JPS63202386A - 外来遺伝子の発現制御方法及び該方法を用いた外来遺伝子産物の生産方法 - Google Patents
外来遺伝子の発現制御方法及び該方法を用いた外来遺伝子産物の生産方法Info
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- JPS63202386A JPS63202386A JP62034397A JP3439787A JPS63202386A JP S63202386 A JPS63202386 A JP S63202386A JP 62034397 A JP62034397 A JP 62034397A JP 3439787 A JP3439787 A JP 3439787A JP S63202386 A JPS63202386 A JP S63202386A
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、所望の外来遺伝子を挿入した組換え体プラス
ミド［ハイブリッドプラスミド（以後器−プラスミドと
称する）］を導入した大腸菌を、該外来遺伝子の発現を
効果的に制御しながら効率良く増殖させるのに有用な外
来遺伝子の発現制御方法、および該制御方法を用いて菌
体の増殖と外来遺伝子の発現の時期を分離した旧−プラ
スミド導入大腸菌の培養による外来遺伝子産物の生産方
法に関する。
ミド［ハイブリッドプラスミド（以後器−プラスミドと
称する）］を導入した大腸菌を、該外来遺伝子の発現を
効果的に制御しながら効率良く増殖させるのに有用な外
来遺伝子の発現制御方法、および該制御方法を用いて菌
体の増殖と外来遺伝子の発現の時期を分離した旧−プラ
スミド導入大腸菌の培養による外来遺伝子産物の生産方
法に関する。
近年、遺伝子組換え技術の発達により、宿主菌での外来
遺伝子の形質発現を可能とする発現ベクターに、動物、
植物、微生物等から得た所望の外来ポリペプチドをコー
ドする構造遺伝子を組み込んで旧−プラスミドを構築し
、その旧−プラスミドを導入した宿主菌を培養して、宿
主菌に所望の外来ポリペプチドを生産させる方法が開発
されてきている。
遺伝子の形質発現を可能とする発現ベクターに、動物、
植物、微生物等から得た所望の外来ポリペプチドをコー
ドする構造遺伝子を組み込んで旧−プラスミドを構築し
、その旧−プラスミドを導入した宿主菌を培養して、宿
主菌に所望の外来ポリペプチドを生産させる方法が開発
されてきている。
この技術により、例えばヒトインシュリン、ヒト成長ホ
ルモン等の有用物質の大量生産が可能となりつつある。
ルモン等の有用物質の大量生産が可能となりつつある。
このような遺伝子組換え技術を用いた外来遺伝子産物を
生産するために用いる宿主菌としては、その生物学的特
性の解析が十分になされており、また病原性を持たず、
簡単な組成の培地で容易に培養可能であるという点から
大腸菌が広く用いられている。
生産するために用いる宿主菌としては、その生物学的特
性の解析が十分になされており、また病原性を持たず、
簡単な組成の培地で容易に培養可能であるという点から
大腸菌が広く用いられている。
ところが、一般に旧−プラスミドの大腸菌内での安定性
は必ずしも高くなく、それを導入した大腸菌の培養では
、菌の増殖にともなって旧−プラスミドの構造的変化や
旧−プラスミド自体の消滅により外来遺伝子の発現能を
失った旧−プラスミド脱落菌が出現してくる。
は必ずしも高くなく、それを導入した大腸菌の培養では
、菌の増殖にともなって旧−プラスミドの構造的変化や
旧−プラスミド自体の消滅により外来遺伝子の発現能を
失った旧−プラスミド脱落菌が出現してくる。
例えば、大量培養を行なう工業的規模での生産では、一
般に本培養に必要な菌体量や菌体活性を得るための前培
養を含めて培養期間が比較的長くなり、上記のようなＨ
ｉ−プラスミド説落菌の出現が避けられず、しかも全培
養菌あたりの旧−説落菌の割合が高くなると、最終的に
得られる培養物中の所望の外来遺伝子産物の濃度の低下
を招き、効率良い外来遺伝子の生産ができない。
般に本培養に必要な菌体量や菌体活性を得るための前培
養を含めて培養期間が比較的長くなり、上記のようなＨ
ｉ−プラスミド説落菌の出現が避けられず、しかも全培
養菌あたりの旧−説落菌の割合が高くなると、最終的に
得られる培養物中の所望の外来遺伝子産物の濃度の低下
を招き、効率良い外来遺伝子の生産ができない。
そこで、このようなＨｉ−プラスミドを用いた培養にお
ける問題点を解決する手段の一つとして、菌の増殖と外
来遺伝子の発現時期とを分離させる方法が検討されてい
る。
ける問題点を解決する手段の一つとして、菌の増殖と外
来遺伝子の発現時期とを分離させる方法が検討されてい
る。
具体的には、まず導入された旧−プラスミドの外来遺伝
子の発現を制御しつつ該プラスミド導入菌を培養し、所
望の菌体量が得られたところで、発現の制御を緩和して
外来遺伝子を発現させて、旧−プラスミド脱落菌の発生
を極力抑え、より効率良く外来遺伝子産物を生産しよう
とするものである。
子の発現を制御しつつ該プラスミド導入菌を培養し、所
望の菌体量が得られたところで、発現の制御を緩和して
外来遺伝子を発現させて、旧−プラスミド脱落菌の発生
を極力抑え、より効率良く外来遺伝子産物を生産しよう
とするものである。
このような方法に用いられる外来遺伝子の発現制御方法
としては、例えば、 旧−プラスミドに、大腸菌ラムダ
ファージの１プロモーター（ＰＬラムダプロモーター）
・オペレーターや大腸菌トリプトファンオペロンのプロ
モーター（ｔｒｐプロモーター）・オペレーター等のレ
プレッサーを不活性化する誘導試薬の添加によって任意
の時期に開始領域を持つ（すなわちその複製開始に必要
な所定の温度もしくは温度範囲を有する）温度制御型の
ベクターを用い、培養温度を調節することによフて外来
遺伝子の発現を制御する方法が知られている。
としては、例えば、 旧−プラスミドに、大腸菌ラムダ
ファージの１プロモーター（ＰＬラムダプロモーター）
・オペレーターや大腸菌トリプトファンオペロンのプロ
モーター（ｔｒｐプロモーター）・オペレーター等のレ
