RU1438240C - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РТNF 22, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЙ ГЕН ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА - ПРОМЕЖУТОЧНАЯ ПЛАЗМИДА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pTNF 31, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии. Цель изобретения - повышение уровня биосинтеза полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека (ФНО) и упрощение технологии его получения. Это достигается с помощью новой рекомбинантной плазмиды pTNF 31, кодирующей конститутивный синтез фактора некроза опухоли человека, штамма E. coli S G 28858/pTNF 31, обеспечивающего высокий уровень экспрессии ФНО. Рекомбинантная плазмида pTNF 22 содержит полусинтетический ген ФНО и является источником C-концевого Xho I/Hind III - фрагмента этого гена, использованного для конструирования плазмиды pTNF 31 и других рекомбинантных плазмид, кодирующих гены мутантных белков ФНО. Рекомбинантная плазмида pTNF 22 состоит из Bam T/Hind III - фрагмента ДНК плазмидного вектора pUR 291 (5,35 т.п.о.), содержащего промотор, оператор и измененный ген β--галактозидазы E. coli, Bam I/Msp I - фрагмента синтетической ДНК (128 п.о.), содержащей сайт инициации трансляции E. coli и 31 N-концевых кодонов ФНО, и Msp I/Hind III - фрагмента рекомбинантного фага λ 422, содержащего часть четвертого экзона гена ФНО человека, кодирующего аминокислотную последовательность 32 - 157 зрелого белка ФНО. Рекомбинантная плазмида pTNF 31 кодирует полипептид 3 - 157 фактора некроза опухоли человека и состоит из Pst I/Pvu II-фрагмента ДНК плазмиды pGA 23 (1,83 т. п.о.), содержащего тандем сильных промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7, ген дигидрофолатредуктазы и часть гена β--лактамазы; Pst I/Xho I-фрагмента ДНК плазмиды pTNF 3, содержащей ген хлорамфениколацетилтрансферазы, терминатор транскрипции фага λ, часть гена β--,--лактамазы и большую часть гена ФНО, кодирующую аминокислотную последовательность 4 - 157 (2,99 т. п.о.), и фрагмента синтетической ДНК (44 п.о.), содержащей рибосомосвязывающий сайт и сериновый кодон. Штамм E. coli S 628858, содержащий плазмиду pTNF 31, обеспечивает уровень экспрессии полипептида с активностью ФНО человека, равный 1,25 • 10⁶ ед. на 1 мл клеточной суспензии.

Description

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированные in vitro рекомбинатные плазмидные ДНК, содержащие полусинтетические гены фактора некроза опухоли человека, промоторы ранней области фага 17 и синтетические участки инициации трансляции, обусловливающие биосинтез полипептидов с биологической активностью фактора некроза опухоли и штаммы E.coli-продуценты этих полипептидов.

Цель изобретения увеличение уровня биосинтеза фактора некроза опухоли и упрощение процесса его получения.

Созданы новая рекомбинатная плазмида pTNF 31, кодирующая конститутивный синтез фактора некроза опухоли человека, новая рекомбинатная плазмида ДНК pTNF 22, являющаяся промежуточным продуктом при конструировании плазмиды pTNF 31, и штамм E.coli SG 20050/pNNF 31, обеспечивающий уровень экспрессии ФНО 1,25·10⁶ ед на 1 мл клеточной суспензии.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pTNF 31, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, характеризуется следующими признаками:
кодирует полипептид 3-157 фактора некроза опухоли человека;
имеет мол.м. 2,93 mD (4,85 т.п.о.) и состоит из
Pst I/Puv II -фрагмента ДНК плазмиды pGA 23, содержащего тандем промоторов А2 и А3 ранней области бактериофага 17, ген дигидрофолатредуктазы и часть гена β-лактамазы (1,83 т.п.о);
Pst I/Xho I фрагмента ДНК плазмиды pTNF 3, содержащей ген хлорамфениколацетилтрансферазы, терминатор транскрипции фага λ, часть гена β -лактамазы и часть гена фактора некроза опухоли человека, кодирующего аминокислотную последовательность 4/Ser/-157/Leu/ (2,99 т.п.о.);
blunt Xho I фрагмента синтетической ДНК, содержащей сайт инициации трансляции E.coli и сериновый кодон (44 п.о.);
содержит в качестве генетических маркеров гены β-лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазы, детерминирующие устойчивость трансформированных плазмидой pTNF 31 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам и к хлорамфениколу;
уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенных на следующих расстояниях от сайта Bam I: Cla I 848 п.о. вправо, Xho I 865 п. о. вправо.

