Gilber
t、1977、Proc.Nat.Acad.Sci.USA71:3455）。単離した
４種の生成物をライゲートし、反応混合物を10％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で解析した。チモシンアル
フア１遺伝子の大きさ（90〜105塩基対）のDNAを電気溶
出して得た。
プラスミドpBR322（.5μｇ）をBam HIおよびEco RI制限
エンドヌクレアーゼで処理し、生成したフラグメントを
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離した。大きい
フラグメントを電気溶出してゲルから回収し、組立てた
合成DNAとライゲートした（Goeddelら、1979）。この混
合物をE.coli K12菌株294（ATCC No.31446）の形質転換
に用いた。この形質転換混合物の５％を20μg/mlのアン
ピシリンを含んだLBプレート上においた。得られたアン
ピリシン耐性コロニーはテトラサイクリン感受性であ
り、テトラサイクリン耐性遺伝子への挿入を示唆した。
これらのコロニーから得られたプラスミドを分析した結
果、どの場合にも、このプラスミド（pThα１と命名）
は、（ａ）pBR322自身には含まれていないBgl II部位を
含んでおり（従つて第５図に示す如くチモシンアルフア
１遺伝子の存在を示唆している）、（ｂ）Bam HI/Eco R
I開裂で生じた約105個の塩基対から成るフラグメントを
含んでいた。プラスミドpTbα１の組立て図（縮尺通り
でない）を添付の第７図に示す。図中、黒点（．）は
５′−ホスフエート基を表わしている。
エンドヌクレアーゼで処理し、生成したフラグメントを
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離した。大きい
フラグメントを電気溶出してゲルから回収し、組立てた
合成DNAとライゲートした（Goeddelら、1979）。この混
合物をE.coli K12菌株294（ATCC No.31446）の形質転換
に用いた。この形質転換混合物の５％を20μg/mlのアン
ピシリンを含んだLBプレート上においた。得られたアン
ピリシン耐性コロニーはテトラサイクリン感受性であ
り、テトラサイクリン耐性遺伝子への挿入を示唆した。
これらのコロニーから得られたプラスミドを分析した結
果、どの場合にも、このプラスミド（pThα１と命名）
は、（ａ）pBR322自身には含まれていないBgl II部位を
含んでおり（従つて第５図に示す如くチモシンアルフア
１遺伝子の存在を示唆している）、（ｂ）Bam HI/Eco R
I開裂で生じた約105個の塩基対から成るフラグメントを
含んでいた。プラスミドpTbα１の組立て図（縮尺通り
でない）を添付の第７図に示す。図中、黒点（．）は
５′−ホスフエート基を表わしている。
３） 処理pThα１とLE′（ｄ）フラグメントの反応 プラスミドpThα１は、アンピシリン耐性を指定する遺
伝子と、その５′暗号鎖末端がEco RI部位に、またその
３′末端がBam HI部位にクローンされた、チモシンα１
を指定する構造遺伝子を含有している。このチモシン遺
伝子はBgl II部位をも有している。先に調製したLE′
（ｄ）フラグメントを受け入れることができるプラスミ
ドを調製するために、このpThα１をEco RI消化し、次
いで、TTPおよびdATPを加えてクレナウポリメラーゼＩ
反応に付し、Eco RI残分を平滑化した。得られた生成物
をBgl II消化すると、アンピシリン耐性に関する遺伝子
と、その両方の末端に、Bgl II粘着残分を平滑末端とを
有する直線状DNAフラグメントが得られた。得られ生成
物をT4リガーゼの存在下、Bgl II粘着末端と平滑末端と
を有するLE′（ｄ）フラグメントと反応させることによ
り再環化し、プラスミドpTrp24を得ることができた。こ
の様にして、平滑末端結合が行なわれた箇所にEco RI部
位が再生成される。
伝子と、その５′暗号鎖末端がEco RI部位に、またその
３′末端がBam HI部位にクローンされた、チモシンα１
を指定する構造遺伝子を含有している。このチモシン遺
伝子はBgl II部位をも有している。先に調製したLE′
（ｄ）フラグメントを受け入れることができるプラスミ
ドを調製するために、このpThα１をEco RI消化し、次
いで、TTPおよびdATPを加えてクレナウポリメラーゼＩ
反応に付し、Eco RI残分を平滑化した。得られた生成物
をBgl II消化すると、アンピシリン耐性に関する遺伝子
と、その両方の末端に、Bgl II粘着残分を平滑末端とを
有する直線状DNAフラグメントが得られた。得られ生成
物をT4リガーゼの存在下、Bgl II粘着末端と平滑末端と
を有するLE′（ｄ）フラグメントと反応させることによ
り再環化し、プラスミドpTrp24を得ることができた。こ
の様にして、平滑末端結合が行なわれた箇所にEco RI部
位が再生成される。
E. プラスミドpSOM7△２△４の組立て pTrp24をBgl IIとEco RIで順次消化し、次いでpAGEにか
け、電気溶出することにより、LE′（ｄ）ポリペプチド
のコドンであつて、その暗号鎖の３′末端を隣接するEc
o RI粘着末端と、Bgl II粘着末端を有するコドンを持つ
たフラグメントを得た。このLE′（ｄ）フラグメントを
プラスミドpSom7△２のBgl II部位にクローンして、ト
リプトフアンプロモーター／オペレーターのコントロー
ル下に発現されるLE′ポリペプチド／ソマトスタチン融
合タンパク質を形成させることができる。そのために
