JPH05184381A - 組換えｇｒｆの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は組換えヒトＧＲＦ−ＯＨの製造方法
を提供する。 【構成】 本発明の方法は、ヒトＧＲＦ−ＯＨ（４４）
または少なくともその最初の３７個のアミノ酸を有する
生物学的に活性なそのフラグメントをコードする構造遺
伝子を含有する複製可能な微生物発現ビヒクルで形質転
換した細菌を発育させ、組換え遺伝子の発現を誘導し、
誘導期間の終了時に微生物を溶解させ、微生物の細胞構
成成分よりＧＲＦ−ＯＨを分離することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】最近Ｓａｌｋ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＧｕ
ｉｌｌｅｍｉｎおよび共同研究者は、彼等が成長ホルモ
ン放出因子（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅ
ａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＧＲＦ）と称する、一群の
近縁物質の単離、合成および生物活性を報告した〔Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２１８，５８５−５８７（１１月５日、１
９８２）、また、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｔｉｍｅｓ，１０
月２９日、１９８２、１頁、カラム２をみよ〕。この因
子は、数１０年に及んで科学者が求めていたが、天然に
微量しか存在しないので、今日までそのような研究に成
功しなかった。

【０００２】ＧＲＦの単離がうまくいったのは、１部に
は、末端巨大症をともなうすい臓腫瘍により、ＧＲＦが
異所性に大量に生産されることの発見にもとづいてい
る。すい臓腫瘍に由来する３つの型のＧＲＦつまり、Ｇ
ＲＦ−４４、ＧＲＦ−４０、およびＧＲＦ−３７が観察
された。ＧＲＦ−４４は、ＧＲＦ−４０の完全なアミノ
酸配列を含有し、これのカルボキシル末端が４アミノ酸
だけ伸びている。ＧＲＦ−４０もまたＧＲＦ−３７の完
全なアミノ酸配列を含み、それのカルボキキシル末端が
３アミノ酸だけ伸びている。さらにＧＲＦ−４４はアミ
ド化カルボキシ末端を有するが、ＧＲＦ−４０およびＧ
ＲＦ−３７ではカルボキシ末端は遊離カルボキシ基であ
る。

【０００３】ＧＲＦ−４４のアミド化形は、恐らく親分
子で、インビトローでは最高の生物活性が示されてい
る。しかし、これら３種のペプチドは、インビボーでは
みかけ上等しい活性を示す。さらにＧＲＦからアミノ末
端チロシンを除くと生物活性は完全に消失する。それで
分子の活性中心がこのアミノ末端アミノ酸で開始してい
ることが分る。

【０００４】動物の生長は、一連の生物調節性の分子に
より調節されていると信じられる。そこで、視床下部は
ＧＲＦを生産し、ついで、これが脳下垂体に作用して生
長ホルモンを放出させる。この脳下垂体は、ソマトスタ
チンおよびインスリン生長因子（ＩＧＦ）により、負の
フイードバックコントロールされている。ＧＲＦは著し
い活性を有し、ＥＤ₅₀は約５０ｆｍｏｌｅ／ｍｌまたは
７５ｐｇ／ｍｌで、血液中にマイクログラム／ｍｌレベ
ルの成長ホルモンを放出することが分った。それで、Ｇ
ＲＦは、生長ホルモンによる治療を要する領域の大部分
で治療に用いうる。このような治療に使用の例として、
脳下垂体性小人症、生長ホルモン生産の異常による糖尿
病、傷の治癒の促進、火傷の治療、および加令の遅延な
どがある。生長ホルモン自体に比して活性がすぐれてい
るので、ＧＲＦは、農業の分野で用いて大いに有利であ
る。農業用の用途には、たとえば、肉をうる目的での鳥
または動物の発育を促進し、早い時期に市場に出し、ま
たは、飼育に際し、等しい時間でより大きな動物を生産
することが可能となる。さらに、ＧＲＦは、乳牛でミル
クの生成を促進し、にわとりで卵の生産を増加さすのに
役立つであろう。

【０００５】種々の形状のＧＲＦの分子の大きさは、従
来法による固体相または溶液相ペプチド合成法を可能と
する程度であるが、これらの治療上に有用な物質を大規
模に生産するのに、組み換えＤＮＡ技術の使用が有利で
ある。

【０００６】化学的方法で合成された遺伝子を用いて組
み換え哺乳類ペプチドを生産するための方法が、この方
面の技術ではすでに知られている。たとえば、化学的に
合成された遺伝子を用いてＥ．ｃｏｌｉ に組み換えヒ
トソマトスタチンを生産さすことが報告された（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ １９８，１９５６（１２月９日、１９７
７）。この遺伝子は、プラスミドｐＢＲ３２２上のＥ．
ｃｏｌｉベーター−ガラクトシダーゼに融合させた。こ
のキメラプラスミドＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉを形質転換す
ると、ソマトスタチンに対応するアミノ酸配列を含むポ
リペプチドの合成に導びく。シアノゲンブロマイドで処
理し、キメラ蛋白質より生物活性ソマトスタチンを特異
的に切り出した。この操作は、Ｕ．Ｋ．特許願２，００
７，６７５Ａにより詳細に記載されている。より最近に
は、実質的により大きな合成遺伝子が合成されそしてク
ローン化された。たとえば、ヒト白血球インターフェロ
ンに対する遺伝子がある（Ｎａｔｕｒｅ ２９２，７５
６−７６１〔１９８１〕）。

【０００７】本発明は、宿主微生物中にあって適切なプ
ロモーターオペレーター配列にコントロールされて既知
の方法で発現させうる、ＧＲＦの既知の形のそれぞれを
コードする構造遺伝子の製造方法を提供する。この方法
は、つぎの課程を包含する。 ａ）適当な順序で結合さすと、ＧＲＦのアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ鎖を与える、第１の１連のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドフラグメントを調製し、 ｂ）適当な順序で結合さすと、上記のコード鎖に相補的
なＤＮＡ鎖を与える、第２の１連のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドフラグメントを調製し、 ｃ）第１の１連と第２の１連のフラグメントの相互に相
補的な部分を水素結合させて、２本鎖ＤＮＡ構造物（複
数）とし；そして ｄ）それらの２本鎖ＤＮＡ構造物を連結させて望むＧＲ
Ｆ構造遺伝子とする。 生ずる遺伝子は、上記ＧＲＦ形のひとつをコードする。
本発明のさらに別の特徴として、ＧＲＦをコードする構
造遺伝子と、各末端に制限エンドヌクレアーゼ認識サイ
トを表わす接着末端とを含有する２本鎖ポリデオキシリ
ボヌクレオチドを提供する。本発明のさらに別の特徴と
して、該ＧＲＦの微生物による発現を行なわせうるＤＮ
Ａと操作により連結させた、ＧＲＦをコードするＤＮＡ
配列を提供する。

【０００８】本発明のさらに別の特徴として、第１のエ
ンドヌクレアーゼ認識サイトと、ＧＲＦをコードする構
造遺伝子と、第２のエンドヌクレアーゼ認識サイトとを
包含する、組み換え微生物クローニングビヒクルを提供
する。また、形質転換された微生物中でＧＲＦを発現し
うる、複製しうる微生物性発現ビヒクルを提供する。こ
のような発現ビヒクルは、組み換え技術において用いら
れて来た酵母または細菌のような微生物宿主を形質転換
して、適当な条件で発酵された時に実質的な量で望むＧ
ＲＦを与える微生物を提供する。本発明のさらに別の特
徴として、これらの発現ビヒクルで形質転換された微生
物も包含する。最後に本発明の別の特徴は、発酵ブロス
よりＧＲＦを分離しそして精製し、殺菌蛋白質を本質的
に含有しない、それで治療剤として適当なＧＲＦを与え
ることを包含する。

