JPS6047685A - 改良された抗生物質耐性遺伝子 - Google Patents
改良された抗生物質耐性遺伝子Info
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- JPS6047685A JPS6047685A JP59151943A JP15194384A JPS6047685A JP S6047685 A JPS6047685 A JP S6047685A JP 59151943 A JP59151943 A JP 59151943A JP 15194384 A JP15194384 A JP 15194384A JP S6047685 A JPS6047685 A JP S6047685A
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- Japan
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- gene
- dna
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- ala
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- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、改良された）１イグロマイシンＢ耐性付与遺
伝子に関するものである。本発明の改良遺伝子は、プロ
モーターのクローニング、単離および識別、並びに適当
な宿主内で優勢な選択マーカーとして機能する遺伝子融
合物（ｇｅｎｅ Ｅｕ５ｉｏｎ）の組立てに有用である
。本発明はまた、上記ＤＮＡを含むベクターおよび形質
転換体に関するものでもある。
伝子に関するものである。本発明の改良遺伝子は、プロ
モーターのクローニング、単離および識別、並びに適当
な宿主内で優勢な選択マーカーとして機能する遺伝子融
合物（ｇｅｎｅ Ｅｕ５ｉｏｎ）の組立てに有用である
。本発明はまた、上記ＤＮＡを含むベクターおよび形質
転換体に関するものでもある。
イギリス特許出願公開節２．１’ ＯＯ，７３５号には
、△ 本発明に有用な出発物質（プラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２
およびハイグロマイシンＢ剛性付与ＤＮＡセク゛セ伝子
を開示するものでないばかりか、選択可能な遺伝子融合
物の主要な成分としてのその有用性を示唆するものでも
ない。
、△ 本発明に有用な出発物質（プラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２
およびハイグロマイシンＢ剛性付与ＤＮＡセク゛セ伝子
を開示するものでないばかりか、選択可能な遺伝子融合
物の主要な成分としてのその有用性を示唆するものでも
ない。
発明の目的および構成
優勢で選択可能なマーカーとの遺伝子融合は、転写また
は翻訳１こ関する活性素配列を単離し、外来性の系内で
この優勢な選択マーカーを発現せしめるのに有用な方法
である。広範な微生物類がアミ／ブリコンラド系抗生物
質のハイグロマイシンＢＫ感受性を有するので（Ａｂｍ
ａｄら、１９８０、Ａｎｔｉｒｎｉｃｒｏｂ、Ａｇｅｎ
ｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｃｒ、 １８ ニア８９ ：Ｍａ
ｎｎら、１９５３、Ａｎｔｉｌ〕ｉｏｔ、 ａｎｄ に
ｈｅｍｏ−ｔｂｅｒ、３ ： １２７９ ； Ｐｅｔ、
ｔｉｒ＋ｇｅｒら＋１９５３、Ａｎｔｉｌ）ｉｏｔ、
ａｎｄ （１；ｈｅｍｏｔｈｅｒ、３ ： ］ ２６８
：およびＳｉｎｇｂら、１９７９、Ｎａ１．ｕｒｅ
２７７ ： １４６）、本発明の改良されたハイグロマ
イシフＢ耐性付与遺伝子は、種々の宿主系に有効に用い
得る優勢な選択マーカーである。
は翻訳１こ関する活性素配列を単離し、外来性の系内で
この優勢な選択マーカーを発現せしめるのに有用な方法
である。広範な微生物類がアミ／ブリコンラド系抗生物
質のハイグロマイシンＢＫ感受性を有するので（Ａｂｍ
ａｄら、１９８０、Ａｎｔｉｒｎｉｃｒｏｂ、Ａｇｅｎ
ｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｃｒ、 １８ ニア８９ ：Ｍａ
ｎｎら、１９５３、Ａｎｔｉｌ〕ｉｏｔ、 ａｎｄ に
ｈｅｍｏ−ｔｂｅｒ、３ ： １２７９ ； Ｐｅｔ、
ｔｉｒ＋ｇｅｒら＋１９５３、Ａｎｔｉｌ）ｉｏｔ、
ａｎｄ （１；ｈｅｍｏｔｈｅｒ、３ ： ］ ２６８
：およびＳｉｎｇｂら、１９７９、Ｎａ１．ｕｒｅ
２７７ ： １４６）、本発明の改良されたハイグロマ
イシフＢ耐性付与遺伝子は、種々の宿主系に有効に用い
得る優勢な選択マーカーである。
本発明に於いて、ハイグロマイシンＢホスホトランスフ
ェラーゼの後方の３３８．３３９または３４０個のアミ
ノ酸群とは、天然に存在するハイグロマイシンＢホスホ
トランスフェラーゼ分子のＮ末端から、第１番目、第１
と第２番目、または第１、第２および第３番目のアミノ
酸を除く天然の配列の、ハイグロマイシンＢホスホトラ
ンスフェラーゼの全アミノ酸配列を含むポリペプチドを
意味するものとする。更に、本明７￥ｌｌＩ書で使用す
る用語は以下の定義に従うものとする。
ェラーゼの後方の３３８．３３９または３４０個のアミ
ノ酸群とは、天然に存在するハイグロマイシンＢホスホ
トランスフェラーゼ分子のＮ末端から、第１番目、第１
と第２番目、または第１、第２および第３番目のアミノ
酸を除く天然の配列の、ハイグロマイシンＢホスホトラ
ンスフェラーゼの全アミノ酸配列を含むポリペプチドを
意味するものとする。更に、本明７￥ｌｌＩ書で使用す
る用語は以下の定義に従うものとする。
組換えＤＮＡクローニングベクター７カまたは１以上の
追加のＤＮＡセグメ゛ントを付加せしめることができる
、あるいは付加せしめたＤＮＡ分子であって、自律的自
己複製能力を有する全ての本のを指し、プラスミドを含
むがこれに限定されるものではない。
追加のＤＮＡセグメ゛ントを付加せしめることができる
、あるいは付加せしめたＤＮＡ分子であって、自律的自
己複製能力を有する全ての本のを指し、プラスミドを含
むがこれに限定されるものではない。
形質転換−ＤＮＡを受容体宿主に導入し、その遺伝子形
質を変化させ、その結果、受容体細胞に変化をもたらす
ことをいう。
質を変化させ、その結果、受容体細胞に変化をもたらす
ことをいう。
機能的ポリペプチド−回収可能な、生物学的に活性であ
りかつ全体がヘテロローガス（外来性）なポリペプチド
または前駆体、あるいはヘテロローガスなポリペプチド
とホモローガス（内性）なポリペプチドの一部または全
部とから成る１回収可能で生物学的に活性なポリペプチ
ド、あるいはヘテロローガスなポリペプチドと生物学的
に不活性な、特異的）こ開裂できるホモローガスなポリ
ペプチドとから成る、回収可能な生物学的に不活性な融
合ポリペプチド。
りかつ全体がヘテロローガス（外来性）なポリペプチド
または前駆体、あるいはヘテロローガスなポリペプチド
とホモローガス（内性）なポリペプチドの一部または全
部とから成る１回収可能で生物学的に活性なポリペプチ
ド、あるいはヘテロローガスなポリペプチドと生物学的
に不活性な、特異的）こ開裂できるホモローガスなポリ
ペプチドとから成る、回収可能な生物学的に不活性な融
合ポリペプチド。
融合遺伝子産物−ホモローガスなポリペプチドの一部ま
たは全部と融合した、回収可能な、ヘテロローガスなポ
リペプチド。
たは全部と融合した、回収可能な、ヘテロローガスなポ
リペプチド。
構造遺伝子−機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝
子であるが、転写または翻訳に関する活性素配列は含ま
ないもの。
子であるが、転写または翻訳に関する活性素配列は含ま
ないもの。
本発明は、ＰＫＣ２２２の〜１．４５ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ
１制限フラグメントをＥ ｃ ｏ ＲＩ−消化プラスミ
ドｐｌＴ１２２ ｌこライゲーション（結合）させてプ
ラスミドＰＩＴ１２３ を得ることからなる、ハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェラーゼの後方の３３８個
のアミノ酸配列を、単独で、あるいは翻訳解読相内；こ
おいて転写および翻訳活性素配列−含有遺伝子または遺
伝子部分と共に暗号化しているＤＮＡ配列を含有してい
るプラスミドの調製法を提供するものである。本発明は
更に、上記ＤＮＡを含有している形質転換体を提供する
ものである。
１制限フラグメントをＥ ｃ ｏ ＲＩ−消化プラスミ
ドｐｌＴ１２２ ｌこライゲーション（結合）させてプ
ラスミドＰＩＴ１２３ を得ることからなる、ハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェラーゼの後方の３３８個
のアミノ酸配列を、単独で、あるいは翻訳解読相内；こ
おいて転写および翻訳活性素配列−含有遺伝子または遺
伝子部分と共に暗号化しているＤＮＡ配列を含有してい
るプラスミドの調製法を提供するものである。本発明は
更に、上記ＤＮＡを含有している形質転換体を提供する
ものである。
さらに詳しくは、本発明のＤＮＡは、デオキシリボヌク
レオチド配列翻訳活性素配列含有−遺伝子または遺伝子
部分を含有するものである。さらに本発明は、上記ＤＮ
Ａを含有する組換えＤＮ、Ａクローニングベクターおよ
び形質転換体を提供するものである。 Ｒ＋ｎ 工り具体的には、本発明は、式：１シ Ｙｊ ｌ Ｌｌ：、１，１−Ｕ ＬＹｂ Ｉ’ｌ比 Δ５１’
５ＥＩｔ ＶΔＬＳＥ艮Δ５１’ ＬＩｉＵ ＭＥ’
ｒ ＧＬＮ Ｌｌｉｌ’Ｌ’ＣＣ，ＧＡＣＣＣＣＧＡＡ
ＧＡＡ コ’Ｃ丁ＣＧ′ｒＧＣ丁ＴｒＣＡＧＣ’Ｉ’
ｌ’ＣＧＡＩ’ Ｇ１’ＡＣＧＡ Ｃ＋ＣＧ ＣＧ−１
’ ＧＧＡ ＴＡＩ−Ｇ’ｌ’Ｃ； ＣＹＧ ＣＧＧ
Ｇ’ｌ’Δ ＡΔ’ｌ’ ＡＧＣＩＹ；ＣＧＣＧ（Ｘ：
Ａ ’ＩｃＧ ＧＣＣＧ＋′、Ｇ Ｏ’ＣＧＣＧ Ａｒ
ｌ’ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＩＧＣＩ’ｌ’ ＧＡＣＡ’
ｌ’ＩＧＧＧ ＧＡＡ Ｔ１’ＣＡＧＯＧＡＣＡＣＣＣ
ＩＧ ＡＣＧ −１ΔＵ’ ］Ｙ；ＣΔ’Ｉ’Ｃｌ’Ｉ
Ｃ１Ｇ（：ＣＧＴ ＧＣＡ ＧＡＣ６６丁 ＣＩＣ八
ＣＧ １−ＩＴｚ ＣへＡＧΔＣＣ１’Ｇ ににｌ’
ＧＡＡ 八（尤Ａｂｌ′ 八ＬＡ ＩＬＩ！、ＡＩ−Ａ
Ａｌ−Ａ Ａｌ−Ａ ＡＳＰ ＬＩｉＬＩ ５ｌｌｔ
Ｇｉ、Ｎ −ＩＴＩＲＳＥＲＧい′１−１’ｃ （Ｘ
；Ｃ： Ｃ：ＣＡ Ｔ］’ＣＧＧＡ ＣＣら Ｃ八人
ＧＧＡ 八’Ｉ’Ｇ ＧＣＴ Ｃ八人 ＴＡＣへＣ３円
圧ＧＬＹ 円ｔ０１’１−１１シＧｌ−Ｙ Ｉ’ＲＯＧ
ＬＮ Ｇｌ−Ｙ ｌｌ−１ζＧＬＹ Ｇｌ−Ｎ ＴＹＲ
’１−１１ＲＡ（：Ａ ’ＹＧ（しく；Ｇｉ’ ＧＡ−
］”ＩＴｃ ＡＴＡ ’ＩＧＣＧｆ：Ｇ ＡＩＴ Ｇσ
ｌ’ ＧＡ’ｌ−ＣＣＣＣ；Δ丁′ロ１１ζ１−Ｒ１’
ＡＲに ＡＳＩ’ Ｉ’ｌ圧 ＪＬＩ！、ＣＹＳ Ａ
＋＋Δ １．１−１已Ａ１−ΔＡＳＰ 円ｔｒｉｌｌｓ
（、Ｉ’Ｇ Ｔｈ’ｌ’ ＣＡＣ，’］’ＧＧ ＣΔΔ
Ａｃｔ’ ＧＴＧ Ａ’１℃ＧＡＣＧＡに ＡＣＣｃ’
ｒｃ Ａ＜；−ｒＧＧに ’Ｉ’ＣＣＧ’ｌに ＧＣＧ
ＣＡＣＧ（］’ ＣＩ’ＣＧにＩ’ ＧＡＧ ＣＩＧ
Ａ’ｌＧσ１丁’１ｌ−ＧＧＧＣ（：ｌ ＧＡＧ Ｇ
Ａｃ ’ＩＧＣＣにに ＧＡＡ ＧＴＣ，ＣＧＧ ＣＡ
ＣＣ１℃Ｇ’ｌ’Ｇ ＣＡＣＧＣＧＩｌｌ Ｉｌｌ Ｉ
ｌｌ Ｉｌｌ Ｉｌｌ ＩＩＩ Ｉｌｌ Ｉｌｌ Ｉｌ
ｌ Ｉｌｌ Ｉｌｌ Ｉｌｌ ｌ１ｌＣＧＧ Ｃ１’Ｃ
ＣＩＧ ＡＣＧ ＧＧＧ に１丁ＣＣＣＧＣＣＧ−１’
Ｇ ＧＡＧ ＣＡＣに−ＩＣＧＣＧＧＧＡ八 ＧＬＵ
ＡＳＩ’ ＣＹＳ ｌ’ＲＩＪ ＧＬＩＪ ＶＡＬ Ａ
ＲＧ ｌｌｌ５ ＬｌｉＬＪ ＶＡＬ Ｉｌｌ Ｓ 八
ＬΔ（、Ａ’ｌ’ −１−１’に ＧＧＣ’１１：ＣＡ
ＡＣ八Ａ’ｌ’ ＧｒＣＣＩＧ ＡＣＣＧＡＣ： ＡＡ
Ｔ ＧＧＣＣｆ；ＣＡ−１’Ａ Ａ（：Ａ ＧＧＧ Ｇ
ＴＣ八ＴＴ ＧＡＣ’ｌＩ’ＧＧ ＡＧＣＧＡＧ ＧＣ
Ｇ Ａ’ｌＧ ’１−１’ＣＧＣＧ（；Δ’Ｉ’ ｌ’
ｃｃ にＡＡ ＴＡＣ； ＧＡＧ ＧＩ’ＣＧＣＣΔＡ
ＣＡ’ｌ’Ｃ’Ｉ’ｌ−（： ＴＩＣ’］−ＧＧ八ＣＧ
Ｃへ’Ａ ＡＧ（、Ｇ’ｌＴ Δ′１て； Ｇｌ−ｃ
ＣＡＧ （Ｘ；Ｇ −１′Ｉ′Ｇ ＴＡＣＡＡＧ 八人
Ｇ ＡＣＣ’］’ＣにＡＳＩ’５ＩｉｌｔＧ１．Ｎ’ｌ
’Ｙｌｔ（Ｈ，１％ｌ’ｌ’Ｙｌｔ’Ｉ’ＹｌｔＧｌ−
ＵＶＡＬＡｌ−八ＡＳＮＩＬＩ−１１１１１ｉ１’１ｌ
ＥＴＲＩ’Δｌ（ＧしくじＣＩＸ；Ｇ−１’ｌ”Ｃ，Ｇ
ＣＩ”ＩＧ−１−ＡＩＣＧＡＣＣＡＣ（’、ＡＧ Δし
Ｇ （ｆ、Ｃ’ｌＡＣＧ−１−１’Ｃ（ンＡＧＣＧＧＡ
ＧＧ（：ΔＩ’ＣＣＧＧＡＧＣＩＴＧにΔＧＧＡ’Ｉ’
ＣＧＣにＧにＧＧσＩＧＧＡＡ Ｒ’ 〔式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシクアニン
ル、Ｃはデオキシンチシル（ｄｅＯＸＹＣγｔｉｓ−Ｙ
ｌ）、Ｔはチミジルであり、 ｌ（およびＲ２は、独立してリジンを暗号化して０るデ
オキシリボヌクレオチドトリプレットであり、Ｒ１およ
びに３は、その含窒素塩基が、それぞれｋおよびに２の
対応する塩基と相補的であるデオキシリボヌクレオヂド
トリプレットであり、＋１１おＪ：び１１は０または１
であり（ただしｎが０のときはｍもＯてあり、Ｉｎが１
のときはｎも１である）、 １（４は翻訳停止コドンを暗号化しているデオキソリボ
ヌクレオヂドトリプレットであり、ｉｔ５はその含窒素
塩基か、Ｒ４の対応する塩基と相ｒ由的であるデオキシ
リボヌクレオチドトリプレ′ントである。〕 て示されるデオキシリボヌクレオチド配列からなるＤＮ
Ａである。
レオチド配列翻訳活性素配列含有−遺伝子または遺伝子
部分を含有するものである。さらに本発明は、上記ＤＮ
Ａを含有する組換えＤＮ、Ａクローニングベクターおよ
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’ ＧＧＡ ＴＡＩ−Ｇ’ｌ’Ｃ； ＣＹＧ ＣＧＧ
Ｇ’ｌ’Δ ＡΔ’ｌ’ ＡＧＣＩＹ；ＣＧＣＧ（Ｘ：
Ａ ’ＩｃＧ ＧＣＣＧ＋′、Ｇ Ｏ’ＣＧＣＧ Ａｒ
ｌ’ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＩＧＣＩ’ｌ’ ＧＡＣＡ’
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Ａ’ｌＧσ１丁’１ｌ−ＧＧＧＣ（：ｌ ＧＡＧ Ｇ
Ａｃ ’ＩＧＣＣにに ＧＡＡ ＧＴＣ，ＣＧＧ ＣＡ
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ル、Ｃはデオキシンチシル（ｄｅＯＸＹＣγｔｉｓ−Ｙ
ｌ）、Ｔはチミジルであり、 ｌ（およびＲ２は、独立してリジンを暗号化して０るデ
オキシリボヌクレオチドトリプレットであり、Ｒ１およ
びに３は、その含窒素塩基が、それぞれｋおよびに２の
対応する塩基と相補的であるデオキシリボヌクレオヂド
トリプレットであり、＋１１おＪ：び１１は０または１
であり（ただしｎが０のときはｍもＯてあり、Ｉｎが１
のときはｎも１である）、 １（４は翻訳停止コドンを暗号化しているデオキソリボ
ヌクレオヂドトリプレットであり、ｉｔ５はその含窒素
塩基か、Ｒ４の対応する塩基と相ｒ由的であるデオキシ
リボヌクレオチドトリプレ′ントである。〕 て示されるデオキシリボヌクレオチド配列からなるＤＮ
Ａである。
上記ＤＮＡによって暗号化されている、適当なヌクレオ
チドトリプレットに対応するアミノ酸はり、下の記号で
表わされる。即ち、Ｍ Ｅ Ｔはメチオニン、ＬＹＳは
リジン、ＰＲＯはプロジン、Ｇ Ｉ−Ｕはグルタミン酸
、ＬＥｔＪはロインン、Ｔ ＨＲはスレオニン、ＡＬＡ
はＴラニ／、ＳＥＲはセリ／、ＶＡＬはバリン、ＰＩ４
Ｅはフェニルアラニン、ｌＬＥはイソロイシン、Ｃ，Ｌ
Ｙはグリソノ、ＡＳＰはアスパラギン酸、ＧＬＮはグル
タミン、Ａ ＲＧはアルギニン、ＣＹＳはンスティ／、
ＴＩ（Ｐはトリプトファン、ＡＳＮはアスパラギン、ｌ
−１１５ハヒスチジンそしてＴＹＲはチロシンを表わす
。
チドトリプレットに対応するアミノ酸はり、下の記号で
表わされる。即ち、Ｍ Ｅ Ｔはメチオニン、ＬＹＳは
リジン、ＰＲＯはプロジン、Ｇ Ｉ−Ｕはグルタミン酸
、ＬＥｔＪはロインン、Ｔ ＨＲはスレオニン、ＡＬＡ
はＴラニ／、ＳＥＲはセリ／、ＶＡＬはバリン、ＰＩ４
Ｅはフェニルアラニン、ｌＬＥはイソロイシン、Ｃ，Ｌ
Ｙはグリソノ、ＡＳＰはアスパラギン酸、ＧＬＮはグル
タミン、Ａ ＲＧはアルギニン、ＣＹＳはンスティ／、
ＴＩ（Ｐはトリプトファン、ＡＳＮはアスパラギン、ｌ
−１１５ハヒスチジンそしてＴＹＲはチロシンを表わす
。
そのＩ（、Ｉ（１、Ｒ２、Ｒ３、餅および節が遺伝暗号
（ＷａＬｓｏｎ、Ｊ、Ｄｏ、１９７６、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ ｕｂｅ Ｇｅｎｅ、Ｗ、Ａ
＋Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｉｎｃ、、Ｍｅ ｎ ｌ 。
（ＷａＬｓｏｎ、Ｊ、Ｄｏ、１９７６、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ ｕｂｅ Ｇｅｎｅ、Ｗ、Ａ
＋Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｉｎｃ、、Ｍｅ ｎ ｌ 。
Ｉ’ａｒｋ、 Ｃａｌ ｉ［ｏｒｎｉａ）１コ従−）’
？Ｔ定められる本発明７）ＤＮＡ配列は、完全シこ保護
されたトリデオキシリボヌクレオチド組立てブロックを
用いて、改良ホスホトリエステル法により、常法ｌこ従
゛つて合成することかできる。その様な合成法は当該技
術分野て周・知てあり、ＩＬａｋ’ｕｒａら（１９７７
，５ｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６珀よびＣｒｃａら（
１９７８、Ｐｒｏｃ、ＮａＬ。
？Ｔ定められる本発明７）ＤＮＡ配列は、完全シこ保護
されたトリデオキシリボヌクレオチド組立てブロックを
用いて、改良ホスホトリエステル法により、常法ｌこ従
゛つて合成することかできる。その様な合成法は当該技
術分野て周・知てあり、ＩＬａｋ’ｕｒａら（１９７７
，５ｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６珀よびＣｒｃａら（
１９７８、Ｐｒｏｃ、ＮａＬ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７５ ： ５７６５ ）
の方法を実質」二踏襲して行うことができる。当業者な
らば、先に例示したＤＮＡ配列によって暗号化されてい
るアミノ酸と同じアミノ酸を暗号化している他のＤＮＡ
配列も合成することができるということが理解できよう
。この様な他のＤＮＡ配列は遺伝暗号の縮重を反映する
ものであり、それらもまた本発明に包含されるものであ
る。
の方法を実質」二踏襲して行うことができる。当業者な
らば、先に例示したＤＮＡ配列によって暗号化されてい
るアミノ酸と同じアミノ酸を暗号化している他のＤＮＡ
配列も合成することができるということが理解できよう
。この様な他のＤＮＡ配列は遺伝暗号の縮重を反映する
ものであり、それらもまた本発明に包含されるものであ
る。
上で定義したＤＮＡにおいて、ｍが０、Ｒ４７）ｉ Ｔ
ＡＧそして節がＡＴＣであるものは、プラスミドｐ Ｋ
Ｃ２２２を適轟に消化することによっても組立てるこ
とができる。この目的のためには、ｐ ＫＣ２２２のハ
イグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の暗
号領域の開始部位に近接したＥ−１ｐ ＩＩ！制限サイ
ト（部位〕が極めて有用である。
ＡＧそして節がＡＴＣであるものは、プラスミドｐ Ｋ
Ｃ２２２を適轟に消化することによっても組立てるこ
とができる。この目的のためには、ｐ ＫＣ２２２のハ
イグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の暗
号領域の開始部位に近接したＥ−１ｐ ＩＩ！制限サイ
ト（部位〕が極めて有用である。
即ち、プラスミドｌ） Ｋ Ｃ： ２２２をＨｐｈＩ−
Ｐｓｔｌ消化することにより、３２５ｂＰ（塩基対）（
プラス−末鎖延長部）からなり、ハイグロマイシフＢホ
スホトランスフェラーゼポリペプチドの４−１１２アミ
ノ酸を暗号化している、先端を切断さレタハイグロマイ
ソンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子が得られる。Ｈ
ｐｈｌ制限酵素によって生成したこの３′方向伸長部を
除去した後、このフラグメント１こＢａｍＨ１分子リン
カ−を結合させ、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した後、Ｂ
ａｍｌ−１１−Ｅｃ。
Ｐｓｔｌ消化することにより、３２５ｂＰ（塩基対）（
プラス−末鎖延長部）からなり、ハイグロマイシフＢホ
スホトランスフェラーゼポリペプチドの４−１１２アミ
ノ酸を暗号化している、先端を切断さレタハイグロマイ
ソンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子が得られる。Ｈ
ｐｈｌ制限酵素によって生成したこの３′方向伸長部を
除去した後、このフラグメント１こＢａｍＨ１分子リン
カ−を結合させ、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した後、Ｂ
ａｍｌ−１１−Ｅｃ。
ＲＩ消化プラスミドｐ Ｂ Ｒ３２２と結合させること
ができる。こうして得たｐＩＴ１２２と呼称されるプラ
スミドは、ハイグロマイソンＢボスホトラノスフエラー
ゼ遺伝子の一部分のみを含有しており、出発物質として
用いられる。
ができる。こうして得たｐＩＴ１２２と呼称されるプラ
スミドは、ハイグロマイソンＢボスホトラノスフエラー
ゼ遺伝子の一部分のみを含有しており、出発物質として
用いられる。
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの１１３
〜３４１番目までのアミノ酸のための暗号情報は、プラ
スミドｐＫＣ：２２２の〜１，４５ ｋ １）ＥｃｏＲ
Ｉ ７ラグメントを、適切に切り開いたプラスミｌ’ｐ
ＩＴＩ ２２にライゲート（結合）することにより得
られる。こうして得られたｐｌＴ１２３と呼称されるプ
ラスミドは、最初の９個のヌクレオチド対がＢ ａ ｍ
■−Ｉ Ｉリンカ−で置換されていることを除いて、全
てのハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ構造
遺伝子を含むものである。
〜３４１番目までのアミノ酸のための暗号情報は、プラ
スミドｐＫＣ：２２２の〜１，４５ ｋ １）ＥｃｏＲ
Ｉ ７ラグメントを、適切に切り開いたプラスミｌ’ｐ
ＩＴＩ ２２にライゲート（結合）することにより得
られる。こうして得られたｐｌＴ１２３と呼称されるプ
ラスミドは、最初の９個のヌクレオチド対がＢ ａ ｍ
■−Ｉ Ｉリンカ−で置換されていることを除いて、全
てのハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ構造
遺伝子を含むものである。
即ち、この頭部切断遺伝子は、天然の遺伝子によって暗
号化されている最初の３個のアミノ酸を欠くハイグロマ
イシンＢホスホトランスフェラーゼを暗号化している。
号化されている最初の３個のアミノ酸を欠くハイグロマ
イシンＢホスホトランスフェラーゼを暗号化している。
このプラスミドｐｌＴ１２’３の制限サイト地図（制限
酵素切断地図〕を添付の第１図に示す。
酵素切断地図〕を添付の第１図に示す。
本発明のＤＮＡを調整するのに使用することができるプ
ラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２は、〜５，８ｋｂであり、プ
ラスミドＰ’ＫＣ２０３ノ〜２．７５ ｋ ｂＳａ７？
１−Ｂｇｐ ＩＩフラグメントを、プラスミドｐ Ｋ
Ｃ７の〜４．］、 ｋ ｂ Ｓａ、／ Ｉ −Ｂ ｇ
ｌ ＩＩ７ ラクメントにライゲートすることにより得
ることができる。このプラスミドＰＫＣ２０３は〜１５
ｋｂであり、ノｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
ラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２は、〜５，８ｋｂであり、プ
ラスミドＰ’ＫＣ２０３ノ〜２．７５ ｋ ｂＳａ７？
１−Ｂｇｐ ＩＩフラグメントを、プラスミドｐ Ｋ
Ｃ７の〜４．］、 ｋ ｂ Ｓａ、／ Ｉ −Ｂ ｇ
ｌ ＩＩ７ ラクメントにライゲートすることにより得
ることができる。このプラスミドＰＫＣ２０３は〜１５
ｋｂであり、ノｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託されてお
り、その永久ストック・カルチャーコレクションの一部
となっている菌株Ｅ、 ｃｏ目ＪＲ２２５から常法に従
って単離することができる。この菌株は、寄託番号ＡＴ
ＣＣ３１９１２ノ下、プラスミドＰＫ（：２０３の好ま
しい供給源並びに保管源として、誰もが利用できる。プ
ラスミドｐ Ｋ Ｃ７は当業者によく知られており（Ａ
、ＴＣＣ３７０８４）、コレもまた、ＲａｏおよびＲｏ
ｇｅｒｓの方法（１９７９、Ｇｅｎｅ ７：７９）に従
って組立てることができる。プラスミドｐ Ｋ Ｃ２２
２およびｐＫｃ２０３１７）各々の制限サイト地図を添
付の第１図並びに第２図にそれぞれ示す。
り、その永久ストック・カルチャーコレクションの一部
となっている菌株Ｅ、 ｃｏ目ＪＲ２２５から常法に従
って単離することができる。この菌株は、寄託番号ＡＴ
ＣＣ３１９１２ノ下、プラスミドＰＫ（：２０３の好ま
しい供給源並びに保管源として、誰もが利用できる。プ
ラスミドｐ Ｋ Ｃ７は当業者によく知られており（Ａ
、ＴＣＣ３７０８４）、コレもまた、ＲａｏおよびＲｏ
ｇｅｒｓの方法（１９７９、Ｇｅｎｅ ７：７９）に従
って組立てることができる。プラスミドｐ Ｋ Ｃ２２
２およびｐＫｃ２０３１７）各々の制限サイト地図を添
付の第１図並びに第２図にそれぞれ示す。
本発明のＤＮＡは、転写および翻訳活性素配列含有遺伝
子または遺伝子部分と翻訳読みとり相内で融合させるこ
と１こより、優勢で選択可能なマーカーとして役立つ。
子または遺伝子部分と翻訳読みとり相内で融合させるこ
と１こより、優勢で選択可能なマーカーとして役立つ。
この遺伝子または遺伝子部分によって暗号化されている
アミノ酸の数は、本発明の目的を達成するのに臨界的な
ものではない。