Рекомбинатная плазмида TNF 31 содержит полусинтетический ген фактора некроза опухоли. Источником С-концевой части гена является Msp I/Hind III фрагмент четвертого экзона природного гена ФНО. Недостающая последовательность ДНК, кодирующая последовательность 29 N-концевых аминокислот, была получена с помощью химического синтеза.

Клонотеку генов человека приготовляют из смеси высокомолекулярных ДНК, выделенных из 6 индивидуальных плацент. Для этого ДНК гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой E.coRI и полученный гидролизат фракционируют электрофорезом в агаровом геле, выделяя зоны, содержащие ДНК размером 0,5-1, 2-4, 4-6 и так далее до 12 т.п.о. Материал отдельных фракций был подвергнут блот-гибридизации по Саузерну с олигонуклеотидами
5'CTACTCCCAGGTCCTCT 3'
3'GTCCAGGAGAAGTTCCCG 5' последовательность которых соответствует аминокислотной последовательности 59-66 зрелого белка фактора некроза опухоли. С целью увеличения удельной радиоактивности пробы олигонуклеотидные зонды сначала 5'-фосфорилируют с помощью γ-(³²Р)АТР, а затем достраивают выступающие концы фрагментом Кленова ДНК-полимеразы E. coli с помощью высокомеченых α-(³²Р)-дезоксинуклеозид-5-трифосфатов. Ис- пользование полученных таким образом зондов с удельной радиоактивностью до 10⁸имп/мин^.пмоль позволяет идентифицировать фракцию ДНК, содержащую ген фактора некроза опухоли (2-4 т. п. о. ). ДНК этой фракции лигируют с предварительно дефосфорилированными большими фрагментами ("плечами") фагового вектора λ gt-WesB, которые выделяют в результате гидролиза фаговый ДНК эндонуклеазой рестрикции EcoR I. Для повышения эффективности лигирования реакцию проводят в два этапа. На первом этапе лигируют геномные фрагменты в высокой концентрации без фаговой ДНК, которую прибавляют при повтоpном лигировании. Перед скринингом клонотеки препараты упакованных рекомбинатных фагов концентрируют центрифугированием в ступенчатом градиенте хлористого цезия, после чего проводят трансфекцию и высевают на чашки. Анализ полученной таким образом клонотеки проводят путем гибридизации амплифицированных на дуплицированных фильтрах НА-85 с указанными олигонуклеотидными зондами. Из 40 000 клонов первичный скрининг выявил два положительных сигнала. Зоны, содержащие рекомбинатные фаги, вырезают с исходных чашек и после амплификации подвергают вторичному скринингу.

ДНК одного из рекомбинатных фагов, λ 422, давшего положительную гибридизацию с олигонуклеотидными зондами, выделяют и анализируют с помощью блот-гибридизации по Саузерну, используя гидролизаты рекомбинатной фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoR I, EcoR I/Bg II, EcoR I/Xho I, Alu I/Ubo I, log I, Hinf I, Hind II и Pvu II. Далее ДНК рекомбинатного фага λ 422 гидролизуют рестриктазой EcoR I, выделяют фрагмент величиной 2,8 тыс.п.о. содержащий ген ФНО, и реклонируют его по сайту EcoR I в плазмиду pUC 12.

В результате получают рекомбинантную плазмиду р4221, в который ген фактора некроза опухоли человека находится в такой ориентации, что его транскрипция совпадает с транскрипцией α-пептида β -галактозидазы E.coli.

Для получения 5'-концевого фрагмента гена фактора некроза опухоли было синтезировано фософорамидитным методом четырнадцать олигодезоксирибонуклеотидов величиной 11-20 нуклеотидных звеньев. Лигазные сшивки олигонуклеотидов проводят в два этапа, на первом этапе проводят две четырехкомпонентные и одну шестикомпонентную сшивки. На втором этапе сшивают лигазой сегменты А+В+С, которые предварительно очищают электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Получившуюся в результате 96-звенную двухцепочечную ДНК очищают электрофорезом в 15%-ном ПААГ.