【０００９】本発明の有利な具体例を図面に示してあ
る。

【００１０】図１は、バクテリオファージラムダーＰ_L
プロモーターを含有する、有利な、クローニングしそし
て発現するベクター（ｐＲＣ２３）をうる操作の概略を
模式的に示す。このベクターを構築するには、“コンセ
ンサス”リボゾーム結合サイト含有合成オリゴヌクレオ
チド（Ｓｃｈｅｒｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ８，３８９５〔１９８０〕）をＰ_L
プロモーター含有２５０ ｂｐ Ｂｇｌ ＩＩ−Ｈａｅ
ＩＩＩフラグメントに連結させ、そして、連結生成物
をプラスミドｐＲＣ２中に挿入する。ｐＲＣ２３の構築
についてのさらに詳細は、たとえばヨーロッパ特許願Ｎ
ｏ．８９６７６をみよ。

【００１１】図２は、ＧＲＦ−ＯＨ（４４）のアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列の構造を模式的に示
す。示してあるように、発現ベクターに挿入するための
制限エンドヌクレアーゼ認識サイトを両端に有する二本
鎖遺伝子も示してある。

【００１２】図３は、ＧＲＦ−４４のアミノ酸配列をコ
ードする合成遺伝子のコード鎖を示す。追加して、制限
エンドヌクレアーゼ認識サイトも示してある。示してあ
る構造遺伝子は、両端が、適当なＰ_L リンカー配列では
さまれ、クローニングし発現するためのベクター中への
挿入を容易としてある。天然ＧＲＦ（４４）のペプチド
配列はアミド末端で終っているが、対応する組み換えＧ
ＲＦの末端は遊離カルボン酸で、それで組み換えＧＲＦ
（４４）をＧＲＦ−ＯＨ（４４）と以降称すことにす
る。

【００１３】図４は、Ｐ_L リンカー末端もあわせた、Ｇ
ＲＦ−ＯＨ（４４）の合成構造遺伝子の構築に用いられ
る１８個の１連のオリゴデオキシリボヌクレオチドフラ
グメントを示す。プライムを付した番号を有するフラグ
メントは、相補的遺伝子鎖である。

【００１４】図５は、ＧＲＦ−ＯＨ（４４）のための合
成構造遺伝子のアミノ末端セクションを構築するための
フローチャートである。フラグメントの番号は図４と同
じである。

【００１５】図６は、ＧＲＦ−ＯＨ（４４）のための合
成構造遺伝子のカルボキシ末端セクションを構築するた
めのフローチャートである。図４のフラグメント番号を
用いてある。

【００１６】図７は、親プラスミドｐＲＣ２３よりＧＲ
Ｆ−ＯＨ（４４）を発現しうる組み換えプラスミドを構
成するためのフローチャートを示す。示すように、ＧＲ
Ｆ合成遺伝子のＮ（アミノ末端）およびＣ（カルボキシ
末端）フラグメントをまず結合させ、ついでプラスミド
に挿入する。Ａｍｐ^R は、アンピシリン抵抗性の遺伝子
を示す。種々の制限エンドヌクレアーゼ特異的切断サイ
トは、たとえばＰｓｔＩ，Ｂｇｌ ＩＩ，ＥｃｏＲＩ，
Ｓａ１のように示してある。ｐＲＣ２３上にふつう見出
だされるテトラサイクリン抵抗性（Ｔｅｔ^R ）の遺伝子
は、Ｓａｌサイトでの制限カットで除かれていることに
留意されたい。それで、組み換えプラスミドはスクリー
ニングに際してはアンピシリン抵抗性のみを示す。

【００１７】図８は、オリゴヌクレオチド１，４，５，
９，１１，１５および２０の合成に用いられる固体担体
ホスファイト法に用いられるガラス担体法での付着（ｌ
ｏａｄｉｎｇ）を模式的に示す。この方法は、Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，３１８５（１９８１）の応用で
ある。

【００１８】図９は、固体担体ホスファイト法を用いる
オリゴヌクレオチド合成スキームの模式的なアウトライ
ンを示す。

【００１９】図１０は、固体担体ホスファイト法におい
て、固体担体よりオリゴヌクレオチドを除保護し遊離さ
すための模式的アウトラインを示す。

【００２０】図１１は、フラグメント２，３，６，７，
８，１０，１２，１３，１４，１６，および１７の調製
に用いる固体担体トリエステル法における官能基中間体
を一般化して示してある。方法はＤｅｍｂｅｋ等、Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，７０６（１９８１）
の応用である。

【００２１】図１２は、固体担体トリエステル法により
オリゴヌクレオチドを構築する際に用いる反応スキーム
の模式的アウトラインを示す。

【００２２】図１３は、オリゴヌクレオチドフラグメン
ト１４−１８（図６）に代えるための配列１４′，１
５′および１６′およびこれらのフラグメントを含有す
る遺伝子セグメントの部分的構成（連結点は矢印で示
す）を示す。この単位は遺伝子セグメント１−１３に連
結させて、ＧＲＦ−ＯＨ（３７）生成のための構造遺伝
子の形成に用いうる。

【００２３】図１４は、オリゴヌクレオチドフラグメン
ト１４−１８（図６）に代えるための配列１４″，１
５″および１６″および、これらのフラグメントを含有
する遺伝子セグメントの部分的構成（連結点は矢印で示
す）を示す。この単位は遺伝子セグメント１−１３に連
結させてＧＲＦ−ＯＨ（４０）生成のため構造遺伝子の
形成に用いうる。

【００２４】図１５は、ＮおよびＣフラグメントモノマ
ーを用いてＧＲＦ−ＯＨ（４４）を発現しうる組み換え
プラスミドを構築するためのフローチャートを示す。

【００２５】つぎに本発明を詳しく記載してゆく。 ＧＲＦをコードする遺伝子の調製 ＧＲＦのいずれか、つまり、ＧＲＦ−ＯＨ（４４）、Ｇ
ＲＦ−ＯＨ（４０）およびＧＲＦ−ＯＨ（３７）をコー
ドするＤＮＡを、遺伝コードによるコドンを選択し調製
しうる。調製および精製が容易のために、たとえば約１
４から約２０のヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌク
レオチドフラグメントを別々に調製しておき、それらを
合体して望む配列とする。つまり、便利な大きさのオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドフラグメントを、第１の系
列および第２の系列について調製する。第１の系列は、
適当な順序に結合さすと、ＧＲＦをコードするＤＮＡ鎖
（図３、フラグメント１，３，５，７，９，１１，１
３，１５および１７）を与える。第２の系列もまた、適
当な順序に配列すると、上記のコード鎖に相補的な鎖
（図３、フラグメント２，４，６，８，１０，１２，１
４，１６および１８）を与える。コード鎖および相補鎖
のフラグメントは、それらの自己集合性が、フラグメン
トブロックの接着末端の水素結合で促進させるように、
なるべくは重複させる。集合させたあと、２量体のＮお
よびＣフラグメントについては図５および図６に示すよ
うに、なるべくは２段階アプローチで、または、より有
利には、単量体ＮおよびＣフラグメントについて図１５
に示すようにして、従来法により連結させて構造遺伝子
を完成する。

【００２６】遺伝コードは縮重しているので、あるアミ
ノ酸配列についてのコドンの選択には実質的な自由度が
ある。図２をみよ。さしあたり、微生物ゲノムの発現に
おいて有利とされるコドンを優先利用した。

