KR910001812B1

KR910001812B1 - 외래유전자의 발현제어방법 및 그 방법을 사용한 외래유전자산물의 생산방법

Info

Publication number: KR910001812B1
Application number: KR1019880001742A
Authority: KR
Inventors: 노부히로 후꾸하라; 세쯔오 요시노; 가오루 야마모또; 사도리 소네; 마끼 스즈끼; 요시유끼 나까지마
Original assignee: 미쯔이도오아쯔가가꾸 가부시기가이샤; 마지마 마사요시
Priority date: 1987-02-19
Filing date: 1988-02-19
Publication date: 1991-03-26
Also published as: CA1320922C; EP0279665A2; EP0279665B1; DE3877012D1; KR880010129A; US5322786A; DK88488A; EP0279665A3; MX168908B; ES2043805T3; US5043277A; DE3877012T2; DK88488D0

Abstract

내용 없음.

Description

외래유전자의 발현제어방법 및 그 방법을 사용한 외래유전자산물의 생산방법

제1도는 P^SW11, P^sw2및 P^SW13의 페닐알라닌 암모니아리아제 (PAL)구조유전자에 관한 부분의 제한효소절단지도를 도시한 도면.

제2도(a)∼ (d)는 참고예 1에서 클로운(Clon)화된 PAL을 코오드화한 영역을 가지는 DNA 배열의 한쪽의 사슬을 가지는 염기배열을 도시한 도면.

제3도는 P^sw101을 구축하는 수순의 순서도.

제4도는^PYtrp6을 구축하는 수순의 순서도.

제5도 내지 제7도는 각각 제4도에 도시된 순서도내의 일부상세도.

제8도는 참고예 2에서 구축된 각각의 하이브리드(hybrid)플라스미드의 구축공정의 개략도.

제9도, 제10도 및 제11도는 각각 하이브리드플라스미드 P^Tac11, P^PL-PAL-head 및 P^SW15의 구축공정을 도시한 상세도.

제12도, 제13도, 제14도 및 제15도는 각각 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2에 있어서의 배양조작의 흐름을 도시한 다이어그램.

본 발명은, 바라던 외래유전자를 삽입한 조환체(hybrid plasmid) 플라스미드(이하 Hi-플라스미드라 칭한다.)를 도입한 대장균(Escherichia coli)을, 그 외래유전자의 발현을 효과적으로 제어하면서 효율이 양호하게 증식되는 것에 유용한 외래유전자의 발현제어방법에 관한 것이고, 또한 이 제어방법을 사용하여 균체의 증식과 외래유전자의 발현의 시기를 분리한 Hi-플라스미드도입대장균의 배양에 의한 외래유전자산물의 생산방법에 관한 것이다.

최근, 유전자조환기술의 발달에 의해, 숙주균으로의 외래유전자의 형질발현을 가능하게한 발현 벡터로,동물, 식물, 미생물등으로부터 얻어진 바라던 외래폴리펩티드를 코오드화하는 구조유전자를 조립해서 Hi-플라스미드를 구축하고, 그 Hi-플라스미드를 도입한 숙주균을 배양해서, 숙주균에 바라던 외래폴리펩티드를 생산시키는 방법이 개발되고 있다.

이 기술에 의해, 예를 들면 인체인슐린, 인체성장호르몬등의 유용한 물질을 대량생산하는 것이 가능해지는 중이다.

이와 같은 유전자조환기술을 사용한 외래유전자산물을 생산하기 위해서 사용하는 숙주균으로서는, 그 생물학적특성의 해석이 충분히 되어 있고, 또 병원성을 가지지 않고, 간단한 조성의 배지에서 용이하게 배양가능하다는 점에서 대장균이 넓게 사용되고 있다.

그러나, 일반적으로 Hi-플라스미드의 안정성은 반드시 높을 필요는 없고, 그것을 도입한 대장균의 배양으로는, 균의 증식에 따라서 Hi-플라스미드의 구조적 변화와 Hi-플라스미드자체의 소멸에 의해 외래유전자의 발현성을 잃었던 Hi-플라스미드탈락균이 출현하고 있다.

예를 들면, 대량배양을 행하는 공업적규모의 생산은, 일반적으로 본 배양에 필요한 균체량과 균체활성을 얻기위한 예비배양을 포함해서 배양기간이 비교적길게되어, 상기와 같은 Hi-플라스미드탈락균의 출현을 피할수 없고, 더구나 전체배양균당 Hi-플라스미드탈락균의 비율이 높게되면, 최종적으로 얻어지는 배양물중의 바라던 외래유전자산물의 농도의 저하를 초래하여, 효율이 양호한 외래유전자의 생산을 할수없다.

그래서, 이와 같은 Hi-플라스미드를 사용한 배양에 있어서의 문제점을 해결하는 수단의 하나로서, 균의 증식과 외래유전자의 발현시기와를 분리시키는 방법이 검토되고 있다.

구체적으로는, 우선 도입된 Hi-플라스미드의 외래유전자의 발현을 억제하면서 이 플라스미드도입균을 배양하고, 원하던 균체량이 얻어진 곳에서, 발현의 제어를 완화하여 외래유전자를 발현시키고, Hi-플라스미드탈락균의 발생을 강력히 억제하여, 보다 효율이 좋은 외래유전자를 생산하도록한 것이다.

이와 같은 방법에 사용되는 외래유전자의 발현방법으로서는, 예를 들면, Hi-플라스미드에, 대장균 람다파아지의 P_L람다프로모우터/오퍼레이터와 대장균 트립토판 오페론의 trp 프로모우터/오퍼레이터등의 리프레서를 불활성화하는 유도시약의 첨가에 의해서 임의의 시기에 외래유전자의 발현을 유발할수 있는 유도형발현프로모우터를 사용하는 방법과, 온도의존성을 가지는 복제개시영역을 가진(즉 그 복제개시에 필요한 소정의 온도 혹은 온도범위를 가진다) 온도제어형의 벡터를 사용하여, 배양온도를 조정하는것에 의해서 외래유전자의 발현을 억제하는 방법이 알려져있다.

그러나, 유도형발현프로모우터를 사용한 방법은 발현유도를 위한 유도시약이 고가이기 때문에, 생산코스트의 상승을 초래하고, 더우기, Hi-플라스미드탈락균의 출현, 증가를 충분히 억제되지않는다고하는 문제가 있고, 공업적인 규모의 배양에는 적용하기 어렵다.

또, 온도제어형벡터를 사용한 방법도, Hi-플라스미드탈락균의 출현방지효과가 충분하지 않다.

본 발명자들은, 상술한 바와 같은 문제점에 비추어, 보다 효율이 양호한 외래유전자산물의 생산을 실현하기 위하여, Hi-플라스미드도입대장균의 배양공학적 특성에 대해서 여러검토를 행하던중, Hi-플라스미드 도입대장균의 배양온도를 조절하는 것만으로, 대장균에서의 외래유전자의 발현을 효과적으로 억제할수 있는 것을 새롭게 보게되었다.

또한, Hi-플라스미드도입균을 배양해서 외래유전자산물을 생산할때에, 이와 같은 배양온도의 조절에 의한 발현제어방법을 사용해서 외래유전자의 발현억제시기를 조작하여, 균의 증식과 외래유전자의 발현시기와를 분리하면, Hi--플라스미드탈락균의 발생이 충분히 억제된 양호한 균체증식과, 효율이 양호한 외래유전자산물의 생산이 가능하다는 결론을 얻어서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, Hi-플라스미드가 도입된 대장균의 배양에 있어서, Hi-플라스미드에 삽입된 외래유전자의 발현을 간단한 조작에 의해서 효과적으로 억제할수 있는 방법을 제공하는것에 있다.

본 발명의 다른 목적은, 배양물에 고농도로 원하던 외래유전자산물을 효율이 양호하게 생산할수가 있고, 특히 공업적규모의 Hi-플라스미드도입대장균에 의한 외래유전자산물의 생산에 가장 적합한 방법을 제공하는것에 있다.

본 발명의 외래유전자의 발현제어방법은, 발현벡터에 바라던 외래유전자를 삽입한 Hi-플라스미드를 도입하여 이 외래유전자의 발현을 가능하게한 대장균을 배양할때에, 이 대장균에서의 상기 외래유전자의 발현을 억제하는 방법에 있어서, 이 대장균의 배양온도를 40℃이상으로 유지하는 것에 의해 상기 외래유전자의 발현을 제어하는 것을 특징으로 한다.

그래서, 본 발명의 발현제어방법에 의하면, 배양온도를 조절한다고 하는 간단한 방법으로, Hi-플라스미드도입대장균에 있어서의 외래유전자의 발현을 바라던 바에 따라서 효과적으로 제어가능하다.

또, Hi-플라스미드도입대장균의 배양에 의한 외래유전자산물의 생산방법에, 본 발명의 발현제어방법을 사용하여 균의 증식과 외래유전자의 발현시기와를 분리하고, 이것들을 효율이 양호하게 행하는 것에 의해서, Hi-플라스미드_탈락균의 발생을 충분히 억제한 양호한 균체증식을 달성할 수 있고, 더우기 배양물속에 고농도로 바라던 외래유전자산물이 얻어지고, 효율이 양호한 외래유전자산물의 생산이 가능하게 되었다.

특히, 본 발명의 방법으로는, 외래유전자의 발현제어를 배양온도의 조절이라고하는 간단한 조작에 의해서, 행해지므로, 유도형 플라스미드를 사용하는 경우와 같이 고가의 유도시약을 사용할 필요가 없다.

또, Hi-플라스미드탈락균의 출현을 보다 효과적으로 억제할수가 있으므로, 본 발명의 방법에 의하면, 공업적규모의 대량배양에 의한 외래유전자의 생산성의 향상이 용이하게 도모된다.

본 발명의 방법에 사용하고 있는 Hi-플라스미드(조환체 플라스미드)는, 외래유전자의 대장균에서의 발현을 가능하게하는 구성을 가진 발현벡터에 바라던 외래유전자를 삽입하여 얻을수 있는 것이다.

Hi-플라스미드를 구성하는 발현벡터로서는, 예를 들면, 대장균에서 복제가능한 벡터와, 이 벡터에 결합된, 예를 들면 P_L람다 파아지 프로모우터 (P_L람다프로모우터), 트립토판 오페론프로모우터 (trp 프로모우터) 및 P_L람다프로모우터와 trp 프로모우터 마이너스 35영역과 lac UV-5 프로모우터 마이너스 10영역을 융합한 tac 프로모우터로 이루어진 연결프로모우터등의 각종 프로모우터를 가지는 구서의 것등을 들수가 있다.

또, 여기서 말하는 외래유전자는, 예를 들면 진핵세포유래의 폴리펩티드와 실질적으로 아미노산배열을 가지는 비대장균유래의 폴리펩티드등의 야생형대장균으로는 통상 생산되지 않는 폴리펩티드를 코오드하는 구조유전자를 말한다.

본 발명의 발현제어방법은, Hi-플라스미드도입대장균의 배양온도를 조절하는 것에 의해서 Hi-플라스미드에 조립된 외래유선자의 발현을 제어하는 것이다.

구체적으로는, 외래유전자의 발현을 제어하고 싶은 경우에는, Hi-플라스미드도입대장균의 배양온도를 40℃이상으로하고, 또, 외래유전자를 발현시키고 싶은 경우에는, 40℃미만으로 한다.

이와 같이 배양온도를 40℃이상으로 유지하며 Hi-플라스미드도입균의 배양을 행하면, 외래유전자의 발현을 효과적으로 제어할 수 있고, 양호한 균체증식이 얻어지고, 더우기, 바라던 균체량이 얻어질때까지의 배양기간을 지나서 Hi-플라스미드탈락균의 출현을 효과적으로 억제할수가 있다.

그에 덧붙여서, 본 발명의 제어방법은, 배양온도의 조절이라고하는 간단한 조작으로, 외래유전자의 발현을 제어하기 때문에, 상술한 바와 같은 발현유도시약등과 같은 매우 고가인 시약을 사용하지 않아도 되었다.

이와 같은 본 발명의 외래유전자의 발현제어방법을, Hi-플라스미드도입대장균을 배양하여 Hi-플라스미드에 조립된 외래유전자유래의 외래유전자산물을 생산에 적용하면, 효과적인 외래유전자산물의 생산이 가능하게 된다.

즉, 상술한 본 발명의 발현제어방법을 사용한 Hi-플라스미드도입대장균에서의 외래유전자산물의 생산방법은, 발현벡터에 바라던 외래유전자를 삽입한 Hi-플라스미드를 도입하여 이 외래유전자의 발현을 가능하게한 대장균을 배양하고, 이 왜래유전자를 발현시켜서 이 외래유전자에 코오드된 외래유전자산물을 생산하는 방법에 있어서, a) 40℃이상으로 배양온도를 유지하여 상기 대장균을 배양하는 제1의 배양과정과, b)이 제1의 배양과정에서 증식한 대장균을 40℃미만의 배양온도에서 배양하는 제2의 배양과정과를 가지는것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 있어서의 제1배양과정에서는, 배양온도가 40℃이상으로 유지되어, Hi-플라스미드에 조립되어서 대장균내로 도입된 외래유전자의 발현이 제어된다. 그 결과, 제1배양과정에서는, 양호한 균의증식이 얻어지고, 효율이 양호한 바라던 균체량을 얻을수 있다. 게다가, 바라던 균체량을 얻기까지에 Hi-플라스미드탈락균의 출현은 거의 무시될수 있는 정도로 억제된다. 또, 균제의 증식활성을 유지하면서 장기간에 걸쳐서 계속적인 배양을 행할 경우에도 이러한 발현을 제어하는 것에 의해서 Hi-플라스미드탈락균의 출현을 억제할수가 있다.

본 발명에 있어서의 제2배양과정에서는, 배양온도가 40℃미만으로 되어, Hi-플라스미드유지균으로의 외래유전자의 발현제어가 해제된다. 그러면, Hi-플라스미드유지균에서 외래유전자가 발생하고, 외래유전자산물의 생산이 행해진다. 그때, 제1배양과정에서 얻어진 전체배양균에 차지하는 Hi-플라스미드탈락균의 비율은 거의 무시할수있는 정도로 작기때문에, 배양균의 거의 모두 효율이 양호한 외래유전자가 발현되고, 충분히 높은 농도로 외래유전자산물을 배양물중에서 얼을수 있다.

또, 제1배양과정에서의 배양온도와 제2배양과정에서의 배양온도를 조합시킨 것으로서는, 예를 들면 40℃∼45℃와 25∼35℃의 조합시킨것등을 사용할수 가 있다.

이와 같은 본 발명의 방법에 의해서, 균체를 대량으로 배양하여 배양물을 대량으로 생산하면, 배양물중에 외래유전자산물을 고농도로 얻어지기때문에, 외래유전자산물의 생산량을 상승적으로 증가시킬수가 있다.

더우기, 상술한 바와 같이 외래유전자의 발현을 수반하는 균체의 증식과정은, 예를 들면 계속적인 배양기간이 길게되는외에, Hi-플라스미드탈락균의 배양균에 차지하는 비율이 증가하기때문에, 그 배양기간을 그다지 길게할수가 없었지만, 본 발명의 발명에 있어서는, 제1배양과정에서, 필요에 용하여, 충분히 긴 배양기간을 취할수있기 때문에, 본 발명의 방법은, 바라던 균체량을 얻기위한 배양을 충분히 장시간 효과적으로 행할수가 있고, 비교적 긴 예비 배양기간이 필요하게되는 공업적규모에서의 대량배양에 특히 가장 적합하다.

또, 제1배양과정과, 제2배양과정과의 절환시기는, 사용하는 Hi-플라스미드도입균의 종류와 제1 및 제2배양과정에서 사용하는 배양방법에도 의하지만, 예를 들면, 소용량의 종균을 얻는 예비배양과, 대용량의배치 (batch)식에 의한 본 배양을 행할때에 본 발명의 방법을 적용하는 경우, 예비배양과 본 배양에 있어서의 대수증식기의 전기까지를 본 발명의 제1배양과정으로하고, 이것이하를 제2과정으로하면 좋지만, 바라는 바에 따라서 적절히 선택하여 얻는다.

또, 본 발명의 방법에 있어서, 페닐알라닌 암모니아리아제(PAL)에서의 예를 참고예, 실시예 및 비교예에 의해 이하에 표시한다.

참고예 1

(1) mRNA(PAL)의 단리 및 정제

로도스포리듐 토루로이드(Rhodosporidum toruloides IF0559, 이 균은 ATCC10788로도 수록기재되어 있다.)를 2% 글루코오스를 함유하는 합성배지(표 1)에서, 27℃에서 통기교반배양을 행하고, 배양초기에 첨가한 글루코오스를 전부 소비한 직후, 균체를 원심분리하여 집균하고, 습균체를 멸균한 0.85% 식염수로 세정한후 다시 원심분리를 행하여, 습세정균체를 얻는다.

[표 1]

이 습세정균체는 즉시 PAL유도배지[2% L-페닐알라닌을 함유하는 0.17% Yeast Nitrogen Base(Difco사 제조, 무 황산암모늄 및 무 아미노산형태1에 균체농도 0.5∼0.8%가 되도록 현탁하고, 27℃에서 진탕교반을 행하는 PAL을 유도했다. 처리하지 않은 균체 및 2시간 유도처리를 행했던 균체는 PAL 유도배지로부터 각가 원심분리해서 회수하고, 얻어진 습균체는 같은양의 멸균수에 현탁후, 이 현탁수를 액체질소속에 적하하여 동결균체로 하였다.

동결균체 10g을 유발속에서의 액체질소에 첨가하여 분쇄를 행한후, 그때 분쇄된 동결균체가 녹기시작하자마자 액체질소는 순간적으로 증발하며, 여기에 50ml의 5%의 SDS(sodium dodecylsulfate)를 첨가한 완충액 C(0.1M Na₂HPO₄(pH7.4), 0.15M 염화나트륨, 1% 데옥시콜산나트륨, 1% 트리톤 X-100)를 첨가하고, 30분간 서서히 교반하였다.

30분후, 50ml의 페놀-클로로포름혼합액(페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알코올혼합용액비 25 : 24 : 1) 50ml를 첨가하고 15분간 교반하여 혼합하였다.

이 혼합액을 원심분리하여 수층을 회수하고, 이 수층에 세로 50ml의 페놀-클로로포름혼합액을 첨가하고, 15분간 교반후 원심분리하고, 더우기 수층을 회수하여 재차 페놀-클로로포름혼합액추출조작을 2회 반복했다.

마지막으로 얻은 수층에 식염을 최종농도 0.2M이 되도록 멸균한 5M 식염수를 첨가하고, 더우기 2.5용적의 냉에탄올을 첨가하고, -20℃이하로 보존하여 핵산성분을 침전시켰다.

이 침전물을 원심분리에 의해 회수하고, 냉에탄올로 세정하고 그후, 감압하에서 건조를 행했다.

이 건조물을 10ml의 멸균수로 용해하고, 65℃에서 5분간 열처리를 행하고, 올리고-d(T) 셀룰로오스를 사용한 mRNA의 공지의 Maniatis법 [Maniatis. T., 등 "Molecular Cloning"(1982)]에 따라 mRNA를 단리 하였다.

이렇게해서 얻어진 mRNA를 샘플완충액 (5M 요소, 1mM EDTA 및 0.05% 브로모페놀블루)에 용해한후, 65℃에서 2분간 열처리를 행하여 RNA의 고차구조를 변성시킨 후, 8M 요소-아크릴아미드슬립겔(아크릴아미드농도 3%, 8M 요소존재)을 사용해서 영동용 완충액(89mM Tris, 89mM 붕산, 2mM EDTA)중에서, 100볼트로 1.5시간 전기영동을 제공하였다.

전기영동 후, 아크릴아미드겔을 브롬화 에티늄으로 처리하고, 자외선하에서 mRNA의 밴드를 발색시켜서 mRNA크기에서 2.0∼3.0kb의 범위를 세로로 3등분으로 분할하고, 슬립겔로부터 세개의 겔단편을 절단했다.

각각의 겔단편을 투석튜우브에 봉입하고, 상술한 조성을 갖는 영동용 완충액에 담가서, mRNA를 겔단편으로부터 전기적으로 용출했다.

투석튜우브내의 액체에 페놀-클로로포름혼합액을 첨가하고, 이 혼합액의 추출조작을 2회 반복하고, 이렇게해서 얻은 수층을 에테르로 다시 추출하여 나머지 페놀을 제거하였다. 이 수층에 1/10용적의 3M 아세트산나트륨수용액 (pH5.2)을 첨가한 후, 2.5용적의 냉에탄올을 첨가해서, -20℃로 보존하여, mRNA를 침전시켰다.

상기에서 얻어진 mRNA가 PAL mRNA를 함유하는 것인지를 확인하기 위하여, 각각의 mRNA 분획에서 단백질로 번역시켜서, 생산단백질을 PAL 특이항체를 사용하여 행했다.

즉, 각각의 분획 mRNA는 토끼의 망상적혈구용해물을 사용한 무세포계의 번역키드로 제공했다[Pelham. H. R등, European J. Biochem ., 67, 247-256(1976)].

사용된 토끼의 망상적혈구분석용 키드는 Promega Biotec사의 제품을 사용하고, 포식아미노산으로는³⁵S-메티오닌(Amersham사 제품)을 사용했다.

토끼의 망상적혈구 in vitro 번역시스템에서 번역된 단백질을 확인하기 위해서, 번역반응혼합액에 완충액 C을 가해서 용해하고, 불용성물질을 원심분리하여 제거하고, 상청액에 자체제조한 토끼의 항-PAL · IgG를 첨가해서, 얼음위에서 30분간 반응시키고, 이 반응혼합액에 양의 항토끼 IgG(자체제조)을 첨가해서, 얼음위에서 30분간 반응시켜서, 단백질을 토끼항체와 함께 침전시켰다.

침전물을 원심분리하여 회수하고, 완충액 C으로 2회 세정을 행하고, 이 침전물을 2% SDS, 10% β-메르캅토에탄올혼합액과 0.1M Tris-인산(pH6.8), 1% SDS, 50% 글리세롤혼합액과를 3 : 1의 용적비로 혼합한 용액으로 용해하고, 95℃에서 2시간 열처리를 행하고, 단백질의 이황화결합과 절단하고, SDS-폴리아크릴아미드슬립겔 전기영동(아크릴아미드농도 10%)을 Laemmli의 방법 [Laemmli, U. K., Nature,227, 680-685(1970)]에 따라서 행하고, 전기영동후의 겔을 건조한 후, 방사선사진법에 의해 PAL의 관측을 행했다.

겔분획으로부터 유도된 각각의 mRNA 분획은 상기와 같은 절차로 실험되어서 PAL을 위하여 코오드한mRNA를 함유하는 분획이 식별되었다.

(2) PAL mRNA의 이중사 cDNA(ds-cDNA)으로의 변환

PAL 유도처리 2시간후의 세포에서 얻은 mRNA를 함유하는 겔단편으로의 분획을 상기 제1항의 방법으로 정제하고, 이렇게 얻어진 mRNA를, AMV 역전사효소를 작용시켜서, 단일사 cDNA 분자로 변환했다.

[Gugger, U., 등, Gene, 25, 263-269, (1983)].

이 단일 cDNA-mRNA 혼성체에, RNaseH, DNA 중합효소 I 및 T₄DNA 리가아제를 작용시켜서, mRNA를 제거한 이중사 cDNA(ds-cDNA)를 구축했다.

(3) 3'-말단에 올리고-dc 꼬리를 가지는 ds-cDNA의 구축

상기 제2항에서 얻어진 ds-cDNA에 말단 데옥시뉴클레오티딜-트랜스퍼라아제(TdT)를 작용시켜서 ds-cDNA의 3'-말단에 올리고-dc 꼬리를 부가시켰다.

즉, 3㎍의 ds-cDNA를 TdT 완충액[100mM 카코딜산 칼륨(pH7.2), 2mM 염화코발트, 0.2mM 디티오트레이톨]과 0.2mM dCTP를 함유한 반응액에 용해하고, 37℃에서 5분간 예비처리를 행한 후, 50단위의TdT를 첨가하고, 37℃에서 15분간 반응을 진행시켜서, 그후 EDTA를 최종농도가 40mM이 되도록 첨가하여, 얼음위에 놓고, 페놀-클로로포름혼합액을 첨가해서, TdT를 변성불활성화시키고, 변성불용성 단백질을 원심분리하여 제거하고, 상청액을 페놀로 추출하고, 분리된 수층을 냉에탄올과 혼합하였다. 이와같이 형성된 침전물을 여과하고, 70% 에탄올로 세정한 후 감압건조를 행하여, 3'-말단에 부가된 올리고-dc 꼬리를 가지는 ds-cDNA를 얻었다.

(4) 하이브리드 플라스미드의 구축

[pUC9(올리고-dc 꼬리를 가진다)분자와 ds-cDNA(올리고-dc 꼬리를 가진다)분자와의 결합

상기 제3항에 얻어진 올리고-dc부가 ds-cDNA와 플라스미드 pUC9[올리고-dc 고리부가, Pharmacia사(스웨덴)로부터 용이하게 입수가능]분자와를 dc-dG 호모폴리법으로서 알려진 Maniatis법에 따른 방법으로 결합시켰다.

(5) 형질변환 및 클로운의 선택

상기 4항에서 얻어진 하이브리드 플라스미드(올리고-dG부가 pUC9분자와 올리고-dc부가 ds-cDNA 분자로 구성된다.)를 Cacl₂처리된 대장균(MC-1061) [Casadababan, M. T., 등, Method in En-zymology, vol 100, 293-308, Academic Press, New York(1983)]에 콤퍼턴드(competent)세포법으로 도입했다.

약 4만개의 형질전환체의 콜로니를 얻은 후, 상기의 제2항에 있어서 PAL mRNA에서 단일사 cDNA를합성할때에, 반응액중의 dCTP의 대신에 α-³²P-dCTP를 사용하여,³²P로 표식한 단일사 cDNA를 증명으로 하여, Grunstein방법[Grunstein, M., 등 Proc. Natl. Acad. Sci-USA., 72, 3961(1971)]에 준한 콜로니 혼성화법으로, 세포의 선택을 행했다.

그 결과, 양성의 콜로니중에서, 플라스미드를 추출하여 정제하고, 더우기, 각종의 제한효소로 절단하고, 아가로우즈 겔전기영동에 의해서 DNA 단편의 크기를 조절하였다.

(6) 완전한 PAL 구축유전자를 함유하는 ds-cDNA의 구축

상기 제5항에서 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드 Psw²및 Psw¹¹을 단리하였다.

더우기, PAL mRNA에 상당하는 충분한 길이를 갖는 완전한 cDNA는, P^sw2및 P^sw11을 조합하는 것에 의해 구축가능한 것이 명확하게 되었기 때문에, 각각을 함유하는 형질전환세포로부터 플라스미드를 추출, 정제하고, 제한효소 BanIII로 전달한 후, P^sw2에 있어서는, 제한효소 HindIII로 절단하고, 아가로우즈겔 전기영동에 의한 분획을 행하고, 4.2kb의 크기의 DNA 단편을 회수하고, 페놀-클로로포름 혼합액처리 및 냉에탄올 침전조작을 각각 수회 반복하여 이 DNA 단편을 구축하였다.

한편, P^sw11은 제한효소 BanIII 및 HindIII로 절단한 후, 전기영동에 의해 0.8kb의 DNA 단편을 회수하여 정제하였다.

4.2kb및 0.8kb의 각각의 DNA 단편을 T₄DNA 리가아제에 의해 환상으로하고, 이 생성물에서 대장균(JM 83, ATCC 35607) [Messing, J. and Vieira, J ., Gene, 19, 259-268(1982)]을 형질전환하였다.

마아커로서 사용한 암피실린내성의 전환체로부터 플라스미드를 추출하고, 각종의 제한효소를 작용시켜서 절단지도를 작성하고, 제1도 및 제3도의 제한효소 절단지도에 나타낸 완전한 길이의 PAL 구조를 가지는 플라스미드 P^sw13을 선택하였다.

(7) 클로운화합 DNA의 염기배열의 결정

상기의 플라스미드 P^SW13을 함유한 클로운으로부터 플라스미드 P^SW13을 단리하고, 그 클로운화 DNA 단편을 각종 제한효소로 분해하고, 적당한 제한효소 단면에 대해서, 각각 DNA의 염기배열 분석을 Maxan-Gilbert법 (화학분해법)에 의해, 또 Maat법[Maat, J., 등, Nucleic Acids Research, 5, 4537∼4545,(1978)]에 의한 Dideoxy법에 의해 생화학적으로 행했다. 얻어진 각각의 DNA 단편의 염기배열의 결과를 일본국 미쓰이정보 개발(주)제품의 GENAS 프로그램에 의해 DNA 편집을 행하고, 그 염기배열은 제2도(A) ∼ (D)에 도시하고 있는 것이다.

또한, 개시코오돈 및 종료코오돈을 함유하는 PAL 구조유전자는 1∼2151까지의 염기배열을 구성한다.

(8)P^SW101의 구축(제3도 참조)

플라스미드 P^UC13(Pharmacia사 제품) 0.9㎍에 10단위의 제한효소 Sal을 14㎕의 반응배지 [7mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.7mM EDTA, 7mM MgCl₂, 175mM NaCl, 7mM β-메르캅토에탄올 및 0.01% 보빈혈청알부민(이하 BSA로 약칭함.)]중에서, 37℃에서 16시간 작용시키고, 페놀-클로로포름 혼합액처리, 에탄올침전조작을 행하고, 선형 DNA를 얻었다.

이 선형 DNA를 니크(Dick)번역 완충액[50mM Tris-HCl(pH 7.5) 10mM MgCl₂, 0.1mM 디티오트레이톨, 2% BSA, 80μM dATP, 80μM dGTP, 80μM dTTP 및 80μM dCTP]의 존재하에서, DNA 중합효소 I (다까라 수죠(주)사 제품)의 클레노우(Klenow) 단편을 실온에서 30분간 작용시켜, 점착말단을 평활말단으로한 후, 페놀로 단백질을 제거하고, 냉에탄올로 DNA를 침전회수하였다. 이 DNA 단편에 송아지비장으로부터 유래된 인산디에스트리아제(CIP : 베링거만 하임사 제품)을 작용시켜 5'-말단의 인산기를 제거하고, 선형 P^UC13의 자기고리화를 방지하였다.

한편 P^SW13을 함유하는 세포로부터, 이 플라스미드를 추출하고 정제하고, 제한효소 Dra I을 반응배지 (4mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.4mM EDTA 및 50mM NaCl)에서 37℃로 28시간 작동시키고, 이어서 식염액을 가해서 식염농도를 100mM로 하고, 제한효소 EcoR I 및 HindIII를 37℃에서 16시간 작용시켰다.

반응의 완료 후, 반응혼합액을 아가로우즈겔 전기영동에 제공하고, 2.3kb의 크기의 DNA 단편을 겔중에서 회수하고, 페놀로추출, 페놀-클로로포름 혼합액으로 처리, 냉에탄올로 침전시키는 조작을 각각 3회 반복한 후에 PAL cDNA 단편을 얻었다.

이 cDNA 단편에 상술한 니크번역 완충액을 첨가하고, DNA 중합효소 I의 클레노우 단편을 실온에서 45분간 작용시키고, 페놀-클로로포름 혼합액으로 처리 및 냉에탄올로 침전조작을 각각 3회 반복하여, 평활말단을 양단에 가지는 cDNA 단편을 얻었다.

이어서 평활말단을 가지는 P^UC13단편과 평활말단을 가지는 cDNA 단편과를 T₄DNA 리가아제로 결합하여, 환상플라스미드 P^SW101을 구축하였다.

이 하이브리드 플라스미드에서 대장균(JM 83)을 공지의 방법으로 형질변환하고, 암피실린내성 콜로니로부터 세포주(MT-10410, FERM P-8834. 한국기탁번호 : KFCC-10470, 기탁년월일 1988년 1월 8일, 한국종균협회)를 선출하여 PAL 활성을 측정하였다.

(9) P^Ytrp6의 구축 및 형질전환

상기 제8항에 기재한 방법으로 구축한 P^SW101을 Pst I 및 BamH I으로 소화하고, 아가로우즈겔 전기영동 후, 370bp의 DNA 단편을 회수하고, 그것을 2분활하여, 각각 Ban I 및 Bbe I로 소화하였다.

소화 후, 아크릴아미드겔 전기영동에 의해, Ban I 소화물로부터는 70bp의 크기의 단편을 회수하고, BbeI 소화물로부터 280bp의 크기의 DNA 단편을 회수하였다.

70bp의 단편은 DNA 중합효소 I로 처리하여 평활말단으로하고, 이것에 Cla I (BanIII) 링커를 T₄DNA 리가아제로 결합시켰다.

양말단에 결합된 Cla I 링커를 가지는 DNA 단편을 제한효소 BanIII 및 Bbe I으로 소화하였다. 그리고나서, 제5도에 도시한 바와 같이, Cla I 링커를 가지는 DNA 단편과 앞에서 제조된 Bbe I 단편(280bp)을 P^BR322(Pharmacia사 제품)을 제한효소 BanIII 및 BamH I로 소화함에 의해 얻어진 4.0kb 단편에 T₄DNA 리가아제를 결합시켜, 플라스미드 P^SYA1을 구축하였고, 공지의 칼슘법에 따라 플라스미드 P^SYA1으로 대장균(MC-1061)을 형질전환하였다. P^SYA1을 도입하는 대장균을, 3ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지[Bacto-Tryptone(Difco사, 등록상표) 10g, Bacto-Yeast Extract(Difco사, 등록상표) 5g, NaCl 5g, 글루코오스 1g 및 증류수 1l로 구성, 또한 NaOH로 7.5pH로 조정]에서 37℃로 배양하였다. 이 배양세포를 원심분리하여 집균하고, 50mM 글루코오스, 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 10mM EDTA로 구성된 60㎕용액중에 현탁시켜 세포현탁액을 만들었다. 여기에, 40㎕의 10mg/ml 리소조온용액을 첨가하고 이 반응혼합액을 실온에서 5분간 방치하였다. 반응종료 후, 여기에 1% S0S를 함유하는 200㎕의 0.2N NaOH를첨가하고, 서서히 교반한 후, 얼음위에 5분동안 방치하였다. 그리고나서 여기에 150㎕의 5M 아세트산나트륨용액 (pH 4.8)을 첨가하여 서서히 교반한 후, 반응혼합물을 얼음위에 놓고 반응을 정지시켰다.

이 결과의 용해물을 1200rpm으로 10분간 원심분리하고 상청액을 분리하였다. 이 상청액을, 페놀-클로로포름 혼합액으로의 처리 및 냉에탄올로의 침전조작을 3회 반복하였다.

이와 같이해서 얻은 침전물로부터, 종래방법에 따라 P^SYA1을 추출하였다. P^SYA1을 BamH I 및 BanIII로 소화한 후, 350bp의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다.

이와는 별도로, 상기 제6항에서 구축한 플라스미드 P^SW13을 Xba I으로 소화시키고 이 결과의 점착말단을 DNA 중합효소 I로 처리하여 평활말단을 만들었다. 여기에 T₄DNA 리가아제로 HindIII 링커를 결합하여 P^SW13H를 구축하였다. 그리고나서, 이 P^SW13H를 BamH I 및 HindIII로 소화하였다. 이 결과의 DNA 단편 혼합액을 아가로우즈겔 전기영동을 행하여, 1.9kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다.

한편, 대장균의 trp 오페론의 일부를 함유하는 플라스미드 P^VV1[Brian P. Nicols and Clarles Yanofsky, Methods in Enzymology 101, 155(1983)]을 제한효소 Hinf I으로 소화하였다.

소화된 플라스미드 DNA 단편을 아가로우즈겔 전기영동으로 분리하고, 상술한 방법에 따라 겔로부터 0.9kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다.

Hinf I으로 소화하여 만든 0.9kb DNA 단편의 점착말단을, 상기 제8항에 기술한 방법에 따라 평활말단으로 변환하고, T₄DNA 리가아제를 사용하여 EcoR I 링커 (GGAATTCC)를 5'-말단에 결합하였다.

EcoR I 링커를 갖는 DNA 단편에 제한효소 EcoR I을 작용시켜 EcoR I 절단점착말단을 갖는 DNA 단편을 만들었다[Brian P. Nicols and Charles Yanofsky, Methods in Enzyrmology, 101, 155(1985)].

T₄DNA 리가아제를 사용하여, EcoR I 점착말단을 갖는 DNA 단편을, P^BR322의 EcoR I 소화물을 상기 제8항에 기재한 방법에 따라 CIP로 처리하여 얻은 DNA 단편에 결합하였다. 이 결과의 생성물을 제한효소 EcoR I 및 BgIII로 소화하고, 이 소화물을 아가로우즈겔 전기영동을 행하여 0.4kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 분리, 회수하였다.

제한효소 Taq I의 절단위치 3개를 함유하고 있는 이 0.4kb DNA 단편을 Taq I으로 부분적으로 소화하여 345bp의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다.

이 345bp DNA 단편을, 제한효소 EcoR I 및 Cla I으로 P^BR322를 소화시켜 얻은 4.3kb DNA 단편과 결합시켜 trp 프로모우터를 갖는 플라스미드 P^Ftrp2를 얻었다.

상술한 방법으로 구축한 플라스미드 P^Ftrp2를 제한효소 BanIII 및 HindIII로 소화하고, 이 결과의 단편 혼합액을 아가로우즈겔 전기영동을 행하여 4.7kb의 단편을 회수하였다. 그리고나서, 제6도에 도시한 바와같이, 이 4.7kb 단편을, 앞에서 제조한 350bp의 BamH I＋BanIII 단편 및 앞에서 제조한 1.9kb의 BamHI + HindIII 단편과 T₄DNA 리가아제를 사용하여 결합하여, 제7도에 도시한 바와 같이 환상플라스미드P^SYA2를 구축하였다.

또한, 플라스미드 P^SYA2를 BanIII로 부분소화하고, 이 결과의 점착말단을 DNA 중합효소 I로 처리하여 평활말단을 만들었다. 이 단편을 T₄DNA 리가아제를 사용하여 고리화하여 Nru I 절단위치를 갖는 플라스미드 P^Ytrp6(제7도)를 구축하였다.

공지방법에 따라 플라스미드 P^Ytrp6를 사용하여 대장균 MC-1061을 형질전환하였다. 이 결과의 암피실린내성 콜로니로부터 세포를 선택하고 PAL 활성을 측정하였다. PAL 활성을 나타내는 대장균의 형질전환한 균주를 단리하여 MT-10414, (FERM P-8876, 한국기탁번호 : KFCC-10472, 기탁년월일 1988년 1월 8일 한국종균협회)라고 명명하였다.

플라스미드 P^Ytrp6의 구축공정의 순서는 제4도에 개략적으로 예시하였고, 제5도, 제6도, 제7도에서 상세하게 예시하였다.

참고예 2

(플라스미드 P^SW115의 구축)

본 참고예에 있어서의 각각의 플라스미드의 구축공정의 개략도를 제8도에 도시하고 있다.

(1) 제9도에 예시된 공정에 따른 플라스미드 P^Tac11의 구축

먼저, 참고예 1에 기재된 방법에 따라서 얻어진 로도스포리듐-토루로이드의 PAL 구조유전자가 클로운화되어 있는 플라스미드 P^Ytrp6을 가지는 대장균 MT 10414(FERM P-8876, 한국기탁번호 : KFCC-10472)주로부터 추출된 플라스미드 P^Ytrp6를 제한효소 Nru I 와 HindIII로 소화하여 얻어진 DNA 단편 혼합물로부터 전기영동법에 의해서 2.4kbp의 크기의 DNA 단편을 분리회수하였다.

이와는 별도로, tac 프로모우터를 가지는 플라스미드 P^KK223-3(Phamarcia사 제품)을 제한효소 EcoR I 로 소화하고, DNA 단편을 얻은 후, 이들 DNA 단편의 점착말단을 DNA 중합효소 I 를 사용하여 평활말단으로 변환하였다.

그후, 이와 같이하여 얻어진 점착말단을 가지는 DNA 단편과, 먼저 얻은 2.4bP의 DNA 단편과를, T₄DNA 리가아제의 존재하에 반응시킨 후, 얻어진 반응생성물을 S. N. Cohen 등의 방법에 의해서 대장균(MC-1061)에 도입하였다[Cohen, S. N. 등., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1982)].

이어서, 이 반응생성물이 도입된 대장균을, 암피실린을 50ug/ml의 농도로 함유하는 LB 배지에 한천을 1.5% 첨가하여 암피실린 플레이트에서 배양하였다. 배양 후, 플레이트상에 출현한 암피실린내성의 클로니의 각각으로부터 하나하나 플라스미드를 추출하고, 각 플라스미드의 제한효소지도를 제작하고, 목적으로하는 제9도에 도시된 바와 같은 구성의 플라스미드 P^Tac11을 가지는 클로니를 확인하였고, 더우기 이 클로니에서 플라스미드 P^Tac11을 단리하였다.

(2) 제10도에 예시된 공경에 따른 플라스미드 P_L ^P-PAL-head의 구축

플라스미드

(Pharmacia사 제품)를 제한효소 EcoR I 와 HPa I 로 소화하고, 얻어진 DNA 단편 혼합물로부터 전기영동법에 의해 470bp의 DNA 단편을 분리회수하였다. 이 470bp의 DNA 단편을 다음에 제한효소 Hinf I 로 부분소화하고, 얻어진 DNA 단편 혼합물로부터 전기영동법에 의해 370bp의 DNA 단편을 분리회수하였다.

더우기, 이 370bp의 DNA 단편의 말단을 DNA 중합효소 I 를 사용해서 평활말단화하였기 때문에, 그것을 T₄DNA 리가아제의 존재하에서 Cla I 링커와 반응시켰다. 반응완료 후, 얻어진 반응생성물을 제한효소 EcoR I 와 Cla I 로 소화하여 크고 작은 EcoR I -Cla I DNA 단편을 함유하는 혼합물을 얻었다.

이와 달리, 앞에 표시한 참고예 1에 있어서의 로도스포리듐-토루로이드의 구조유전자의 클로우닝과정에서 구축한 플라스미드 P^SYA2를, 제한효소 EcoR I로 소화한 후, 얻어진 DNA 단편을, 더우기 제한효소 Cla I 로 부분소화하고, 얻어진 대소의 2종의 DNA단편의 혼합물로부터 전기영동법에 의해서 큰 DNA 단편을 추출분리하였다.

다음에, 이렇게해서 얻어진 플라스미드 P^SYA2유래의 큰 DNA 단편과, 앞에 얻은 EcoR I -Cla I 단편을 함유하는 혼합물과를 T₄DNA 리가아제의 존재하에 반응시키고, 얻어진 반응생성물을 대장균(MC-1061)에 도입하고, 이것을 암피실린 플레이트에서 배양하였다. 배양 후, 암퍼실린 플레이트상에 출현한 각각의 콜로니로부터 플라스미드를 조제하고, 그 제한효소 절단지도를 제작하고, 목적으로하는 제10도에 도시한 구성의 플라스미드

을 가지는 콜로니를 확인하고, 이 콜로니로부터 플라스미드

을 단리하였다. 이 콜로니를 MT-10424(FERM P-9024)라 명명하였다.

더우기, 이렇게해서 얻어진 플라스미드

을 EcoR I 와 BamH I 로 소화하고, 얻어진 대소 2종의 DNA 단편의 혼합액으로부터 전기영동법에 의해서 작은 DNA 단편을 분리회수하였다.

다음에, 플라스미드 P^BR322(Pharmarcia사 제품)을 제한효소 EcoR I 와 BamH I 로 소화하고, 얻어진 대소 2종의 DNA 단편의 혼합액으로부터 전기영동법에 의해서 큰 DNA 단편을 분리회수한 후, 큰 DNA단편과 앞에 얻은 플라스미드

유래의 작은 단편과를, T₄DNA 리가아제의 존재하에 반응시키고, 제10도 구성의 플라스미드

를 얻었다. 또한, 여기서 목적의 플라스미드가 얻어졌는지 어떤지는, T₄DNA 리가아제를 사용한 반응에서 생성된 반응생성물을 대장균(MC-1061)에 도입하고, 이것을 암피실린 플레이트에서 배양하고, 암피실린 플레이트상에 출현한 각각의 콜로니로부터 플라스미드를 제조하고, 그 제한효소 절단지도를 작성하는 것으로 확인하였다.

(3) 제11도에 예시된 공정에 따른 플라스미드 P^SW115의 구축

우선, 상기(1)항에서 얻은 플라스미드 P^Tac11을 제한효소 EcoR I 와 Aat I 로 소화하고, 얻어진 대소 2종의 DNA 단편의 혼합물로부터 전기영동법에 의해 작은 DNA 단편을 분리회수하였다.

마지막으로 이렇게해서 얻은 플라스미드 P^Tac11유래의 큰 DNA 단편과 플라스미드

유래의 작은 DNA 단편과를 T₄DNA 리가아제의 존재하에 반응시켜서 결합하여, 플라스미드 P^SW115를 얻었다.

또한, 목적으로하는 플라스미드가 얻어졌는지 어떤지는, 얻어진 플라스미드를 대장균(MC-1061)에 도입하여, 형질전환주를 암피실린 플레이트에서 선택하고, 암피실린내성을 가지는 각각의 형질전환주로부터 플라스미드를 조제하고, 그것들의 제한효소 절단지도를 제작함과 동시에, 형질전환주의 PAL 활성을 후술하는 방법에 의해서 측정하여 확인하였다. 여기서 얻어진 PAL 활성을 가지는 형질전환 대장균주를 MT-10423(FERM P-9023)로 하였다.

(4) 플라스미드 P^SW115에 의한 PAL의 발현

상기(3)항에서 얻은 플라스미드 P^SW115가 도입된 형질전환 대장균을 앞에서 암피시린 플레이트의 조성에 사용한 LB 배지 (pH 7.5)에 암피실린을 50㎍/ml의 농도로 첨가한 배지에 접종하고, 이것을 30℃에서 진탕(振湯)배양하였다.

20시간의 배양에 의해 660mm에서의 흡광도(optical densitg : O.D.)가 5.40을 나타내는 배양균체 농도가 얻어지기 때문에, 배양액에서 균체를 원심분리에 의해서 모으고, 얻어진 균체의 PAL 활성을 이하의 방법에 따라서 측정하고, 건조균체중량에 대한 비활성을 산출한 바, 630U/g 건조균체중량(g)이었다.

PAL 활성의 측정:

균체추출의 PAL 활성은 신남산이 L-페닐알라닌에서 합성된 효소반응을 사용하여 다음과 같이 측정된다.

균체를 원심분리에 의해서 배양액으로부터 집균하고, 집균한 균체를 0.85% 식염수에 현탁시키고 다시 원심분리를 거쳐서 세정한 후, 세정균체를, 25mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.8)에 습중량으로 1%로 되도록 현탁하고, 이 현탁액을, 그 조성이 25mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.8), 25mM L-페닐알라닌, 0.005% 세틸피리듐 염산염으로 되도록한 효소반응액에 첨가해서, 이것들을 30℃, 20분간 반응시켰다. IN-HCl을 첨가하여 반응을 종료시키고, 반응액중에 생성된 신남산의 양을 액체 크로마토그래피로 분석하여 PAL 활성을 측정하였다. 여기서의 1U(Unit)는 1분당 1마이크로몰의 신남산을 생성시키는 효소량에 상당한다.

또한, 상기의 건조균체중량은, 세정균체를 건조하여 측정하였다.

또한, 이상의 참고예 2에 있어서의 조환체 플라스미드의 대장균으로의 도입은 S. N. Cohen 등의 방법[S. N. Cohen, 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69, 2110(1982)]을 사용하여 행하였다. 또, 제한효소, T₄DNA 리가아제, DNA 중합효소 I를 사용한 플라스미드와 DNA 단편의 처리 및 균체에서의 플라스미드의 조제는, 특별히 지정되어 있는 경우 이외는 통상적으로 사용되고 있는 방법에 의해서 행하였다. 또한, 제한효소류, 링커, T₄DNA 리가아제 및 DNA 중합효소 I 는 특별히 지정하지 않는한 Takara Shuzo K. K. 제품을 사용하였다.

실시예 및 비교예

이하 본 발명의 실시예 및 비교예를 설명한다.

이하의 실시예 및 비교예에서 사용되고 있는 배지는 다음과 같이하여 조제하였다.

LB-AP배지 :

이하 조성의 LB-AP배지를 120℃에서 15분의 조건으로 오토클레이브로 처리한 후, 앰피실린(AP)을 무균적으로 50㎍/ml의 농도에서 첨가하여 조제하였다.

LB배지조성 :

트립톤 10g

이이스트 추축물 5g

글루코오제 1g

NaCl 5g

증류수 1l

(KOH에 의해 pH 7.2로 조정)

LB 한천 배지 :

상기 조성의 LB배지에 한천을 15g/1의 비율로 가하고, 이것을 오토클레이브로 처리 (120℃에서 15분)하고, petri접시에 유입하여 LB한천배지 플레이트로 하였다.

LB-AP한천 배지 :

상기 조성의 LB배지에 한천을 15g/1의 비율로 가하고, 이것을 오토클레이브로 처리(120℃, 15분)한 후, 거기에 AP를 20㎍/ml의 농도로 무균적으로 첨가하므로서 Petri접시에 유입하여 LB-AP한천 배지 플레이트로 하였다.

합성배지 :

이하의 각 성분을 증류수 1l에 가하고, 더우기 KOH로 pH를 7.2로 조정하였다.

폴리펩톤 10g

이이스트 추축물 5g

인산이칼륨 1g

황산마그네슘·2H₂O 0.5g

실시예 1

LB-AP한천 배지에, 참고예 2에서 얻은 AP내성을 코오드하는 유전자를 함유하는 벡터에 tac프로모우터의 연결모우터 하류에 PAL구조유전자가 삽입된 구성의 Hi-플라스미드 pSWl15를 유지하는 대장균 MT-10423(FERM P-9023)을 도포하고, 37℃에서 배양하였다.

출현한 콜로니로부터 균체를 면마개부착 시험관중의 AP함유 LB배지 (5ml)에 접종하고, 이 것을 42℃에서12시간, 110스트로크/분에서 진탕하여 배양하였다. 배양종료 후, 배양액 (배양균체를 함유한다)의 15㎕를 종배양으로 2개의 면마개부착시험관내에 준비한 새로운 5ml의 AP함유 LB배지의 각각에 접종하고, 한쪽을 41℃로, 다른쪽을 30℃로 상기와 마찬가지의 조건에서 각각 진탕하여 배양하고, 배양액 No 1-1(41℃, 12시간배양), 배양액 No 1-2(30℃, 20시간 배양)을 얻었다.

다음에, 배양액 No 1-1에서 배양액(배양균체를 함유한다)의 15㎕를 종배양액으로서 2개의 면마개부착시험관내에 준비한 새로운 5ml의 AP함유 LB배지의 각각에 접종하고, 한쪽을 42℃로, 다른쪽을 30℃로 상기와 마찬가지의 조건에서 각각 진탕하여 배양하고, 배양액 No.1-3(42℃, 12시간배양), 배양액 No.1-4(30℃, 20시간배양)을 얻었다. 더우기 제12도에 표시한 바와 같은 조건에서 행하는 이외는 상기와 마찬가지의 배양조작을 반복하고, 배양액 No.1-5배양액 No. 1-4, No.1-6, No.1-7을 각각 얻었다.

또한, 배양액 (No.1-2, No.1-4, No.1-6, No.1-7에 있어서는, 배양종료 후 즉각 원심분리에 의해서 집균하고 이것을 0.85% NaCl수용액에 현탁하여 세정 후, 다시 원심분리해서 회수한 균체를 동결보존하여 왔다.

다음에, 각각의 동결보존균체를 해동하고, 균체추출액을 조제하고, 각각의 PAL비활성을 이하와 같이해서 구했다.

그 결과를 표 2에 표시하였다

균체추출액의 조제 :

해동균체를 습균체농도 1%의 균체농도되도록 0.05M Tris-HCl완충액(pH 8.8)에 현탁시킨 상태에서 초음파 처리하여 균체를 파쇄하고, 더욱기 이 용액으로부터 원심분리에 의해서 세포부스러기등을 제거하여 균체추출액을 조제 하였다.

PAL활성의 측정 :

각각의 추출액의 PAL활성은, L-페닐알라닌으로부터 신남산을 생성하는 효소반응을 이용하여 이하의 조작에 따라서 구했다.

먼저, 균체추출액을 25mM Tris-HCl완충액(pH 8.8)으로 습균체 농도 1% 정도로 희석하고, 그 10ml를, 31.25mM의 L-페닐알라닌을 함유하는 4.0ml의 31.25mM Tris-HCl완충액에 첨가하고, 30℃ 20분간 반응시켰다. 1ml의 1N-HCl의 첨가에 의해서 반응을 종료시키고, 반응액속에 생성한 신남산양을 이하의 조건에서의 액체 크로마토그래피에 의해 분석하고 그 활성을 측정하였다.

또한, 여기서의 1U(Unit)는 1분당 1마이크로몰의 신남산을 생성하는 효소량에 상당한다.

액체크로마토그래피조작조건 :

분리 컬럼 YMC Pack A-312(일본국 야마무라 화학연구소 제품)을 이용하고, 이동위상에 메탄올 : 물 : 인산=50 : 41 : 0.08v/v를 사용하여, 신남산의 검출을 자외분광 광도계(검출파장 260nm)로 행했었다.

또, PAL비활성의 산출에 사용한 균체량은 세정균체를 건조하여 구했다.

비교예 1

실시예 1에 있어서의 40℃ 이상에서의 배양을 제13도에 표시한 온도로 변경하는 것 이외에는, 실시예 1과마찬가지로해서 배양조작을 반복하고, 배양액 No.2-1∼2-7을 얻었다. 그 결과를 표 2에 표시하였다.

[표 2]

*건조중량

실시예 2

대장균 MT-10423주의 대신에, 참고예 2에서 얻은 AP내성을 코오드하는 유전자를 함유한 벡터에, P_L람다프로모우터/오퍼레이터가 결합한 발현벡터의 상기 프로모우터/오퍼레이터 하류에 PAL구조 유전자가 삽입된 구성의 Hi-플라스미드 pSYP_L-3을 유지하는 대장균 MT-10424주(FERM P-9024)를 이용하고, 제14도에 표시한 배양온도에서 배양하는 이외는 실시예 1과 마찬가지로하여, 배양액 NO. 3-1∼3-7을 얻었다.

더우기, 배양액 No. 3-2, No.3-4, No.3-6, No.3-7로부터 실시예 1과 마찬가지로해서 동결보존균체를 조제하고, 또한 PAL비활성을 구했다. 그 결과를 표 3에 표시하였다.

비교예 2

대장균 MT-10423주의 대신에, 실시예 2에서 사용한 Hi-플라스미드 pSYP_L-3을 유지하는 대장균MT-10424주를 사용하고, 제15도에 표시한 배양온도에서 배양하는 이외는, 비교예 1과 마찬가지로하여,배양액 No 4-1∼4-7을 얻었다.

더우기 배양액 No.4-2, No.4-4, No.4-6, No. 4-7로부터 실시예 1과 마찬가지로해서 동결보존 균체를 조제하고 또한 PAL비활성을 구했다. 그 결과를 표 3에 표시하였다.

[표 3]

*건조중량

표 2 및 표 3의 결과로부터 명백해지는 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2에 있어서의 배양온도 40℃ 이상으로의 재배양의 후에 배양온도 30℃에서 배양하였다. 즉, 본 발명에서 말하는 제℃ 및 제2배양과정을 경유해서 얻어진 배양균은, 제1배양균은, 제1배양과정에 있어서의 재배양회수가 증가하여도 PAL비활성의 저하는 인정되지 않았다.

이것에 대하여, 비교예 1 및 비교예 2에 있어서의 배양온도 40℃ 미만에서의 재배양 후에, 배양온도 30℃에서 배양한 배양균은, 재배양회수가 증가하였기 때문에 PAL비활성이 현저하게 저하하였다.

또한, 각각의 예에서 얻어진 각각의 배양액에서 균체를 LB-AP한천배지와 LB한천배지에 각각 동량도포하고, 이것들은 37℃에서 배양하고, 생성된 콜로니수를 비교해서 배양균당 AP내성 소실균(Hi-플라스미드탈락균)의 비율을 조사하였다.

그결과, 40℃ 이상에서의 재배양에 있어서의 배양균당 AP내성소실균의 배율은 3회재배양 후에 1% 이하로 있었던 것에 대해서, 40℃ 미만에서의 재배양에 있어서의 배양균당 AP 내성소실균의 비율은 3회 재배양후에 80%에 도달하였다.

실시예 3

참고예 1에서 얻은 AP내성을 코오드하는 유전자를 함유한 벡터에 trp프로모우터를 연결한 발현벡터의 상기 프로모우터 하류에 구조유전자가 삽입된 구성의 Hi-플라스미드 pYtrp6을 유지하는 대장균 MT-10414주(FERM P-8876)를 견부(付肩)플라스크 내의 LB-AP배지 50ml속에 42℃에서 12시간 진탕 배양하였다.

다음에, 합성배지 1.0l를 2l의 최소량 발효단지에 집어넣어서, 살균처리 후, 또한 AP를 50mg 무균적으로 첨가한 후, 더우기 상기의 대장균 MT-10414주의 배양액 30ml를 첨가하고, 배지를 통기교반하면서 배양을 개시하였다. 그때, 42℃에서 배양을 개시하고, 균의 증식이 대수기의 중기에 당도하는 6시간 후에 배양온도를 30℃로한 후, 18시간 배양하였다. 또, 배양기간을 지나는 배지의 pH은 7.0으로 조정하였다.

배양종료 후, 배양균체를 원심분리하여 집균하고, 게다가, 0.85% NaCl수용액에 현탁하여 세정 후, 다시 원심분리해서 집균하고, 이것을 습균체농도 1%의 균체농도가 되도록 0.05M Tris-HCl완충액(pH 8.8)에 현탁시키고, 이하 실시예 1과 마찬가지로해서 균체추출액을 조정하고, PAL비활성을 구한바, 270U/g.cell 건조중량이었다.

비교예 3

각각의 배양조작에 있어서의 배양온도를 전부 30°로하는 이외는 실시예 3과 마찬가지로해서 배양을 행하고, 배양균체의 PAL비활성을 구한바 45U/g.cell 건조중량이었다.

또, 상술한 방법과 마찬가지로 해서, Hi-플라스미드탈락균의 발생에 대해서 조사한 바, 24시간 배양 후의 배양균당 AP내성소실균의 비율은 실시예 3에서는 10% 정도이었던 것에 대해서, 비교예 3에 있어서는 85% 정도이었다.

실시예 4

실시예 1에서 사용한 Hi-플라스미드 pSW 115를 유지하는 대장균주 MT 10423주(FERM P-9023)을 LB-AP 한천배지에 도포하고, 이것을 37℃에서 배양하였다.

출현한 콜로니로부터 균체를 살균제의 시험관속의 AP함유 LB배지 (0.5ml)에 현탁시키고, 이 균체현탁액을 50㎕씩 5개의 새로운 5ml의 AP함유 LB배지에 넣어, 면마개부착 시험관에 각각 분주하고, 표 3에 표시한 각각의 온도에서 24시간 110스트로크/분로 진탕하여 배양을 행하고 배양종료 후 즉시 원심분리에 의해서 집균하고, 이것을 85% NaCl수용액에 현탁하고 세정 후, 다시 원심분리로 회수한 균체를 동결보존하여 왔고, 해동 후 그 PAL활성을 실시예 1과 마찬가지로해서 구했던(표 4)바, 배양온도를 조절하는 것에 의해 외래 유전자의 발현이 제어될 수 있음을 확인할 수 있었다.

[표 4]

* 건조중량

상술한 균주중에서 ATCC(번호를 갖는 것들은 American Type Culture Collection(미합중국, 메릴랜드20852-1776, 로크빌, 파크로운다 1230)에 기탁되어 있고 IFO번호를 갖는 것은 Fermentation Fesearch Institute(법인체, 일본국, 오오사까시, 요도가와국 주조-모토마찌 2-죠오메 17-85)에, FERM번호를 갖는 것들을 Fermentaion Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology(공업기술원 미생물공업기술연구소, 일본국 이바라끼껭 쯔구바시 히가시 1죠오메 1-3)에 기탁되어 있다.

ATCC번호 및 IFO번호를 갖는 것들은 공적으로 이용할 수 있다.

FERM번호를 갖는 것들은 특허를 목적으로 본 출원인에 의해 아래일자로 "사단법인 한국종균협회"에 재기탁되었다.

Claims

발현벡터에 바라던 외래유전자를 삽입한 조환체플라스미드를 도입하고 이 외래유전자의 발현을 가능하게 한 대장균의 배양시 이 대장균에서의 상기 외래유전자의 발현을 제어하는 방법에 있어서, 이 대장균의 배양온도를 40℃ 이상으로 유지하는 것에 의해 상기 외래 유전자의 발현을 제어하는 것을 특징으로 하는 외래유전자의 발현 제어방법 .
제1항에 있어서, 상기 외래유전자는 L-페닐알라닌 암모니아리아제 구조유전자인 것을 특징으로 하는 외래유전자의 발현제어방법.
제2항에 있어서, 상기 L-페닐알라인 암모니아리아제는 아래에 표시한 아미노산 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 외래유전자의 발현제어방법.
제1항에 있어서, 상기 대장균은 조환체플라스미드 pSYP_L-3을 유지하는 대장균 MT 10424주(FERMP-9024)인 것을 특징으로 하는 외래유전자의 발현제어방법.
제1항에 있어서, 상기 대장균은 조환체플라스미드 pYtrp6을 유지하는 대장균 MT 10414주(FERMP-8876)인 것을 특징으로 하는 외래유전자의 발현제어방법.
제1항에 있어서, 상기 대장균은 조환체플라스미드 pSW 115를 유지하는 대장균 MT 10423주(FERM P-9023)인 것을 특징으로 하는 외래유전자의 발현제어방법.
발현벡터에 바라던 외래유전자를 삽입한 조환체플라스미드를 도입하고 이 외래유전자의 발현을 가능하게한 대장균을 배양하고 이 외래 유전자를 발현시켜서 이 외래유전자에 코오드된 외래유전자산뮬을 생산하는 방법에 있어서, a) 40℃ 이상으로 배양온도를 유지해서 상기 대장균을 배양하는 제1배양과정과, b)이 제1배양과정에서 증식한 대장균을 40℃ 미만의 배양온도에서 배양하는 제2배양과정을 가지는 것을 특징으로 하는 대장균에서의 외래유전자산물의 생산방법 .
제7항에 있어서, 상기 외래유전자 산물은 L-페닐알라닌 암모이나아리아제인 것을 특징으로 하는 대장균에서의 외래유전자 산물의 생산방법.
제8항에 있어서, 상기 L-페닐알라닌 암모니아리아제는 제3항에 표시한 아미노산 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 대장균에서의 외래유전자 산물의 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 대장균은 조환체플라스미드 pSYP_L-3을 유지하는 대장균 MT 10424주(FERMP-9024)인 것을 특징으로 하는 대장균에서의 외래유전자 산물의 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 대장균은 조환체플라스미드 pYtrp6을 유지하는 대장균 MT 10414주(FERMP-8876)인 것을 특징으로 하는 대장균에서의 외래유전자 산물의 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 대장균은 조환체플라스미드 pSW 115을 유지하는 대장균 MT 10423주(FERM P-9023)인 것을 특징으로 하는 대장균에서의 외래유전자 산물의 생산방법.