は、（１）トリプトフアンプロモーター／オペレーター
から遠位のEco RI部位を開裂せしめるためにpSom7△７
の部分的Eco RI消化を行なう、（２）コドンの解読枠を
適切に保持すると共にEco RI開裂部位を再生成する様な
プライマー配列の適切な選択が必要である。
け、電気溶出することにより、LE′（ｄ）ポリペプチド
のコドンであつて、その暗号鎖の３′末端を隣接するEc
o RI粘着末端と、Bgl II粘着末端を有するコドンを持つ
たフラグメントを得た。このLE′（ｄ）フラグメントを
プラスミドpSom7△２のBgl II部位にクローンして、ト
リプトフアンプロモーター／オペレーターのコントロー
ル下に発現されるLE′ポリペプチド／ソマトスタチン融
合タンパク質を形成させることができる。そのために
は、（１）トリプトフアンプロモーター／オペレーター
から遠位のEco RI部位を開裂せしめるためにpSom7△７
の部分的Eco RI消化を行なう、（２）コドンの解読枠を
適切に保持すると共にEco RI開裂部位を再生成する様な
プライマー配列の適切な選択が必要である。
すなわち、プラスミドpSom7△２（16μｇ）を、20mMト
リス（pH7.5）、5mMMgCl2、.02NP4O洗浄剤および100mM
NaClを含む緩衝液200μで希釈し、.5単位のEco RIで
処理した。37℃で15分経過した後、反応混合物をフエノ
ール抽出、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に付
し、次いでBgl IIで消化した。得られたフラグメントの
大きい方をPAGE法および電気溶出法で単離した。このフ
ラグメントはLE′ポリペプチドの近位の末端（proximal
end）部分、即ち、Bgl II部位の上流部分に関するコド
ン「LE′（ｐ）」を含んでいる。次いでこのフラグメン
トを、T4DNAリガーゼの存在下、上記LE′（ｄ）にライ
ゲートし、プラスミドpSom7△２△４を形成させる。こ
れをE.coli菌株294に導入すると、トリプトフアンプロ
モーター／オペレーターのコントロール下に、完全に再
構成されたLEポリペプチドとソマトスタチンから成る融
合タンパク質が効率良く生産された。
リス（pH7.5）、5mMMgCl2、.02NP4O洗浄剤および100mM
NaClを含む緩衝液200μで希釈し、.5単位のEco RIで
処理した。37℃で15分経過した後、反応混合物をフエノ
ール抽出、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に付
し、次いでBgl IIで消化した。得られたフラグメントの
大きい方をPAGE法および電気溶出法で単離した。このフ
ラグメントはLE′ポリペプチドの近位の末端（proximal
end）部分、即ち、Bgl II部位の上流部分に関するコド
ン「LE′（ｐ）」を含んでいる。次いでこのフラグメン
トを、T4DNAリガーゼの存在下、上記LE′（ｄ）にライ
ゲートし、プラスミドpSom7△２△４を形成させる。こ
れをE.coli菌株294に導入すると、トリプトフアンプロ
モーター／オペレーターのコントロール下に、完全に再
構成されたLEポリペプチドとソマトスタチンから成る融
合タンパク質が効率良く生産された。
F. テトラサイクリン耐性を特定する遺伝子を囲んで
３′末端にPstI残基を、またそ５′末端にbgl II残基を
有する直線状DNAの組立て プラスミドpBR322をHind III消化し、突出したHind III
末端をS1ヌクレアーゼで消化した。このS1ヌクレアーゼ
消化は、10μｇのHind III開裂pBR322をS1緩衝液（.3MN
aCl、1mM ZnCl2、25mM酢酸ナトリウム、pH4.5）30μ
中、300単位のS1ヌクレアーゼで、15℃において30分間
処理することにより行なつた。30×S1ヌクレアーゼ停止
溶液（.8Mトリス塩基、50mM EDTA）１μを加えること
により反応を終了させた。この混合物をフエノール抽
出、クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿に付し、
次いで既述した様にしてEco RI消化したPAGE法、次いで
電気溶出法を適用して得られたフラグメントは、Cco RI
粘着末端と平滑末端を有し、その暗号鎖がヌクレオチ
ド、チミジンから開始されるものであつた。この、チミ
ジンから始まるS1消化Hind III残分をクレナウポリメラ
ーゼＩ処理Bgl II残分と混合し、ライゲーシヨンするこ
とによつてBgl II制限部位を再構成することができる。
３′末端にPstI残基を、またそ５′末端にbgl II残基を
有する直線状DNAの組立て プラスミドpBR322をHind III消化し、突出したHind III
末端をS1ヌクレアーゼで消化した。このS1ヌクレアーゼ
消化は、10μｇのHind III開裂pBR322をS1緩衝液（.3MN
aCl、1mM ZnCl2、25mM酢酸ナトリウム、pH4.5）30μ
中、300単位のS1ヌクレアーゼで、15℃において30分間
処理することにより行なつた。30×S1ヌクレアーゼ停止
溶液（.8Mトリス塩基、50mM EDTA）１μを加えること
により反応を終了させた。この混合物をフエノール抽
出、クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿に付し、
次いで既述した様にしてEco RI消化したPAGE法、次いで
電気溶出法を適用して得られたフラグメントは、Cco RI
粘着末端と平滑末端を有し、その暗号鎖がヌクレオチ