【００２７】それで、遺伝子が殺菌および酵母の発現ベ
クターに適当であるように、Ｅ．ｃｏｌｉに有利なコド
ンを酵母の発現コドンにも用いるのは理由あることであ
ろう。選んだ遺伝子配列はまた、遺伝子の組立ておよび
それの引続く分析を容易にする便宜な制限サイトを提供
する。ＧＲＦについて選択した配列は、コンピューター
−スキャンして、組立て中のオリゴヌクレオチドの適切
な連結を妨げるかも知れない、自己相補性およびくり返
し配列がないことを確認した。

【００２８】Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現さすために、Ｇ
ＲＦのコード配列の前方にＡＴＧ開始コドンをおき、後
方には１個のＴＡＡ翻訳停止コドンをおいた。発現ベク
ター中に挿入するのに便宜なように、遺伝子の始まりお
よび終わりにＥｃｏＲＩ末端をおいた。発現ベクター中
に挿入するための別のサイトとして、クローン化された
遺伝子の迅速Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定を容
易にするために、コドン配列に続いてＳａｌ Ｉサイト
を導入した。

【００２９】発現ベクターの調製 本発明を実施するのに用いる有利な発現ベクターは、ハ
イブリドリボゾーム結合サイトを含有する。ハイブリド
ＲＢＳが由来するリボゾーム結合サイトは、ＤＮＡによ
りコードされたＲＮＡ配列を含有する。宿主における翻
訳の開始にＲＢＳが必要である。ＲＢＳは、本質的に、
（１）翻訳を開始させるＡＴＧコドン（すべての既知の
Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子生成物は、アミノ酸メチオニンから
始まる。これはそのあとで切り取られても取られなくて
もよい）；（２）Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ
Ｄ）配列（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．およびＤａｌｇａｒｎｏ，
Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５４，３４〔１９７５〕）とし
て知られる、１６ＳリボゾームＲＮＡの３′末端におけ
る塩基に相補的の３から９個の塩基配列；および（３）
リンカー領域として知られるこれら２つの配列のあいだ
に存在する塩基配列より本質的に成立つ。

【００３０】本発明の有利な具体例となる発現ベクター
は、バクテリオファージラムダーＤＮＡより分離されそ
してｔｅｔ^R 遺伝子ａｍｐ^R 遺伝子とのあいだに挿入さ
れたＰ_L プロモーターを含有する、プラスミドｐＢＲ３
２２の誘導体である。Ｐ_L は、ラムダーｃＩリプレッサ
ーにより能率的にそして具合よくコントロールされうる
非常に強いプロモーターなので選択された。リプレッサ
ーをコードする遺伝子は変異ｃＩｔｓ２またはｃＩｔｓ
８５７を有し、これはリプレッサーに対し温度感受性と
する。３０℃でリプレッサーは正常に働らき、約３７−
４２℃では不活化される。そして、Ｐ_L プロモーターは
３０℃で抑制され（切れ）そして４２℃で抑制が取れる
（入る）。Ｐ_L プロモーターをコントロールするこの能
力で、培養物は、約３０から３６℃で遺伝子生成物を発
現しないで培養物を発育させ、温度を約３７から４２℃
まで上昇さすと望むＧＲＦ生成物を生産する方向へシフ
トする。

【００３１】本発明で使用する有利なベクターはまた、
ＳＤ配列の末稍の方（３′方向に向けて下流）にＥｃｏ
ＲＩ制限サイトを有し、種々のハイブリドＲＢＳを構築
する手段を与える。ＳＤ配列をＧＲＦ構造遺伝子のＡＴ
Ｇ開始コードに結合するためのＥｃｏＲＩサイトを用い
てハイブリドＲＢＳが構築されると、ＥｃｏＲＩを用い
る制限によりさらに変型しうる。つまり末端をＫｌｅｎ
ｏｗ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉで充填し、２つの生成
する平滑末端をＴ₄ ＤＮＡリガーゼによる連結により結
合する。

【００３２】本発明により提供されるＧＲＦに対する新
規構造遺伝子と組合わせた別の発現ベクトルを製造する
のに、他のコントロール要素を用いることも本発明の範
囲内にある。明らかに、必要とするプラスミド中に遺伝
子の挿入を可能とするためには、末端にある程度の変型
が必要とされうるであろう。

【００３３】本発明のもっとも広い特徴に従い細菌に用
いるための適当なシステムには、ｌａｃプロモーターオ
ペレーターシステム、アラビノースオペロン（ｐｈｉ
８０ｄａｒａ）またはコリシンＥｌ、ガラクトース、ア
ルカリホスファターゼまたはトリプトファンオペロンが
ある。同様にＡＤＨシステムを酵母において発現さすの
に用いうる。

【００３４】微生物 形質転換に適当な単細胞微生物が多数に知られる。特
に、細菌、かびおよびもがある。形質転換に有利な微生
物には、Ｅ．ｃｏｌｉ株のような細菌、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび類似のバチラッセーがあ
る。酵母も形質転換に有利な群の微生物がある。本発明
の有利な具体例において、形質転換を受ける微生物は、
英国特許願Ｎｏ．２０５５３８２Ａ記載のＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２菌株２９４である。この微生物の株はｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎ
ｏ．３１４４６および３１４４８として、１９７８年１
０月２８日に寄託され、入手しうる。他の適当なＥ．ｃ
ｏｌｉ株、たとえばＥ．ｃｏｌｉ ＭＡ２１０またはＲ
ＲＩを用いうる。

【００３５】本発明をさらにつぎの実施例で説明する。 例１ 図１に示すように、 "コンセンサス”ＲＢＳ〔Ｓｃｈｅ
ｒｒｅｒ等 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，８，３８９５（１９８０）〕を含有する合成オリ
ゴヌクレオチドを、ラムダーＰ_L プロモーターを含有す
る２５０ｂｐＢｇｌ ＩＩ−Ｈａｅ ＩＩＩフラグメン
トに連結させ、連結生成物をｐＲＣ２中に挿入すること
により、ｐＲＣ２３を構築した。この構築の詳細を下記
する。

【００３６】ラムダーＰ_L プロモーターを含有する２５
０塩基対（ｂｐ）ＤＮＡフラグメントを分離するため
に、４５０ｂｐ Ｂｇｌ ＩＩ−Ｈｐａ Ｉ ＤＮＡフ
ラグメント（ラムダＤＮＡ配列の１９８１年１１月バー
ジョンのｂｐ３５２６０から３５７１０まで）の１μｇ
をＨａｅ ＩＩＩで消化し生成物を５％ポリアクリルア
ミドゲル中調製用ゲル電気泳動で分離した。２５０ｂｐ
Ｂｇｌ ＩＩ−ＨａｅＩＩＩフラグメントの約２００
μｇを、図１に示した合成オリゴヌクレオチドのそれぞ
れの６０ｐｍｏｌｅｓに連結させた。これらのヌクレオ
チドは、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，８，３８９５（１９８０）にＳｃｈｅｒｅｒ等が記
載したようなコンピューター分析により生成された "コ
ンセンサス”リボゾーム−結合サイト配列の大部分を含
有する。連結された分子はＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化し（オリゴマー除去のため）そしてゲル電気泳動
で精製した。連結生成物は、ついで、やはりＢｇｌ Ｉ
ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＲＣ２に連結させた。
ｐＲＣ２は、ｐＢＲ３２２の誘導物で、ＥｃｏＲＩサイ
トに隣接して位置するＢｇｌ ＩＩサイトを有する（図
１をみよ）。Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩ
ｔｓ）の形質転換は標準方法を用いて行ない、アンピシ
リン（５０μｇ／ｍｌ）含有培地上で３０℃で転換物を
選んだ。５０個の転換物を得た。これらのうちの８個か
らＤＮＡを分離し、Ｈｉｎｃ ＩＩで消化して分析し
た。８個のうち６個は予期された制限パターンを示し、
これらのうちのひとつをＭａｘｉｍａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔヌクレオチド配列分析に処すると、予期された構成
（ｐＲＣ２３と称する）であることが確かめられた。