アミノ酸の数は、本発明の目的を達成するのに臨界的な
ものではない。
細菌性遺伝子の場合には、上記の様な融合は、プラスミ
ド１Ｔ１２３の先端を欠＜ ”Ｐｈ（４）遺伝子をプラ
スミドｐＵＣ７にライゲートすることによって行なわれ
る。プラスミドｐｕｃ７は市販品から入手可能であり、
ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ（１９８２、Ｇｅｎ
ｅ ９ ： ２５９ ）の示した方法と実質的１こ同様
５こして組立てられるが、Ｅ、ｃｏｌｉ。
ド１Ｔ１２３の先端を欠＜ ”Ｐｈ（４）遺伝子をプラ
スミドｐＵＣ７にライゲートすることによって行なわれ
る。プラスミドｐｕｃ７は市販品から入手可能であり、
ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ（１９８２、Ｇｅｎ
ｅ ９ ： ２５９ ）の示した方法と実質的１こ同様
５こして組立てられるが、Ｅ、ｃｏｌｉ。
のｌａｃ Ｚ 遺伝子の１部分およびそのＩａｃオペレ
ーターおよび翻訳開始信号の下流に単一のＢａｍｌ−１
１制限部位を有している。このＩａｃＺ 遺伝子フラグ
メント内のＢａｍＨ１部位における解読枠ハ、プラスミ
ドｐ Ｉ Ｔ ］ ２３の先端切断ａｐｌｔ（４）遺伝
子に必要とされる解読枠と同じである。従って、プラス
ミドｐ Ｉ Ｔ １２３の〜１．３ ｋ ｂ ＢａｍＨ
Ｉ −Ｂｇ、／ ｎフラグメントを、ＢａｍＩ−ＩＩ消
化プラスミドｐＵＣ７＋こライゲートしてこれら２個の
遺伝子をＢａｍＨ１部位で連結すると、ハイグロマイシ
ンＢ耐性を付与することができる雑種遺伝子が得られる
。この例示組立て物は、先端切断ａｐｈ（４）遺伝子と
融合したｌａｃ Ｚの最初の１２個のアミノ酸に関する
暗号配列を含有している。こうして得られた遺伝子含有
プラスミド（ＰＩＴ１４４と命名）の制限サイト地図を
添付の第２図に示す。
ーターおよび翻訳開始信号の下流に単一のＢａｍｌ−１
１制限部位を有している。このＩａｃＺ 遺伝子フラグ
メント内のＢａｍＨ１部位における解読枠ハ、プラスミ
ドｐ Ｉ Ｔ ］ ２３の先端切断ａｐｌｔ（４）遺伝
子に必要とされる解読枠と同じである。従って、プラス
ミドｐ Ｉ Ｔ １２３の〜１．３ ｋ ｂ ＢａｍＨ
Ｉ −Ｂｇ、／ ｎフラグメントを、ＢａｍＩ−ＩＩ消
化プラスミドｐＵＣ７＋こライゲートしてこれら２個の
遺伝子をＢａｍＨ１部位で連結すると、ハイグロマイシ
ンＢ耐性を付与することができる雑種遺伝子が得られる
。この例示組立て物は、先端切断ａｐｈ（４）遺伝子と
融合したｌａｃ Ｚの最初の１２個のアミノ酸に関する
暗号配列を含有している。こうして得られた遺伝子含有
プラスミド（ＰＩＴ１４４と命名）の制限サイト地図を
添付の第２図に示す。
平滑末端を有するＨｐｈｌ−消化プラスミドｐＩＴ１０
４を、同じく平滑末端を有するＨｉｎｃ ＩＩ−消化プ
ラスミドＰＵＣ８１こライゲートすることにより、同様
のプラスミド（ｐＫｃ３０７と命名）を組立てた。プラ
スミドｐｔｒｃＢはｐｔｒｃ７と類似しており、これも
また市販されており、ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎ
ｇ（１９８２）の方法に従って組立てられる。
４を、同じく平滑末端を有するＨｉｎｃ ＩＩ−消化プ
ラスミドＰＵＣ８１こライゲートすることにより、同様
のプラスミド（ｐＫｃ３０７と命名）を組立てた。プラ
スミドｐｔｒｃＢはｐｔｒｃ７と類似しており、これも
また市販されており、ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎ
ｇ（１９８２）の方法に従って組立てられる。
本発明のＤＮＡは真核性遺伝子または遺伝子部分、例え
ばＩｎｇｏｌ ｉａ ら（１９８２、Ｍｏ１．ａｎｄＣ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ、２ ： １３８８ ）が開
示したイースト（酵母）・ヒート・ショック遺伝子（Ｙ
Ｇｌｏｌ）と融合することもできる。ＹＧｌｏｌの転写
および翻訳活性素配列をプラスミドＩ） Ｉ Ｔ １１
８の７５ Ｑ ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ フラグ
メント上に移動させることができるので、この融合は特
に有用である。そのためには、まず前述の転写および翻
訳活性素配列含有フラグメントをＢａｍ１（１制限プラ
スミドルＭｃ１５８７にライゲートした中間体プラスミ
ドｐｌＴ２０７ を組立てる。次いでプラスミドｐＩＴ
１２３の〜１．３ ｋｂ Ｂａｍ１−１１− Ｂｇｌ
１１７ ラグメ７１−をＢａｍＨＩ−消化プラスミドＰ
ＩＴ２０７にライゲートし、２機能性プラスミドル Ｉ
Ｔ ２０８を得る。プラスミドｐｌＴ２０８はＩＥ、
ｃｏｌ ｉ内で選択可能であり、酵母に抗生物質ハイ
グロマイシンＢに対する耐性を付与することができる。
ばＩｎｇｏｌ ｉａ ら（１９８２、Ｍｏ１．ａｎｄＣ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ、２ ： １３８８ ）が開
示したイースト（酵母）・ヒート・ショック遺伝子（Ｙ
Ｇｌｏｌ）と融合することもできる。ＹＧｌｏｌの転写
および翻訳活性素配列をプラスミドＩ） Ｉ Ｔ １１
８の７５ Ｑ ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ フラグ
メント上に移動させることができるので、この融合は特
に有用である。そのためには、まず前述の転写および翻
訳活性素配列含有フラグメントをＢａｍ１（１制限プラ
スミドルＭｃ１５８７にライゲートした中間体プラスミ
ドｐｌＴ２０７ を組立てる。次いでプラスミドｐＩＴ
１２３の〜１．３ ｋｂ Ｂａｍ１−１１− Ｂｇｌ
１１７ ラグメ７１−をＢａｍＨＩ−消化プラスミドＰ
ＩＴ２０７にライゲートし、２機能性プラスミドル Ｉ
Ｔ ２０８を得る。プラスミドｐｌＴ２０８はＩＥ、
ｃｏｌ ｉ内で選択可能であり、酵母に抗生物質ハイ
グロマイシンＢに対する耐性を付与することができる。
この様に、このプラスミドは本発明の代表例である。こ
のプラスミドＰＩＴ２０８の制限サイト地図を添付の第
３図に示す。
のプラスミドＰＩＴ２０８の制限サイト地図を添付の第
３図に示す。
同じ＜ Ｉｎｇｏｌｉａらの開示（１９８２）Ｌ、たヒ
ート、ショック遺伝子（ＹＧｌｏｏ）も、同様に有用な
翻訳融合物の組立てに用いることができる。
ート、ショック遺伝子（ＹＧｌｏｏ）も、同様に有用な
翻訳融合物の組立てに用いることができる。
これは、プラスミドｐｌＴ１２０の、転写および翻訳活
性素配列含有〜１ ｋ ｂ ＢａｍＨＩ −Ｂｇｊ’
ＩＩフラグメ／Ｉ−を、ＢａｍＨｉ−消化プラスミドｐ
ｌＴ２１３１こライゲートすることによって行われる。
性素配列含有〜１ ｋ ｂ ＢａｍＨＩ −Ｂｇｊ’
ＩＩフラグメ／Ｉ−を、ＢａｍＨｉ−消化プラスミドｐ
ｌＴ２１３１こライゲートすることによって行われる。
後者のプラスミドは、既知のプラスミドｐＲＪ３５、カ
ナマイシン耐性遺伝子、および前述したプラスミＦｐｌ
Ｔ１２３の先端切断ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子含有
〜１．３ ｋ ｂ ＢａｍＨＩ −Ｂｇ、Ｉ！ＩＩ ７
ラグメントを含有している。また、ｂｓｃｌｏＯ転写お
よび翻訳活性素配列を得ることができるプラスミドｐ
Ｉ Ｔ １２０は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｐｅｏｒ
ｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓに寄託されその永久ストック
カルチャー・コレクションの一部となっている菌株Ｅ、
ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／Ｐ ＩＴＩ ２０か
ら常法通りに単離することができる。この菌株は、該プ
ラスミドの好ましい供給源および保管源として寄託番号
ＮＲＲＬＢ−１５６０３の下に誰でも入手することがで
きる。
ナマイシン耐性遺伝子、および前述したプラスミＦｐｌ
Ｔ１２３の先端切断ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子含有
〜１．３ ｋ ｂ ＢａｍＨＩ −Ｂｇ、Ｉ！ＩＩ ７
ラグメントを含有している。また、ｂｓｃｌｏＯ転写お
よび翻訳活性素配列を得ることができるプラスミドｐ
Ｉ Ｔ １２０は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｐｅｏｒ
ｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓに寄託されその永久ストック
カルチャー・コレクションの一部となっている菌株Ｅ、
ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／Ｐ ＩＴＩ ２０か
ら常法通りに単離することができる。この菌株は、該プ
ラスミドの好ましい供給源および保管源として寄託番号
ＮＲＲＬＢ−１５６０３の下に誰でも入手することがで
きる。
上記の、ｐ ｌ Ｔ １２０とｐｌＴ２１３フラグメン
トとのライゲーションによって代表的プラスミドである
２機能性プラスミドル Ｉ Ｔ ２ ｉ ７が得られる
。このプラスミドｐＩＴ２１７はＥ、ｃｏｌｉ内で選択
可能であり、酵母にハイグロマイシン１３耐性を付与す
ることができ、かくしてこれもまた本発明を例示するも
のである。
トとのライゲーションによって代表的プラスミドである
２機能性プラスミドル Ｉ Ｔ ２ ｉ ７が得られる
。このプラスミドｐＩＴ２１７はＥ、ｃｏｌｉ内で選択
可能であり、酵母にハイグロマイシン１３耐性を付与す
ることができ、かくしてこれもまた本発明を例示するも
のである。
当業者ならば、前述のＢ ａ ｍｌ−１１−消化プラス
ミドｐ Ｉ Ｔ ２１３とプラスミドｐ ＩＴＩ １８
の７５０ｂｐ Ｂａｍ１（Ｉ −ＢｇＪ ｎ フラグメ
ントのライゲーションによっても、本発明の技術的範囲
内ｌこある代表的な融合物が得られるということが理解
されよう。こうして得られたｐｌＴ２１５と呼称される
プラスミドはＥ、ＣＯＩ ｉ内で選択可能であり、酵母
にハイグロマイシンＢ耐性を付与する。さらに様々な遺
伝子を用いて組立てを行うことができる。
ミドｐ Ｉ Ｔ ２１３とプラスミドｐ ＩＴＩ １８
の７５０ｂｐ Ｂａｍ１（Ｉ −ＢｇＪ ｎ フラグメ
ントのライゲーションによっても、本発明の技術的範囲
内ｌこある代表的な融合物が得られるということが理解
されよう。こうして得られたｐｌＴ２１５と呼称される
プラスミドはＥ、ＣＯＩ ｉ内で選択可能であり、酵母
にハイグロマイシンＢ耐性を付与する。さらに様々な遺
伝子を用いて組立てを行うことができる。
例えば、プラスミドｐＩＴ１４３の転写および翻訳活性
素配列−含有２３０ ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントを
ＢａｍＨＩ−消化プラスミドｐ ＩＴ２１３にライゲー
トすることにより、真核性ホスホグリセレートキナーゼ
遺伝子（ＰＧＫ）と本発明の先端切断ハイグロマイシン
Ｂ耐性付与ＤＮＡとを融合することができる。ＰＫＧ転
写および翻訳活性素配列の供給源であるプラスミドｐｌ
Ｔ１４３は、プラスミドｐＩＴ１４１の９５８ｂｐＣ１
！ａＩ −ＨｌＨｃＩＩ フラグメントを制限酵素Ｍｂ
ｏＩＩで消化し、生じた延長部分をＤＮＡポリメラーゼ
のフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントで切断し、配
列：ＴＣ，ＧＡＴＣＣＡを持ったＢａｍＨＩリンカ−を
結合させ、次いで、このリンカ−含有フラグメントをＢ
ａ ｍＨＩ−消化プラスミドｐＵＣ３にライゲートす
ることによって組立てられる。プラスミドｐｔＴ１４３
の組立てに用いられるこの全ＰＧＫ遺伝子を持ったプラ
スミドｐ ＩＴＩ ４１は、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｂｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋
Ｐｅｏｒｉａ。
素配列−含有２３０ ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントを
ＢａｍＨＩ−消化プラスミドｐ ＩＴ２１３にライゲー
トすることにより、真核性ホスホグリセレートキナーゼ
遺伝子（ＰＧＫ）と本発明の先端切断ハイグロマイシン
Ｂ耐性付与ＤＮＡとを融合することができる。ＰＫＧ転
写および翻訳活性素配列の供給源であるプラスミドｐｌ
Ｔ１４３は、プラスミドｐＩＴ１４１の９５８ｂｐＣ１
！ａＩ −ＨｌＨｃＩＩ フラグメントを制限酵素Ｍｂ
ｏＩＩで消化し、生じた延長部分をＤＮＡポリメラーゼ
のフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントで切断し、配
列：ＴＣ，ＧＡＴＣＣＡを持ったＢａｍＨＩリンカ−を
結合させ、次いで、このリンカ−含有フラグメントをＢ
ａ ｍＨＩ−消化プラスミドｐＵＣ３にライゲートす
ることによって組立てられる。プラスミドｐｔＴ１４３
の組立てに用いられるこの全ＰＧＫ遺伝子を持ったプラ
スミドｐ ＩＴＩ ４１は、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｂｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋
Ｐｅｏｒｉａ。
１１１ｉｎｏｉｓに寄託され、その永久ストック・カル
チャー・コレクションの一部となっている菌株、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐｌＴ１４１ から常法
通り、分離することができる。この菌株は、該プラスミ
ドの好ましい供給源および保管源として、寄託番号Ｎ１
ｔＲＬ Ｂ−１５６０２の下、誰でも利用することがで
きる。
チャー・コレクションの一部となっている菌株、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐｌＴ１４１ から常法
通り、分離することができる。この菌株は、該プラスミ
ドの好ましい供給源および保管源として、寄託番号Ｎ１
ｔＲＬ Ｂ−１５６０２の下、誰でも利用することがで
きる。
以上の各側で示した細菌性１ａｃ Ｚ、並びに真菌性の
ＰＧＫ、ＹＧＩ ００およびＹＧＩＯＩ遺伝子を、広範
な種類の遺伝子または遺伝子部分と置き換えることがで
きるということは、当業者には理解されよう。その様な
遺伝子または遺伝子部分に暗号化されているアミノ酸の
数は本発明の目的を達成する上で重要な問題ではない。
ＰＧＫ、ＹＧＩ ００およびＹＧＩＯＩ遺伝子を、広範
な種類の遺伝子または遺伝子部分と置き換えることがで
きるということは、当業者には理解されよう。その様な
遺伝子または遺伝子部分に暗号化されているアミノ酸の
数は本発明の目的を達成する上で重要な問題ではない。
その他の遺伝子には、以下の供給源から得られる遺伝子
が含まれる： ｌ） Ｅ、ｃｏ目から、例えばｔｒｐＥ
遺伝子お裏びリポタンパク遺伝子； ２） Ｓａｃｃｈ
ａｒｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ−ｖｉｓｉａｅから、例えば
α因子遺伝子： ３）Ｂａｃｉｌｌｕｓから、例えばα
−アミラーゼ遺伝子および５ｐｏＶＧ遺伝子； Ｊ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙＣｅｓから、例えばチオストレプトン
耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、およびバイオマ
イシン耐性遺伝子；５ンウイルスまたはバタテリオファ
ージから、例えばλＰＬ プロモーターおよびλＰＲプ
ロモーターによって転写される遺伝子；６）＠乳動物か
ら、例えはチミジン・キナーゼ遺伝子およびジヒドロフ
オレート・リダクターゼ遺伝子；７）植物から、例えば
オクトピン合成酵素遺伝子およびツバリン合成酵素遺伝
子。
が含まれる： ｌ） Ｅ、ｃｏ目から、例えばｔｒｐＥ
遺伝子お裏びリポタンパク遺伝子； ２） Ｓａｃｃｈ
ａｒｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ−ｖｉｓｉａｅから、例えば
α因子遺伝子： ３）Ｂａｃｉｌｌｕｓから、例えばα
−アミラーゼ遺伝子および５ｐｏＶＧ遺伝子； Ｊ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙＣｅｓから、例えばチオストレプトン
耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、およびバイオマ
イシン耐性遺伝子；５ンウイルスまたはバタテリオファ
ージから、例えばλＰＬ プロモーターおよびλＰＲプ
ロモーターによって転写される遺伝子；６）＠乳動物か
ら、例えはチミジン・キナーゼ遺伝子およびジヒドロフ
オレート・リダクターゼ遺伝子；７）植物から、例えば
オクトピン合成酵素遺伝子およびツバリン合成酵素遺伝
子。
上記の遺伝子群は、適当な制限酵素および／またはＢａ
ｌ！３１ヌクレアーゼで処理して先端を切断し、次いで
、便利さおよび所望する融合に応じて、分子リンカ−を
結合させる。分子リンカ−は市販品から入手できるが、
特殊な、または一般的でない遺伝子融合を希望する場合
には、ＩＬａｋｕｒａ ら（１９７７）、およびＣｒｅ
ａら（１９７８）（７）方法【こ従って組立てることが
できる。特に有用な融合産物は、プラスミドｐＩＴ１２
３の〜１．３ｋｂ先端切断ａＰｈ（４）遺伝子含有フラ
グメントを、プラスミドｐ ＩＡ７Δ４△１の〜４，５
ｋｂ−ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ！ＩＩ フラグメントにラ
イゲートすることによって得られる。後者のフラグメン
トは、転写および翻訳活性素配列、並びに細菌性Ｕｒｐ
ＬＥ’遺伝子の１５個のアミノ酸の暗号領域を含有して
いる。上記のライゲーションにより、代表的な〜５，８
ｋｂプラスミドｐＩＴ１２．５が得られる。
ｌ！３１ヌクレアーゼで処理して先端を切断し、次いで
、便利さおよび所望する融合に応じて、分子リンカ−を
結合させる。分子リンカ−は市販品から入手できるが、
特殊な、または一般的でない遺伝子融合を希望する場合
には、ＩＬａｋｕｒａ ら（１９７７）、およびＣｒｅ
ａら（１９７８）（７）方法【こ従って組立てることが
できる。特に有用な融合産物は、プラスミドｐＩＴ１２
３の〜１．３ｋｂ先端切断ａＰｈ（４）遺伝子含有フラ
グメントを、プラスミドｐ ＩＡ７Δ４△１の〜４，５
ｋｂ−ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ！ＩＩ フラグメントにラ
イゲートすることによって得られる。後者のフラグメン
トは、転写および翻訳活性素配列、並びに細菌性Ｕｒｐ
ＬＥ’遺伝子の１５個のアミノ酸の暗号領域を含有して
いる。上記のライゲーションにより、代表的な〜５，８
ｋｂプラスミドｐＩＴ１２．５が得られる。
前述の、その他の先端切断遺伝子を、分子リンカ−を使
用、または使用することなく、本発明の先端切断ａＰｈ
（４）遺伝子と融合させると本発明の範囲に含まれる代
表的なベクターが得られることは、当業者ならば理解で
きるであろう。
用、または使用することなく、本発明の先端切断ａＰｈ
（４）遺伝子と融合させると本発明の範囲に含まれる代
表的なベクターが得られることは、当業者ならば理解で
きるであろう。
本発明のＤＮＡを含有するベクター類は以下の条件を満
たす限り、あらゆるハイグロマイシンＢ感受性宿主細胞
に使用することができる：１）該ベクターが宿主細胞内
で複製されるか、もしくは宿主細胞の染色体に組み込ま
れること；２）先端切断ａｐｂ（４）遺伝子と融合した
遺伝子が宿主細胞内で発現されること：および３）宿主
細胞が形質転換され得ること。代表的な、特に重要な宿
主細胞には、例えば、児、五隻すュ、占、−！すｊ工に
１２、丑！１±に１２ ＪＡ２２１、上、−８月工に１
２ ＨＢＩＯＩ 、互、ｃｏｌｉ Ｋ１２咄乳類の＃１
胞および植物細胞、特にＡｎｇｉｏｓｐｅｒ−ｍｏｕｓ
細胞が含まれる。さらに、本発明のＤＮＡを含むベクタ
ー類で形質転換されたその他の宿主細胞もまた本発明に
包含されることは、当業者ならば容易に理解し得るであ
ろう。
たす限り、あらゆるハイグロマイシンＢ感受性宿主細胞
に使用することができる：１）該ベクターが宿主細胞内
で複製されるか、もしくは宿主細胞の染色体に組み込ま
れること；２）先端切断ａｐｂ（４）遺伝子と融合した
遺伝子が宿主細胞内で発現されること：および３）宿主
細胞が形質転換され得ること。代表的な、特に重要な宿
主細胞には、例えば、児、五隻すュ、占、−！すｊ工に
１２、丑！１±に１２ ＪＡ２２１、上、−８月工に１
２ ＨＢＩＯＩ 、互、ｃｏｌｉ Ｋ１２咄乳類の＃１
胞および植物細胞、特にＡｎｇｉｏｓｐｅｒ−ｍｏｕｓ
細胞が含まれる。さらに、本発明のＤＮＡを含むベクタ
ー類で形質転換されたその他の宿主細胞もまた本発明に
包含されることは、当業者ならば容易に理解し得るであ
ろう。
本発明においては、あらゆる態様が有用であるが、その
内いくつかのＤＮＡ配列、クローニングベクター、およ
び形質転換体が特に好ましい。すなわち、好ましいＤＮ
Ａ配列はプラスミドｐＩＴ１２３の〜ｌ、 ３ ｋ ｂ
ＢａｍＨｌ −ＢｇｊＩＩ フラグメントであって、
式： （式中、Ａはデオキソアデニル、Ｇはデオキソアデニル
、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示されるものであり、好ましいプラスミドは、プラス
ミドｐ ｌＴ１２３、ｐｌＴ１２５、ｐＫｃ３０７、ｐ
ｌＴ２０８、ｐＩＴ２１５、ｐｌＴ２１７、・Ｐ汀２１
９、およびｐｌ″ｒ１４４てあり、好ましい形質転換体
は、Ｅ、ｃｏｌ±に１２ ＪΔ２２１／ＰＩＴ１２３、
愚、−鵠月ユに１２ ＪＡ２２１／ＰＩＴ１２５、ム、
ｃｏｌ尤に１２ ＪＡ２２１／ｐＫｃ３０７、亙、−９
月−に１２ＪＡ２２１／ＰＩＴ２０８、しμｍ上に１２
ＪＡ２２１／ＰＩＴ２１５、ム、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２
ＪＡ２２１／ＰＩＴ２１７、見通ヅエに１２ ＪＡ２２
１／ＰＩＴ２１９、易、２旦Ｋ］２ ＪＡ２２１／ＰＩ
Ｔ１４４およびＳａｃｃｌｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉリド７ｐ ｌＴ２Ｏ８、である。
内いくつかのＤＮＡ配列、クローニングベクター、およ
び形質転換体が特に好ましい。すなわち、好ましいＤＮ
Ａ配列はプラスミドｐＩＴ１２３の〜ｌ、 ３ ｋ ｂ
ＢａｍＨｌ −ＢｇｊＩＩ フラグメントであって、
式： （式中、Ａはデオキソアデニル、Ｇはデオキソアデニル
、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示されるものであり、好ましいプラスミドは、プラス
ミドｐ ｌＴ１２３、ｐｌＴ１２５、ｐＫｃ３０７、ｐ
ｌＴ２０８、ｐＩＴ２１５、ｐｌＴ２１７、・Ｐ汀２１
９、およびｐｌ″ｒ１４４てあり、好ましい形質転換体
は、Ｅ、ｃｏｌ±に１２ ＪΔ２２１／ＰＩＴ１２３、
愚、−鵠月ユに１２ ＪＡ２２１／ＰＩＴ１２５、ム、
ｃｏｌ尤に１２ ＪＡ２２１／ｐＫｃ３０７、亙、−９
月−に１２ＪＡ２２１／ＰＩＴ２０８、しμｍ上に１２
ＪＡ２２１／ＰＩＴ２１５、ム、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２
ＪＡ２２１／ＰＩＴ２１７、見通ヅエに１２ ＪＡ２２
１／ＰＩＴ２１９、易、２旦Ｋ］２ ＪＡ２２１／ＰＩ
Ｔ１４４およびＳａｃｃｌｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉリド７ｐ ｌＴ２Ｏ８、である。
本発明のＤＮＡは、ホモローガス（Ｅ、ｃｏｌｉ）な系
、並びにヘテロローガス（非Ｅ、ｃｏｌｉ ）な系のい
ずれにおいても選択マーカーとして有用であり、従って
、これにより種々の異なる性質の宿主細胞に遺伝子をク
ローンするための選択可能なビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ
） を組立てることができる。本発明に係るＤＮＡの、
抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与し得る能力は、
形質転換体を選択するための機能テストに役立つ。この
ことは、ベクターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し
、選択するという実用上の必要性から、重要な点である
。その存在に関する機能試験法のない他のＤＮＡセグメ
ントをベクターに挿入し、この非選択性のＤＮＡを含有
する形質転換体を抗生物質ハイ１０フ４２フ８選別法に
従って分離することができる。その の様な非選択的なりＮＡ上セグメントは、以下物△ 質を指定している遺伝子が含まれる：ヒトインソユリン
Ａ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、ヒトプロインシュリン、
ヒトプレプロインシュリン、ヒト成長ホルモン、ウシ成
長ホルモン、ブタ成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒ
トインターフェロ／並びに非−ヒトインターフェロン（
ただしこれら薔こ限定されるものではない〕。
、並びにヘテロローガス（非Ｅ、ｃｏｌｉ ）な系のい
ずれにおいても選択マーカーとして有用であり、従って
、これにより種々の異なる性質の宿主細胞に遺伝子をク
ローンするための選択可能なビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ
） を組立てることができる。本発明に係るＤＮＡの、
抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性を付与し得る能力は、
形質転換体を選択するための機能テストに役立つ。この
ことは、ベクターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し
、選択するという実用上の必要性から、重要な点である
。その存在に関する機能試験法のない他のＤＮＡセグメ
ントをベクターに挿入し、この非選択性のＤＮＡを含有
する形質転換体を抗生物質ハイ１０フ４２フ８選別法に
従って分離することができる。その の様な非選択的なりＮＡ上セグメントは、以下物△ 質を指定している遺伝子が含まれる：ヒトインソユリン
Ａ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、ヒトプロインシュリン、
ヒトプレプロインシュリン、ヒト成長ホルモン、ウシ成
長ホルモン、ブタ成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒ
トインターフェロ／並びに非−ヒトインターフェロン（
ただしこれら薔こ限定されるものではない〕。
より詳しくは、ある遺伝子を含む選択不可能なりＮＡ上
セグメントプラスミド、例えば代表的なプラスミドであ
るＰ ＩＴＩ ４４またはｐ Ｉ Ｔ２Ｏ８に挿入する
。選択不可能なりＮＡは、ｐｌＴ１４４をＳａｌ！ｌテ
部分消化した後、該ｐ Ｉ Ｔｌ ４４のＥＣ０ＲＩ
部位に挿入するか、あるいはＰ］Ｔ２Ｏ８のＳｍａ Ｉ
部位に挿入することができる。所望の形質転換体の同
定は、ライゲーション混合物によって形質転換された細
胞を、ニック翻訳プローブを用いたコロニーハイブリダ
イゼーションによって行なう。選択不可能なりＮＡの存
在を確認した後、該ベクターをＥ、 ｃｏｌ ｉ内でさ
らに増幅させ、次いで、例えばプラスミドｐＩＴ２０Ｂ
の場合には、酵母に導入する。酵母形質転換体は、抗生
物質ハイグロマイシンＢの選択によって容易に同定する
ことができる。従って、この抗生物質耐性に基づく選択
能により興味の対象である特定の選択不可能なりＮＡを
含有する極めて稀有な細胞を効果的に単離することがで
きる。
セグメントプラスミド、例えば代表的なプラスミドであ
るＰ ＩＴＩ ４４またはｐ Ｉ Ｔ２Ｏ８に挿入する
。選択不可能なりＮＡは、ｐｌＴ１４４をＳａｌ！ｌテ
部分消化した後、該ｐ Ｉ Ｔｌ ４４のＥＣ０ＲＩ
部位に挿入するか、あるいはＰ］Ｔ２Ｏ８のＳｍａ Ｉ
部位に挿入することができる。所望の形質転換体の同
定は、ライゲーション混合物によって形質転換された細
胞を、ニック翻訳プローブを用いたコロニーハイブリダ
イゼーションによって行なう。選択不可能なりＮＡの存
在を確認した後、該ベクターをＥ、 ｃｏｌ ｉ内でさ
らに増幅させ、次いで、例えばプラスミドｐＩＴ２０Ｂ
の場合には、酵母に導入する。酵母形質転換体は、抗生
物質ハイグロマイシンＢの選択によって容易に同定する
ことができる。従って、この抗生物質耐性に基づく選択
能により興味の対象である特定の選択不可能なりＮＡを
含有する極めて稀有な細胞を効果的に単離することがで
きる。
上記のハイグロマイシンＢ耐性についての機能試験は、
遺伝子の発現を指令するためのコントロール要素として
作用し得るＤＮＡセグメントの同定ニモ利用することが
できる。その様なセグメント類は、プロモーター、アテ
ニュエイター、リプレッサー、インデューサー、リポソ
ーム結合部位などを含み（ただしこれらに限定されない
）、経済的に重要性のある遺伝子の発現をコントロール
するのに使用される。加えて、本発明は、複製起源の単
離並びに同定にも有用である。この利用方法は、ＤＮＡ
フラグメントを本発明のａｐｈ（４）遺伝子融合物を含
有するベクターにクローニングし、次いでハイグロマイ
シンＢを選別しつる条件下で、適当な宿主細胞に形質転
換することによって実施される。ハイグロマイシンＢ耐
性細胞を選択することができ、かくして、Ｅ、ｃｏｌｉ
の形質転換に用いたこのＤＮＡは、事実上懸案のどの様
な微生物の中からも、レプリコンを容易に単離せしめる
のに役立つ。
遺伝子の発現を指令するためのコントロール要素として
作用し得るＤＮＡセグメントの同定ニモ利用することが
できる。その様なセグメント類は、プロモーター、アテ
ニュエイター、リプレッサー、インデューサー、リポソ
ーム結合部位などを含み（ただしこれらに限定されない
）、経済的に重要性のある遺伝子の発現をコントロール
するのに使用される。加えて、本発明は、複製起源の単
離並びに同定にも有用である。この利用方法は、ＤＮＡ
フラグメントを本発明のａｐｈ（４）遺伝子融合物を含
有するベクターにクローニングし、次いでハイグロマイ
シンＢを選別しつる条件下で、適当な宿主細胞に形質転
換することによって実施される。ハイグロマイシンＢ耐
性細胞を選択することができ、かくして、Ｅ、ｃｏｌｉ
の形質転換に用いたこのＤＮＡは、事実上懸案のどの様
な微生物の中からも、レプリコンを容易に単離せしめる
のに役立つ。
本発明の耐性付与ベクターは、結合したＩ）ＮΔフラグ
メントがＥ、ｃｏ目、イースト、その他の形質転換体中
に安定に保持されていることを保証するのにも有用であ
る。本発明のａｐＨ（４）遺伝子融合物に共有結合によ
って結合したこれらの遺伝子またはＤＮＡフラグメント
は、その形質転換体を、形質転換されていない細胞にと
っては毒性を示す様な濃度のハイグロマイシンＢにさら
すことによって保持される。それ故、このベクターを欠
く形質転換体、従って共有結合で結合しているこのＤＮ
Ａを失なったものは増殖できず、培地から消失してしま
う。このことは、最大限の生産発現効率が望まれる大規
模発酵の場合に、特に重要である。
メントがＥ、ｃｏ目、イースト、その他の形質転換体中
に安定に保持されていることを保証するのにも有用であ
る。本発明のａｐＨ（４）遺伝子融合物に共有結合によ
って結合したこれらの遺伝子またはＤＮＡフラグメント
は、その形質転換体を、形質転換されていない細胞にと
っては毒性を示す様な濃度のハイグロマイシンＢにさら
すことによって保持される。それ故、このベクターを欠
く形質転換体、従って共有結合で結合しているこのＤＮ
Ａを失なったものは増殖できず、培地から消失してしま
う。このことは、最大限の生産発現効率が望まれる大規
模発酵の場合に、特に重要である。
発明の作用効果
本発明のＤＮＡ、クローニングベクター、並びに形質転
換体は、例えば、ヒトインシュリン１ｍ、ヒトインシュ
リンＢ鎖、ヒトプロインツユリン、ヒトプレプロインシ
ュリン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホルモン、ヒト
および非ヒトインターフェロンなど；商業的１こ重要な
行程または化合物を生ぜしめるような代謝経路における
酵素様機能物質；遺伝子の発現またはベクター類の複製
を改良するコントロール要素：あるいは、学問上のまた
は商業上の価値ある、生理的に活性な酵素類、などの、
特定の機能を有するポリペプチドまたは遺伝子融合物を
直接または間接的に暗号化している遺伝子をクローニン
グするのに、特ｆこ有用である。酵素様機能物質を暗号
化しているＤＮＡ配列の例として、セファロスポリン系
抗生物質、アクタプラニン、ペニシリン、ペニシリン誘
導体およびチロシンの合成において触媒作用を示す酵素
類の暗号配列などが含まれる（ただしこれらに限定され
るものではない）。当業者ならば、本発明は広範囲に適
用し得るものであり、上て明示した特定の遺伝子のクロ
ーニングに限定されるものでないということを容易に理
解するであろう。以下に実施例を挙げて、本発明をさら
に詳細に説明する。
換体は、例えば、ヒトインシュリン１ｍ、ヒトインシュ
リンＢ鎖、ヒトプロインツユリン、ヒトプレプロインシ
ュリン、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホルモン、ヒト
および非ヒトインターフェロンなど；商業的１こ重要な
行程または化合物を生ぜしめるような代謝経路における
酵素様機能物質；遺伝子の発現またはベクター類の複製
を改良するコントロール要素：あるいは、学問上のまた
は商業上の価値ある、生理的に活性な酵素類、などの、
特定の機能を有するポリペプチドまたは遺伝子融合物を
直接または間接的に暗号化している遺伝子をクローニン
グするのに、特ｆこ有用である。酵素様機能物質を暗号
化しているＤＮＡ配列の例として、セファロスポリン系
抗生物質、アクタプラニン、ペニシリン、ペニシリン誘
導体およびチロシンの合成において触媒作用を示す酵素
類の暗号配列などが含まれる（ただしこれらに限定され
るものではない）。当業者ならば、本発明は広範囲に適
用し得るものであり、上て明示した特定の遺伝子のクロ
ーニングに限定されるものでないということを容易に理
解するであろう。以下に実施例を挙げて、本発明をさら
に詳細に説明する。
本発明の解説並びにその組立て方法は、それぞれ適当な
箇所に記述されている。
箇所に記述されている。
実施例１ プラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２出発物質ノ組立
て Ａ、プラスミドｐＫｃ：２０３の単離、並びにｌ１ｃｏ
ｔｉ Ｋ１２ ＢＥ８２７／ｐＫｃ２０３ ｃ７）組立
てバクテリアの１！、、ｃｏｌ ｉ ＪＲ２２５（ＡＴ
ＣＣ／Ｋ ３１９１２）を、１００μｆ／／ｍｔ の抗
生物質ハイグロマイシンＢを含んだＴＹブロス（１％ト
リプトン１．５％酵母エキス１，５φ塩化す計すウム、
ｐ１４７）中、通常の微生物学的手法に従って培養した
。１８時間インキュベートした後、培養物約、５ｉを１
．５−のエッペンドルフチューブに移し、約１５秒間遠
心した。特に明記しない限り、全ての操作は周囲温度で
行なった。生成した上澄液を先端の細いＴスピレーター
を用いて注意深く取り除き、細胞ペレットを、２■／ｄ
のりゾチーム、５ＱｍＭグルコーヌ、１０ ｍＭ ＧＤ
ＴＡ （シクロヘキサンジアミンテトラアセテート〕お
よび２５ｍＭ トリスｆｊＡｅ （ｐＨ８，０）を含有
する調製したはかりのりゾチーム溶液約１００μｌに懸
濁した。０℃で約３０分間インキュベートした後、アル
カリ性５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液（，２Ｎ
ＮａＯＨ２１チ５ＤＳ）約２００μｅを加え、チュー
ブをゆっくり回転させ、１５分間Ｏ℃に保った。次いで
、酢酸ナトリウム３モルを最少量の水に溶かし、氷酢酸
でｐＨ４，８に調節し、容量を１１に調節することによ
り調製した３Ｍ酢酸ナトリウム１５〇−を加え、次いて
チューブの内容物を、該チューブを数秒間静かに転倒さ
せることにより混合した。
て Ａ、プラスミドｐＫｃ：２０３の単離、並びにｌ１ｃｏ
ｔｉ Ｋ１２ ＢＥ８２７／ｐＫｃ２０３ ｃ７）組立
てバクテリアの１！、、ｃｏｌ ｉ ＪＲ２２５（ＡＴ
ＣＣ／Ｋ ３１９１２）を、１００μｆ／／ｍｔ の抗
生物質ハイグロマイシンＢを含んだＴＹブロス（１％ト
リプトン１．５％酵母エキス１，５φ塩化す計すウム、
ｐ１４７）中、通常の微生物学的手法に従って培養した
。１８時間インキュベートした後、培養物約、５ｉを１
．５−のエッペンドルフチューブに移し、約１５秒間遠
心した。特に明記しない限り、全ての操作は周囲温度で
行なった。生成した上澄液を先端の細いＴスピレーター
を用いて注意深く取り除き、細胞ペレットを、２■／ｄ
のりゾチーム、５ＱｍＭグルコーヌ、１０ ｍＭ ＧＤ
ＴＡ （シクロヘキサンジアミンテトラアセテート〕お
よび２５ｍＭ トリスｆｊＡｅ （ｐＨ８，０）を含有
する調製したはかりのりゾチーム溶液約１００μｌに懸
濁した。０℃で約３０分間インキュベートした後、アル
カリ性５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液（，２Ｎ
ＮａＯＨ２１チ５ＤＳ）約２００μｅを加え、チュー
ブをゆっくり回転させ、１５分間Ｏ℃に保った。次いで
、酢酸ナトリウム３モルを最少量の水に溶かし、氷酢酸
でｐＨ４，８に調節し、容量を１１に調節することによ
り調製した３Ｍ酢酸ナトリウム１５〇−を加え、次いて
チューブの内容物を、該チューブを数秒間静かに転倒さ
せることにより混合した。
この間にＤＮＡの固まりが形成した。
チューブを６０分間０℃に保ち、５分間遠心するとほと
んど澄明な上澄液が得られた。この上澄液約、４ｍ／を
第２の遠心管に移し、それに冷エタノール１−を加えた
。遠心管を３０分間、−２０℃に保った後、生成した沈
殿を遠心分離して（２分間）集め、上澄液をアスピレー
タ−で除去した。
んど澄明な上澄液が得られた。この上澄液約、４ｍ／を
第２の遠心管に移し、それに冷エタノール１−を加えた
。遠心管を３０分間、−２０℃に保った後、生成した沈
殿を遠心分離して（２分間）集め、上澄液をアスピレー
タ−で除去した。
この様にして集めたペレットを１．１Ｍ酢酸ナトＩＪ’
７ム／、０５Ｍ ）ＩＪス塩酸（ｐＨ８＞ １００μｆ
ｆ ＋ｃ溶かし、２倍量の冷エタノールを加えて再沈殿
させた。２０℃で１０分間保った後、生した沈殿を遠心
して集めたところ、上記の、所望のＥ、ｃｏｌｉＪｌ’
！−２２５プラスミドＤＮＡが得られた。
７ム／、０５Ｍ ）ＩＪス塩酸（ｐＨ８＞ １００μｆ
ｆ ＋ｃ溶かし、２倍量の冷エタノールを加えて再沈殿
させた。２０℃で１０分間保った後、生した沈殿を遠心
して集めたところ、上記の、所望のＥ、ｃｏｌｉＪｌ’
！−２２５プラスミドＤＮＡが得られた。
とのＥ、ｃｏｌｉ ＪＲ２２５プラスミドＤ Ｎ Ａペ
レットを水または希釈した緩衝液約４０μｅ１こ溶かし
、次イテ、これをＷ（４ｎＢｉｎｋ（１９７４、Ｃ：ｅ
ｌ１３：３１５）の形質転換法と実質的に同様ｌこして
、Ｅ。
レットを水または希釈した緩衝液約４０μｅ１こ溶かし
、次イテ、これをＷ（４ｎＢｉｎｋ（１９７４、Ｃ：ｅ
ｌ１３：３１５）の形質転換法と実質的に同様ｌこして
、Ｅ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２ＢＥＢ２７の形質転換に用いた。Ｅ、
ｃｏｌｉＫ１２ ＢＥ８２７はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃ：ｕｌ ｃｕｒｅＣｏｌ ｌ ｅｃＬ ｉｏｎ
、 Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌ ｅ ％Ｍａｒｙｌａｎｄに
寄託されてその永久ストックカルチャーコレクションの
一部となっており、寄託番号ＡＴＣ：Ｃ３１９１１の下
で誰でも利用できる。得られた形質転換体を、抗生物質
ハイグロマイシンＢ２００μｇ／ｍｔを含有しているＴ
Ｙ寒天（１％トリプトン１．５％酵母エキス１．５ ｑ
ｂの塩化ナトリウム、１．５％の寒天 ｐ Ｈ７，４）
上で選別した。形質転換体のうちあるものは、ゲル電気
泳動分析法（ＲａｏおよびＲｏｇｅｒｓ、１９７８、Ｇ
ｅｎｅ ３：２４７）やその他のテストの結果、大きい
プラスミドと小さいプラスミド（〜１５ｋｂ）の両方を
持ち、抗生物質のアンピンリ／およヒハイクロマイソン
Ｂの両方に耐性を有していることがわかった。その他の
形質転換体は、小さい〜１５ｋｂプラスミドのみを持ち
、抗生物質ハイグロマイシンＢとＧ４１８には耐性を有
するがアンピシリンには感受性を示すことがわかった。
ｃｏｌｉＫ１２ ＢＥ８２７はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃ：ｕｌ ｃｕｒｅＣｏｌ ｌ ｅｃＬ ｉｏｎ
、 Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌ ｅ ％Ｍａｒｙｌａｎｄに
寄託されてその永久ストックカルチャーコレクションの
一部となっており、寄託番号ＡＴＣ：Ｃ３１９１１の下
で誰でも利用できる。得られた形質転換体を、抗生物質
ハイグロマイシンＢ２００μｇ／ｍｔを含有しているＴ
Ｙ寒天（１％トリプトン１．５％酵母エキス１．５ ｑ
ｂの塩化ナトリウム、１．５％の寒天 ｐ Ｈ７，４）
上で選別した。形質転換体のうちあるものは、ゲル電気
泳動分析法（ＲａｏおよびＲｏｇｅｒｓ、１９７８、Ｇ
ｅｎｅ ３：２４７）やその他のテストの結果、大きい
プラスミドと小さいプラスミド（〜１５ｋｂ）の両方を
持ち、抗生物質のアンピンリ／およヒハイクロマイソン
Ｂの両方に耐性を有していることがわかった。その他の
形質転換体は、小さい〜１５ｋｂプラスミドのみを持ち
、抗生物質ハイグロマイシンＢとＧ４１８には耐性を有
するがアンピシリンには感受性を示すことがわかった。
後者の型の形質転換体を抗生物質ノ・イグロマイシンＢ
１〜／ｒｎ１．を含有するＴＹ寒天平板上にのばし、微
生物学上の標準的手法に従って培養した。得られた細胞
を、以後プラスミドＰＫＣ２０３と命名した、上記の〜
１５ｋｂハイグロマイシンＢおよびＧ４１４耐性−付与
プラスミドの単離に用いた。
１〜／ｒｎ１．を含有するＴＹ寒天平板上にのばし、微
生物学上の標準的手法に従って培養した。得られた細胞
を、以後プラスミドＰＫＣ２０３と命名した、上記の〜
１５ｋｂハイグロマイシンＢおよびＧ４１４耐性−付与
プラスミドの単離に用いた。
プラスミドＰＫＣ２０３上に抗生物質ハイグロマイシン
ＢおよびＧ４１８耐性遺伝子が存在していることは、形
質転換法、および選択分析法によって確認した。
ＢおよびＧ４１８耐性遺伝子が存在していることは、形
質転換法、および選択分析法によって確認した。
Ｂ６ プラスミドｐＫＣ２２２および形質転換体Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐＫＣ２２２の組立て１
） 〜２，７５ｋｂ Ｓａｌ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩフラグ
メツドブラスミドｐＫＣ：２０３の単離 約５μｇのプラスミドｐＫＣ２Ｑ３ＤＮＡを、供給７の
明記した指示に従い、同じく明記されている条件の下で
Ｓａｌ！ｌ およびＢｇｌ！ＩＩ 制限酵素で処理した
。有用な制限酵素による消化法は、Ｍａ ｎ ｉ ａ
ｔ ｉ ｓら（１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ。
ｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐＫＣ２２２の組立て１
） 〜２，７５ｋｂ Ｓａｌ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩフラグ
メツドブラスミドｐＫＣ：２０３の単離 約５μｇのプラスミドｐＫＣ２Ｑ３ＤＮＡを、供給７の
明記した指示に従い、同じく明記されている条件の下で
Ｓａｌ！ｌ およびＢｇｌ！ＩＩ 制限酵素で処理した
。有用な制限酵素による消化法は、Ｍａ ｎ ｉ ａ
ｔ ｉ ｓら（１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ−１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ＋
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）（（よって開示されている。抗生
物質ハイグロマイシンＢおよびＧ４１８に対する耐性遺
伝子、およびコントロール要素を含有するＮ２，７５ｋ
ｂフラグメントを常法に従って回収した（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）。
ｒａｔｏｒｙ、ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ＋
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）（（よって開示されている。抗生
物質ハイグロマイシンＢおよびＧ４１８に対する耐性遺
伝子、およびコントロール要素を含有するＮ２，７５ｋ
ｂフラグメントを常法に従って回収した（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）。
Ｘ特に明記しない限り、制限酵素類、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびフレナラフラグメント（
それらの使用方法を含めて月よ、次の供給者から入手で
きる。
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびフレナラフラグメント（
それらの使用方法を含めて月よ、次の供給者から入手で
きる。
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、 ３２ Ｔ
ｏｚｅｒ ＲｏａｄＢｅｖｅｒｌｙ、 ＭＡ Ｏ１９１
５ ２） ライゲーションおよび最終的な組立てＲａＯおよ
びＲｏｇｅｒｓ （１９７９、Ｇｅｎｅ ７ ニア９）
の教示に従って組立てられるプラスミドｐＫＣ，７（Ａ
ＴＣＣ３７０８４）約５μ９を、ＳａＩ！ＩおよびＢｇ
ｌＩＩ制限酵素で処理した。７０℃で５分間加熱して酵
素を不活化した後、このＤＮＡ約１μＦをＰＫＧ２０３
の〜２．７５ｋｂ ５ａｊ２１／Ｂｇ／ＩＩフラグメン
トと１＝１の比率で混合した。これらのフラグメントを
、実施例ＩＢ−１１こ記載した如く供給者の教示した方
法および規定条件の下でＴ ４． Ｄ Ｎ Ａ リガー
ゼを用いて連結した。制限酵素による消化並びにライゲ
ーションの両者に関する有用す方法がＭａｎｉａｔｉｓ
ら（１９８２）ｌこよっても開示されている。得られた
プラスミドＰＫＣ；２２２により、実施例ＩＡと実質的
に同様にしてＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲ
ＬＢ−１５２１１） を形質転換した。得られた形質転
換体を、抗生物質アンピシリン５０μｇ／ｆｆｌ／を含
んだＴＹ寒天（１％トリフトン１．５％酵母工＋：ｙ、
１．５％ＮａＣｊ７．１．５％実天〕上で選択した。次
いで、形質転換体を所望のプラスミドに関してスクリー
ニングした。
ｏｚｅｒ ＲｏａｄＢｅｖｅｒｌｙ、 ＭＡ Ｏ１９１
５ ２） ライゲーションおよび最終的な組立てＲａＯおよ
びＲｏｇｅｒｓ （１９７９、Ｇｅｎｅ ７ ニア９）
の教示に従って組立てられるプラスミドｐＫＣ，７（Ａ
ＴＣＣ３７０８４）約５μ９を、ＳａＩ！ＩおよびＢｇ
ｌＩＩ制限酵素で処理した。７０℃で５分間加熱して酵
素を不活化した後、このＤＮＡ約１μＦをＰＫＧ２０３
の〜２．７５ｋｂ ５ａｊ２１／Ｂｇ／ＩＩフラグメン
トと１＝１の比率で混合した。これらのフラグメントを
、実施例ＩＢ−１１こ記載した如く供給者の教示した方
法および規定条件の下でＴ ４． Ｄ Ｎ Ａ リガー
ゼを用いて連結した。制限酵素による消化並びにライゲ
ーションの両者に関する有用す方法がＭａｎｉａｔｉｓ
ら（１９８２）ｌこよっても開示されている。得られた
プラスミドＰＫＣ；２２２により、実施例ＩＡと実質的
に同様にしてＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲ
ＬＢ−１５２１１） を形質転換した。得られた形質転
換体を、抗生物質アンピシリン５０μｇ／ｆｆｌ／を含
んだＴＹ寒天（１％トリフトン１．５％酵母工＋：ｙ、
１．５％ＮａＣｊ７．１．５％実天〕上で選択した。次
いで、形質転換体を所望のプラスミドに関してスクリー
ニングした。
３）プラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２の単離純化（精製）形
質転換体を、５０μｙ／−の抗生物質アンピシリンを含
むＴＹブロス（１％トリプトン１．５％酵母エキス２，
５％の塩化ナトリウム、ｐｉ−１７，４）中、通常の微
生物学的手法ｌこ従って培養した。１８時間インキュベ
ートした後、約、５−の培養物を１．５ｍ１．のエツペ
ンドルフチューブに移し約１５秒間遠心した。特に明記
しない限り、全ての操作は周囲温度で行なった。生成し
た上澄液を先端の細いアスピレータ−を用いて注意深く
除き、細胞ペレットを、２μｇ／ｒｎ！のりゾチーム、
５ＱｍＭのグルコース、ｌＱｍＭのＣＩ）ＴＡ（シクロ
ヘキサンジアミンテトラアセテート）および２’５ｍＭ
のトリス塩酸（ｐｉ（ｓ ）を含有する調製したばかり
のリゾチーム溶液約１００μｌに懸濁した。０℃で３０
分間インキュベートした後、アルカｌＪ性５Ｄｓ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）溶液（，２ＮＮａＯＩ−１，１％
ＳＤＳ ）約２００μｌを加え、チューブをゆっくり回
転させ、１５分間０°Ｃに保った。次いで、酢酸ナトリ
ウム３モルを最少量の水）こ溶かし、氷酢酸でｐ１４４
．８に調節し、容量を１７？に調節することにより調製
した３Ｍ酢酸す計すウム約１５０μｌを加え、チューブ
の内容物を数秒間転倒させることにより混合した。する
とＤＮＡのかたまりが生成した。次いでこの混合物を０
°Ｃで６０時間保った後、５分間遠心すると、殆んど澄
明な上澄み液を得た。この上澄み約、４ｒｎｔを第２の
遠心管に移し、それに冷エタノール１ｄを加えた。遠心
管を３０分間−２０°Ｃに保った後、得られた沈殿を遠
心分離（２分間）して集め、上澄液をアスピレータ−で
除去した。この機船こして集めたペレットを１．ＩＭ酢
酸ナトリウム乙０５ Ｍトリス塩酸（ｐ）１８）１００
μｌに溶かし、２倍量の冷エタノールを加えて再沈殿さ
せた。１０分間、−２０℃に放置した後、上記の如（沈
殿を遠心して集めたところ、これはアガロースゲル電気
泳動分析（ＲａｏおよびＲｏｇｅｒｓ、１９７８）によ
って所望のｐＫＣ２：ｊ２ＤＮＡであることがわかった
。
質転換体を、５０μｙ／−の抗生物質アンピシリンを含
むＴＹブロス（１％トリプトン１．５％酵母エキス２，
５％の塩化ナトリウム、ｐｉ−１７，４）中、通常の微
生物学的手法ｌこ従って培養した。１８時間インキュベ
ートした後、約、５−の培養物を１．５ｍ１．のエツペ
ンドルフチューブに移し約１５秒間遠心した。特に明記
しない限り、全ての操作は周囲温度で行なった。生成し
た上澄液を先端の細いアスピレータ−を用いて注意深く
除き、細胞ペレットを、２μｇ／ｒｎ！のりゾチーム、
５ＱｍＭのグルコース、ｌＱｍＭのＣＩ）ＴＡ（シクロ
ヘキサンジアミンテトラアセテート）および２’５ｍＭ
のトリス塩酸（ｐｉ（ｓ ）を含有する調製したばかり
のリゾチーム溶液約１００μｌに懸濁した。０℃で３０
分間インキュベートした後、アルカｌＪ性５Ｄｓ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）溶液（，２ＮＮａＯＩ−１，１％
ＳＤＳ ）約２００μｌを加え、チューブをゆっくり回
転させ、１５分間０°Ｃに保った。次いで、酢酸ナトリ
ウム３モルを最少量の水）こ溶かし、氷酢酸でｐ１４４
．８に調節し、容量を１７？に調節することにより調製
した３Ｍ酢酸す計すウム約１５０μｌを加え、チューブ
の内容物を数秒間転倒させることにより混合した。する
とＤＮＡのかたまりが生成した。次いでこの混合物を０
°Ｃで６０時間保った後、５分間遠心すると、殆んど澄
明な上澄み液を得た。この上澄み約、４ｒｎｔを第２の
遠心管に移し、それに冷エタノール１ｄを加えた。遠心
管を３０分間−２０°Ｃに保った後、得られた沈殿を遠
心分離（２分間）して集め、上澄液をアスピレータ−で
除去した。この機船こして集めたペレットを１．ＩＭ酢
酸ナトリウム乙０５ Ｍトリス塩酸（ｐ）１８）１００
μｌに溶かし、２倍量の冷エタノールを加えて再沈殿さ
せた。１０分間、−２０℃に放置した後、上記の如（沈
殿を遠心して集めたところ、これはアガロースゲル電気
泳動分析（ＲａｏおよびＲｏｇｅｒｓ、１９７８）によ
って所望のｐＫＣ２：ｊ２ＤＮＡであることがわかった
。
実施例２ プラスミドＰＩＴ１２３およびＩ乞、ｃｏｌ
ｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｐｌＴ１２３ の組立てＡ、プ
ラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２の１−１ｐｈ Ｉ ” Ｐｓ
ｔ Ｉフラグメントの単離 プラスミドＰＫ（：２２２ＤＮＡ約５０μｇを１×１−
（ｐｌｓＩ 塩類（５ｍＭ Ｋｃｊ２．１ｍＭトリス塩
酸、１）Ｉ−１７，４−１０ｍＭ ＭｇＣｌ！２．１ｍ
Ｍ ジチオｌ−Ｌ／イツト）中に入れ、全量１００μｌ
とし、２ＯＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ単位
（７）ｌ（ｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。
ｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｐｌＴ１２３ の組立てＡ、プ
ラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２の１−１ｐｈ Ｉ ” Ｐｓ
ｔ Ｉフラグメントの単離 プラスミドＰＫ（：２２２ＤＮＡ約５０μｇを１×１−
（ｐｌｓＩ 塩類（５ｍＭ Ｋｃｊ２．１ｍＭトリス塩
酸、１）Ｉ−１７，４−１０ｍＭ ＭｇＣｌ！２．１ｍ
Ｍ ジチオｌ−Ｌ／イツト）中に入れ、全量１００μｌ
とし、２ＯＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ単位
（７）ｌ（ｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。
完全に消化されたことを、アガロース上に反応混合物（
２％）を置き電気泳動分析にかけて調べた。適量の５Ｍ
ＮａＣ／を加えてＮａＣ，ｊ７濃度を５ Ｑ ｍＭに調
節した後、ＰＳＬＩ 制限エンドヌクレアーゼ約２０単
位を加えた。この場合もアガロースゲル電気泳動分析に
よって消化の完了を監視した。所望の３２５ ｂｐ（プ
ラス１本鎖延長部分） ｌ−１ｐｈ Ｉ −Ｐｓ ｔ
Ｉ フラグメントを常法（Ｓ’ｃｈｌｉｅｆおよびＷｅ
ｎｓｉｎｋ。
２％）を置き電気泳動分析にかけて調べた。適量の５Ｍ
ＮａＣ／を加えてＮａＣ，ｊ７濃度を５ Ｑ ｍＭに調
節した後、ＰＳＬＩ 制限エンドヌクレアーゼ約２０単
位を加えた。この場合もアガロースゲル電気泳動分析に
よって消化の完了を監視した。所望の３２５ ｂｐ（プ
ラス１本鎖延長部分） ｌ−１ｐｈ Ｉ −Ｐｓ ｔ
Ｉ フラグメントを常法（Ｓ’ｃｈｌｉｅｆおよびＷｅ
ｎｓｉｎｋ。
１９８１、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、 Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ、 ＮＹ） ニ従ってアクリルア
ミドから精製した。
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、 Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ、 ＮＹ） ニ従ってアクリルア
ミドから精製した。
純化３２５ ｂｐフラグメントをＥ、ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ポリメラーゼｌラージフラグメント（Ｎｅｗ’ Ｅｎｇ
ｌ −ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。すなわち
、約１．５μｒ（１μｙ）のフラグメント５μｌの１０
×緩衝液（，５Ｍ トリス、ｐＨ７，５５，ＩＭ Ｍｇ
Ｃｌ２１各々、５μｌの２００ ｍＭ ｄＣＴＰ 、
ｄＡＴＰ 、 ＴＴＰ オヨ０：ｄＣ，ＴＰ、並びｌこ
１μｌ （１単位含有）のＤＮＡポリメラーゼｌラージ
（フレナラ）フラグメントを３７℃で１５分間、インキ
ュベートした。ポリメラーゼを熱不活化処理した後、Ｒ
ｏｂｅｒｔｓとＬａｕｅｒ（１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：４７３）の方法
と実質的に同様にしてＢａｍＨＩリンカ−含有ＤＮＡを
加えた。得られたＢａｍＩ且リンカ−含有ＤＮＡをｌ
Ｘ Ｂａｍ１４Ｉ 塩（，１５ＭＮａＣｊ７．６ｍＭ
トリス塩酸、ＰＨ７，９，６ｍＭ ＭｇＣ１２）中、Ｂ
ａｒｎＨＩ制限酵素で常法通り消化した。次いで、適量
の２ Ｍ １７ ！Ｊス塩酸、ｐＨ７，４を加えてトリ
ス塩酸の濃度を１００ｍＭに高めた後、］） Ｎ Ａを
ざらにＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。得られた消化Ｄ
ＮＡを７％アクリルアミドゲルにのせて電気泳動し、所
望の２５０ ｂｐフラグメントを前記と同様にして精製
した。
ポリメラーゼｌラージフラグメント（Ｎｅｗ’ Ｅｎｇ
ｌ −ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。すなわち
、約１．５μｒ（１μｙ）のフラグメント５μｌの１０
×緩衝液（，５Ｍ トリス、ｐＨ７，５５，ＩＭ Ｍｇ
Ｃｌ２１各々、５μｌの２００ ｍＭ ｄＣＴＰ 、
ｄＡＴＰ 、 ＴＴＰ オヨ０：ｄＣ，ＴＰ、並びｌこ
１μｌ （１単位含有）のＤＮＡポリメラーゼｌラージ
（フレナラ）フラグメントを３７℃で１５分間、インキ
ュベートした。ポリメラーゼを熱不活化処理した後、Ｒ
ｏｂｅｒｔｓとＬａｕｅｒ（１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：４７３）の方法
と実質的に同様にしてＢａｍＨＩリンカ−含有ＤＮＡを
加えた。得られたＢａｍＩ且リンカ−含有ＤＮＡをｌ
Ｘ Ｂａｍ１４Ｉ 塩（，１５ＭＮａＣｊ７．６ｍＭ
トリス塩酸、ＰＨ７，９，６ｍＭ ＭｇＣ１２）中、Ｂ
ａｒｎＨＩ制限酵素で常法通り消化した。次いで、適量
の２ Ｍ １７ ！Ｊス塩酸、ｐＨ７，４を加えてトリ
ス塩酸の濃度を１００ｍＭに高めた後、］） Ｎ Ａを
ざらにＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。得られた消化Ｄ
ＮＡを７％アクリルアミドゲルにのせて電気泳動し、所
望の２５０ ｂｐフラグメントを前記と同様にして精製
した。
Ｂ、プラスミドｐｌＴ１２２とＥ、 ｃｏｌ ｉ Ｋ１
２ＪＡ２２１／ＰＩＴ１２２の組立て ＰＢＲ３２２ＤＮＡ約２μｇを、実施例２Ａｉこ記載し
た方法と実質上同様１こしてＢａｍｔｌｌおよびＥｃｏ
ＲＩ制限酵素で順次消化した。７０℃で５分間加熱して
酵素を不活化した後、ｐ Ｂ Ｒ３２２ＤＮＡ約１μ６
（１μｇ）を、純化２５０ｂＰフラグメント約１μ６（
１μｙ）、水３７μ／、ＡＴＰ（ＬＯｍＭ）５μで、ラ
イゲーソヨンミックス（，５Ｍトリス塩酸、ｐｌ−１７
，８１，Ｉ Ｍジチオトレイブト１、ＩＭ Ｍｇ、Ｃ／
２ン５μｌ、およびＴ４ＤＮＡ リガーゼ１μｌ（約１
００，０００ Ｎｅｗ Ｅｒ５ｇ１ａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ単位）と混合した。この混合物を１５℃で約２時間
インキュベートした後、７０℃で５分間インキュベート
することにより反応を終結させた。氷上で冷却した後、
このライゲートして得た混合物を、Ｗｅｎｓｉｎｋ（１
９７４） の形質転換法に実質上従って、アンピシリン
２００μｇ／ｒｎｌを含んだＴＹプレート上でＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１１
）を形質転換するのに用いた。所望の形質転換体である
ことは、予想される発現形質（ＡｍＰＲ，Ｔｅ【５）を
テストすること、並びに適切なＥ’ｃｏＲＩ −Ｂａｍ
１−１１挿入をテストすることによって常法通り確認し
た。得られたＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐｌ
Ｔ１２２形質転換体を、続いてプラスミドＰＩＴ１２２
を生産し、単離するために通常の方法で培養した。
２ＪＡ２２１／ＰＩＴ１２２の組立て ＰＢＲ３２２ＤＮＡ約２μｇを、実施例２Ａｉこ記載し
た方法と実質上同様１こしてＢａｍｔｌｌおよびＥｃｏ
ＲＩ制限酵素で順次消化した。７０℃で５分間加熱して
酵素を不活化した後、ｐ Ｂ Ｒ３２２ＤＮＡ約１μ６
（１μｇ）を、純化２５０ｂＰフラグメント約１μ６（
１μｙ）、水３７μ／、ＡＴＰ（ＬＯｍＭ）５μで、ラ
イゲーソヨンミックス（，５Ｍトリス塩酸、ｐｌ−１７
，８１，Ｉ Ｍジチオトレイブト１、ＩＭ Ｍｇ、Ｃ／
２ン５μｌ、およびＴ４ＤＮＡ リガーゼ１μｌ（約１
００，０００ Ｎｅｗ Ｅｒ５ｇ１ａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ単位）と混合した。この混合物を１５℃で約２時間
インキュベートした後、７０℃で５分間インキュベート
することにより反応を終結させた。氷上で冷却した後、
このライゲートして得た混合物を、Ｗｅｎｓｉｎｋ（１
９７４） の形質転換法に実質上従って、アンピシリン
２００μｇ／ｒｎｌを含んだＴＹプレート上でＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１１
）を形質転換するのに用いた。所望の形質転換体である
ことは、予想される発現形質（ＡｍＰＲ，Ｔｅ【５）を
テストすること、並びに適切なＥ’ｃｏＲＩ −Ｂａｍ
１−１１挿入をテストすることによって常法通り確認し
た。得られたＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐｌ
Ｔ１２２形質転換体を、続いてプラスミドＰＩＴ１２２
を生産し、単離するために通常の方法で培養した。
Ｃプラスミドｐ Ｋ Ｃ２２２の〜１．４５ｋｂＥｃｏ
ＲＩフラグメントのＥｃｏＲＩ 消化プラスミドｐ ｒ
Ｔｌ ２２へのライゲーション 約２０ｔｔ９のＰＫＣ：２２２とｐ Ｉ Ｔ ２２２と
を全く別個に、反応容量２００μｇで、］ＸＥｃｏＲＩ
反応ミックス（，１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７，５１，０５
ＭＮａＣ１！１．００５ＭＭｇｃ１２）中、ＥｃｏＲＩ
制限酵素４０単位を用いてそれぞれ開裂させた。所望の
〜ｌ、４５ ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを通常通り
、７％アクリルアミドゲルで精製し、ＥＣ０ＲＩ消化ｐ
ＩＴ１２２にライゲートした。ｐ Ｉ Ｔ １２３と命
名されたこのライゲート産物のり、ＮＡを、Ｅ、ｃｏｌ
ｉＫ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲＬ Ｂ＝１５２１１）の
形質転換に用いた。これら、ライゲーションおよび形質
転換における操作はいずれも、実質上、実施例２Ｂの方
法に従って行なった。アンピッリン耐性形質転換体を、
その構成プラスミドの制限酵素分析並びにアガロースゲ
ル電気泳動分析により、〜１．４５ｋｂ ＥｃｏＲＩ
フラグメントの存在とその正しい方向性（オリエンテー
ション）に関してスクリーニングした。最初の９塩基対
を除く全ａｐｈ（４）遺伝子を含有するプラスミドが、
所望のプラスミド１２３である。この様にして同定した
Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｐｌＴ１２３形質転
換体を、以後のプラスミドＰ ＩＴｌ ２３の生産およ
び単離のために培養した。プラスミドｐＩＴ１２３制限
サイト地図を添付の第１図に示す。
ＲＩフラグメントのＥｃｏＲＩ 消化プラスミドｐ ｒ
Ｔｌ ２２へのライゲーション 約２０ｔｔ９のＰＫＣ：２２２とｐ Ｉ Ｔ ２２２と
を全く別個に、反応容量２００μｇで、］ＸＥｃｏＲＩ
反応ミックス（，１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７，５１，０５
ＭＮａＣ１！１．００５ＭＭｇｃ１２）中、ＥｃｏＲＩ
制限酵素４０単位を用いてそれぞれ開裂させた。所望の
〜ｌ、４５ ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを通常通り
、７％アクリルアミドゲルで精製し、ＥＣ０ＲＩ消化ｐ
ＩＴ１２２にライゲートした。ｐ Ｉ Ｔ １２３と命
名されたこのライゲート産物のり、ＮＡを、Ｅ、ｃｏｌ
ｉＫ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲＬ Ｂ＝１５２１１）の
形質転換に用いた。これら、ライゲーションおよび形質
転換における操作はいずれも、実質上、実施例２Ｂの方
法に従って行なった。アンピッリン耐性形質転換体を、
その構成プラスミドの制限酵素分析並びにアガロースゲ
ル電気泳動分析により、〜１．４５ｋｂ ＥｃｏＲＩ
フラグメントの存在とその正しい方向性（オリエンテー
ション）に関してスクリーニングした。最初の９塩基対
を除く全ａｐｈ（４）遺伝子を含有するプラスミドが、
所望のプラスミド１２３である。この様にして同定した
Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１／ｐｌＴ１２３形質転
換体を、以後のプラスミドＰ ＩＴｌ ２３の生産およ
び単離のために培養した。プラスミドｐＩＴ１２３制限
サイト地図を添付の第１図に示す。
実施例３ プラスミドｐｌＴ１４４およびＥ。
ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＲＲ１△Ｍ１５／ｐＩＴ１４４の
組立てＡ、プラスミドｐｌＴ１２３の〜１．３ｋｂＢａ
ｍ Ｈｌ −Ｂｇ ７３１１フラグメントの組立ておよ
び単離 所望の消化、および単離は、ＨＰＩＩＩおよびＰｓｔＩ
制限酵素および塩類の代りに、ＢａｍＨＩおよびＢｇ、
ｇ ＩＪ制限酵素および塩類を用いることを除き、実施
例２Ａて示した方法と実質上同様にして行った。
組立てＡ、プラスミドｐｌＴ１２３の〜１．３ｋｂＢａ
ｍ Ｈｌ −Ｂｇ ７３１１フラグメントの組立ておよ
び単離 所望の消化、および単離は、ＨＰＩＩＩおよびＰｓｔＩ
制限酵素および塩類の代りに、ＢａｍＨＩおよびＢｇ、
ｇ ＩＪ制限酵素および塩類を用いることを除き、実施
例２Ａて示した方法と実質上同様にして行った。
１３、プラスミドｐＵＣ７のＢａｍ１−ＩＩ消化Ｒａｍ
ＨＩ リンカ−含有ＤＮＡの代りにプラスミ ド ｐ
Ｕ Ｃ７（Ｂｅｔｂｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔ−ｏｒｉｅｓ、 ３７１７ Ｇｒｏｖｅ、ｍ
ｃｎＬ Ｃｌｒｃｌｅ％Ｐ、００ＢＯＸ ６００９、Ｇ
ａｉｔｂｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＤ ２０８７７から入手
可能）１μｇを用いることを除き、実施例２人の方法と
実質的に同様にして所望の消化を行った。
ＨＩ リンカ−含有ＤＮＡの代りにプラスミ ド ｐ
Ｕ Ｃ７（Ｂｅｔｂｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔ−ｏｒｉｅｓ、 ３７１７ Ｇｒｏｖｅ、ｍ
ｃｎＬ Ｃｌｒｃｌｅ％Ｐ、００ＢＯＸ ６００９、Ｇ
ａｉｔｂｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＤ ２０８７７から入手
可能）１μｇを用いることを除き、実施例２人の方法と
実質的に同様にして所望の消化を行った。
Ｃ，ライゲーションと形質転換
プラスミドｐＩＴ１２３の〜ｌ、 ３ ｋ ｂ Ｂａｍ
Ｈ１−ＢｇｐＨフラグメント約１μダを、Ｂ ａ ｍ
Ｉ−Ｉ Ｉ消化ｐＵＣ７約１μｇにライゲートした後、
得られた混合物をＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＲＲ１△Ｍ
１５ （ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｐｅｏｒｉａ。
Ｈ１−ＢｇｐＨフラグメント約１μダを、Ｂ ａ ｍ
Ｉ−Ｉ Ｉ消化ｐＵＣ７約１μｇにライゲートした後、
得られた混合物をＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＲＲ１△Ｍ
１５ （ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｐｅｏｒｉａ。
１１１ｉｎｏｉｓに寄託され、その永久ストックカルチ
ャーコレクションの一部となっており、寄託番号ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ １５４４０の下に入手することができる）の形
質転換に用いた。上記の操作はいずれも実施例２Ｂで示
したライゲーション並びｆこ形質転換の方法と実質的に
同様にして行った。形質転換細胞を、５０１１ｇ／−の
アンピシリン、１００ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−
ガラクトンッド（１，ＰＴＧ）および、０２％５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（Ｘ−ガル）を含んだＴＹプレート上においた。白色
のアンピシリン耐性コロニーを、アンピノリ／（５０１
１ｆｌ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍ
ｌ）およびＩ Ｐ Ｔ Ｇ （１００ｍＭ ）を含んだ
ＴＹ上においた。ハイグロマイリンＢ耐性株が所望のり
。
ャーコレクションの一部となっており、寄託番号ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ １５４４０の下に入手することができる）の形
質転換に用いた。上記の操作はいずれも実施例２Ｂで示
したライゲーション並びｆこ形質転換の方法と実質的に
同様にして行った。形質転換細胞を、５０１１ｇ／−の
アンピシリン、１００ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−
ガラクトンッド（１，ＰＴＧ）および、０２％５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（Ｘ−ガル）を含んだＴＹプレート上においた。白色
のアンピシリン耐性コロニーを、アンピノリ／（５０１
１ｆｌ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍ
ｌ）およびＩ Ｐ Ｔ Ｇ （１００ｍＭ ）を含んだ
ＴＹ上においた。ハイグロマイリンＢ耐性株が所望のり
。
ｃｏｌ ｉ Ｋ １２ ＲＲＩ△Ｍｌｓ／ｐＩＴ１４４
形質転換体であり、これは、構成プラスミドの制限酵素
分析並びにアガロースゲル電気泳動分析で確認した。
形質転換体であり、これは、構成プラスミドの制限酵素
分析並びにアガロースゲル電気泳動分析で確認した。
得られたＥ、ｃｏｌ ｉ Ｋｌ ２ ＲＲ］△Ｍｌ ５
／ｐ Ｉ Ｔ］４４形質転換体を、引き続きプラスミド
ｐ ＩＴＩ ４４の生産、単離のために常法に従って培
養した。プラスミドｐ ＩＴＩ ４４は、実施例２Ｂで
示した形質転換法と実質的に同様にして通常のＥ、 ｃ
ｏｔ ｉ菌株、例えばＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＲＲｌ、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２
２１およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１ｊＢ１０１を形質転
換することができる。プラスミドＰＩＴ１４４の制限サ
イト（部位）地図を添イ」の第２図に示す。
／ｐ Ｉ Ｔ］４４形質転換体を、引き続きプラスミド
ｐ ＩＴＩ ４４の生産、単離のために常法に従って培
養した。プラスミドｐ ＩＴＩ ４４は、実施例２Ｂで
示した形質転換法と実質的に同様にして通常のＥ、 ｃ
ｏｔ ｉ菌株、例えばＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＲＲｌ、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２
２１およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１ｊＢ１０１を形質転
換することができる。プラスミドＰＩＴ１４４の制限サ
イト（部位）地図を添イ」の第２図に示す。
実施例４ プラスミドＰＩＴ２０８およびＥ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＩＴ２０８の組立て
Ａ、プラスミドｐＩＴ２０７の組立て １） プラスミドｐＩＴ１１Ｂの〜７５０ ｂｐＢａｍ
ｌ−ＩＩ −Ｂｇｊ７ ＩＩ フラグメントの組立てお
よび単離 ａ） プラスミドｐ ＩＴＩ １８の単離プラスミドｐ
ＩＴ１１８は、実施例ＩＡに示した方法に実質上従って
、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＩＴ１１’８
から単離することができる。上記の菌株はＮｏｒｔｌ
＞ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉ
ｓ （（−寄託番号Ｎ ＲＲｌ−１３−１５４４１の下
に寄託され、その永久ストックカルチャーコレクション
の一部となっている。
Ａ、プラスミドｐＩＴ２０７の組立て １） プラスミドｐＩＴ１１Ｂの〜７５０ ｂｐＢａｍ
ｌ−ＩＩ −Ｂｇｊ７ ＩＩ フラグメントの組立てお
よび単離 ａ） プラスミドｐ ＩＴＩ １８の単離プラスミドｐ
ＩＴ１１８は、実施例ＩＡに示した方法に実質上従って
、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ＰＩＴ１１’８
から単離することができる。上記の菌株はＮｏｒｔｌ
＞ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉ
ｓ （（−寄託番号Ｎ ＲＲｌ−１３−１５４４１の下
に寄託され、その永久ストックカルチャーコレクション
の一部となっている。
ｂ）消化
Ｈｐ ｂ １およびＰｓＬＩ制限酵素の代りｌ（Ｂ ａ
ｍＨ１および１３ｇｊｌ’ｌｌ制限酵素を用いて、実
施例２Ａで示した方法と実質的に同様にして、所望の消
化および単離を行った。
ｍＨ１および１３ｇｊｌ’ｌｌ制限酵素を用いて、実
施例２Ａで示した方法と実質的に同様にして、所望の消
化および単離を行った。
２）プラスミドｌ）ＭＣ，１５８７のＢａｍｔＩＩ消化
Ｂ ａ ｍＨＩ リンカ−含有ＤＮＡの代りにプラスミ
ドＰＭＣＩ５８７ ２μダを用いて、実施例２Ａの方法
と実質的に同様にして所望の消化を行った。
Ｂ ａ ｍＨＩ リンカ−含有ＤＮＡの代りにプラスミ
ドＰＭＣＩ５８７ ２μダを用いて、実施例２Ａの方法
と実質的に同様にして所望の消化を行った。
プラスミドｐＭｃ１５８７は、Ｎｏｒｔｌｔｅｒｎ Ｒ
ｅｇｉ−ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、 Ｐｅｏｒｉａ １ｌｌｉ−ｎｏｉｓ （ｃ、
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４２の下に寄託され、そ
の永久ストックカルチャーコレクションの一部となって
いる菌株、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ＪＡ２２１／ＰＭＣ１
５８７から、実施例ＩＡに示した方法と実質的に同様に
して常法通り単離できる。
ｅｇｉ−ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、 Ｐｅｏｒｉａ １ｌｌｉ−ｎｏｉｓ （ｃ、
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４２の下に寄託され、そ
の永久ストックカルチャーコレクションの一部となって
いる菌株、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ＪＡ２２１／ＰＭＣ１
５８７から、実施例ＩＡに示した方法と実質的に同様に
して常法通り単離できる。
このプラスミドｐＭｃ１５８７は１個のＢ ａ ｍＨ１
部位を有するので、その消化を、アガロースゲル電気泳
動分析により、容易に監視できる。約１５ｋｂｌこ現わ
れたシングルバンドは、消化の完了を意味する。
部位を有するので、その消化を、アガロースゲル電気泳
動分析により、容易に監視できる。約１５ｋｂｌこ現わ
れたシングルバンドは、消化の完了を意味する。
３） Ｅ、ｃｏ目に１２ ＪＡ２２１のライゲーショ／
および形質転換 プ５ｘミドｐＩＴ１１８の〜７５０ ｂｐ ＢａｍＨｌ
−Ｂｇｌ！ＩＩフラグメント約１／ｊｇをＢａｍＨＩ消
化プラスミドＰＭＣ１５８７約１μｇにライゲートし、
次いで、得られたライゲーション混合物をＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１１）の
形質転換に用いた。これらの操作は実施例２Ｂの方法と
実質的に同様にして行った。アンピシリン耐性形質転換
体を、構成プラスミドの制限酵素分析およびアガロース
ゲル電気泳動分析により常法通り、〜７５０ ｂ’ｐフ
ラグメントの存在並びに正しい方向性に関してスクリー
ニングした。１ｅｕ２遺伝子に極めて接近した位置にＢ
ａｍ１−１１／Ｂｇ／■接続部（ジャンクション）（〜
７５０ ｂｐフラグメントのライゲーションで形成され
た）を持ったプラスミドが所望のプラスミドＰＩＴ２０
７である。このＥ、ｃｏ目に１２ ＪＡ２２１／ＰＩＴ
２０７形質転換体を引き続き、プラスミドＰＩ丁２０７
の生産および単離のために培養した。
および形質転換 プ５ｘミドｐＩＴ１１８の〜７５０ ｂｐ ＢａｍＨｌ
−Ｂｇｌ！ＩＩフラグメント約１／ｊｇをＢａｍＨＩ消
化プラスミドＰＭＣ１５８７約１μｇにライゲートし、
次いで、得られたライゲーション混合物をＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１１）の
形質転換に用いた。これらの操作は実施例２Ｂの方法と
実質的に同様にして行った。アンピシリン耐性形質転換
体を、構成プラスミドの制限酵素分析およびアガロース
ゲル電気泳動分析により常法通り、〜７５０ ｂ’ｐフ
ラグメントの存在並びに正しい方向性に関してスクリー
ニングした。１ｅｕ２遺伝子に極めて接近した位置にＢ
ａｍ１−１１／Ｂｇ／■接続部（ジャンクション）（〜
７５０ ｂｐフラグメントのライゲーションで形成され
た）を持ったプラスミドが所望のプラスミドＰＩＴ２０
７である。このＥ、ｃｏ目に１２ ＪＡ２２１／ＰＩＴ
２０７形質転換体を引き続き、プラスミドＰＩ丁２０７
の生産および単離のために培養した。
Ｂ、プラスミドｐＩＴ２０８の最終的な組立て１、プラ
スミドｐｌＴ２０７のＢ ａ ｍｔｌ Ｉ消化Ｂ ａ
ｍ Ｉ−Ｉ Ｉ リンカ−含有Ｄ Ｎ Ａの代りにプラ
スミドＰＩＴ２０７ １μｇを使用するほかは、実施例
２人と実質的に同様にして所望の消化を行った。
スミドｐｌＴ２０７のＢ ａ ｍｔｌ Ｉ消化Ｂ ａ
ｍ Ｉ−Ｉ Ｉ リンカ−含有Ｄ Ｎ Ａの代りにプラ
スミドＰＩＴ２０７ １μｇを使用するほかは、実施例
２人と実質的に同様にして所望の消化を行った。
２、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／ｐＩＴ２０８
のライゲーションおよび組立て プラスミドｐｌＴＩ’２３の〜ｌ、 ３ ｋ ｂ Ｂａ
Ｂａｍ１−１ｌ−Ｂ！ＩＩ フラグメント（実施例３Ａ
で調製）約２μｇをＢａｍＨＩ−消化プラスミドＰＩＴ
２０７約２μｇにライゲートし、次いで、得られたライ
ゲーション混合物をＥ、ｃａｌ ｉ Ｋｌ ２ ＪＡ２
２１ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１１）の形質転換に用い
た。これらの操作は、いずれも実施例２Ｂのライゲーシ
ョンおよび形質転換の方法と実質的に同様にして行った
。このアンピシリン耐性形質転換体を、構成プラスミド
の制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分析によ
り常法通り、〜１，３ｋｂフラグメントの存在および正
しい方向性に関してスクリーニングした。ｌｅｕ ２遺
伝子に極めて接近した位置に〜１，３ｋｂフラグメント
の内性Ｅ、ｃｏＲ１部位を持ったプラスミドが所望のｐ
ｌＴ２０８プラスミドである。Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＪＡ２２１／ｐｌＴ２０８形質転換体を、プラスミドｐ
ＩＴ２０８の生産および単離のために培養した。
のライゲーションおよび組立て プラスミドｐｌＴＩ’２３の〜ｌ、 ３ ｋ ｂ Ｂａ
Ｂａｍ１−１ｌ−Ｂ！ＩＩ フラグメント（実施例３Ａ
で調製）約２μｇをＢａｍＨＩ−消化プラスミドＰＩＴ
２０７約２μｇにライゲートし、次いで、得られたライ
ゲーション混合物をＥ、ｃａｌ ｉ Ｋｌ ２ ＪＡ２
２１ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１１）の形質転換に用い
た。これらの操作は、いずれも実施例２Ｂのライゲーシ
ョンおよび形質転換の方法と実質的に同様にして行った
。このアンピシリン耐性形質転換体を、構成プラスミド
の制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分析によ
り常法通り、〜１，３ｋｂフラグメントの存在および正
しい方向性に関してスクリーニングした。ｌｅｕ ２遺
伝子に極めて接近した位置に〜１，３ｋｂフラグメント
の内性Ｅ、ｃｏＲ１部位を持ったプラスミドが所望のｐ
ｌＴ２０８プラスミドである。Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＪＡ２２１／ｐｌＴ２０８形質転換体を、プラスミドｐ
ＩＴ２０８の生産および単離のために培養した。
プラスミドｐｌＴ２０８は、１）翻訳解読相内で本発明
のＤＮＡに融合している先端を切断されたＹＧＩＯＩ遺
伝子、り酵母１ｅｕ２遺伝子（ｌｅｕ２栄養要栄養要求
元することにより、このプラスミドを選択可能なものと
する）３）酵母２ミクロン配列（酵母内での自律的自己
複製を容易にする〕、優プラスミドｐＢＲ３２２の複製
起源（Ｅ、ｃｏｌｉ内での自律的自己複製を容易にする
〕、および５）ｐ Ｂ Ｒ３２２からのβ−ラクタマー
ゼ遺伝子（Ｅ・ｃｏｌｉ内でのプラスミドの選択を容易
にする）の各成分を含有している。プラスミドＰＩＴ２
０８の制限サイト地図を添付の第３図に示す。
のＤＮＡに融合している先端を切断されたＹＧＩＯＩ遺
伝子、り酵母１ｅｕ２遺伝子（ｌｅｕ２栄養要栄養要求
元することにより、このプラスミドを選択可能なものと
する）３）酵母２ミクロン配列（酵母内での自律的自己
複製を容易にする〕、優プラスミドｐＢＲ３２２の複製
起源（Ｅ、ｃｏｌｉ内での自律的自己複製を容易にする
〕、および５）ｐ Ｂ Ｒ３２２からのβ−ラクタマー
ゼ遺伝子（Ｅ・ｃｏｌｉ内でのプラスミドの選択を容易
にする）の各成分を含有している。プラスミドＰＩＴ２
０８の制限サイト地図を添付の第３図に示す。
実施例５ Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｃ／ＰＩＴ２０８の組立て Ｈｉ ｎ ｎ ｅ ｎら（１９７８、Ｐｒｏｃ 、Ｎａ
ｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ｓｉａｃ／ＰＩＴ２０８の組立て Ｈｉ ｎ ｎ ｅ ｎら（１９７８、Ｐｒｏｃ 、Ｎａ
ｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ７５ ：１９２９）の方法と実質的に同様にし
てプラスミドｐ Ｉ Ｔ ２０８１ｃよりＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙ−ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 細胞を形質
転換した。あらゆる酵母を用いることができるが、本明
細書では、特にＳａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ＤＢＹ７４６を例示の菌株とする。この
菌株は、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔ−ｉｃｓ ５ｔｏｃｋ
Ｃｅｎｔｅｒ＋Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏ
ｐｈ−ｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓ
ｉｃｓ％Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｃａ１ｉｆｏｒｎ
ｉａ＋Ｂｅｒｋｌｅｙ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ９４７
２０から、誰でも入手することができる。
てプラスミドｐ Ｉ Ｔ ２０８１ｃよりＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙ−ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 細胞を形質
転換した。あらゆる酵母を用いることができるが、本明
細書では、特にＳａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ＤＢＹ７４６を例示の菌株とする。この
菌株は、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔ−ｉｃｓ ５ｔｏｃｋ
Ｃｅｎｔｅｒ＋Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏ
ｐｈ−ｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓ
ｉｃｓ％Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｃａ１ｉｆｏｒｎ
ｉａ＋Ｂｅｒｋｌｅｙ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ９４７
２０から、誰でも入手することができる。
所望の組立ては、酵母細胞約１ｏｏｒｎ！、をＹＰＤ培
地（１チバクトー酵母エキス、２％バタトーペプトンお
よｉ２％ Ｄ−グルコース）中、３０’Ｃにおいて、Ａ
６００が約１となるまで増殖させて行なった。無菌条件
下で細胞を遠心分離し、１．２Ｍソルビトール１５ｍ／
内で２回洗浄し、次いでソルビトール溶液１５−中に再
懸濁した。２．５１１ｔｇ／ｄのザイモリエース’（５
ｍＭ ｋＰＯ４、ｐＨ７，６，１，２Ｍソルビトール中
に６０．Ｏｏｏ単位〕約１００μｌを加えた後、この細
胞を３０’Ｃでインキュベートした。プロトプラスト化
の程度を、１０％５ＤＳ１８０μｌ を、２０ｒｎ！部
に加えて位相差顕微鏡で観察することによって監視した
。約９０％の細胞が黒く見えるようになれば、穏やかに
遠心分離して細胞を集め、１．２Ｍソルビトール１５−
で２回洗浄し、１．２Ｍソルビトール−，５Ｘ Ｙ Ｐ
Ｄ溶液１〇−中に再懸濁し、室温で４０分間インキュ
ベートした。再び穏やかに遠心分離して細胞を集め１．
５ＸＹＰＤ、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｊ
７およびＩ Ｑ ｍＭ トリス塩酸（ＰＨ７，５）から
なる溶液６００μｌ中に再懸濁した。これらの細胞のう
ち一部（，２ｍ１．）をとり、１．２Ｍソルビトール中
にＤＮＡを含有する２０μｌの溶液に加エタ。この混合
物を室温で１０分間インキュベートし、その時点で２０
％のＰＥＧ４，０００°、１０ ｍＭ ＣａＣｊ７２、
１０ｍＭ トリス塩酸（ＰＨ７，５）からなる溶液１−
を加えた。この混合物を室霊で６０分間インキュベート
した後、４つに分けた。
地（１チバクトー酵母エキス、２％バタトーペプトンお
よｉ２％ Ｄ−グルコース）中、３０’Ｃにおいて、Ａ
６００が約１となるまで増殖させて行なった。無菌条件
下で細胞を遠心分離し、１．２Ｍソルビトール１５ｍ／
内で２回洗浄し、次いでソルビトール溶液１５−中に再
懸濁した。２．５１１ｔｇ／ｄのザイモリエース’（５
ｍＭ ｋＰＯ４、ｐＨ７，６，１，２Ｍソルビトール中
に６０．Ｏｏｏ単位〕約１００μｌを加えた後、この細
胞を３０’Ｃでインキュベートした。プロトプラスト化
の程度を、１０％５ＤＳ１８０μｌ を、２０ｒｎ！部
に加えて位相差顕微鏡で観察することによって監視した
。約９０％の細胞が黒く見えるようになれば、穏やかに
遠心分離して細胞を集め、１．２Ｍソルビトール１５−
で２回洗浄し、１．２Ｍソルビトール−，５Ｘ Ｙ Ｐ
Ｄ溶液１〇−中に再懸濁し、室温で４０分間インキュ
ベートした。再び穏やかに遠心分離して細胞を集め１．
５ＸＹＰＤ、１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｊ
７およびＩ Ｑ ｍＭ トリス塩酸（ＰＨ７，５）から
なる溶液６００μｌ中に再懸濁した。これらの細胞のう
ち一部（，２ｍ１．）をとり、１．２Ｍソルビトール中
にＤＮＡを含有する２０μｌの溶液に加エタ。この混合
物を室温で１０分間インキュベートし、その時点で２０
％のＰＥＧ４，０００°、１０ ｍＭ ＣａＣｊ７２、
１０ｍＭ トリス塩酸（ＰＨ７，５）からなる溶液１−
を加えた。この混合物を室霊で６０分間インキュベート
した後、４つに分けた。
それぞれを、３チの寒天１．６７％Ｄｉｒｃｏ酵母窒素
塩基（アミノ酸を含ます）、１．２Ｍソルビトーノペ２
チグルコース、２％ＹＰＤ、その他通常の栄養源を含む
２５ｒｎ！、を入れたチューブに加えた。
塩基（アミノ酸を含ます）、１．２Ｍソルビトーノペ２
チグルコース、２％ＹＰＤ、その他通常の栄養源を含む
２５ｒｎ！、を入れたチューブに加えた。
さらに、ロイシンプロトトロフィーを選別するためにヒ
スチジン、ロイシンおよびトリプトファンをも加えた。
スチジン、ロイシンおよびトリプトファンをも加えた。
細胞を静かに混合し、即座に空の無菌ペトリ皿に入れ、
寒天が固化した後、加湿条件下、３０℃でインキュベー
トした。約３日後、ロイシンプロトトロフを拾い上ケ、
５００μｇ／ｒｎｌのハイグロマイシンＢを含んだＹＰ
Ｄプレート」二に画線接種した。得られたハイグロマイ
シンｌへ耐性酵母細胞が所望のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ／ＰＩＴ２０８形質転換体で
あった。この形質転換体を一構成プラスミドの制限酵素
およびアガロースゲル電気泳動分析法で同定した。
寒天が固化した後、加湿条件下、３０℃でインキュベー
トした。約３日後、ロイシンプロトトロフを拾い上ケ、
５００μｇ／ｒｎｌのハイグロマイシンＢを含んだＹＰ
Ｄプレート」二に画線接種した。得られたハイグロマイ
シンｌへ耐性酵母細胞が所望のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ／ＰＩＴ２０８形質転換体で
あった。この形質転換体を一構成プラスミドの制限酵素
およびアガロースゲル電気泳動分析法で同定した。
Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ
２０００ Ｅｌｋｂａｒｔ、ｌＮ４６５１５ ｘｘＰＥＧ４００は下記の供給者から得られる：Ｂａｋ
ｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ２２２ Ｒｅｄ ５
ｃｈｏｏｌ ＬａｎｅＩ’ｂｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ
Ｊ ０８８６５実施例６ プラスミドｐＫｃ３０７およ
びＥ。
２０００ Ｅｌｋｂａｒｔ、ｌＮ４６５１５ ｘｘＰＥＧ４００は下記の供給者から得られる：Ｂａｋ
ｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ２２２ Ｒｅｄ ５
ｃｈｏｏｌ ＬａｎｅＩ’ｂｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ
Ｊ ０８８６５実施例６ プラスミドｐＫｃ３０７およ
びＥ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲＩ△Ｍ１５／ＰＫＣ３０７の組
立てＡ・ プラスミドｐｉＴ１０４およびＥ、ｃｏｌ
１Ｋ１２ ＲＲ１／ｐＩＴ１０４ の組立てＳａｃ Ｉ
カット（切断）プラスミドＰＫＣ２２２約１．５μｔ！
（１μｇ）、１０×バツフアー（，５Ｍトリス、ＰＨ７
，５１，ＩＭ ＭｇＣｊ？２） 、５μｌ、各＋５μｌ
の２０ ＱｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄ
ＧＴＰ、およびフラグメント［：ＤＮＡ、ｔ？リメラー
ゼ■ラージ（フレナラ）１単位含有〕１μｌを３７℃で
１５分間インキュベートした。ポリメラーゼを熱的に不
活化した後、ＢａｍＨＩ ＋）ンカーＸをＲｏｂｅｒｔ
ｓおよび１．ａｕｅｒ（１９７９）の方法と実質的に同
様にして加入Ｌ０得られたＢ ａ ｍＨＩ ＩＪンカー
含有ＤＮＡを常法通りＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、次
いで実施例２Ｂの方法と実質的に同様にしてライゲート
した。親プラスミドの数を減少するために５ａｃＩ制限
酵素で消化した後、得られたプラスミドｐＩＴ１０４Ｄ
ＮＡを用いてＷｅ ｎ ｓ −１ｎｋ（１９７４）の方
法と実質的に同様＋ｃ ＬテＥ、ｃｏｌｉ換を行なった
。形質転換体細胞をアンピンリン５０△ μｇ／ｒｎｌを含んだＬＢプレー） （Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ ａｎｄＣｏｕｒＬ、１９７９、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、
Ｇｅｎｅｔ １３ ：３１９）上においた。得られたア
ンピシリン耐性Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲ１／ｐｌＴ
１０４ 細胞を、ｐｉ”ｒ１０４を生産、単離するため
に、常法通り単離し。
立てＡ・ プラスミドｐｉＴ１０４およびＥ、ｃｏｌ
１Ｋ１２ ＲＲ１／ｐＩＴ１０４ の組立てＳａｃ Ｉ
カット（切断）プラスミドＰＫＣ２２２約１．５μｔ！
（１μｇ）、１０×バツフアー（，５Ｍトリス、ＰＨ７
，５１，ＩＭ ＭｇＣｊ？２） 、５μｌ、各＋５μｌ
の２０ ＱｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄ
ＧＴＰ、およびフラグメント［：ＤＮＡ、ｔ？リメラー
ゼ■ラージ（フレナラ）１単位含有〕１μｌを３７℃で
１５分間インキュベートした。ポリメラーゼを熱的に不
活化した後、ＢａｍＨＩ ＋）ンカーＸをＲｏｂｅｒｔ
ｓおよび１．ａｕｅｒ（１９７９）の方法と実質的に同
様にして加入Ｌ０得られたＢ ａ ｍＨＩ ＩＪンカー
含有ＤＮＡを常法通りＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、次
いで実施例２Ｂの方法と実質的に同様にしてライゲート
した。親プラスミドの数を減少するために５ａｃＩ制限
酵素で消化した後、得られたプラスミドｐＩＴ１０４Ｄ
ＮＡを用いてＷｅ ｎ ｓ −１ｎｋ（１９７４）の方
法と実質的に同様＋ｃ ＬテＥ、ｃｏｌｉ換を行なった
。形質転換体細胞をアンピンリン５０△ μｇ／ｒｎｌを含んだＬＢプレー） （Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ ａｎｄＣｏｕｒＬ、１９７９、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、
Ｇｅｎｅｔ １３ ：３１９）上においた。得られたア
ンピシリン耐性Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲ１／ｐｌＴ
１０４ 細胞を、ｐｉ”ｒ１０４を生産、単離するため
に、常法通り単離し。
培養した。プラスミドｐｌＴ１０４の構造を形質転換法
、選択法、制限酵素分析および配列分析により確認した
。
、選択法、制限酵素分析および配列分析により確認した
。
Ｘ−Ｂ ａｍＨＩリンカ−［ｄ （ＣＣＧＧＡＴＣＣ：
ＧＧ）１）は、下記の供給者から入手することができる
：Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
１２８ Ｓｐｒｉｎｇ ５ｔｒｅｅｔ、Ｌｅｘｉｎｇｔ
ｏｎ 、Ｍａｓｓａｃ’ｈｕｓｅｔｔｓ Ｑ２１７３Ｂ
、プラスミドｐＩＴ１０４のｕｐｈｉ消化プラスミドｐ
ＫＣ２２２の代りにプラスミドＰＩＴ１０４を用いるこ
と、および、その後のＰｓ【Ｉ消化を行なわないこと、
を除き、実施例２Ａと実質的に同様にして所望の消化を
行なった。得られたプラスミドルｌＴ１０４ＨｐＨＩ消
化物は、精製せずにそのまま使用した。
ＧＧ）１）は、下記の供給者から入手することができる
：Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
１２８ Ｓｐｒｉｎｇ ５ｔｒｅｅｔ、Ｌｅｘｉｎｇｔ
ｏｎ 、Ｍａｓｓａｃ’ｈｕｓｅｔｔｓ Ｑ２１７３Ｂ
、プラスミドｐＩＴ１０４のｕｐｈｉ消化プラスミドｐ
ＫＣ２２２の代りにプラスミドＰＩＴ１０４を用いるこ
と、および、その後のＰｓ【Ｉ消化を行なわないこと、
を除き、実施例２Ａと実質的に同様にして所望の消化を
行なった。得られたプラスミドルｌＴ１０４ＨｐＨＩ消
化物は、精製せずにそのまま使用した。
Ｃ，プラスミドｐＵ（，３のＨｉｎｃｎ消化プラスミド
ＰＫＣ２２２、ＨｐｈｌおよびｐｓＴＩ制限酵素、並び
に塩類の代りにプラスミドＰＵＣＢ （Ｂｅｔｌｌｅｓ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
８７１７Ｇｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｃｌｒｃｌｅ％Ｐ、０
０Ｂｏｘ ５ＱＱ９、Ｇａｉｔｈｅ−ｒｂｕｒｇ、ＭＤ
２０８７７ から市販ノモノを入手テキる）、およびＨ
ｉｎｃＩＩ制限酵素並びに反応ミックス７を用いること
を除き、実施例２Ａと実質的に同様にして所望の消化を
行なった。得られたプラスミドｐ Ｕ Ｃ８Ｈｉ ｎｃ
ｎ消化物は、精製せずにそのまま使用した。
ＰＫＣ２２２、ＨｐｈｌおよびｐｓＴＩ制限酵素、並び
に塩類の代りにプラスミドＰＵＣＢ （Ｂｅｔｌｌｅｓ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
８７１７Ｇｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｃｌｒｃｌｅ％Ｐ、０
０Ｂｏｘ ５ＱＱ９、Ｇａｉｔｈｅ−ｒｂｕｒｇ、ＭＤ
２０８７７ から市販ノモノを入手テキる）、およびＨ
ｉｎｃＩＩ制限酵素並びに反応ミックス７を用いること
を除き、実施例２Ａと実質的に同様にして所望の消化を
行なった。得られたプラスミドｐ Ｕ Ｃ８Ｈｉ ｎｃ
ｎ消化物は、精製せずにそのまま使用した。
ＨＨｉｎｃｕ制限酵素用の反応ミックスは以下の成分で
調製した＋ ５９ ｍＭ ＮａＣ１！、１０ｍＭトリス
塩酸（Ｐ’Ｈ７，５）、 １ｏ ｍＭ ＭｇＣｌ２およ
びｌ ｍＭジチオトレイット Ｄ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる３′延長鎖の除去 実施例６Ｂの１−ＩｐｈＩ消化によって残存した３′延
長鎖を、続いて平滑末端ライゲーションするために除去
した。すなわち、プラスミドｐＩＴ１０４ＨｐｂＩ消化
物約１μｍを％３３ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，８） ６
７ ｍＭ酢酸カリウム、ｌＱｍＭ酢酸マグネシウム２，
５ｍＭ ジチオトレイット１．１ｍ９／−のＢ Ｓ Ａ
、各１５０μＭのｄＣＴＰ、ｄＡ−ｒｌ”、ｄＧＴＩ）
およびＴＴＰ並びにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ３単位を含
有する溶液１０μｅ中、３７℃で約５分間インキュベー
トした。反応を、５０ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ約１μｌを
加えた後、６５℃でインキュベートすることにより常法
通り終結させた。
調製した＋ ５９ ｍＭ ＮａＣ１！、１０ｍＭトリス
塩酸（Ｐ’Ｈ７，５）、 １ｏ ｍＭ ＭｇＣｌ２およ
びｌ ｍＭジチオトレイット Ｄ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる３′延長鎖の除去 実施例６Ｂの１−ＩｐｈＩ消化によって残存した３′延
長鎖を、続いて平滑末端ライゲーションするために除去
した。すなわち、プラスミドｐＩＴ１０４ＨｐｂＩ消化
物約１μｍを％３３ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，８） ６
７ ｍＭ酢酸カリウム、ｌＱｍＭ酢酸マグネシウム２，
５ｍＭ ジチオトレイット１．１ｍ９／−のＢ Ｓ Ａ
、各１５０μＭのｄＣＴＰ、ｄＡ−ｒｌ”、ｄＧＴＩ）
およびＴＴＰ並びにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ３単位を含
有する溶液１０μｅ中、３７℃で約５分間インキュベー
トした。反応を、５０ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ約１μｌを
加えた後、６５℃でインキュベートすることにより常法
通り終結させた。
Ｅ、 Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＲＲＩΔＭｌ ５／ｐ
ＫＣ３０７のライゲーションおよび組立て 平滑末端を有するプラスミドＰＩＴ１０４とプラスミド
ｐＵＣ８消化物とを、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）
の方法に実質的に従って、常法通りライゲーションさせ
た。こうして得たｐ Ｋ Ｃ３０７（！：Ｅ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＲＲ１△Ｍ１５／ＰＫＣ３０７形質転換体
を、プラスミドｐＫｃ３０７の生産および単離のために
常法通り培養した。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３０７は通常
のＥ、ｃｏｌ ｉ菌株、例えばＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２、
Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＲＲｌ、Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ
１２ ＪＡ２２１およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩ
ＯＩ などを、実施例２Ｂの形質転換法に実質的に従っ
て形質転換することができる。プラスミドＰＫＣ３０７
の制限サイト地図を添付の第４図）こ示す。
ＫＣ３０７のライゲーションおよび組立て 平滑末端を有するプラスミドＰＩＴ１０４とプラスミド
ｐＵＣ８消化物とを、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）
の方法に実質的に従って、常法通りライゲーションさせ
た。こうして得たｐ Ｋ Ｃ３０７（！：Ｅ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＲＲ１△Ｍ１５／ＰＫＣ３０７形質転換体
を、プラスミドｐＫｃ３０７の生産および単離のために
常法通り培養した。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３０７は通常
のＥ、ｃｏｌ ｉ菌株、例えばＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２、
Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＲＲｌ、Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ
１２ ＪＡ２２１およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩ
ＯＩ などを、実施例２Ｂの形質転換法に実質的に従っ
て形質転換することができる。プラスミドＰＫＣ３０７
の制限サイト地図を添付の第４図）こ示す。
前述したプラスミドから〜１，７ ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩフを ラグメント常法に従って欠失（欠落）せしめるこ△ とにより、プラスミドＰＫＣ３０７と機能的に同等であ
る誘導体を得た。このプラスミドはｐ Ｋ Ｃ３０８と
命名され、Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１の形質
転換に用いられており、本発明を例示するものである。
ＩＩフを ラグメント常法に従って欠失（欠落）せしめるこ△ とにより、プラスミドＰＫＣ３０７と機能的に同等であ
る誘導体を得た。このプラスミドはｐ Ｋ Ｃ３０８と
命名され、Ｅ、ｃｏｌ ｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１の形質
転換に用いられており、本発明を例示するものである。
実施例７ プラスミドＰ ＩＴＩ ２５およびＥ。
ｃｏｌｉ ｘｉ２ ＪＡ２２１／ＰＩＴＩ２５の組立て
１、 プラスミドｐＩＡ７△４△１の組立てＡ、プラス
ミドｐＢＲＨｔｒｐの組立てプラスミドｐＧＭｌはΔＬ
Ｅ１４１３欠損を含むＥ、Ｃ０１１トリプトフアンオペ
ｏ ７ （Ｍｉｏｚｚａｒｉら、１９７８、Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４５７〜１４６６）を相持して
おり、従って、ｔｒｐ リーダー配列の最初の６個のア
ミノ酸およびＬｒｐＥポリペプヂドの終りの３分の１を
含んでいる融合蛋白質（以後これらを合せてＬＥ’とい
う）、並びにＬｒｐＤポリペプチドの全配列を、いずれ
もｔｒｐプロモーター／オペレーター系のコントロール
の下で発現せしめルノテある。Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２
Ｗ３１１０ ”ａ２ｔｒｐΔ１０２／ｐＧＭｌは、／１
ｕｎｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１−ｔｕｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ ｊＣ寄託され（ＡＴ ＣＣＡ３１６
２２におり、ｐＧＭｌはこの菌株から下記の如く、常法
に従って分離することができる。
１、 プラスミドｐＩＡ７△４△１の組立てＡ、プラス
ミドｐＢＲＨｔｒｐの組立てプラスミドｐＧＭｌはΔＬ
Ｅ１４１３欠損を含むＥ、Ｃ０１１トリプトフアンオペ
ｏ ７ （Ｍｉｏｚｚａｒｉら、１９７８、Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４５７〜１４６６）を相持して
おり、従って、ｔｒｐ リーダー配列の最初の６個のア
ミノ酸およびＬｒｐＥポリペプヂドの終りの３分の１を
含んでいる融合蛋白質（以後これらを合せてＬＥ’とい
う）、並びにＬｒｐＤポリペプチドの全配列を、いずれ
もｔｒｐプロモーター／オペレーター系のコントロール
の下で発現せしめルノテある。Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２
Ｗ３１１０ ”ａ２ｔｒｐΔ１０２／ｐＧＭｌは、／１
ｕｎｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１−ｔｕｒｅ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ ｊＣ寄託され（ＡＴ ＣＣＡ３１６
２２におり、ｐＧＭｌはこの菌株から下記の如く、常法
に従って分離することができる。
約２０μｇのこのプラスミドを、このプラスミドを５箇
所で切断する制限酵素Ｐｖｕ ｕで消化した。次いでこ
の遺伝子フラグメントを、後にＥｃ。
所で切断する制限酵素Ｐｖｕ ｕで消化した。次いでこ
の遺伝子フラグメントを、後にＥｃ。
ＲＩ開裂部位を含有するプラスミドヘクローンするため
に、ＥｃｏＲＩリンカ−（配列式：ｐＣＡＴＧＡＡＴＴ
ＣＡＴＧで示される自己相補性（ｓｅｌｆ ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔａｒｙ）オリゴヌクレオチドンとでＥ ｃ
ｏ Ｒ１開裂部位を作成した。ｐＧＭｌから得たＤＮＡ
フラグメント２０μｇを、５′−リン酸化合成オリゴヌ
クレオチドｐ ＣＡ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｔ ＣＡＴ
Ｇ（２００ピコモル〕の存在下、２０μｌのＴ ４ Ｄ
Ｎ Ａリガーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｉ−リス、ｐ−１
７，６１，５ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｊ７２．５
ｍＭジチオトレイット）中、４℃で一夜、Ｔ ４ Ｄ
Ｎ Ａリガーゼ（１０単位）で処理した。次いで、溶液
を７０℃で１０分間加熱してライゲーションを停止させ
た。このリンカ−をＥ ｃ ＯＲＩ消化によって開裂し
、そのＥＣ０ＲＩ末端を有するフラグメントを５多ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法（以後「ＰＡＧＥ Ｊと
呼称）で分離した。まず最初にエチジウムブロマイドに
より染色し、次いで紫外線によってフラグメントの位置
を定め、所望の部分をゲルから切り取る−ことにより、
３つの最も大きいフラグメントをゲルから分離した。各
ゲルフラグメントを３００μｌの１．ＩＸＴＢＥと共に
透析袋に入れ１．１ＸＴＢＥ緩衝液中（ＴＢＥ緩衝液：
水１１！中にトリス塩基１０．８！、ホウ酸５．５ｇお
よびＮ ａ ２ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 、０９ ｆを含有）
１時間、１００Ｖにおける電気泳動に付した。透析袋中
の水溶液ヲ集メ、フェノール抽出並びにクロロホルム抽
出を行ない、塩化ナトリウム濃度を、６２Ｍ１こ調節し
た。次いで、エタノール沈殿の後、ＤＮＡを水中に回収
した。このＥｃｏＲＩ粘着末端を持ったＬｒｐプロモー
ター／オペレーター−含有遺伝子は後述する方法で同定
した。この方法は、テトラサイクリン耐性プラスミドに
フラグメントを挿入し、これにより、プロモーター／オ
ペレーターの挿入によってテトラサイクリン耐性プラス
ミドをテトラサイクリン耐性プラスミドにするのである
。以後に述べるＤＮＡフラグメントの単離は全て上記の
如く、ＰＡＧＥを行ない、次いで電気溶出する方法で行
なった。
に、ＥｃｏＲＩリンカ−（配列式：ｐＣＡＴＧＡＡＴＴ
ＣＡＴＧで示される自己相補性（ｓｅｌｆ ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔａｒｙ）オリゴヌクレオチドンとでＥ ｃ
ｏ Ｒ１開裂部位を作成した。ｐＧＭｌから得たＤＮＡ
フラグメント２０μｇを、５′−リン酸化合成オリゴヌ
クレオチドｐ ＣＡ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｔ ＣＡＴ
Ｇ（２００ピコモル〕の存在下、２０μｌのＴ ４ Ｄ
Ｎ Ａリガーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｉ−リス、ｐ−１
７，６１，５ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｊ７２．５
ｍＭジチオトレイット）中、４℃で一夜、Ｔ ４ Ｄ
Ｎ Ａリガーゼ（１０単位）で処理した。次いで、溶液
を７０℃で１０分間加熱してライゲーションを停止させ
た。このリンカ−をＥ ｃ ＯＲＩ消化によって開裂し
、そのＥＣ０ＲＩ末端を有するフラグメントを５多ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法（以後「ＰＡＧＥ Ｊと
呼称）で分離した。まず最初にエチジウムブロマイドに
より染色し、次いで紫外線によってフラグメントの位置
を定め、所望の部分をゲルから切り取る−ことにより、
３つの最も大きいフラグメントをゲルから分離した。各
ゲルフラグメントを３００μｌの１．ＩＸＴＢＥと共に
透析袋に入れ１．１ＸＴＢＥ緩衝液中（ＴＢＥ緩衝液：
水１１！中にトリス塩基１０．８！、ホウ酸５．５ｇお
よびＮ ａ ２ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 、０９ ｆを含有）
１時間、１００Ｖにおける電気泳動に付した。透析袋中
の水溶液ヲ集メ、フェノール抽出並びにクロロホルム抽
出を行ない、塩化ナトリウム濃度を、６２Ｍ１こ調節し
た。次いで、エタノール沈殿の後、ＤＮＡを水中に回収
した。このＥｃｏＲＩ粘着末端を持ったＬｒｐプロモー
ター／オペレーター−含有遺伝子は後述する方法で同定
した。この方法は、テトラサイクリン耐性プラスミドに
フラグメントを挿入し、これにより、プロモーター／オ
ペレーターの挿入によってテトラサイクリン耐性プラス
ミドをテトラサイクリン耐性プラスミドにするのである
。以後に述べるＤＮＡフラグメントの単離は全て上記の
如く、ＰＡＧＥを行ない、次いで電気溶出する方法で行
なった。
Ｂ、Ｔｒｐ フロモーター／オペレーターのコントロー
ル下でテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドｐ
１３ Ｒ１１ｔｒｐの組立て、並びに」１記ｒＡＪで単
離したＴｒｐプロモーター／オペレーター含有ＤＮＡフ
ラグメントの同定および増幅 プラスミドｐ Ｂ ＲＨｌ （Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ら
、１９７９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ５．３２６７−３２８７およびＷｅ ｓ ｔ
ら、１９７９、Ｇｅｎｅ ７ ：２７１−２８８、に記
載された方法で組み立てられたもの。これは、Ａ＋ｎｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎに、寄託番号ＡＴＣＣ３７０７０の下に寄託さ
れている）は、アンピシリン耐性を発現すると共に、テ
トラサイクリン耐性遺伝子を含有しているが、これはプ
ロモーターを伴なっていないので、その耐性を発現する
ことはない。従って、このプラスミドはテトラサイクリ
ン感受性である。そのＥｃｏＲ１部位にプロモーター／
オペレーター系を導入してこのプラスミドをテトラサイ
クリン耐性にすることができる。
ル下でテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドｐ
１３ Ｒ１１ｔｒｐの組立て、並びに」１記ｒＡＪで単
離したＴｒｐプロモーター／オペレーター含有ＤＮＡフ
ラグメントの同定および増幅 プラスミドｐ Ｂ ＲＨｌ （Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ら
、１９７９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ５．３２６７−３２８７およびＷｅ ｓ ｔ
ら、１９７９、Ｇｅｎｅ ７ ：２７１−２８８、に記
載された方法で組み立てられたもの。これは、Ａ＋ｎｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎに、寄託番号ＡＴＣＣ３７０７０の下に寄託さ
れている）は、アンピシリン耐性を発現すると共に、テ
トラサイクリン耐性遺伝子を含有しているが、これはプ
ロモーターを伴なっていないので、その耐性を発現する
ことはない。従って、このプラスミドはテトラサイクリ
ン感受性である。そのＥｃｏＲ１部位にプロモーター／
オペレーター系を導入してこのプラスミドをテトラサイ
クリン耐性にすることができる。
プラスミドｐＢＲＨ１（ＡＴＣＣ３７０７０）をＥｃ。
Ｒ１で消化した。酵素をフェノール抽出、次いでクロロ
ホルム抽出することにより除去し、エタノール沈殿の後
、ＤＮＡを水中に回収した。得られたＤＮＡ分子を、実
施例７Ａで得た３種のＤＮＡフラグメントの各々と、別
々の反応混合物で混合し、前述の如くにしてＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼでライダ−１した。この反応混合物中のＤＮ
Ａを用いて標準的手法（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、１９
７４、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ。
ホルム抽出することにより除去し、エタノール沈殿の後
、ＤＮＡを水中に回収した。得られたＤＮＡ分子を、実
施例７Ａで得た３種のＤＮＡフラグメントの各々と、別
々の反応混合物で混合し、前述の如くにしてＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼでライダ−１した。この反応混合物中のＤＮ
Ａを用いて標準的手法（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、１９
７４、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７１ ：３４５５−３４５９
）に従い、コンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １２菌株２
９４ （Ｂａｃｋｍａｎら、１９７６、Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７３：４１７
４−４１９８、ＡＴＣＣ黒３１４４６ ）を形質転換し
、次いでこの細菌を、アンピシリン２０μｇ／ｍ１４お
よびテトラサイクリン５μｇ／−を含んだＬＢプレート
上においた。
）に従い、コンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １２菌株２
９４ （Ｂａｃｋｍａｎら、１９７６、Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７３：４１７
４−４１９８、ＡＴＣＣ黒３１４４６ ）を形質転換し
、次いでこの細菌を、アンピシリン２０μｇ／ｍ１４お
よびテトラサイクリン５μｇ／−を含んだＬＢプレート
上においた。
数個のテトラサイクリン耐性コロニーを選択し、そのプ
ラスミドＤＮＡを分離してｐＢＲＨｔｒｐと命名した。
ラスミドＤＮＡを分離してｐＢＲＨｔｒｐと命名した。
所望のフラグメントの存在を制限酵素分析で確認した。
プラスミドｐＢＲＨＬｒｐはβ−ラクタマーゼを発現し
、アンピシリン耐性を与え、さらにｔｒｐプロモーター
／オペレーターを含むＤＮＡフラグメントを含有してい
る。このＤＮＡフラグメントはまた、ｔｒｐｌＪ−グー
配列の最初の６個のアミノ酸とｔｒｐＥポリペプチドの
後方のおよそ３分の１の融合物である第１番目のタンパ
ク質（Ｌ、Ｅ’と呼称）、ＬｒｐＤポリペプチドのおよ
そ前半分に対応する第２番目のタンパク質（Ｄ’と呼称
）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子によって暗号化
された第３番目のタンパク質、をも暗号化している。
、アンピシリン耐性を与え、さらにｔｒｐプロモーター
／オペレーターを含むＤＮＡフラグメントを含有してい
る。このＤＮＡフラグメントはまた、ｔｒｐｌＪ−グー
配列の最初の６個のアミノ酸とｔｒｐＥポリペプチドの
後方のおよそ３分の１の融合物である第１番目のタンパ
ク質（Ｌ、Ｅ’と呼称）、ＬｒｐＤポリペプチドのおよ
そ前半分に対応する第２番目のタンパク質（Ｄ’と呼称
）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子によって暗号化
された第３番目のタンパク質、をも暗号化している。
Ｃ，プラスミドｐｓＯＭ７△２の組立てプラスミドｐ
Ｂ ＲＨＬｒｐをＥｃｏＲＩ制限酵素て消化し、得られ
たフラグメントをＰＡＧＥおよび電気溶出法で単離し、
ＥｃｏＲＩ消化プラスミドＰＳ ＯＭ ｌ ｌ （Ｉｔ
ａｋｕｒａら、１９７７、Ｓｃｉ、 、 １９８ ：１
０５６、イギリス特許出願公告番号第２，００７，６７
６Ａ号）と混合した。この混合物をＴ４ＤＮＡＵガーゼ
でライゲートしそのＤＮＡで前述の如くにしてＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ １２菌株２９４を形質転換した。形質転換し
た細菌をアンピシリン含有プレート上で選択し、得られ
たアンピシリン耐性コロニーを、コロニーハイブリダイ
ゼーション（Ｇｒｕｅｎｓｔｅｉｎら、１９７５、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ ７
２ ：３９５１３９６５ ）によってスクリーニングし
た。ＰＢＲＨｔｒｐから単離し、３２Ｐで放射活性を示
すべくラベルしたｔｒｐプロモーター／オペレーター含
有フラグメントを上記の実験でプローブとして用いた。
Ｂ ＲＨＬｒｐをＥｃｏＲＩ制限酵素て消化し、得られ
たフラグメントをＰＡＧＥおよび電気溶出法で単離し、
ＥｃｏＲＩ消化プラスミドＰＳ ＯＭ ｌ ｌ （Ｉｔ
ａｋｕｒａら、１９７７、Ｓｃｉ、 、 １９８ ：１
０５６、イギリス特許出願公告番号第２，００７，６７
６Ａ号）と混合した。この混合物をＴ４ＤＮＡＵガーゼ
でライゲートしそのＤＮＡで前述の如くにしてＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｋ １２菌株２９４を形質転換した。形質転換し
た細菌をアンピシリン含有プレート上で選択し、得られ
たアンピシリン耐性コロニーを、コロニーハイブリダイ
ゼーション（Ｇｒｕｅｎｓｔｅｉｎら、１９７５、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ Ａ ７
２ ：３９５１３９６５ ）によってスクリーニングし
た。ＰＢＲＨｔｒｐから単離し、３２Ｐで放射活性を示
すべくラベルしたｔｒｐプロモーター／オペレーター含
有フラグメントを上記の実験でプローブとして用いた。
コロニーハイブリダイゼーションで陽性を示した数個の
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、Ｂｇ
ｌ ■およびＢａｍＨ１酵素を用いて二重消化して行な
う制限酵素分析により、挿入フラグメントの方向性を決
定した。適切な方向性のｔｒｐプロモーター／オペレー
ターフラグメントを持った所望のプラスミドを含むコロ
ニーを１０μＱ／ｍｅのアンピシリンを含んだＬＢ培地
で増殖させた。所望のプラスミドをｐｓＯＭ７△２と命
名し、以下に述べる組立てに用いた。
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、Ｂｇ
ｌ ■およびＢａｍＨ１酵素を用いて二重消化して行な
う制限酵素分析により、挿入フラグメントの方向性を決
定した。適切な方向性のｔｒｐプロモーター／オペレー
ターフラグメントを持った所望のプラスミドを含むコロ
ニーを１０μＱ／ｍｅのアンピシリンを含んだＬＢ培地
で増殖させた。所望のプラスミドをｐｓＯＭ７△２と命
名し、以下に述べる組立てに用いた。
Ｄ、プラスミドｐＴｒｐ２４の組立て
１） ＬＥ／ポリペプチドの遠位領域に関するコドンを
含む遺伝子フラグメントであって、その暗号鎖の５′並
ひに３′末端にそれぞれＢｇｌ ＩＩおよびＥｃ。
含む遺伝子フラグメントであって、その暗号鎖の５′並
ひに３′末端にそれぞれＢｇｌ ＩＩおよびＥｃ。
Ｒ１制限部位を有するフラグメントの組立てプラスミド
ｐｓＯＭ７△２をＨｉｎｄ ｌｌｌ消化した後、ＬＥ’
暗号領域内のＢｇｌ［制限部位を越えて消化が行なわれ
る様な条件を選んでラムダエキソヌクレアーゼ（５′か
ら３′へのエキソヌクレアーゼ）で消化した。約２０
ＮのＨｉｎｄ Ｎ消化ｐｓＯＭ７△２を緩衝液（２Ｑｍ
Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ９，６，１ｍ ＭＭｇＣ１２，
１ｍＭβ−メルカプトエタノール）に溶かした。得られ
た混合物をラムダエキソヌクレアーゼ５単位により、室
温で６０分間処理した。得られた反応混合物をフェノー
ル抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿を行
なった。
ｐｓＯＭ７△２をＨｉｎｄ ｌｌｌ消化した後、ＬＥ’
暗号領域内のＢｇｌ［制限部位を越えて消化が行なわれ
る様な条件を選んでラムダエキソヌクレアーゼ（５′か
ら３′へのエキソヌクレアーゼ）で消化した。約２０
ＮのＨｉｎｄ Ｎ消化ｐｓＯＭ７△２を緩衝液（２Ｑｍ
Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ９，６，１ｍ ＭＭｇＣ１２，
１ｍＭβ−メルカプトエタノール）に溶かした。得られ
た混合物をラムダエキソヌクレアーゼ５単位により、室
温で６０分間処理した。得られた反応混合物をフェノー
ル抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿を行
なった。
ＬＥ／遺伝子フラグメントの遠位末端にＥｃｏＲＩ残分
（ｒｅｓｉｄｕｅ）を形成するために、改良ホスホトリ
エステル法（Ｃｒｅａ ら、１９７８）に従ってプライ
マー、３２ＰｃｃＴＧＴＧｃＡＴＧＡＴを合成し、ラム
ダエキソヌクレアーゼ消化によって生成したＬＥ’遺伝
子フラグメントの一本鎖末端にハイブリダイズさせた。
（ｒｅｓｉｄｕｅ）を形成するために、改良ホスホトリ
エステル法（Ｃｒｅａ ら、１９７８）に従ってプライ
マー、３２ＰｃｃＴＧＴＧｃＡＴＧＡＴを合成し、ラム
ダエキソヌクレアーゼ消化によって生成したＬＥ’遺伝
子フラグメントの一本鎖末端にハイブリダイズさせた。
このハイブリダイゼーションは、エキソヌクレアーゼ処
理したプラスミドｐｓＯＭ７△２の１（ｉｎｄ ｌ［消
化物２０ ｔｔｌｌ を水２０ ｔｔｌ に溶解し、上
記の５′−りん酸化オリゴヌクレオチドを約８０ピコモ
ル含有する６μｌの溶液と混合することにより行なった
。合成フラグメントはＬＥ’暗号配列の３′末端に結合
し、残るＬＥ／フラグメントの１本鎖を、ｄＡＴＰ、Ｔ
Ｔｐ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを用いてタレナウボリメ
ラーゼエで充填した。クレナウボリメラーゼエはＤＮＡ
ポリメラーゼエのタンパク分解的開裂で得られるフラグ
メントである。これは５’Ｔ ３’ （５’から３′へ
の）ポリメラーゼ作用および３′→５′工キンヌクレア
ーゼ作用を有するが、親酵素の有する５′→３′工キソ
ヌクＬ／７−ゼ作用は持たなイ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ 、
１９７４、Ｗ、ＨｏＦｒｅｅｍａｎ、ａｎｄ ｃｏ、
、Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ 。
理したプラスミドｐｓＯＭ７△２の１（ｉｎｄ ｌ［消
化物２０ ｔｔｌｌ を水２０ ｔｔｌ に溶解し、上
記の５′−りん酸化オリゴヌクレオチドを約８０ピコモ
ル含有する６μｌの溶液と混合することにより行なった
。合成フラグメントはＬＥ’暗号配列の３′末端に結合
し、残るＬＥ／フラグメントの１本鎖を、ｄＡＴＰ、Ｔ
Ｔｐ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを用いてタレナウボリメ
ラーゼエで充填した。クレナウボリメラーゼエはＤＮＡ
ポリメラーゼエのタンパク分解的開裂で得られるフラグ
メントである。これは５’Ｔ ３’ （５’から３′へ
の）ポリメラーゼ作用および３′→５′工キンヌクレア
ーゼ作用を有するが、親酵素の有する５′→３′工キソ
ヌクＬ／７−ゼ作用は持たなイ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ 、
１９７４、Ｗ、ＨｏＦｒｅｅｍａｎ、ａｎｄ ｃｏ、
、Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ 。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ ）。
すなわち、反応混合物を５０℃に加熱し、徐々に１０℃
まで冷却し、その後４μ召のフレナラ酵素を加えた。室
温で１５分間インキュベーションした後、３７℃で３０
分間インキュベーションし１．２５ＭＥＤＴＡ ５μｌ
を加えて反応を停止させた。
まで冷却し、その後４μ召のフレナラ酵素を加えた。室
温で１５分間インキュベーションした後、３７℃で３０
分間インキュベーションし１．２５ＭＥＤＴＡ ５μｌ
を加えて反応を停止させた。
反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出した後
、エタノール沈殿に付した。次いでＤＮＡを制限酵素Ｂ
ｇｌ ■で開裂させ、フラグメントをＰＡＧＥで分離し
た。ゲルをオートラジオグラムにかけたところ、約４７
０ ｂｐ という予測された長さの３２Ｐラベル−フラ
グメントが存在することがわかった。これを電気溶出法
で回収した。概説した様に、このフラグメン）ＬＥ’（
ｄ）はＢｇｌｌｉ末端と、プライマーの開始点に符号す
る平滑末端とを有している。
、エタノール沈殿に付した。次いでＤＮＡを制限酵素Ｂ
ｇｌ ■で開裂させ、フラグメントをＰＡＧＥで分離し
た。ゲルをオートラジオグラムにかけたところ、約４７
０ ｂｐ という予測された長さの３２Ｐラベル−フラ
グメントが存在することがわかった。これを電気溶出法
で回収した。概説した様に、このフラグメン）ＬＥ’（
ｄ）はＢｇｌｌｉ末端と、プライマーの開始点に符号す
る平滑末端とを有している。
２）プラスミドｐＴｂｃｔｌの組立て
プラスミドｐＴｈα１は、チモシンアルファ１のための
合成遺伝子をプラスミドＰＢＲ３２２に挿入することに
より、組立てた。チモシンアルファ１暗号ＤＮＡは、添
付の第５図において両頭矢印（０）で指示した１６個の
オリゴヌクレオチド（１゛１〜Ｔ□６）の合成、および
それらのライゲーションにより合成した。Ｎ末端にＭｅ
ｔ（メチオニン）コトンＡＴＧを挿入し、５′末端を、
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで開裂したプラスミドに結合し
易くするために、−重鎖粘着末端を持つ様に調整した。
合成遺伝子をプラスミドＰＢＲ３２２に挿入することに
より、組立てた。チモシンアルファ１暗号ＤＮＡは、添
付の第５図において両頭矢印（０）で指示した１６個の
オリゴヌクレオチド（１゛１〜Ｔ□６）の合成、および
それらのライゲーションにより合成した。Ｎ末端にＭｅ
ｔ（メチオニン）コトンＡＴＧを挿入し、５′末端を、
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで開裂したプラスミドに結合し
易くするために、−重鎖粘着末端を持つ様に調整した。
容易に理解されるであろうが、組換えプラスミドの分析
（同定）には、遺伝子の中心にあるＢｇｌ ■部位が役
立つ。
（同定）には、遺伝子の中心にあるＢｇｌ ■部位が役
立つ。
オリゴデオキシリボヌクレオチドＴ０〜Ｔ１６は、完全
に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド組立てブロ
ックを用いて、改良ホスホトリエステル法（Ｉ ｔａｋ
ｕｒａら、１９７７およびＣｒｅａら、１９７８月こ従
って合成された。種々のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを表１に示す。
に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド組立てブロ
ックを用いて、改良ホスホトリエステル法（Ｉ ｔａｋ
ｕｒａら、１９７７およびＣｒｅａら、１９７８月こ従
って合成された。種々のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを表１に示す。
上記の化合物の合成は、添付の第６図に総括した、下記
のフラグメントＴ□５に関する合成方法で代表される。
のフラグメントＴ□５に関する合成方法で代表される。
”１５の合成に用いた種々のヌクレオチドフラグメント
を、図面に数字で表わした。また、採用した略号は次の
通りである：ＴＰＳＴｅ ＝２．４．６−）リイソプロ
ピルベンゼンスルホニルテトラゾール１ＢｓＡ−ベンゼ
ンスルホン酸１ＴＬＣ−薄層クロマトグラフイー逼ＨＰ
ＬＣ＝高速液体クロマトグラフィーｉＤＭＴ＝４．４’
−ジメトキシトリチル；ｃＥ＝２−シアンエチルｉ ”
＝ Ｐ −クロロフェニル；ＢＺ−ベンゾイル； Ａ
ｎ−アニソイル；１Ｂｕ＝インブチリル１Ｐｙ−ピリ
ジン；Ａｃ０Ｈ−酢酸； Ｅｔ３Ｎ＝ｌ−リエチルアミ
ン。
を、図面に数字で表わした。また、採用した略号は次の
通りである：ＴＰＳＴｅ ＝２．４．６−）リイソプロ
ピルベンゼンスルホニルテトラゾール１ＢｓＡ−ベンゼ
ンスルホン酸１ＴＬＣ−薄層クロマトグラフイー逼ＨＰ
ＬＣ＝高速液体クロマトグラフィーｉＤＭＴ＝４．４’
−ジメトキシトリチル；ｃＥ＝２−シアンエチルｉ ”
＝ Ｐ −クロロフェニル；ＢＺ−ベンゾイル； Ａ
ｎ−アニソイル；１Ｂｕ＝インブチリル１Ｐｙ−ピリ
ジン；Ａｃ０Ｈ−酢酸； Ｅｔ３Ｎ＝ｌ−リエチルアミ
ン。
完全に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド（４）
（８５〜１．Ｑ５ｍＭ ）および（２）（１８０＃、。
（８５〜１．Ｑ５ｍＭ ）および（２）（１８０＃、。
１ｍＭ）を、７ ： ３ （Ｖ／Ｖ）のクロロホルム／
メタ／−ル中の２％ＢＳＡ（それぞれ１０および２０を ｍｅ ）により、０℃で１０分間処理し、５′の水酸へ
脱保護した。重炭酸アンモニウム飽和水溶液（２ｗｇ
）を加えて反応を止め、クロロホルム（２５ｄ）で抽出
した後、水洗した（２Ｘ１０１１Ｌｌ）。有機層を硫酸
マグネシウムで乾燥し、少量（約５−）になるまで濃縮
した後、石油エーテル（３５°〜６０℃留分）を加えて
沈殿させた。無色の沈殿を遠心分離して集め、真空デシ
ケータ−内で乾燥すると、いずれもシリカゲルＴ Ｌ
Ｃ（Ｍｅｒｃｋ ６０ Ｆ２５４、クロロホルム／メタ
ノール、９．：１）でホモジーニアス（均一）な（６）
および（８）を得た。
メタ／−ル中の２％ＢＳＡ（それぞれ１０および２０を ｍｅ ）により、０℃で１０分間処理し、５′の水酸へ
脱保護した。重炭酸アンモニウム飽和水溶液（２ｗｇ
）を加えて反応を止め、クロロホルム（２５ｄ）で抽出
した後、水洗した（２Ｘ１０１１Ｌｌ）。有機層を硫酸
マグネシウムで乾燥し、少量（約５−）になるまで濃縮
した後、石油エーテル（３５°〜６０℃留分）を加えて
沈殿させた。無色の沈殿を遠心分離して集め、真空デシ
ケータ−内で乾燥すると、いずれもシリカゲルＴ Ｌ
Ｃ（Ｍｅｒｃｋ ６０ Ｆ２５４、クロロホルム／メタ
ノール、９．：１）でホモジーニアス（均一）な（６）
および（８）を得た。
トリマー（三量体）（１）および（３） （２７０ｍｇ
ｌ、１５ｍＭ１１４５１１Ｗ 、、０７５ｍＭ ）をト
リエチルアミン／ピリジン／水（１：３：１、ｖ ／
ｖ、１０Ｉｌ＋Ｉりにより室温で２５分間処理すること
により、ホスホジエステル、（５）および（７）に変換
した。ロータリーエバポレーターを用いて反応剤を留去
し、残留物を無水ピリジンと共に繰返し蒸留することに
より（３Ｘ１０ｓ＋／）乾燥した。トリマー（８）（，
９５ｍＭ）とトリマー（７）とを無水ピリジン（３ｗｇ
）中でＴＰＳＴｅ （５０Ｍｇ、１５ｍＭ）と混合し
、この反応混合物を、減圧下に、室温で２時間放置した
。ＴＬＣ分析の結果、トリマー（８）の９５鴨かヘキサ
マー生成物に変換していることがわかった（１０悌硫酸
水溶液を噴霧し、６０℃に加熱することにより、ＤＭＴ
基を検出して観察した）。
ｌ、１５ｍＭ１１４５１１Ｗ 、、０７５ｍＭ ）をト
リエチルアミン／ピリジン／水（１：３：１、ｖ ／
ｖ、１０Ｉｌ＋Ｉりにより室温で２５分間処理すること
により、ホスホジエステル、（５）および（７）に変換
した。ロータリーエバポレーターを用いて反応剤を留去
し、残留物を無水ピリジンと共に繰返し蒸留することに
より（３Ｘ１０ｓ＋／）乾燥した。トリマー（８）（，
９５ｍＭ）とトリマー（７）とを無水ピリジン（３ｗｇ
）中でＴＰＳＴｅ （５０Ｍｇ、１５ｍＭ）と混合し
、この反応混合物を、減圧下に、室温で２時間放置した
。ＴＬＣ分析の結果、トリマー（８）の９５鴨かヘキサ
マー生成物に変換していることがわかった（１０悌硫酸
水溶液を噴霧し、６０℃に加熱することにより、ＤＭＴ
基を検出して観察した）。
この反応物に水（１ｍ／）を加えてクエンチングし、溶
媒を減圧蒸留した。トルエンと共に共沸蒸留してピリジ
ンを除いた後、トリマー（４）および（２）に関して記
述した如く、２％ＢＳＡ（８ｄ）でこのヘキサマーの５
′位を脱保護した。この生成物（１０）ヲシリカゲルｆ
）ラム（Ｍｅｒｃｋ ５ＱＨ，３，５ｘ５α）にカケ、
クロロホルム／メタノール（９８：２〜９５：５、■／
ｖ）による段階的傾斜溶出により精製した。生成物（１
のを含む両分を蒸発乾固した。
媒を減圧蒸留した。トルエンと共に共沸蒸留してピリジ
ンを除いた後、トリマー（４）および（２）に関して記
述した如く、２％ＢＳＡ（８ｄ）でこのヘキサマーの５
′位を脱保護した。この生成物（１０）ヲシリカゲルｆ
）ラム（Ｍｅｒｃｋ ５ＱＨ，３，５ｘ５α）にカケ、
クロロホルム／メタノール（９８：２〜９５：５、■／
ｖ）による段階的傾斜溶出により精製した。生成物（１
のを含む両分を蒸発乾固した。
同様に、トリマー（５）を（６）につなぎ、完全に保護
された生成物を直接、シリカゲルで精製した。
された生成物を直接、シリカゲルで精製した。
この生成物の３′末端を、トリエチルアミン／ピリジン
／水を用いて前述の如く脱保護してフラグメント（９）
を得た。
／水を用いて前述の如く脱保護してフラグメント（９）
を得た。
ｉ後に、ヘキサマー（９）と（１のとを、無水ピリジン
（２ｄ）中、ＴＰＳＴｅ （７５Ｗ１．２２５ｍＭ ）
を縮合剤として用いて結合させた。反応完了後（周囲温
度で４時間）、混合物をロータリーエバポレーターで蒸
留し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた
。石油エーテルを加えると生成物（ｕ）（１６ｏ＃）が
析出した。こうして得たものハＴ Ｌ Ｃてホモジーニ
アスであった。化合物（１１）の一部（２ｏｑ）をピリ
ジン（，５ｄ）に入れ、濃水酸化アンモニウム処理（７
ｍＪ、８時間、６０℃）および８０％酢酸処理（１５分
間、周囲温度）をこの順序で行なうことにより、完全に
脱保護した。
（２ｄ）中、ＴＰＳＴｅ （７５Ｗ１．２２５ｍＭ ）
を縮合剤として用いて結合させた。反応完了後（周囲温
度で４時間）、混合物をロータリーエバポレーターで蒸
留し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた
。石油エーテルを加えると生成物（ｕ）（１６ｏ＃）が
析出した。こうして得たものハＴ Ｌ Ｃてホモジーニ
アスであった。化合物（１１）の一部（２ｏｑ）をピリ
ジン（，５ｄ）に入れ、濃水酸化アンモニウム処理（７
ｍＪ、８時間、６０℃）および８０％酢酸処理（１５分
間、周囲温度）をこの順序で行なうことにより、完全に
脱保護した。
酢酸を留去した後、固型残留物を４％水酸化アンモニウ
ム水溶液（ｖ／ｖ 、 ４ｔｒｒｌ ）に溶かし、エチ
ルエーテル（３Ｘ２ｍ／）で抽出した。水層を１〜２ｒ
ｇｌに濃縮し、その一部をＩ−ＩＰＬｃにかけて（１２
）を精製した。主ピークに相当する両分をプールしく０
゜０．２５４約２，０単位）、約５−に濃縮した。この
最終生成物（１２）を、Ｂｉｏ−ｇｅｌ Ｐ −２（１
，５Ｘ１００ｃｍ）にかけ、２０％エタノール水溶液で
溶離して脱塩処理し、蒸発乾固した後、水（２００μｍ
りに再懸濁してＡ２５４ ＝ １０の溶液とした。化合
物（１２）の配列は２次元配列決定法で確認した。
ム水溶液（ｖ／ｖ 、 ４ｔｒｒｌ ）に溶かし、エチ
ルエーテル（３Ｘ２ｍ／）で抽出した。水層を１〜２ｒ
ｇｌに濃縮し、その一部をＩ−ＩＰＬｃにかけて（１２
）を精製した。主ピークに相当する両分をプールしく０
゜０．２５４約２，０単位）、約５−に濃縮した。この
最終生成物（１２）を、Ｂｉｏ−ｇｅｌ Ｐ −２（１
，５Ｘ１００ｃｍ）にかけ、２０％エタノール水溶液で
溶離して脱塩処理し、蒸発乾固した後、水（２００μｍ
りに再懸濁してＡ２５４ ＝ １０の溶液とした。化合
物（１２）の配列は２次元配列決定法で確認した。
ソマトスタシン（Ｉｔａｋｕｒａら、１９７７）および
成長ホルモン（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９ 、 Ｎａ
ｔｕｒｅ２８１：５４４）ｌこ関して既に詳細に述べら
れている方法に従って、１６個の合成オリゴヌクレオチ
ドから、完全なチモシンα１遺伝子を組立てた。１０μ
ｆづつのオリゴヌクレオチドＴ２〜Ｔ１５を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）
の存在下、Ｃ７−”２Ｐ） −ＡＴＰ （Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ ）で定量的にリン酸化し、
比活性的ＩＣｉ／ｍｍｏｌ のものを得た。この放射性
同位元素でラベルしたフラグメントを２０係ポリアクリ
ルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動法で精製し、溶出した
フラグメントの配列を、二次元電気泳動法／部分的ヘビ
毒消化物のホモクロマトグラフィー法（Ｊａｙら、１９
７４ 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １
：３３１）に従って確認した。フラグメントＴ□およ
び”１６は、以後のライゲーション反応に伴なう望まし
くない重合反応を最少限度にとどめるため、りん酸化せ
ずにおいた。これらのオリゴヌクレオチド（各２ｔｔｆ
）ヲ、公知の手法（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）に従
い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、４フラグメントから
なる４つのグループに組立てた（第７図参照）。こうし
て得た生成物を７Ｍの尿素を含んだ１５％ポリアクリル
アミドゲルによるゲル電気泳動法で精製した（ Ｍａｘ
ａｍ ａｎｄ Ｇ１１ｂｅｒＬ、１９７７、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７１：３４
５５）。単離した４種の生成物をライゲートし、反応混
合物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析
シタ。チモシンアルファ１遺伝子の大キサ（９０〜１０
５塩基対）のＤＮＡを電気溶出して得た。
成長ホルモン（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９ 、 Ｎａ
ｔｕｒｅ２８１：５４４）ｌこ関して既に詳細に述べら
れている方法に従って、１６個の合成オリゴヌクレオチ
ドから、完全なチモシンα１遺伝子を組立てた。１０μ
ｆづつのオリゴヌクレオチドＴ２〜Ｔ１５を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）
の存在下、Ｃ７−”２Ｐ） −ＡＴＰ （Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ ）で定量的にリン酸化し、
比活性的ＩＣｉ／ｍｍｏｌ のものを得た。この放射性
同位元素でラベルしたフラグメントを２０係ポリアクリ
ルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動法で精製し、溶出した
フラグメントの配列を、二次元電気泳動法／部分的ヘビ
毒消化物のホモクロマトグラフィー法（Ｊａｙら、１９
７４ 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １
：３３１）に従って確認した。フラグメントＴ□およ
び”１６は、以後のライゲーション反応に伴なう望まし
くない重合反応を最少限度にとどめるため、りん酸化せ
ずにおいた。これらのオリゴヌクレオチド（各２ｔｔｆ
）ヲ、公知の手法（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）に従
い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、４フラグメントから
なる４つのグループに組立てた（第７図参照）。こうし
て得た生成物を７Ｍの尿素を含んだ１５％ポリアクリル
アミドゲルによるゲル電気泳動法で精製した（ Ｍａｘ
ａｍ ａｎｄ Ｇ１１ｂｅｒＬ、１９７７、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７１：３４
５５）。単離した４種の生成物をライゲートし、反応混
合物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析
シタ。チモシンアルファ１遺伝子の大キサ（９０〜１０
５塩基対）のＤＮＡを電気溶出して得た。
プラスミドｐＢＲ３２２（，５μｇ）をＢａｍ１−Ｉ
ＩおよヒＥｃｏ ＲＩ 制限エンドヌクレアーゼで処理
し、生成したフラグメントをポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で分離した。大きいフラグメントを電気溶出し
てゲルから回収し、組立てた合成りＮＡとライゲートし
た（ Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）。この混合物をＥ
、ＣＯＩ ｉ Ｋ １２菌株２ｇ４ （ＡＴＣＣ塵３１
４４６）の形質転換に用いた。この形質転換混合物の５
哄を２０μｇ／−のアンピシリンを含んだＬＢプレート
上においた。得られたアンピシリン耐性コロニーはテト
ラサイクリン感受性であり、テトラサイクリン耐性遺伝
子への挿入を示唆した。これらのコロニーから得られた
プラスミドを分析した結果、どの場合にも、このプラス
ミド（ｐＴｈα１と命名）は、（すｐＢＲ３２２自身に
は含まれていないＢｇｌ ｌＩ部位を含んでおり（従っ
て第５図に示す如くチモシンアルファ１遺伝子の存在を
示唆している）、（ｂ） Ｂａｍ ＨＩ ／ Ｅｃｏ
ＲＩ開裂で生じた約１０５個の塩基対から成るフラグメ
ントを含んでいた。プラスミドｐＴｈα１の組立て図（
縮尺通りでない）を添付の第７図に示す。図中、黒点（
、）は５′−ホスフェート基を表わしている。
ＩおよヒＥｃｏ ＲＩ 制限エンドヌクレアーゼで処理
し、生成したフラグメントをポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で分離した。大きいフラグメントを電気溶出し
てゲルから回収し、組立てた合成りＮＡとライゲートし
た（ Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）。この混合物をＥ
、ＣＯＩ ｉ Ｋ １２菌株２ｇ４ （ＡＴＣＣ塵３１
４４６）の形質転換に用いた。この形質転換混合物の５
哄を２０μｇ／−のアンピシリンを含んだＬＢプレート
上においた。得られたアンピシリン耐性コロニーはテト
ラサイクリン感受性であり、テトラサイクリン耐性遺伝
子への挿入を示唆した。これらのコロニーから得られた
プラスミドを分析した結果、どの場合にも、このプラス
ミド（ｐＴｈα１と命名）は、（すｐＢＲ３２２自身に
は含まれていないＢｇｌ ｌＩ部位を含んでおり（従っ
て第５図に示す如くチモシンアルファ１遺伝子の存在を
示唆している）、（ｂ） Ｂａｍ ＨＩ ／ Ｅｃｏ
ＲＩ開裂で生じた約１０５個の塩基対から成るフラグメ
ントを含んでいた。プラスミドｐＴｈα１の組立て図（
縮尺通りでない）を添付の第７図に示す。図中、黒点（
、）は５′−ホスフェート基を表わしている。
３）処理ｐ’Ｔｈα１とＬＥ’（ｄ）フラグメントの反
応 プラスミドｐＴｈα１は、アンピシリン耐性を指定する
遺伝子と、その５′暗号鎖末端がＥｃｏＲ１部位に、ま
たその３′末端がＢａｍＨＩ部位にクローンされた、チ
モシンα１を指定する構造遺伝子を含有している。この
チモシン遺伝子はＢｇｌ ＩＩ部位をも有している。先
に調製したＬＥ’ （ｄ）フラグメントを受け入れるこ
とができるプラスミドを調製するために、このｐＴｈσ
１をＥｃｏＲＩ消化し、次いで、ＴＴＰおよびｄＡＴＰ
を加えてタレナラポリメラーゼＩ反応に付し、ＥｃｏＲ
１残分を平滑化した。
応 プラスミドｐＴｈα１は、アンピシリン耐性を指定する
遺伝子と、その５′暗号鎖末端がＥｃｏＲ１部位に、ま
たその３′末端がＢａｍＨＩ部位にクローンされた、チ
モシンα１を指定する構造遺伝子を含有している。この
チモシン遺伝子はＢｇｌ ＩＩ部位をも有している。先
に調製したＬＥ’ （ｄ）フラグメントを受け入れるこ
とができるプラスミドを調製するために、このｐＴｈσ
１をＥｃｏＲＩ消化し、次いで、ＴＴＰおよびｄＡＴＰ
を加えてタレナラポリメラーゼＩ反応に付し、ＥｃｏＲ
１残分を平滑化した。
得られた生成物をＢｇｌ ＩＩ消化すると、アンピシリ
ン耐性に関する遺伝子と、その両方の末端に、Ｂｇｌ■
粘着残分と平滑末端とを有する直線状ＤＮＡフラグメン
トが得られた。得られた生成物を１４リガーゼの存在下
、Ｂｇｌ ＩＩ粘着末端と平滑末端とを有するＬＥ’（
ｄ）フラグメントと反応させることにより再環化し、プ
ラスミドｐＴｒｐ２４を得ることができた。この様にし
て、平滑末端結合が行なわれた箇所にＥｃｏＲＩ部位が
再生成される。
ン耐性に関する遺伝子と、その両方の末端に、Ｂｇｌ■
粘着残分と平滑末端とを有する直線状ＤＮＡフラグメン
トが得られた。得られた生成物を１４リガーゼの存在下
、Ｂｇｌ ＩＩ粘着末端と平滑末端とを有するＬＥ’（
ｄ）フラグメントと反応させることにより再環化し、プ
ラスミドｐＴｒｐ２４を得ることができた。この様にし
て、平滑末端結合が行なわれた箇所にＥｃｏＲＩ部位が
再生成される。
Ｅ、プラスミドｐｓＯＭ７へ２△４の組立てｐＴｒｐ２
４をＢｇｌ ］ＩとＥｃｏ ＲＩで順次消化し、次いで
ｐＡＧＥにかけ、電気溶出することにより、ＬＥ’ （
ｄ）ポリペプチドのコドンであって、その暗号鎖の３′
末端に隣接するＥｃｏＲＩ粘着末端と、 Ｂｇｌ■粘着
末端を有するコドンを持ったフラグメントを得た。この
ＬＥ／ （ｄ）フラグメントをプラスミドｐＳｏｍ７△
２のＢｇｌ ■部位にクローンして、トリプトファンプ
ロモーター／オペレーターのコントロール下に発現され
るＬＥ’ポリペプチド／ソマトスタチン融合タンパク質
を形成させることができる。そのためには、（１）トリ
プトファンプロモーター／オペレーターから遠位のＥｃ
ｏＲ１部位を開裂せしめるためにｐｓｏｍ７△７の部分
的ＥｃｏＲ１消化を行なう、（２）コドンの解読枠を適
切に保持すると共にＥｃｏＲＩ開裂部位を再生成する様
なプライマー配列の適切な選択が必要である。
４をＢｇｌ ］ＩとＥｃｏ ＲＩで順次消化し、次いで
ｐＡＧＥにかけ、電気溶出することにより、ＬＥ’ （
ｄ）ポリペプチドのコドンであって、その暗号鎖の３′
末端に隣接するＥｃｏＲＩ粘着末端と、 Ｂｇｌ■粘着
末端を有するコドンを持ったフラグメントを得た。この
ＬＥ／ （ｄ）フラグメントをプラスミドｐＳｏｍ７△
２のＢｇｌ ■部位にクローンして、トリプトファンプ
ロモーター／オペレーターのコントロール下に発現され
るＬＥ’ポリペプチド／ソマトスタチン融合タンパク質
を形成させることができる。そのためには、（１）トリ
プトファンプロモーター／オペレーターから遠位のＥｃ
ｏＲ１部位を開裂せしめるためにｐｓｏｍ７△７の部分
的ＥｃｏＲ１消化を行なう、（２）コドンの解読枠を適
切に保持すると共にＥｃｏＲＩ開裂部位を再生成する様
なプライマー配列の適切な選択が必要である。
すなわち、プラスミドｐｓｏｍ７△２（１６μｇ）を、
２０ｍＭ）リス（ＰＨ７，５）、５ ｒｎＭＭｇｃ５ｚ
１．０２ＮＰ４０洗浄剤およびｌ Ｑ Ｑ ｍＭＮａ
ｃＪＪを含む緩衝液２００μｇで希釈し１．５単位のＥ
ｃｏＲＩで処理した。３７℃で１５分経過した後、反応
混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈殿に付し、次いでＢｇｌ Ｉ［で消化した。得
られたフラグメントの大きい方をＰＡＧＥ法および電気
溶出法で単離した。このフラグメントはＬＥ’ポリペプ
チドの近位の末端（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｎｄ）部分、
即ち、Ｂｇｌ （１部位の上流部分に関するコドン「Ｌ
Ｅ′（Ｐ）」を含んでいる。次いでこのフラグメントを
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、上記ＬＥ’ （ｄ）に
ライゲートし、プラスミドｐＳｏｍ７△２△４を形成さ
せる。これをＥ、 ｃｏｌ ｉ菌株２９４に導入すると
、トリプトファンプロモーター／オペレーターのコント
ロール下に、完全に再構成されたＬＥポリペプチドとソ
マトスタチンから成る融合タンパク質が効率良く生産さ
れた。
２０ｍＭ）リス（ＰＨ７，５）、５ ｒｎＭＭｇｃ５ｚ
１．０２ＮＰ４０洗浄剤およびｌ Ｑ Ｑ ｍＭＮａ
ｃＪＪを含む緩衝液２００μｇで希釈し１．５単位のＥ
ｃｏＲＩで処理した。３７℃で１５分経過した後、反応
混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈殿に付し、次いでＢｇｌ Ｉ［で消化した。得
られたフラグメントの大きい方をＰＡＧＥ法および電気
溶出法で単離した。このフラグメントはＬＥ’ポリペプ
チドの近位の末端（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｎｄ）部分、
即ち、Ｂｇｌ （１部位の上流部分に関するコドン「Ｌ
Ｅ′（Ｐ）」を含んでいる。次いでこのフラグメントを
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、上記ＬＥ’ （ｄ）に
ライゲートし、プラスミドｐＳｏｍ７△２△４を形成さ
せる。これをＥ、 ｃｏｌ ｉ菌株２９４に導入すると
、トリプトファンプロモーター／オペレーターのコント
ロール下に、完全に再構成されたＬＥポリペプチドとソ
マトスタチンから成る融合タンパク質が効率良く生産さ
れた。
Ｆ、テトラサイクリン耐性を特定する遺伝子を囲んで３
′末端にＰｓｔＩ残基を、またその５′末端にＢｇｌ
ｌ［残基を有する直線状ＤＮＡの組立てプラスミドｐＢ
Ｒ３２２をＨｉｎｄ ｌ［消化し、突出したＨｉｎｄ
１［末端を５１ヌクレアーゼで消化した。
′末端にＰｓｔＩ残基を、またその５′末端にＢｇｌ
ｌ［残基を有する直線状ＤＮＡの組立てプラスミドｐＢ
Ｒ３２２をＨｉｎｄ ｌ［消化し、突出したＨｉｎｄ
１［末端を５１ヌクレアーゼで消化した。
この８１ヌクレアーゼ消化は、１０μｆの１（ｉｎｄ■
開裂ｐＢＲ３２２をｓ１緩衝液（，３Ｍ ＮａＣ１、１
ｍＭＺｎｃｄ２．２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５
）３０μβ中、３００単位の５１ヌクレアーゼで、１５
℃において３０分間処理することにより行なつた。３０
×５１ヌクレアーゼ停止溶液（，８Ｍトリス塩基、５
ＱｍＭＥＤＴＡ）１μβを加えることにより反応を終了
させた。この混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽
出、およびエタノール沈殿に付し、次いで既述した様に
してＥｃｏＲＩ消化した。ＰＡＧＥ法、次いで電気溶出
法を適用して得られたフラグメントは、ＥｃｏＲ１粘着
末端と平滑末端を有し、その暗号鎖がヌクレオチド、チ
ミジンから開始されるものであった。この、チミジンか
ら始まるＳ１消化Ｈｉｎｄ ｌ［残分をタレナラポリメ
ラーゼ１処理Ｂｇｌ ■残分と混合し、ライゲーション
することによってＢｇｌ ■制限部位を再構成すること
ができる。
開裂ｐＢＲ３２２をｓ１緩衝液（，３Ｍ ＮａＣ１、１
ｍＭＺｎｃｄ２．２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５
）３０μβ中、３００単位の５１ヌクレアーゼで、１５
℃において３０分間処理することにより行なつた。３０
×５１ヌクレアーゼ停止溶液（，８Ｍトリス塩基、５
ＱｍＭＥＤＴＡ）１μβを加えることにより反応を終了
させた。この混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽
出、およびエタノール沈殿に付し、次いで既述した様に
してＥｃｏＲＩ消化した。ＰＡＧＥ法、次いで電気溶出
法を適用して得られたフラグメントは、ＥｃｏＲ１粘着
末端と平滑末端を有し、その暗号鎖がヌクレオチド、チ
ミジンから開始されるものであった。この、チミジンか
ら始まるＳ１消化Ｈｉｎｄ ｌ［残分をタレナラポリメ
ラーゼ１処理Ｂｇｌ ■残分と混合し、ライゲーション
することによってＢｇｌ ■制限部位を再構成すること
ができる。
そこで、実施例７−ＩＣで得たプラスミドＰＳＯＭ７△
２をＢｇｌｌＩ消化し、得られたＢｇｌ ■粘着末端を
、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート全てを
使用し、クレナウポリメラーゼエで処理することにより
二重鎖とした。この生成物をＥｃｏＲＩで開裂し、ＰＡ
ＧＥにかけ、小さいフラグメントを電気溶出すると、ト
リプトファンプロモーター／オペレーターと、Ｂｇｌ
■部位がら上流の、ＬＥ’ 「近位」配列に関するコド
ン（ｒ ＬＥ’（ｐ）Ｊ ）を持った直線状ＤＮＡ片が
得られた。この生成物はＥｃｏＲＩ末端と、Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ部位の充填により生成した平滑末端とを有する。しか
しながら、このＢｇｌｌｉ部位は、該平滑末端を上記Ｓ
１消化Ｈｉｎｄ■フラグメントの平滑末端にライゲート
することにより再構成される。すなわち、これら２種の
フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲー
トシて再環化したプラスミドｐＨＫＹ１０を形成させ、
これを形質転換によりコンピテントＥ、ｃｏｌｉ菌株２
９４細胞に導入した。組換えプラスミドＰ■月（Ｙｌｏ
を担持しているテトラサイクリン耐性細胞を選択し、そ
のプラスミドＤＮＡを抽出した。
２をＢｇｌｌＩ消化し、得られたＢｇｌ ■粘着末端を
、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート全てを
使用し、クレナウポリメラーゼエで処理することにより
二重鎖とした。この生成物をＥｃｏＲＩで開裂し、ＰＡ
ＧＥにかけ、小さいフラグメントを電気溶出すると、ト
リプトファンプロモーター／オペレーターと、Ｂｇｌ
■部位がら上流の、ＬＥ’ 「近位」配列に関するコド
ン（ｒ ＬＥ’（ｐ）Ｊ ）を持った直線状ＤＮＡ片が
得られた。この生成物はＥｃｏＲＩ末端と、Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ部位の充填により生成した平滑末端とを有する。しか
しながら、このＢｇｌｌｉ部位は、該平滑末端を上記Ｓ
１消化Ｈｉｎｄ■フラグメントの平滑末端にライゲート
することにより再構成される。すなわち、これら２種の
フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲー
トシて再環化したプラスミドｐＨＫＹ１０を形成させ、
これを形質転換によりコンピテントＥ、ｃｏｌｉ菌株２
９４細胞に導入した。組換えプラスミドＰ■月（Ｙｌｏ
を担持しているテトラサイクリン耐性細胞を選択し、そ
のプラスミドＤＮＡを抽出した。
Ｂｇｌ ［およびＰｓｔ：［消化、次いてＰＡＧＥ法お
よび電気溶出法による大きいフラグメントの単離、によ
って、ＰｓｔｌおよびＢｇｌ ［両粘着末端を有する所
望の直線状ＤＮＡ片を得た。こうしてｐ ＨＫ Ｙｌｏ
から調製されたＤＮＡフラグメントは複製起源を有して
おり、従って、ｔｒｐＬＥ’ポリペプチド融合クンノ（
りりの暗号遺伝子およびテトラサイクリン耐性に関する
暗号遺伝子の両方がＬｒｐプロモーター／オペレーター
でコントロールされる、プラスミドｐｌＡ７△４△１の
組立て要素の１つとして有用である。
よび電気溶出法による大きいフラグメントの単離、によ
って、ＰｓｔｌおよびＢｇｌ ［両粘着末端を有する所
望の直線状ＤＮＡ片を得た。こうしてｐ ＨＫ Ｙｌｏ
から調製されたＤＮＡフラグメントは複製起源を有して
おり、従って、ｔｒｐＬＥ’ポリペプチド融合クンノ（
りりの暗号遺伝子およびテトラサイクリン耐性に関する
暗号遺伝子の両方がＬｒｐプロモーター／オペレーター
でコントロールされる、プラスミドｐｌＡ７△４△１の
組立て要素の１つとして有用である。
Ｇ、Ｔｒｐプロモーター／オペレーターを有する直線状
ＤＮＡの組立て 実施例７−ＩＣで得たプラスミドｐｓＯＭ７△２△４を
ＥｃｏＲ１部分消化、次いでＰｓｔ：［消化に付した。
ＤＮＡの組立て 実施例７−ＩＣで得たプラスミドｐｓＯＭ７△２△４を
ＥｃｏＲ１部分消化、次いでＰｓｔ：［消化に付した。
得られたフラグメントはｔｒｐプロモーター／オペレー
ターを含有しており、ＰＡＧＥ法にかけ、電気溶出する
ことにより単離した。ソマトスタチン遺伝子の５′末端
に隣接した部位で開裂され、アンピシリン耐性遺伝子と
ｔｒｐプロモーター／オペレーターとの間にあるＥｃｏ
Ｒ１部位では開裂されていないフラグメントを得るため
に、ＥｃｏＲｌ 部分消化が必要であった。アンピシリ
ン耐性遺伝子中のＰｓｔｉ部位を切断することにより失
なわれたアンピシリン耐性は、上記実施例７−ＩＦで得
た最終的なｐＨＫＹＩＱ直線状ＤＮＡ誘導体とのライゲ
ーションによって回復することができる。
ターを含有しており、ＰＡＧＥ法にかけ、電気溶出する
ことにより単離した。ソマトスタチン遺伝子の５′末端
に隣接した部位で開裂され、アンピシリン耐性遺伝子と
ｔｒｐプロモーター／オペレーターとの間にあるＥｃｏ
Ｒ１部位では開裂されていないフラグメントを得るため
に、ＥｃｏＲｌ 部分消化が必要であった。アンピシリ
ン耐性遺伝子中のＰｓｔｉ部位を切断することにより失
なわれたアンピシリン耐性は、上記実施例７−ＩＦで得
た最終的なｐＨＫＹＩＱ直線状ＤＮＡ誘導体とのライゲ
ーションによって回復することができる。
Ｈ，インシュリンＡ鎖構造遺伝子の単離インシュリンＡ
鎖構造遺伝子は、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７９、Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７６
： １０６ ）の開示した方法で組立てられるプラスミ
ドｐｌＡ ｌのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化により
得られた。
鎖構造遺伝子は、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７９、Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７６
： １０６ ）の開示した方法で組立てられるプラスミ
ドｐｌＡ ｌのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化により
得られた。
このプラスミドはＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １２菌株９４／ｐ
ＩＡ １（ＡＴＣＣ３１４４８）からも得ることがで
きる。所望のフラグメントをＰＡＧＥおよび電気溶出に
より精製した。このものはＥｃｏＲＩおよび１３ａｍｌ
−１１末端を有していた。
ＩＡ １（ＡＴＣＣ３１４４８）からも得ることがで
きる。所望のフラグメントをＰＡＧＥおよび電気溶出に
より精製した。このものはＥｃｏＲＩおよび１３ａｍｌ
−１１末端を有していた。
■、インシュリンＡ鎖構造遺伝子、Ｔｒｐプロモーター
／オペレーター、並ひにＰｓｔｉおよびＢｇｌ■末端を
有するｐＨＫＹＩＱ直線状ＤＮＡフラグメントのライゲ
ーション インシュリンＡ鎖構造遺伝子、ｔｒｐプロモーター／オ
ペレーターを含有する直線状ＤＮＡフラグメント（実施
例７−ＩＧで調製）、およびｐ ＨＫ Ｙ１０直線状Ｄ
ＮＡフラグメント（実施例７−ＩＦで調製）を、第８図
に示す如く、適切な方向性でライゲートし、所望のプラ
スミドｐｌＡ７Δ４Δ１を得た。プラスミドｐＩＡ７△
４△１は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性が
回復しているので容易に選択できる。
／オペレーター、並ひにＰｓｔｉおよびＢｇｌ■末端を
有するｐＨＫＹＩＱ直線状ＤＮＡフラグメントのライゲ
ーション インシュリンＡ鎖構造遺伝子、ｔｒｐプロモーター／オ
ペレーターを含有する直線状ＤＮＡフラグメント（実施
例７−ＩＧで調製）、およびｐ ＨＫ Ｙ１０直線状Ｄ
ＮＡフラグメント（実施例７−ＩＦで調製）を、第８図
に示す如く、適切な方向性でライゲートし、所望のプラ
スミドｐｌＡ７Δ４Δ１を得た。プラスミドｐＩＡ７△
４△１は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性が
回復しているので容易に選択できる。
２、 プラスミドｐｌＴ１２３ の〜１．３ ｋ ｂ
ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ［フラグメントとプラスミドｐｌＡ
７△４△１の〜４．５ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ −Ｂｇｌ
ＩＩフラグメントのライゲーション Ａ、プラスミドｐＩＡ７△４△１のＢａｍＨＩ −Ｂｇ
ｌ■消化、並びに〜４，５ｋｂ フラグメントの単離プ
ラスミドｐｌＴ１２３ 並びにＨｐｈ工およびＰｓｔ工
制限酵素、および塩類を用いる代りにプラスミドｐｌＡ
７△４△１並ひにＢｇｌ ■およびＢａｍＨＩ制限酵素
、および製造業者指定の塩類を使用したほかは、実施例
２Ａの方法と実質的に同様にして表記の消化および単離
を行なった。
ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ［フラグメントとプラスミドｐｌＡ
７△４△１の〜４．５ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ −Ｂｇｌ
ＩＩフラグメントのライゲーション Ａ、プラスミドｐＩＡ７△４△１のＢａｍＨＩ −Ｂｇ
ｌ■消化、並びに〜４，５ｋｂ フラグメントの単離プ
ラスミドｐｌＴ１２３ 並びにＨｐｈ工およびＰｓｔ工
制限酵素、および塩類を用いる代りにプラスミドｐｌＡ
７△４△１並ひにＢｇｌ ■およびＢａｍＨＩ制限酵素
、および製造業者指定の塩類を使用したほかは、実施例
２Ａの方法と実質的に同様にして表記の消化および単離
を行なった。
Ｂ、ライゲーションおよび形質転換
プラスミドｐＵｃ７およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲ
１△Ｍ１５ の代りにプラスミドｐｌＡ７△４△１の〜
４５ｋｂ ＢａｍＨｌ −Ｂｇｌ ’ｆｌフラグメント
およびＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＩＬＬ
Ｂ−１５２１１）を用いるほかは実施例３Ｃの方法と実
質的ｌこ同様にして表記のライゲーションおよび形質転
換を行なった。形質転換された細胞を、アンピシリン５
０μＱ／ｍｅを含んだＴＹプレート上におき、次いでハ
イグロマイシンＢ２００μｆ／Ｎｅを含んだプレート上
に貼付（ｐａＬｃｈｅｄ） した。次いで所望のハイグ
ロマイシンＢ耐性Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／
ＰＩＴ１２５形質転換体を、プラスミドｐＩＴ１２５の
生産および単離のために常法通り培養した。プラスミド
ｐｌＴ１２５は、通常のＥ、ｃｏｌｉ菌株、例えばＥ、
ｃｏｌ ｉ Ｋｌ ２、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲＩ
およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１（ＢＩＱｌを、実施例２
Ｂの方法と実質的に同様の方法に従い、形質転換するこ
とができる。プラスミドｐｌＴ１２５ の制限部位（サ
イト）地図を添付の第４図に示す。
１△Ｍ１５ の代りにプラスミドｐｌＡ７△４△１の〜
４５ｋｂ ＢａｍＨｌ −Ｂｇｌ ’ｆｌフラグメント
およびＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＪＡ２２１（ＮＲＩＬＬ
Ｂ−１５２１１）を用いるほかは実施例３Ｃの方法と実
質的ｌこ同様にして表記のライゲーションおよび形質転
換を行なった。形質転換された細胞を、アンピシリン５
０μＱ／ｍｅを含んだＴＹプレート上におき、次いでハ
イグロマイシンＢ２００μｆ／Ｎｅを含んだプレート上
に貼付（ｐａＬｃｈｅｄ） した。次いで所望のハイグ
ロマイシンＢ耐性Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／
ＰＩＴ１２５形質転換体を、プラスミドｐＩＴ１２５の
生産および単離のために常法通り培養した。プラスミド
ｐｌＴ１２５は、通常のＥ、ｃｏｌｉ菌株、例えばＥ、
ｃｏｌ ｉ Ｋｌ ２、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲＩ
およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１（ＢＩＱｌを、実施例２
Ｂの方法と実質的に同様の方法に従い、形質転換するこ
とができる。プラスミドｐｌＴ１２５ の制限部位（サ
イト）地図を添付の第４図に示す。
前述の方法に従って組立てられた、その他の代表的なプ
ラスミドおよび形質転換体を、次の表２および表３に示
す。
ラスミドおよび形質転換体を、次の表２および表３に示
す。
表３ 代表的な形質転換体
Ｅ、 ｃｏｔ ｉ ／Ｒ
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２／Ｒ
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＡ２２１／”Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＨＢ Ｉ Ｑ ｌ ／ＲＥ、 ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＲＲＩ／Ｒ ３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
／Ｒ１上記において、ｋはプラスミドｐｌＴ１４３、Ｐ
ＩＴ２１２、ｐｌＴ２１３、ｐ ＩＴ２１５、ｐｌＴ２
１７およびｐＩＴ２１９からなる群から選ばれるもので
あり、Ｋ１はプラスミドｐＩＴ２１２、ｐＩＴ２１３、
ｐＩＴ２１５、Ｐ １：Ｔ２１７およびｐｌ、Ｔ２１９
からなる群から選ばれるものである。
ｉ Ｋ１２ ＨＢ Ｉ Ｑ ｌ ／ＲＥ、 ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＲＲＩ／Ｒ ３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
／Ｒ１上記において、ｋはプラスミドｐｌＴ１４３、Ｐ
ＩＴ２１２、ｐｌＴ２１３、ｐ ＩＴ２１５、ｐｌＴ２
１７およびｐＩＴ２１９からなる群から選ばれるもので
あり、Ｋ１はプラスミドｐＩＴ２１２、ｐＩＴ２１３、
ｐＩＴ２１５、Ｐ １：Ｔ２１７およびｐｌ、Ｔ２１９
からなる群から選ばれるものである。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐｌＴ１２３およびｐＫＣ２２２の
制限サイト地図、第２図はプラスミドｐＫｃ２０３およ
びＰＩＴ１４４の制限サイト地図、第３図はＰＩＴ２０
８およびｐｌＴ２０７の制限サイト地図、第４図はプラ
スミドｐ Ｋ Ｃ３０７およびｐｌＴ１２５の制限サイ
ト地図、第５図はチモシンアルファ１遺伝子のアミノ酸
およびヌクレオチド配列を示す模式図、第６図はフラグ
メン）Ｔ□５の合成工程図、第７図はプラスミドｐＴｈ
α１の組立て経路を示す模式図、第８図はプラスミドｐ
ＩＴ２１５およびｐＩＴ２１７の制限サイト地図、第９
図はプラスミドｐｌＴ２１９の制限サイト地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー化
理 人 弁理士 青白 葆 外１名ＦＩＧ、 １ 一！噛！１３ ｐｔｃｃｇａｔ ＦＩＧ、 ２ Ｋｃｚｏａ ｌＴ１４４ ＦＩＧ、 ３ 寥珈雪Ｔ！！０７ ＦＩＧ、４ ｌＴ１１８ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、 ８ ｐｆｆｉｌ１７ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’ 識別記号 庁内整理番号優先権主
張 ６１９８３１９月２６日［相］米国（Ｕ Ｓ）［株
］昭５５梠手続補正書 昭和５９年９月２５日 昭和５９年特許願第 １５’１９４３ 号２発明の名称 改良された抗生物質耐性遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国インディアナ州インディアナポリ
ス市、イースト・マツカーティ・ストリート３０７番名
称 イーライ・リリー・アンド・カンパニー４、代理人 住所 大阪府大阪市東区本町２−１０ 本町ビル内６補
正の対象；明３細書の［発明の詳細な説明］の欄 、〈
Ｔ７、補正の内容 ■、明細書中、以下の箇所を補正致します。 ゛ゝ°７頁下１５〜１６行、「デオキソ・ ・・ ・「
デオキシノトンル」と訂正。 ２）３４頁Ｔ１行、「デオキシシトノル」を「デオキシ
シトノル」七訂正。 ３）６１頁９行、「Ｉ８０μσを、」をｒ１８０１１Ｑ
をこの細胞液」と訂正。 ４）６１頁１７行、ｒｃａｃＩ２ＪをｒｃａｃＩＬＪと
訂正。 ５）６２頁１１行、「ロイシン」を「ウラシル」と訂正
。 以」ニ
制限サイト地図、第２図はプラスミドｐＫｃ２０３およ
びＰＩＴ１４４の制限サイト地図、第３図はＰＩＴ２０
８およびｐｌＴ２０７の制限サイト地図、第４図はプラ
スミドｐ Ｋ Ｃ３０７およびｐｌＴ１２５の制限サイ
ト地図、第５図はチモシンアルファ１遺伝子のアミノ酸
およびヌクレオチド配列を示す模式図、第６図はフラグ
メン）Ｔ□５の合成工程図、第７図はプラスミドｐＴｈ
α１の組立て経路を示す模式図、第８図はプラスミドｐ
ＩＴ２１５およびｐＩＴ２１７の制限サイト地図、第９
図はプラスミドｐｌＴ２１９の制限サイト地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー化
理 人 弁理士 青白 葆 外１名ＦＩＧ、 １ 一！噛！１３ ｐｔｃｃｇａｔ ＦＩＧ、 ２ Ｋｃｚｏａ ｌＴ１４４ ＦＩＧ、 ３ 寥珈雪Ｔ！！０７ ＦＩＧ、４ ｌＴ１１８ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、 ８ ｐｆｆｉｌ１７ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’ 識別記号 庁内整理番号優先権主
張 ６１９８３１９月２６日［相］米国（Ｕ Ｓ）［株
］昭５５梠手続補正書 昭和５９年９月２５日 昭和５９年特許願第 １５’１９４３ 号２発明の名称 改良された抗生物質耐性遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国インディアナ州インディアナポリ
ス市、イースト・マツカーティ・ストリート３０７番名
称 イーライ・リリー・アンド・カンパニー４、代理人 住所 大阪府大阪市東区本町２−１０ 本町ビル内６補
正の対象；明３細書の［発明の詳細な説明］の欄 、〈
Ｔ７、補正の内容 ■、明細書中、以下の箇所を補正致します。 ゛ゝ°７頁下１５〜１６行、「デオキソ・ ・・ ・「
デオキシノトンル」と訂正。 ２）３４頁Ｔ１行、「デオキシシトノル」を「デオキシ
シトノル」七訂正。 ３）６１頁９行、「Ｉ８０μσを、」をｒ１８０１１Ｑ
をこの細胞液」と訂正。 ４）６１頁１７行、ｒｃａｃＩ２ＪをｒｃａｃＩＬＪと
訂正。 ５）６２頁１１行、「ロイシン」を「ウラシル」と訂正
。 以」ニ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ハイグロマイソ７Ｂホスホトランスフェラーゼの後
方の３３８個、３３９個または３４０個のアミノ酸配列
を、単独で、あるいは翻訳解読相内において転写および
翻訳活性素配列−含有遺伝子または遺伝子部分と共に暗
号化している新規ＤＮＡ配列。 ２、式： （：１丁］’ＧＧ ＧＣＣＣＡＧ ＧＡＣ１Ｃ；ＣＣＣ
ＣＧＡＡ Ｇ−１”ＣＣＧＧ ＣＡＣＣｒＣＧ１１ｌ；
ＣＡに ＧにＧ ＧＡ’ｌ’ −ｆｆｃ ＧＧＣＴｃｃ
ＡＡＣＡＡＴ （ｍ； ＧＩＧ Ａ（：Ｇ ＣＡＣＡ
ＡＣＡＡ’ｌ’ ＧＧＣＣＧＣＡＴΔ ＡＣＡ ＧＣＧ
ＧＴＣＡＵ丁ＧＡＣ’１−ＧＧ 八ＧＣ； ＧＡＧ
ＧＣＧＡ−１’Ｇ Ｔ］’ＣＧＧＧ ＧＡ丁丁ＣＧ Ｃ
ＡＡ ’ｌ’ΔＣＧＡＧ Ｇ’ｌ’（： ＧＯ（： Δ
ＡＣΔＴＣＴｒＣＴＡ（１； ＡＡＧ ＣＣＣＣＴＡ
ＡＧＧ ＧＴｒＡＴＧ ＣＴＣＣＡＧ ＣＧＧ丁丁丁Ａ
Ｇ ＡＡＧｔ−ｉ−ｃ−仄ス）ΔＣ；Ｃ，ＣＣＧ ＴＣ
ＣＴｌ”ＧＧＣコ゛％Ｔ Ｎ１−Ｇ Ｃ，へＧＣへＧ
ＣＡＣΔＣＧＡＧＣ八ｃｃ 丁ＣＣＧＧＣＡＣ，ＣＡＡ
ＣＣＣ，Ａ ＡＣＡ−１’八ＣＧコ゛ＣＣＴＣＧ’ｌ’
Ｃ−ＩＣＣＣＧＣ’ｒΔＣ’１丁ＣＣ，ＡＣＣ：Ｃ，Ｇ
ＡＧＧ ＣＡＴ （ｊ）ＣＧＡＧ Ｃ１］−ＧＣＡ
ＣＧＡ コ゛ＣＧＩｌｌ ＩＩＩ Ｉｌｌ Ｉｌｌ Ｉ
’ｌｌ Ｉｌｌ ＩＩＩ目Ｉ Ｉｌｌ Ｉｌｌ Ｉｌｌ
Ｉｌｌ ＩＩＩにＣＧ Ａ′］Ｇ ＡＡＧ ＣＩ’Ｃ
ＧＣＣＴＣ：ＣＧ１’Ａ ＧＧＣσｉｃ ＧＡＡ （×
：ｆｆ ＣＣ１’ ＡＧＣｃｃｃ ｃｃｃ Ｃ１−ＣＣ
ＧＧ ＧＣＧ ＴＡＴ ＡｌＧ ＣＴＣＣＧＣＡ’ｌＴ
Ｃ；Ｃ，Ｔ ＣＩ−ｒ ＧＡ（：ＣＡＡ Ｃ’Ｔ’Ｇ
ＴＡＴ ＣＡＧ ＡＧＣＴＴＧ Ｇ’１７ｒ ＧＡＣ
ＧＧＣＡＡＴ ’１７１−ＣＧΔＴＧΔ］”ＧＣＡ Ｇ
Ｃｌ” ’１’ＧＧ ＧＣＣ； （：ＡＧ ＣＧ’ｌ’
ＣＧＡ ＴＧＣＧＡＣＧＣＡ Ａ−ＩＴ； ＧＴＣに
Ｇ八へＩ’ＣＣＧＧＡ Ｇ（Ｔ、Ｃ（１；Ｇ ＡＣｒσ
ｒＣＧＧＧ ＣＧ丁丁ＧＡ ＣＡＡ Δ１−Ｃｃｃｃ
ｃａｃＡＣＧ ＣＣＩ’ ＣＧＣＧＧＯ’１℃Ａ ＣＡ
Ｇ （：ｌ：ＣＧＯＡ ’ＩＧＴ Ｇ’ｌＴ ’１’Ａ
Ｇ ＣＧＧ Ｃ；ＣＧＡＧＡ ＡＧＣＧＣＧ ＧＣＣＧ
ＴＣ’ＩＧＧ ＡＱ： ＧＡ−ｒ ＧＧＣ１ＣＩ’ Ｇ
ＴＡ ＧＡＡ Ｇｌ’ＡＡＣ；Ｇ ＣＧＡ ＡＡＧ Ｇ
ＡＡ Ｒ４−１’（：ＧＣＧＴ−ＩＴにＣ１−１’夏（
５（式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ジル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、Ｒおよび
に２は独立してリジンを暗号化しているデオキシリボヌ
クレオチドトリプレット、ＲおよびＲ３は、それぞれ対
応するＫおよびＲ２の塩基に対し相補的な窒素塩基を含
有するデオキシリボヌクレオチドトリプレット、ｍおよ
び１１はＯまたは１、Ｒ４は翻訳停止コドンを暗号化し
ているデオキシリボヌクレオチドトリプレット、Ｎ５は
対応する餅の塩基に対し相補的な窒素塩基を含有するデ
オキシリボヌクレオチドトリプレットを表わす。ただし
、ｎ二〇のときはｍ ＝ Ｑであり、ｍ ＝ １のとき
はｎ＝１である。） て示される配列からなる第１項に記載のＩ）ＮＡ。 ３転写および翻訳活性素配列含有遺伝子または遺伝子部
分と共に翻訳解読相内にある、第２項に記載のＤＮＡ０ ４、Ｒ４がＴＡＧであり節がＡＴＩＣである第３項に記
載のＤＮＡ０ ５、遺伝子または遺伝子部分が細菌性の遺伝子または遺
伝子部分である第４項に記載のＤＮＡ０６、遺伝子また
は遺伝子部分が１５個までのアミノ酸を暗号化した遺伝
子である第５項に記載の１） Ｎ Ａ ０ ７、遺伝子または遺伝子部分がＥ、ｃｏｌｉ １ａｃＺ
遺伝子の一部債喘一啼１＝である第６項に記載のＤＮＡ
０ ８遺伝子または遺伝子部分が真核性遺伝子または牛舎遺
伝子部分である第４項に記載のＤＮＡ０９、遺伝子また
は遺伝子部分が酵母ヒートショック遺伝子またはその遺
伝子部分である第８項に記載のＤＮＡ０ １０、 ｎ ＝ １でありｍ＝０である第２項〜第９項
のいずれかに記載のＤＮ八へ １１、ｍ−＝ｌでありｎ＝１である第２項〜第９項のい
ずれかに記載のＤＮＡ０ １２、ｍ＝Ｏでありｎ ＝ Ｑである第２項〜第９項の
いずれかに記載のＤＮＡ０ １３、式： ％式％ ： （ ｌｌｌ５ ＡＬＡ ＡＳＰ Ｉ’ＨＥ ＧＬＹ ＳＥＲ
ＡＳＮ ＡＳＮ ＶＡＬ ＬＥＵ ＴＯＩＬ ｋＳＰ
ＡＳＮＧＬＹ ＡＲＧ ＩＬＥ ’ＩＩ（艮ＡＬＡ Ｖ
ＡＬ ＩＬＥ ＡＳＩ’ Ｔ艮Ｐ ５ＥＬＬ Ｃ，Ｕυ
ＡＬＡ ！ａ丁１’１４Ｅ ＧＬＹ ＡＳＩ’ ＳＥＲ
ＧＬＮ ＴＹＲＧＬｔＪ ＶＡＬ ＡＬＡ ＡＳＮ Ｉ
ＬＥ ｐＨＥ ＰＨＥ１゛艮ｌ） 八ＲＧ ｌ’Ｒｏ
ＴＲＰ ＬＥＵ ＡＬＡ ＧＹＳ ＭＥＴ ＧＬＵ Ｇ
ＬＮ ＧＬＮ １１ｕＬ ＡＲＧＴＹＲＩ’ｌｌｌシＧ
ＬＵ Ａｌｔｃ ＡＲＧ ［ＩＩＳ １）］ｔＯＧＬＵ
ＬＥＵ ＡＬＡ ＧＬＹ ＳＥ技ＰＲＯＡＲＧ ＬＥ
Ｕ ＡＲＧ ＡＬＡ ＴＹＲＭＥＴ ＬＥＵ ＡＲＧ
ＩＬＥ ＧＬＹ ＬＥＵ ＡＳＩ’ ＧＬＮＬＥＵ Ｔ
ＹＲＧＬＮ ＳＥＲＬＥＵ ＶＡＬ ＡＳＰ ＧＬＹ
ＡＳＮ Ｉ’１−ＬＥ ＡＳＰ ＡＳＰ ＡＬＡＡＬＡ
’１７（１１ＡＬＡ ＧＬＮ ＧＬＹ ＡＲＧ （：
ＹＳ ＡＳＰ ＡＬＡ ＩＬＥ ＶＡＬ ＡＲＧ ５Ｅ
１ｔにＬＹ ＡＬＡ Ｇｌ−Ｙ −ｎ（ＲＶＡＬ ＧＬ
Ｙ ＡＲＧ Ｉ’ｍ−ＩＲＧＬＮ ＩＬＥ ＡＬＡ Ａ
ＲＧ Ａ、ＲＧＳＥＲＡｌ−Ａ ＡＬＡ ＶＡＬ ＴＩ
ＬＩ’ ＴＩＩＲＡＳＰ ＧＬＹ ＣＹＳ ＶＡＩ−Ｇ
ＬＵ ＶＡＬ ＬＥＵＡＬＡ ＡＳＩＩ ５ＥＩＬ Ｇ
ＬＹ ＡＳＮ ＡＩｔＧ ＡＲＧ ＰＩのＳＥＲＴ］−
１ＲＡＲＧ ＩＩＲＯＡＲＧＡＬＡ ＬＹＳ ＣＬＵ （式中、ＭＥＴはメチオニン、ＬＹＳはリジン、ＰＲＯ
はプロリン、ＧＬＵはグルタミン酸、ＬＥＵはロイツン
、ＴＨＲはスレオニン、ＡＬＡはアラニン、ＳＥＲはセ
リン、ＶＡＬはバリ′・ ＰＨＥはフェニルアラニン、
ＩＬＥはイソロイシン、Ｇ Ｌ Ｙはグリシノ、ＡＳＰ
はアスパラギン酸、ＧＬＮはグルタミン、ＡＲＧはアル
ギニン、ｃｙｓはシスティン、ＴＲＩ’はトリプトファ
ン、ＡＳＮはアスパラギン、ＨＩ Ｓはヒスチジンそし
てＴＹｋはチロシンを表わす） で示されるアミノ酸配列を暗号化している第１２項に記
載のＤＮＡ。 １４．７’ ラスミドｐ Ｉ Ｔ １２３ （７）〜１
．３ｋｂＢａｍｌ−１１−８ｇｌｌｌ制限フラグメント
である第２項に記載のＤＮＡ。 １５、第１項〜第１４項のいずれかに記載のＩ） Ｎ
Ａを含有する組換えＤＮＡクローニングベクター。 １６、プラスミドである第１５項に記載のベクター。 １７、プラスミドｐｌＴ１２３、ｐ Ｉ Ｔ１２５、ｐ
ｌＴ１４４、ｐ Ｉ Ｔ ２０８、ｐＫＣ３Ｑ７または
ｐ Ｋ Ｃ３０８である第１６項に記載のベクター。 １８、プラスミドＩ） Ｉ Ｔ ２１２、ｐｌＴ２１．
３、ｐｌＴ２１５、ｐｌＴ、２１７およびｐ ｌ Ｔ
２１９である第１６項に記載のベクター。 １９第１５項〜第１８項のいずれかに記載の組換えＤＮ
Ａクローニングベクターを含有する形質転換体。 ２０、 Ｅ、 ｃｏｌ ｉである第１９項に記載の形質
転換体〇２１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ ｃ：ｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅである第１９項に記載の形質転換体。 ２２、プラスミドｐ ｌ Ｔ １４１、ｐ Ｉ Ｔ １
４３またはｐｉ”ｒ２０７゜ ２３宿主細胞がＥ、ｃｏｌｉであり、第２２項に記載の
プラスミドを含有している形質転換体。
Applications Claiming Priority (4)
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