ド、チミジンから開始されるものであつた。この、チミ
ジンから始まるS1消化Hind III残分をクレナウポリメラ
ーゼＩ処理Bgl II残分と混合し、ライゲーシヨンするこ
とによつてBgl II制限部位を再構成することができる。
そこで、実施例７−1Cで得たプラスミドpSOM7△２をBgl
II消化し、得られたBgl II粘着末端を、４種のデオキ
シヌクレオチドトリホスフエート全てを使用し、クレナ
ウポリメラーゼＩで処理することにより二重鎖とした。
この生成物をEco RIで開裂し、PAGEにかけ、小さいフラ
グメントを電気溶出すると、トリプトフアンプロモータ
ー／オペレーターと、Bgl II部位から上流の、LE′「近
位」配列に関するコドン（「LE′（ｐ）」）を持つた直
線状DNA片が得られた。この生成物はEco RI末端と、Bgl
II部位の充填により生成した平滑末端とを有する。し
かしながら、このBgl II部位は、該平滑末端を上記S1消
化Hind IIIフラグメントの平滑末端にライゲートするこ
とにより再構成される。すなわち、これら２種のフラグ
メントをT4DNAリガーゼの存在下にライゲートて再環化
したプラスミドpHKY10を形成させ、これを形質転換によ
りコンピテントE.coli菌株294細胞に導入した。組換え
プラスミドpHKY10を担持しているテトラサイクリン耐性
細胞を選択し、そのプラスミドDNAを抽出した。Bgl II
およびPstI消化、次いでPAGE法および電気溶出法による
大きいフラグメントの単離、によつて、PstIおよびBgl
II両粘着末端を有する所望の直線状DNA片を得た。こう
してpHKY10から調製されたDNAフラグメントは複製起源
を有しており、従つて、trpLE′ポリペプチド融合タン
パク質の暗号遺伝子およびテトラサイクリン耐性に関す
る暗号遺伝子の両方がtrpプロモーター／オペレーター
でコントロールされる、プラスミドpIA7△４△１の組立
て要素の１つとして有用である。
II消化し、得られたBgl II粘着末端を、４種のデオキ
シヌクレオチドトリホスフエート全てを使用し、クレナ
ウポリメラーゼＩで処理することにより二重鎖とした。
この生成物をEco RIで開裂し、PAGEにかけ、小さいフラ
グメントを電気溶出すると、トリプトフアンプロモータ
ー／オペレーターと、Bgl II部位から上流の、LE′「近
位」配列に関するコドン（「LE′（ｐ）」）を持つた直
線状DNA片が得られた。この生成物はEco RI末端と、Bgl
II部位の充填により生成した平滑末端とを有する。し
かしながら、このBgl II部位は、該平滑末端を上記S1消
化Hind IIIフラグメントの平滑末端にライゲートするこ
とにより再構成される。すなわち、これら２種のフラグ
メントをT4DNAリガーゼの存在下にライゲートて再環化
したプラスミドpHKY10を形成させ、これを形質転換によ
りコンピテントE.coli菌株294細胞に導入した。組換え
プラスミドpHKY10を担持しているテトラサイクリン耐性
細胞を選択し、そのプラスミドDNAを抽出した。Bgl II
およびPstI消化、次いでPAGE法および電気溶出法による
大きいフラグメントの単離、によつて、PstIおよびBgl
II両粘着末端を有する所望の直線状DNA片を得た。こう
してpHKY10から調製されたDNAフラグメントは複製起源
を有しており、従つて、trpLE′ポリペプチド融合タン
パク質の暗号遺伝子およびテトラサイクリン耐性に関す
る暗号遺伝子の両方がtrpプロモーター／オペレーター
でコントロールされる、プラスミドpIA7△４△１の組立
て要素の１つとして有用である。
G. Trpプロモーター／オペレーターを有する直線状DNA
の組立て 実施例７−1Cで得たプラスミドpSOM7△２△４をEco RI
部分消化、次いでPstI消化に付した。得られたフラグメ
ントはtrpプロモーター／オペレーターを含有してお
り、PAGE法にかけ、電気溶出することにより単離した。
ソマトスタチン遺伝子の５′末端に隣接した部位で開裂
され、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーター／オ
ペレーターとの間にあるEco RI部位では開裂されていな
いフラグメントを得るために、Eco RI部分消化が必要で
あつた。アンピシリン耐性遺伝子中のPstI部位を切断す
ることにより失なわれたアンピシリン耐性は、上記実施
例７−1Fで得た最終的なpHKY10直線DNA誘導体とのライ
ゲーシヨンによつて回復することができる。
の組立て 実施例７−1Cで得たプラスミドpSOM7△２△４をEco RI
部分消化、次いでPstI消化に付した。得られたフラグメ
ントはtrpプロモーター／オペレーターを含有してお
り、PAGE法にかけ、電気溶出することにより単離した。
ソマトスタチン遺伝子の５′末端に隣接した部位で開裂
され、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーター／オ
ペレーターとの間にあるEco RI部位では開裂されていな
いフラグメントを得るために、Eco RI部分消化が必要で
あつた。アンピシリン耐性遺伝子中のPstI部位を切断す
ることにより失なわれたアンピシリン耐性は、上記実施
例７−1Fで得た最終的なpHKY10直線DNA誘導体とのライ
ゲーシヨンによつて回復することができる。
H. インシユリンＡ鎖構造遺伝子の単離 インシユリンＡ鎖構造遺伝子はGoeddelら（1979、Proc.
Nat.Acad.Sci.USA76:106）の開示した方法で組立てられ
るプラスミドpIA1のEco RIおよびBam HI消化により得ら