【００３７】例２ ３′−Ｏ−スクシニルヌクレオシド調製のための標準法 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチルおよびＮ−保護デオキシ
ヌクレオシド（２．５ｍｍｏｌｅ）を乾燥ピリジン（５
ｍｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．３
ｇ）に溶解する。コハク酸無水物（２．０ｍｍｏｌｅ，
０．２ｇ）を加え、溶液は室温で２４時間かくはんす
る。反応完了後、溶媒を減圧で蒸発させ、乾燥ゴム状物
にトルエン（１０ｍｌ）を加え蒸発さす。２度行なう。
残留物は塩化メチレン（３０ｍｌ）に溶解し、溶液を氷
冷くえん酸で抽出する。有機相は水１５ｍｌ宛２度洗
い、無水硫酸マグネシウム乾燥する。生成物より脱トリ
エチル化するのを避けるために、塩化メチレン溶液に約
０．３ｍｌのピリジンを添加する。塩化メチレン溶液は
約１０ｍｌに濃縮し、サクシニル化されたヌクレオシド
を、ヘキサン：エーテル（１：１、ｖ／ｖ、２５０ｍ
ｌ）中に加えて分離する。沈殿は濾取し、減圧乾燥す
る。

【００３８】例３ サクシニル化ヌクレオシドのｐ−ニトロフェニルエステ
ル製造の標準法 サクシニル化ヌクレオシド（１ｍｍｏｌｅ）をピリジン
（０．３ｍｌ）含有乾燥ジオキサン（３ｍｌ）に溶解す
る。上記の溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ）（５ｍｍｏｌｅ，９００ｍｇ）およびｐ−ニトロ
フェノール（０．２２ｇ，１ｍｍｏｌｅ）を加える。溶
液は２時間かくはんする。ジシクロヘキシル尿素の沈殿
を遠心除去する。上清をそのまま、つぎの実施例に示す
ように、樹脂へのカップリングに用いる。

【００３９】例４ 固体担体ホスファイト法のための、サクシニル化ヌクレ
オシドの樹脂への縮合 Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｏｎｇ Ｃｈａｉｎ Ａｌｋｙｌａｍ
ｉｎｅ／ＣＰＧ（孔直径調節ガラス）担体（孔直径５０
０Å、粒子の大きさ１２５−１７７μ）の２５ｍｌ（約
１０ｇ）の試料を２５ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）に溶解する。サクシニル化ヌクレオシドのｐ
−ニトロフェニルエステル含有溶液を上記懸濁液に添加
する（図８）。内容物を２４時間ふる。誘導体とした樹
脂を分け、乾燥ＤＭＦで３０ｍｌ宛３度、ジオキサンで
３０ｍｌ宛５回、メタノールで３０ｍｌ、３回、そして
最後に無水エーテルで３０ｍｌ宛３回洗う。未反応アミ
ノ官能基は、担体を、乾燥ピリジン（２５ｍｌ）、Ｎ，
Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２５０ｍｇ）および無水
酢酸（５ｍｌ）と反応させて（２時間、室温）保護す
る。この固体担体を濾過し、メタノール（５回、３０ｍ
ｌ）および無水エーテル（２回、３０ｍｌ）で順次洗
う。

【００４０】ヌクレオシドを付着させた樹脂の約１ｍｇ
量を、アセトニトリル（１ｍｌ）中で０．１Ｍのトルエ
ンスルホン酸で処理する。赤−オレンジ色状に、樹脂よ
り遊離されたトリチルカルボニウムイオンを集め、アセ
トニトリルで適当に希釈して４９８ｎｍでの光学密度を
測定する。４回測定を平均して担体へのヌクレオシドの
付着の程度を知る。いくつかの異なる樹脂への付着実験
で得られた付着の範囲は、２２−２５μｍｏｌｅヌクレ
オシド／ｇ固体担体である。

【００４１】例５ ヌクレオシドの５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−
Ｏ−ホスホロアミダイト誘導体の標準的製造 図９に示すように、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔ
ｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ
２２，１８５９（１９８１）の方法に従い、５′−Ｏ−
ジメトキシトリチルヌクレオシド（５ｍｍｏｌｅ）を乾
燥した酸不含のクロロホルムに溶解する。この溶液にジ
イソプロピルエチル−アミン（２．７４ｍｌ，１５．７
４ｍｍｏｌｅ）を加え、ついでジメチルアミノ−メチル
ホスホノモノクロリダイト（ＣＨ₃ ＯＰ（Ｃｌ）Ｎ（Ｃ
Ｈ₃ ）₂ ）を１から２分かけて加える。反応混合物は１
７５ｍｌの酢酸エチルを用いて分液ロ斗に移す。有機混
合物は飽和食塩水（７５ｍｌ，４回）で抽出する。酢酸
エチル相は硫酸ナトリウムで乾燥する。溶液は濃縮して
油とし、酢酸エチル（乾燥）に溶解して、５０ｍｌの溶
液とする。この溶液をあらかじめドライアイス−アセト
ンで冷却したｎ−ヘキサン（２５０ｍｌ）に滴加して生
成物を沈殿させ、濾取し、室温で高真空中で１７時間乾
燥する。４種のヌクレオシド誘導体のすべてについて約
８０％の収率となった。ジメチルアミノホスホロアミダ
イトの試料はマイナス１４℃でアルゴン中に保存した。

【００４２】例６ ホスファイト法によるフラグメントＮｏ．１ ５′−Ａ
ＡＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡ−３′の固体担体法
合成 段階１： ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−デオキシア
デノシンを付着させたガラス担体（４３５ｍｇ、１０μ
ｍｏｌｅジメトキシトリチル−デオキシアデノシン／ｇ
担体）を、ジクロルメタン（２ｍｌ）中０．２Ｍジクロ
ル酢酸を用い、懸濁液を１．５分振ることにより脱トリ
チル化した。担体はジクロルメタン（５ｍｌ宛、２回）
で洗った。数秒間のジクロルメタン反復処理で、確実に
脱トリチル化された。

【００４３】担体は、つぎの順序で洗った。 ａ） ジクロルメタン中１％トリエチルアミン（５ｍ
ｌ、２回） ｂ） 無水アセトニトリル（３ｍｌ、９回） 段階２： ジメトキシトリチル−デオキシグアノシンの
ジメチルアミノホスホロアミダイトの溶液（２ｍｌの無
水アセトニトリル中１００μｍｏｌｅ）を担体に加え、
ついでテトラゾール溶液（２ｍｌのアセトニトリル中２
５０μｍｏｌｅ）を加えた。懸濁液は５分間振り、減圧
濾過し、無水アセトニトリルで洗った（４×５ｍｌ）。 段階３： 約１０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジ
ンを含有するピリジン中無水酢酸（０．４ｍｌ）の溶液
２ｍｌを担体と２分間振り、未反応ヒドロキシル官能基
を保護し、保護された担体はアセトニトリルで洗った
（５ｍｌ、４回）。 段階４： ヨー素（０．２Ｍ）をテトラヒドロフラン／
水／２，６−ルチジン（２：１：１ ｖ／ｖ）を、保護
された担体と０．５分振り、乾燥アセトニトリルで洗い
（５ｍｌ、６回）そしてジクロルメタンで洗った（５ｍ
ｌ、２回）。

