RU1438241C - Рекомбинантная плазмидная днк ртnf 33, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии. Цель изобретения - повышение уровня биосинтеза полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека (ФНО) и упрощение технологии его получения. Создана новая рекомбинатная плазмида pTNF 33, кодирующая конститутивный синтез фактора некроза опухоли человека, и штамм E. coli SG 20050/pTNF 33, обеспечивающий высокий уровень экспрессии ФНО. Рекомбинантная плазмида pTNF 33 кодирует фактор некроза опухоли человека и состоит из Pst I/Pvu II-фрагмента плазмиды pGA 23 (1,83 т.п.о.), содержащего тандем сильных промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7, ген дигидрофолатредуктазы и часть гена β- лактамазы, Pst I/Xho I-фрагмента ДНК плазмиды pTNF 3, содержащей ген хлорамфениколацетилтрансферазы, терминатор транскрипции фага λ, часть гена β- лактамазы и большую часть гена ФНО, кодирующего аминокислотную последовательность 4 - 157 (2,99 т.п.о.), и фрагмента синтетической ДНК (50 п.о.), содержащей рибосомосвязывающий сайт и первые три кодона фактора некроза опухоли человека. Штамм E. coli SG 20050, содержащий плазмиду pTNF 33, обеспечивает уровень экспрессии полипептида с активностью ФНО человека до 1,2 • 10⁶ ед на 1 мл клеточной суспензии.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированные in vitro рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие полусинтетические гены фактора некроза опухоли человека, промоторы ранней области фага 17 и синтетические участки инициации трансляции, обусловли- вающие биосинтез полипептидов с биологической активностью фактора некроза опухоли, и штаммы E.coli продуценты этих полипептидов.

Цель изобретения увеличение уровня биосинтеза фактора некроза опухоли и упрощение процесса его получения.

Создана новая рекомбинантная плазмидная ДНК рTNF 33, кодирующая конститутивный синтез фактора некроза опухоли человека, и штамм E.coli SG 20050/pTNF 33, обеспечивающий уровень экспрессии ФНО 1,2х10⁶ ед на 1 мл клеточной суспензии.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pTNF 33 содержит полусинтетический ген фактора некроза опухоли. Источником С-концевой части гена является MSp I/Hind III фрагмент четвертого экзона природного гена ФНО. Недостающая последовательность ДНК, кодирующая последовательность 29N-концевых аминокислот была получена с помощью химического синтеза.

Клонотеку генов человека приготавливают из смеси высокомолекулярных ДНК, выделенных из 6 индивидуальных плацент. Для этого ДНК гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой EcoRI и полученный гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, выделяя зоны, содержащие ДНК размером 0,5-2, 2-4, 4-6 и так далее до 12 т.п.о. Материал отдельных фракций был подвергнут блот-гибридизации по Саузерну с олигонуклеотидами
5'СТАСТСССАGGТССТСТ 3'
3' GТССАGGAGAAСТТСССG 5', последовательность которых соответствует аминокислотной последовательности 59-66 зрелого белка фактора некроза опухоли. С целью увеличения удельной радиоактивности пробы олигонуклеотидные зонды сначала 5"-фосфорируют с помощью γ [³²P]АТР, а затем достраивают выступающие концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы E.coli с помощью высокомеченых α [³²P]-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов. Использование полученных таким образом зондов (удельной радиоактивности до 10⁸имп/мин^.пмоль) позволило идентифицировать фракцию ДНК, содержащую ген фактора некроза опухоли (2-4 т.п.о. ).

ДНК этой фракции лигируют с предварительно дефосфорилированными большими фрагментами ("плечами") фагового вектора λ gt-wesB, которые выделяют после гидролиза фаговый ДНК эндонуклеазой рестрикции EcoRI. Для повышения эффективности лигирования реакцию проводят в два этапа, на первом из которых лигируют геномные фрагменты в высокой концентрации без фаговой ДНК, которую прибавляют при повторном лигировании. Перед скриннингом клонотеки препараты упакованных рекомбинантных фагов концентрируют центрифугированием в ступенчатом градиенте хлористого цезия, после чего проводят трансфекцию и высевают на чашки.