プレッサーを不活性化する誘導試薬の添加によって任意
の時期に開始領域を持つ（すなわちその複製開始に必要
な所定の温度もしくは温度範囲を有する）温度制御型の
ベクターを用い、培養温度を調節することによフて外来
遺伝子の発現を制御する方法が知られている。
しかしながら、誘導型発現プロモーターを用いた方法で
は、発現誘導のための誘導試薬が高価であるために生産
コストの上昇を招き、更に旧−プラスミド脱落菌の出現
、増加を十分に抑えられないという問題があり、工業的
な規模での培養には適用しにくい。
は、発現誘導のための誘導試薬が高価であるために生産
コストの上昇を招き、更に旧−プラスミド脱落菌の出現
、増加を十分に抑えられないという問題があり、工業的
な規模での培養には適用しにくい。
また、温度制御型のベクターを用いた方法でも、旧−プ
ラスミド脱落菌の出現防止効果が十分でない。
ラスミド脱落菌の出現防止効果が十分でない。
本発明者らは、以上述べたような問題点に鑑み、より効
率良い外来遺伝子産物の生産を実現するために、旧−プ
ラスミド導入大腸菌の培養工学的特性について種々検討
を加えたところ、 旧−プラスミド導入大腸菌の培養温
度を調節するだけで、大腸菌での外来遺伝子の発現を効
果的に制御できることを新たに見い出した。
率良い外来遺伝子産物の生産を実現するために、旧−プ
ラスミド導入大腸菌の培養工学的特性について種々検討
を加えたところ、 旧−プラスミド導入大腸菌の培養温
度を調節するだけで、大腸菌での外来遺伝子の発現を効
果的に制御できることを新たに見い出した。
更に、 旧−プラスミド導入菌を培養して外来遺伝子産
物を生産する際に、このような培養温度の調節による発
現制御方法を用いて外来遺伝子の発現制御時期を操作し
て、菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離すれば、
旧−プラスミド脱落菌の発生が十分に抑えられた良好
な菌体増殖と、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能と
なるとの結論を得て本発明を完成した。
物を生産する際に、このような培養温度の調節による発
現制御方法を用いて外来遺伝子の発現制御時期を操作し
て、菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離すれば、
旧−プラスミド脱落菌の発生が十分に抑えられた良好
な菌体増殖と、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能と
なるとの結論を得て本発明を完成した。
本発明の目的は、 Ｈｉ−プラスミドが導入された大腸
菌の培養において、 Ｈｉ−プラスミドに挿入された外
来遺伝子の発現を簡易な操作によって効果的に制御でき
る方法を提供することにある。
菌の培養において、 Ｈｉ−プラスミドに挿入された外
来遺伝子の発現を簡易な操作によって効果的に制御でき
る方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、培養物に高濃度で所望の外来遺伝
子産物を効率良く生産することができ、特に工業的規模
での旧−プラスミド導入大腸菌による外来遺伝子産物の
生産に好適な方法を提供することにある。
子産物を効率良く生産することができ、特に工業的規模
での旧−プラスミド導入大腸菌による外来遺伝子産物の
生産に好適な方法を提供することにある。
本発明の外来遺伝子の発現制御方法は、発現ベクターに
所望の外来遺伝子を挿入した組換え体プラスミドを導入
して該外来遺伝子の発現を可能とした大腸菌の培養に際
し、該大腸菌での前記外来遺伝子の発現を制御する方法
において、該大腸菌の培養温度を４０℃以上に維持する
ことにより前記外来遺伝子の発現を制御することを特徴
とする。
所望の外来遺伝子を挿入した組換え体プラスミドを導入
して該外来遺伝子の発現を可能とした大腸菌の培養に際
し、該大腸菌での前記外来遺伝子の発現を制御する方法
において、該大腸菌の培養温度を４０℃以上に維持する
ことにより前記外来遺伝子の発現を制御することを特徴
とする。
本発明の方法に用いられる旧−プラスミド（組換え体プ
ラスミド）とは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能と
する構成を有する発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿
入して得られるものである。
ラスミド）とは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能と
する構成を有する発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿
入して得られるものである。
旧−プラスミドを構成する発現ベクターとしては、例え
ば大腸菌で複製可能なベクターと、該ベクターに結合さ
せた、例えばＰＬラムダプロモーター、 ｔｒｐプロモ
ーター、 ｔｒｐプロモーターと大腸菌ラクトースオペ
ロンのプロモーター（Ｉｔ ａｃプロモーター）の融合
プロモーター（ｔａｃプロモーター）とＰＬラムダプロ
モーターの連結プロモーターなどの各種プロモーターと
を有する構成のものなどを挙げることができる。
ば大腸菌で複製可能なベクターと、該ベクターに結合さ
せた、例えばＰＬラムダプロモーター、 ｔｒｐプロモ
ーター、 ｔｒｐプロモーターと大腸菌ラクトースオペ
ロンのプロモーター（Ｉｔ ａｃプロモーター）の融合
プロモーター（ｔａｃプロモーター）とＰＬラムダプロ
モーターの連結プロモーターなどの各種プロモーターと
を有する構成のものなどを挙げることができる。
なお、ここでいう外来遺伝子とは、例えば真核細胞由来
のポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有する
非大腸菌由来のポリペプチドなどの野生型大腸菌では通
常生産されないポリペプチド゛ルゴーにすス虚；告；青
イアーｉ！−ルいう一本発明の発現制御方法は、 旧−
プラスミド導入大腸菌の培養温度を調製することによっ