【００４４】段階４の生成物で段階１を反復し、５′−
Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンのホスホロアミダイト
誘導体で段階２を反復し、最後に段階３および４を反復
する。ついでサイクル（段階１から４まで）を順次にそ
れぞれのヌクレオシドを加えて反復してゆき、デオキシ
シチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、チミ
ジン（Ｔ）、デオキシアデノシン（ｄＡ）、Ｔ，ｄＧ，
Ｔ，ｄＡ，Ｔ，ｄＣ，Ｔ，Ｔ，ｄＡおよびｄＡの相当す
るホスホルアミド誘導体をそれぞれに加えてゆき、５′
−方向に鎖を伸ばして望むフラグメントとする。

【００４５】例７ 担体よりオリゴヌクレオチドの除保護および遊離 例６で得られたオリゴヌクレオチド−結合担体の試料
（１５０ｍｇ）を、１，４−ジオキサン（０．２５ｍ
ｌ）、０．２５ｍｌの無水トリエチルアミンおよび０．
１２５ｍｌのチオフェノールの混合物で室温で３０分処
理した。樹脂を濾取し、メタノールで洗い（２ｍｌ、４
回）、濃水酸化アンモニウムで５０℃で１７時間水解し
た。樹脂をペレット状とし、上清を減圧濃縮し、水（１
ｍｌ）に再溶解した。オリゴヌクレオチドの溶液は０．
４５ミクロンのフィルターを通して非常に細かい懸濁物
を除き、高速液クロで分画した。条件は、ｐＨ７．０、
５０℃、０．０５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート
中１０−３０％グラジェントでＣ１８逆相Ｍｉｃｒｏｂ
ｏｎｄａｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃ．）カラム
を用いた。よく分かれたジメトキシトリチル含有生成物
を集め、濃縮し、室温で０．５時間８０％酢酸水溶液で
処理した。酢酸を蒸発させたあと、試料を水に溶解しエ
ーテル抽出しトリチルアルコールを除いた。望むオリゴ
ヌクレオチドを含有する水層を分け、高速液クロで純度
をみた。いくつかの場合に、この段階での２回目の精製
が、均質生成物をうるのに必要であった。純度の最終的
評価には、変性条件でのアクリルアミドゲル電気泳動に
より５′−３２ｐ−ラベルオリゴヌクレオチドを分析し
た。フラグメントのヌクレオチド配列はＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）７４，５６０（１９７７）で確か
めた。

【００４６】上記のようなアプローチで、フラグメント
４，５，９，１１，１５および１８を合成する。

【００４７】例８ ヘプタデカヌクレオチドｄ（ＣＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣ
ＴＡＡＣＴ）、ＧＲＦ遺伝子のフラグメント３のホスホ
トリエステル固体相合成の標準法 ホスホトリエステル固体相によるＧＲＦ遺伝子のフラグ
メント３の調製は、アウトラインに示したようなスキー
ムで行なった。化合物の番号は、図１１および図１２に
対応している。反応段階はつぎのようである。 （ａ） 一般構造式１および２の、適当に保護されたモ
ノ−およびジヌクレオチドの合成。 （ｂ） アミノメチルポリスチレン樹脂５の調製。 （ｃ） アミノメチルポリスチレン樹脂５へのサクシネ
ート７の付着および無水酢酸−ピリジンを用いる未反応
アミノ基のマスキング。 （ｄ） 重合体に支持されたヌクレオシド８の５′−ジ
メトキシトリチル基のＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中０．２Ｍジクロル
酢酸（ＤＣＡ）による除去による、カップリング反応の
ための５′−ヒドロキシ官能基の生成（樹脂９）。 （ｅ） 二量体１０のトリエチルアンモニウム塩と樹脂
９との縮合による、重合体に支持されたトリヌクレオチ
ド１１の生成。９よりの未反応５′−ＯＨ基があれば、
それはピリジン中１０％無水酢酸でマスクする。 （ｆ） ０．２ＭＤＣＡを用いる１１の脱トリチル化に
よる、つぎのカップリングのための新しい５′−ＯＨ基
の生成。

【００４８】上記の適当に保護されたモノ−ジヌクレオ
チドは、いくらかの変型をした従来法で合成した。５′
−ジメトキシトリチル−チミジン６の３′−サクシネー
ト７を、Ｍｉｙｏｓｈｉ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８，５４９１（１９８０）の方法
で製造した。

【００４９】アミノメチルポリスチレン樹脂５ 市販クロルメチルポリスチレン（３０ｇ、９ｍｍｏｌ
ｅ、１％架橋、０．３２ｍｍｏｌｅ／ｇ Ｃｌ^- ）およ
びカリウムフタルイミド（２．７７ｇ，１５ｍｍｏｌ
ｅ）を２５０ｍｌ ＤＭＦ中に含有するスラリーを１２
０℃で２０時間加熱した。樹脂は熱時濾取し、熱ＤＭＦ
（２００ｍｌ）、水（４×５０ｍｌ）、ジオキサン（３
×８０ｍｌ）、エタノール（３×８０ｍｌ）およびエー
テル（３×５０ｍｌ）で順次に洗い、フタルイミド誘導
体４とし、エタノール（３５０ｍｌ）中に懸濁させ、ヒ
ドラジン（５ｍｌ）と５時間還流させた。反応混合物を
濾取し、熱エタノール（４×７０ｍｌ）、熱ＤＭＦ（２
×７０ｍｌ）、水（３×７０ｍｌ）、エタノール（３×
７０ｍｌ）およびエーテル（３×８０ｍｌ）で洗った。
樹脂は乾燥しアミノメチルポリスチレン５（２８ｇ）と
した。ピクリン酸滴定すると０．２１ｍｍｏｌｅ／ｇの
アミノ基濃度を示した。

【００５０】アミノメチル樹脂５への５′−ジメトキシ
−３′−Ｏ−サクシニル−チミジン７の付着 乾燥ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （３０ｍｌ）中アミノメチル樹脂５
（５ｇ）のスラリーにモノサクシネート７（０．９７
ｇ，１．５ｍｍｏｌｅ）、ＤＣＣ（０．９２７ｇ）およ
びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（５０ｍｇ）を
加え、反応混合物は室温で４時間かくはんした。濾取し
た樹脂８をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （４×１５ｍｌ）、ＭｅＯＨ
（４×１５ｍｌ）、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （４×１５ｍｌ）およ
びエーテル（３×１０ｍｌ）で洗った。減圧（０．１ｍ
ｍ Ｈｇ）で樹脂８を乾燥したあと、ＣＨＣｌ₃ 中１％
ＢＳＡ溶液中担体より遊離されるトリエタノールの吸収
スペクトル〔λ_max ４９８，ε９２１００〕を測定して
付着ヌクレオシド濃度を測定した。０．１８５ｍｍｏｌ
ｅ／ｇであった。

【００５１】樹脂８とあわせて樹脂５よりの未反応アミ
ノ基のマスキングは、樹脂全体の混合物を、１０％無水
酢酸−ピリジン混合物（３０ｍｌ、ジメチルアミノピリ
ジンＤＭＡＰ３０ｍｇ含有）と、室温で３０分反応させ
達成した。樹脂は、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ，ＭｅＯＨ，ＣＨ₂ Ｃ
ｌ₂ およびエーテルで洗った。付着ヌクレオシド濃度
は、ふたたび上記のように測定した。０．１７８ｍｍｏ
ｌｅ／ｇであった。