Анализ полученной таким образом клонотеки проводят путем гидридизации амплифицированных на дуплицированных фильтрах НА-85 с вышеупомянутыми олигонуклеотидными зондами. Из 40 000 клонов первичный скрининг выявил два положительных сигнала. Зоны, содержащие рекомбинантные фаги, вырезают с исходных чашек и после амплификации подвергают вторичному скринингу. ДНК одного из рекомбинатных фагов λ 422, дававшего положительную гибридизацию с олигонуклеотидными зондами, выделяют и анализируют с помощью блот-гибридизации по Саузерну, используя гидролизаты рекомбинатной фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoRI, EcoRI/Bgl I, EcoRI/Xho I, Alu I, Mbo I, Tag I, Hinf I, Hind II и Pvu II. Далее ДНК рекомбинантного фага λ 422 гидролизуют рестриктазой ЕcoRI, выделяют фрагмент величиной 2,8 т.п.о. содержащий ген ФНО, и реклонируют его по сайту EcoRI в плазмиду pUC 12. В результате получают рекомбинантную плазмиду р4221, в которой ген фактора некроза опухоли человека находится в такой ориентации, что его транскрипция совпадает с транскрипцией α-пептида β-галактозидазы E.coli.

Для получения 5'-концевого фрагмента гена фактора некроза опухоли было синтезировано фосфорамидитным методом четырнадцать олигодезоксирибонуклеотидов величиной от 11 до 28 нуклеотидных звеньев. Лигазные сшивки олигонуклеотидов проводят в два этапа, на первом этапе проводят две четырехкомпонентные и одну шестикомпонентную сшивки, причем все олигонуклеотиды перед сшивкой фосфорилируют при помощи rАТР и Т4 полинуклеотидкиназы за исключением олигонуклеотидов (I) и (XIY) из сегментов А и С соответственно. На втором этапе сшивают лигазой сегменты А+В+С, которые предварительно очищают электрофорезом в 28%-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Получившуюся в результате 96-звенную двухцепочную ДНК очищают электрофорезом в 15%-ном ПААГ.

Для конструирования рекомбинантной ДНК рТNF 2 векторную плазмиду рUR 291 расщепляют совместно эндонуклеазами Sal I и Hind III и выделяют больший фрагмент, содержащий промотор, оператор и измененный ген β-галактозидазы E.coli. Одновременно расщепляют эндонуклеазами Hind III и Msp I ДНК плазмиды р4221, содержащей EcoRI-фрагмент величиной 2,8 т.п.о. геномного клона фага λ 422, и выделяют фрагмент ДНК величиной 506 п.о. содержащий 3'-концевую последовательность гена зрелого фактора некроза опухоли. Полученный фрагмент соединяют с помощью ДНК-лигазы с синтетическим 5'-концевым фрагментом гена фактора некроза опухоли и с Sal I/Hind III векторным фрагментом плазмиды рUR 291. После трансформации клеток E.coli JM 101 отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, дающие на среде с Х-Gal и IPTG ярко-синюю окраску, и проводят среди них скрининг на присутствие синтетического и природного фрагментов гена фактора некроза опухоли гибридизацией колоний in situ с ³²P-мечеными олигонуклеотидными зондами TCGACCATGTCCTCGAGCC и CTACTCCCGGTCCTCT. Колонии, гибридизирующиеся с обоими зондами, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как рTNF 2.

Новым в предлагаемом способе является использование при конструировании плазмиды синтетического 5'-концевого фрагмента гена фактора некроза опухоли при мультикомпонентной сборке плазмиды, использование для этой цели рестрикционной эндонуклеазы Msp I, а также гибридизации с двумя олигонуклеотидными зондами, соответствующими клонируемым фрагментам. Это позволяет однозначно отобрать клоны E.coli, содержащие целевую плазмиду, что значительно упрощает процедуру конструирования плазмидной ДНК.

Плазмида рTNF 2 при трансформации клеток E.coli обеспечивает в них индуцируемый синтез фактора некроза опухоли человека в составе гибридного белка с неизменной β-галактозидазой E.coli. Использование в качестве реципиента плазмиды рTNF 2 штамма E.coli CSH 36 (F^-) обеспечивает конститутивный синтез химерного белка β-галактозидаза фактор некроза опухоли.

На основе плазмиды рTNF 2 создают другую рекомбинантную плазмиду рTNF 22, кодирующую полный зрелый белок-фактор некроза опухоли. Для этого плазмиду рTNF 2 расщепляют смесью рестриктаз Bam I и Xho I, выделяют большой фрагмент и лигируют его с синтетическими олигонуклеотидами.

5' GATCCGAATTCTAAGGAAATTTAAATGGTTCGTTCC 3'
3' GCTTAAGATTCCTTTAAATTTACCAAGCAAGGAGCT 5'
При трансформации E.coli (штамм НВ 101) целевые клоны отбирают по положительной гибридизации с клонированными синтетическими олигонуклеотидами и структуру вставки подтверждают анализом ее нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта. Полученная таким образом плазмида рTNF 22 обеспечивает в клетках E.coli (JM 101) при индукции изопропилтио-β-D-галактопиранозидом (IPTG) экспрессию зрелого белка фактора некроза опухоли в количестве 60000 ед на 1 мл культуры клеток с плотностью 2,0.

С целью создания конструкции для конститутивного синтеза фактора некроза опухоли полусинтетический ген реклонируют в плазмиду рGA 23, содержащую тандем сильных промоторов А2 и А3 бактериофага 17. В свою очередь плазмиду рGA 23 получают путем клонирования по сайтам Pst I/Bam I малого фрагмента плазмиды pLZ 56 в плазмидный вектор рDSI. Для этого из плазмиды рTNF 22 выделяют после гидролиза рестриктазой EcoRI фрагмент величиной 714 п.о. и клонируют его в промоторсодержащей плазмиде рGA 23 после ее частичного гидролиза с помощью EcoRI. В результате получают плазмиду рTNF 30, в которой экспрессия искусственного гена фактора некроза опухоли контролируется тендемом сильных промоторов ранней области бактериофага 17. После трансформации плазмидой рTNF 30 клетки E.coli НВ 101 способны конститутивно синтезировать 120 000 ед активности фактора некроза опухоли на 1 мл клеточной культуры.

Для усовершенствования системы экспрессии фактора некроза опухоли конструируют новую рекомбинантную плазмиду рTNF 33, которая содержит усовершенствованный рибосомосвязывающий сайт и перекодированный искусственный ген фактора некроза опухоли. Для этого сначала получают промежуточную плазмиду рTNF 3 путем клонирования Hind III/Xho I фрагмента из плазмиды рTNF 2 в те же сайты плазмиды рDSIt^о 2⁺. Затем эту плазмиду гидролизуют рестриктазами Xho I и Pst I, после чего выделяют больший фрагмент. Оба фрагмента затем соединяют с помощью ДНК-лигазы с синтетической ДНК, содержащей последовательность сайта инициации трансляции E.coli и первые четыре кодона зрелого белка фактора некроза опухоли человека. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E. coli НВ 101 и отбирают клоны, устойчивые к ампициллину и хлорамфениколу, и среди них проводят скрининг на присутствие полусинтетического гена фактора некроза опухоли путем гибридизации in situ ³²Р-меченой верхней цепью клонированного дуплекса. Колонии, дающие положительную гибридизацию с пробой, отбирают и выделенную из них плазмиду охарактеризовывают рестриктным анализом.

В результате получают новую рекомбинантную плазмиду рTNF 33, содержащую полусинтетический ген, кодирующий полипептид 1-157 зрелого фактора некроза опухоли человека.

Для получения штамма-продуцента полипептида с биологической активностью ФНО^- плазмидой рTNF 33 трансформируют компетентные клетки E.coli SG 20050.

Полученный штамм Escherichia coli SG 20050/рTNF 33 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки очень мелкие, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биологические признаки. Клетки растут в пределах от 4 до 40^оС при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к хлорамфениколу (до 500 мкг/мл) и к ампициллину (до 250 мк/мл), обусловленную наличием плазмиды.

Штамм E.Coli SG 20050/pTNF 33 обусловливает конститутивный синтез полипептида с биологической активностью фактора некроза опухоли человека на уровне 1,2х10⁶ ед/мл клеточной суспензии.

П р и м е р 1. Химико-ферментативный синтез N-концевой части структурного гена фактора некроза опухоли человека.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-(метокси, диизопропиламино)фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в стеклянной колонке с пористым фильтром путем ручного прибавления реагентов и растворителей, используя для этой цели 0,6-0,8 мкмоль 3'-концевого нуклеозида, ковалентно связанного с 25-30 мг пористого стекла (размер пор 500

). Каждый цикл наращивания состоит из следующих операций: промывка полимерного носителя ацетонитрилом (3 мл, 2 мин); детритилирование с помощью 0,5 М раствора дихлоpуксусной кислоты (2 мл, 2 мин); промывка ацетонитрилом (1,5 мл, 1 мин); промывка абсолютным ацетонитрилом (3 мл, 3 мин); конденсация прибавление смеси 0,05 М раствора соответствующего амидита и 0,3 М раствора дважды возогнанного тетразола порциями по 0,1 мл (0,2 мл, 2 мин); промывка ацетонитрилом (1,5 мл, 1 мин), окисление прибавление 0,1 М раствора иода в смеси тетрагидрофуран-лутидин-вода 8:1:1 (1 мл, 1 мин); промывка абсолютным ацетонитрилом (3 мл, 2 мин); "кэппирование" обработка 1М раствором уксусного ангидрида и 0,1 М раствором 4-диметиламинопиридина в ацетонитриле.

По завершении синтеза носитель высушивают, обрабатывают 0,5 мл смеси тиофенол-триэтиламин-диоксан, 1:2:2 (1,5 ч при 20^оС), промывают метанолом и снова высушивают. Отделение олигонуклеотида от полимерного носителя и удаление ацильных защитных групп проводят действием концентрированного аммиака (24 ч, 55^оС). Затем носитель отфильтровывают, промывают 0,05 М триэтиламмонийбикарбонатом (ТЕАВ) и этанолом. Фильтрат и промывки упаривают и хроматографируют на колонке Zorbax ODS (0,46х25 см) в градиенте концентрации ацетонитрила (5-30% ) в 0,05 М ТЕАВ. Фракцию, содержащую диметокситритильное производное олигонуклеотида, упаривают и обрабатывают 80%-ной уксусной кислотой (30 мин, 20^оС). Растворитель упаривают и олигонуклеотид выделяют хроматографией на той же колонке в градиенте концентрации ацетонитрила (5-15%). Выход очищенного олигонуклеотида 20-80 нмоль.

Лигазная сшивка сегмента А. Смесь 480 пмоль олигонуклеотида (1), 400 пмоль каждого из фосфорилированных олигонуклеотидов (II), (III), (IV), (V) и 480 пмоль фосфорилированного олигонуклеотида (VI) нагревают 10 мин при 65^оС в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НCl, рН 7,5, 10мМ MgCl₂, затем медленно охлаждают до 15^оС, прибавляют rАТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 10 мМ и 300 ед Т4 ДНК лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15^оС, затем депротеинизируют двукратной экстракцией фенолом, ДНК высаживают этанолом и сшивки выделяют при помощи электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Продукт сшивки элюируют из геля электроизоляцией на DEAE-бумагу DE 81, которую промывают несколько раз TE-буфером (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют с помощью 1,5 М раствора NaCl в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с сефадексом G-50. Выход сегмента А 280 пмоль.

Аналогичным образом получают сегменты В и С. Выходы 350 и 320 пмоль соответственно. Далее сшивают по 50 пмоль каждого из сегментов А, В и С в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rАТР, 10 мМ дитиотреита и 250 ед Т4 ДНК-лигазы, 4 ч при 15^оС. Продукт сшивки выделяют электрофорезом в 15% -ном ПААГ, как описано выше. Выход 35 пмоль. Структуру промежуточных и конечных продуктов лигазных реакций доказывают анализом нуклеотидной последовательности.

П р и м е р 2. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК рTNF 2.

Клетки бактерий E.coli SM 101, содержащие плазмидную ДНК рUR 291, выращивают при 37^оС в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем клетки осаждают центрифугированием (215 мин, 6000 об/мин), выделяют плазмидную ДНК модифицированным методом так, что к супернатанту, полученному после подкисления ацетатом натрия, прибавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37^оС, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1), после чего ДНК высаживают этанолом. Осадок растворяют в 1М NaCl, прибавляют полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 до концентрации 1,5% выдерживают 1 ч при 0^оС, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин; осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной ДНК 500-800 мкг. Концентрацию плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 БОЕ/мг.

Аналогичным образом выделяют ДНК плазмиды р 4221, содержащей ген фактора некроза опухоли в виде EcoRI-фрагмента (2,8 т. п.о.), клонированного в плазмиде рUC 12 из рекомбинантного фага λ 422. Полученные препараты плазмидных ДНК используют для конструирования плазмиды рTNF 2, которое проводят следующим образом. 5 мкг плазмиды рUR 291 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Sal I (20 ед) и Hind III (10 ед) в буфере R, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 5 мМ меркаптоэтанола, 1 ч при 37^оС. После инкубации реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1). Анализ полноты гидролиза и выделение векторного Sal I/Hind III фрагмента (5,3 т.п.о.) проводят электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Одновременно 10 мкг плазмиды р 4221 обрабатывают 1,5 ч при 37^оС в буфере R рестриктазами Msp I (20 ед) и Hind III (20 ед), после чего электрофорезом в 5% -ном ПААГ выделяют С-концевой фрагмент гена фактора некроза опухоли (Msp I/Hind III, 506 п.о.). Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соединяют с Sal I/Hind III векторным фрагментом (1,5 мкг) и синтетическим фрагментом 0,1 мкг (см. пример 1) с помощью 14 ДНК-лигазы (50 ед) в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС.

Десятую часть релаксационной смеси используют для трансформации клеток E. coli JM 101. Для этого клетки высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% -ную глюкозу и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37^оС до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 500 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCl₂, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl₂ и выдерживают при 0^оС в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl₂ и через 3 ч используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М CaCl₂, прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают 30 мин при 0^оС, затем 2 мин при 42^оС и снова 10 мин при 0^оС. Прибавляют 1,4 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37^оС и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл), Х-Gal (40 мкг/мл) и 1 мМ IPTG. Полученные ярко-синие колонии переносят на параллельные нитроцеллюлозные фильтры и анализируют на содержание синтетического и природного фрагмента гена ФН гибридизацией колоний in situ с ³²Р-мечеными олигонуклеотидами TCGACCATGTCCTCGAGCC и CTACTCCCAGGTCCTCT. Колонии, дающие положительную гибридизацию с обоими зондами, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как рTNF 2. Структуру плазмидной ДНК рTNF 2 подтверждают рестриктным анализом и определением нуклеотидной последовательности части плазмидной ДНК между сайтами эндонуклеаз Bam I и Hind III.

П р и м е р 3. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК рTNF 22.

10 мкг ДНК плазмиды рTNF 2 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции Bam I (20 ед) и Xho I (15 ед) в течение 1,5 ч при 37^оС. После инкубации смесь экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1). Векторный фрагмент величиной 5,92 т.п.о. выделяют с помощью электрофореза в 1%-ной агарозе. 0,5 мкг этого фрагмента лигируют с 15 пмоль синтетического дуплекса
GATCCTGAATTCTAAGGAAATTTAAATGGTTCGTTCC
GACTTAAGATTCCTTTAAATTTACCAAGCAAGGAGCT
в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС в присутствии 50 ед Т4 ДНК-лигазы. Пятую часть лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli НВ 101, как это описано в примере 2. Отбор клонов проводят гибридизацией колоний с ³²Р- мечеными вставочными олигонуклеотидами. Колонии, дающие положительную гибридизацию, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как рTNF 22. Структуру плазмидной ДНК рTNF 22 подтверждают рестриктным анализом и определением нуклеотидной последова- тельности между сайтами EcoRI.

П р и м е р 4. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК рTNF 30.

Конструирование плазмиды рTNF 30 проводят следующим образом. Сначала плазмидную ДНК рDS1t^о 2⁺ (5мкг) инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Рst I (10 ед) и Bam I (10 ед) в 50 мкл буфера R 1,5 ч при 37^оС. После обработки, как в примере 2, векторный фрагмент выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Далее 10 мкг плазмиды pLZ 56 гидролизуют с помощью эндонуклеаз рестрикции Рst I (20 ед) и Bam I (20 ед) и фрагмент около 1 т.п.о. содержащий промоторы А1 и А3 ранней области фага 17 выделяют электрофорезом в 5% -ном ПААГ. Затем 0,5 мкг векторного фрагмента соединяют с 0,2 мкг промоторсодержащего фрагмента с помощью Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС. Аликвотой реакционной смеси трансформируют компетентные клетки E. coli С 600 и трансформированные клетки высевают на агар, содержащий среду LB и 150 мкг/мл хлорамфеникола. Из хлорамфениколустойчивых колоний выделяют плазмидную ДНК, обозначенную рGA 23. Структуру плазмидной ДНК рGA 23 подтверждают рестриктивным анализом.

15 мкг полиамидной ДНК рGA 23 инкубируют с 10 ед эндонуклеазы EcoRI в 120 мкл буфера R в течение 1 ч при 25^оС. Реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенол-хлороформом (1:1) и линеаризованную плазмиду выделяют при помощи электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Аналогичным образом с помощью гидролиза эндонуклеазой EcoRI и электрофореза в 1%-ном агарозном геле из плазмиды рTNF 22 выделяют фрагмент величиной 714 п.о. 0,1 мкг которого инкубируют с 1 мкг линеаризованной плазмиды рGA 23 в 25 мкл буфера L в присутствии 50 ед Т4 ДНК-лигазы. Одной десятой частью лигазной сшивки трансформируют компетентные клетки Е. coli НВ 101, как описано в примере 2. Смесь высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (100 мкг/мл).

Полученные колонии сканируют на содержание полусинтетического гена гибридизацией с ³²Р-меченым сегментом В (см. пример 1). Колонии, дающие положительную гибридизацию, отбирают, из них выделяют плазмидную ДНК и проводят рестриктный анализ с помощью эндонуклеаз Hind III и Hae III на ориентацию фрагмента, содержащего искусственный ген фактора некроза опухоли. Плазмидную ДНК, образующую при гидролизе рестриктазой Hind III фрагмент величиной 784 п. о. и содержащую в Hae III гидролизате промоторсодержащий фрагмент величиной 360 п.о. обозначают как pTNF 30. Строение рекомбинантной ДНК pTNF 30 подтверждают рестриктным анализом с помощью рестрикционных эндонуклеаз Hae III, Msp I и Hind III, а также определением цитопатической активности лизатов клеток, содержащих плазмиду pNTF 30 (см. пример 7).

П р и м е р 5. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTNF 33.

1 мкг ДНК плазмиды pDS1t^о 2⁺ инкубируют в 25 мкл буфера R с эндонуклеазами Hind III (2 ед) и Xho I (1 ед) в течение 1 ч при 37^оС. После обработки электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, как в предыдущем примере, выделяют векторный фрагмент величиной около 3,2 т.п.о. Аналогичным образом гидролизуют 10 мкг плазмиды pTNF 2 в 150 мкл буфера R с помощью 20 ед рестриктазы Hind III и 15 ед рестриктазы Xho I и фрагмент величиной 640 п.о. содержащий большую часть гена фактора некроза опухоли, выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Затем сшивают с помощью 15 ед 14 ДНК-лигазы 1 мкм большого фрагмента и 0,2 мкг малого фрагмента в 15 мкл буфера L в течение 3 ч при 13^оС. Пятую часть лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli 0 600.

Трансформированные клетки высевают на LB-агар, содержащий ампициллина (100 мкг/мл), и среди устойчивых к ампициллину клонов проводят скрининг на содержание гена фактора некроза опухоли гибридизацией с ³²Р-меченым олигонуклеотидом СTACTCCCAGGTCCTCT. Из клонов, дающих положительную гибридизацию с этим олигонуклеотидным зондом, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как рТNF 3, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз Hae III и Msp I. Далее 10 мкг плазмидной ДНК pTNF I и 15 ед эндонуклеазы Xho I. Больший фрагмент выделяют при помощи электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Тем же способом выделяют малый фрагмент, полученный при гидролизе 10 мкг ДНК плазмиды pGA 23, 15 ед рестриктазы Pst I и 20 ед рестриктазы Pvu II. Затем оба фрагмента (0,5 и 0,2 мкг) смешивают с синтетическим ДНК-дуплексом (1 мкг), содержащим последовательность сайта инициации трансляции E. coli и первые четыре кодона зрелого фактора некроза опухоли, и инкубируют 8 ч при 18^оС в 30 мкл буфера L с 25 ед Т4 ДНК-лигазы. Пятую часть реакционной смеси используют для трансформации компонентных клеток E.coli HB 101, высевая трансформаторы на LB-агар, содержащий ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (100 мкг/мл). Отбор клонов проводят гибридизацией с ³²Р-меченой верхней цепью клонированного дуплекса. Из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как рTNF 33. Строение рекомбинатной плазмиды pTNF 33 подтверждают рестриктный анализ и определение нуклеотидной последовательности в районе вставки.

П р и м е р 6. Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека.

Плазмидой pNTF 33 трансформируют клетки E.coli SG 20050 по методу, описанному в примере 2, и получают штамм-продуцент полипептида 1-157 фактора некроза опухоли человека E.coli SG 20050/pTNF 33.

П р и м е р 7. Определение продуктивности штамма E.coli SG 20050/pTNF 33 продуцента полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека.

Клетки E.coli SG 20050/pTNF 33 выращивают при 37^оС в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости вращения 190 об/мин. Отбирают пробу 2 мл, клетки центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин, затем суспендируют в 25 мМ трис-буфере (рН 8,8), содержащем 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид и 5 мг/мл лизоцима, и инкубируют 30 мин при 25^оС. Для вскрытия клеток смесь замораживают в течение 10 мин при -70^оС, а затем оттаивают во льду. Эту операцию повторяют трижды, после чего определяют содержание фактора некроза опухоли в растворе измерением его биологической активности.

Биологическую активность ФНО определяют на культуре трансформированных мышиных фибробластов линии L-929. С этой целью монослойную культуру клеток выращивают в СО₂-термостате в 96-луночных пластинах для культур клеток в среде DMEM, содержащей 10%-ную сыворотку теленка. Для определения биологической активности культуральную среду заменяют на свежую среду DMEM, содержащую 1%-ную сыворотку теленка, 1 мг/мл актиномицина D и клеточный лизат в серийных двукратных разбавлениях, примерно соответствующих концентрации фактора некроза опухоли от 10 до 10^-5 мкг/мл. Платы снова инкубируют 16-20 ч в СО₂-термостате, затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количество окрашенных (нежизнеспо- собных) и неокрашенных (живых) клеток. За единицу активности принимают количество фактора некроза опухоли, вызывающее гибель 50% трансформированных клеток.

Изобретение позволяет повысить уровень биосинтеза полипептида с активностью фактора некроза опухоли человека до 1,2х10⁶ ед на 1 мл клеточной суспензии и упростить процесс его получения за счет исключения нетехнологичной стадии индукции.

Claims (2)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTNF 33, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, с мол.м. 2,93 MD и размером 4,85 т. п.о., содержащая
Pst I / Pvu II-фрагмент ДНК плазмиды pGA 23 с тандемом промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7, с геном дигидрофолатредуктазы и частью гена β -лактамазы размером 1,83 т.п.о.,
Pst I /Xho I-фрагмент ДНК плазмиды pTNF 3 с геном хлорамфениколацетилтрансферазы, терминатором транскрипции фага l, частью гена β -лактамазы и частью гена фактора некроза опухоли человека, кодирующего аминокислотную последовательность 4 (Ser)-157 (Leu) размером 2,99 т.п.о.,
Blunt/Xho I-фрагмент синтетической ДНК с сайтом инициации трансляции и первыми тремя кодонами фактора некроза опухоли размером 50 п.о.,
генетические маркеры: гены b -лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазы, детерминирующих устойчивость трансформированных плазмидой pTNF 33 клеток Escherichia coli к пенициллиновым антибиотикам и к хлорамфениколу, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Bam I: Xho I 865 нуклеотидов вправо, Pst I 1010 нуклеотидов влево.

2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3969 - продуцент со свойствами фактора некроза опухоли человека.