れた。このプラスミドはE.coli K12菌株94/pIA1（ATCC3
1448）からも得ることができる。所望のフラグメントを
PAGEおよび電気溶出により精製した。このものはEco RI
およびBam HI末端を有していた。
Nat.Acad.Sci.USA76:106）の開示した方法で組立てられ
るプラスミドpIA1のEco RIおよびBam HI消化により得ら
れた。このプラスミドはE.coli K12菌株94/pIA1（ATCC3
1448）からも得ることができる。所望のフラグメントを
PAGEおよび電気溶出により精製した。このものはEco RI
およびBam HI末端を有していた。
I. インシユリンＡ鎖構造遺伝子、Trpプロモーター／
オペレーター、並びにPstIおよびBgl II末端を有するpH
KY10直線状DNAフラグメントのライゲーシヨン インシユリンＡ鎖構造遺伝子、trpプロモーター／オペ
レーターを含有する直線状DNAフラグメント（実施例７
−1Gで調製）、およびpHKY10直線状DNAフラグメント
（実施例７−1Fで調製）を、第８図に示す如く、適切な
方向性でライゲートし、所望のプラスミドpIA7△４△１
を得た。プラスミドpIA7△４△１は、アンピシリンおよ
びテトラサイクリン耐性が回復しているので容易に選択
できる。
オペレーター、並びにPstIおよびBgl II末端を有するpH
KY10直線状DNAフラグメントのライゲーシヨン インシユリンＡ鎖構造遺伝子、trpプロモーター／オペ
レーターを含有する直線状DNAフラグメント（実施例７
−1Gで調製）、およびpHKY10直線状DNAフラグメント
（実施例７−1Fで調製）を、第８図に示す如く、適切な
方向性でライゲートし、所望のプラスミドpIA7△４△１
を得た。プラスミドpIA7△４△１は、アンピシリンおよ
びテトラサイクリン耐性が回復しているので容易に選択
できる。
2. プラスミドpIT123の〜1.3kb Bam HI−Bgl IIフラグ
メントとプラスミドPIA7△４△１の〜4.5kb Bam HI−Bg
l IIフラグメントのライゲーシヨン A. プラスミドpIA7△４△１のBam HI−Bgl II消化、並
びに〜4.5kbフラグメントの単離 プラスミドpIT123並びにHph IおよびPstI制限酵素、お
よび塩類を用いる代りにプラスミドpIA7△４△１並びに
Bgl IIおよびBam HI制限酵素、および製造業者指定の塩
類を使用したほかは、実施例2Aの方法と実質的に同様に
して表記の消化および単離を行なつた。
メントとプラスミドPIA7△４△１の〜4.5kb Bam HI−Bg
l IIフラグメントのライゲーシヨン A. プラスミドpIA7△４△１のBam HI−Bgl II消化、並
びに〜4.5kbフラグメントの単離 プラスミドpIT123並びにHph IおよびPstI制限酵素、お
よび塩類を用いる代りにプラスミドpIA7△４△１並びに
Bgl IIおよびBam HI制限酵素、および製造業者指定の塩
類を使用したほかは、実施例2Aの方法と実質的に同様に
して表記の消化および単離を行なつた。
B. ライゲーシヨンおよび形質転換 プラスミドpUC7およびE.coli K12 RR1△M15の代りにプ
ラスミドpIA7△４△１の〜4.5kb Bam HI−Bgl IIフラグ
メントおよびE.coli K12 JA221（NRRL Ｂ−15211）を
用いるほかは実施例3Cの方法と実質的に同様にして表記
のライゲーシヨンおよび形質転換を行なつた。形質転換
された細胞を、アンピシリン50μg/mlを含んだTYプレー
ト上におき、次いでハイグロマイシンB200μg/mlを含ん
だプレート上に貼付（Patched）した。次いで所望のハ
イグロマイシンＢ耐性E.coli K12 JA221/pIT125形質転
換体を、プラスミドpIT125の生産および単離のために常
法通り培養した。プラスミドpIT125は、通常のE.coli菌
株、例えばE.coli K12、E.coli K12 RR1およびE.coli K
12 HB101を実施例2Bの方法と実質的に同様の方法に従
い、形質転換することができる。プラスミドpIT125の制
限部位（サイト）地図を添付の第４図に示す。
ラスミドpIA7△４△１の〜4.5kb Bam HI−Bgl IIフラグ
メントおよびE.coli K12 JA221（NRRL Ｂ−15211）を
用いるほかは実施例3Cの方法と実質的に同様にして表記
のライゲーシヨンおよび形質転換を行なつた。形質転換
された細胞を、アンピシリン50μg/mlを含んだTYプレー
ト上におき、次いでハイグロマイシンB200μg/mlを含ん
だプレート上に貼付（Patched）した。次いで所望のハ
イグロマイシンＢ耐性E.coli K12 JA221/pIT125形質転
換体を、プラスミドpIT125の生産および単離のために常
法通り培養した。プラスミドpIT125は、通常のE.coli菌
株、例えばE.coli K12、E.coli K12 RR1およびE.coli K
12 HB101を実施例2Bの方法と実質的に同様の方法に従
い、形質転換することができる。プラスミドpIT125の制
限部位（サイト）地図を添付の第４図に示す。
前述の方法に従つて組立てられた、その他の代表的なプ
ラスミドおよび形質転換体を、次の表２および表３に示
す。
ラスミドおよび形質転換体を、次の表２および表３に示
す。
表３ 代表的な形質転換体 E.coli/R E.coli K12/R E.coli K12 JA221/R E.coli K12 HB101/R E.coli K12 RR1/R Saccharomyces cerevisiae/R1 上記において、ＲはプラスミドpIT143、pIT212、pIT21