【００５２】ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中０．２Ｍジクロル酢酸を用
いる樹脂８の脱トリチル化 ４種のヌクレオシドのそれぞれのジメトキシトリチル基
のそれぞれを脱トリチル化する用いた条件を下記表１に
示す。典型的な実験はつぎのようである。小型カラム
（１．３×１０ｃｍ）中で、乾燥ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２ｍ
ｌ）中で約３０秒樹脂をまず膨潤させた。ついで１０ｍ
ｌの０．２ＭのＤＣＡと３０から４０秒ふり、つぎに非
常に早く濾過し、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （３−４ｍｌ）で非常に
早く洗った。この操作を反復し（表１をみよ）、洗液が
トリタノールによる色を示さない状態とした。洗液を集
め、吸収スペクトルを測定し、生成トリタノールの濃度
を測定した。これは、つまり、付着したモノ−またはジ
ヌクレオチドの濃度を表わすことになる。完全に脱トリ
チル化してから、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中０．５Ｍ Ｅｔ₃ Ｎ溶
液で樹脂９を洗い、ついでＣＨ₂ Ｃｌ₂ （３×１０ｍ
ｌ）およびピリジン（３×５ｍｌ）で洗った。

【表１】

【００５３】ＡＣ二量体１０と５′−ヒドロキシ−ポリ
スチレン担体９とのカップリングによる重合体に支持さ
れたＡＣＴ三量体１１の生成 ピリジンで洗った５′−ヒドロキシ樹脂９（５７ｍｇ，
０．０１ｍｍｏｌｅ）（上記をみよ）を高真空（０．０
５ｍｍ Ｈｇ）にしておいて、ヒートガンよりカラムに
熱風を２分吹きつけて乾燥した。乾燥空気またはアルゴ
ンを注意して吹き込み真空を元に戻した。樹脂には、Ａ
Ｃ二量体のトリエチルアンモニウム塩１０（０．０６ｍ
ｍｏｌｅ）のピリジン（０．７ｍｌ）溶液を加え、つい
でメシチレンスルホニル−３−ニトロ−トリアゾール
（ＭＳＮＴ）と０．１８ｍｍｏｌｅを加えた。カラムに
は適当な栓をして４０℃で５０分加熱した。反応混合物
を濾取し、ピリジン（各３ｍｌ）で３度洗った。樹脂
を、１０％Ａｃ₂ Ｏ／Ｐ_y （ＤＭＡＰ １０ｍｇ含有）
と室温で３分反応させて、未反応５′−ＯＨ基をマスク
した。樹脂は濾取し、ピリジン（２×２ｍｌ）、ＣＨ₂
Ｃｌ₂ （２×５ｍｌ）、ＭｅＯＨ（２×５ｍｌ）そして
ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２×５ｍｌ）で洗い、ポリスチレン重合
体に支持されたＡＣＴ三量体１１を得た。

【００５４】上記したように（Ｔａｂｌｅ １）０．２
ＭのＤＣＡを用いて樹脂１１の５′−ジメトキシトリチ
ル基を除いた。生ずる５′−ヒドロキシ樹脂１２は、選
択した二量体または単量体を用いて、各サイクルを反復
し、望むヘプタデカヌクレオチドに延長した。担体より
遊離されるトリタノールの吸収スペクトルより評価して
平均カップリング収率は９４％であった。

【００５５】除保護および精製 最後のカップリング反応のあと、樹脂（５０ｍｇ）は、
Ｒｅｅｓｅ等Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９，２７２７
（１９７８）の操作に従い、Ｎ¹ ，Ｎ¹ ，Ｎ³ ，Ｎ³ −
テトラメチルグアニジウムピリジン−２−カルボキサア
ルドキシメート（１ｍｌ）の８０％（ｖ／ｖ）ジオキサ
ン−Ｈ₂ Ｏ中０．５モル溶液で室温で１５時間処理し
た。溶媒を留去し、残留物を濃アンモニヤ（２８％，４
ｍｌ）で６０℃で８時間処理した。遠心したあとの上清
を約０．５ｍｌに濃縮し、０．０５Ｍ ＴＥＡＢ（１．
５ｍｌ）に溶解し、０．０５ＭのＴＥＡＢを流動相に用
いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムに通した。溶出
分画（各６ｍｌ）を集め、Ｂｅｃｋｍａｎ ＵＶ分光光
度計Ｍｏｄｅｌ ３４で吸光値を測定した。生成物を含
有する分画３０−３３を集めた。１００．８ＯＤ_s （Ｏ
Ｄ＝光学密度）であった。この生成物の５０ＯＤ_s をＣ
₁₈カラムを用いるＭｉｃｒｏｂｏｎｄａｐａｋの高速液
クロで精製した。１２分間に及んで７．５から３７．５
％アセトニトリル（ｐＨ７．８）の直線状グラジェント
とした。３１％ＣＨ₃ ＣＮで溶出されるピークＮｏ．２
がジメトキシトリチル生成物を含有するのでこれを集め
た。３０．２ＯＤ_s である。溶媒を蒸発させ、残留物を
８０％酢酸で脱トリチル化した（室温、２０分）。酢酸
を蒸発させ、残留物をトルエンとあわせて蒸発させ（３
×１ｍｌ）、残存酢酸を除いた。残留物は水（２ｍｌ）
に溶解し、エーテルで抽出し（３×３ｍｌ）、有機不純
物を除いた。水溶液を注意して濃縮し、４００μｌと
し、濾過し、Ｍｉｃｒｏｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ₁₈高速液
クロで精製した。７．５−３７．５％アセトニトリル直
線状グラジェントを用いた。２０．６％のアセトニトリ
ルで溶出されるピークを集め、７Ｍの尿素の存在でアク
リルアミドゲル上の電気泳動で精製した。もっとも動き
の遅いバンドを緩衝液溶出で分離し５′−ヒドロキシ基
をγ〔³²ｐ〕−ＡＴＰでラベルしたあと、ヘプタデカヌ
クレオチドフラグメント３の配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ配列分析でたしかめた。

【００５６】上記に示したのと同じアプローチで、フラ
グメント２，６，７，８，１０，１２，１３，１４，１
６および１７の合成をした。

【００５７】例９ 二量体の構築 図５および図６に示すように、オリゴヌクレオチドを２
段階で組立てる。オリゴヌクレオチドＮｏ．１−９を図
５のスキームに従って連結させ、フラグメントＮつま
り、ＧＲＦ遺伝子のアミノ末端側の半分とする。同様に
オリゴヌクレオチドＮｏ．１０−１８を連結させて、遺
伝子のカルボキ−末端半分のフラグメントＣとした（図
６）。ＮおよびＣの二量体はそれぞれにｐＢＲ３２２の
Ｐｓｔ Ｉサイトにクローニングした（Ｂｏｌｉｖａｒ
等、Ｇｅｎｅ ２，９５〔１９７７〕）。そのようにし
て、転換物の最初のスクリーニングにベーターラクタマ
ーゼ遺伝子のインセクション不活化を用いる。ｔｅｔ^R
およびａｍｐ^S フェノタイプを示す形質転換物よりのプ
ラスミドＤＮＡはさらに分析して正しいフラグメントの
クローニングされたことを確かめる。ＮおよびＣを有す
るプラスミドＤＮＡを増殖させてから、Ｐｓｔ Ｉで消
化してフラグメントを切断し、調製用ゲル電気泳動で精
製する。ついでＮおよびＣの二量体を相互に連結させＥ
ｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉで消化し、完全に組立てられ
たＧＲＦ遺伝子の単量体形とした（図７をみよ）。

【００５８】上記の連結の具体的操作をつぎに示す。５
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭの
ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭのＮａ₃ ＥＤＴＡ、５ｍＭのＤ
ＴＴ、０．１ｍＭのスペルミジン−ＨＣｌおよび５倍モ
ル量の過剰のＡＴＰ（γ−³²ｐ−ＡＴＰ）を含有する反
応混合物２０μｌ中で、３７℃で、３０分、オリゴヌク
レオチド（Ｎｏ．１−１８）のそれぞれの３００ｐｍｏ
ｌｅをＴ₄ ポリヌクレオチドキナーゼで、３７℃で３０
分リン酸化する。