て旧−プラスミドに組込まれた外来遺伝子の発現を制御
するものである。
のポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有する
非大腸菌由来のポリペプチドなどの野生型大腸菌では通
常生産されないポリペプチド゛ルゴーにすス虚；告；青
イアーｉ！−ルいう一本発明の発現制御方法は、 旧−
プラスミド導入大腸菌の培養温度を調製することによっ
て旧−プラスミドに組込まれた外来遺伝子の発現を制御
するものである。
具体的には、外来遺伝子の発現を制御したい場合には、
旧−プラスミド導入大腸菌の培養温度を４０℃以上と
し、また、外来遺伝子を発現させたい場合には、４０℃
未満とする。
旧−プラスミド導入大腸菌の培養温度を４０℃以上と
し、また、外来遺伝子を発現させたい場合には、４０℃
未満とする。
このように培養温度を４０℃以上に維持して旧−プラス
ミド導入菌の培養を行なうと、外来遺伝子の発現を効果
的に制御でき、良好な菌体増殖が得られ、しかも所望の
国体量が得られるまでの培養期間を通して旧−説落菌の
出現を効果的に抑えることができる。
ミド導入菌の培養を行なうと、外来遺伝子の発現を効果
的に制御でき、良好な菌体増殖が得られ、しかも所望の
国体量が得られるまでの培養期間を通して旧−説落菌の
出現を効果的に抑えることができる。
その上、本発明の制御方法は、培養温度の調節という簡
易な操作で、外来遺伝子の発現を制御できるので、先に
述べたような発現誘導試薬などのような特別高価な試薬
を使用しなくてもすむ。
易な操作で、外来遺伝子の発現を制御できるので、先に
述べたような発現誘導試薬などのような特別高価な試薬
を使用しなくてもすむ。
このような本発明の外来遺伝子の発現制御方法を、旧−
プラスミド導入大腸菌を培養して旧−プラスミドに組込
んだ外来遺伝子由来の外来遺伝子産物を生産する方法に
適用すれば、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能とな
る。
プラスミド導入大腸菌を培養して旧−プラスミドに組込
んだ外来遺伝子由来の外来遺伝子産物を生産する方法に
適用すれば、効率良い外来遺伝子産物の生産が可能とな
る。
すなわち、上述した本発明の発現制御方法を用いた旧−
プラスミド導入大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法は
、発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿入した組換え体
プラスミドを導入して該外来遺伝子の発現を可能とした
大腸菌を培養して、該外来遺伝子を発現させて該外来遺
伝子にコードされた外来遺伝子産物を生産する方法にお
いて、ａ）４０℃以上に培養温度を維持して前記大腸菌
を培養する第１の培養過程と、 ｂ）該第１の培養過程で増殖した大腸菌を４０℃未満の
培養温度で培養する第２の培養過程 とを有することを特徴とする。
プラスミド導入大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法は
、発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿入した組換え体
プラスミドを導入して該外来遺伝子の発現を可能とした
大腸菌を培養して、該外来遺伝子を発現させて該外来遺
伝子にコードされた外来遺伝子産物を生産する方法にお
いて、ａ）４０℃以上に培養温度を維持して前記大腸菌
を培養する第１の培養過程と、 ｂ）該第１の培養過程で増殖した大腸菌を４０℃未満の
培養温度で培養する第２の培養過程 とを有することを特徴とする。
本発明の方法における第１の培養過程では、培養温度が
４０℃以上に維持されて、旧−プラスミドに組み込まれ
て大腸菌内に導入された外来遺伝子の発現が制御される
。その結果、第１の培養過程では、良好な菌の増殖が得
られ、効率良く所望とする菌体量を得ることができる。
４０℃以上に維持されて、旧−プラスミドに組み込まれ
て大腸菌内に導入された外来遺伝子の発現が制御される
。その結果、第１の培養過程では、良好な菌の増殖が得
られ、効率良く所望とする菌体量を得ることができる。
その上、所望とする菌体量を得るまでに旧−プラスミド
脱落菌の出現はほとんど無視できる程度に抑えられる。
脱落菌の出現はほとんど無視できる程度に抑えられる。
また、菌体の増殖活性を維持しつつ長期にわたって植え
継ぎ培養を行なう場合でもこのように発現を制御するこ
とによって同様に旧−プラスミド脱落菌の出現を抑える
ことができる。
継ぎ培養を行なう場合でもこのように発現を制御するこ
とによって同様に旧−プラスミド脱落菌の出現を抑える
ことができる。
本発明における第２の培養過程では、培養温度が４０℃
未満とされ、旧−プラスミド保持菌での外来遺伝子の発
現の制御が解除される。すると、旧−プラスミド保持菌
で外来遺伝子が発現し、外来遺伝子産物の生産が行なわ
れる。その際、第１の培養過程で得られた全培養菌に占
める旧−プラスミド脱落菌の割合はほとんど無視できる
程度に小さいので、全培養菌のほとんどで効率良く外来
遺伝子が発現され、十分に高い濃度で外来遺伝子産物を
培養物中に得ることができる。
未満とされ、旧−プラスミド保持菌での外来遺伝子の発
現の制御が解除される。すると、旧−プラスミド保持菌
で外来遺伝子が発現し、外来遺伝子産物の生産が行なわ
れる。その際、第１の培養過程で得られた全培養菌に占
める旧−プラスミド脱落菌の割合はほとんど無視できる
程度に小さいので、全培養菌のほとんどで効率良く外来
遺伝子が発現され、十分に高い濃度で外来遺伝子産物を
培養物中に得ることができる。
なお、第１の培養過程での培養温度と第２の培養過程で
の培養温度の組み合わせとしては、例えば４０〜４５℃
と３０〜３８℃の組み合わせなどを用いることができる
。
の培養温度の組み合わせとしては、例えば４０〜４５℃
と３０〜３８℃の組み合わせなどを用いることができる
。
このような本発明の方法によって、菌体を大量に培養し
て培養物を大量に生産すれば、培養物中に外来遺伝子産
物を高濃度で得られるので、外来遺伝子産物の生産量を
相乗的に増加させることができる。
て培養物を大量に生産すれば、培養物中に外来遺伝子産
物を高濃度で得られるので、外来遺伝子産物の生産量を
相乗的に増加させることができる。
しかも、先に述べたように外来遺伝子の発現をともなう
菌体の増殖過程では、例えば植え継ぎ培養期間が長くな
るほど旧−プラスミド脱落菌の培養菌に占める割合が増
加するので、その培養期間をあまり長くとることができ
なかったが、本発明の方法においては、第１の培養過程
で、必要に応じて、十分に長い培養期間をとることがで
きるので、本発明の方法は、所望の菌体量を得るための
培養を十分に長い時間効果的に行なうことができ、比較
的長い前培養期間が必要とされる工業的規模での大量培
養に特に好適である。
菌体の増殖過程では、例えば植え継ぎ培養期間が長くな
るほど旧−プラスミド脱落菌の培養菌に占める割合が増
加するので、その培養期間をあまり長くとることができ
なかったが、本発明の方法においては、第１の培養過程
で、必要に応じて、十分に長い培養期間をとることがで
きるので、本発明の方法は、所望の菌体量を得るための
培養を十分に長い時間効果的に行なうことができ、比較
的長い前培養期間が必要とされる工業的規模での大量培
養に特に好適である。
なお、第１の培養過程と、第２の培養過程との切換え時
期は、用いる旧−プラスミド導入菌の種類や第１および
第２の培養過程に用いる培養方法にもよるが、例えば、
小容量での種菌を得る前培養と、大容量でのバッチ式に
よる本培養を行なう際に本発明の方法を適用する場合、
前培養と本培養における対数増殖期の前期までを本発明
の第１の培養過程とし、それ−以降を第２の過程とすれ
ば良いが、所望に応じて適宜選択し得る。
期は、用いる旧−プラスミド導入菌の種類や第１および
第２の培養過程に用いる培養方法にもよるが、例えば、
小容量での種菌を得る前培養と、大容量でのバッチ式に
よる本培養を行なう際に本発明の方法を適用する場合、
前培養と本培養における対数増殖期の前期までを本発明
の第１の培養過程とし、それ−以降を第２の過程とすれ
ば良いが、所望に応じて適宜選択し得る。
また、本発明の方法について、フェニルアラニン・アン
モニアリアーゼ（ＰＡＬ）での例を以下に示す。
モニアリアーゼ（ＰＡＬ）での例を以下に示す。
（実施例）
以下、実施例及び比較例により本発明の外来遺伝子の発
現の制御方法及び外来遺伝子産物の生産方法について更
に詳細に説明する。
現の制御方法及び外来遺伝子産物の生産方法について更
に詳細に説明する。
なお、以下の各側で用いられる培地は次のようにして調
製した。
製した。
ＬＢ−ＡＰ培地：
以下の組成のＬＢ培地を１２０℃、１５分の条件でオー
トクレーブで処理した後、アンピシリン（ＡＰ）を無菌
的に５０μｇ／ｎｌの濃度で添加して調製した。
トクレーブで処理した後、アンピシリン（ＡＰ）を無菌
的に５０μｇ／ｎｌの濃度で添加して調製した。
ＬＢ培地組成；
トリプトン １０ｇ
酵母エキストラクト ５ｇ
グルコース １ｇ
ＮａＧ ｆｌ ５ｇ蒸留水
１２ （ＫＯＨによりｐＨ７，２に調整） ＬＢ寒天培地； 上記組成のＬＢ培地に寒天を１５ｇ／４の割合で加え、
これをオートレープで処理（１２０℃、１５分）し、シ
ャーレに流し込みプレートにした。
１２ （ＫＯＨによりｐＨ７，２に調整） ＬＢ寒天培地； 上記組成のＬＢ培地に寒天を１５ｇ／４の割合で加え、
これをオートレープで処理（１２０℃、１５分）し、シ
ャーレに流し込みプレートにした。
ＬＢ−ＡＰ寒天培地；
上記組成のＬＢ培地に寒天を１５ｇ／ｊ２の割合で加え
、これをオートレープで処理（１２０℃、１５分）した
後、更にＡＰを２０μｇ／ｌｒｉの濃度で無菌的に添加
してからシャーレに流し込みプレートにした。
、これをオートレープで処理（１２０℃、１５分）した
後、更にＡＰを２０μｇ／ｌｒｉの濃度で無菌的に添加
してからシャーレに流し込みプレートにした。
合成培地；
以下の各成分を蒸留水ＩＪＺに加え、更にＫＯ）Ｉでｐ
Ｈを７．２に調整した。
Ｈを７．２に調整した。
ポリペプトン １０ｇ
酵母エキストラクト ５ｇ
リン酸二カリウム １ｇ
硫酸マグネシウム・２水和物 ０．５ｇ実施例Ｉ
ＬＢ−ＡＰ寒天培地に、本件特許出願人により昭和６２
年２月 ６日付けで出願された特許出願に添付された明
細書に記載された本発明者らの方法によって構築され、
靜耐性をコードする遺伝子を含むベクターに ｔａｃプ
ロモーターとその下流に連結されたＰＬラムダプロモー
ターとの連結プロモーターを結合させた発現ベクターの
該連結プロモーター下流にＰＡＬ構造遺伝子が挿入され
た構成の旧−プラスミドｐｓＷ１１５を保持する大腸菌
ＭＴ１０４２３株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０２３）を塗布し
て、３７℃で培養した。
年２月 ６日付けで出願された特許出願に添付された明
細書に記載された本発明者らの方法によって構築され、
靜耐性をコードする遺伝子を含むベクターに ｔａｃプ
ロモーターとその下流に連結されたＰＬラムダプロモー
ターとの連結プロモーターを結合させた発現ベクターの
該連結プロモーター下流にＰＡＬ構造遺伝子が挿入され
た構成の旧−プラスミドｐｓＷ１１５を保持する大腸菌
ＭＴ１０４２３株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０２３）を塗布し
て、３７℃で培養した。
出現したコロニーから菌体を綿栓付き試験管中のＡＰ含
有ＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、これを４２℃、１２時
間、 １１０ストロ一ク／分で振どう培養した。
有ＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、これを４２℃、１２時
間、 １１０ストロ一ク／分で振どう培養した。
培養終了後、培養液（培養菌体を含む）の１５μ２を種
培養液として２本の綿栓付き試験管内に用意した新たな
５ｄのＡＰ含有ＬＢ培地のそれぞれに接種し、ニガを４
２℃で、他方を３０℃で上記と同様の条件でそれぞれ振
どう培養して、培養液！ １−１ （４２℃、１２時
間培養）、培養液ＡＩＩＬＩ−２（３０℃、２０時間培
養）を得た。
培養液として２本の綿栓付き試験管内に用意した新たな
５ｄのＡＰ含有ＬＢ培地のそれぞれに接種し、ニガを４
２℃で、他方を３０℃で上記と同様の条件でそれぞれ振
どう培養して、培養液！ １−１ （４２℃、１２時
間培養）、培養液ＡＩＩＬＩ−２（３０℃、２０時間培
養）を得た。
次に、培養液、ＪＦＬｌ−１から培養液（培養菌体を含
む）の１５μＵを種培養液として２本の綿栓付き試験管
内に用意した新たな５１１ｊのＡＰ含有ＬＢ培地のそれ
ぞれに接種し、一方を４１”Ｃで、他方を３０℃で上記
と同様の条件でそれぞれ振どう培養して、培養液述１３
（４１℃、１２時間培養）、培養液！１４ （３
０℃、２０時間培養）を得た。更に、第１図に示したよ
うな条件で行なう以外は上記と同様の培養操作を繰り返
し、培養液ＡＩＩＬＬ−５、培養液Ａ１１Ｌｌ−６、誠
１−７をそれぞれ得た。
む）の１５μＵを種培養液として２本の綿栓付き試験管
内に用意した新たな５１１ｊのＡＰ含有ＬＢ培地のそれ
ぞれに接種し、一方を４１”Ｃで、他方を３０℃で上記
と同様の条件でそれぞれ振どう培養して、培養液述１３
（４１℃、１２時間培養）、培養液！１４ （３
０℃、２０時間培養）を得た。更に、第１図に示したよ
うな条件で行なう以外は上記と同様の培養操作を繰り返
し、培養液ＡＩＩＬＬ−５、培養液Ａ１１Ｌｌ−６、誠
１−７をそれぞれ得た。
なお、培養液（ＡＩＩＬＩ−２、Ａ／Ｌｌ−４、Ａ１１
ｉＬｘ−ａ 、益１−７）においては、培養終了後ただ
ちに遠心分離によって集菌し、これを０．８５％ＮａＣ
Ｉｌ水溶液に懸濁して洗浄後、再度遠心分離で回収した
菌体を凍結保存しておいた。
ｉＬｘ−ａ 、益１−７）においては、培養終了後ただ
ちに遠心分離によって集菌し、これを０．８５％ＮａＣ
Ｉｌ水溶液に懸濁して洗浄後、再度遠心分離で回収した
菌体を凍結保存しておいた。
次に、各凍結保存菌体を解凍し、菌体抽出液を調製して
、それぞれのＰＡＬ比活性を以下のようにして求めた。
、それぞれのＰＡＬ比活性を以下のようにして求めた。
その結果を表１に示す。
菌体抽出液の調製；
解凍菌体を湿菌体濃度１％の菌体濃度となるように０．
０５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＬ緩衝液（ｐＨ８，８）に
懸濁させた状態で超音波処理して菌体を破砕し、さらに
該溶液から遠心分離によって細胞残漬等を取り除いて菌
体抽出液を調製した。
０５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＬ緩衝液（ｐＨ８，８）に
懸濁させた状態で超音波処理して菌体を破砕し、さらに
該溶液から遠心分離によって細胞残漬等を取り除いて菌
体抽出液を調製した。
ＰＡＬ活性の測定；
各抽出液のＰＡＬ活性は、Ｌ−フェニルアラニンから桂
皮酸を生成する酵素反応を利用して以下の操作に従って
求めた。
皮酸を生成する酵素反応を利用して以下の操作に従って
求めた。
まず、菌体抽出液を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｌ緩衝
液（ｐ１４８．８）で湿菌体濃度ＬＯ％程度に希釈し、
その１．０思１を、３１．２５ ｍＭのし一フェニルア
ラニンを含む４．０思１の３１．２５ ｍＭＴｒｉｓ−
ｔＨ：１緩衝液に加え、３０℃、２０分間反応させた。
液（ｐ１４８．８）で湿菌体濃度ＬＯ％程度に希釈し、
その１．０思１を、３１．２５ ｍＭのし一フェニルア
ラニンを含む４．０思１の３１．２５ ｍＭＴｒｉｓ−
ｔＨ：１緩衝液に加え、３０℃、２０分間反応させた。
ｌｎｌのｌＮ−Ｈｌの添加によって反応を終了させ、
反応液中に生成した桂皮酸量を、以下の条件での液体ク
ロマトグラフィーにより分析してその活性を測定した。
反応液中に生成した桂皮酸量を、以下の条件での液体ク
ロマトグラフィーにより分析してその活性を測定した。
なお、ここでのＩＵ（ユニット）は１分間当りに１マイ
クロモルの桂皮酸を生成する酵素量に相当する。
クロモルの桂皮酸を生成する酵素量に相当する。
液体クロマトグラフィー操作条件；
分離カラムＹＭＣパックＡ−３１２（山村化学新製）を
用い、移動相にメタノール：水ニリン酸＝５０：４１：
０．０８ｖ／ｖを使用し、桂皮酸の検出を紫外分光光度
計（検出波長２６０ｎｍ ）で行なった。
用い、移動相にメタノール：水ニリン酸＝５０：４１：
０．０８ｖ／ｖを使用し、桂皮酸の検出を紫外分光光度
計（検出波長２６０ｎｍ ）で行なった。
また、ＰＡＬ比活性の算出に用いた菌体量は洗浄菌体を
乾燥して求めた。
乾燥して求めた。
比較例１
実施例１における４０℃以上での培養を第２図に示した
温度に変更する以外は、実施例１と同様にして培養′操
作を縁り返し、培養液、／ｌ ２−１〜２−７を得た。
温度に変更する以外は、実施例１と同様にして培養′操
作を縁り返し、培養液、／ｌ ２−１〜２−７を得た。
更に培養液遂２−２ 、 Ａ２−４ 、！２−６ 、
！２−７から実施例１と同様にして凍結保存菌体をそれ
ぞれ調製し、更にＰＡＬ比活性を求めた。その結果を表
１に示す。
！２−７から実施例１と同様にして凍結保存菌体をそれ
ぞれ調製し、更にＰＡＬ比活性を求めた。その結果を表
１に示す。
実施例２
大腸菌ＭＴ−１０４２３株の代りに、先に引用した特許
出願の明細書に記載された方法によって構築され、靜耐
性をコードする遺伝子を含むベクターに、 ＰＬラムダ
プロモーター・オペレーターが結合した発現ベクターの
該プロモーター・オペレーター下流にＰＡＬ構造遺伝子
が挿入された構成の旧−プラスミドｐＳＹＰＬ−３を保
持する大腸菌ＭＴ−１０４２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０
４２）を用い、第３図に示す培養温度で培養する以外は
実施例１と同様にして、培養液Ａ１１Ｌ３−１〜３−７
を得た。
出願の明細書に記載された方法によって構築され、靜耐
性をコードする遺伝子を含むベクターに、 ＰＬラムダ
プロモーター・オペレーターが結合した発現ベクターの
該プロモーター・オペレーター下流にＰＡＬ構造遺伝子
が挿入された構成の旧−プラスミドｐＳＹＰＬ−３を保
持する大腸菌ＭＴ−１０４２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０
４２）を用い、第３図に示す培養温度で培養する以外は
実施例１と同様にして、培養液Ａ１１Ｌ３−１〜３−７
を得た。
更に培養液Ａｌ１Ｌ３−２ 、遂３−４ 、 ！３−５
、 ！３−７から実施例１と同様にして凍結保存菌体
を調製し、更にＰＡＬ比活性を求めた。その結果を表２
に示す。
、 ！３−７から実施例１と同様にして凍結保存菌体
を調製し、更にＰＡＬ比活性を求めた。その結果を表２
に示す。
比較例２
大腸菌ＭＴ−１０４２３株の代りに、実施例２で用いた
旧−プラスミドｐＳＹＰＬ−３を保持する大腸菌ＭＴ−
１０４２４株を用い、第４図に示す培養温度で培養する
以外は、比較例１と同様にして、培養液Ｊ／Ｌ４−１〜
４−７を得た。
旧−プラスミドｐＳＹＰＬ−３を保持する大腸菌ＭＴ−
１０４２４株を用い、第４図に示す培養温度で培養する
以外は、比較例１と同様にして、培養液Ｊ／Ｌ４−１〜
４−７を得た。
更に培養液Ａ１１Ｌ４−２ 、Ａ１１Ｌ４−４ 、誠４
−６ 、／ａ４−７から実施例１と同様にして凍結保存
菌体を調製し、更にＰＡＬ比活性を求めた。その結果を
表２に示す。
−６ 、／ａ４−７から実施例１と同様にして凍結保存
菌体を調製し、更にＰＡＬ比活性を求めた。その結果を
表２に示す。
表 １
表 ２
表１及び表２の結果から明らかなように、実施例１およ
び実施例２における培養温度４０℃以上での植え継ぎ培
養の後に培養温度３０℃で培養した、すなわち本発明で
いう第１及び第２の培養過程を経て得られた培養菌では
、第１の培養過程における植え継ぎ回数が増加してもＰ
ＡＬ比活性の低下は認められなかった。
び実施例２における培養温度４０℃以上での植え継ぎ培
養の後に培養温度３０℃で培養した、すなわち本発明で
いう第１及び第２の培養過程を経て得られた培養菌では
、第１の培養過程における植え継ぎ回数が増加してもＰ
ＡＬ比活性の低下は認められなかった。
これに対して、比較例１および比較例２における培養温
度４０℃未満での植え継ぎ培養後に、培養温度３０℃で
培養した培養菌では、植え継ぎ回数が増加するにしたが
ってＰＡＬ比活性が著しく低下した。
度４０℃未満での植え継ぎ培養後に、培養温度３０℃で
培養した培養菌では、植え継ぎ回数が増加するにしたが
ってＰＡＬ比活性が著しく低下した。
更に、各個で得られた各培養液から菌体をＬＢ−ＡＰ寒
天培地とＬＢ寒天培地にそれぞれ同量塗布し、これらを
３７℃で培養し、生じたコロニー数を比較して、培養菌
あたりのＡＰ耐性消失菌（旧−プラスミド脱落菌）の割
合を調査した。
天培地とＬＢ寒天培地にそれぞれ同量塗布し、これらを
３７℃で培養し、生じたコロニー数を比較して、培養菌
あたりのＡＰ耐性消失菌（旧−プラスミド脱落菌）の割
合を調査した。
その結果、４０℃以上での植え継ぎ培養における培養菌
当りのＡＰ耐性消失菌の割合は３回植え継ぎ後で１％以
下であったのに対して、４０℃未満での植え継ぎ培養に
おける培養菌当りのＡＰ耐性消失菌の割合は３回植え継
ぎ後で８０％に達した。
当りのＡＰ耐性消失菌の割合は３回植え継ぎ後で１％以
下であったのに対して、４０℃未満での植え継ぎ培養に
おける培養菌当りのＡＰ耐性消失菌の割合は３回植え継
ぎ後で８０％に達した。
実施例３
特願昭６１−２１５８６４号公報に記載された本発明ら
による方法によって構築され、ＡＰ耐性をコードする遺
伝子を含むベクターに ｔｒｐプロモーターを連結した
発現ベクターの該プロモーター下流にＰＡＬ構造遺伝子
が挿入された構成の旧−プラスミドｐＹｔｒｐ６を保持
する大腸菌ＭＴ１０４１４株（ＦＥＲＭＰ−８８７６）
を肩付きフラスコ内のＬＢ−ＡＰ培培地５一次に、合成
培地１．Ｏ Ｊ２．を２ＩＬのミニジャーファーメンタ
−に入れて、殺菌処理後、更にＡＰを５０ｍｇ無菌的に
添加した後、更に上記の大腸菌ＭＴ１０４１４株の培養
液の３０ｍ１を添加し、培地を通気撹拌しつつ培養を開
始した。
による方法によって構築され、ＡＰ耐性をコードする遺
伝子を含むベクターに ｔｒｐプロモーターを連結した
発現ベクターの該プロモーター下流にＰＡＬ構造遺伝子
が挿入された構成の旧−プラスミドｐＹｔｒｐ６を保持
する大腸菌ＭＴ１０４１４株（ＦＥＲＭＰ−８８７６）
を肩付きフラスコ内のＬＢ−ＡＰ培培地５一次に、合成
培地１．Ｏ Ｊ２．を２ＩＬのミニジャーファーメンタ
−に入れて、殺菌処理後、更にＡＰを５０ｍｇ無菌的に
添加した後、更に上記の大腸菌ＭＴ１０４１４株の培養
液の３０ｍ１を添加し、培地を通気撹拌しつつ培養を開
始した。
その際、４２℃で培養を開始し、菌の増殖が対数期中期
にさしかかる６時間後に培養温度を３０℃とし、更に１
８時間培養した。また、培養期間を通じて培地のｐｌ（
は７．０に調整した。
にさしかかる６時間後に培養温度を３０℃とし、更に１
８時間培養した。また、培養期間を通じて培地のｐｌ（
は７．０に調整した。
培養終了後、培養菌体を遠心分離で集菌し、更に０，８
５％ＮａＣＩＬ水溶液に懸濁して洗浄後、再度遠心分離
で集菌し、これを湿菌体濃度１％の菌体濃度となるよう
に０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ（：ｆ緩衝液（ｐＨ ａ
．ａ）に懸濁させ、以下実施例１と同様にして菌体抽出
液を調整し、ＰＡＬ比活性を求めたところ、２７０ ０
７ｇ − ｃｅｌｌであった。
５％ＮａＣＩＬ水溶液に懸濁して洗浄後、再度遠心分離
で集菌し、これを湿菌体濃度１％の菌体濃度となるよう
に０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ（：ｆ緩衝液（ｐＨ ａ
．ａ）に懸濁させ、以下実施例１と同様にして菌体抽出
液を調整し、ＰＡＬ比活性を求めたところ、２７０ ０
７ｇ − ｃｅｌｌであった。
比較例３
各培養操作における培養温度を全て３０℃とする以外は
実施例３と同様にして培養を行ない、培養菌体のＰＡＬ