3、pIT215、pIT217およびpIT219からなる群から選ばれ
るものであり、R1はプラスミドpIT212、pIT213、pIT21
5、pIT217およびpIT219からなる群から選ばれるもので
ある。
3、pIT215、pIT217およびpIT219からなる群から選ばれ
るものであり、R1はプラスミドpIT212、pIT213、pIT21
5、pIT217およびpIT219からなる群から選ばれるもので
ある。
第１図はプラスミドpIT123およびpKC222の制限サイト地
図、第２図はプラスミドpKC203およびpIT144の制限サイ
ト地図、第３図はpIT208およびpIT207の制限サイト地
図、第４図はプラスミドpKC307およびpIT125の制限サイ
ト地図、第５図はチモシンアルフア１遺伝子のアミノ酸
およびヌクレオチド配列を示す模式図、第６図はフラグ
メントT15の合成工程図、第７図はプラスミドpThα１の
組立て経路を示す模式図、第８図はプラスミドpIT215お
よびpIT217の制限サイト地図、第９図はプラスミドpIT2
19の制限サイト地図である。
図、第２図はプラスミドpKC203およびpIT144の制限サイ
ト地図、第３図はpIT208およびpIT207の制限サイト地
図、第４図はプラスミドpKC307およびpIT125の制限サイ
ト地図、第５図はチモシンアルフア１遺伝子のアミノ酸
およびヌクレオチド配列を示す模式図、第６図はフラグ
メントT15の合成工程図、第７図はプラスミドpThα１の
組立て経路を示す模式図、第８図はプラスミドpIT215お
よびpIT217の制限サイト地図、第９図はプラスミドpIT2
19の制限サイト地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ケビン・レイ・カスター アメリカ合衆国インデイアナ46234、イン デイアナポリス、ウエストリツヂ・ドライ ブ8431番 (56)参考文献 特開 昭58−13598（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−50892（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−164200（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−141790（ＪＰ，Ａ)
Claims (22)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列で示されるハイグロマ
イシンＢホスホトランスフェラーゼのＣ末端側の338
個、339個または340個のアミノ酸配列をコードしている
DNA、あるいは翻訳解読相内において転写および翻訳ア
クチベーター配列を含有しているある種の遺伝子または
遺伝子部分と共にある該DNAであって、該DNAが、天然の
ハイグロマイシンＢホスホトランフェラーゼ遺伝子の転
写および翻訳アクチベーター配列を伴っていないDNA: （式中、METはメチオニン、LYSはリジン、PROはプロリ
ン、GLUはグルタミン酸、LEUはロイシン、THRはスレオ
ニン、ALAはアラニン、SERはセリン、VALはバリン、PHE
はフェニルアラニン、ILEはイソロイシン、GLYはグリシ
ン、ASPはアスパラギン酸、GLNはグルタミン、ARGはア
ルギニン、CYSはシステイン、TRPはトリプトファン、AS
Nはアスパラギン、HISはヒスチジン、そしてTYRはチロ
シンを表わす）。 - 【請求項２】式： （式中、Ａはデオキシアデニル、 Ｇはデオキシグアニジル、 Ｃはデオキシシチジル、 Ｔはチミジル、 ＲおよびR2は、独立してリジンをコードしているデオキ
シリボヌクレオチドトリプレット、 R1およびR3は、それぞれＲおよびR2の塩基に対応した相
補的な窒素塩基を含有するデオキシリボヌクレオチドト
リプレット、 ｍおよびｎは０または１、 R4は翻訳停止コドンをコードしているデオキシリボヌク
レオチドトリプレット、そして R5は、R4の塩基に対応した相補的な窒素塩基を含有する
デオキシリボヌクレオチドトリプレットを表わす。ただ
し、ｎ＝０のときはｍ＝０であり、ｍ＝１のときはｎ＝
１である。） で示される配列からなる特許請求の範囲第１項に記載の
DNA。 - 【請求項３】転写および翻訳アクチベーター配列と翻訳
解読相内にある特許請求の範囲第１項または第２項に記
載のDNA。 - 【請求項４】転写および翻訳アクチベーター配列とホモ
ローガスな構造遺伝子の最初の15個までのアミノ末端コ
ドンを含有する特許請求の範囲第３項に記載のDNA。 - 【請求項５】R4がTAGであり、R5がATCである特許請求の
範囲第４項に記載のDNA。 - 【請求項６】転写および翻訳アクチベーター配列とホモ
ローガスな遺伝子が細菌性の遺伝子である特許請求の範
囲第１項から第５項までのいずれかに記載のDNA。 - 【請求項７】遺伝子が15個までのアミノ酸をコードして
いる特許請求の範囲第６項に記載のDNA。 - 【請求項８】遺伝子がエシエリシア・コリ（E.coli）la
c Z遺伝子の一部である特許請求の範囲第６項または第
７項に記載のDNA。 - 【請求項９】遺伝子が真核性遺伝子である特許請求の範
囲第１項から第５項までのいずれかに記載のDNA。 - 【請求項１０】遺伝子が酵母ヒートショック同族遺伝子
の一部である特許請求の範囲第９項に記載のDNA。 - 【請求項１１】ｎ＝１であり、ｍ＝０である特許請求の