【００５９】オリゴヌクレオチドのそれぞれの等モル量
を、１５℃で３−１２時間で１５℃で４単位のＴ₄ ＤＮ
Ａリガーゼを用い、標準条件で連結させた。連結反応は
２０％ポリアクリル中ゲル電気泳動でモニターする。必
要なら、連結生成物は調製用ゲル電気泳動で精製する。

【００６０】単量体の構築 図１５のように、オリゴヌクレオチドを２段階で組立て
た。図１５のスキームに従いオリゴヌクレオチドＮｏ．
１−９を連結させてフラグメントＲＦ−Ｎ，ＧＲＦ遺伝
子のアミノ末端半分とした。同様に、オリゴヌクレオチ
ドＮｏ．１０−１８は連結させて、フラグメントＲＦ−
Ｃ，遺伝子のカルボキシ末端半分とした（図１５）。

【００６１】上記連結の具体的操作をつぎに示す。５０
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、
０．１ｍＭのスペルミジン−ＨＣｌ、１２．５ＭのＡＴ
Ｐ、３７．５μＣ〔γ−³²ｐ〕ＡＴＰ（担体−不含）を
含有する１０μｌ反応混合物中で３７℃で３０分、Ｎｏ
ｓ．１−１８の合成フラグメントの各２０ｐｍｏｌｅを
５単位ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。反応
は６５℃に５分加熱し止めた。ついで５μｌの０．５Ｍ
ＥＤＴＡ、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡおよび
１９０μｌの５Ｍの酢酸アンモニウムを加えた。核酸は
エタノール沈殿し、２００μｌの０．３Ｍの酢酸ナトリ
ウムに再懸濁させ、エタノールで再沈殿させ、真空で乾
燥し、１０μｌの１ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、
０．１ｍＭのＥＤＴＡ（＝０．１×ＴＥ）中に再懸濁さ
せた。

【００６２】ＧＲＦ遺伝子の半分宛（ＲＦ−ＮおよびＲ
Ｆ−Ｃ）は、図１５に示すスキームにより別々に組立て
た。リン酸化オリゴヌクレオチドのそれぞれの８ｐｍｏ
ｌｅを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ
のＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭのＤＴＴおよび０．３ｍＭのＡ
ＴＰを含有反応混合物中で４単位のＴ₄ ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結させた（１５℃，３０分から６０分）。こ
の順次の連結のあと、追加して２００単位のリガーゼを
加え、４℃で２日インキュベーションを続けた。６５℃
で５分加熱して連結反応を止め、氷冷した。連結分子は
Ｐｓｔ ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、エタノール沈殿
させ、８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動で分け
た。ＧＲＦ遺伝子のＮ−末端部分を含有する８０ｂｐ生
成物とＣ−末端部分を含有する７０ｂｐ生成物をオート
ラジオグラフィーで同定し、ゲルより採取し、エタノー
ルで２度沈殿させ、乾燥し、１０μｌの０．１×ＴＥ中
に再懸濁させた。

【００６３】例１０ Ｅ．ｃｏｌｉ中にＧＲＦ遺伝子産生物を直接に発現さす
ために、ＧＲＦ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
Ｉフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し
た発現ベクターｐＲＣ２３に挿入する。このＥｃｏＲＩ
サイトにＧＲＦ配列を結合さすと、効率の良い翻訳の開
始のための非常に有利なリボゾーム−結合サイトを生成
する。強いＰ_L プロモーターより開始される転写は、低
コピー数プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓによりコード
される温度感受性ｃＩリプレッサーにより都合よくそし
て効率良くコントロールされる。

【００６４】例９よりの単量体構築を用い組み換えプラ
スミドを構築する具体的操作をつぎに示す。

【００６５】例９に記載のような反応混合物の１０μｌ
中で、２００単位のＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用い、１５℃
で１５時間かけて、精製ＲＦ−ＮおよびＲＦ−Ｃフラグ
メントの３μｌを連結させた。６５℃で５分加熱して反
応を止め、混合物は氷冷した。連結分子はＥｃｏＲＩお
よびＳａｌ Ｉで消化し、前記のように２００ｎｇのベ
クターｐＲＣ２３（ＥｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉでやは
り消化してある）に連結させた。この連結混合物を用い
て、標準操作によりＥ．ｃｏｌｉ株ＲＲＩ（ｐＲＫ２４
８ｃＩｔｓ）を転換した。転換物はアンピシリン含有培
地（５０μｇ／ｍｌ）培地上で選択した。約２００個の
転換物を得た。転換物のうちの１０個よりプラスミドＤ
ＮＡを分け、Ａｖａ Ｉ（ＧＲＦ遺伝子中で１度および
ｐＲＣ２３中で１度切断する）で消化し分析した。１０
のうち７個は予期された制限パターンを示した。これら
のうちのひとつをＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔヌクレオ
チド配列の分析に処すると図２に示すような全ＧＲＦ遺
伝子の予期された配列のを確実にした。この転換物は、
ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ，ｐＲＣ２３／ＧＲＦ−
１）と称する。

【００６６】クローン化されたＧＲＦ遺伝子の発現を試
験するために２つのアプローチを用いた。１．ｐＲＣ２
３／ＧＲＦ−１によりコードされた細胞不含翻訳生成物
の分析、２．ｐＲＣ２３／ＧＲＦ−１含有誘導細胞を溶
解させてＧＲＦ生物活性を分析する。これらの実験の詳
細を下記する。

【００６７】１． 精製ｐＲＣ２３／ＧＲＦ−１ＤＮＡ
（対照ＤＮＡと平行して）を³⁵Ｓ−メチオニン含有、イ
ンビトロ−転写−翻訳システム〔Ｋｕｎｇ等，Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９５，３９６
（１９７９）〕に加え、生ずる生成物はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分析し、ついでフルオログ
ラフィーにかけた。結果は、対照ｐＲＣ２３ＤＮＡによ
り生産されない５−６キロダルトンのポリペプチド（Ｇ
ＲＦ−４４標品は約５．３Ｋｄ）の合成を指令すること
を示す。平行した反応（未ラベルメチオニン使用）を、
下記するような生物活性について試験した。 ２． 株ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ，ｐＲＣ２３／
ＧＲＦ）をＭ９グルコース培地中で発育させて約２×１
０⁸ 細胞／ｍｌとし、ついで４２℃で２時間誘導した。
１ｍｌ試料を取り細胞は遠心して集めた。細胞は５０μ
ｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１０％スクロ
ース中に再懸濁させ、ドライアイス／エタノール浴中で
急速に凍らせた。細胞を融解し０−４℃に保存した。溶
解用の混合物の５μｌ（５ｍＭのＮａＣｌ、０．５Ｍの
ＥＤＴＡ、１Ｍスペスミジン−ＨＣｌ、および５ｍｇ／
ｍｌライソゾーム、１：１：１：２ ｖ／ｖ）を添加
し、３０分してから、氷上で混合物を３７℃で２分イン
キュベートした。凍結融解をさらに反復して溶解を完了
させた。細胞残渣を遠心して除き、溶解物をドライアイ
ス／エタノール浴中ですみやかに凍らせた。上記した細
胞不含翻訳生成物とあわせて溶解物は、Ｂｒａｓｅａｕ
等、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １，２５５（１９
８１）記載のようにＧＲＦ生物活性を分析した。表２の
結果は、発現ベクターｐＲＣ２３中にクローンされたＧ
ＲＦのための合成遺伝子が生物活性のあるＧＲＦポリペ
プチドの合成を指令していることを示す。

【表２】 表 ２ ＧＲＦ活性対照 試料番号 プラスミド に対する百分率 １ 対照（培地のみ） １００ ２ 対照 + 25fmoleのGRF-NH₂(44) ３２０ ３ pRC 23 + 25fmoleのGRF-NH₂(44) １０９^* ４ pRC 23／IFN-γ ６５ ５ pRC 23／GRF-１ ９６ ６ pRC 23／GRF-９ ９７ ７ pRC 23 ４７ ８ pRC ／IFN-γ ５９ ９ pRC ／GRF-９ １０４

【００６８】試料Ｎｏ．３−６は、上記したように、示
したプラスミドを含有する誘導された細胞の溶解物であ
った。試料Ｎｏ．７−９は、示した精製プラスミドの細
胞不含転写／翻訳よりの反応混合物であった。＊Ｎｏ．
３の比較は、細菌溶解物がＧＲＦ活性を阻害することを
示す。それで、ＧＲＦ試料についてのデータ（Ｎｏ．
５、６および９）は、上記バックグラウンド（Ｎｏ．
１）でないが、それらは、マイナスの対照より有意に高
い（Ｎｏ．４、７および８）、そして、細菌溶解物に加
えた精製ＧＲＦ−ＮＨ₂ （４４）を用いた試料と同様で
ある。

【００６９】ｐＲＣ２３／ＩＦＮ−γは、ヒト免疫イン
ターフェロン遺伝子含有発現ベクトルを表わす。この構
築物は、親ベクターｐＲＣ２３と同じくネガチブコント
ロールとして、上記の分析に含めた。溶解物よりのＧＲ
Ｆポリペプチドの精製は、この方面でよく知られている
クロマトグラフ法で達成しうる。このような操作には、
支持されたＧＲＦポリクロナルまたはモノクロナル抗体
を用いるアフィニティクロマトグラフィー、カラムクロ
マトグラフィー、または、なるべくは、１または１より
多くの逆相高速液クロがあり、そして、相互に組合わせ
ても用いうる。このようにして、組み換え法によるＧＲ
Ｆ−ＯＨ（４４）を治療に用いるに適当な均質な形で得
られる。

【００７０】例１１ ＧＲＦ−ＯＨ（３７）遺伝子 ＧＲＦ−ＯＨ（４４）遺伝子の構築のために用いるＤＮ
ＡフラグメントＮｏ．１から１３をＧＲＦ−ＯＨ（３
７）遺伝子にも用いる。さらにフラグメント１４′，１
５′および１６′（図１３）を、上記のように、ホスフ
ァイト固体担体法により合成する。そして、ＧＲＦ−Ｏ
Ｈ（４４）の部分的構造遺伝子に連結させて、ＧＲＦ−
ＯＨ（３７）の構造遺伝子とする（図１３）。

【００７１】例１２ ＧＲＦ−ＯＨ（４０） ＧＲＦ−ＯＨ（４４）の構築のために用いるＤＮＡフラ
グメントＮｏ．１から１３を、ＧＲＦ−ＯＨ（４０）遺
伝子にも用いる。前記のようにトリエステル固体担体法
により合成されるフラグメントＮｏ．１４″，１５″お
よび１６″（図１４）を、ＧＲＦ−ＯＨ（４４）の部分
構造遺伝子（フラグメントＮｏ．１−１３により構成）
に連結させ、図１４に示すＧＲＦ−ＯＨ（４０）の構造
遺伝子とする。

【００７２】ＧＲＦ−ＯＨ（３７）およびＧＲＦ−ＯＨ
（４０）のクローニングおよび発現は、ＧＲＦ−ＯＨ
（４４）遺伝子について上記のように実施しうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】バクテリオファージラムダーＰ_L プロモーター
を含有する、有利な、クローニングしそして発現するベ
クター（ｐＲＣ２３）をうる操作の概略を模式的に示
す。

【図２】ＧＲＦ−ＯＨ（４４）のアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列の構造を模式的に示す。

【図３】ＧＲＦ−４４のアミノ酸配列をコードする、合
成遺伝子のコード鎖を示す。

【図４】Ｐ_L リンカー末端もあわせた、ＧＲＦ−ＯＨ
（４４）の合成遺伝子の構築に用いられる１８個の１連
のオリゴデオキシリボヌクレオチドフラグメントを示
す。

【図５】ＧＲＦ−ＯＨ（４４）のための合成構造遺伝子
のアミノ末端セクションを構築するためのフローチャー
トである。

【図６】ＧＲＦ−ＯＨ（４４）のための合成構造遺伝子
のカルボキシ末端セクションを構築するためのフローチ
ャートである。

【図７】親プラスミドｐＲＣ２３よりＧＲＦ−ＯＨ（４
４）を発現しうる組み換えプラスミドを構成するための
フローチャートを示す。

【図８】オリゴヌクレオチド１，４，５，９，１１，１
５および２０の合成に用いられる固体担体ホスファイト
法に用いられるガラス担体法での付着を模式的に示す。

【図９】固体担体ホスファイト法を用いるオリゴヌクレ
オチド合成スキームの模式的アウトラインを示す。

【図１０】固体担体ホスファイト法において、固体担体
よりオリゴヌクレオチドを除保護し遊離さすための模式
的アウトラインを示す。

【図１１】フラグメント２，３，６，７，８，１０，１
２，１３，１４，１６および１７の調製に用いる固体担
体トリエステル法における官能基中間体を一般化して示
してある。

【図１２】固体担体トリエステル法によりオリゴヌクレ
オチドを構築する際に用いる反応スキームの模式的アウ
トラインを示す。

【図１３】オリゴヌクレオチドフラグメント１４−１８
（図６）に代えるための配列１４′，１５′および１
６′およびこれらのフラグメントを含有する遺伝子セグ
メントの部分的構成（連結点は矢印で示す）を示す。

【図１４】オリゴヌクレオチドフラグメント１４−１８
（図６）に代えるための配列１４″，１５″および１
６″およびこれらのフラグメントを含有する遺伝子セグ
メントの部分的構成（連結点は矢印で示す）を示す。

【図１５】ＮおよびＣフラグメントモノマーを用いてＧ
ＲＦ−ＯＨ（４４）を発現しうる組み換えプラスミドを
構築するためのフローチャートを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ケネス ジエイ．コリアー アメリカ合衆国ニユージヤージー州ロツカ ウエイ，ウエノア アベニユー 12 (72)発明者 ロバート エム．クロウル アメリカ合衆国ニユージヤージー州リトル フオールズ，パターソン アベニユー 246 (72)発明者 モヒンダー エス．プーニアン アメリカ合衆国ニユージヤージー州ウエス ト カルドウエル，ノウル プレース 16

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＧＲＦ−ＯＨの微生物発現を行なわ
   せうるＤＮＡ配列を作動するように連結させた、 アミノ酸配列 Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔ
   ｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａ
   ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ
   −Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
   Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ を有するヒトＧＲＦ−ＯＨ（４４）または少なくともそ
   の最初の３７個のアミノ酸を有する生物学的に活性なそ
   のフラグメントをコードする構造遺伝子およびそれぞれ
   制限エンドヌクレアーゼ認識部位を表わす付着末端を含
   有する二本鎖ポリデオキシリボヌクレオチドを含有する
   複製可能な微生物発現ビヒクルで形質転換した細菌であ
   る形質転換微生物を発育させ、組み換え遺伝子の発現を
   誘導し、誘導期間の終了時に微生物を溶解させ、微生物
   の細胞構成成分よりＧＲＦ−ＯＨを分離することからな
   る組み換えヒトＧＲＦ−ＯＨの製造方法。
2. 【請求項２】 微生物を約３０から３６℃までの範囲の
   温度で発育させ、温度を約４２℃に上昇させて遺伝子の
   発現を誘導する、特許請求の範囲（１）項記載の方法。