比活性を求めたところ、４５ ０７ｇ・ｃｅｌｌであっ
た。
実施例３と同様にして培養を行ない、培養菌体のＰＡＬ
比活性を求めたところ、４５ ０７ｇ・ｃｅｌｌであっ
た。
また、先に述べた方法と同様にして、 ｌｉ−プラスミ
ド脱落菌の発生について調査したところ、２４時間培養
後の培養菌当りのＡＰ耐性消失菌の割合は実施例３では
１０％程度であったのに対して、比較例３においては８
５％程度であワた。
ド脱落菌の発生について調査したところ、２４時間培養
後の培養菌当りのＡＰ耐性消失菌の割合は実施例３では
１０％程度であったのに対して、比較例３においては８
５％程度であワた。
実施例４
実施例１で用いた旧−プラスミドｐＳＷ １１５を保持
する大腸菌株ＭＴ １０４２３株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０
２３）をＬＢ−ＡＰ寒天培地に塗布して、これを３７℃
で培養した。
する大腸菌株ＭＴ １０４２３株（ＦＥＲＭ Ｐ−９０
２３）をＬＢ−ＡＰ寒天培地に塗布して、これを３７℃
で培養した。
出現したコロニーから菌体を殺菌済の試験管中のＡＰ含
有ＬＢ培地（０，５ｍ１）に懸濁させ、この菌体懸濁液
を５０μづつ５木の新たな５ｊｌｌのＡＰ含有ＬＢ培地
入り綿栓付き試験管にそれぞれ分注し、表３に示す各温
度で２４時間１１０ストロ一ク／分で振どう培養を行な
つた。培養終了後ただちに遠心分離によって集菌し、こ
れを０．８５％ＮａＣ１水溶液に懸濁して洗浄後、再度
遠心分離で回収した菌体を凍結保存しておき、解凍後そ
のＰＡＬ活性を実施例１と同様にして求めた（表３）と
ころ、培養温度を調節することにより外来遺伝子の発現
が制御できることが確認できた。
有ＬＢ培地（０，５ｍ１）に懸濁させ、この菌体懸濁液
を５０μづつ５木の新たな５ｊｌｌのＡＰ含有ＬＢ培地
入り綿栓付き試験管にそれぞれ分注し、表３に示す各温
度で２４時間１１０ストロ一ク／分で振どう培養を行な
つた。培養終了後ただちに遠心分離によって集菌し、こ
れを０．８５％ＮａＣ１水溶液に懸濁して洗浄後、再度
遠心分離で回収した菌体を凍結保存しておき、解凍後そ
のＰＡＬ活性を実施例１と同様にして求めた（表３）と
ころ、培養温度を調節することにより外来遺伝子の発現
が制御できることが確認できた。
表 ３
〔発明の効果〕
本発明の発現制御方法によれば、培養温度を調節すると
いう簡易な操作で、 旧−プラスミド導入大腸菌におけ
る外来遺伝子の発現を所望に応じて効果的に制御可能で
ある。
いう簡易な操作で、 旧−プラスミド導入大腸菌におけ
る外来遺伝子の発現を所望に応じて効果的に制御可能で
ある。
また、 旧−プラスミド導入大腸菌の培養による外来遺
伝子産物の生産方法に、本発明の発現制御方法を用い、
菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離し、これらを
効率良く行なうことによって、旧−プラスミド説落閑の
発生を十分に抑えた良好な菌体増殖が達成でき、しかも
培養物中に高濃度で所望の外来遺伝子産物が得られ、効
率良い外来遺伝子産物の生産が可能となった。
伝子産物の生産方法に、本発明の発現制御方法を用い、
菌の増殖と外来遺伝子の発現時期とを分離し、これらを
効率良く行なうことによって、旧−プラスミド説落閑の
発生を十分に抑えた良好な菌体増殖が達成でき、しかも
培養物中に高濃度で所望の外来遺伝子産物が得られ、効
率良い外来遺伝子産物の生産が可能となった。
特に、本発明の方法では、外来遺伝子の発現制御を培養
温度の調節という簡易な操作によって行なうので、誘導
型プラスミドを用いる場合のように高価な誘導試薬を用
いる必要がない。
温度の調節という簡易な操作によって行なうので、誘導
型プラスミドを用いる場合のように高価な誘導試薬を用
いる必要がない。
更に、 旧−プラスミド脱落菌の出現をより効果的に抑
えることができるので、本発明の方法によれば、工業的
規模での大量培養による外来遺伝子の生産性の向上が容
易に図れる。
えることができるので、本発明の方法によれば、工業的
規模での大量培養による外来遺伝子の生産性の向上が容
易に図れる。
第１図〜第４図は実施例１、実施例２、比較例１および
比較例２における培養操作の流れを示した図である。
比較例２における培養操作の流れを示した図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿入した組換え
体プラスミドを導入して該外来遺伝子の発現を可能とし
た大腸菌の培養に際し、該大腸菌での前記外来遺伝子の
発現を制御する方法において、該大腸菌の培養温度を４
０℃以上に維持することにより前記外来遺伝子の発現を
制御することを特徴とする外来遺伝子の発現制御方法。 ２）前記外来遺伝子がＬ−フェニルアラニン・アンモニ
アリアーゼ構造遺伝子である特許請求の範囲第１項に記
載の外来遺伝子の発現制御方法。 ３）前記大腸菌が組換え体プラスミドｐＳＹＰ＿Ｌ−３
を保持する大腸菌ＭＴ１０４２４株である特許請求の範
囲第１項に記載の外来遺伝子の発現制御方法。 ４）前記大腸菌が組換え体プラスミドｐＹｔｒｐ６を保
持する大腸菌ＭＴ１０４１４株である特許請求の範囲第
１項に記載の外来遺伝子の発現制御方法。 ５）前記大腸菌が組換え体プラスミドｐＳＷ１１５を保
持する大腸菌ＭＴ１０４２３株である特許請求の範囲第
１項に記載の外来遺伝子の発現制御方法。 ６）発現ベクターに所望の外来遺伝子を挿入した組換え
体プラスミドを導入して該外来遺伝子の発現を可能とし
た大腸菌を培養して、該外来遺伝子を発現させて該外来
遺伝子にコードされた外来遺伝子産物を生産する方法に
おいて、 ａ）４０℃以上に培養温度を維持して前記大腸菌を培養
する第１の培養過程と、 ｂ）該第１の培養過程で増殖した大腸菌を４０℃未満の
培養温度で培養する第２の培養過程 とを有することを特徴とする大腸菌での外来遺伝子産物
の生産方法。 ７）前記外来遺伝子産物がＬ−フェニルアラニン・アン
モニアリアーゼである特許請求の範囲第６項に記載の外
来遺伝子の発現制御方法。 ８）前記大腸菌が組換え体プラスミドｐＳＹＰ＿Ｌ−３
を保持する大腸菌ＭＴ１０４２４株である特許請求の範
囲第６項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法
。 ９）前記大腸菌が組換え体プラスミドｐＹｔｒｐ６を保
持する大腸菌ＭＴ１０４１４株である特許請求の範囲第
６項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。 １０）前記大腸菌が組換え体プラスミドｐＳＷ１１５を
保持する大腸菌ＭＴ１０４２３株である特許請求の範囲
第６項に記載の大腸菌での外来遺伝子産物の生産方法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62034397A JPS63202386A (ja) | 1987-02-19 | 1987-02-19 | 外来遺伝子の発現制御方法及び該方法を用いた外来遺伝子産物の生産方法 |
| CA000559127A CA1320922C (en) | 1987-02-19 | 1988-02-17 | Method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
| US07/156,814 US5043277A (en) | 1987-02-19 | 1988-02-17 | Method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
| EP88301356A EP0279665B1 (en) | 1987-02-19 | 1988-02-18 | A method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
| ES88301356T ES2043805T3 (es) | 1987-02-19 | 1988-02-18 | Un metodo para regular la expresion de un gen extra\o controlando la temperatura del cultivo y procedimiento para producir un producto de gen extra\o por este metodo. |
| DE8888301356T DE3877012T2 (de) | 1987-02-19 | 1988-02-18 | Verfahren zur regulierten expression eines fremdgens durch kontrolle der kulturtemperatur und ein prozess, dadurch ein fremdgenprodukt herzustellen. |
| DK088488A DK88488A (da) | 1987-02-19 | 1988-02-19 | Fremgangsmaade til styring af ekspression af et fremmed gen i escherichia coli og fremgangsmaade til fremstilling af et fremmed genprodukt |
| MX010485A MX168908B (es) | 1987-02-19 | 1988-02-19 | Metodo para regular la expresion de un gen exterior controlando la temperatura de cultivo y el procedimiento para producir un producto de gen exterior |
| KR1019880001742A KR910001812B1 (ko) | 1987-02-19 | 1988-02-19 | 외래유전자의 발현제어방법 및 그 방법을 사용한 외래유전자산물의 생산방법 |
| US07/798,044 US5322786A (en) | 1987-02-19 | 1991-11-27 | Method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62034397A JPS63202386A (ja) | 1987-02-19 | 1987-02-19 | 外来遺伝子の発現制御方法及び該方法を用いた外来遺伝子産物の生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63202386A true JPS63202386A (ja) | 1988-08-22 |
Family
ID=12413050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62034397A Pending JPS63202386A (ja) | 1987-02-19 | 1987-02-19 | 外来遺伝子の発現制御方法及び該方法を用いた外来遺伝子産物の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63202386A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63317088A (ja) * | 1987-06-18 | 1988-12-26 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 外来遺伝子産物の生産方法 |
-
1987
- 1987-02-19 JP JP62034397A patent/JPS63202386A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63317088A (ja) * | 1987-06-18 | 1988-12-26 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 外来遺伝子産物の生産方法 |
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