Для конструирования рекомбинатной ДНК pTNF 2 векторную плазмиду pUR 291 расщепляют совместно эндонуклеазами Sal I и Hind III и выделяют больший фрагмент, содержащий промотор, оператор и измененный ген β-галактозидазы E. coli. Одновременно расщепляют эндонуклеазами Hind III и Msp I ДНК плазмиды р4221, содержащей EcoR I фрагмент величиной 2,8 т.п.о. геномного клона фага λ 422, и выделяют фрагмент ДНК величиной 506 п.о. содержащий 3'-концевую последовательность гена зрелого фактора некроза опухоли. Полученный фрагмент соединяют с помощью ДНК-лигазы с синтетическим 5'-концевым фрагментом гена-фактора некроза опухоли и с Sal I/Hind III векторным фрагментом плазмиды pUR 291. После трансформации клеток E.coli 101 отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, дающие на среде с Х-Gal и IPTG ярко-синюю окраску, и проводят среди них скрининг на присутствие синтетического и природного фрагментов гена фактора некроза опухоли гибридизацией колоний in situ с ³²Р-мечеными олигонуклеотидными зондами TCGACCATGTCCTCGAGCC и CTACTCCCAGGTCCTCT. Колонии, гибридизующиеся с обоими зондами, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как pTNF 2.

Новым является использование при конструировании плазмиды синтетического 5-концевого фрагмента гена фактора некроза опухоли при мультикомпонентной сборке плазмиды, использование для этой цели рестрикционной эндонуклеазы Msp I, а также гибридизации с двумя олигонуклеотидными зондами, соответствующими клонируемым фрагментам. Это позволяет однозначно отобрать клоны E.coli, содержащие целевую плазмиду, что значительно упрощает процедуру конструирования плазмидной ДНК.

Плазмида pTNF 2 при трансформации клеток E.coli IM 101 обеспечивает в них индуцируемый синтез фактора некроза опухоли человека в составе гибридного белка с измененной β-галактозидазой E.coli. При использовании в качестве реципиента плазмиды pTNF 2 штамма E.coli CSH 36 (F) обеспечивается конститутивный синтез химерного белка β-галактозидаза фактор некроза, опухоли.

На основе плазмиды PTNF 2 создают другую рекомбинантную плазмиду pTNF 22, кодирующую полный зрелый белок фактора некроза опухоли. Для этого плазмиду pTNF 2 расщепляют смесью рестриктаз Bam I и Xho I, выделяют большой фрагмент и его лигируют с синтетическими олигонуклеотидами.

5'GATCCGAATTCTAAGGAAATTTAAATGGTTCGTTCC 3'
3'GCTTAAGATTCCTTTAAATTTACCAAGCAAGGAGCT 5' После трансформации E.coli (штамм НВ 101) целевые клоны отбирают по положительной гибридизации с клонированными синтетическими олигонуклеотидами и структуру вставки подтверждают анализом ее нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта.

Полученная таким образом плазмида pTNF 22 обеспечивает в клетках E.coli IM 101 при индукции изопропилтио-β-D-галактопиранозидом (IPTG) экспрессию зрелого белка фактора некроза опухоли в количестве 60 000 ед на 1 мл культуры клеток с плотностью 2,8. Для создания конструкции для конструктивного синтеза фактора некроза опухоли полусинтетический ген реклонируют в плазмиду pGA23, содержащую тандем сильных промоторов А2 и А3 бактериофага 17. В свою очередь, плазмиду pGA 23 получают путем клонирования по сайтам Pst I/Bam I малого фрагмента плазмиды pLZ 56 в плазмидный вектор pDSl (EMBO I. 1982, v. 1, р.1399). Для этого из плазмиды pTNF 22 выделяют после гидролиза рестриктазой EcoR I фрагмент величиной 714 п.о. и клонируют его в промоторсодержащей плазмиде pGA 23 после ее частичного гидролиза с помощью E.coR I. В результате получают плазмиду pTNF 30, в которой экспрессия искусственного гена фактора некроза опухоли контролируется тандемом сильных промоторов ранней области бактериофага 17. После трансформации плазмидой pTNF 30 клетки E.coli HB 101 способны конструктивно синтезировать 120 000 ед активности фактора некроза опухоли на 1 мл клеточной культуры.

Для усовершенствования системы экспрессии фактора некроза опухоли конструируют новую рекомбинатную плазмиду pTNF 31, которая содержит усовершенствованный рибосомосвязывающий сайт и перекодированный искусственный ген фактора некроза опухоли. Для этого сначала получают промежуточную плазмиду pTNF 3 путем клонирования Hind III/Xho I фрагмента из плазмиды pNTF 22 в те же сайты плазмиды pDSlt^о 2⁺. В результате получают новую рекомбинантную плазмиду pTNF 3, содержащую большую часть искусственного гена фактора некроза опухоли. Затем эту плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазами Xho I и Pst I и выделяют больший фрагмент. С другой стороны, ДНК плазмиды pGA 23 подвергают гидролизу смесью рестриктаз Pst I и Pvu II и выделяют фрагмент величиной около 1,8 тыс.п.о. Оба фрагмента затем соединяют с одной стороны по тупому концу, а с другой стороны по сайту Xho I с помощью ДНК-лигазы с синтетической ДНК, содержащей последовательность сайта инициации трансляции E.coli и сериновый кодон. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli HB 101 и отбирают клоны, устойчивые к ампициллину и хлорамфениколу, и среди них проводят скрининг на присутствие полусинтетического гена фактора некроза опухоли путем гибридизации in situ с ³²Р-меченой верхней цепью клонированного дуплекса. Колонии, дающие положительную гибридизацию с пробой, отбирают и выделенную из них плазмиду охарактеризовывают рестриктным анализом.

В результате получают новую рекомбинантную плазмиду pTNF 31, содержащую полусинтетический ген, кодирующий полипептид 3-157 зрелого фактора некроза опухоли человека.

Для получения штамма-продуцента полипептида с биологической активностью ФНО-плазмидой pTNF 31 трансформируют компонентные клетки E.coli SG 20050.

Полученный таким образом штамм E.coli SG 20050/pTNF 31 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки очень мелкие, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биологические признаки. Клетки растут в пределах от 4 до 48^оС при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к хлорамфениколу (до 500 мкг/мл) и к ампициллину (до 250 мк/мл), обусловленную наличием плазмиды.

Штамм E. coli SG 20050/pTNF 31 обусловливает конститутивный синтез полипептида с биологической активностью фактора некроза опухоли человека на уровне 1,25·18⁶ ед/мл клеточной суспензии.

П р и м е р 1. Химико-ферментативный синтез N-концевой части структурного гена фактора некроза опухоли человека.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3-0-(метокси, диизопроприламино)фосфитов, активиро- ванных тетразолом. Синтез проводят в стеклянной колонне с пористым фильтром путем ручного прибавления реагентов и растворителей, используя для этой цели 0,6-0,8 мкмоль 3'-концевого нуклеозида, ковалентно связанного с 25-30 мг пористого стекла (размер пор 500

). Каждый цикл наращивания состоит из следующих операций: промывка полимерного носителя ацетонитрилом (3 мл, 2 мин); детритилирование с помощью 0,5 М раствора дихлоруксусной кислоты (2 мл, 2 мин), промывка ацетонитрилом (1,5 мл, 1 мин), промывка абсолютным ацетонитрилом (3 мл, 3 мин); конденсация прибавление смеси 0,05 М раствора соответствующего амидита и 0,3 М раствора дважды возогнанного тетразола порциями по 0,1 мл (0,2 мл, 2 мин); промывка ацетонитрилом (1,5 мл, 1 мин); окисление прибавление 0,1 М раствора иода в смеси тетрагидрофуран-лутидин-вода 8:1:1 (1 мл, 1 мин). промывка абсолютным ацетонитрилом (3 мл, 2 мин); "кэппирование" обработка 1 М раствором уксусного ангидрида и 0,1 М раствором 4-диметиламинопиридина в ацетонитриле.

По завершении синтеза носитель высушивают, обрабатывают 0,5 мл смеси тиофенол-триэтиламин-диоксан, 1: 2: 2 (1,5 ч, 28^оС), промывают метанолом и снова высушивают. Отделение олигонуклеотида от полимерного носителя и удаление ацильных защитных групп проводят действием концентрированного аммиака (24 ч, 55^оС). Затем носитель отфильтровывают, промывают 0,05 М триэтиламмонийбикарбонатом (ТЕАВ) и этанолом; фильтрат и промывки упаривают и хроматографируют на колонке в градиенте концентрации ацетонитрила (5-30%) в 0,05 М ТЕАВ. Фракцию, содержащую диметокситритильное производное олигонуклеотида упаривают и обрабатывают 80%-ной уксусной кислотой (30 мин, 20^оС), растворитель упаривают и олигонуклеотид выделяют хроматографией на той же колонке в градиенте концентрации ацетонитрила (5-15%). Выход очищенного олигонуклеотида 20-80 ммолей.

Лигазная сшивка сегмента А. Смесь 480 пмоль олигонуклеотида (I), 400 пмоль каждого из фосфорилированных олигонуклеотидов II, III, IV, V и 480 пмоль фосфорилированного олигонуклеотида (VI) нагревают 10 мин при 65^оС в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, затем медленно охлаждают до 15^оС, прибавляют rАТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 10 мМ и 300 ед 14 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15^оС, затем депротеинизируют двукратной экстракцией фенолом, ДНК высаживают этанолом и продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевины. Продукт сшивки элюируют из геля электроэлюцией на DEAE-бумагу DE 81, которую промывают несколько раз ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют с помощью 1,5 М раствора NaCl в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с сефадексом 6-50. Выход сегмента А 280 пмоль.

Аналогичным образом получают сегменты В и С. Выходы 350 пмоль и 320 пмоль соответственно.

Далее сшивают по 50 пмоль каждого из сегментов А, В и С в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl₂ 0,2 М rАТР, 10 мМ дитиотреита, и 250 ед 14 ДНК-лигазы 4 ч при 15^оС. Продукт сшивки выделяют электрофорезом в 15%-ном ПААГ, как описано выше. Выход 35 пмоль. Структуру промежуточных и конечных продуктов лигазных реакций доказывают анализом нуклеотидной последовательности.

П р и м е р 2. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК pTNF 2.

Клетки бактерий E.coli IM 101, содержащие плазмидную ДНК pUR 291, выращивают при 37^оС в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем клетки осаждают центрифугированием (15 мин, 6000 об/мин) и плазмидную ДНК выделяют методом с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту, полученному после подкисления ацетатом натрия, прибавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37^оС, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1: 1), после чего ДНК высаживают этанолом. Осадок растворяют в 1 М NaCl, прибавляют полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 до концентрации 1,5% выдерживают 1 ч при 0^оС, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин, осадок промывают 70%ным этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плазменной ДНК 500-800 мкг. Концентрацию плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 БОЕ/мг.

Аналогичным образом выделяют ДНК плазмиды р 4221, содержащей ген фактора некроза опухоли в виде EcoR I -фрагмента (2,8 т.п.о.), клонированный в плазмиде pUC 12 из рекомбинантного фага λ 422. Полученные препараты плазмидных ДНК используют для конструирования плазмиды pTNF 2, которое проводят следующим образом. 5 мкг плазмиды pUR 291 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Sal I (20 ед) и Hind III (10 ед) в буфере R, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 5 мМ меркаптоэтанола, 1 ч при 37^оС. После инкубации реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1). Анализ полноты гидролиза и выделение векторного Sal I/Hind III фрагмента (5,3 т.п.о.) проводят электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Одновременно 10 мкг плазмиды р 4221 обрабатывают 1,5 ч при 37^оС в буфере R рестриктазами Msp I (20 ед) и Hind III (20 ед), после чего электрофорезом в 5% -ном ПААГ выделяют С-концевой фрагмент гена фактора некроза опухоли (Msp I/Hind III, 506 п.о.). Далее этот фрагмент (0,2 мк) соединяют с Sal I/Hind III векторным фрагментом (1,5 мкг) и синтетическим фрагментом (0,1 мкг, см. пример 1) с помощью Т4 ДНК-лигазы (50 ед) в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС.

Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации клеток E. coli IM 101. Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37^оС до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCl₂, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора СаСl₂ и выдерживают при 0^оС в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М СаСl₂ и через 3 ч используют для трансформации. Для этого 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М СаСl₂, прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают 30 мин при 0^оС, затем 2 мин при 42^оС и снова 10 мин при 0^оС, прибавляют 1,4 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37^оС и аликвоты высевают на чаши c LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл), Х-GaL (40 мкг/мл) и 1 мМ IPTG.

Полученные ярко-синие колонии переносят на параллельные нитроцеллюлозные фильтры и анализируют на содержание синтетического и природного фрагментов гена ФНО гибридизацией колоний in situ с ³²Р-мечеными олигонуклеотидами TGGACCATGTGGTCGAGCC и CTACTCCCAGGTCCTCT. Колонии, дающие положительную гибридизацию с обоими зондами, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную как pTNF 2. Структуру плазмидной ДНК pTNF 2 подтверждают рестриктным анализом и определением нуклеотидной последовательности части плазмидной ДНК между сайтами эндонуклеаз Bam I и Hind III.

П р и м е р 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTNF 22.

10 мкг ДНК плазмиды рTNF 2 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции Bam I (20 ед) и Xho I (15 ед) в течение 1,5 ч при 37^оС. После инкубации смесь экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1). Векторный фрагмент величиной 5,92 тыс. п. о. выделяют с помощью электрофореза в 1%-ной агарозе. 0,5 мкг этого фрагмента лигируют с 15 пмоль синтетического дуплекса
GATCCTGAATTCTAAGGAAATTTAAATGGTCGTTCC
GACTTAAGATTCCTTTAAATTTACCAAGCAAGGAGCT в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС в присутствии 50 ед 14 ДНК-лигазы. Пятую часть лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli HB 101, как описано в примере 2. Отбор клонов проводят гибрибизацией колоний с ³²Р-мечеными вставочными олигонуклеотидами. Колонии, дающие положительную гибридизацию, отбирают и из них выделяют плазмиду, обозначенную pTNF 22. Структуру плазмидной ДНК pTNF 22 подтверждают рестриктным анализом и определением нуклеотидной последовательности между сайтами EcoR I.

П р и м е р 4. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTNF 3.

Конструирование плазмиды pTNF 3 проводят следующим образом. Сначала плазмидную ДНК pDSlt^о 2⁺ 9 5 мкг) инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Pst I (10 ед) в 50 мкл буфера R 1,5 ч при 37^оС. После обработки, как в примере 2, векторный фрагмент выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Далее 10 мкг плазмиды RLZ 56 гидролизуют с помощью эндонуклеаз рестрикции Pst I (20 ед) и Bam I (20 ед) и фрагмент около 1 т.п.о. содержащий промоторы А2 и А3 ранней области фага 17, выделяют электрофорезом в 5%-ном ПААГ. Затем 0,5 мкг векторного фрагмента соединяют с 0,2 мкг промоторсодержащего фрагмента с помощью Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС. Аликвотой реакционной смеси трансформируют компетентные клетки E.coli 0600 и трансформированные клетки высевают на агар, содержащий среду LB и 150 мкг/мл хлорамфеникола. Из хлорамфениколоустойчивых колоний выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как рGA 23. Структуру плазмидной ДНК pGA 23 подтверждают рестриктным анализом.

15 мкг плазмидной ДНК pGA 23 инкубируют с 10 ед эндонуклеазы EcoR I в 120 мкл буфера R в течение 1 ч при 25^оС. Реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1) и линеаризованную плазмиду выделяют при помощи электрофореза в 1% -ном агарозном геле. Аналогичным образом с помощью гидролиза эндонуклеазой EcoR I и электрофореза в 1%-ном агарозном геле из плазмиды pTNF 22 выделяют фрагмент величиной 714 п.о. 0,1 мкг которого инкубируют с 1 мкг линеаризованной плазмиды pGA 23 в 25 мкл буфера L в присутствии 50 ед 14 ДНК-лигазы. Одной десятой частью лигазной сшивки трансформируют компетентные клетки E.coli HB 101, как описано в примере 2. Смесь высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (100 мкг/мл).

Полученные колонии скринируют на содержание полусинтетического гена гибридизацией с ³²Р-меченым сегментом В (см. пример 1). Колонии, дающие положительную гибридизацию, отбирают, из них выделяют плазмидную ДНК и проводят рестриктный анализ с помощью эндонуклеазы Hind III на ориентацию фрагмента, содержащего искусственный ген фактора некроза опухоли, и с помощью эндонуклеазы Hal III. Плазмидную ДНК, образующую при гидролизе рестриктазой Hind III фрагмент величиной 784 п.о. и содержащую в Hal III гидролизате промоторсодержащий фрагмент величиной 360 п.о. обозначают как рTNF 30. Строение рекомбинантной ДНК pTNF 30 подтверждают рестриктным анализом с помощью рестрикционных эндонуклеаз Hal III, Msp I и Hind III, а также определением цитопатической активности лизатов клеток, содержащих плазмиду pTNF 30 (см. пример 7). Затем 1 мкг ДНК-плазмиды pDS1t^о 2⁺ инкубируют в 25 мкл буфера R с эндонуклеазами Hind III (2 ед) и Xho I (1 ед) в течение 1 ч при 37^оС. После обработки, как в предыдущем примере, электрофорезом в 1%-ном агарозном геле выделяют векторный фрагмент величиной около 3,2 тыс.п.о.

Аналогичным образом гидролизуют 10 мкг плазмиды pTNF 30 в 150 мкл буфера R с помощью 20 ед рестриктазы Hind III и 15 ед рестриктазы Xho I и фрагмент величиной 648 п. о. содержащий большую часть гена фактора некроза опухоли, выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Затем смешивают с помощью 15 ед. Т4 ДНК-лигазы 1 мкг большого фрагмента и 8,2 мкг малого фрагмента в 15 мкл буфера L в течение 3 ч при 13^оС. Пятую часть лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli С 600. Трансформированные клетки высеивают на LB-агар, содержащий ампициллин (100 мкг/мл) и среди устойчивых к ампициллину клонов проводят скрининг на содержание гена фактора некроза опухоли гибридизацией с ³²Р-меченым олигонуклеотидом СТАСТСССAGGTCCTCT. Из клонов, дающих положительную гибридизацию с этим олигонуклеотидным зондом, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как pTNF 3, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз Hal III и Msp I и определением нуклеотидной последовательности в районе сайтов рестриктаз Xho I и Hind III.

П р и м е р 5. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК pTNF 31.

1 мкг плазмиды pGA 23 инкубируют в 25 мкл буфера R эндонуклеазами Pst (2 ед) Рvu (2 ед) в течение 1 ч при 37^оС. После обработки реакционной смеси электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, как в предыдущем примере, выделяют векторный фрагмент величиной, около 1,8 т.п.о. Аналогичным образом гидролизуют 3 мкг ДНК-плазмиды pTNF в 50 мкл буфера R с помощью 18 ед каждой из рестриктаз Pst I и Xho I и больший фрагмент (около 3 тыс.п.о.) выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Затем оба фрагмента (по 0,5 мкг) смешивают с 1 мкг нефосфорилированного синтетического ДНК-дуплекса (44 п.о.), содержащего нуклеотидную последовательность сайта инициации E.coli и сериновый кодон, и инкубируют 8 ч при 18^оС в 30 мкл буфера L с 25 ед Т4 ДНК-лигазы. Пятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli НВ 101, трансформанты высевают на LВ-агар, содержащий ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (100 мкг/мл), отбирают клоны, устойчивые к обоим антибиотикам, и среди них проводят скрининг гибридизацией колоний с 5'-³²Р-меченой верхней цепью клонированного дуплекса. Из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как pTNF 31. Строение рекомбинантной плазмиды pTNF 31 подтверждают рестриктным анализом при помощи эндонуклеаз Hae III и Msp I и определением нуклеотидной последовательности в районе вставки.

П р и м е р 6. Получение штамма продуцента полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека.

Плазмидой pTNF 31 трансформируют клетки E. coli SG 20050 по методу, описанному в примере 2, и получают штамм продуцент полипептида 3-157 фактора некроза опухоли человека E.coli SG 20050/pTNF 31.

П р и м е р 7. Определение продуктивности штамма E.coli продуцента полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека.

Клетки E.coli SG 20050/pTNF 31 выращивают при 37^оС в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости вращения 190 об/мин. Отбирают пробу 2 мл, клетки центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин, затем суспендируют в 25 мМ трис-буфере (рН 8,0), содержащем 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида и лизоцим (5 мг/мл), и инкубируют 30 мин при 25^оС. Для вскрытия клеток смесь замораживают в течение 10 мин при -70^оС, а затем оттаивают во льду. Эту операцию повторяют трижды, после чего определяют содержание фактора некроза опухоли в растворе измерением его биологической активности.

Биологическую активность ФНО определяют на культуре трансформированных мышиных фибробластов линии L-929. С этой целью монослойную культуру клеток выращивают в СО₂-термостате в 96-луночных пластинах для культур клеток в среде DMEM, содержащей 10%-ную сыворотку теленка. Для определения биологической активности культуральную среду заменяют на свежую среду DMEM, содержащую 1%-ную сыворотку теленка, актиномицин D (1 мкг/мл) и клеточный лизат в серийных двукратных разбавлениях (примерно соответствующих концентрации фактора некроза опухоли от 10 мг/мл до 10^-5 мкг/мл). Платы снова инкубируют 16-20 ч в СО₂-термостате, затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количество окрашенных (нежизнеспособных) и неокрашенных (живых) клеток. За единицу активности принимают количество фактора некроза опухоли, вызывающее гибель 50% трансформированных клеток.

Изобретение позволяет повысит уровень биосинтеза полипептида с биологической активностью фактора некроза опухоли человека до 1,25·10⁶ед на 1 мл клеточной суспензии и упростить процесс его получения за счет исключения нетехнологичной стадии индукции.

Claims (3)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTNF 22, содержащая полусинтетический ген фактора некроза опухоли человека, - промежуточная плазмида для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTNF 31, с мол.м. 3,6 MD (5,95 т.п.о. ), содержащая:
Bam I - Hind III-фрагмент ДНК плазмидного вектора PVR 291 с промотором, оператором и измененным геном β -галактозидазы, кодирующим 1027 аминокислотных остатков размером 5,35 т.п.о.;
Bam I - Msp I-фрагмент синтетической ДНК с участком, инициации трансляции Escherichia coli, инициирующим кодоном ATG и 31 N-концевым кодоном фактора некроза опухоли размером 120 тыс. п.о.;
Msp I - Hind III-фрагмент ДНК рекомбинантного фага l 422 с частью четвертого экзона гена фактора некроза опухоли, кодирующего аминокислотную последовательность 32-127 зрелого белка;
генетические маркеры: ген b -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформирования плазмидой pTNF 22 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Bam I: Xho I 35 т.п.о. вправо, Pst I 1409 т.п.о. вправо, EcoR V 1929 т.п.о. вправо.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTNF 31, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, с мол.м. 2,93 Mg (4,85 т.п.о.), содержащая Pst I/Pvu II-фрагмент ДНК плазмиды pGA 23 с тандемом промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7, с геном дигидрофолатредуктазы и частью гена b -лактамазы размером 1,83 т.п.о.;
Pst I/Xho I-фрагмент ДНК плазмиды pTNF 3 с геном хлорамфениколацетилтрансферазы с терминатором транскрипции фага l частью гена b - лактамазы и частью гена фактора некроза опухоли человека, кодирующего аминокислотную последовательность 4 (Ser) - 157 (Leu) размером 2,99 т.п.о.;
blunt /Xho I-фрагмент синтетической ДНК с сайтом инициации трансляции и сериновым кодоном AGS с размером 44 п.о.;
уникальные сайты узнавания рестракционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Bam I,:
Clo I 848 п.о. вправо;
Xho I 865 п.о. вправо;
Pst I 1010 п.о. влево.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3968 - продуцент полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека.