JP2624470B2 - ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造 - Google Patents

ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、ストレプトアビジン様ポリペプチドおよび
その断片を製造するためのDNA配列、組換DNA分子および
製造方法に関するものである。さらに詳細には、本発明
は、ストレプトアビジン様ポリペプチドおよびその断片
をコードするDNA配列、並びにこれら配列を含有して適
当な宿主中でこれらポリペプチドおよび断片を合成する
と共に一つの具体例ではこれらポリペプチドおよびこれ
に融合した他の生産物を宿主細胞の膜を通して分泌させ
るのに使用する組換DNA分子に関するものである。
本発明の他の具体例において、これらDNA配列および
組換DNA分子は所望の蛋白，ポリペプチド，ペプチドお
よびアミノ酸との融合蛋白を製造するのに使用すること
もでき、その際これら生産物をコードするDNA配列に結
合させかつ得られたハイブリッド遺伝子を適当な宿主で
発現させる。使用する特定の構造およびストレプトアビ
ジンDNA断片に応じて、これら融合蛋白はこれが産生さ
れた宿主の膜を通して分泌することができる。ここで
も、使用する特定の構造およびストレプトアビジン断片
に応じて、ビオチンおよびその誘導体に対するストレプ
トアビジンの極めて強力な結合親和性により特に容易に
精製することができる。
発明の背景 ストレプトアビジンは、ストレプトミセス・アビジニ
イ（Streptomyces avidinii）細菌およびその他のスト
レプトミセス菌種によって産生される抗生物質である
〔E.O.スタップレー等、アンチマイクロビアル・エイジ
エンツ・アンド・ケモテラピー（1963）、第20−27頁
（J.C.シルベスター編（1964）〕。これらは約60,000ダ
ルトンの分子量を有する四元重合体として天然に生ずる
ものである。ストレプトアビジンは、ビオチンおよびビ
オチン誘導体並びにその同族体に対し強力な親和性を有
することを特徴とする。４種の同一なサブユニットのそ
れぞれは、単一のビオチン結合部位を有する〔K.ホフマ
ン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス、USA、第77巻、第4666−68頁（1980）;L.チャ
イエトおよびF.J.ウルフ、アルキベス・オブ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフィジックス、第106巻、
第１−５頁（1964）〕。
ビオチンに対する強力な親和性のため、ストレプトア
ビジンは工業的にも基礎生物医学研究に応用してビオチ
ン要求性の酵素を研究するためにも幅広い用途を有し、
さらにビオチン化物質と一緒に使用してこれら物質と他
の物質との間の相互作用を研究するにも使用される〔K.
ホフマン、上記；同じくE.A.バイエルおよびM.ウィルチ
ェック、メソッズ・オブ・バイオケミカル・アナリシ
ス、第26巻、第１−45頁（1980）;F.M.フィン等、ジャ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第255巻、第5
742−46頁（1980）〕。現在、ストレプトアビジンは、
これをストレプトミセス・アビジニイの細胞媒体から単
離して工業的に生産されている。ストレプトアビジニイ
からのストレプトアビジンの精製は、菌体培養物１当
り僅か３〜4mgの極めて低い収率を与える。
分子生物学における最近の進歩は、細菌宿主におい
て、異質蛋白を多量に産生することを可能にしている。
これらは、たとえば白血球インタフェロン〔S.ナガタ
等、「ヒト白血球インタフェロン活性を有するポリペプ
チドのイー・コリにおける合成」、ネイチャー、第284
巻、第316−20頁（1980）〕、ヒトＢ型肝炎ウイルスの
抗原〔C.J.バレル等、「プラスミドpBR322にてクローン
化したＢ型肝炎ウイルスDNA配列の枯草菌における発
現」、ネイチャー、第279巻、第43−47頁（1979）およ
びM.パセク等、「Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子およびイー・
コリにおけるその発現」、ネイチャー、第282巻、第575
−79頁（1979）〕、SV40t抗原〔T.M.ロバーツ等、「枯
草菌における猿ウイルス40t抗原の合成」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、
第76巻、第5596−5600頁（1979）〕、およびFMDウイル
ス抗原〔H.クッパー等、「口蹄疫ウイルスの主抗原のcD
NAクローン化およびイー・コリにおけるその発現」、ネ
イチャー、第289巻、第555−59頁（1982）〕を包含す
る。
一般に、これらの方法は、所望の蛋白，ポリペプチ
ド，ペプチドもしくはアミノ酸をコードするDNA配列を
発現制御配列に作用結合させたことを特徴とする組換DN
A分子の作成に頼っている。次いで、適当な宿主をこれ
ら分子で形質転換させて、発酵により所望の産生物を製
造することができる。化学合成を介して製造する以外の
DNA配列については、この種の組換DNA分子の作成はしば
しば所望の産生物に対するメッセンジャーRNA（「mRN
A」）雛型の一本鎖DNAコピー（「cDNA」）を生成させ、
このcDNAを二重鎖DNAに変換させ、かつこのDNAを適当な
クローン化ビークルにおける適当な発現制御配列に作用
結合させる工程からなっている。次いで、この組換DNA
分子を使用して適当な宿主を形質転換させる。このよう
な形質転換は、適当な条件下で発酵された際に所望の産
生物を生成することを可能にする。
上記技術のその後の改良は、選択した蛋白，ポリペプ
チド，ペプチドもしくはアミノ酸をこれが産生された際
に宿主細胞の膜を通して分泌させることを可能にし、こ
れは宿主により分泌されるような細胞外もしくは外質キ
ャリヤ蛋白からのDNA配列と選択される蛋白，ポリペプ
チドもしくはアミノ酸をコードする異質DNA断片とより
なるハイブリッド遺伝子を形成し、 発現制御配列に作用結合されたハイブリッド遺伝子で
宿主を形質転換させ、かつ 形質転換宿主を培養して、選択した蛋白，ポリペプチ
ド，ペプチドもしくはアミノ酸を合成させかつ分泌させ
る ことからなっている。
この種の技術は、たとえばL.ピラーカマロフ等により
開示されている〔「プロインシェリンを合成する細菌ク
ローン」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー
・サイエンス、USA、第75巻、第3727−31頁（1978）お
よび米国特許第4,411,994号〕。しかしながら、この方
法で作成された蛋白，ポリペプチド，ペプチドもしくは
アミノ酸は分泌によって細胞内蛋白および細胞の残骸か
ら分離されるが、さらに細胞媒体もしくは外質空間から
回収せねばならない。一般に、この回収は所望する程効
果的でも簡単でもない精製方式を含んでいる。さらに、
これは一般に産生物の損失をもたらす。
発明の要約 本発明は上記問題を解決する。本発明は、DNA配列の
少なくとも１部がストレプトアビジン様ポリペプチドを
コードすることを特徴とする少なくとも１種のDNA配列
を提供する。本発明のDNA配列は、（ａ）SA304,SA307,S
A324;（ｂ）前記DNA配列のいずれかにハイブリッド化し
かつストレプトアジビン様ポリペプチドをコード化する
DNA配列、および（ｃ）前記DNA配列のいずれかによって
コードされたポリペプチドをコード化するDNA配列より
成る群から選択される。これらDNA配列は、これらによ
り形質転換された宿主がストレプトアジビン様ポリペプ
チドを産生することを可能にする。さらに本発明は、DN
A配列の少なくとも１部が、組織プラスミノーゲン活性
体（「TPA」）に対し末端どうしが結合したストレプト
アビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白をコードする
ことを特徴とする少なくとも１種のハイブリッドDNA配
列を提供する。本発明のこの面におけるDNA配列は、
（ａ）SAT9724,SAT7021;（ｂ）前記DNA配列のいずれか
にハイブリッド化しかつ融合蛋白をコード化するDNA配
列、および（ｃ）前記DNA配列のいずれかによってコー
ドされたポリペプチドをコード化するDNA配列より成る
群から選択される。
したがって、本発明のDNA配列、組換DNA分子、宿主お
よび方法を使用して、ストレプトアビジン産生に関する
他の公知方法に伴う従来の低収率を回避する。したがっ
て、高純度のストレプトアビジン様ポリペプチドおよび
その誘導体を多量に医薬およびその他の工業で種々の目
的に使用することを可能にする。
他の実施態様において、本発明は選択した蛋白，ポリ
ペプチド，ペプチドもしくはアミノ酸を産生させかつ宿
主細胞の膜を通して分泌させる方法を提供し、これは生
成した融合蛋白を宿主細胞の膜を通して分泌させるのに
充分なプレストレプトアビジン様ポリペプチドの部分を
コードするDNA配列と、選択された蛋白，ポリペプチ
ド，ペプチドもしくはアミノ酸をコードするDNA配列と
よりなるハイブリッドDNA配列を発現させて行なわれ
る。ハイブリッドDNA配列の発現に際し、このハイブリ
ッドDNA配列から発現された融合蛋白は、前記ハイブリ
ッドDNA配列により形質転換された宿主細胞の膜を通し
て分泌される。次いで、これを融合蛋白として使用し或
いは各種の化学法，酵素法，生物学的方法により切断し
て所望の蛋白，ポリペプチド，ペプチドもしくはアミノ
酸およびストレプトアビジン様ポリペプチドを産生させ
ることができる。
さらに他の実施態様において、本発明はビオチンおよ
びその誘導体もしくは同族体に対するストレプトアビジ
ン様ポリペプチドの結合親和性を利用して精製しうる融
合蛋白の製造方法を提供する。本発明はこの実施態様に
おいては、生成する融合蛋白をビオチンまたはその誘導
体もしくは同族体に結合させるのに充分なストレプトア
ビジン様ポリペプチドの部分をコードするDNA配列と、
選択された蛋白，ポリペプチド，ペプチドもしくはアミ
ノ酸をコードするDNA配列とよりなるハイブリッドDNA配
列を使用する。このハイブリッドDNA配列の発現に際
し、融合蛋白のストレプトアビジン部分はビオチンまた
はその誘導体もしくは同族体の１種に結合することがで
きる。次いで、ビオチンに結合しない他の分泌蛋白もし
くは汚染物を洗浄除去して融合蛋白をビオチンから溶出
させることができる。次いで、選択した蛋白，ポリペプ
チド，ペプチドもしくはアミノ酸を融合蛋白として使用
し、或いは必要に応じ慣用技術でストレプトアジビン様
ポリペプチドから切断させることができ、かつストレプ
トアビジン様ポリペプチドおよび選択した蛋白，ポリペ
プチド，ペプチドもしくはアミノ酸を次いで別々に回収
することができる。
本発明の最も好適な実施態様においては、融合蛋白を
産生された宿主細胞から分泌させると共に、ビオチンお
よびその誘導体もしくは同族体に対するストレプトアビ
ジン様ポリペプチドの結合親和性を利用して精製するこ
とができる。この最も好適な実施態様においては、生成
する融合蛋白を宿主細胞の膜を通して分泌させかつ生成
する融合蛋白をビオチンまたはその誘導体もしくは同族
体に結合させるのに充分なプレストレプトアビジン様ポ
リペプチドの部分をコードするDNA配列と、選択した蛋
白，ポリペプチド，ペプチドもしくはアミノ酸をコード
するDNA配列とよりなるハイブリッド遺伝子を使用す
る。
図面の簡単な説明 第１図は本発明のストレプトアビジン様ポリペプチド
をコードするDNA配列を持った発現ベクターpSA304およ
びpSA307の製造例を示す略図であり、 第２図はSA307の１部のヌクレオチド配列とストレプ
トアビジン様ポリペプチドをコードする部分の領域のア
ミノ酸配列とを示し、アミノ酸配列のラインｃはストレ
プトアビジン様ポリペプチドを産生するよう転写される
解読枠であり、 第３図は本発明のストレプトアビジン様ポリペプチド
の見掛け分子量を測定するのに使用したSDS−ポリアク
リルアミドゲルを示し、レーンａは再精製した市販スト
レプトアビジンの試料であり、レーンｂは上部から下部
まで順次に読んで43Kd,25.7Kd,18.4Kd,14.3Kd,12.3Kd,
6.2Kdおよび3.0Kdのバンドを有する蛋白標準の試料であ
り、レーンｃはイー・コリにおいてSA307の発現により
産生されたエコーアビジンであり、かつレーンｄはS.リ
ビダンスにおいてpSA3721の発現により産生されたスト
レプトアビジン様ポリペプチドであり、 第４図は本発明のストレプトアビジン様ポリペプチド
をコードするDNA配列を含んだ発現ベクターの他の製造
例の略図であり、 第５図は本発明の融合したストレプトアビジン様組織
プラスミノーゲン活性体蛋白をコードするDNA配列を持
った発現ベクターの製造例の略図であり、 第６図は本発明の融合したストレプトアビジン様組織
プラスミノーゲン活性体蛋白をコードするDNA配列を持
った発現ベクターの他の製造例の略図であり、 第７図は融合したストレプトアビジン様組織プラスミ
ノーゲン活性体蛋白をコードするDNA配列を持った発現
ベクターのさらに他の製造例の略図である。
発明の詳細な説明 この詳細な説明においては、次の定義を使用する： 蛋白:50個以上のアミノ酸の線状列を含有するポリペプ
チドであって、たとえば組織プラスミノーゲン活性体、
プロインシュリン，血清アルブミン，ヒト成長ホルモ
ン，上皮小体ホルモンおよびインタフェロンがある。
ポリペプチド：隣接アミノ酸のアミノ基とカルボキシ基
との間のペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸
の線状列。
蛋白もしくはポリペプチドの先駆体：信号配列によって
宿主細胞内で合成されるポリペプチドもしくは蛋白であ
って、たとえばプレストレプトアビジン，プレプロイン
シュリン，プレ血清アルブミン，プレ成長ホルモン，プ
レ上皮小体ホルモンおよびプレインタフェロンがある。
成熟ポリペプチドもしくは蛋白は、その先駆体の信号配
列の喪失もしくは剥離（すなわち成熟）を伴なって宿主
細胞膜を通して分泌される。
ヌクレオチド：糖部分（ペントース）と燐酸と含窒素複
素環式塩基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマー単位の
塩基はグルコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介し
て糖成分に結合され、塩基と糖とこの組合せはヌクレオ
チドである。塩基はヌクレオチドを特性化する。４種の
DNA塩基はアデニン（「Ａ」），グアニン（「Ｇ」），
シトシン（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）である。４
種のRNA塩基はA,G,Cおよびラウシル（「Ｕ」）である。
DNA配列：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素と
の間のホスホジエステル結合により互いに連結されたヌ
クレオチドの線状列。
コドン：メッセンジャRNA（「mRNA」）を介しアミノ
酸，翻訳開始信号または翻訳停止信号をコードする３個
のヌクレオチド（トリプレット）のDNA配列。たとえ
ば、ヌクレオチドトリプレットTTA,TTG,CTT,CTC,CTAお
よびCTGはアミノ酸ロイシン（「Leu」）をコードし、TA
G,TAAおよびTGAは翻訳停止信号でありかつATGは翻訳開
始信号である。
プラスミド：完全「レプリコン」からなる非染色体の二
重鎖DNA配列であって、このプラスミドは宿主細胞内で
複製される。プラスミドを単細胞宿主生物内に入れる
と、この生物の特性がプラスミドにおけるDNAの結果と
して変化しまたは形質転換する。たとえば、テトラサイ
クリン耐性（TetR）に対する遺伝子を有するプラスミド
は、テトラサイクリンに対し感受性であった宿主細胞を
テトラサイクリンに対し耐性のものに形質転換させる。
プラスミドにより形質転換された宿主細胞を「形質転換
体」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ：細菌ウイルスであ
って、その多くは蛋白エンベロプもしくはコードにカプ
セル化されたDNA配列を有する（「カプシド」）。
クローン化ビークル：宿主内で複製しうるプラスミド，
ファージDNAまたはその他のDNA配列であって、１個もし
くは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、こ
の部位でDNA配列はDNAの本質的な生物学的機能、たとえ
ば複製，コード蛋白の産生、またはプロモータもしくは
結合部位の消失を伴なわずに決定可能に切断することが
でき、かつ形質転換細胞の同定に使用するのに適した標
識、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリ
ン耐性を有する。クローン化ビークルはベクターとして
も知られる。
宿主：クローン化ビークルにより形質転換されてクロー
ン化ビークルを複製させかつ他の生物学的機能、たとえ
ばプラスミドの遺伝子の発現を介するポリペプチドもし
くは蛋白の産生を達成させうる生物。
コスミド：バクテリオファージλの凝集性末端（「co
s」）部位を有するプラスミド、コスミドはcos部位の存
在によりλコード蛋白中へ封入して適当な宿主に感染さ
せるために使用することができる。その外来DNAの大型
断片に対する容量のため、コスミドはクローン化ビーク
ルとして有用である。
発現：ポリペプチドもしくは蛋白を産生すべく遺伝子に
より受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである。
転写：遺伝子からmRNAを生成する過程。
翻訳:mRNAから蛋白もしくはポリペプチドを産生する過
程。
プロモータ：遺伝子におけるDNAの領域であって、ここ
でRNAポリメラーゼが結合しかつ転写を開始する。プロ
モータは遺伝子のリボソーム結合部位の前に位置する。
リボソーム結合部位：リボソームに対するmRNAの結合を
促進して翻訳を開始させうるmRNA上の部位をコードする
遺伝子のDNA領域。このリボソーム結合部位は、プロモ
ータの後かつ遺伝子における翻訳開始信号の前に位置す
る。
遺伝子:mRNAに対する雛型として特異性蛋白，ポリペプ
チドもしくはペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコー
ドするDNA配列。
発現制御配列：遺伝子に作用結合された際、クローン化
ビークルにおける遺伝子の発現を制御しかつ調整するDN
A配列。
信号DNA配列:mRNAに対する雛型として、ポリペプチドも
しくは蛋白のアミノ末端における疏水性アミノ酸の配
列、すなわちポリペプチドもしくは蛋白の「信号配列」
もしくは「疏水性リーダー配列」をコードするポリペプ
チドもしくは蛋白のための遺伝子内のDNA配列。信号DNA
配列は、成熟蛋白をポリペプチドとしてコードするDNA
配列の直前かつ遺伝子の翻訳開始信号（ATG）の後にお
けるポリペプチドまたは蛋白用の遺伝子に位置する。信
号DNA配列は、ポリペプチドもしくは蛋白の先駆体に特
徴的であるポリペプチドもしくは蛋白の信号配列をコー
ドする。
蛋白もしくはポリペプチドの先駆体における信号配列
の１部のみが宿主の細胞膜を通して移動すべき蛋白もし
くはポリペプチドの先駆体に対し必須であり、さらに先
駆体の信号配列が適切に欠落して分泌に際し成熟蛋白も
しくはポリペプチドを形成するのに必須であると思われ
る。したがって、「信号DNA配列」という用語は、分泌
に対しかつ好ましくは宿主細胞内で産生された蛋白，ポ
リペプチドもしくはペプチドの先駆体の成熟に対し必須
な信号配列の部分をコードするDNA配列を意味する。
ストレプトアビジン様ポリペプチド：天然ストレプトア
ビジンとほぼ免疫学上均等でありかつビオチンまたはビ
オチン誘導体もしくは同族体に結合しうるポリペプチド
である。このポリペプチドは天然ストレプトアビジンの
１部でないアミノ酸を含有することができ、或いは天然
ストレプトアビジンの１部のみを含有することもでき
る。さらに、このポリペプチドは、これを産生した宿主
が宿主産生されたポリペプチドを天然ストレプトアビジ
ンの構造に変化させるのに必要とされる適当な酵素を欠
損することもあるので、天然ストレプトアビジンとは同
一でないこともある。
本発明の宿主細胞 任意多数の入手しうる周知の宿主細胞を、本発明の宿
主／発現ベクター組合せで使用することができる。特定
宿主の選択は、当業者により知られた多くのファクタに
依存する。これらは、たとえば選択される発現ベクター
との適合性，ベクターに対するハイブリッドプラスミド
によりコードされた蛋白の毒性，所望蛋白の回収容易
性，発現特性，生物安全性および価格を包含する。必ず
しも全ての宿主が本発明の発現ベクターおよび方法にお
いて特定DNA配列の発現に対し同等に有効であるとは限
らないことを理解した上で、これらファクタの調和を計
らねばならない。
これら一般的指針内において有用な微生物宿主は、イ
ー・コリ，シュードモナス，細菌類，ストレプトミセ
ス，酵母およびその他の真菌類の菌株，昆虫，培養中の
植物細胞もしくは動物細胞（ヒトを含む）または当業界
で知られたその他の宿主を包含しうる。
特に好ましくは、本発明に使用する宿主はたとえばス
トレプトミセスのようなグラム陽性菌である。グラム陽
性菌は、外側細胞壁に持たない。したがって、分泌され
る蛋白は、細胞膜を通して細胞媒体中へ直接に移動す
る。この特性は、たとえばイー・コリのようなグラム陰
性菌を宿主細胞として使用する際に必要とされるような
外質空間から蛋白を単離する必要性を除去する。蛋白
は、全ゆる細胞を汚染物を含まないよう、細胞媒体から
直接に精製することができる。好適なグラム陽性宿主細
胞はストレプトミセス・リビダンスである。
本発明の発現制御配列 本発明のストレプトアビジンDNA配列またはバイブリ
ッドストレプトアビジン−異質DNA配列を発現させるに
は、これらDNA配列を発現制御配列に作用結合させねば
ならない。この作用結合を、DNA配列がクローン化ビー
クル中へ挿入される前または後のいずれかに行なう方法
は周知されている。
本発明に有用な発現制御配列も周知されている。これ
らはイー・コリlac系，イー・コリtrp系，イー・コリβ
−lac系,TAC系,TRC系，バクテリオファージλの主オペ
レータおよびプロモータ領域，フィラメント状一本鎖DN
Aファージの制御領域，ストレプトミセスまたはその他
のグラム陽性菌の発現制御配列、並びに原核もしくは真
核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発現を制御するこ
とが知られたその他の配列、またはその組合せを包含す
る。
より好ましくは、グラム陽性菌において作用する発現
制御配列を使用する。特に好ましくは、ストレプトミセ
ス宿主を使用する場合には、ストレプトミセス発現制御
配列を使用する。
本発明のクローン化ビークル 本発明によれば、宿主細胞中で複製することができか
つDNA断片を挿入しうる制限部位を有する任意のクロー
ン化ビークルを使用することができる。本発明に使用す
る好適なクローン化ビークルは、ストレプトミセスで複
製しうる多コピープラスミドである。
本発明のストレプトアビジンDNA配列またはハイブリ
ッドストレプトアビジン−異質DNA配列が挿入されるク
ローン化ビークルにおける挿入部位の特定位置は、選択
される蛋白，ポリペプチド，ペプチドもしくはアミノ酸
を製造するのに臨界的でない。この点において、切断部
位は、宿主内における複製を阻害しないようなクローン
化ビークルの任意の個所に位置することができる。
所望の切断部位を作るために使用する制限酵素は周知
されている。これらは、たとえばAra I,Pst I,Sal I,Ec
oR I,BamH I,Hind III,Hinc IIおよびSau3aを包含す
る。本発明の方法に使用するクローン化ビークルを所望
の制限部位で切断してこの部位にDNA配列を挿入するた
めの方法も周知されている。
本発明の方法によるDNA配列の発現 本発明の方法はストレプトアビジン様ポリペプチドを
コードするDNA配列或いはストレプトアビジン様ポリペ
プチドの１部をコードするDNA配列と所望の真核，原核
もしくはウイルス性蛋白，ポリペプチド，ペプチドもし
くはアミノ酸を種々の方法でコードするDNA配列とより
なるハイブリッドDNA配列を発現させるべく使用するこ
とができる。
ストレプトアビジン様ポリペプチドを単独で産生させ
ることが望ましい本発明の具体例においては、所望のポ
リペプチドをコードするDNA配列をクローン化ビークル
における発現制御配列に作用結合させる。この構成にお
いては、DNA配列自身が開始信号で開始しなければ、ス
トレプトアビジン様ポリペプチドをコードするDNA配列
の直前に翻訳開始信号が存在しなければならない。さら
に、開始信号とストレプトアビジン様ポリペプチドをコ
ードするDNA配列の末端との間には停止コドンが存在し
てはならない。次いで、生成する組換DNA分子を使用し
て適当な宿主を形質転換させ、かつこの形質転換宿主を
慣用の発酵条件下で培養して所望のストレプトアビジン
様ポリペプチドを産生させる。
本発明によるこの面の好適具体例において、融合した
キャリヤ蛋白−ストレプトアビジン様ポリペプチドをこ
れを産生した細胞から分泌させるのに充分なキャリヤ蛋
白信号配列の部分を含め、キャリヤ蛋白の１部をコード
化するDNA配列は、翻訳開始信号とストレプトアビジン
様ポリペプチドをコード化するDNA配列との間に存在す
る。キャリヤ蛋白自身をコードするDNA配列なしに、キ
ャリヤ蛋白信号DNA配列のみが翻訳開始信号とストレプ
トアビジン様ポリペプチドをコード化するDNA配列との
間に存在する。特に好ましくは、翻訳開始信号とストレ
プトアジビン様ポリペプチドをコードするDNA配列との
間に存在する信号DNA配列はストレプトアビジン信号DNA
配列であり、その充分な部分が存在するとストレプトア
ビジン様ポリペプチドを宿主細胞から分泌させる。
このようにしてストレプトアビジン様ポリペプチドが
産生され、かつ形質転換宿主から分泌される。好ましく
は、信号配列は、その細胞からの分泌に際し、ストレプ
トアビジン様ポリペプチドまたは融合キャリヤ蛋白−ス
トレプトアビジン様ポリペプチドから切断される。キャ
リヤ蛋白の１部をストレプトアビジン様ポリペプチドに
融合させる具体例においては、融合蛋白の産生および単
離の後にストレプトアビジン様ポリペプチドを下記する
公知方法によりキャリヤ蛋白から切断するのが好まし
い。
非ストレプトアビジン様の蛋白，ポリペプチド，ペプ
チドもしくはアミノ酸を本発明の方法により産生させる
ことが望ましい本発明の具体例においては、これら産生
物をコードするDNA配列を、ストレプトアビジン様ポリ
ペプチドをコードするDNA配列の少なくとも１部より下
流かつそれと同じ解読枠に結合させて、ハイブリッドDN
A配列を生成させる。次いで、生成したハイブリッドDNA
配列をクローン化ビークルにおける発現制御配列に作用
結合させる。ここでも、この構成において、ハイブリッ
ドDNA配列自身が開始信号で開始しなければ、ハイブリ
ッドDNA配列の直前に翻訳開始信号が存在せねばならな
い。さらに、開始信号とハイブリッドDNA配列との末端
との間に停止コドンが存在してはならない。
本発明によるこの面の種々の具体例において、上記し
たキャリア蛋白／キャリア蛋白信号配列／ストレプトア
ジビン信号配列の組合せをコードするDNA配列の幾つか
または全部は、翻訳開始信号とハイブリッドDNA配列と
の間に存在する。このようにして、ストレプトアビジン
様ポリペプチドと非ストレプトアビジン様の蛋白，ポリ
ペプチド，ペプチドもしくはアミノ酸とが末端結合して
なる融合蛋白が産生され、かつ形質転換宿主から分泌さ
れる。他の具体例においては、ストレプトアジビン信号
DNA配列を非ストレプトアビジン様の蛋白，ポリペプチ
ド，ペプチドもしくはアミノ酸をコード化するDNA配列
に直接結合させて、宿主細胞からの蛋白，ポリペプチ
ド，ペプチドもしくはアミノ酸の分泌を可能にする。上
記全ての具体例において、好ましくは信号配列を宿主細
胞からの分泌に際し切断させる。キャリヤ蛋白の１部を
融合蛋白に融合させる具体例においては、融合蛋白を下
記する公知方法により融合蛋白の産生および単離の後に
キャリヤ蛋白から切断するのが好ましい。
使用したストレプトアビジン様ポリペプチドまたはプ
レストレプトアビジン様ポリペプチドをコードするDNA
配列の適当な部分は、多くのファクタで決定される。こ
れらは、所望産生物をコード化するDNA配列の発現特
性、所望産生物の分泌容易性，所望産生物の最終用途、
並びにストレプトアビジン配列を用いる分泌，ストレプ
トアビジン結合を用いる精製またはその両者が望ましい
かどうかなどの要因を包含する。
たとえば、ストレプトアビジン信号配列を用いて所望
産生物を分泌させかつビオチンまたはビオチン誘導体も
しくは同族体に対するストレプトアビジン結合を用いて
精製する場合は、分泌を可能にするのに充分なストレプ
トアビジン信号配列の部分およびビオチンまたはその誘
導体もしくは同族体の１種に対する結合を可能にするの
に充分な成熟ストレプトアビジンコード配列の部分が必
要とされる。
さらに、非ストレプトアビジン様の蛋白，ポリペプチ
ド，ペプチドもしくはアミノ酸自身が必要であれば、ス
トレプトアビジン誘導配列を産生，分泌，精製またはそ
れらの組合せの後に種々の手段で除去することができ
る。たとえば、融合蛋白は、所望産生物をストレプトア
ジビン様ポリペプチドから分離するのに有用な化学的も
しくは酵素的切断部位を有することができる。本発明の
他の具体例においては、この種の切断部位を融合蛋白中
へ組込み、その際融合蛋白の望ましくない部分をコード
する領域と、望ましい部分をコードする領域との間に１
個もしくはそれ以上のコドンを持たないようにハイブリ
ッドDNA配列を作成する。発現に際し、これらコドンは
所望の切断部位を生ぜしめる。
ストレプトアビジンはメチオニン残基をもたないの
で、融合蛋白を切断する好適手段（ただし所望の蛋白，
ポリペプチド，ペプチドもしくはアミノ酸もメチオニン
残基を持たないものとする）は、ストレプトアジビン様
ポリペプチドをコードするDNA配列と所望の産生物をコ
ードするDNA配列との間にATGコドン（メチオニンをコー
ドする）を有するハイブリッドDNA配列を作成すること
である。次いで、この融合蛋白は臭化シアノゲンでの処
理により孤立メチオニン残基において切断することがで
きる（E.グロス、メソッズ・イン・エンチモロジー、第
11巻、第238−55頁（1967）参照〕。
本発明の有用な異質DNA配列としては、動物およびヒ
トホルモン、たとえば各種IFN−α、特にα2,α5,α7,
α8,IFN−β,IFN−λ，ヒトインシュリンおよび成長ホ
ルモン，牛成長ホルモン，豚成長ホルモンおよびエリス
ロポイエチン，ヒト血液ファクタおよび組織プラスミノ
ーゲン活性体，ウイルス性もしくは細菌性抗原、たとえ
ばHBVの核もしくは表面抗原またはFMDVの抗原並びに原
核，真核もしくはウイルス性の他の有用なポリペプチド
をコードするものがある。好ましくは、使用する異質DN
A断片は、さらにその遺伝子翻訳停止信号をも含有し、
特に好ましくはその５′非コード領域の１部を含有す
る。
本発明の産生物の精製 本発明の一層有利な具体例は、産生物がストレプトア
ビジン様ポリペプチドであっても或いはビオチンまたは
その誘導体もしくは同族体の１種に結合しうるのに充分
なストレプトアビジン様ポリペプチドの部分を有する融
合蛋白であっても、ビオチンまたはビオチン誘導体もし
くは同族体に結合させて精製されるものである。次い
で、未結合の汚染物を捨てかつ所望の産生物をビオチン
から回収する。勿論、ビオチン結合を使用して融合蛋白
のストレプトアビジン残基を、前記したように融合蛋白
の切断後に所望の産生物から分離することもできる。
好ましくは、本発明のストレプトアビジン様ポリペプ
チドは生物親和性クロマトグラフィーを用いて精製され
る。特に好ましくは、クロマトグラフィー用樹脂は、免
疫ビオチン（すなわち、ビオチン同族体）をアガロース
または他の不活性マトリックスに共有結合させて生成さ
れる〔ホフマン等、上記;G,ヘネイおよびG.A.オール、
アナリチカル・バイオケミストリー、第114巻、第92−9
6頁（1981）〕。
ストレプトアジビンは未改変のビオチン−アガロース
樹脂に強力に結合して、極めて厳しい条件下でのみ溶出
することができる〔P.カトレカサスおよびM.ウィルチエ
ック、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・
コミューニケーション、第33巻、第235−39頁（196
8）〕。したがって、ビオチン−アガロースはストレプ
トアビジン様ポリペプチドを精製する際使用するには不
満足である。しかしながら、ビオチン−アガロースまた
は同様な樹脂は、選択した蛋白，ポリペプチド，ペプチ
ドもしくはアミノ酸に結合したストレプトアビジン様ポ
リペプチドの融合蛋白を精製するのに有用であり、この
樹脂は選択した蛋白，ポリペプチド，ペプチドもしくは
アミノ酸の存在によりビオチンに対し低い親和性を有す
る。
ストレプトアジビンは塩基性pHにて免疫ビオチンに結
合し、かつ高濃度の尿素の存在下で酸性pHにて溶出され
る。特に好ましくは、ストレプトアビジン様ポリペプチ
ドは5mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH10.5,0.5M NaCl）
にて免疫ビオチン−アガロースカラムに施こされ、かつ
50mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH3.8,1M尿素）で溶出さ
れる。
本発明を一層よく理解するため、以下の実施例により
本発明を説明する。
実施例 ストレプトアビジンDNA試料の作成 市販ストレプトアビジン（BRL社から購入）の最初の3
8N−末端アミノ酸におけるアミノ酸配列を決定した。次
いで、ストレプトアビジンにおけるアミノ末端の１部
（trp−tyr−asn−gln−leu）に対応する14−塩基試料
（「SA−１」）を化学合成した。このDNA試料を使用し
て、下記するように作成されたコスミド保存物をストレ
プトアビジン様ポリペプチドをコードするDNA配列につ
きスクリーニングした。
SA−１試料は16倍の変質物であって、次の配列を有し
た： Ｓ・アビジニイのコスミド保存物の作成 Ｓ・アビジニイ菌をYME培地中で培養し、その細菌DNA
を標準法で単離した〔K.F.チェーター等、カレント・ト
ピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イシ
ュノロジー、第96巻、第69−75頁（1982）〕。次いで、
DNAをSau3Aにより部分切断し、かつこれを塩勾配での遠
心分離によって寸法分画した。コスミドpHC79中へ挿入
するため、20Kbより大きい断片を集めた。
ベーリンガ・マンハイム社により市販されているコス
ミドpHC79は、アンピシリン耐性をコードする遺伝子を
含むプラスミドpBR322の部分と、バクテリオファージλ
DNAの相補末端をコードする「cos」領域とよりなってい
る〔B.ホーンおよびJ.コリンス、ジィーン、第11巻、第
291−98頁（1980）〕。
pHC79をBamH Iで線状化させ、このBamH Iはプラスミ
ドを単一の部位で切断すると共に、Sau3A切断されたDNA
の末端に相補的な末端を生成する。次いで、Ｓ・アビジ
ニイ断片を線状化されたpHC79へ結合させた。得られた
組換DNA分子はＳ・アビジニイ・コスミド保存物からな
り、これらをλ試験管内包装抽出物（アメルシャム社）
に添加した。得られた溶菌物を使用して、標準法により
イー・コリＫ−17菌株 ED8767にトランスフェクトした
〔マニアチス等、モレキュラー・クローニング、ラボラ
トリー・マニュアル・第295−305頁（マニアチス・フリ
ッチおよびサムブルック編（1982）〕。
SA−１試料によるＳ・アビジニイのコスミド保存物のス
クリーニング ストレプトアビジンをコード化するDNA配列につき上
記保存物をクリーニングするため、トランスフェクトし
たイー・コリ菌体をアンピシリン（50μg/ml）を補充し
たLB培地で37℃にて増殖させた。コスミドpHC79はアン
ピシリン耐性をコードする遺伝子を有するので、pHC79
を含有するイー・コリＫ−12菌株はアンピシリンの存在
下で増殖するのに対し、pHC79を含有しないＫ−12菌体
は増殖することができない。したがって、アンピシリン
含有培地での増殖は、pHC79を含有する宿主の選択を可
能にする。
2200個のAmpRコロニーを選択し、これらを96穴のミク
ロ測定板の個々の穴部に釣り上げて入れた。選択した培
養物を前記と同様に37℃にて増殖させ、かつこれらを96
本のフォークによりニトロセルロースフイルタへ列とし
てプリントした。次いで、これらコロニーを上記のよう
に作成したSA−１試料により６×SSC緩衝液（0.1％SD
S）にて30℃で１晩ハイブリッド化させ、その際グリュ
ンスタインおよびホグネスのハイブリッド化法を使用し
た〔プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス、USA、第72巻、第3961−65頁（1975）〕。2200
個のコロニーの内１個が、SA−１試料にハイブリッド化
したDNA配列を有した（コロニー62/C）。
ストレプトアビジン関連DNAの単離 プラスミドDNAをコロナー62/Cから単離し、上記と同
様にしてSA−１試料に対するそのハイブリッド化を再確
認した。このプラスミドDNA（p62/C）は、pHC79のBamH
I部位に約40KbのＳ・アビジニイDNAの挿入物を含有し
た。次に、第１図を参照して、この40Kb断片をBamH Iで
切断しかつ2Kb断片を単離し、この断片もSA−１にハイ
ブリッド化した。この2Kb断片をSA304と呼ぶ。次いで、
プラスミドpUC8〔J.ビエラおよびJ.メッシング、ジー
ン、第19巻、第259−68頁（1982）〕をBamH Iで線状化
させて、lacプロモータから下流の１の位置で切断し
た。線状化したpUC8を常法によりSA304に結合させた。
この結合は組換DNA分子を生成し、これをpSA304と呼
ぶ。
pSA304で形質転換させたイー・コリ菌体はストレプト
アビジン様ポリペプチドを産生し、これを細胞膜を通し
て分泌することを見出した。しかしながら、この産生お
よび分泌は、SA304がpUC8に存在するlacプロモータに作
用結合されるような配向で存在する時のみ生じた。これ
らの結果に基づき、pSA304は信号DNA配列を含めストレ
プトアビジン様ポリペプチドをコード化するDNA配列に
作用結合されてその発現を制御するイー・コリlacプロ
モータを含有すると結論された。
ストレプトアビジン信号DNA配列の存在を、SA307（下
記に説明）のヌクレオチド配列決定により確認した。さ
らに、Ｓ・アビジニイのストレプトアビジン発現制御配
列の存在を下記するS1地図化によって確認した。
ストレプトアビジン様ポリペプチドをコードするDNA
配列のSA304における存在を、pSA304の部分を配列決定
して確認した。SA304断片におけるヌクレオチドNo.623
（Alu）に近いヌクレオチド配列（第２図参照）は、SA
−１試料の配列と正確に一致した。このヌクレオチド配
列は、さらにSA−１試料に対応する領域から下流のスト
レプトアビジンポリヌクレオチドの20個アミノ酸領域の
蛋白配列から予想されるものと一致した。
ストレプトアビジン様ポリペプチドのヌクレオチド配列
の決定 再び第１図を参照して、ストレプトアビジン様ポリペ
プチドをコード化するDNA断片を一層正確に位置決定し
かつ配列決定するため、pSA304をBamH Iで処理した。断
片SA304を再単離し、かつこれを予めBamH Iで線状化さ
れたプラスミドpUC13に結合させた。プラスミドpUC13
は、BamH I部位を直接包囲するヌクレオチドが異なる配
向で存在しかつ付加的制限部位を有する以外は、pUC8と
同一である（J.ピエラおよびJ.メッシング、上記）。次
いで、生成したプラスミド（pSA306）をSma Iで制限し
かつ大きい断片を再結合すると、SA304の900塩基対断片
を喪失してプラスミドpSA307を生成した。次いで、この
pSA307をBamH IおよびSma Iで処理し、かつ1.1Kb断片
（「SA307」）を単離した。この断片をマキサムおよび
ギルバートの方法により配列決定した〔メソッズ・イン
・エンチモロジー、第65巻、第499−560頁（1980）〕。
この配列（第２図）は、ヌクレオチドNo.480におけるAT
G翻訳開始信号と、ヌクレオチドNo.1030におけるTAG停
止信号との間にストレプトアビジン様ポリペプチドをコ
ードするDNA断片が存在することを示している。この配
列は、さらに35アミノ酸信号配列をコードする信号DNA
配列の存在を示している。ストレプトアビジン発現制御
配列の存在については、下記するS1地図化によって確認
した。
イー・コリにおけるストレプトアビジン様ポリペプチド
の発現 pSA304およびpSA307を使用して、標準法によりイー・
コリＫ−12菌体を形質転換させた。
次いで、このように形質転換した生物の培養物を、ス
トレプトアビジン様ポリペプチドの発現および外質空間
中への分泌につき免疫学的反応性とビオチン結合活性と
イー・コリ産生されたポリペプチドのＮ−末端アミノ酸
配列とによって試験した。ｐ−150ゲル濾過クロマトグ
ラフィーによって再精製した市販のストレプトアビジン
に対するウサギ抗−ストレプトアビジン抗体を生成させ
た。抗血清は、SDS−ポリアクリルアミドゲルからニト
ロセルロースシートへ電気泳動した蛋白の免疫斑点によ
り判断して、市販のストレプトアビジンとＳ・アビジニ
イ細胞媒体から精製されたストレプトアビジンとを識別
した〔H.トウビン等、プロシーディング・ナショナル・
アカデミー・サイエンス、USA、第76巻、第4350−54頁
（1979）〕。
pSA304で形質転換されたイー・コリＫ−12菌体の菌株
JM83を40μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地におい
て37℃にて約18時間培養した。冷浸透圧ショック技術
〔L.A.ヘッペル、メソッゾ・イン・エンチモロジー、第
126巻、第841−47頁（1968）〕を用いて、外質空間から
蛋白を単離した。上記と同様に市販のストレプトアビジ
ンに対して生成させたウサギ抗血清は、浸透圧ショック
流体から単離された２種の主たる外質ポリペプチドをウ
エスタンブロットで識別した〔Ｈ・トウビン等、上
記）。２種のストレプトアビジン様ポリペプチドの大き
い方はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測
定して約17,500ダルトンの見掛け分子量を有するのに対
し、市販ストレプトアビジンの見掛け分子量は13,500ダ
ルトンであった（第３図）。２種のポリペプチドの小さ
い方は15,000ダルトンの見掛け分子量を有した。これら
２種のストレプトアビジン様ポリペプチドを免疫ビオチ
ン−アガロースクロマトグラフィーカラムから一緒に溶
出させた。次いで、イー・コリ産生されたストレプトア
ビジン様ポリペプチド（「エコアビジンメジャー」およ
び「エコアビジンマイナー」）を、10mMトリスHCl緩衝
液（pH8.0,0.9％ NaCl）中で非変性条件下にｐ−150ゲ
ル濾過クロマトグラフィーにかけた。２種のエコアビジ
ンは約88,000ダルトンの見掛け分子量をもって移動し
た。この分子量は、天然ストレプトアビジンと同様な天
然四元重合体構造に最もよく一致した。
これらエコアビジンを、10mMトリスHCl緩衝液（pH8,
0.9％ NaCl）の存在下にビオチン−アガロースおよび
ファロースCL−6B（未改変アガロース）のカラムクロマ
トグラフィーにかけた。これらエコアビジンはビオチン
−アガロースに結合したが、未改変アガロースには結合
しなかった。さらに、これらエコアビジンは、免疫ビオ
チンのカラムに結合して天然ストレプトアビジンにより
示される同様な溶出パターンを示した〔Ｋ・ホフマン
等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス、USA、第77巻、第4666−68頁（1980）〕。
さらに、天然ストレプトアビジンと両形態のエコアビ
ジンとの間の差を、アプライド・ビオシステムスの気相
アミノ酸配列決定装置を用いて、エコアビジンポリペプ
チドのアミノ末端を配列決定することにより確認した。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりメジャー
型およびマイナー型のエコアビジンを分離し、これらポ
リペプチドを電気溶出させ、かつそれぞれのアミノ末端
のアミノ酸配列を別々に決定した。これらエコアビジン
は天然の成熟ストレプトアビジンには存在しないアミノ
末端に13個のアミノ酸を含有し、次いで天然ストレプト
アビジンと同一の12個のアミノ酸を含有した。エコアビ
ジンメジャーおよびエコアビジンマイナーの両者は同一
アミノ末端を有するが異なる見掛け分子量を有するの
で、これらはカルボキシル末端が相違するはずである。
ヒドロキシルアミノ切断に際し、エコアビジンメジャー
は、エコアビジンマイナーと同様な見掛け分子量を有す
る形態に変化する。これは、２種の形態がカルボキシル
末端においてのみ相違するという推定に一致する。蛋白
配列は、SA307の対応する領域のヌクレオチド配列から
予想されるものと正確に一致し、ストレプトアビジン信
号配列の22アミノ酸断片のイー・コリにおける切断を確
認した。かくして、ストレプトアビジン信号配列の13ア
ミノ酸断片は、両形態の成熟エコアビジンに残存する。
エコアビジンを、放射能標識したビオチンを結合する
その能力によって分析した〔S.G.コレンマンおよびB.W.
オーマレー、メソッズ・エンチモロジー、第18A巻、第4
27−30頁（1970）〕。精製したエコアビジンの収量は培
地１当り約30mgであり、これらはＳ・アビジニイから
作成される天然ストレプトアビジンの収量の7.5〜10倍
の増加である。pSA307で形質転換させかつ上記と同様に
分析したイー・コリ菌体は、同様なレベルのストレプト
アビジンを産生した。
上記pSA304と同様にして、pSA307−形質転換イー・コ
リ菌体におけるストレプトアビジン様DNA断片の発現を
制御する発現制御配列は、イー・コリlacプロモータで
あることを確認した。
Ｓ・リビダンスにおけるストレプトアビジン様ポリペプ
チドの発現 さらに、ストレプトアビジン様ポリペプチドをコード
化するDNA配列を、ストレプトアビジン発現制御配列の
制御下で、グラム陽性菌ストレプトミセス・リビダンス
にて複製しうる発現ベクターにクローン化させた。pSA3
04はＳ・リビダンスで複製しなかったので、pSA304とpI
J702とよりなる共体プラスミドを作成した。このプラス
ミドにおいて、ストレプトアビジンDNA配列はSA304、す
なわち挿入DNA配列のすぐ上流に位置するlacプロモータ
と、SA304に存在するストレプトアビジン発現制御配列
との両者に作用結合する。
次に、第４図を参照して、pSA304をPst Iで線状化さ
せ、かつ線状化したプラスミドを牛腸内ホスファターゼ
で処理して再環化を防止した。次いで、pIJ702をPst I
により線状化させ〔E.キャッツ等、ジャーナル・オブ・
ゼネラル・マイクロバイオロジー、第129巻、第2703−1
4頁（1983）〕、かつこれを線状化pSA304に結合させ
た。このプラスミドpIJ702はチオストレプトン耐性に対
するストレプトミセス標識遺伝子を含有すると共に、ス
トレプトミセス宿主細胞にて増殖しうるレプリコンを含
有する。
結合混合物によりイー・コリJM83菌体を形質転換さ
せ、かつ前記と同様にアンピシリンの存在下に培養し
た。共体プラスミドpSA3721を含有する１個のAmpRコロ
ニーを単離した。
pSA3721を単離し、かつこれを使用してストレプトミ
セス・リビダンスを形質転換させた。チオストレプトン
耐性につきスクリーニングし、８種のコロニーを単離し
た。各コロニーを２μg/mlのチオストレプトンを含有す
るR2YE培地において、８日間まで邪魔板振とうフラスコ
にて30℃で培養した。菌体と培地とを種々の時間で収穫
し、かつ上記の免疫学的分析およびビオチン結合分析に
よりストレプトアビジン様ポリペプチドの産生およびそ
の細胞培地中への分泌につき試験した。形質転換したＳ
・リビダンスは、これら分析において天然ストレプトア
ビジンと同一に挙動するポリペプチドを産生し、かつ細
胞培地中へ分泌することが見出された。産生のレベルは
培地1ml当り約250mgの蛋白であり、これはＳ・アビジニ
イの産生よりも約60〜80倍の増加であった。ストレプト
アビジン様DNA配列は、S1地図化実験を行なうことによ
りSA304断片に存在するストレプトアビジン発現制御配
列の制御下にあることを確認し〔A.J.バークおよびP.A.
シャープ、セル、第12巻、第721−32頁（1977）〕、こ
のことはRNA転写がＳ・アビジニイおよびpSA3721におけ
る同じ部位で開始することを示している。
S.リビダンスにより産生されかつ分泌されたストレプ
トアビジン様ポリペプチドがpSA3721組換DNA分子に含有
されるDNA断片の発現の結果であることを確認するた
め、Ｓ・リビダンスをpIJ702単独で同一条件下に形質転
換させ、かつ上記と同様にチオストレプトン耐性につき
選択した。このように単離したコロニーは、いずれも上
記分析のいずれで測定しても、ストレプトアビジン様活
性を有する蛋白を産生しなかった。
融合蛋白またはポリペプチドの産生 次いで選択された蛋白，ポリペプチド，ペプチドもし
くはアミノ酸をコード化するDNA配列をプラスミドpSA30
7中へ、ストレプトアビジン様ポリペプチドをコード化
するDNA配列の末端に位置する制限部位であるが、その
翻訳停止信号前かつその同じ解読枠において挿入し、ハ
イブリッドDNA配列を作成した。
この構造を得るため、たとえばα−アンチトリプシン
（「αAT」）をコード化するDNA配列を使用した。pULB1
523〔A.ホレン等、ジーン、第２巻、第225−64頁（198
3）〕をBamH IおよびPstで処理し、かつαATの最初の２
個のアミノ酸だけをコード化する小さいDNA断片を単離
した。合成リンカをこの断片を５′末端に付加させて、
最初の２個のアミノ酸をコードするコドンを再形成させ
ると共に、この断片の５′末端にNco制限部位を付加し
た。次いで、Hinc IIでの部分切断によりpSA304を線状
化させた。Ncoリンカを線状化したpSA304に付加させ、
かつNcoで切断して凝集性末端を生成させた。次いで、
線状化したpSA304をPstで処理した。Hinc IIで切断され
かつSA304のヌクレオチド994にのみNcoリンカを有する
断片を選択した。αATをコード化するDNA配列をこのDNA
断片に結合させて、ストレプトアビジン様ポリペプチド
をコード化するDNA配列に隣接してそれと同じ解読枠に
挿入されたαATを有する組換DNA分子を生成させた。
イー・コリK12菌体を得られた組換DNA分子で形質転換
させ、かつこの形質転換宿主菌体を培養して、αATに対
し末端結合したストレプトアビジン様ポリペプチドより
なる融合ポリペプチドを産生させかつ宿主細胞膜を通し
て分泌させた。
他のDNA配列も入手することができ、これを本発明の
方法に使用して選択された蛋白，ポリペプチド，ペプチ
ドもしくはアミノ酸に結合されたストレプトアビジン様
ポリペプチドよりなる融合蛋白を産生させることができ
る。
ストレプトミセスにおいて複製することができかつ融
合ストレプトアビジン様αAT蛋白を産生しうるクローン
化ビークルを作成するため、ハイブリッドDNA配列を有
する組換DNA分子をPst Iで線状化させ、かつ線状化した
組換DNA分子を子牛腸内ホスファターゼで処理して再環
化を防止した。次いで、Pst Iで線状化したpIJ702を線
状化した組換DNA分子に結合させて、ハイブリッドスト
レプトアビジン−αAT DNA配列を有する共体プラスミ
ドを生成させた。Ｓ・リビダンス菌体をこの共体プラス
ミドで形質転換させ、かつ宿主細胞を培養してαATに対
し末端結合したストレプトアビジン様ポリペプチドより
なる融合蛋白を産生させかつ宿主細胞膜を通して細胞媒
体中へ分泌させた。
本発明の他の実施例において、組織プラスミノーゲン
活性体（「TPA」）に対し末端融合したストレプトアビ
ジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白をコード化するハ
イブリッドDNA配列を作成した。
第５図を参照して、先ずストレプトアビジン様ポリペ
プチドをコードするDNA配列を含んだプラスミドを作成
した。pSA307をHinc IIで処理して、SA307におけるヌク
レオチドNo.174および994にて切断した（第２図）。次
いで、Ncoリンカをこの断片の両末端に付加させ、かつN
coで切断して凝集性末端を生成させた。この断片をSA32
4と呼ぶ。
次いで、プラスミドpKK233−２〔J.ブロシウス、私的
通信〕をNcoで線状化させた。この線状化したpKK233−
２をSA302に結合して、プラスミドpSA324を生ぜしめ
た。イー・コリK12菌体をpSA324で形質転換させかつこ
の形質転換宿主菌体を培養して、ストレプトアビジン様
ポリペプチドを産生させると共に、宿主細胞膜を通して
分泌させた。ストレプトアビジン様ポリペプチドの産生
はIPTGにより誘発された。これから結論されるように、
pSA324は、pKK233−２に存在するTRC発現制御配列に作
用結合したストレプトアビジン様ポリペプチドをコード
化するDNA配列（信号DNA配列をも含む）を含有する。
次いで、TPAをコード化する配列を有するプラスミド
を作成した。プラスミドpTPA20は３′末端におけるBgl
II制限部位とTPA遺伝子の５′末端におけるHind III制
限部位との間に挿入された成熟TPAをコード化するDNA配
列を有する。pTPA20をBgl IIおよびHind IIIで処理し、
かつTPA断片を単離した。Nco−Bgl IIのリンカをTPA遺
伝子の５′末端に結合させた。次いで、pKK233−２をNc
oおよびHind IIIで処理した。大きい断片を単離しかつ
これをTPA断片（「pTPA101」）に結合させた。次いで、
pTPA101をBamH Iで切断し、lac I（TRCリプレッサ）遺
伝子を有する断片を挿入した。lac I遺伝子はTRCプロモ
ータのリプレッサをコードする。lac Iリプレッサの存
在下にTRCプロモータは、たとえばIPTGのような誘発剤
を添加した際のみ転写を開始させ、宿主細胞に添加され
るIPTGのレベルを制御することにより転写を開始または
停止させることができる。このプラスミドをpTPA102と
呼ぶ。
ハイブリッドストレプトアビジン−TPAのDNA配列を次
のように作成した。pSA324をNcoで処理してSA324を単離
した。次いで、pTPA102をNcoで線状化させ、かつ牛腸内
ホスファターゼで処理して再環化を防止した。この線状
化したpTPA102をSA324に結合させた。このプラスミドを
pSAT9724と呼び、かつそこに存在するハイブリッドDNA
配列をSAT9724と呼ぶ。
イー・コリHB101をpSAT9724で形質転換させかつこの
形質転換宿主を培養した。上記免疫学的分析により融合
ストレプトアビジン様−TPA蛋白の産生につき試験した
〔H.トービン等、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス、USA、第76巻、第4350−54頁（197
9）〕。形質転換したイー・コリはストレプトアビジン
とTPA免疫反応性物質との両者を含有するポリペプチド
を産生することが判明した。この蛋白は約80,000ダルト
ンの見掛け分子量を有した。これは、融合ストレプトア
ビジン−TPA蛋白の分子量に一致する。融合蛋白の産生
はIPTGにより誘発され、このことはハイブリッドDNA配
列がpKK233−２に存在するTRCプロモータの制御下にあ
ることを示している。
次いで、Ｓ・リビダンスにおいて複製しうるプラスミ
ドを作成した。pSAT9724をBamH Iで切断し、かつこれを
Bgl IIで線状化させたpIJ702に結合させて、共体プラス
ミドpSAT9786およびpSAT9790を生成させた。これらのプ
ラスミドを使用してＳ・リビダンスを形質転換させ、次
いでこれを培養してTPAに対し末端結合したストレプト
アビジン様ポリペプチドよりなる融合蛋白を産生させ、
かつ細胞媒体中へ分泌させた。
本発明のさらに他の実施例において、TPAに対し末端
融合したストレプトアビジン様ポリペプチドよりなる融
合蛋白をストレプトミセスにおいてのみ産生するハイブ
リッドDNA配列を持った組換DNA分子を作成した。
第６図を参照して、pSA324をNcoで処理し、かつスト
レプトアビジン様ポリペプチドをコードするDNA配列を
持ったSA324を再単離した。TPAをコードするDNA配列を
含んだpSAT7001をNcoで線状化させて、TPA遺伝子の前で
切断し、これをSA324に結合させた。次いで、プラスミ
ドpSAT7020を単離した。ヌクレオチド配列決定によりス
トレプトアビジン遺伝子はTPA遺伝子の前に適切な配向
で存在し、TPAに対し末端結合したストレプトアビジン
様ポリペプチドよりなる融合蛋白をコードするハイブリ
ッドDNA配列を生成することを確認した。
SA324の作成に際し除去されたSA304の最初の174ヌク
レオチドを再構成するため、pSA307をBamH IおよびBssH
2で処理して、SA304のヌクレオチド422にて切断した
（第２図参照）。次いで、小さい断片を単離した。次
に、pSAT7020をBamH IおよびBssH2で処理し、かつ大き
い断片を小さいpSA304断片に結合させた。得られたプラ
スミドをpSAT7021と呼び、そこに存在するハイブリッド
DNA配列をSAT7021と呼ぶ。
次いで、pSAT7021をBamH Iで線状化させ、かつ線状化
したプラスミドを牛腸内ホスファターゼで処理して再環
化を防止した。Bgl II−線状化pIJ702を線状化したpSAT
7021に結合して、ハイブリッドストレプトアビジン−TP
A DNA配列を有する共体プラスミド pSAT7026を生成さ
せた。このpSAT7026によりＳ・リビダンス菌体を形質転
換させた。細胞媒体から、上記の分析で測定してストレ
プトアビジンとTPAとの両者の免疫学的活性を有する融
合蛋白を単離した。
上記のようにpSAT7021を作成したが、同様なプラスミ
ドを次のようにして一層容易に作成することができた。
第７図を参照して、部分的Hinc II切断のみが生ずるよ
うな条件下でpSA307をHinc IIで切断させた。Ncoリンカ
を加え、かつNcoおよびBamH Iで切断した。次いで、ス
トレプトアビジン遺伝子の殆んどを含有する994ヌクレ
オチド断片を単離した。pTPA101をNcoおよびHind IIIで
切断し、かつTPAをコード化するDNA断片を単離した。こ
れら２種の断片を結合させて、TPA遺伝子に対し末端結
合しかつそれと同じ解読枠に存在するストレプトアビジ
ン遺伝子よりなるハイブリッドDNA配列を生成させた。
次いで、pUC13をBamH IおよびHind IIIで切断し、かつ
大きい断片をハイブリッドDNA配列に結合させた。これ
により、ストレプトアビジン発現制御配列の制御下でハ
イブリッドストレプトアビジン−TPA遺伝子を有するプ
ラスミドが生成した。次いで、このプラスミドを使用し
て、ストレプトミセス中で複製しうる共体プラスミドを
生成させた。
次いで、標準技術により細胞媒体から分泌蛋白を単離
し（たとえば、硫酸アンモニウム沈澱）、かつ単離物を
上記のように免疫ビオチン−アガロースのカラムクロマ
トグラフィーにかけて融合蛋白を汚染蛋白から分離し
た。融合蛋白を上記のように高pH−尿素緩衝液で免疫ビ
オチン−アガロースから溶出させ、かつ選択した蛋白，
ポリペプチド，ペプチドもしくはアミノ酸から公知技術
によってストレプトアビジン様ポリペプチドを切断し、
この公知方法はストレプトアビジンまたは選択した蛋白
もしくはポリペプチドのいずれにおいても切断しない。
たとえば所望蛋白がメチオニンを含まない場合には、臭
化シアノゲンを切断剤として使用することができる。蛋
白切断のための他の方法は上記に記載されており、これ
を本発明の方法に使用することができる。
次いで、ストレプトアビジン様ポリペプチドを選択し
た蛋白，ポリペプチド，ペプチドもしくはアミノ酸から
種々の手段によって、好ましくは免疫ビオチン−アガロ
ースのカラムクロマトグラフィーによって分離した。こ
の選択した蛋白，ポリペプチド，ペプチドもしくはアミ
ノ酸は免疫ビオチンに結合することなくカラムを通過
し、ストレプトアビジン様ポリペプチドを上記と同様に
カラムから溶出させた。ストレプトアビジン様ポリペプ
チドおよび選択した蛋白，ポリペプチド，ペプチドもし
くはアミノ酸が充分に異なる分子量を有する場合、これ
らはたとえば天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動また
はモレキュラシーブクロマトグラフィーのような当業界
で知られた幾つかの寸法決定技術により分離することも
できる。
本発明の組換DNA分子を有する微生物は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル・メ
リーランド）に寄託された培養物を例とし、次のように
同定されている。３種の培養物を1984年９月10日付けで
寄託した： イー・コリK12,菌株JM83（pSA304） イー・コリK12,菌株JM83（pSA307） Ｓ・リビダンス （pSA3721）。
これらの培養物には、それぞれ受託番号ATCC39845、3
9846および39844が与えられた。２種の培養物を1984年
９月26日付けで寄託した： イー・コリHB101（pSAT9724） Ｓ・リビダンス （pSAT7026）。
これら培養物はそれぞれ受託番号ATCC39880および398
79が付与されている。
以上、本発明につき多くの実施例を示したが、この基
本構成を改変して本発明の方法および組成物を用いる他
の具体例を与えることもできる。したがって、本発明の
範囲は、上記実施例に示した特定具体例に限定されるこ
となく、多くの改変をなしうることが了解されよう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (56)参考文献 Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ ｈｙｓ．，Ｖｏｌ．106（1964）Ｐ．１ −５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．77，Ｎｏ．８ （1980）Ｐ．4666−4668

Claims (28)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ストレプトアビジンまたはその一部をコー
    ドするヌクレオチド配列を有するDNAであって、前記ス
    トレプトアビジンまたはその一部は、ビオチンもしくは
    ビオチン誘導体または類縁体に結合することができ、前
    記DNAは、 （ａ）それぞれ受託番号ATCC39845およびATCC39846によ
    り同定される形質転換イー・コリ K12株中に保持さ
    れ、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTC
    GATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGG
    TCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAGCTCGGC
    TCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTA
    CGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTT
    ACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACG
    GTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAG
    CGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGC
    TGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGC
    CACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGC
    GAAGAAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAG
    TA; よりなる、プラスミドpSA304のDNA挿入物およびプラス
    ミドpSA307のDNA挿入物； （ｂ）ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCA
    GAAAATGTTGTTGAGAACCCTCCGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACA
    TGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTCTGCCGC
    CAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCAC
    GGCCGAGGTCACAAACCTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACA
    GCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGAGTATTTTTCGTG
    TCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCAC
    GGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGG
    CCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG
    CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGG
    AACCTACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCG
    GTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGT
    TGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCAC
    GTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGT
    GGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTG
    GTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGA
    CGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドpSA324のDNA挿入物； （ｃ）６×SSCおよび0.1％SDS、30℃、一晩の条件で前
    記（ａ），（ｂ）に記載のいずれかのDNAにハイブリダ
    イズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体または類
    縁体に結合することができるポリペプチドをコードする
    DNA;および、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ），（ｃ）に記載のいずれかの
    DNAと縮重関係にあり、かつ同じポリペプチドをコード
    するDNA、 から成る群から選択される、DNA。
  2. 【請求項２】前記DNAが、前記DNAによりコードされるポ
    リペプチドを前記DNAの発現に際して前記DNAによって形
    質転換された単細胞宿主の細胞膜を通過して分泌させる
    のに充分な、信号DNAの部分を含有することを特徴とす
    る、請求の範囲第１項に記載のDNA。
  3. 【請求項３】前記DNAが、前記DNAによりコードされるポ
    リペプチドが前記DNAによって形質転換された単細胞宿
    主の細胞膜を通過して分泌される時、前記DNAの発現に
    際して前記DNAによりコードされるポリペプチドを成熟
    させるのに充分な、信号DNAの部分を含有することを特
    徴とする、請求の範囲第２項に記載のDNA。
  4. 【請求項４】ストレプトアビジンまたはその一部をコー
    ドするヌクレオチド配列を有するDNAから成る組換DNA分
    子であって、前記ストレプトアビジンまたはその一部
    は、ビオチンもしくはビオチン誘導体または類縁体に結
    合することができ、前記DNAは、 （ａ）それぞれ受託番号ATCC39845およびATCC39846によ
    り同定される形質転換イー・コリ K12株中に保持さ
    れ、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTC
    GATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGG
    TCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAGCTCGGC
    TCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTA
    CGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTT
    ACGAGAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACG
    GTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAG
    CGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGC
    TGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGC
    CACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGC
    GAAGAAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAG
    TA; よりなる、プラスミドpSA304のDNA挿入物およびプラス
    ミドpSA307のDNA挿入物； （ｂ）ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCA
    GAAAATGTTGTTGAGAACCCTCCGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACA
    TGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTCTGCCGC
    CAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCAC
    GGCCGAGGTCACAAACCTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACA
    GCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGAGTATTTTTCGTG
    TCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCAC
    GGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGG
    CCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG
    CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGG
    AACCTACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCG
    GTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGT
    TGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCAC
    GTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGT
    GGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTG
    GTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGA
    CGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドpSA324のDNA挿入物； （ｃ）６×SSCおよび0.1％SDS、30℃、一晩の条件で前
    記（ａ），（ｂ）に記載のいずれかのDNAにハイブリダ
    イズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体または類
    縁体に結合することができるポリペプチドをコードする
    DNA;および、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ），（ｃ）に記載のいずれかの
    DNAと縮重関係にあり、かつ同じポリペプチドをコード
    するDNA、 から成る群から選択される、組換DNA分子。
  5. 【請求項５】前記DNAが、前記DNAによりコードされるポ
    リペプチドを前記DNAの発現に際して前記DNAによって形
    質転換された単細胞宿主の細胞膜を通過して分泌させる
    のに充分な、信号DNAの部分を含有することを特徴とす
    る、請求の範囲第４項に記載の組換DNA分子。
  6. 【請求項６】前記DNAが、前記DNAによりコードされるポ
    リペプチドが前記DNAによって形質転換された単細胞宿
    主の細胞膜を通過して分泌される時、前記DNAの発現に
    際して前記DNAによりコードされるポリペプチドを成熟
    させるのに充分な、信号DNAの部分を含有することを特
    徴とする、請求の範囲第５項に記載の組換DNA分子。
  7. 【請求項７】前記DNAが、組換DNA分子中で発現制御配列
    に作用的に結合されていることを特徴とする、請求の範
    囲第４項乃至６項のいずれかに記載の組換DNA分子。
  8. 【請求項８】前記発現制御配列が、イー・コリ Iac
    系、イー・コリ trp系、イー・コリ β−1ac系、TAC
    系、TRC系、バクテリオファージλの主オペレータおよ
    びプロモータ領域、フィラメント状一本鎖DNAファージ
    の制御領域、ストレプトミセス属菌または他のグラム陽
    性細菌の制御領域、およびその他の原核細胞もしくは真
    核細胞およびそれらのウィルスの遺伝子の発現を制御す
    る配列、またはそれらの組合せよりなる群から選択され
    ることを特徴とする、請求の範囲第７項に記載の組換DN
    A分子。
  9. 【請求項９】（ａ）それぞれ受託番号ATCC39845およびA
    TCC39846により同定される形質転換イー・コリ K12株
    中に保持される、プラスミドpSA304およびプラスミドpS
    A307;および （ｂ）受託番号ATCC39844により同定される形質転換ス
    トレプトミセス リビダンス菌株中に保持されるプラス
    ミドpSA3721、 よりなる群から選択される、請求の範囲第８項に記載の
    組換DNA分子。
  10. 【請求項１０】ストレプトアビジンまたはその一部をコ
    ードするヌクレオチド配列を有するDNAから成る少なく
    とも１つの組換DNA分子によって形質転換されたストレ
    プトミセス リビダンスおよびイー・コリの菌株よりな
    る群から選択される宿主であって、前記ストレプトアビ
    ジンまたはその一部は、ビオチンもしくはビオチン誘導
    体または類縁体に結合することができ、前記DNAは、 （ａ）それぞれ受託番号ATCC39845およびATCC39846によ
    り同定される形質転換イー・コリ K12株中に保持さ
    れ、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTC
    GATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGG
    TCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAGCTCGGC
    TCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTA
    CGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTT
    ACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACG
    GTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAG
    CGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGC
    TGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGC
    CACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGC
    GAAGAAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAG
    TA; よりなる、プラスミドpSA304のDNA挿入物およびプラス
    ミドpSA307のDNA挿入物； （ｂ）ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCA
    GAAAATGTTGTTGAGAACCCTCCGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACA
    TGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTCTGCCGC
    CAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCAC
    GGCCGAGGTCACAAACCTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACA
    GCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGAGTATTTTTCGTG
    TCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCAC
    GGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGG
    CCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG
    CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGG
    AACCTACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCG
    GTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGT
    TGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCAC
    GTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGT
    GGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTG
    GTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGA
    CGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドpSA324のDNA挿入物； （ｃ）６×SSCおよび0.1％SDS、30℃、一晩の条件で前
    記（ａ），（ｂ）に記載のいずれかのDNAにハイブリダ
    イズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体または類
    縁体に結合することができるポリペプチドをコードする
    DNA;および、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ），（ｃ）に記載のいずれかの
    DNAと縮重関係にあり、かつ同じポリペプチドをコード
    するDNA、 からなる群から選択され、かつ前記組換DNA分子中で発
    現制御配列に作用的に結合されていることを特徴とす
    る、形質転換された宿主。
  11. 【請求項１１】前記DNAが、前記DNAによりコードされる
    ポリペプチドを前記DNAの発現に際して前記DNAによって
    形質転換された単細胞宿主の細胞膜を通過して分泌させ
    るのに充分な、信号DNAの部分を含有することを特徴と
    する、請求の範囲第10項に記載の形質転換された宿主。
  12. 【請求項１２】前記DNAが、前記DNAによりコードされる
    ポリペプチドが前記DNAによって形質転換された単細胞
    宿主の細胞膜を通過して分泌される時、前記DNAの発現
    に際して前記DNAによりコードされるポリペプチドを成
    熟させるのに充分な、信号DNAの部分を含有することを
    特徴とする、請求の範囲第11項に記載の形質転換された
    宿主。
  13. 【請求項１３】ストレプトミセス リビダンス（pSA372
    1）（受託番号ATCC39844）、イー・コリ K12（pSA30
    4）（受託番号ATCC39845）およびイー・コリ K12（pSA
    307）（受託番号ATCC39846）よりなる群から選択され
    る、請求の範囲第10項に記載の形質転換された宿主。
  14. 【請求項１４】融合蛋白質をコードするヌクレオチド配
    列を有し、同じ読取り枠となるように末端どうしで結合
    された少なくとも２つのDNAから成るハイブリッドDNAで
    あって、その第一のDNAの少なくとも一部はストレプト
    アビジンまたはその一部をコードし、前記ストレプトア
    ビジンまたはその一部はビオチンもしくはビオチン誘導
    体または類縁体に結合することができ、前記第一のDNA
    の少なくとも一部は、 （ａ）それぞれ受託番号ATCC39845およびATCC39846によ
    り同定される形質転換イー・コリ K12株中に保持さ
    れ、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTC
    GATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGG
    TCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAGCTCGGC
    TCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTA
    CGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTT
    ACGAGAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACG
    GTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAG
    CGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGC
    TGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGC
    CACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGC
    GAAGAAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAG
    TA; よりなる、プラスミドpSA304のDNA挿入物およびプラス
    ミドpSA307のDNA挿入物； （ｂ）ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCA
    GAAAATGTTGTTGAGAACCCTCCGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACA
    TGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTCTGCCGC
    CAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCAC
    GGCCGAGGTCACAAACCTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACA
    GCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGAGTATTTTTCGTG
    TCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCAC
    GGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGG
    CCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG
    CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGG
    AACCTACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCG
    GTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGT
    TGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCAC
    GTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGT
    GGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTG
    GTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGA
    CGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドpSA324のDNA挿入物； （ｃ）６×SSCおよび0.1％SDS、30℃、一晩の条件で前
    記（ａ），（ｂ）に記載のいずれかのDNAにハイブリダ
    イズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体または類
    縁体に結合することができるポリペプチドをコードする
    DNA;および、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ），（ｃ）に記載のいずれかの
    DNAと縮重関係にあり、かつ同じポリペプチドをコード
    するDNA、 からなる群から選択され、その第二のDNAは、もう１つ
    の蛋白質、ペプチドまたはアミノ酸をコードすることを
    特徴とする、ハイブリッドDNA。
  15. 【請求項１５】前記ハイブリッドDNAが、前記融合蛋白
    質を分泌させるのに充分な信号DNAの部分を含有するこ
    とを特徴とする、請求の範囲第14項に記載のハイブリッ
    ドDNA。
  16. 【請求項１６】前記ハイブリッドDNAが、前記融合蛋白
    質を成熟させるのに充分な信号DNAの部分を含有するこ
    とを特徴とする、請求の範囲第15項に記載のハイブリッ
    ドDNA。
  17. 【請求項１７】前記第二のDNAが、組織プラスミノーゲ
    ン活性体をコードし、前記ハイブリッドDNAが、 （ａ）受託番号ATCC39880により同定される形質転換イ
    ー・コリ HB101株中に保持される、DNA断片SAT9724; （ｂ）６×SSCおよび0.1％SDS、30℃、一晩の条件で前
    記（ａ）のDNAにハイブリダイズし、かつビオチンもし
    くはビオチン誘導体または類縁体に結合することができ
    るポリペプチドをコードするDNA;および、 （ｃ）前記（ａ），（ｂ）に記載のいずれかのDNAと縮
    重関係にあり、かつ同じポリペプチドをコードするDN
    A、 よりなる群から選択されることを特徴とする、請求の範
    囲第14項乃至16項のいずれかに記載のハイブリッドDN
    A。
  18. 【請求項１８】前記第二のDNAが、ヒトおよび動物イン
    タフェロン、ヒトおよび動物成長ホルモン、FMDVの抗
    原、HBVの抗原、ヒトインシュリン、ヒト血液ファクタ
    およびエリスロポイエチンよりなる群から選択されるポ
    リペプチドをコードすることを特徴とする、請求の範囲
    第14項乃至16項のいずれかに記載のハイブリッドDNA。
  19. 【請求項１９】融合蛋白質をコードするヌクレオチド配
    列を有し、かつ同じ読取り枠となるように末端どうしで
    結合された少なくとも２つのDNAよりなるハイブリッドD
    NAから成る組換DNA分子であって、その第一のDNAの少な
    くとも一部はストレプトアビジンまたはその一部をコー
    ドし、前記ストレプトアビジンまたはその一部はビオチ
    ンもしくはビオチン誘導体または類縁体に結合すること
    ができ、前記第一のDNAの少なくとも一部は、 （ａ）それぞれ受託番号ATCC39845およびATCC39846によ
    り同定される形質転換イー・コリ K12株中に保持さ
    れ、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTC
    GATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGG
    TCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAGCTCGGC
    TCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTA
    CGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTT
    ACGAGAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACG
    GTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAG
    CGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGC
    TGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGC
    CACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGC
    GAAGAAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAG
    TA; よりなる、プラスミドpSA304のDNA挿入物およびプラス
    ミドpSA307のDNA挿入物； （ｂ）ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCA
    GAAAATGTTGTTGAGAACCCTCCGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACA
    TGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTCTGCCGC
    CAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCAC
    GGCCGAGGTCACAAACCTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACA
    GCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGAGTATTTTTCGTG
    TCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCAC
    GGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGG
    CCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG
    CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGG
    AACCTACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCG
    GTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGT
    TGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCAC
    GTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGT
    GGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTG
    GTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGA
    CGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドpSA324のDNA挿入物； （ｃ）６×SSCおよび0.1％SDS、30℃、一晩の条件で前
    記（ａ），（ｂ）に記載のいずれかのDNAにハイブリダ
    イズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体または類
    縁体に結合することができるポリペプチドをコードする
    DNA;および、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ），（ｃ）に記載のいずれかの
    DNAと縮重関係にあり、かつ同じポリペプチドをコード
    するDNA、 からなる群から選択され、その第二のDNAは、もう１つ
    の蛋白質、ペプチドもしくはアミノ酸をコードし、そし
    て前記ハイブリッドDNAは前記組換DNA分子中で発現制御
    配列に作用的に結合されていることを特徴とする、組換
    DNA分子。
  20. 【請求項２０】前記ハイブリッドDNAが、前記融合蛋白
    質を分泌させるのに充分な信号DNAの部分を含有するこ
    とを特徴とする、請求の範囲第19項に記載の組換DNA分
    子。
  21. 【請求項２１】前記ハイブリッドDNAが、前記融合蛋白
    質を成熟させるのに充分な信号DNAの部分を含有するこ
    とを特徴とする、請求の範囲第20項に記載の組換DNA分
    子。
  22. 【請求項２２】前記発現制御配列が、イー・コリ Iac
    系、イー・コリ trp系、イー・コリ β−lac系、TAC
    系、TRC系、バクテリオファージλの主オペレータおよ
    びプロモータ領域、ストレプトミセス属菌または他のグ
    ラム陽性細菌の制御領域、およびその他の原核細胞もし
    くは真核細胞およびそれらのウィルスの遺伝子の発現を
    制御する配列、またはそれらの組合せよりなる群から選
    択されることを特徴とする、請求の範囲第19項乃至21項
    のいずれかに記載の組換DNA分子。
  23. 【請求項２３】前記ハイブリッドDNAが、ヒトおよび動
    物インタフェロン、ヒトおよび動物成長ホルモン、FMDV
    の抗原、HBVの抗原、ヒトインシェリン、ヒト血液ファ
    クタ、組織プラスミノーゲン活性化物質、およびエリス
    ロポイエチンよりなる群から選択されるポリペプチドを
    コードする第二のDNAを包含することを特徴とする、請
    求の範囲第19項乃至21項のいずれかに記載の組換DNA分
    子。
  24. 【請求項２４】（ａ）受託番号ATCC39880により同定さ
    れる形質転換イー・コリ HB101株中に保持される、プ
    ラスミドpSAT9724;および （ｂ）受託番号ATCC39879により同定される形質転換ス
    トレプトミセス リビダンス菌株中に保持される、プラ
    スミドpSA7026、 よりなる群から選択される、請求の範囲第22項に記載の
    組換DNA分子。
  25. 【請求項２５】融合蛋白質をコードするヌクレオチド配
    列を有するハイブリッドDNAから成る少なくとも１つの
    組換DNA分子によって形質転換されたストレプトミセス
    リビダンスおよびイー・コリの菌株よりなる群から選
    択される宿主であって、前記ハイブリッドDNAは、同じ
    読取り枠となるように末端どうしで結合された少なくと
    も２つのDNAよりなるから成り、その第一のDNAの少なく
    とも一部はストレプトアビジンまたはその一部をコード
    し、前記ストレプトアビジンまたはその一部は、ビオチ
    ンもしくはビオチン誘導体または類縁体に結合すること
    ができ、前記DNAは、 （ａ）それぞれ受託番号ATCC39845およびATCC39846によ
    り同定される形質転換イー・コリ K12株中に保持さ
    れ、かつヌクレオチド配列： ATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCACGGTCTC
    GATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCCCAGG
    TCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAGCTCGGC
    TCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGGAACCTA
    CGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCGGTCGTT
    ACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGTTGGACG
    GTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCACGTGGAG
    CGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGTGGCTGC
    TGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTGGTCGGC
    CACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGACGCGGC
    GAAGAAGGCCGGCGTTCAACAACGGCAACCCGCTCGACGCCGTTCAGCAG
    TA; よりなる、プラスミドpSA304のDNA挿入物およびプラス
    ミドpSA307のDNA挿入物； （ｂ）ヌクレオチド配列： ACGAAGTAACCGACAGGACTCGGCCATTCTTTGGCCGAAATTCCTTTGCA
    GAAAATGTTGTTGAGAACCCTCCGATGGCTAGTACGATTTACACCGAACA
    TGTGCCCTTGGCAACCATCGACCCGGACCTCGACCATCCAGTTCTGCCGC
    CAAAGACACATGCCGCACTGCTGTTTGTTCACCGACACCGTCAGGTGCAC
    GGCCGAGGTCACAAACCTTGACGGGCGGGATACGGACGGCGCACGCCACA
    GCGCGCCCTCCGTCCCCCGCCGGGCAACAACTAGGGGAGTATTTTTCGTG
    TCTCACATGCGCAAGATCGTCGTTGCAGCCATCGCCGTTTCCCTGACCAC
    GGTCTCGATTACGGCCAGCGCTTCGGCAGACCCCTCCAAGGACTCGAAGG
    CCCAGGTCTCGGCCGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAACCAG
    CTCGGCTCGACCTTCATCGTGACCGCGGGCGCCGACGGCGCCCTGACCGG
    AACCTACGAGTCGGCCGTCGGCAACGCCGAGAGCCGCTACGTCCTGACCG
    GTCGTTACGACAGCGCCCCGGCCACCGACGGCAGCGGCACCGCCCTCGGT
    TGGACGGTGGCCTGGAAGAATAACTACCGCAACGCCCACTCCGCGACCAC
    GTGGAGCGGCCAGTACGTCGGCGGCGCCGAGGCGAGGATCAACACCCAGT
    GGCTGCTGACCTCCGGCACCACCGAGGCCAACGCCTGGAAGTCCACGCTG
    GTCGGCCACGACACCTTCACCAAGGTGAAGCCGTCCGCCGCCTCCATCGA
    CGCGGCGAAGAAGGCCGGCGT; よりなるプラスミドpSA324のDNA挿入物； （ｃ）６×SSCおよび0.1％SDS、30℃、一晩の条件で前
    記（ａ），（ｂ）に記載のいずれかのDNAにハイブリダ
    イズし、かつビオチンもしくはビオチン誘導体または類
    縁体に結合することができるポリペプチドをコードする
    DNA;および、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ），（ｃ）に記載のいずれかの
    DNAと縮重関係にあり、かつ同じポリペプチドをコード
    するDNA、 からなる群から選択され、その第二のDNAは、もう１つ
    の蛋白質、ペプチドまたはアミノ酸をコードし、そして
    前記ハイブリッドDNAは前記組換DNA分子中で発現制御配
    列に作用的に結合されていることを特徴とする、形質転
    換された宿主。
  26. 【請求項２６】前記ハイブリッドDNAが、前記融合蛋白
    質を分泌させるのに充分な信号DNAの部分を含有するこ
    とを特徴とする、請求の範囲第25項に記載の形質転換さ
    れた宿主。
  27. 【請求項２７】前記ハイブリッドDNAが、前記融合蛋白
    質を成熟させるのに充分な信号DNAの部分を含有するこ
    とを特徴とする、請求の範囲第26項に記載の形質転換さ
    れた宿主。
  28. 【請求項２８】イー・コリ HB101（pSAT9724）（受託
    番号ATCC39880）およびストレプトミセス リビダンス
    （pSAT7026）（受託番号ATCC39879）よりなる群から選
    択される、請求の範囲第25項乃至27項のいずれかに記載
    の形質転換された宿主。
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