範囲第２項から第10項までのいずれかに記載のDNA。 - 【請求項１２】ｍ＝１であり、ｎ＝１である特許請求の
範囲第２項から第10項までのいずれかに記載のDNA。 - 【請求項１３】ｍ＝０であり、ｎ＝０である特許請求の
範囲第２項から第10項までのいずれかに記載のDNA。 - 【請求項１４】式： で示されるアミノ酸配列をコードしている特許請求の範
囲第13項に記載のDNA。 - 【請求項１５】以下に示す制限地図を有するプラスミド
pIT123の1.3kb Bam HI−Bgl II制限フラグメントである
特許請求の範囲第１項または第２項に記載のDNA: - 【請求項１６】下記のアミノ酸配列で示されるハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェラーゼのＣ末端側の338
個、339個または340個のアミノ酸配列をコードしている
DNA、あるいは翻訳解読相内において転写および翻訳ア
クチベーター配列を含有しているある種の遺伝子または
遺伝子部分と共にある該DNAであって、該DNAが、天然の
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の
転写および翻訳アクチベーター配列を伴っていないDNA
を含有する組換えDNAクローニングベクター： （式中、METはメチオニン、LYSはリジン、PROはプロリ
ン、GLUはグルタミン酸、LEUはロイシン、THRはスレオ
ニン、ALAはアラニン、SERはセリン、VALはバリン、PHE
はフェニルアラニン、ILEはイソロイシン、GLYはグリシ
ン、ASPはアスパラギン酸、GLNはグルタミン、ARGはア
ルギニン、CYSはシステイン、TRPはトリプトファン、AS
Nはアスパラギン、HISはヒスチジン、そしてTYRはチロ
シンを表わす）。 - 【請求項１７】プラスミドである特許請求の範囲第16項
に記載のベクター。 - 【請求項１８】プラスミドpIT123、pIT125、pIT144、pI
T208、pKC307またはpKC308である特許請求の範囲第17項
に記載のベクター。 - 【請求項１９】プラスミドpIT212、pIT213、pIT215、pI
T217またはpIT219である特許請求の範囲第17項に記載の
ベクター。 - 【請求項２０】下記のアミノ酸配列で示されるハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェラーゼのＣ末端側の338
個、339個または340個のアミノ酸配列をコードしている
DNA、あるいは翻訳解読相内において転写および翻訳ア
クチベーター配列を含有しているある種の遺伝子または
遺伝子部分と共にある該DNAであって、該DNAが、天然の
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の
転写および翻訳アクチベーター配列を伴っていないDNA
を含有する組換えDNAクローニングベクターで形質転換
された細菌または酵母から選ばれる形質転換体： （式中、METはメチオニン、LYSはリジン、PROはプロリ
ン、GLUはグルタミン酸、LEUはロイシン、THRはスレオ
ニン、ALAはアラニン、SERはセリン、VALはバリン、PHE
はフェニルアラニン、ILEはイソロイシン、GLYはグリシ
ン、ASPはアスパラギン酸、GLNはグルタミ、ARGはアル
ギニン、CYSはシステイン、TRPはトリプトファン、ASN
はアスパラギン、HISはヒスチジン、そしてTYRはチロシ
ンを表わす）。 - 【請求項２１】エシエリシア・コリ（E.coli）である特
許請求の範囲第20項に記載の形質転換体。 - 【請求項２２】サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae）である特許請求の範囲第20項に記載
の形質転換体。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51622283A | 1983-07-22 | 1983-07-22 | |
| US516222 | 1983-07-22 | ||
| US53550883A | 1983-09-26 | 1983-09-26 | |
| US535508 | 1983-09-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6047685A JPS6047685A (ja) | 1985-03-15 |
| JPH0712312B2 true JPH0712312B2 (ja) | 1995-02-15 |
Family
ID=27058764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15194384A Expired - Lifetime JPH0712312B2 (ja) | 1983-07-22 | 1984-07-20 | 改良された抗生物質耐性遺伝子 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0135291B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0712312B2 (ja) |
| CA (1) | CA1278540C (ja) |
| DE (1) | DE3481627D1 (ja) |
| DK (1) | DK174933B1 (ja) |
| FI (1) | FI842878A (ja) |
| GB (1) | GB2143534B (ja) |
| GR (1) | GR79980B (ja) |
| IE (1) | IE57776B1 (ja) |
| IL (1) | IL72426A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340766C (en) * | 1984-12-24 | 1999-09-28 | Clive Waldron | Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants |
| RU1780542C (ru) * | 1985-04-22 | 1992-12-07 | Эли Лилли Энд Компани | Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК pPS 20, кодирующей изопенициллин-N-синтетазу, способ получени штамма СернаLоSроRIUм асRемоNIUм, обладающего активностью изопенициллин-N-синтетазы |
| IL78531A0 (en) * | 1985-04-22 | 1986-08-31 | Lilly Co Eli | Recombinant dna expression vectors and dna compounds which encode isopenicillin n synthetase |
| US6774283B1 (en) | 1985-07-29 | 2004-08-10 | Calgene Llc | Molecular farming |
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| DE4410188A1 (de) * | 1994-03-24 | 1995-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von antibiotikaresistenzgenfreien DNA-Vektoren |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2422685A1 (fr) * | 1978-04-14 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Vecteurs, derives du bacteriophage lambda, permettant l'insertion et l'expression d'un gene, procaryote ou eucaryote, sous le controle du promoteur et de l'operateur de l'operon lactose de la bacterie escherichia coli |
| FR2428075A1 (fr) * | 1978-06-08 | 1980-01-04 | Pasteur Institut | Procede de production de proteines par expression des genes correspondants dans des bacteries et vecteurs susceptibles d'etre mis en oeuvre dans de tels procedes |
| US4350764A (en) * | 1980-03-10 | 1982-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microbiological synthesis of beta endorphin |
| IL66065A (en) * | 1981-06-22 | 1989-06-30 | Lilly Co Eli | Recombinant dna cloning vectors and the e.coli transformants thereof |
| JPS5813598A (ja) * | 1981-06-22 | 1983-01-26 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 組み替えｄｎａクロ−ニング・ベクタ−ならびにその真核細胞性および原核細胞性被形質転換体 |
-
1984
- 1984-07-16 CA CA000458935A patent/CA1278540C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-17 EP EP84304856A patent/EP0135291B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-17 GB GB08418171A patent/GB2143534B/en not_active Expired
- 1984-07-17 DE DE8484304856T patent/DE3481627D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-17 IL IL72426A patent/IL72426A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-17 GR GR75324A patent/GR79980B/el unknown
- 1984-07-17 IE IE1847/84A patent/IE57776B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-17 FI FI842878A patent/FI842878A/fi not_active Application Discontinuation
- 1984-07-19 DK DK198403536A patent/DK174933B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-07-20 JP JP15194384A patent/JPH0712312B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK353684D0 (da) | 1984-07-19 |
| EP0135291A1 (en) | 1985-03-27 |
| FI842878A0 (fi) | 1984-07-17 |
| IL72426A (en) | 1990-03-19 |
| IE57776B1 (en) | 1993-04-07 |
| GB8418171D0 (en) | 1984-08-22 |
| DE3481627D1 (de) | 1990-04-19 |
| JPS6047685A (ja) | 1985-03-15 |
| CA1278540C (en) | 1991-01-02 |
| AU3089884A (en) | 1985-01-24 |
| GR79980B (ja) | 1984-10-31 |
| GB2143534A (en) | 1985-02-13 |
| AU565625B2 (en) | 1987-09-24 |
| FI842878A (fi) | 1985-01-23 |
| IE841847L (en) | 1985-01-22 |
| EP0135291B1 (en) | 1990-03-14 |
| IL72426A0 (en) | 1984-11-30 |
| GB2143534B (en) | 1987-07-29 |
| DK174933B1 (da) | 2004-03-01 |
| DK353684A (da) | 1985-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2694840B2 (ja) | ポリペプチドを微生物により発現させる方法 | |
| EP0080848B1 (en) | Stabilizing & selecting cells | |
| CA1266628A (en) | Manufacture and expression of structural genes | |
| EP0049619B1 (en) | Method for stabilizing and selecting host cells containing recombinant dna | |
| JPH0657154B2 (ja) | 所望のポリペプチドを発現させるためのクローニングビーイクル | |
| EP0075444A2 (en) | Methods and products for facile microbial expression of DNA sequences | |
| JPH0759193B2 (ja) | 外来性蛋白質発現用クロ−ニングベクタ− | |
| US4530904A (en) | Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria | |
| JPH0712312B2 (ja) | 改良された抗生物質耐性遺伝子 | |
| US4960704A (en) | Modified antibiotic resistance gene | |
| KR900001014B1 (ko) | 소 성장 호르몬 유도체 발현 벡터의 제조방법 | |
| EP0259891A2 (en) | [Leu 13] motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| KR900001015B1 (ko) | 재조합체 dna 발현 벡터의 제조방법 | |
| EP0207165A1 (en) | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms | |
| EP0534705A2 (en) | Expression of low molecular weight recombinant polypeptides | |
| US4732859A (en) | Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria | |
| JPH0716432B2 (ja) | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 | |
| KR970009082B1 (ko) | 인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법 | |
| HU200366B (en) | Process for producing modified hygromycin resistance gene | |
| JPS5974987A (ja) | 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 | |
| JPS611391A (ja) | 牛の成長ホルモン誘導体を発現するベクタ− |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |