JPH07108221B2 - レンニンの製造方法 - Google Patents
レンニンの製造方法Info
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- JPH07108221B2 JPH07108221B2 JP6264642A JP26464294A JPH07108221B2 JP H07108221 B2 JPH07108221 B2 JP H07108221B2 JP 6264642 A JP6264642 A JP 6264642A JP 26464294 A JP26464294 A JP 26464294A JP H07108221 B2 JPH07108221 B2 JP H07108221B2
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
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- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はレンニンの製法に関す
る。詳しくは、プレ−プロレンニンまたはプロレンニン
を遺伝子工学的に産生し、これを切断することによりレ
ンニンを得る方法に関する。
る。詳しくは、プレ−プロレンニンまたはプロレンニン
を遺伝子工学的に産生し、これを切断することによりレ
ンニンを得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素蛋白レンニンはチーズ製造において
乳汁カゼインを凝固させるのに有用であることが長い間
知られてきた。レンニンはまたその特異な蛋白質加水分
解活性のためにチーズ熟成と関連して使用される。過去
において、レンニンは商業生産ではレンネットから得ら
れてきた。乳汁で飼育した子牛を屠殺し、食物を含有し
ていない第４胃を除去する。ついで、それらの胃を乾燥
し、塩漬けし、冷凍するという複雑な方法を用いる。工
場段階では、それらの胃を洗浄し、塩を分離し、表面の
脂肪を除去するように処理する。ついでそれらの胃を網
だなの上に広げて乾燥する。それらの乾燥した胃をしば
しば冷却して貯蔵し、ついですりつぶし、さらにレンニ
ンの抽出が完了するまでその皮膚を通して循環している
ブライン溶液の入った大きなタンクの中に置く。レンニ
ンを製造するための上記の方法は多大な費用を要し、か
つ世界中の種々の利用における商業上の使用のために要
する莫大な量を生産する際に多くの困難を伴う。
乳汁カゼインを凝固させるのに有用であることが長い間
知られてきた。レンニンはまたその特異な蛋白質加水分
解活性のためにチーズ熟成と関連して使用される。過去
において、レンニンは商業生産ではレンネットから得ら
れてきた。乳汁で飼育した子牛を屠殺し、食物を含有し
ていない第４胃を除去する。ついで、それらの胃を乾燥
し、塩漬けし、冷凍するという複雑な方法を用いる。工
場段階では、それらの胃を洗浄し、塩を分離し、表面の
脂肪を除去するように処理する。ついでそれらの胃を網
だなの上に広げて乾燥する。それらの乾燥した胃をしば
しば冷却して貯蔵し、ついですりつぶし、さらにレンニ
ンの抽出が完了するまでその皮膚を通して循環している
ブライン溶液の入った大きなタンクの中に置く。レンニ
ンを製造するための上記の方法は多大な費用を要し、か
つ世界中の種々の利用における商業上の使用のために要
する莫大な量を生産する際に多くの困難を伴う。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上記課
題を解消した遺伝子工学的に大量生産可能なレンニンの
製法を提供することにある。
題を解消した遺伝子工学的に大量生産可能なレンニンの
製法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、 配
列表の配列番号１の配列に記載の塩基配列番号２０５〜
１３４７のＤＮＡから得られる遺伝子を含有し、かつプ
レ−プロレンニンを発現することのできる細菌または酵
母を培養し、該プレ−プロレンニンを得、次いでレンニ
ンを得るために該プレ−プロレンニンを切断することを
特徴とするレンニンの製造方法、および 配列表の配
列番号１の配列に記載の塩基配列番号２５３〜１３４７
のＤＮＡから得られる遺伝子を含有し、かつプロレンニ
ンを発現することのできる細菌または酵母を培養し、該
プロレンニンを得、次いでレンニンを得るために該プロ
レンニンを切断することを特徴とするレンニンの製造方
法により達成できる。
列表の配列番号１の配列に記載の塩基配列番号２０５〜
１３４７のＤＮＡから得られる遺伝子を含有し、かつプ
レ−プロレンニンを発現することのできる細菌または酵
母を培養し、該プレ−プロレンニンを得、次いでレンニ
ンを得るために該プレ−プロレンニンを切断することを
特徴とするレンニンの製造方法、および 配列表の配
列番号１の配列に記載の塩基配列番号２５３〜１３４７
のＤＮＡから得られる遺伝子を含有し、かつプロレンニ
ンを発現することのできる細菌または酵母を培養し、該
プロレンニンを得、次いでレンニンを得るために該プロ
レンニンを切断することを特徴とするレンニンの製造方
法により達成できる。
【０００５】即ち、本発明は細菌または酵母により発現
されたプレ−プロレンニンのプレ−プロ配列と成熟配列
のレンニン配列との結合部位（即ち、配列表の配列番号
１の配列に記載のアミノ酸配列番号−１と１の間）また
はプロレンニンのプロ配列と成熟配列のレンニン配列と
の同結合部位を切断することにより、レンニンを製造す
るものである。
されたプレ−プロレンニンのプレ−プロ配列と成熟配列
のレンニン配列との結合部位（即ち、配列表の配列番号
１の配列に記載のアミノ酸配列番号−１と１の間）また
はプロレンニンのプロ配列と成熟配列のレンニン配列と
の同結合部位を切断することにより、レンニンを製造す
るものである。
【０００６】尚、プレ配列は、配列表の配列番号１の配
列に記載の塩基配列番号２０５〜２５２（アミノ酸配列
番号−５８〜−４３）、プロ配列は同塩基配列番号２５
３〜３７８（アミノ酸配列番号−４２〜−１）である。
また、レンニンは、同塩基配列番号３７９〜１３４７
（アミノ酸配列番号１〜３２３）である。宿主細胞中の
プレ−プロレンニンの発現はプレ−プロレンニンをコー
ドするＤＮＡ配列を発生させることによって得られる。
その配列はその５′末端のところで転写プロモーターお
よびリボソーム結合サイトに結合し、プレ−プロレンニ
ンをコードするＤＮＡの開始点とプロモーターおよび結
合サイトを担うＤＮＡの断片との距離は変化する。その
ＤＮＡはついで宿主細胞中に移入して（形質）転換され
る。宿主細胞はクローン化され、プレ−プロレンニンの
高レベルの発現を有する宿主細胞が選択される。
列に記載の塩基配列番号２０５〜２５２（アミノ酸配列
番号−５８〜−４３）、プロ配列は同塩基配列番号２５
３〜３７８（アミノ酸配列番号−４２〜−１）である。
また、レンニンは、同塩基配列番号３７９〜１３４７
（アミノ酸配列番号１〜３２３）である。宿主細胞中の
プレ−プロレンニンの発現はプレ−プロレンニンをコー
ドするＤＮＡ配列を発生させることによって得られる。
その配列はその５′末端のところで転写プロモーターお
よびリボソーム結合サイトに結合し、プレ−プロレンニ
ンをコードするＤＮＡの開始点とプロモーターおよび結
合サイトを担うＤＮＡの断片との距離は変化する。その
ＤＮＡはついで宿主細胞中に移入して（形質）転換され
る。宿主細胞はクローン化され、プレ−プロレンニンの
高レベルの発現を有する宿主細胞が選択される。
【０００７】宿主細胞中のプロレンニンの発現を得る方
法において、プレ−プロレンニンをコードし、かつ５′
末端を有するＤＮＡ配列が選択される。一部分が５′末
端から除去され、その部分はプロレンニン即ちレンニン
前駆体ポリペプチドをコードする。プロレンニンをコー
ドするＤＮＡ配列を有する残りの部分はその断片の３′
末端に翻訳開始コドンを有するＤＮＡの合成断片上に結
合される。ついで、前と同様にして、転写プロモーター
およびリボソーム結合サイトと該ＤＮＡ配列とを結合さ
せる操作、並びにプロレンニンをコードする該ＤＮＡの
開始点とプロモーターおよびリボソーム結合サイトを有
するＤＮＡの断片との間の距離を変化させる操作を続行
する。この材料は宿主細胞中に移入され、クローニング
が行なわれ、ついで所望の、かつ上で選択されたプロレ
ンニンを発現する細胞の選択が行なわれる。
法において、プレ−プロレンニンをコードし、かつ５′
末端を有するＤＮＡ配列が選択される。一部分が５′末
端から除去され、その部分はプロレンニン即ちレンニン
前駆体ポリペプチドをコードする。プロレンニンをコー
ドするＤＮＡ配列を有する残りの部分はその断片の３′
末端に翻訳開始コドンを有するＤＮＡの合成断片上に結
合される。ついで、前と同様にして、転写プロモーター
およびリボソーム結合サイトと該ＤＮＡ配列とを結合さ
せる操作、並びにプロレンニンをコードする該ＤＮＡの
開始点とプロモーターおよびリボソーム結合サイトを有
するＤＮＡの断片との間の距離を変化させる操作を続行
する。この材料は宿主細胞中に移入され、クローニング
が行なわれ、ついで所望の、かつ上で選択されたプロレ
ンニンを発現する細胞の選択が行なわれる。
【０００８】ここに記載される方法によって調製された
エシエリヒア・コリ（大腸菌）はメリーランド20852，
ロックビレ，12301パーク・ウォーレン・ドライブのア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れた培養菌によって例示され、かつ大腸菌BNN45株由来
のCGE24株である受託番号第31929号として同定される。
ここに記載される方法によって調製された酵母微生物は
メリーランド20852、ロックビレ、12301パーク・ウォー
レン・ドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに寄託された培養菌によって例示され、かつ
サッカロミセス・セレビシエ−CGY80株由来のCGY116株
である受託番号第20623号として同定される。
エシエリヒア・コリ（大腸菌）はメリーランド20852，
ロックビレ，12301パーク・ウォーレン・ドライブのア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れた培養菌によって例示され、かつ大腸菌BNN45株由来
のCGE24株である受託番号第31929号として同定される。
ここに記載される方法によって調製された酵母微生物は
メリーランド20852、ロックビレ、12301パーク・ウォー
レン・ドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに寄託された培養菌によって例示され、かつ
サッカロミセス・セレビシエ−CGY80株由来のCGY116株
である受託番号第20623号として同定される。
【０００９】好ましくは、本発明の方法において、プレ
−プロレンニンまたはプロレンニンはそれぞれプレ−プ
ロレンニンＤＮＡの単離によって得ることができる。プ
レ−プロレンニンはプロレンニンの前駆体であり、文献
には記載されていない。プレ−プロレンニンＤＮＡのプ
レ部分を除去することによって、プロレンニンをコード
する遺伝子を得ることができる。
−プロレンニンまたはプロレンニンはそれぞれプレ−プ
ロレンニンＤＮＡの単離によって得ることができる。プ
レ−プロレンニンはプロレンニンの前駆体であり、文献
には記載されていない。プレ−プロレンニンＤＮＡのプ
レ部分を除去することによって、プロレンニンをコード
する遺伝子を得ることができる。
【００１０】本発明によるプレ−プロレンニンまたはプ
ロレンニン遺伝子はプレ−プロレンニンまたはプロレン
ニンの各々のアミノ酸配列をコードする特定のヌクレオ
チド配列を含有し、かつプレ−プロレンニンまたはプロ
レンニンの各々をコードするゲノムＤＮＡ中に存在する
すべての介在ヌクレオチド配列を除外する。これらの２
つの遺伝子はまた適当な宿主細胞中で複製するベクター
に結合されて与えられている。
ロレンニン遺伝子はプレ−プロレンニンまたはプロレン
ニンの各々のアミノ酸配列をコードする特定のヌクレオ
チド配列を含有し、かつプレ−プロレンニンまたはプロ
レンニンの各々をコードするゲノムＤＮＡ中に存在する
すべての介在ヌクレオチド配列を除外する。これらの２
つの遺伝子はまた適当な宿主細胞中で複製するベクター
に結合されて与えられている。
【００１１】宿主細胞は好ましくは大腸菌であり、これ
は所望の酵素蛋白を生産する細換えＤＮＡを発現するこ
とができる。酵母もまた使用することができる。これら
の細胞は合理的な商業規模の培養条件下で大量の酵素蛋
白を生産できるように選択される。この明細書中に記載
された酵素レンニン（EC3. 4. 23. 4)はまたキモシン
（chymosin）として知られている。これは予め反芻する
子牛の胃の中に見い出される主要な加水分解性蛋白であ
り、凝固乳に対して反応性である。レンニンは商業的に
はチーズの製造に用いられる。プロレンニンは、B.Folt
mannらによってProc.Nat.Acad.Sci.USA第74巻2321〜232
4頁(1977)に記載されているようにアミノ末端に42個の
付加アミノ酸を有するレンニンの前駆体形である。この
明細書中に最初に記載されたプレ−プロレンニンはプロ
レンニンの前駆体形であり、プロレンニン分子のアミノ
末端上に多くの付加アミノ酸（16個のアミノ酸）を有す
る。これらの付加アミノ酸は好ましくは胃細胞からの酵
素の選択にとって重要である。B.Foltmannらは、精製さ
れたレンニンが２つの形、ＡおよびＢの混合物であるこ
とを示した〔B.Foltmann外、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第
74巻、2321〜2324頁(1977)およびJ.Biol.Chem.第254
巻、8447〜8456頁(1979)〕。両方の形は活性であり、そ
して配列データは、おそらく唯一の相異がレンニンＡ中
の位置＃290におけるアスパラギン酸塩残基およびレン
ニンＢ中の上記位置におけるグリシン残基であることを
示している。本発明の実施例で生産されたレンニンはレ
ンニンＡである。しかしながら、同一の手法および（ま
たは）簡単な転化によってレンニンＢを生産することが
できる。同様にプレおよびプロ形はＡまたはＢ形中に生
起させることができる。
は所望の酵素蛋白を生産する細換えＤＮＡを発現するこ
とができる。酵母もまた使用することができる。これら
の細胞は合理的な商業規模の培養条件下で大量の酵素蛋
白を生産できるように選択される。この明細書中に記載
された酵素レンニン（EC3. 4. 23. 4)はまたキモシン
（chymosin）として知られている。これは予め反芻する
子牛の胃の中に見い出される主要な加水分解性蛋白であ
り、凝固乳に対して反応性である。レンニンは商業的に
はチーズの製造に用いられる。プロレンニンは、B.Folt
mannらによってProc.Nat.Acad.Sci.USA第74巻2321〜232
4頁(1977)に記載されているようにアミノ末端に42個の
付加アミノ酸を有するレンニンの前駆体形である。この
明細書中に最初に記載されたプレ−プロレンニンはプロ
レンニンの前駆体形であり、プロレンニン分子のアミノ
末端上に多くの付加アミノ酸（16個のアミノ酸）を有す
る。これらの付加アミノ酸は好ましくは胃細胞からの酵
素の選択にとって重要である。B.Foltmannらは、精製さ
れたレンニンが２つの形、ＡおよびＢの混合物であるこ
とを示した〔B.Foltmann外、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第
74巻、2321〜2324頁(1977)およびJ.Biol.Chem.第254
巻、8447〜8456頁(1979)〕。両方の形は活性であり、そ
して配列データは、おそらく唯一の相異がレンニンＡ中
の位置＃290におけるアスパラギン酸塩残基およびレン
ニンＢ中の上記位置におけるグリシン残基であることを
示している。本発明の実施例で生産されたレンニンはレ
ンニンＡである。しかしながら、同一の手法および（ま
たは）簡単な転化によってレンニンＢを生産することが
できる。同様にプレおよびプロ形はＡまたはＢ形中に生
起させることができる。
【００１２】本発明の目的のために、プロレンニン遺伝
子は、プロレンニン分子をコードする特定のヌクレオチ
ド配列として定義され、そのアミノ酸配列は文献に記載
されている〔B.Foltmann, V.B.Pedersen, H.Jacobsen,
D.Kauffman, およびG.Wybrandt, Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA 第74、2321〜2324頁(1977)〕。プレ−プロレン
ニン遺伝子はプロレンニンをコードしているヌクレオチ
ドの配列を含有するばかりではなく、プレ−プロレンニ
ン酵素上に見い出されるアミノ末端前駆体ポリペプチ
ド、即ちプレ配列をコードする５′末端上の48個の付加
ヌクレオチドを含有する。
子は、プロレンニン分子をコードする特定のヌクレオチ
ド配列として定義され、そのアミノ酸配列は文献に記載
されている〔B.Foltmann, V.B.Pedersen, H.Jacobsen,
D.Kauffman, およびG.Wybrandt, Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA 第74、2321〜2324頁(1977)〕。プレ−プロレン
ニン遺伝子はプロレンニンをコードしているヌクレオチ
ドの配列を含有するばかりではなく、プレ−プロレンニ
ン酵素上に見い出されるアミノ末端前駆体ポリペプチ
ド、即ちプレ配列をコードする５′末端上の48個の付加
ヌクレオチドを含有する。
【００１３】レンニン遺伝子はプロレンニンの酵素原部
分をコードする最初の126個のヌクレオチドを排除して
なるレンニン分子をコードするヌクレオチドの特定の配
列として定義される。培養胞は、子牛の第４胃から得ら
れる材料を用いて出発する複数かつ公知のＤＮＡ技術を
用いることによって最初の実施例において生産される。
分をコードする最初の126個のヌクレオチドを排除して
なるレンニン分子をコードするヌクレオチドの特定の配
列として定義される。培養胞は、子牛の第４胃から得ら
れる材料を用いて出発する複数かつ公知のＤＮＡ技術を
用いることによって最初の実施例において生産される。
【００１４】得られるレンニン、あるいはプレ−プロレ
ンニンやプロレンニンがチーズ製造において乳汁を凝固
させてチーズを得るのに使用することができ、かつおそ
らく他の商業上の利用において乳汁を凝固させてチーズ
を得るのに使用することができることは本発明の一つの
特徴である。大量生産は培養技術によって可能である。
こうして、大量の材料が合理的な生産速度およびコスト
で生産されることができる。組換えＤＮＡの遺伝子は、
レンニンが生産されることになっているときは子牛のプ
レ−プロレンニン遺伝子のレンニン部分と実質的に同一
であり、プレ−プロレンニンが生産されることになって
いるときは子牛のプレ−プロレンニン遺伝子と実質的に
同一であり、そしてプロレンニンが生産されることにな
っているときは子牛のプレ−プロレンニン遺伝子のプロ
レンニン部分と実質的に同一である。組換えＤＮＡ中の
ものとの相違は主として、組換えＤＮＡは子牛の遺伝子
中に存在するイントロン（intron）を有していないこと
である。
ンニンやプロレンニンがチーズ製造において乳汁を凝固
させてチーズを得るのに使用することができ、かつおそ
らく他の商業上の利用において乳汁を凝固させてチーズ
を得るのに使用することができることは本発明の一つの
特徴である。大量生産は培養技術によって可能である。
こうして、大量の材料が合理的な生産速度およびコスト
で生産されることができる。組換えＤＮＡの遺伝子は、
レンニンが生産されることになっているときは子牛のプ
レ−プロレンニン遺伝子のレンニン部分と実質的に同一
であり、プレ−プロレンニンが生産されることになって
いるときは子牛のプレ−プロレンニン遺伝子と実質的に
同一であり、そしてプロレンニンが生産されることにな
っているときは子牛のプレ−プロレンニン遺伝子のプロ
レンニン部分と実質的に同一である。組換えＤＮＡ中の
ものとの相違は主として、組換えＤＮＡは子牛の遺伝子
中に存在するイントロン（intron）を有していないこと
である。
【００１５】組換えＤＮＡ操作に対して安全であると考
えられるすべての種属の細菌を使用することができる。
これらの細菌には例えばエシュリヒア・コリ（大腸
菌）、いろいろな種属のバチルス、例えばバチルス・ズ
ブチリス、種々のラクトバチルス種属、および種々のミ
クロコッカス種属、例えばミクロコッカス・フラジリス
が包含される。菌類（fungi)、酵母または哺乳動物のよ
うな他の細胞もまた宿主細胞として使用することができ
る。それぞれの場合において、もたらされる細胞の遺伝
子情報は組換えＤＮＡから得られる新しい遺伝子を含有
する。この遺伝子はプラスミドの形でしばしば含有さ
れ、プラスミドは宿主細胞中で複製することができ、か
つ宿主細胞中にある初期の段階でドナー（供与体）細胞
からの遺伝子が挿入される。いったん組換えＤＮＡ分子
が形成され、宿主細胞に挿入されれば、その宿主細胞は
生育し、本質的に正常な手段によって複製する。組換え
ＤＮＡによりコードされる酵素蛋白（プレ−プロレンニ
ンまたはプロレンニン）の生産は本発明に従って生起す
る。
えられるすべての種属の細菌を使用することができる。
これらの細菌には例えばエシュリヒア・コリ（大腸
菌）、いろいろな種属のバチルス、例えばバチルス・ズ
ブチリス、種々のラクトバチルス種属、および種々のミ
クロコッカス種属、例えばミクロコッカス・フラジリス
が包含される。菌類（fungi)、酵母または哺乳動物のよ
うな他の細胞もまた宿主細胞として使用することができ
る。それぞれの場合において、もたらされる細胞の遺伝
子情報は組換えＤＮＡから得られる新しい遺伝子を含有
する。この遺伝子はプラスミドの形でしばしば含有さ
れ、プラスミドは宿主細胞中で複製することができ、か
つ宿主細胞中にある初期の段階でドナー（供与体）細胞
からの遺伝子が挿入される。いったん組換えＤＮＡ分子
が形成され、宿主細胞に挿入されれば、その宿主細胞は
生育し、本質的に正常な手段によって複製する。組換え
ＤＮＡによりコードされる酵素蛋白（プレ−プロレンニ
ンまたはプロレンニン）の生産は本発明に従って生起す
る。
【００１６】所望の組換えＤＮＡ材料が導入される宿主
細胞は好ましくは大腸菌K-12由来株である。有用な由来
株は次のとおりである。HB101, H.W.Boyer & D.Roullan
d-Dussoix (1969) J.Mol.Biol.第41巻、459〜472頁、C6
00, M.Mandel & A.Higa J.Mol.Biol. 第53巻、159〜162
頁(1970)、およびC600の由来株、例えばMV1およびMV12,
V.Hershfield, H.W.Boyer, C.Yanofsky, M.A.Lovett &
D.R.Helinski (1974) Proc.Natl.Acad.Sci.USA第71
巻、3455〜3459頁、LE392, S.M.Tilghman, D.C.Tiemeie
r, F.Polsky, M.H.Edgell, J.G.Seidman, A.Leder, L.
W.Enquist, B.Norman & P.Leder (1977) Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA第74巻、4406〜4410頁、JM101, J.Messing (1
979) Recombinant DNA Technical Bulletin第２巻、43
〜48頁、W3110および由来株, K.L.Korr & C.Yarofsky(1
976) J.Mol.Biol. 第103巻、395〜409頁 これらの細胞は通常の培養技術によって生育させること
ができる。例えば、大腸菌のための培地は次のとおりで
ある。 栄養培地 ＬＢ ｌ当り バクト（Bacto)・トリプトン (Difcoラボラトリーズ、デトロイト) １０ｇ バクト酵母抽出物 (Difcoラボラトリーズ、デトロイト) ５ｇ ＮａＣｌ １０ｇ グルコース ２ｇ ＴＹ ｌ当り バクト・トリプトン (Difcoラボラトリーズ、デトロイト) １０ｇ バクト酵母(Difcoラボラトリーズ、デトロイト) １ｇ ＮａＣｌ ８ｇ グルコース １ｇ 最少培地 Ｍ９ ｌ当り ＮａＨＰＯ4 ６ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ ＮａＣｌ ０．５ｇ ＣａＣｌ2 １１mg ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ Ｂｌ（チアミンＨＣｌ） ５mg 株により必要量のアミノ酸（各40mg) グルコース ２ｇ 培養菌は懸濁液中で生育し、寒天培地上でプレート化す
ることができ、または他の標準的な技術および細胞培養
技術を使用することができる。
細胞は好ましくは大腸菌K-12由来株である。有用な由来
株は次のとおりである。HB101, H.W.Boyer & D.Roullan
d-Dussoix (1969) J.Mol.Biol.第41巻、459〜472頁、C6
00, M.Mandel & A.Higa J.Mol.Biol. 第53巻、159〜162
頁(1970)、およびC600の由来株、例えばMV1およびMV12,
V.Hershfield, H.W.Boyer, C.Yanofsky, M.A.Lovett &
D.R.Helinski (1974) Proc.Natl.Acad.Sci.USA第71
巻、3455〜3459頁、LE392, S.M.Tilghman, D.C.Tiemeie
r, F.Polsky, M.H.Edgell, J.G.Seidman, A.Leder, L.
W.Enquist, B.Norman & P.Leder (1977) Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA第74巻、4406〜4410頁、JM101, J.Messing (1
979) Recombinant DNA Technical Bulletin第２巻、43
〜48頁、W3110および由来株, K.L.Korr & C.Yarofsky(1
976) J.Mol.Biol. 第103巻、395〜409頁 これらの細胞は通常の培養技術によって生育させること
ができる。例えば、大腸菌のための培地は次のとおりで
ある。 栄養培地 ＬＢ ｌ当り バクト（Bacto)・トリプトン (Difcoラボラトリーズ、デトロイト) １０ｇ バクト酵母抽出物 (Difcoラボラトリーズ、デトロイト) ５ｇ ＮａＣｌ １０ｇ グルコース ２ｇ ＴＹ ｌ当り バクト・トリプトン (Difcoラボラトリーズ、デトロイト) １０ｇ バクト酵母(Difcoラボラトリーズ、デトロイト) １ｇ ＮａＣｌ ８ｇ グルコース １ｇ 最少培地 Ｍ９ ｌ当り ＮａＨＰＯ4 ６ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ ＮａＣｌ ０．５ｇ ＣａＣｌ2 １１mg ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ Ｂｌ（チアミンＨＣｌ） ５mg 株により必要量のアミノ酸（各40mg) グルコース ２ｇ 培養菌は懸濁液中で生育し、寒天培地上でプレート化す
ることができ、または他の標準的な技術および細胞培養
技術を使用することができる。
【００１７】使用される培地は特別の細胞を生育させる
ためのすべての標準的な培地であり得る。例えば、大腸
菌LE392(大腸菌C600rk -m+SupE, SupF, gal-）またはBNN
45(大腸菌hadR-, hsdM+, SupE, SupF, Bl-met-)(Advanc
ed Bacterial Genetics, R.W.Davis, D.Botstein, J.R.
Roth, コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
〔1980〕p.７）の細胞を最初に１％〜４％のレベルで接
種したＴＹ培地が好ましい。
ためのすべての標準的な培地であり得る。例えば、大腸
菌LE392(大腸菌C600rk -m+SupE, SupF, gal-）またはBNN
45(大腸菌hadR-, hsdM+, SupE, SupF, Bl-met-)(Advanc
ed Bacterial Genetics, R.W.Davis, D.Botstein, J.R.
Roth, コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
〔1980〕p.７）の細胞を最初に１％〜４％のレベルで接
種したＴＹ培地が好ましい。
【００１８】標準的な技術において、該大腸菌は10〜30
×1012細胞１ｌの密度まで生育し、所望の酵素蛋白が生
産される。細胞を生育させるために知られている種々の
培地を使用することができるが、本発明の部分を構成す
るものではない。同様に種々の生育方法、技術および条
件を用いることができる。例えば、該細胞が好ましくは
30℃〜40℃の温度で生育している間に、この範囲外の温
度を用いることができる。
×1012細胞１ｌの密度まで生育し、所望の酵素蛋白が生
産される。細胞を生育させるために知られている種々の
培地を使用することができるが、本発明の部分を構成す
るものではない。同様に種々の生育方法、技術および条
件を用いることができる。例えば、該細胞が好ましくは
30℃〜40℃の温度で生育している間に、この範囲外の温
度を用いることができる。
【００１９】本発明の細胞を得るための出発点は所望の
遺伝子を得るための、かつそれを宿主細胞に挿入してそ
の後宿主細胞がクローン化されるための当業界公知の組
換えＤＮＡ技術を使用することである。好ましくは、微
生物におけるクローンを最終的に望むプレ−プロレンニ
ン遺伝子またはプロレンニン遺伝子は組織源からのプレ
−プロレンニン遺伝子のメッセンジャー（伝令）ＲＮＡ
を得ることによって第１段階で単離される。子牛の場
合、これは子牛の第４胃からの単離によって得られる。
メッセンジャーＲＮＡはDeeleyらの方法によって単離す
ることができる(R.G.Deeley, J.I.Gordon, A.T.H.Burn
s, K.P.Mullinix, M.Bina-Stein, R.F.Goldberger J.Bi
ol.Chem. 第252巻、8310〜8319頁〔1977〕）。また、ポ
リＡ−富化ＲＮＡはR.C.Desrasiers, K.H.Friderici, &
F.M.Rottmanの方法によるオリゴ（dT）セルローズ上の
クロマトグラフィーによって得ることができる（Bioche
mistry, 第14巻、4367〜4374頁〔1975〕）。
遺伝子を得るための、かつそれを宿主細胞に挿入してそ
の後宿主細胞がクローン化されるための当業界公知の組
換えＤＮＡ技術を使用することである。好ましくは、微
生物におけるクローンを最終的に望むプレ−プロレンニ
ン遺伝子またはプロレンニン遺伝子は組織源からのプレ
−プロレンニン遺伝子のメッセンジャー（伝令）ＲＮＡ
を得ることによって第１段階で単離される。子牛の場
合、これは子牛の第４胃からの単離によって得られる。
メッセンジャーＲＮＡはDeeleyらの方法によって単離す
ることができる(R.G.Deeley, J.I.Gordon, A.T.H.Burn
s, K.P.Mullinix, M.Bina-Stein, R.F.Goldberger J.Bi
ol.Chem. 第252巻、8310〜8319頁〔1977〕）。また、ポ
リＡ−富化ＲＮＡはR.C.Desrasiers, K.H.Friderici, &
F.M.Rottmanの方法によるオリゴ（dT）セルローズ上の
クロマトグラフィーによって得ることができる（Bioche
mistry, 第14巻、4367〜4374頁〔1975〕）。
【００２０】メッセンジャーＲＮＡはついで慣用の手段
によって２本鎖ＤＮＡに転換される。まず最初に、該Ｒ
ＮＡの相補（complimentary）コピーがＡＭＶ逆転写酵
素の使用によるなどの慣用の組換えＤＮＡ手段によって
メッセンジャーＲＮＡから作られる。例えば、A.Efstra
tiadis, F.C.Kafatos, A.M.MaxamおよびT.Maniatis,Cel
l, 第７巻、279〜288頁(1976), R.Higuchi, G.V.Paddoc
k, R.WallおよびW.Salser, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第7
3巻、3146〜3150頁(1976), D.L.KacianおよびJ.C.Myer
s, Proc.Nat.Acad.Sci.USA第73巻、2191〜2195頁(197
6), M.P.Wickens,G.N.BuellおよびR.T.Schimke, J.Bio
l.Chem. 第253巻、2483〜2495頁(1978), G.M.Wahl, R.
A.PadgettおよびG.R.Stack, J.Biol.Chem.,第254巻、86
79〜8689頁(1979)の方法をコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を
得るために使用することができる。そのＲＮＡ部分は、
上記方法のいずれかを使用する当業界で公知の連鎖切断
によって、またはWickensらの方法(1978)による熱変性
によって配列されることができる。
によって２本鎖ＤＮＡに転換される。まず最初に、該Ｒ
ＮＡの相補（complimentary）コピーがＡＭＶ逆転写酵
素の使用によるなどの慣用の組換えＤＮＡ手段によって
メッセンジャーＲＮＡから作られる。例えば、A.Efstra
tiadis, F.C.Kafatos, A.M.MaxamおよびT.Maniatis,Cel
l, 第７巻、279〜288頁(1976), R.Higuchi, G.V.Paddoc
k, R.WallおよびW.Salser, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第7
3巻、3146〜3150頁(1976), D.L.KacianおよびJ.C.Myer
s, Proc.Nat.Acad.Sci.USA第73巻、2191〜2195頁(197
6), M.P.Wickens,G.N.BuellおよびR.T.Schimke, J.Bio
l.Chem. 第253巻、2483〜2495頁(1978), G.M.Wahl, R.
A.PadgettおよびG.R.Stack, J.Biol.Chem.,第254巻、86
79〜8689頁(1979)の方法をコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を
得るために使用することができる。そのＲＮＡ部分は、
上記方法のいずれかを使用する当業界で公知の連鎖切断
によって、またはWickensらの方法(1978)による熱変性
によって配列されることができる。
【００２１】次に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたは
ＡＭＶ逆転写酵素のような酵素は、上記の文献およびJ.
I.Gordon, A.T.H.Burns, J.L.Christmann & R.G.Deele
y, J.Biol.Chem.第253巻、8629〜8639頁(1978）の方法
を用いてｃＤＮＡを２本鎖ＤＮＡに変えるために使用す
ることができる。第３に、合成リンカーは、例えばHind
IIIまたはEcoRI合成オリゴヌクレオチドリンカーを使
用することによって、例えばR.H.Scheller, T.L.Thoma
s, A.S.Lee, W.H.Klein, W.D.Niles, R.J.Brittenおよ
びE.H.Davidson, Science 第196巻、197〜200頁(1977),
T.H.FraserおよびB.J.Bruce, Proc.Natl.Acad.Sci.USA
第75巻、5936〜5940頁(1978)、A.Ullrich, J.Shine,
J.Chivgwin, R.Pictet, E.Tischer, W.J.Rutter & H.M.
Goodmann, Science 第196巻、1313〜1319頁(1977), J.S
hine, P.H.Seeburg, J.A.Martial, J.D.Baxter & H.M.G
oodmann, Nature第270巻、494〜499頁（1977）、または
P.H.Seeburg, J.Shine, J.A.Martial, J.D.Baxter & H.
M.Goodman, Nature 第270巻、486〜494頁(1977)に記載
された通常の方法を用いて、２本鎖ＤＮＡの両方の末端
に結合されることができる。
ＡＭＶ逆転写酵素のような酵素は、上記の文献およびJ.
I.Gordon, A.T.H.Burns, J.L.Christmann & R.G.Deele
y, J.Biol.Chem.第253巻、8629〜8639頁(1978）の方法
を用いてｃＤＮＡを２本鎖ＤＮＡに変えるために使用す
ることができる。第３に、合成リンカーは、例えばHind
IIIまたはEcoRI合成オリゴヌクレオチドリンカーを使
用することによって、例えばR.H.Scheller, T.L.Thoma
s, A.S.Lee, W.H.Klein, W.D.Niles, R.J.Brittenおよ
びE.H.Davidson, Science 第196巻、197〜200頁(1977),
T.H.FraserおよびB.J.Bruce, Proc.Natl.Acad.Sci.USA
第75巻、5936〜5940頁(1978)、A.Ullrich, J.Shine,
J.Chivgwin, R.Pictet, E.Tischer, W.J.Rutter & H.M.
Goodmann, Science 第196巻、1313〜1319頁(1977), J.S
hine, P.H.Seeburg, J.A.Martial, J.D.Baxter & H.M.G
oodmann, Nature第270巻、494〜499頁（1977）、または
P.H.Seeburg, J.Shine, J.A.Martial, J.D.Baxter & H.
M.Goodman, Nature 第270巻、486〜494頁(1977)に記載
された通常の方法を用いて、２本鎖ＤＮＡの両方の末端
に結合されることができる。
【００２２】第４段階では、ＤＮＡ分子は染色体に結合
されるか、またはプラスミド、ウイルスまたは当業界公
知のコスミド（cosmid）であり得るベクターに結合され
る。そのようなベクターには以下のものがある。pBR322
(F.Bolivar, R.L.Rodriguez, P.J.Greehe, M.C.Betlac
h, H.L.Heyneker, H.W.Boyer, J.H.Grosa, S.Falkow, 1
977, Gene, 第２巻 95〜119頁） pMB9(R.L.Rodriguez, F.Bolivara, H.M.Goodman, H.W.B
oyer, M.C.Betlach“Molecular Mechanisms in the Con
trol of Gene Expression”〔D.P.Nierlich, W.J.Rutte
r, C.F.Fox, Eds. 〕471頁、アカデミック・プレス，ニ
ューヨーク，1976） pSC101(S.N.Coher, A.C.Y.Chang, H.W.Boyer, R.B.Hell
ing, 1973, Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 第70巻、3240頁） λgtWES (D.Tiemeier, L.Enquist, P.Leder, Nature 第
263巻、526〜527頁)(1976） λcharonファージ(F.R.Blattner外、Science 第196巻、
161〜169頁)(1977） f1R229 (J.D.Boeke, Molec.Gen.Genetics,第181巻、288
〜291頁)(1981） pJC75〜58 (J.Collins, Methcd in Enzymology第68巻、
309〜326頁)(1979）この段階は最後の宿主細胞の外側で
再び行なわれる。この方法のための有用な技術はリンカ
ーと関連して上記の文献に記載され、同様に次の文献に
も記載されている。V.Hershfield, H.W.Boyer, C.Yanof
sky, M.A.Lovett & K.Murray, Nature,第251巻、476〜4
82頁(1974), F.R.Blattner外, Science,第196頁, 161〜
169頁(1977)。
されるか、またはプラスミド、ウイルスまたは当業界公
知のコスミド（cosmid）であり得るベクターに結合され
る。そのようなベクターには以下のものがある。pBR322
(F.Bolivar, R.L.Rodriguez, P.J.Greehe, M.C.Betlac
h, H.L.Heyneker, H.W.Boyer, J.H.Grosa, S.Falkow, 1
977, Gene, 第２巻 95〜119頁） pMB9(R.L.Rodriguez, F.Bolivara, H.M.Goodman, H.W.B
oyer, M.C.Betlach“Molecular Mechanisms in the Con
trol of Gene Expression”〔D.P.Nierlich, W.J.Rutte
r, C.F.Fox, Eds. 〕471頁、アカデミック・プレス，ニ
ューヨーク，1976） pSC101(S.N.Coher, A.C.Y.Chang, H.W.Boyer, R.B.Hell
ing, 1973, Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 第70巻、3240頁） λgtWES (D.Tiemeier, L.Enquist, P.Leder, Nature 第
263巻、526〜527頁)(1976） λcharonファージ(F.R.Blattner外、Science 第196巻、
161〜169頁)(1977） f1R229 (J.D.Boeke, Molec.Gen.Genetics,第181巻、288
〜291頁)(1981） pJC75〜58 (J.Collins, Methcd in Enzymology第68巻、
309〜326頁)(1979）この段階は最後の宿主細胞の外側で
再び行なわれる。この方法のための有用な技術はリンカ
ーと関連して上記の文献に記載され、同様に次の文献に
も記載されている。V.Hershfield, H.W.Boyer, C.Yanof
sky, M.A.Lovett & K.Murray, Nature,第251巻、476〜4
82頁(1974), F.R.Blattner外, Science,第196頁, 161〜
169頁(1977)。
【００２３】第５段階では、組換えＤＮＡ分子は、例え
ばM.Mandel & A.Higa(1970) J.Mol.Biol. 第53巻、159
〜162頁、P.C.Wensink, D.J.Finnegan, J.E.Donelson &
D.S.Hogness, Cell第３巻、315〜325頁(1974)、S.N.Co
hen, A.C.Y.ChangおよびL.Hsu, Proc.Natl.Acad.Sci.US
A第69巻、2110〜2114頁、(1972)、H.M.Goodman,および
R.J.MacDoanld, Methods in Enzymology第68巻、75〜90
頁(1979)、E.M.LederbergおよびS.N.Cohen, J.Bact.第1
19巻、1072〜1074頁(1974)に記載された通常の方法を用
いて、宿主細胞株の細胞質中に導入されることができ
る。
ばM.Mandel & A.Higa(1970) J.Mol.Biol. 第53巻、159
〜162頁、P.C.Wensink, D.J.Finnegan, J.E.Donelson &
D.S.Hogness, Cell第３巻、315〜325頁(1974)、S.N.Co
hen, A.C.Y.ChangおよびL.Hsu, Proc.Natl.Acad.Sci.US
A第69巻、2110〜2114頁、(1972)、H.M.Goodman,および
R.J.MacDoanld, Methods in Enzymology第68巻、75〜90
頁(1979)、E.M.LederbergおよびS.N.Cohen, J.Bact.第1
19巻、1072〜1074頁(1974)に記載された通常の方法を用
いて、宿主細胞株の細胞質中に導入されることができ
る。
【００２４】正確なクローンの確認は雑種化選択（hybr
idization selection)の方法によって、または合成オリ
ゴヌクレオチドを用いるプロービング(probing)によっ
て遂行することができる(T.Taniguchi, Y.Fujii, Kuriy
amaおよびM.Muramatsu, Proc, Natl, Acad.Sci.USA 第7
7巻、4003〜4006頁(1980)、R.P.Ricciardi, J.S.Miller
& B.E.Roberts, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第76巻、492
7〜4931頁(1979)、D.L.Montgomery, B.D.Hall, S.Gilla
mおよびM.Smith, Cell 第14巻、673〜680頁〔1978〕)。
idization selection)の方法によって、または合成オリ
ゴヌクレオチドを用いるプロービング(probing)によっ
て遂行することができる(T.Taniguchi, Y.Fujii, Kuriy
amaおよびM.Muramatsu, Proc, Natl, Acad.Sci.USA 第7
7巻、4003〜4006頁(1980)、R.P.Ricciardi, J.S.Miller
& B.E.Roberts, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第76巻、492
7〜4931頁(1979)、D.L.Montgomery, B.D.Hall, S.Gilla
mおよびM.Smith, Cell 第14巻、673〜680頁〔1978〕)。
【００２５】新たに改変された宿主細胞はついでクロー
ン化され、所望遺伝子の発現が得られる。例えば、ラク
トースオペロンプロモーターを使用するGuarenteらの技
術(1980)（L.Guarente, G.Lauer, T.M.Roberts & M.Pta
shne, Cell第20巻、543〜553頁〔1980〕, L.Guarente,
T.M.Roberts & M.Ptashne, Science第209巻、1428〜143
0頁〔1980〕）によって、外来性ＤＮＡの発現が得ら
れ、かつ最適化される。他のプロモーターは、それらの
プロモーターが所望の細菌、酵母または他の宿主細胞中
で活性である間は、当業界公知の発現を得るために使用
されることができる。そのようなプロモーターには、大
腸菌トリプトファンオペロン、またはβ−ラクタマーゼ
プロモーター、およびサッカロミセス・セレビシエ−、
ウラシル３または転化酵素プロモーターが包含される。
ン化され、所望遺伝子の発現が得られる。例えば、ラク
トースオペロンプロモーターを使用するGuarenteらの技
術(1980)（L.Guarente, G.Lauer, T.M.Roberts & M.Pta
shne, Cell第20巻、543〜553頁〔1980〕, L.Guarente,
T.M.Roberts & M.Ptashne, Science第209巻、1428〜143
0頁〔1980〕）によって、外来性ＤＮＡの発現が得ら
れ、かつ最適化される。他のプロモーターは、それらの
プロモーターが所望の細菌、酵母または他の宿主細胞中
で活性である間は、当業界公知の発現を得るために使用
されることができる。そのようなプロモーターには、大
腸菌トリプトファンオペロン、またはβ−ラクタマーゼ
プロモーター、およびサッカロミセス・セレビシエ−、
ウラシル３または転化酵素プロモーターが包含される。
【００２６】
【実施例】本発明の特定の実施例では、以下のとおり、
プレ−プロレンニンＡまたはプロレンニンＡを生産する
組換え大腸菌株を得ることができる。 １．ＲＮＡの単離 乳汁で飼育した子牛からの胃組織を地方屠殺場から新た
に得た。第４胃の粘膜を胃壁から切り離し、ドライアイ
ス中で冷凍した。粘膜組織21ｇを50mM Tris・HCl(pH7.
5)、8MグアニジンHCl、および１mMジチオトレイトール
からなる冷却した緩衝液 (10℃) 200ml に添加して混合
機により分断した。不溶性材料はSorvallSA-600回転機
中で12分間、10,000 rpmで遠心分離することによって除
去した。スピン(spin)からの表面浮上物質200 mlを冷却
した無水エタノール100mlに添加した。-20℃で1.5時間
後、沈澱を−10℃で30分間、3000rpmで遠心分離するこ
とによってペレット化した。ペレットは、20mM EDTA (p
H 7)、20mM NaOAc (pH 7)、8MグアニジンHCl、および１
mMジチオトレイトールからなる氷で冷却した緩衝液(EGA
D)40mlに溶解させた。冷却した無水エタノール20mlを添
加し、ついでその溶液を-20℃で45分間放置した。沈澱
を−10℃で20分間、3000rpmで遠心分離することによっ
てペレット化した。ペレットを冷却したEGAD緩衝液40ml
中に溶かし、冷却したエタノール20mlで沈澱させ、遠心
分離し、そしてEGAD緩衝液中にペレットを再溶解させる
操作をさらに２回くり返した。最後に、ペレットを20mM
EDTA (pH7) 16mlに溶かし、クロロホルム：イソブタノ
ール（４：１）で３回抽出した。次に、4.5M NaOAc(pH
5.2)の２容積を水性層に添加し、その溶液を−20℃で一
夜放置した。ＲＮＡの沈澱を−10℃で25分間、10,000rp
mで遠心分離することによって収集し、ついで水30mlに
溶かした。収量はＲＮＡ 45mgであった。ＲＮＡを2MNaO
Ac(pH5)１mlおよび無水エタノール75mlの添加によって
沈澱させ、ついで−20℃で一夜インキュベーションし
た。ＲＮＡを遠心分離（10,000rpm、10分間、−10℃)に
よってペレット化し、水20mlに再溶解し、60℃で10分間
加熱し、氷上で急速に冷却し、２×濃縮した結合緩衝液
〔20mM Tris・HCl(pH7.5), 2mM EDTA(pH 7)，0.4％SDS
および0.24M NaCl〕で希釈した。ＲＮＡを４mlのオリゴ
ーdT−セルローズカラムに付し、カラムを１×濃縮した
結合緩衝液で洗い、ついでポリＡ−含有ＲＮＡを、カラ
ムをNaCl非含有の結合緩衝液で洗うことによって溶離し
た。ポリＡ−含有ＲＮＡ約１mgが得られた。ポリＡ−含
有ＲＮＡの一部分をラビット・レティキュロサイト（re
ticulocyte）・リゼイト（lysate）・システム（H.R.B.
PelhamおよびR.J.Jackson〔1976〕Eur.J.Biochem.第67
巻、247〜256頁）中で試験管内で翻訳した。蛋白生成物
は10％ポリアクリルアミド・ゲル上で分析した。単一の
主要蛋白の帯が観察され、これはレンニン抗血清と共に
沈澱した。このことはレンニンｍＲＮＡがポリＡ−含有
ＲＮＡ中に存在することを示している。
プレ−プロレンニンＡまたはプロレンニンＡを生産する
組換え大腸菌株を得ることができる。 １．ＲＮＡの単離 乳汁で飼育した子牛からの胃組織を地方屠殺場から新た
に得た。第４胃の粘膜を胃壁から切り離し、ドライアイ
ス中で冷凍した。粘膜組織21ｇを50mM Tris・HCl(pH7.
5)、8MグアニジンHCl、および１mMジチオトレイトール
からなる冷却した緩衝液 (10℃) 200ml に添加して混合
機により分断した。不溶性材料はSorvallSA-600回転機
中で12分間、10,000 rpmで遠心分離することによって除
去した。スピン(spin)からの表面浮上物質200 mlを冷却
した無水エタノール100mlに添加した。-20℃で1.5時間
後、沈澱を−10℃で30分間、3000rpmで遠心分離するこ
とによってペレット化した。ペレットは、20mM EDTA (p
H 7)、20mM NaOAc (pH 7)、8MグアニジンHCl、および１
mMジチオトレイトールからなる氷で冷却した緩衝液(EGA
D)40mlに溶解させた。冷却した無水エタノール20mlを添
加し、ついでその溶液を-20℃で45分間放置した。沈澱
を−10℃で20分間、3000rpmで遠心分離することによっ
てペレット化した。ペレットを冷却したEGAD緩衝液40ml
中に溶かし、冷却したエタノール20mlで沈澱させ、遠心
分離し、そしてEGAD緩衝液中にペレットを再溶解させる
操作をさらに２回くり返した。最後に、ペレットを20mM
EDTA (pH7) 16mlに溶かし、クロロホルム：イソブタノ
ール（４：１）で３回抽出した。次に、4.5M NaOAc(pH
5.2)の２容積を水性層に添加し、その溶液を−20℃で一
夜放置した。ＲＮＡの沈澱を−10℃で25分間、10,000rp
mで遠心分離することによって収集し、ついで水30mlに
溶かした。収量はＲＮＡ 45mgであった。ＲＮＡを2MNaO
Ac(pH5)１mlおよび無水エタノール75mlの添加によって
沈澱させ、ついで−20℃で一夜インキュベーションし
た。ＲＮＡを遠心分離（10,000rpm、10分間、−10℃)に
よってペレット化し、水20mlに再溶解し、60℃で10分間
加熱し、氷上で急速に冷却し、２×濃縮した結合緩衝液
〔20mM Tris・HCl(pH7.5), 2mM EDTA(pH 7)，0.4％SDS
および0.24M NaCl〕で希釈した。ＲＮＡを４mlのオリゴ
ーdT−セルローズカラムに付し、カラムを１×濃縮した
結合緩衝液で洗い、ついでポリＡ−含有ＲＮＡを、カラ
ムをNaCl非含有の結合緩衝液で洗うことによって溶離し
た。ポリＡ−含有ＲＮＡ約１mgが得られた。ポリＡ−含
有ＲＮＡの一部分をラビット・レティキュロサイト（re
ticulocyte）・リゼイト（lysate）・システム（H.R.B.
PelhamおよびR.J.Jackson〔1976〕Eur.J.Biochem.第67
巻、247〜256頁）中で試験管内で翻訳した。蛋白生成物
は10％ポリアクリルアミド・ゲル上で分析した。単一の
主要蛋白の帯が観察され、これはレンニン抗血清と共に
沈澱した。このことはレンニンｍＲＮＡがポリＡ−含有
ＲＮＡ中に存在することを示している。
【００２７】２．２本鎖コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の作
成 50mM Tris・HCl(pH8.3), 100mM KCl, 8mM MgCl2, 0.4mM
ジチオトレイトール、各１mMデオキシヌクレオシド・ト
リフォスフェート、100単位の逆転写酵素を含有する20
μg/mlオリゴ(-dT)12-18および１Ci/mM α32p-dCTP中で
42℃、１時間インキュベーションすることによって、子
牛の胃ポリＡ−含有ＲＮＡ 20μgからcＤＮＡ約8.7μg
を合成した。反応混合物を100℃で３分間加熱した後、
氷上で３分間冷却し、沈澱した蛋白を遠心分離によって
除去し、表面浮上材料の半分に100mM HepesKOH (pH6.
9), ５mM MgCl2, 0.5mMジチオトレイトール、0.125mMデ
オキシヌクレオシド・トリフォスフェートを添加した。
この混合物を300単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと
共に16℃で２時間インキュベーションすることによっ
て、２本鎖ｃＤＮＡ 8.6μgが作成された。このＤＮＡ
をフェノールで抽出し、Sephadex G-100(12mlのカラ
ム、0.7cm×30cm、20mM Tris ・ HCl (pH7.5), 0.5mMEDT
A(pH7.5)で溶離）上でクロマトグラフィーを行なうこと
によってとり込まれなかったトリフォスフェートから分
離し、2M NaOAc(pH 5)１／10容積、および冷却したエタ
ノール2.5容積の添加によって−20℃で一夜、エタノー
ル沈澱させた。２本鎖ｃＤＮＡ（4.6μg)をついで1000
単位のSlヌクレアーゼで37℃で１時間、BufferS(0.3M N
aCl, 30mM NaOAc(pH4.6), 3mM ZnSO4)中で処理した。反
応は10mM EDTA、および200mM Tris・ HCl(pH8.3)の添加
によって終了させ、混合物をバイオゲルＡ−150ｍカラ
ム（0.7cm×33cm）にかけて平衡させ、10mM Tris ・ HCl
(pH7.5), １mM EDTAおよび250mM NaClで溶離した。高分
子量ＤＮＡのピーク画分（各0.5ml）をプールし、2M Na
OAc(pH 5)１／10容積および冷却した無水エタノール2.5
容積の添加によってエタノール沈澱させた。
成 50mM Tris・HCl(pH8.3), 100mM KCl, 8mM MgCl2, 0.4mM
ジチオトレイトール、各１mMデオキシヌクレオシド・ト
リフォスフェート、100単位の逆転写酵素を含有する20
μg/mlオリゴ(-dT)12-18および１Ci/mM α32p-dCTP中で
42℃、１時間インキュベーションすることによって、子
牛の胃ポリＡ−含有ＲＮＡ 20μgからcＤＮＡ約8.7μg
を合成した。反応混合物を100℃で３分間加熱した後、
氷上で３分間冷却し、沈澱した蛋白を遠心分離によって
除去し、表面浮上材料の半分に100mM HepesKOH (pH6.
9), ５mM MgCl2, 0.5mMジチオトレイトール、0.125mMデ
オキシヌクレオシド・トリフォスフェートを添加した。
この混合物を300単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと
共に16℃で２時間インキュベーションすることによっ
て、２本鎖ｃＤＮＡ 8.6μgが作成された。このＤＮＡ
をフェノールで抽出し、Sephadex G-100(12mlのカラ
ム、0.7cm×30cm、20mM Tris ・ HCl (pH7.5), 0.5mMEDT
A(pH7.5)で溶離）上でクロマトグラフィーを行なうこと
によってとり込まれなかったトリフォスフェートから分
離し、2M NaOAc(pH 5)１／10容積、および冷却したエタ
ノール2.5容積の添加によって−20℃で一夜、エタノー
ル沈澱させた。２本鎖ｃＤＮＡ（4.6μg)をついで1000
単位のSlヌクレアーゼで37℃で１時間、BufferS(0.3M N
aCl, 30mM NaOAc(pH4.6), 3mM ZnSO4)中で処理した。反
応は10mM EDTA、および200mM Tris・ HCl(pH8.3)の添加
によって終了させ、混合物をバイオゲルＡ−150ｍカラ
ム（0.7cm×33cm）にかけて平衡させ、10mM Tris ・ HCl
(pH7.5), １mM EDTAおよび250mM NaClで溶離した。高分
子量ＤＮＡのピーク画分（各0.5ml）をプールし、2M Na
OAc(pH 5)１／10容積および冷却した無水エタノール2.5
容積の添加によってエタノール沈澱させた。
【００２８】３．Hind IIIリンカーの添加 Slで処理した２本鎖ｃＤＮＡ（1.7μg)をBufferT (25mM
Tris・ HCl(pH8), 6.6mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 5mM 2-メ
ルカプトエタノールおよび各0.5mMデオキシヌクレオシ
ド・トリフォスフェート）中で２単位のＴ4ＤＮＡポリ
メラーゼと共に室温で30分間インキュベーションした。
このＤＮＡをフェノールで抽出し、ついでエーテルで抽
出し、さらに2M NaOAc(pH 5)１／10容積およびエタノー
ル2.5容積の添加によってエタノール沈澱させた。こ
の、平滑末端を有する２本鎖ｃＤＮＡをついで66mM Tri
s ・ HCl(pH7.6), 6.6mM MgCl2, 5mM 2-メルカプトエタ
ノール、0.5mM ＡＴＰ中で、32PをラベルしたHind III
合成リンカー300pモル（100×過剰のｃＤＮＡ末端）お
よび平滑末端が９単位のＴ4ＤＮＡリガーゼと共に12℃
で一夜インキュベーションした。
Tris・ HCl(pH8), 6.6mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 5mM 2-メ
ルカプトエタノールおよび各0.5mMデオキシヌクレオシ
ド・トリフォスフェート）中で２単位のＴ4ＤＮＡポリ
メラーゼと共に室温で30分間インキュベーションした。
このＤＮＡをフェノールで抽出し、ついでエーテルで抽
出し、さらに2M NaOAc(pH 5)１／10容積およびエタノー
ル2.5容積の添加によってエタノール沈澱させた。こ
の、平滑末端を有する２本鎖ｃＤＮＡをついで66mM Tri
s ・ HCl(pH7.6), 6.6mM MgCl2, 5mM 2-メルカプトエタ
ノール、0.5mM ＡＴＰ中で、32PをラベルしたHind III
合成リンカー300pモル（100×過剰のｃＤＮＡ末端）お
よび平滑末端が９単位のＴ4ＤＮＡリガーゼと共に12℃
で一夜インキュベーションした。
【００２９】反応は10mM EDTA(pH8)で調整され、Biogel
A-150ｍカラム（0.7cm×20cm）上で分画した。高分子量
ＤＮＡを含有する画分（各0.25ml）をプールし、エタノ
ール沈澱させた。この材料を制限Hind IIIエンドヌクレ
アーゼ（９単位）で、5.6mMTris・ HCl(pH7.6), 5.6mM M
gCl2中で37℃で45分間処理し、ついでフェノールで抽出
し、エーテルで抽出し、さらに1M NaOAc(pH 5)１／10容
積および無水エタノール2.5容積の添加によってエタノ
ール沈澱させた。この、Hind III接着末端を有する２本
鎖ｃＤＮＡを次にflファージCGF4 2本鎖ＤＮＡに結合さ
せた。このflファージCGF4 2本鎖ＤＮＡは制限Hind III
エンドヌクレアーゼで切断開鎖され、かつH.Goodmanお
よびR.J.MacDonaldの方法（H.M.GoodmanおよびR.J.MacD
onald〔1979〕，Methods in Enzymology 第68巻、75〜9
1頁）により子牛の腸のフォスファターゼで２回処理す
ることによって末端リン酸塩を除去したものであった
｛注：ファージCGF4を生成させるために、flファージR2
29（J.D.Boecke〔1981〕Mol.Gen.Genet.第181巻、288〜
291頁）はEcoRIエンドヌクレアーゼで切断され、Ｔ4Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端とされ、ついでコラボラテ
ィブ・リサーチ社（マサチュセッツ州ウオルサム市）か
らのHind III合成オリゴヌクレオチド・リンカーで結合
された｝。この結合反応には66mM Tris ・ HCl(pH7.6),
5mM２−メルカプト−エタノール、２本鎖ｃＤＮＡ 0.3
μg、CGF4 DNA 0.2μg, 0.5mM ATPおよび接着末端300単
位のＴ4ＤＮＡリガーゼを含有させた。結合反応は16℃
で29時間行なわれた。
A-150ｍカラム（0.7cm×20cm）上で分画した。高分子量
ＤＮＡを含有する画分（各0.25ml）をプールし、エタノ
ール沈澱させた。この材料を制限Hind IIIエンドヌクレ
アーゼ（９単位）で、5.6mMTris・ HCl(pH7.6), 5.6mM M
gCl2中で37℃で45分間処理し、ついでフェノールで抽出
し、エーテルで抽出し、さらに1M NaOAc(pH 5)１／10容
積および無水エタノール2.5容積の添加によってエタノ
ール沈澱させた。この、Hind III接着末端を有する２本
鎖ｃＤＮＡを次にflファージCGF4 2本鎖ＤＮＡに結合さ
せた。このflファージCGF4 2本鎖ＤＮＡは制限Hind III
エンドヌクレアーゼで切断開鎖され、かつH.Goodmanお
よびR.J.MacDonaldの方法（H.M.GoodmanおよびR.J.MacD
onald〔1979〕，Methods in Enzymology 第68巻、75〜9
1頁）により子牛の腸のフォスファターゼで２回処理す
ることによって末端リン酸塩を除去したものであった
｛注：ファージCGF4を生成させるために、flファージR2
29（J.D.Boecke〔1981〕Mol.Gen.Genet.第181巻、288〜
291頁）はEcoRIエンドヌクレアーゼで切断され、Ｔ4Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端とされ、ついでコラボラテ
ィブ・リサーチ社（マサチュセッツ州ウオルサム市）か
らのHind III合成オリゴヌクレオチド・リンカーで結合
された｝。この結合反応には66mM Tris ・ HCl(pH7.6),
5mM２−メルカプト−エタノール、２本鎖ｃＤＮＡ 0.3
μg、CGF4 DNA 0.2μg, 0.5mM ATPおよび接着末端300単
位のＴ4ＤＮＡリガーゼを含有させた。結合反応は16℃
で29時間行なわれた。
【００３０】４．組換え−CGF4 DNAを用いる大腸菌BNN4
5のトランスフェクション(transfection） 大腸菌CGE6株(BNN45；hsdR-, hsdM+, supE, supF, Bl-,
met-）をトリプトン（tryptone）ビィヨン中で37℃で
振とうしながら生育させ、４℃で10分間、7000rpmで遠
心分離することによってOD700＝0.5で収穫した。細胞を
氷で冷却した50mM CaCl2（最初の培養容積の１／２）中
に再懸濁させ、ついで０℃で30分間放置した。懸濁液を
ついで４℃で10分間、7000rpmで遠心分離し、氷で冷却
した50mMCaCl2（最初の培養容積の１／20）中に懸濁し
た。０℃で60分間放置した後、細胞をトランスフェクシ
ョンのために使用した。20μlの結合反応剤(ligation r
eaction) の１／２μlを滅菌した50mM Tris ・ HCl(pH7.
6), 50μlを含有する８個の試験管の各々に添加した。C
aCl2で処理した細胞の１／10mlを各試験管に添加し、混
合物を氷上で30分間放置した。37℃まで２分間暖めた
後、CGE5(JM101 : J.Messing〔1979〕，V(lacpro) SupE
thi-バックグラウド中のF′tra D36 pro ABlac IZVM15)
一夜培養物0.2mlおよび0.7％ソフト・アガー（寒天）を
添加し、混合物を８個のトリプトン寒天プレート上に注
いだ。37℃で一夜インキュベーションすることにより、
プレート当り約250個のプラークが生じた。
5のトランスフェクション(transfection） 大腸菌CGE6株(BNN45；hsdR-, hsdM+, supE, supF, Bl-,
met-）をトリプトン（tryptone）ビィヨン中で37℃で
振とうしながら生育させ、４℃で10分間、7000rpmで遠
心分離することによってOD700＝0.5で収穫した。細胞を
氷で冷却した50mM CaCl2（最初の培養容積の１／２）中
に再懸濁させ、ついで０℃で30分間放置した。懸濁液を
ついで４℃で10分間、7000rpmで遠心分離し、氷で冷却
した50mMCaCl2（最初の培養容積の１／20）中に懸濁し
た。０℃で60分間放置した後、細胞をトランスフェクシ
ョンのために使用した。20μlの結合反応剤(ligation r
eaction) の１／２μlを滅菌した50mM Tris ・ HCl(pH7.
6), 50μlを含有する８個の試験管の各々に添加した。C
aCl2で処理した細胞の１／10mlを各試験管に添加し、混
合物を氷上で30分間放置した。37℃まで２分間暖めた
後、CGE5(JM101 : J.Messing〔1979〕，V(lacpro) SupE
thi-バックグラウド中のF′tra D36 pro ABlac IZVM15)
一夜培養物0.2mlおよび0.7％ソフト・アガー（寒天）を
添加し、混合物を８個のトリプトン寒天プレート上に注
いだ。37℃で一夜インキュベーションすることにより、
プレート当り約250個のプラークが生じた。
【００３１】５．大腸菌中のプレ−プロレンニンの発現 大腸菌のプレ−プロレンニンの発現を獲得するのを促進
するようにデザインされたプラスミド、pCGE5は、アガ
ロース・ゲルで精製したＤＮＡの３つの断片（segment)
によって構成された。プラスミドpBR322(4.5μg)は制限
エンドヌクレアーゼ、Hind III (N.E.Biolabs,６単位）
およびPstI (N.E.Biolabs,３単位）を37℃で１時間、50
mM NaCl、7mM Tris・HCl(pH7.5)、7mM MgCl2および6mM 2
-メルカプトエタノールを含有する50μlの反応剤(react
ion)中で切断された。組換えファージ293〜207からの２
本鎖RFIDNA(4μg)は制限エンドヌクレアーゼKpnI(N.E.B
iolabs, 10単位）で、37℃で１時間、Buffer K（6mM Na
Cl、6mM Tris・HCl(pH7.5)、6mM MgCl2、および6mM 2-メ
ルカプトエタノール）を含有する50μlの反応剤中で切
断された。プラスミドpLG400 (L.Guarente, G.Lauer,
T.Roberts, M.Ptasne, Cell第20巻、543〜553頁、1980)
からのＤＮＡ約4.5μgはHind III (N.E.Biolabs,６単
位）で、37℃で１時間、BufferH (60mM NaCl、7mM Tris
・HCl(pH7.5)、7mM MgCl）を含有する50μgの反応剤中で
切断された。フェノールで抽出し、エーテルで抽出し、
そしてエタノール沈澱を行なった後、293-207およびpLG
400からの切断ＤＮＡは、制限切断のところで平滑末端
を創製するために、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ−Ｌバ
イオケミカルズ、10単位)で、37℃で30分間、BufferT
(25mM Tris・HCl(pH 8)、6.6mM MgCl2、5mM 2-メルカプ
トエタノール、0.5mM EDTA、各0.5mMデオキシヌクレオ
チド・トリフォスフェート）を含有する50μlの反応剤
中で別々に処理された。フェノール抽出、エーテル抽出
およびエタノール沈澱を行なった後、pLG400 DNAはさら
にPstI (N.E.Biolabs,３単位）で、37℃で２時間、Buff
erp（50mM NaCl、7mM Tris・ HCl(pH7.5)、7mM MgCl2 6m
Mおよび2-メルカプトエタノール）50μl中で切断され、
一方293-207 DNAはHind III（N.E.Biolabs,６単位）
で、37℃で２時間、BufferH 50μl中で切断された。制
限切断ＤＮＡの３つの調製品の各々をフェノールで抽出
し、エーテルで抽出し、エタノール沈澱させ、水30μl
に再溶解し、予備の、かつ水平の１％アガロース・ゲル
に注入した。40mM Tris・アセテート（pH7.2)中で、70
〜80ボルトで３〜４時間電気泳動を行なった後、そのゲ
ルを臭化エチジウム（ethidium）で染色し、長波長の紫
外線下で試験した。293-207からの500ベース・ペアー
（bp）帯、pLG400からの6000bp帯、およびpBR322からの
800bp帯を切り取り、該ゲル・ピース（pieces）を凍ら
せ、かつ解かすことによりＤＮＡを抽出した（Thuring
外、Anal.Biochem.第66巻、213頁〔1975〕）。３つのＤ
ＮＡ断片（segment）のすべてをエタノール沈澱させ、
水に再溶解させた。各ピースの約0.15pモルを、14℃で
一夜、BufferL(66mM Tris ・ HCl(pH7.5)、6.7mM MgC
l2、10mMジチオトレイトール、0.75mM ATP）およびＴ4
ＤＮＡリガーゼ（N.E.Biolabs, 600単位）を含有する20
μlの反応剤中で互いに結合させた。転換能を有する大
腸菌CGE6株の細胞を前項４で述べた方法と全く同じよう
にして作り、50mM Tris ・ HCl(pH7.6) 50μl中の結合Ｄ
ＮＡ5μlを該細胞100μlと０℃と１時間混合し、37℃２
時間加熱処理し、ついで新たなトリプトン・ブイヨンで
10倍に希釈した。37℃で１時間、振とうしながらインキ
ュベーションした後、細胞をアンピリシン（ampicilli
n）20μg/mlを含有するトリプトン平板上で平板にし
た。アンピシリン耐性コロニーを選択し、プラスミドＤ
ＮＡを作成し、制限酵素の消化力によって分析した。こ
れらのいくつかの標準株によって、図１に示される所望
のプラスミドpCGE5が得られた。ＤＮＡ配列の分析は、2
93-207 DNAとpLG400 DNAとの間の結合が予期されたもの
であることを明らかにした。それ故、プレ−プロレンニ
ンの５′末端はGuarenteらのＩ″Ｚ融合の３′末端にフ
レームに融合させる。プラスミドＤＮＡは標準方法（D.
B.ClewellおよびD.R.Helinski, Proc.Nat.Acad.Sci.US
A.第62巻、1159〜1166頁〔1969〕）によってpCGE5を有
する株から作成された。
するようにデザインされたプラスミド、pCGE5は、アガ
ロース・ゲルで精製したＤＮＡの３つの断片（segment)
によって構成された。プラスミドpBR322(4.5μg)は制限
エンドヌクレアーゼ、Hind III (N.E.Biolabs,６単位）
およびPstI (N.E.Biolabs,３単位）を37℃で１時間、50
mM NaCl、7mM Tris・HCl(pH7.5)、7mM MgCl2および6mM 2
-メルカプトエタノールを含有する50μlの反応剤(react
ion)中で切断された。組換えファージ293〜207からの２
本鎖RFIDNA(4μg)は制限エンドヌクレアーゼKpnI(N.E.B
iolabs, 10単位）で、37℃で１時間、Buffer K（6mM Na
Cl、6mM Tris・HCl(pH7.5)、6mM MgCl2、および6mM 2-メ
ルカプトエタノール）を含有する50μlの反応剤中で切
断された。プラスミドpLG400 (L.Guarente, G.Lauer,
T.Roberts, M.Ptasne, Cell第20巻、543〜553頁、1980)
からのＤＮＡ約4.5μgはHind III (N.E.Biolabs,６単
位）で、37℃で１時間、BufferH (60mM NaCl、7mM Tris
・HCl(pH7.5)、7mM MgCl）を含有する50μgの反応剤中で
切断された。フェノールで抽出し、エーテルで抽出し、
そしてエタノール沈澱を行なった後、293-207およびpLG
400からの切断ＤＮＡは、制限切断のところで平滑末端
を創製するために、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ−Ｌバ
イオケミカルズ、10単位)で、37℃で30分間、BufferT
(25mM Tris・HCl(pH 8)、6.6mM MgCl2、5mM 2-メルカプ
トエタノール、0.5mM EDTA、各0.5mMデオキシヌクレオ
チド・トリフォスフェート）を含有する50μlの反応剤
中で別々に処理された。フェノール抽出、エーテル抽出
およびエタノール沈澱を行なった後、pLG400 DNAはさら
にPstI (N.E.Biolabs,３単位）で、37℃で２時間、Buff
erp（50mM NaCl、7mM Tris・ HCl(pH7.5)、7mM MgCl2 6m
Mおよび2-メルカプトエタノール）50μl中で切断され、
一方293-207 DNAはHind III（N.E.Biolabs,６単位）
で、37℃で２時間、BufferH 50μl中で切断された。制
限切断ＤＮＡの３つの調製品の各々をフェノールで抽出
し、エーテルで抽出し、エタノール沈澱させ、水30μl
に再溶解し、予備の、かつ水平の１％アガロース・ゲル
に注入した。40mM Tris・アセテート（pH7.2)中で、70
〜80ボルトで３〜４時間電気泳動を行なった後、そのゲ
ルを臭化エチジウム（ethidium）で染色し、長波長の紫
外線下で試験した。293-207からの500ベース・ペアー
（bp）帯、pLG400からの6000bp帯、およびpBR322からの
800bp帯を切り取り、該ゲル・ピース（pieces）を凍ら
せ、かつ解かすことによりＤＮＡを抽出した（Thuring
外、Anal.Biochem.第66巻、213頁〔1975〕）。３つのＤ
ＮＡ断片（segment）のすべてをエタノール沈澱させ、
水に再溶解させた。各ピースの約0.15pモルを、14℃で
一夜、BufferL(66mM Tris ・ HCl(pH7.5)、6.7mM MgC
l2、10mMジチオトレイトール、0.75mM ATP）およびＴ4
ＤＮＡリガーゼ（N.E.Biolabs, 600単位）を含有する20
μlの反応剤中で互いに結合させた。転換能を有する大
腸菌CGE6株の細胞を前項４で述べた方法と全く同じよう
にして作り、50mM Tris ・ HCl(pH7.6) 50μl中の結合Ｄ
ＮＡ5μlを該細胞100μlと０℃と１時間混合し、37℃２
時間加熱処理し、ついで新たなトリプトン・ブイヨンで
10倍に希釈した。37℃で１時間、振とうしながらインキ
ュベーションした後、細胞をアンピリシン（ampicilli
n）20μg/mlを含有するトリプトン平板上で平板にし
た。アンピシリン耐性コロニーを選択し、プラスミドＤ
ＮＡを作成し、制限酵素の消化力によって分析した。こ
れらのいくつかの標準株によって、図１に示される所望
のプラスミドpCGE5が得られた。ＤＮＡ配列の分析は、2
93-207 DNAとpLG400 DNAとの間の結合が予期されたもの
であることを明らかにした。それ故、プレ−プロレンニ
ンの５′末端はGuarenteらのＩ″Ｚ融合の３′末端にフ
レームに融合させる。プラスミドＤＮＡは標準方法（D.
B.ClewellおよびD.R.Helinski, Proc.Nat.Acad.Sci.US
A.第62巻、1159〜1166頁〔1969〕）によってpCGE5を有
する株から作成された。
【００３２】ラクトース・オペロン・プロモーターおよ
びリボソーム結合サイトを担うＤＮＡ断片は、ＤＮＡ 1
0μgをPvuII （N.E.Biolabs, 7.5単位）およびPstI (N.
E.Biolabs,４単位）で、37℃で２時間、BufferPを含有
する反応剤100μl中で切断することによって、プラスミ
ドpGL101(L.Guarente, G.Lauer, T.RobertsおよびM.Pta
shne, Cell第20巻、543〜553〔1981〕）から単離され
た。850bp断片は上述したような帯の除去および冷凍／
解凍の技術によって予備のアガロース・ゲルから単離さ
れた。
びリボソーム結合サイトを担うＤＮＡ断片は、ＤＮＡ 1
0μgをPvuII （N.E.Biolabs, 7.5単位）およびPstI (N.
E.Biolabs,４単位）で、37℃で２時間、BufferPを含有
する反応剤100μl中で切断することによって、プラスミ
ドpGL101(L.Guarente, G.Lauer, T.RobertsおよびM.Pta
shne, Cell第20巻、543〜553〔1981〕）から単離され
た。850bp断片は上述したような帯の除去および冷凍／
解凍の技術によって予備のアガロース・ゲルから単離さ
れた。
【００３３】プラスミドpCGE5 DNA (40μg)は、Hind II
I (CRI, 70単位)で37℃で１時間、BufferH(上記参照)を
含有する反応剤150μl中で切断された。このＤＮＡは次
にエクソヌクレアーゼBal 31(N.E.Biolabs, ５単位）
で、30℃で10分間、BufferB(0.6M NaCl、12mM CaCl2、1
2mM MgCl2、20mM Tris ・ HCl(pH8)、１mMおよびEDTA)を
含有する反応剤200μl中で消化された（図２参照）。ゲ
ル電気泳動による分析は、Bal 31処理が十分な数のヌク
レオチドを除去してプレ−プロレンニンのためのＡＴＧ
開始コドン付近の５′末端を有する一群の断片をもたら
したことを示した。ＤＮＡはＴ4ＤＮＡポリメラーゼを
用いる上記の方法によって平滑 端とし、ついでＤＮＡ
（１μg)はPstI (N.E.Biolabs, 0.06単位）で、37℃で
５分間、BufferPを含有する反応剤20μl中で部分的に消
化された。次にこのＤＮＡは、BufferL中にＴ4ＤＮＡリ
ガーゼ(CRI, 300単位)を含有する反応剤20μl中で、ラ
クトースオペロンプロモーターおよびリボソーム結合サ
イト(0.2μg)を有するＤＮＡ断片850bpと結合せしめら
れた。大腸菌CGE7株の転換能を有する細胞(NK5031, suI
II+, lacVM5265. nalr, F-, Bl-）は株CGE6に対する上
記方法と全く同じ方法で作られ、懸濁液中の細胞100μl
は該反応剤５μlで転換せしめられ、インキュベーショ
ンされ、熱ショックを受け、pCGE5によるCGE6の転換に
対する上記方法と全く同じ方法でアンピシリン耐性の表
現型の発現のために生育せしめられた。細胞は、MacCon
keyラクトースおよびアンピシリン(20μg/ml) 培地上で
平板にした。β−ガラクトシダーゼを示す、暗い赤色の
コロニーを選択し、β−ガラグトシダーゼ活性を評価分
析した（J.Miller, Experiments in Molecular Genetic
s、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、1927）。プラスミドＤＮＡを12個のこれ
らの転換細胞(transformant)から単離し、制限酵素の消
化力およびアガロースまたはポリアクリルアミド・ゲル
の電気泳動によって分析した。１個の株、CGE20はプラ
スミドpCGE17（図３参照）上のプレ−プロレンニン−
Ｉ″Ｚ融合のＡＴＧ開始コドンからの約40個のヌクレオ
チド、ラクトースオペロンプロモーターを有し、β−ガ
ラクトシダーゼの中間レベル（CGE6のようなラクトース
+株の完全に誘起されたレベルの約１／３）を生じさせ
る。
I (CRI, 70単位)で37℃で１時間、BufferH(上記参照)を
含有する反応剤150μl中で切断された。このＤＮＡは次
にエクソヌクレアーゼBal 31(N.E.Biolabs, ５単位）
で、30℃で10分間、BufferB(0.6M NaCl、12mM CaCl2、1
2mM MgCl2、20mM Tris ・ HCl(pH8)、１mMおよびEDTA)を
含有する反応剤200μl中で消化された（図２参照）。ゲ
ル電気泳動による分析は、Bal 31処理が十分な数のヌク
レオチドを除去してプレ−プロレンニンのためのＡＴＧ
開始コドン付近の５′末端を有する一群の断片をもたら
したことを示した。ＤＮＡはＴ4ＤＮＡポリメラーゼを
用いる上記の方法によって平滑 端とし、ついでＤＮＡ
（１μg)はPstI (N.E.Biolabs, 0.06単位）で、37℃で
５分間、BufferPを含有する反応剤20μl中で部分的に消
化された。次にこのＤＮＡは、BufferL中にＴ4ＤＮＡリ
ガーゼ(CRI, 300単位)を含有する反応剤20μl中で、ラ
クトースオペロンプロモーターおよびリボソーム結合サ
イト(0.2μg)を有するＤＮＡ断片850bpと結合せしめら
れた。大腸菌CGE7株の転換能を有する細胞(NK5031, suI
II+, lacVM5265. nalr, F-, Bl-）は株CGE6に対する上
記方法と全く同じ方法で作られ、懸濁液中の細胞100μl
は該反応剤５μlで転換せしめられ、インキュベーショ
ンされ、熱ショックを受け、pCGE5によるCGE6の転換に
対する上記方法と全く同じ方法でアンピシリン耐性の表
現型の発現のために生育せしめられた。細胞は、MacCon
keyラクトースおよびアンピシリン(20μg/ml) 培地上で
平板にした。β−ガラクトシダーゼを示す、暗い赤色の
コロニーを選択し、β−ガラグトシダーゼ活性を評価分
析した（J.Miller, Experiments in Molecular Genetic
s、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、1927）。プラスミドＤＮＡを12個のこれ
らの転換細胞(transformant)から単離し、制限酵素の消
化力およびアガロースまたはポリアクリルアミド・ゲル
の電気泳動によって分析した。１個の株、CGE20はプラ
スミドpCGE17（図３参照）上のプレ−プロレンニン−
Ｉ″Ｚ融合のＡＴＧ開始コドンからの約40個のヌクレオ
チド、ラクトースオペロンプロモーターを有し、β−ガ
ラクトシダーゼの中間レベル（CGE6のようなラクトース
+株の完全に誘起されたレベルの約１／３）を生じさせ
る。
【００３４】ラクトースプロモーターおよびリボソーム
結合サイトに融合した全プレ−プロレンニン遺伝子を有
するプラスミドを創製するために、pCGE17 DNA(4μg)を
BglII (N.E.Biolabs, ６単位）で、37℃で１時間、Buff
erPを含有する反応剤90μl中で切断した。ついで、100m
M Tris・ HCl(pH7.5)を添加し、該ＤＮＡをさらにEcoRI
(Boehringer/Mannheim, 40単位）で、37℃て１時間切断
した。次に、pBR322 DNA(5μg)をPvuII (N.E.Biolabs,
５単位）で、37℃で１時間、BufferPを含有する反応剤4
5μl中で切断し、ついで100mM Tris・ HCl(pH7.5)および
EcoRI(Boehringer/Mannheim, 40単位）を添加して37℃
１時間さらにインキュベーションした。最後に、組換え
flファージ293-118/37 RFI DNA(6μg)をHind III (N.E.
Biolabs,６単位）で、37℃で１時間、BufferHを含有す
る反応剤50μl中で切断した。フェノール抽出およびエ
タノール沈澱を行なった後、切断されたＤＮＡをＴ4Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ、10単位)
で、室温で30分間、BufferTを含有する反応剤50μl中で
処理してHindIIIサイトを平滑にした。ついで、再溶解
した、フェノール抽出しかつエタノール沈澱したＤＮＡ
をBiglII(N.E.Biolabs, ４単位）で、37℃で１時間、Bu
fferPを含有する反応剤30μl中で切断した。３つの制限
酵素切断ＤＮＡ種を予備の水平アガロース・ゲルに塗抹
し、ついでpCGE17断片370bp、pBR322断片2300bpおよび2
93-118／37断片1000bpを切り取り、アガロースの塊りを
冷凍し、かつ解凍することにより溶離した。エタノール
沈澱を行なった後、ＤＮＡを水に再溶解し、各断片の約
0.2pモルを14℃で６時間、BufferLおよびＴ4ＤＮＡリガ
ーゼ(N.E.Biolabs, 300単位）を含有する反応剤20μl中
で互いに結合させた。大腸菌CGE6株を上記した方法によ
って結合ＲＮＡで転換し、アンピシリン耐性コロニーを
選択した。制限酵素切断によるプラスミドＤＮＡの分析
によって、CGE24株がラクトース・オペロン・プロモー
ターおよびリボソーム結合サイトに融合した全プレ−プ
ロレンニン配列を有するプラスミドpCGE21（図４参照）
を担持していることが明らかになった。
結合サイトに融合した全プレ−プロレンニン遺伝子を有
するプラスミドを創製するために、pCGE17 DNA(4μg)を
BglII (N.E.Biolabs, ６単位）で、37℃で１時間、Buff
erPを含有する反応剤90μl中で切断した。ついで、100m
M Tris・ HCl(pH7.5)を添加し、該ＤＮＡをさらにEcoRI
(Boehringer/Mannheim, 40単位）で、37℃て１時間切断
した。次に、pBR322 DNA(5μg)をPvuII (N.E.Biolabs,
５単位）で、37℃で１時間、BufferPを含有する反応剤4
5μl中で切断し、ついで100mM Tris・ HCl(pH7.5)および
EcoRI(Boehringer/Mannheim, 40単位）を添加して37℃
１時間さらにインキュベーションした。最後に、組換え
flファージ293-118/37 RFI DNA(6μg)をHind III (N.E.
Biolabs,６単位）で、37℃で１時間、BufferHを含有す
る反応剤50μl中で切断した。フェノール抽出およびエ
タノール沈澱を行なった後、切断されたＤＮＡをＴ4Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ、10単位)
で、室温で30分間、BufferTを含有する反応剤50μl中で
処理してHindIIIサイトを平滑にした。ついで、再溶解
した、フェノール抽出しかつエタノール沈澱したＤＮＡ
をBiglII(N.E.Biolabs, ４単位）で、37℃で１時間、Bu
fferPを含有する反応剤30μl中で切断した。３つの制限
酵素切断ＤＮＡ種を予備の水平アガロース・ゲルに塗抹
し、ついでpCGE17断片370bp、pBR322断片2300bpおよび2
93-118／37断片1000bpを切り取り、アガロースの塊りを
冷凍し、かつ解凍することにより溶離した。エタノール
沈澱を行なった後、ＤＮＡを水に再溶解し、各断片の約
0.2pモルを14℃で６時間、BufferLおよびＴ4ＤＮＡリガ
ーゼ(N.E.Biolabs, 300単位）を含有する反応剤20μl中
で互いに結合させた。大腸菌CGE6株を上記した方法によ
って結合ＲＮＡで転換し、アンピシリン耐性コロニーを
選択した。制限酵素切断によるプラスミドＤＮＡの分析
によって、CGE24株がラクトース・オペロン・プロモー
ターおよびリボソーム結合サイトに融合した全プレ−プ
ロレンニン配列を有するプラスミドpCGE21（図４参照）
を担持していることが明らかになった。
【００３５】２種類の分析は、この株が真正の合成牛プ
レ−プロレンニンであることを示している。まず最初
に、該細胞の粗抽出物がPeakらの方法(G.J.Peak, J.Mor
risおよびM.J.Buckman〔1979〕“Growth Hormones”in
Methods of Hormone Radloimmunoassay, 223〜244頁
〔B.M.Jaffe & H.R.Behrman編〕アカデミック・プレ
ス、ニューヨーク）によって行なわれた放射線免疫測定
法において、抗レンニン血清に対するヨード化レンニン
の結合を阻害する。ただし、上記の方法には次の修正が
施される。すなわち、ヨード化レンニンは50mMリン酸ナ
トリウム(pH6) 0.15MNaCl、１％ BSA中に貯蔵され、RIA
緩衝液は0.05M Tris・ HCl(pH8)、0.5％ヒト血清アルブ
ミンおよび0.1％亜硝酸ナトリウムから成り、インキュ
ベーションは４℃で18時間行なわれる。阻害量は、プレ
−プロレンニン約0.8μgが各mlの抽出物中に存在してい
ること（または細胞培養物のｌ当りプレ−プロレンニン
約４μg）を示している。第２に、細胞は、中間典型相
（midexponential phase）中で30分間、35S-メチオニン
でパルス(pulse) ラベルし、溶解し、抗レンニン血清で
免疫沈澱させた。(J.S.EmtageらNature第283巻、171〜1
75頁〔1980〕に記載されている。）免疫沈澱をSDS (U.
K.Laemmli & M.Favre, J.Mol.Biol. 第80巻、575〜599
頁〔1973〕）を含有する10％ポリアクリルアミドゲル上
で分析し、オートラジオグラフィーを行なうと、プレ−
プロレンニンとほぼ同じ大きさの帯が観察された。加え
て、レンニンと同じ大きさの帯もまた観察され、このこ
とは細菌がプレ−プロレンニンをレンニンに転化させて
いるか、または翻訳の第２の開始がプレ−プロレンニン
配列中で起こっていることを示唆するものである。プラ
スミドを含有しない親株CGE6の免疫沈澱中にはいかなる
帯も存在しなかった。これらの結果は、プレ−プロレン
ニンがプラスミドpCGE21を有する大腸菌細胞中で生産さ
れ、かつ生産のレベルが細胞当り約600分子であること
を示すものである。高レベルの生産は、同様のスキーム
（体系）を使用して、プレ−プロレンニンの開始コドン
に近似したラクトース・オペロンプロモーターの融合を
得ることによって達成することができる。
レ−プロレンニンであることを示している。まず最初
に、該細胞の粗抽出物がPeakらの方法(G.J.Peak, J.Mor
risおよびM.J.Buckman〔1979〕“Growth Hormones”in
Methods of Hormone Radloimmunoassay, 223〜244頁
〔B.M.Jaffe & H.R.Behrman編〕アカデミック・プレ
ス、ニューヨーク）によって行なわれた放射線免疫測定
法において、抗レンニン血清に対するヨード化レンニン
の結合を阻害する。ただし、上記の方法には次の修正が
施される。すなわち、ヨード化レンニンは50mMリン酸ナ
トリウム(pH6) 0.15MNaCl、１％ BSA中に貯蔵され、RIA
緩衝液は0.05M Tris・ HCl(pH8)、0.5％ヒト血清アルブ
ミンおよび0.1％亜硝酸ナトリウムから成り、インキュ
ベーションは４℃で18時間行なわれる。阻害量は、プレ
−プロレンニン約0.8μgが各mlの抽出物中に存在してい
ること（または細胞培養物のｌ当りプレ−プロレンニン
約４μg）を示している。第２に、細胞は、中間典型相
（midexponential phase）中で30分間、35S-メチオニン
でパルス(pulse) ラベルし、溶解し、抗レンニン血清で
免疫沈澱させた。(J.S.EmtageらNature第283巻、171〜1
75頁〔1980〕に記載されている。）免疫沈澱をSDS (U.
K.Laemmli & M.Favre, J.Mol.Biol. 第80巻、575〜599
頁〔1973〕）を含有する10％ポリアクリルアミドゲル上
で分析し、オートラジオグラフィーを行なうと、プレ−
プロレンニンとほぼ同じ大きさの帯が観察された。加え
て、レンニンと同じ大きさの帯もまた観察され、このこ
とは細菌がプレ−プロレンニンをレンニンに転化させて
いるか、または翻訳の第２の開始がプレ−プロレンニン
配列中で起こっていることを示唆するものである。プラ
スミドを含有しない親株CGE6の免疫沈澱中にはいかなる
帯も存在しなかった。これらの結果は、プレ−プロレン
ニンがプラスミドpCGE21を有する大腸菌細胞中で生産さ
れ、かつ生産のレベルが細胞当り約600分子であること
を示すものである。高レベルの生産は、同様のスキーム
（体系）を使用して、プレ−プロレンニンの開始コドン
に近似したラクトース・オペロンプロモーターの融合を
得ることによって達成することができる。
【００３６】CGE24株の抽出物もまた、B.Foltmannの標
準乳汁−凝固分析（Methods in Enzymology〔1970〕第1
9巻、421〜436頁）における活性を試験された。それら
の結果は、この大腸菌株が細胞当り約100分子の活性レ
ンニンまたは乳汁を凝固させることのできるレンニンの
活性断片を生産し、一方レンニンＤＮＡ配列を含有しな
いCGE6株からの抽出物が乳汁を凝固することができない
ことを示している。プラスミドpCGE21を有するCGE24株
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（AT
CC）に受入番号第31929号として寄託されている。
準乳汁−凝固分析（Methods in Enzymology〔1970〕第1
9巻、421〜436頁）における活性を試験された。それら
の結果は、この大腸菌株が細胞当り約100分子の活性レ
ンニンまたは乳汁を凝固させることのできるレンニンの
活性断片を生産し、一方レンニンＤＮＡ配列を含有しな
いCGE6株からの抽出物が乳汁を凝固することができない
ことを示している。プラスミドpCGE21を有するCGE24株
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（AT
CC）に受入番号第31929号として寄託されている。
【００３７】CGE24株は、図５によって定義されるプラ
スミドpCGE21を有する大腸菌BNN45株(hsdR- hsdM+ supE
44 supF Bl-met-)( アドバンスド・バクテリアル・ジェ
ネティックス、R.W.Davis, D.Botstein, J.R.Roth,コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ−、コールド
・スプリング・ハーバー，ニューヨーク、1980、７頁）
である。このプラスミドは、プラスミドpBR322（ヌクレ
オチド2067〜4360, J.G.Sutcliffe〔1979〕コールド・
スプリング・ハーバー・シンポジウム、第43巻、77〜90
頁参照）の一部分並びに、EcoRIおよびプラスミドpGL10
1(L.Guarente,G.Lauer, T.M.RobertsおよびM.Ptashne
〔1980〕Cell第20巻、543〜553頁）からのPvuIIサイト
によって、プレ−プロレンニン分子（組換えflファージ
293-207および293〜118／37からの）をコードする約130
0個のヌクレオチドに融合した95ベース・ペア−の断片
を含有している。その配置は、ラクトースオペロンプロ
モーターが大腸菌中でプレ−プロレンニン蛋白の発現を
進行させるような具合になっている（図５参照）。
スミドpCGE21を有する大腸菌BNN45株(hsdR- hsdM+ supE
44 supF Bl-met-)( アドバンスド・バクテリアル・ジェ
ネティックス、R.W.Davis, D.Botstein, J.R.Roth,コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ−、コールド
・スプリング・ハーバー，ニューヨーク、1980、７頁）
である。このプラスミドは、プラスミドpBR322（ヌクレ
オチド2067〜4360, J.G.Sutcliffe〔1979〕コールド・
スプリング・ハーバー・シンポジウム、第43巻、77〜90
頁参照）の一部分並びに、EcoRIおよびプラスミドpGL10
1(L.Guarente,G.Lauer, T.M.RobertsおよびM.Ptashne
〔1980〕Cell第20巻、543〜553頁）からのPvuIIサイト
によって、プレ−プロレンニン分子（組換えflファージ
293-207および293〜118／37からの）をコードする約130
0個のヌクレオチドに融合した95ベース・ペア−の断片
を含有している。その配置は、ラクトースオペロンプロ
モーターが大腸菌中でプレ−プロレンニン蛋白の発現を
進行させるような具合になっている（図５参照）。
【００３８】６．大腸菌中のメチオニンプロレンニンの
発現 プレ−プロレンニン遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼ
HhaIのための３つの容認サイト（GCGC〔配列表の配列番
号１参照〕を認める）を含有し、それらの１つは“プ
レ”暗号配列を除去し、プロレンニンのための配列から
アラニンコドンのための最初のヌクレオチド（Ｇ）を取
り去ったものを残す。したがって、我々はほとんど無傷
の（完全な）プロレンニン遺伝子を表わす、この部分的
なHhaI消化生成物を単離した。組換えファージ293-118
／37からのRFI ２本鎖ＤＮＡ 18μgを制限Hind III (N.
E.Biolabs)12単位で、BufferH 50μl中で、37℃で１時
間切断した。レンニンＤＮＡを有する挿入物約1230bp
を、冷凍／解凍法による１％アガロース・ゲル上の適当
な帯から該ＤＮＡを抽出することにより精製した。この
ＤＮＡ約1．5μgを、BufferP 30μl中でHhaI (N.E.Biol
abs) 0.25単位と共に37℃で５分間インキュベーション
することによって部分的なHhaI切断に付した。切断され
ていない断片プラス293〜118／37の開始点から約25個の
ヌクレオチドを欠ている１箇所切断された断片に相当す
るＤＮＡを２％アガロース・ゲル上の帯から単離した。
プラスミドpBR322 DNA (10μg)を制限エンドヌクレアー
ゼHind II(N.E.Biolabs、９単位）で、BufferH 10μl中
で、37℃で１時間切断した。このＤＮＡをフェノール抽
出し、ついでエタノール沈澱させた。ＤＮＡ（すなわち
部分的なHhaI切断293〜118／37およびHind III切断pBR3
22）の各約0.5pモルを結合させ、水28μlに再溶解さ
せ、ついでＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer/Mannhei
m,９単位）で、BufferD(60mM Tris・HCl(pH7.5)、80mM M
gCl2、10mMジチオトレイトール、１mM ATPおよび各0.2m
Mデオキシヌクレオチド・トリフォスフェート）を含有
する反応剤40μl中で、10℃で10分間処理することによ
って平滑末端とした。XbaI制限エンドヌクレアーゼ配列
プラスATGGを有する合成オリゴヌクレオチド (すなわ
ち、CCATCTAGATGG）を、コラボラティブ・リサーチ社に
よるトリエステル方法（K.Itakuraら、J.Biol.Chem.第2
50巻、4592頁〔1975〕）によって合成し、その５μgを
Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼ(Ｐ−Ｌバイオケミカル
ズ）６単位を用いて、BufferY (70mM Tris・ HCl(pH7.
6)、10mM MgCl2 10mM 2-メルカプトエタノールおよび２
mM ATP）を含有する反応剤25μl中で、α32P-ATPでキナ
ーゼ化した。この５′−ラベル化オリゴヌクレオチド
を、その濃度を一定に保つための追加の緩衝液成分およ
びＴ4ＤＮＡリガーゼ(N.E.Biolabs)600単位と一緒に平
滑末端反応剤40μlに添加した。反応剤を14℃で一夜イ
ンキュベーションし、ついで180mM NaCl、7mM MgCl2お
よび5mM Tris・HCl(pH8)からなる溶液５容積で希釈し
た。65℃で５分間加熱した後、そのＤＮＡをXbaI制限エ
ンドヌクレアーゼ45単位で処理した(３時間の全消化時
間に対して１時間当り15単位を添加した）。最後に、オ
リゴヌクレオチド単量体を、バイオゲルＡ−５ｍカラム
（0.68×36cm、上記参照)上でゲル濾過することによっ
て大きなＤＮＡから分離した。除外されたＤＮＡをプー
ルし、エタノール沈澱させ、水12μlに再溶解させ、Buf
ferLおよびＴ4ＤＮＡリガーゼ(N.E.Biolabs)300単位を
含有する結合反応剤中で、14℃で一夜インキュベーショ
ンした。この結果反応剤5μlを、上記したようにCGE6株
の細胞に転換能を付与するために使用した。転換した細
胞は、アンピシリン20μg/mlを含有するトリプトン平板
上で平板にし、コロニーを選択し、テトラサイクリン感
受性をスクリーニングした。制限酵素消化 (XbaIプラス
KpnI) およびポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による
プラスミドＤＮＡの分析は、所望のプラスミドpCGE181
(すなわち、XbaI-KpnI断片を生ずる)を有する１個の株
を示していた。
発現 プレ−プロレンニン遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼ
HhaIのための３つの容認サイト（GCGC〔配列表の配列番
号１参照〕を認める）を含有し、それらの１つは“プ
レ”暗号配列を除去し、プロレンニンのための配列から
アラニンコドンのための最初のヌクレオチド（Ｇ）を取
り去ったものを残す。したがって、我々はほとんど無傷
の（完全な）プロレンニン遺伝子を表わす、この部分的
なHhaI消化生成物を単離した。組換えファージ293-118
／37からのRFI ２本鎖ＤＮＡ 18μgを制限Hind III (N.
E.Biolabs)12単位で、BufferH 50μl中で、37℃で１時
間切断した。レンニンＤＮＡを有する挿入物約1230bp
を、冷凍／解凍法による１％アガロース・ゲル上の適当
な帯から該ＤＮＡを抽出することにより精製した。この
ＤＮＡ約1．5μgを、BufferP 30μl中でHhaI (N.E.Biol
abs) 0.25単位と共に37℃で５分間インキュベーション
することによって部分的なHhaI切断に付した。切断され
ていない断片プラス293〜118／37の開始点から約25個の
ヌクレオチドを欠ている１箇所切断された断片に相当す
るＤＮＡを２％アガロース・ゲル上の帯から単離した。
プラスミドpBR322 DNA (10μg)を制限エンドヌクレアー
ゼHind II(N.E.Biolabs、９単位）で、BufferH 10μl中
で、37℃で１時間切断した。このＤＮＡをフェノール抽
出し、ついでエタノール沈澱させた。ＤＮＡ（すなわち
部分的なHhaI切断293〜118／37およびHind III切断pBR3
22）の各約0.5pモルを結合させ、水28μlに再溶解さ
せ、ついでＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer/Mannhei
m,９単位）で、BufferD(60mM Tris・HCl(pH7.5)、80mM M
gCl2、10mMジチオトレイトール、１mM ATPおよび各0.2m
Mデオキシヌクレオチド・トリフォスフェート）を含有
する反応剤40μl中で、10℃で10分間処理することによ
って平滑末端とした。XbaI制限エンドヌクレアーゼ配列
プラスATGGを有する合成オリゴヌクレオチド (すなわ
ち、CCATCTAGATGG）を、コラボラティブ・リサーチ社に
よるトリエステル方法（K.Itakuraら、J.Biol.Chem.第2
50巻、4592頁〔1975〕）によって合成し、その５μgを
Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼ(Ｐ−Ｌバイオケミカル
ズ）６単位を用いて、BufferY (70mM Tris・ HCl(pH7.
6)、10mM MgCl2 10mM 2-メルカプトエタノールおよび２
mM ATP）を含有する反応剤25μl中で、α32P-ATPでキナ
ーゼ化した。この５′−ラベル化オリゴヌクレオチド
を、その濃度を一定に保つための追加の緩衝液成分およ
びＴ4ＤＮＡリガーゼ(N.E.Biolabs)600単位と一緒に平
滑末端反応剤40μlに添加した。反応剤を14℃で一夜イ
ンキュベーションし、ついで180mM NaCl、7mM MgCl2お
よび5mM Tris・HCl(pH8)からなる溶液５容積で希釈し
た。65℃で５分間加熱した後、そのＤＮＡをXbaI制限エ
ンドヌクレアーゼ45単位で処理した(３時間の全消化時
間に対して１時間当り15単位を添加した）。最後に、オ
リゴヌクレオチド単量体を、バイオゲルＡ−５ｍカラム
（0.68×36cm、上記参照)上でゲル濾過することによっ
て大きなＤＮＡから分離した。除外されたＤＮＡをプー
ルし、エタノール沈澱させ、水12μlに再溶解させ、Buf
ferLおよびＴ4ＤＮＡリガーゼ(N.E.Biolabs)300単位を
含有する結合反応剤中で、14℃で一夜インキュベーショ
ンした。この結果反応剤5μlを、上記したようにCGE6株
の細胞に転換能を付与するために使用した。転換した細
胞は、アンピシリン20μg/mlを含有するトリプトン平板
上で平板にし、コロニーを選択し、テトラサイクリン感
受性をスクリーニングした。制限酵素消化 (XbaIプラス
KpnI) およびポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による
プラスミドＤＮＡの分析は、所望のプラスミドpCGE181
(すなわち、XbaI-KpnI断片を生ずる)を有する１個の株
を示していた。
【００３９】pCGE181 DNA約5μgをXbaI (N.E.Biolabs,
４単位）で37℃１時間、BufferX(150mM NaCl、6mM Tris
・ HCl(pH7.9)、6mM MgCl2）を含有する反応剤50μｌ中
で切断する。フェノール抽出およびエタノール沈澱を行
なった後、該ＤＮＡをＴ4ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ−Ｌ
バイオケミカルズ、10単位）で、37℃で30分間、Buffer
Tを含有する反応剤50μl中で処理することによって、そ
の平滑末端とする。再び、該ＤＮＡをフェノール抽出
し、ついでエタノール沈澱させる。ベクターＤＮＡはプ
ラスミドpGL101 DNA (L.GuarenteらCell第20巻543〜553
頁〔1980〕）5μgをPvuII(N.E.Biolabs,５単位）で、Bu
fferPを含有する反応剤50μl中で切断することによって
作成される。ついで、フェノール抽出およびエタノール
沈澱を行なった後、再溶解したＤＮＡを、子牛の腸のア
ルカリ性フォスファターゼ（Boehringer/Mannheim)0.06
単位で、37℃30分間、BufferCを含有する反応剤50μl中
で処理することによってフォスファターゼ化する。PvuI
Iで切断したベクター(0.2pモル)およびXbaIで切断した
プロレンニンＤＮＡ断片(0.2ｐモル)を14℃で一夜Buffe
rLを含有する反応剤20μl中で互いに結合させる。CGE6
株の転換能を有する細胞は上記のようにして調製され、
結合反応剤5μlで転換される。生成する細胞は、アンピ
シリン20μg／mlを含有する。トリプトン寒天平板上で
平板にされる。アンピシリン耐性コロニーを選択し、プ
ラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化およびアガロー
ス・ゲル電気泳動によって分析するラクトースオペロン
プロモーターおよびプロレンニン蛋白が生体内で作られ
るようなリボソーム結合サイトに結合したプロレンニン
ＤＮＡを有する株が見い出される（すなわち、プロレン
ニン配列に添加されたＡＴＧ開始コドンはラクトースオ
ペロンリボソーム結合サイトからの９個のヌクレオチド
である）。我々は、プラスミドを担う細胞の溶解物(lys
ate)を、ヨード化した真正の精製レンニンおよび抗レン
ニン血清を用いる放射免疫測定法に付すことによって、
合成されたプロレンニンの量を決定する。プロレンニン
生成物の大きさはＳＤＳを含有するポリアクリルアミド
・ゲル上の35S-メチオニンをラベルした細胞抽出物の免
疫沈澱の電気泳動によって決定される。
４単位）で37℃１時間、BufferX(150mM NaCl、6mM Tris
・ HCl(pH7.9)、6mM MgCl2）を含有する反応剤50μｌ中
で切断する。フェノール抽出およびエタノール沈澱を行
なった後、該ＤＮＡをＴ4ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ−Ｌ
バイオケミカルズ、10単位）で、37℃で30分間、Buffer
Tを含有する反応剤50μl中で処理することによって、そ
の平滑末端とする。再び、該ＤＮＡをフェノール抽出
し、ついでエタノール沈澱させる。ベクターＤＮＡはプ
ラスミドpGL101 DNA (L.GuarenteらCell第20巻543〜553
頁〔1980〕）5μgをPvuII(N.E.Biolabs,５単位）で、Bu
fferPを含有する反応剤50μl中で切断することによって
作成される。ついで、フェノール抽出およびエタノール
沈澱を行なった後、再溶解したＤＮＡを、子牛の腸のア
ルカリ性フォスファターゼ（Boehringer/Mannheim)0.06
単位で、37℃30分間、BufferCを含有する反応剤50μl中
で処理することによってフォスファターゼ化する。PvuI
Iで切断したベクター(0.2pモル)およびXbaIで切断した
プロレンニンＤＮＡ断片(0.2ｐモル)を14℃で一夜Buffe
rLを含有する反応剤20μl中で互いに結合させる。CGE6
株の転換能を有する細胞は上記のようにして調製され、
結合反応剤5μlで転換される。生成する細胞は、アンピ
シリン20μg／mlを含有する。トリプトン寒天平板上で
平板にされる。アンピシリン耐性コロニーを選択し、プ
ラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化およびアガロー
ス・ゲル電気泳動によって分析するラクトースオペロン
プロモーターおよびプロレンニン蛋白が生体内で作られ
るようなリボソーム結合サイトに結合したプロレンニン
ＤＮＡを有する株が見い出される（すなわち、プロレン
ニン配列に添加されたＡＴＧ開始コドンはラクトースオ
ペロンリボソーム結合サイトからの９個のヌクレオチド
である）。我々は、プラスミドを担う細胞の溶解物(lys
ate)を、ヨード化した真正の精製レンニンおよび抗レン
ニン血清を用いる放射免疫測定法に付すことによって、
合成されたプロレンニンの量を決定する。プロレンニン
生成物の大きさはＳＤＳを含有するポリアクリルアミド
・ゲル上の35S-メチオニンをラベルした細胞抽出物の免
疫沈澱の電気泳動によって決定される。
【００４０】７．サッカロミセスセレビシエ−中でプレ
−プロレンニン及びプロレンニンの発現を得る方法 これらの２つの種類、プレ−プロレンニン及びメチオニ
ン−プロレンニンは、Ｓ．セレビシエ−ウラシル３遺伝
子からのプロモーターおよび他の転写および翻訳制御領
域を用いてＳ．セレビシエ−中で発現される。酵母ウラ
シル３遺伝子を、β−ガラクトシダーゼまたはlacZ遺伝
子の一部削除翻訳文（その５′末端から22bpを抜かして
いる）がura3遺伝子（その３′末端から約900bpを抜か
している）の断片の３′末端に結合しているような形
で、プラスミド（選択され、かつ酵母または大腸菌中に
保持されることができるシャトル(shuttle）ベクター）
上に置いた。これは、M.Rose, M.J.Casadaban,およびD.
B.BotsteinによってProc.Nat.Acad.Sci.USA,第78巻、24
60〜2464頁(1981)に報告されたクラスIII削除部分＃35
である。このプラスミドに関しては、酵母中のβ−ガラ
クトシダーゼ活性の発現はウラシル３遺伝子制御領域の
制御下にある。我々は、Ｓ．セレビシエー中のプレ−プ
ロレンニン、およびメチオニン−プロレンニンの発現を
得るために、この削除部分＃35を以下のとおり使用す
る。
−プロレンニン及びプロレンニンの発現を得る方法 これらの２つの種類、プレ−プロレンニン及びメチオニ
ン−プロレンニンは、Ｓ．セレビシエ−ウラシル３遺伝
子からのプロモーターおよび他の転写および翻訳制御領
域を用いてＳ．セレビシエ−中で発現される。酵母ウラ
シル３遺伝子を、β−ガラクトシダーゼまたはlacZ遺伝
子の一部削除翻訳文（その５′末端から22bpを抜かして
いる）がura3遺伝子（その３′末端から約900bpを抜か
している）の断片の３′末端に結合しているような形
で、プラスミド（選択され、かつ酵母または大腸菌中に
保持されることができるシャトル(shuttle）ベクター）
上に置いた。これは、M.Rose, M.J.Casadaban,およびD.
B.BotsteinによってProc.Nat.Acad.Sci.USA,第78巻、24
60〜2464頁(1981)に報告されたクラスIII削除部分＃35
である。このプラスミドに関しては、酵母中のβ−ガラ
クトシダーゼ活性の発現はウラシル３遺伝子制御領域の
制御下にある。我々は、Ｓ．セレビシエー中のプレ−プ
ロレンニン、およびメチオニン−プロレンニンの発現を
得るために、この削除部分＃35を以下のとおり使用す
る。
【００４１】最初に、ウラシル３コード化配列のより完
全な削除部分は、削除部分＃35からの閉鎖したＤＮＡを
ura3-lacZ連結点で切断する制限エンドヌクレアーゼBam
HIで切断することによって得られる。このＤＮＡを、平
均200bpが除去されるようなヌクレアーゼBal 31で切除
する。次に、BamHI合成オリゴヌクレオチドリンカー(CR
I）をその末端に結合させ、該ＤＮＡを互いに結合さ
せ、その結果、プラスミドの集団はBamH Iサイトと共に
ウラシル制限領域から種々の距離で存在する。制限酵素
で切断された精製プラスミドＤＮＡのゲル電気泳動は、
非常に小さいura3コード化配列を含有するプラスミドpC
GS210を示している。MaxamおよびGilbertの方法によるB
amHIサイトからの配列化はこのことを立証している。そ
のように好適な、Balで切除したクローン化プラスミド
からのＤＮＡを精製する。このＤＮＡは大腸菌（アンピ
シリン耐性）および酵母〔Leu2基本栄養（Prototroph
y)〕を選択し得る標識（マーカー）、大腸菌および酵母
の複製開始点であり、これらのすべてはプラスミドpRB4
5 (M.Rose, M.J.Casadaban, D.Botstein，上記参照）、
およびura3をコードする50個未満のヌクレオチドを有す
るura3制御領域である。特に、pCGS210と呼ばれる、こ
れらのプラスミドの一は、MaxamおよびGlbertの方法に
よるＤＮＡ配列化によって決定されるように、ura3をコ
ードするヌクレオチドをわずか10〜20個有するだけであ
る。
全な削除部分は、削除部分＃35からの閉鎖したＤＮＡを
ura3-lacZ連結点で切断する制限エンドヌクレアーゼBam
HIで切断することによって得られる。このＤＮＡを、平
均200bpが除去されるようなヌクレアーゼBal 31で切除
する。次に、BamHI合成オリゴヌクレオチドリンカー(CR
I）をその末端に結合させ、該ＤＮＡを互いに結合さ
せ、その結果、プラスミドの集団はBamH Iサイトと共に
ウラシル制限領域から種々の距離で存在する。制限酵素
で切断された精製プラスミドＤＮＡのゲル電気泳動は、
非常に小さいura3コード化配列を含有するプラスミドpC
GS210を示している。MaxamおよびGilbertの方法によるB
amHIサイトからの配列化はこのことを立証している。そ
のように好適な、Balで切除したクローン化プラスミド
からのＤＮＡを精製する。このＤＮＡは大腸菌（アンピ
シリン耐性）および酵母〔Leu2基本栄養（Prototroph
y)〕を選択し得る標識（マーカー）、大腸菌および酵母
の複製開始点であり、これらのすべてはプラスミドpRB4
5 (M.Rose, M.J.Casadaban, D.Botstein，上記参照）、
およびura3をコードする50個未満のヌクレオチドを有す
るura3制御領域である。特に、pCGS210と呼ばれる、こ
れらのプラスミドの一は、MaxamおよびGlbertの方法に
よるＤＮＡ配列化によって決定されるように、ura3をコ
ードするヌクレオチドをわずか10〜20個有するだけであ
る。
【００４２】プレ−プロレンニン、およびプロレンニン
の５′末端に対するＤＮＡのコード化は次のようにして
得られる。ＡＴＧ翻訳開始コドン、およびＡＴＧの５′
へ20個未満のヌクレオチドを含有するプレ−プロレンニ
ン遺伝子のためのＤＮＡのコード化は、Bal 31で切除し
て調製されるレンニンＤＮＡを得るためのflファージバ
ンク（bank）から、それらのファージを制限酵素とゲル
電気泳動を併用してスクリーニングすること並びにSang
er法 (F.SangerらJ.Mol.Biol.第143巻、161〜178頁〔19
81〕）により配列化することによって得られる。ＡＴＧ
翻訳開始コドンを有するプロレンニンのためのＤＮＡコ
ード化は、前項６記載のプラスミドpCGE181から得られ
る。
の５′末端に対するＤＮＡのコード化は次のようにして
得られる。ＡＴＧ翻訳開始コドン、およびＡＴＧの５′
へ20個未満のヌクレオチドを含有するプレ−プロレンニ
ン遺伝子のためのＤＮＡのコード化は、Bal 31で切除し
て調製されるレンニンＤＮＡを得るためのflファージバ
ンク（bank）から、それらのファージを制限酵素とゲル
電気泳動を併用してスクリーニングすること並びにSang
er法 (F.SangerらJ.Mol.Biol.第143巻、161〜178頁〔19
81〕）により配列化することによって得られる。ＡＴＧ
翻訳開始コドンを有するプロレンニンのためのＤＮＡコ
ード化は、前項６記載のプラスミドpCGE181から得られ
る。
【００４３】これらの各ＤＮＡ断片の酵母中の発現を獲
得するために、次の実験が行なわれる。プレ−プロレン
ニンまたはメチオニン−プロレンニンのためのＤＮＡコ
ーディングを上記した適当なファージまたはプラスミド
のうちから切断する。その断片をさらにSmaIで切断し、
レンニンの形に対する所望のコーティング断片をゲル電
気泳動によって精製する。同様に、大腸菌からの′ZYA
断片のためのＤＮＡコーティングのBamHI（平滑）-SalI
断片 (その５′末端から22bpを抜かしているβ−ガラク
トシダーゼのための遺伝子およびラクトース・パーミア
ーゼ（permease）およびラクトーストランスアセチラー
ゼのための遺伝子）をpRB45 (M.Rose, M.J.Casadaban,
およびD.Botstein〔1981〕、上記参照)から単離する。
次に、上記のプラスミドpCGS210を唯一のBamHIサイトの
ところで切断し、Ba1 31ヌクレアーゼで短かい距離だけ
切除し（すなわち、L.Guarente, G.Lauer, M.Ptashne
〔1980〕上記参照、の条件を使用する）、それによって
全ての残留ura3コード化配列を除去するが制御配列を除
去しないだけのＤＮＡを失った断片を生成させる。この
ＤＮＡをまたSalIで切断し、ついで最大の断片をゲル精
製する。３分子結合反応を、このベクター断片（fragme
nt）プラスpRB45からのSalI-BamHI（平滑）断片プラスS
maIで切断され、ゲル精製されたプレ−プロレンニンま
たはメチオニン−プロレンニンＤＮＡのいずれかを用い
て行なう。この結合反応物の一部分を、大腸菌CGE4株を
転換させるために使用し、Macconkeyラクトース上の赤
色のコロニーおよびアンピシリン平板を採取する。プラ
スミドＤＮＡの単離および制限酵素による分析は所望の
プラスミドの構造を確認する。酵母CGY80株(下記参照)
中への転換、ロイシン原栄養系（prototrophy)の選択、
および最少培地にウラシル（過剰量、または限定量）と
ロイシンとX-gal(５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド、Bachem, カリフォルニア
州）とを加えた培地上の青色のスクリーニングは、該プ
ラスミドがウラシル制御下に適当なレンニン−β−ガラ
クトシダーゼ融合蛋白の翻訳を指令することを示してい
る。最後に、所望のプラスミドのβ−ガラクトシダーゼ
コード化部分を、該プラスミドをBglIIおよびSalIで切
断し、ついで最大の断片をゲル精製することによって除
去する。この断片をファージ293-118/37からのBgl II-H
ind III(これは合成オリゴヌクレオチドリンカー、CRI
でSalIサイトに転化されている。）断片に結合させ、そ
れによって完全なプレ−プロレンニンまたはプロレンニ
ン遺伝子を再生する。これらのプラスミドは酵母Ｓ．セ
レビシエー中でプレ−プロレンニンまたはメチオニン−
プロレンニンの翻訳を指令する。
得するために、次の実験が行なわれる。プレ−プロレン
ニンまたはメチオニン−プロレンニンのためのＤＮＡコ
ーディングを上記した適当なファージまたはプラスミド
のうちから切断する。その断片をさらにSmaIで切断し、
レンニンの形に対する所望のコーティング断片をゲル電
気泳動によって精製する。同様に、大腸菌からの′ZYA
断片のためのＤＮＡコーティングのBamHI（平滑）-SalI
断片 (その５′末端から22bpを抜かしているβ−ガラク
トシダーゼのための遺伝子およびラクトース・パーミア
ーゼ（permease）およびラクトーストランスアセチラー
ゼのための遺伝子）をpRB45 (M.Rose, M.J.Casadaban,
およびD.Botstein〔1981〕、上記参照)から単離する。
次に、上記のプラスミドpCGS210を唯一のBamHIサイトの
ところで切断し、Ba1 31ヌクレアーゼで短かい距離だけ
切除し（すなわち、L.Guarente, G.Lauer, M.Ptashne
〔1980〕上記参照、の条件を使用する）、それによって
全ての残留ura3コード化配列を除去するが制御配列を除
去しないだけのＤＮＡを失った断片を生成させる。この
ＤＮＡをまたSalIで切断し、ついで最大の断片をゲル精
製する。３分子結合反応を、このベクター断片（fragme
nt）プラスpRB45からのSalI-BamHI（平滑）断片プラスS
maIで切断され、ゲル精製されたプレ−プロレンニンま
たはメチオニン−プロレンニンＤＮＡのいずれかを用い
て行なう。この結合反応物の一部分を、大腸菌CGE4株を
転換させるために使用し、Macconkeyラクトース上の赤
色のコロニーおよびアンピシリン平板を採取する。プラ
スミドＤＮＡの単離および制限酵素による分析は所望の
プラスミドの構造を確認する。酵母CGY80株(下記参照)
中への転換、ロイシン原栄養系（prototrophy)の選択、
および最少培地にウラシル（過剰量、または限定量）と
ロイシンとX-gal(５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド、Bachem, カリフォルニア
州）とを加えた培地上の青色のスクリーニングは、該プ
ラスミドがウラシル制御下に適当なレンニン−β−ガラ
クトシダーゼ融合蛋白の翻訳を指令することを示してい
る。最後に、所望のプラスミドのβ−ガラクトシダーゼ
コード化部分を、該プラスミドをBglIIおよびSalIで切
断し、ついで最大の断片をゲル精製することによって除
去する。この断片をファージ293-118/37からのBgl II-H
ind III(これは合成オリゴヌクレオチドリンカー、CRI
でSalIサイトに転化されている。）断片に結合させ、そ
れによって完全なプレ−プロレンニンまたはプロレンニ
ン遺伝子を再生する。これらのプラスミドは酵母Ｓ．セ
レビシエー中でプレ−プロレンニンまたはメチオニン−
プロレンニンの翻訳を指令する。
【００４４】８．酵母中のプロレンニン融合蛋白の発現 ura3をコードするわずか11個のヌクレオチドだけが、Ba
mHIサイトの前に残留していることを除いて上記(および
M.Rose, M.J.CasadabanおよびD.Botstein, 1981、Proc.
Nat.Acad.Sci.USA 第78巻、2460〜2464頁に記載）の削
除部分＃35およびラクトースオペロンＺＹＡ遺伝子に類
似しているプラスミドpRB71（M.RoseおよびD.Botstei
n、公表するために提出された。）の調整された有用性
のために、我々は、融合蛋白がＳ．セレビシエ−中で合
成されるようなura3をコードする11個のヌクレオチドに
融合したプロレンニンのための遺伝子を有するプラスミ
ドpCGS28を作成した。この融合蛋白は、プロレンニンの
最初の４個のアミノ酸がメチオニン−セリン−リジン−
アラニンによって置き替えられていることを除いて、真
正のプロレンニン分子から成る。レンニンを生成させる
ための活性化はプロレンニンの最初の42個のアミノ酸の
損失をもたらし、その結果これらの最初の４個のアミノ
酸は最終のレンニン生成物に何ら影響を及ぼさない。こ
のプラスミドの構造の詳細は以下に記載されている。
mHIサイトの前に残留していることを除いて上記(および
M.Rose, M.J.CasadabanおよびD.Botstein, 1981、Proc.
Nat.Acad.Sci.USA 第78巻、2460〜2464頁に記載）の削
除部分＃35およびラクトースオペロンＺＹＡ遺伝子に類
似しているプラスミドpRB71（M.RoseおよびD.Botstei
n、公表するために提出された。）の調整された有用性
のために、我々は、融合蛋白がＳ．セレビシエ−中で合
成されるようなura3をコードする11個のヌクレオチドに
融合したプロレンニンのための遺伝子を有するプラスミ
ドpCGS28を作成した。この融合蛋白は、プロレンニンの
最初の４個のアミノ酸がメチオニン−セリン−リジン−
アラニンによって置き替えられていることを除いて、真
正のプロレンニン分子から成る。レンニンを生成させる
ための活性化はプロレンニンの最初の42個のアミノ酸の
損失をもたらし、その結果これらの最初の４個のアミノ
酸は最終のレンニン生成物に何ら影響を及ぼさない。こ
のプラスミドの構造の詳細は以下に記載されている。
【００４５】酵母中のプロレンニンの発現を効率よく得
るために、ura3遺伝子プロモーター領域を使用した。こ
のＤＮＡ配列はクローン化されており、プラスミドに関
して有効である（M.Rose, M.J.CasadabanおよびD.Botst
ein, 1981、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第78巻、2460〜246
4頁）。M.Roseから得られるプラスミドpRB71は、ura3プ
ロモーター領域、および最初の22個のヌクレオチドを抜
かしているlacZ遺伝子の断片に結合したウラシル３遺伝
子の11個のヌクレオチドを有する。２個の不完全な遺伝
子の間の結合点はBamHI制限エンドヌクレアーゼサイト
である。このプラスミドはまた、M.Roseら（上記参照）
によって記載されたように、酵母のプラスミド２μm、
酵母からのleu2遺伝子、および複製開始点プラスpBR322
からのアンピシリン耐性遺伝子を含有する。こうして、
該プラスミドを生育させることができ、その存在は大腸
菌またはＳセレビシエーのいずれかの中で選択すること
ができる。
るために、ura3遺伝子プロモーター領域を使用した。こ
のＤＮＡ配列はクローン化されており、プラスミドに関
して有効である（M.Rose, M.J.CasadabanおよびD.Botst
ein, 1981、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第78巻、2460〜246
4頁）。M.Roseから得られるプラスミドpRB71は、ura3プ
ロモーター領域、および最初の22個のヌクレオチドを抜
かしているlacZ遺伝子の断片に結合したウラシル３遺伝
子の11個のヌクレオチドを有する。２個の不完全な遺伝
子の間の結合点はBamHI制限エンドヌクレアーゼサイト
である。このプラスミドはまた、M.Roseら（上記参照）
によって記載されたように、酵母のプラスミド２μm、
酵母からのleu2遺伝子、および複製開始点プラスpBR322
からのアンピシリン耐性遺伝子を含有する。こうして、
該プラスミドを生育させることができ、その存在は大腸
菌またはＳセレビシエーのいずれかの中で選択すること
ができる。
【００４６】酵母中のプロレンニン結合蛋白（すなわ
ち、ura3遺伝子の最初の11個のヌクレオチドに融合さ
れ、かつura3プロモーターによって制御されている。）
の発現を得るために、２つの基本的なプラスミド構造を
発生させた。最初の構造は、酵母中に配置されたとき活
性なβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白を生ずるura3-プロ
レンニン-lacZ融合であり、これはura3プロモーターが
所望の融合遺伝子の転写を指令していることを示してい
る。第２の構造は、lacZ部分をプロレンニンの残りで置
換したものであり、ura3遺伝子によって特徴づけられた
４個のアミノ酸を有するプロレンニン分子を生成させる
酵母細胞中に生じる。
ち、ura3遺伝子の最初の11個のヌクレオチドに融合さ
れ、かつura3プロモーターによって制御されている。）
の発現を得るために、２つの基本的なプラスミド構造を
発生させた。最初の構造は、酵母中に配置されたとき活
性なβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白を生ずるura3-プロ
レンニン-lacZ融合であり、これはura3プロモーターが
所望の融合遺伝子の転写を指令していることを示してい
る。第２の構造は、lacZ部分をプロレンニンの残りで置
換したものであり、ura3遺伝子によって特徴づけられた
４個のアミノ酸を有するプロレンニン分子を生成させる
酵母細胞中に生じる。
【００４７】最初の構造において、プロレンニン遺伝子
の５′部分は、ura3、プロレンニン、およびlacZがすべ
て同一の翻訳解読フレーム中にあるようなBamHIサイト
中に挿入される。これは次のように行なわれる。完全な
プロレンニン遺伝子を有する２本鎖組換えflファージ29
3-118／37ＤＮＡ（12μg)を、SmaI制限エンドヌクレア
ーゼ(N.E.Biolabs）７単位で、37℃で２時間、20mM KCl
6mM Tris ・ HCl(pH8)6mM MgCl2および6mM 2-メルカプ
トエタノールを含有する反応剤50μl中で切断した。そ
のＤＮＡをフェノール抽出し、エーテル抽出し、ついで
エタノール沈澱させた。次に、前項６記載のＴ4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてその５′末端のところでリ
ン酸化しておいた、BamHI合成オリゴヌクレオチドリン
カー(CRI、CCGGATCCGG)250pモルを14℃で一夜、BufferD
およびＴ4ＤＮＡリガーゼ(N.E.Biolabs）を含有する反
応剤40μl中で、BamHIで切断したファージＤＮＡに結合
させた。結合に続いて、反応剤を180mM NaCl、7mM MgCl
2および5mM Tris・ HCl(pH8)を含有する緩衝液５容積で
希釈し、65℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、１時間当
りBamHIエンドヌクレアーゼ15単位ずつを添加して３時
間の消化に付した。フェノール抽出、エーテル抽出、お
よびエタノール沈澱を行なった後、ＤＮＡを水に再溶解
させ、２％アガロース・ゲル中で電気泳動に付した。Ｄ
ＮＡを、凍ったゲル断片をふやかし残留した液を集める
こと（冷凍−解凍法）によってBamHI-SmaI (BamHI-link
ered）断片約440bpに相当する帯から溶離した。ＤＮＡ
断片をエタノール沈澱させ、水６μlに再溶解させた。
プラスミドpRB71 ＤＮＡ約5μgをBamHIエンドヌクレア
ーゼ(N.E.Biolabs）20単位で、37℃で２時間BufferXお
よび6mM 2-メルカプトエタノールを含有する反応剤50μ
l中で消化させた。フェノール抽出、エーテル抽出、お
よびエタノール沈澱を行なった後、ＤＮＡを水20μlに
再溶解させ、子牛の陽のアルカリ性フォスファターゼ(B
oehringer/Mannheim）0.1単位で37℃で３０分間BufferC
を含有する反応剤50μl中で処理した。フェノール抽出
し、エタノール沈澱させた後、ＤＮＡを水６μlに再溶
解させ、BamHI-SmaI(BamHI-linkered）断片６μlを含有
する結合反応剤に添加した。結合反応はＴ4ＤＮＡリガ
ーゼ（N.E.Biolabs）600単位で、14℃で一夜BufferL 20
μl中で行なわれた。大腸菌CGE6株の細胞を結合ＤＮＡ
で転換させ、アンピシリン耐性転換株を上記のようにし
て得た。約200個の転換株を、M.GrunsteinおよびD.S.Ho
gnessのコロニー雑種化法（1975, Proc.Nat.Acad.Sci.U
SA 第72巻、3961〜3965頁）によって、プローブ（prob
e)としてα-32pをラベルした。ニック(nick)翻訳された
組換えファージ293-207ＤＮＡを用いて試験した。ほと
んど20％の転換株がこの規準によるレンニン配列を含有
していた。プラスミドＤＮＡを10個の転換株から作成
し、挿入物の配置をPstIエンドヌクレアーゼによる消化
によって生成した断片のパターンから決定した。正しい
配置中にプロレンニン断片を含有していたプラスミドpC
GS16の１つを、A.Hinnen, J.B.HicksおよびG.Finkの報
告書(1978, Proc.Nat.Acad.Sci.USA第75巻1929〜1933
頁）に従ってＳ．セレビシエーCGY80株(NATa, leu2-3,
leu2-112, his3, trpl-289, ura3-52）を転換させるた
めに使用した。プラスミド上のleu2遺伝子の存在により
ロイシンを添加せずに生育することのできる酵母転換株
を、発色性の基質X-gal(正確にはM.Roseらにより上記の
とおり記載されたもの)を含有し、かつウラシル、トリ
プトファンおよびヒスチジンで補足された最少培地の平
板上にストリーキングした。試験されたすべての転換は
X-gal最少培地上に青色のコロニーを生じさせ、β-ガラ
クトシダーゼが生産されることを示していた。このこと
は、ura3-プロレンニン-lacZ融合蛋白が生産され、かつ
各３つの蛋白断片のための翻訳解読フレームが同一であ
ることを意味するものである。
の５′部分は、ura3、プロレンニン、およびlacZがすべ
て同一の翻訳解読フレーム中にあるようなBamHIサイト
中に挿入される。これは次のように行なわれる。完全な
プロレンニン遺伝子を有する２本鎖組換えflファージ29
3-118／37ＤＮＡ（12μg)を、SmaI制限エンドヌクレア
ーゼ(N.E.Biolabs）７単位で、37℃で２時間、20mM KCl
6mM Tris ・ HCl(pH8)6mM MgCl2および6mM 2-メルカプ
トエタノールを含有する反応剤50μl中で切断した。そ
のＤＮＡをフェノール抽出し、エーテル抽出し、ついで
エタノール沈澱させた。次に、前項６記載のＴ4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてその５′末端のところでリ
ン酸化しておいた、BamHI合成オリゴヌクレオチドリン
カー(CRI、CCGGATCCGG)250pモルを14℃で一夜、BufferD
およびＴ4ＤＮＡリガーゼ(N.E.Biolabs）を含有する反
応剤40μl中で、BamHIで切断したファージＤＮＡに結合
させた。結合に続いて、反応剤を180mM NaCl、7mM MgCl
2および5mM Tris・ HCl(pH8)を含有する緩衝液５容積で
希釈し、65℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、１時間当
りBamHIエンドヌクレアーゼ15単位ずつを添加して３時
間の消化に付した。フェノール抽出、エーテル抽出、お
よびエタノール沈澱を行なった後、ＤＮＡを水に再溶解
させ、２％アガロース・ゲル中で電気泳動に付した。Ｄ
ＮＡを、凍ったゲル断片をふやかし残留した液を集める
こと（冷凍−解凍法）によってBamHI-SmaI (BamHI-link
ered）断片約440bpに相当する帯から溶離した。ＤＮＡ
断片をエタノール沈澱させ、水６μlに再溶解させた。
プラスミドpRB71 ＤＮＡ約5μgをBamHIエンドヌクレア
ーゼ(N.E.Biolabs）20単位で、37℃で２時間BufferXお
よび6mM 2-メルカプトエタノールを含有する反応剤50μ
l中で消化させた。フェノール抽出、エーテル抽出、お
よびエタノール沈澱を行なった後、ＤＮＡを水20μlに
再溶解させ、子牛の陽のアルカリ性フォスファターゼ(B
oehringer/Mannheim）0.1単位で37℃で３０分間BufferC
を含有する反応剤50μl中で処理した。フェノール抽出
し、エタノール沈澱させた後、ＤＮＡを水６μlに再溶
解させ、BamHI-SmaI(BamHI-linkered）断片６μlを含有
する結合反応剤に添加した。結合反応はＴ4ＤＮＡリガ
ーゼ（N.E.Biolabs）600単位で、14℃で一夜BufferL 20
μl中で行なわれた。大腸菌CGE6株の細胞を結合ＤＮＡ
で転換させ、アンピシリン耐性転換株を上記のようにし
て得た。約200個の転換株を、M.GrunsteinおよびD.S.Ho
gnessのコロニー雑種化法（1975, Proc.Nat.Acad.Sci.U
SA 第72巻、3961〜3965頁）によって、プローブ（prob
e)としてα-32pをラベルした。ニック(nick)翻訳された
組換えファージ293-207ＤＮＡを用いて試験した。ほと
んど20％の転換株がこの規準によるレンニン配列を含有
していた。プラスミドＤＮＡを10個の転換株から作成
し、挿入物の配置をPstIエンドヌクレアーゼによる消化
によって生成した断片のパターンから決定した。正しい
配置中にプロレンニン断片を含有していたプラスミドpC
GS16の１つを、A.Hinnen, J.B.HicksおよびG.Finkの報
告書(1978, Proc.Nat.Acad.Sci.USA第75巻1929〜1933
頁）に従ってＳ．セレビシエーCGY80株(NATa, leu2-3,
leu2-112, his3, trpl-289, ura3-52）を転換させるた
めに使用した。プラスミド上のleu2遺伝子の存在により
ロイシンを添加せずに生育することのできる酵母転換株
を、発色性の基質X-gal(正確にはM.Roseらにより上記の
とおり記載されたもの)を含有し、かつウラシル、トリ
プトファンおよびヒスチジンで補足された最少培地の平
板上にストリーキングした。試験されたすべての転換は
X-gal最少培地上に青色のコロニーを生じさせ、β-ガラ
クトシダーゼが生産されることを示していた。このこと
は、ura3-プロレンニン-lacZ融合蛋白が生産され、かつ
各３つの蛋白断片のための翻訳解読フレームが同一であ
ることを意味するものである。
【００４８】この結果は、同一のプラスミドがもしβ−
ガラクトシダーゼ配列がプロレンニン遺伝子の残りで置
換されるならば、ura3-プロレンニン融合蛋白の発現を
指令することを示唆していた。それ故、プラスミドpCGS
16８μgをBgl II制限エンドヌクレアーゼ(N.E.Biolab
s）で、37℃で１時間BufferP 80μlで消化させた。契
に、1M NaCl 10μlおよび水６μlを反応剤に添加し、Ｄ
ＮＡをさらにSal Iエンドヌクレアーゼ16単位で、37℃
で１時間消化させた。フェノール抽出、エーテル抽出、
およびエタノール沈澱を行なった後、ＤＮＡを子牛の腸
のアルカリ性フォスファターゼ(Boehringer/Mannheim）
0.06単位で37℃で15分間、BufferCを含有する反応剤50
μl中で処理した。反応はＤＮＡのフェノール抽出およ
びエタノール沈澱によって終了させた。
ガラクトシダーゼ配列がプロレンニン遺伝子の残りで置
換されるならば、ura3-プロレンニン融合蛋白の発現を
指令することを示唆していた。それ故、プラスミドpCGS
16８μgをBgl II制限エンドヌクレアーゼ(N.E.Biolab
s）で、37℃で１時間BufferP 80μlで消化させた。契
に、1M NaCl 10μlおよび水６μlを反応剤に添加し、Ｄ
ＮＡをさらにSal Iエンドヌクレアーゼ16単位で、37℃
で１時間消化させた。フェノール抽出、エーテル抽出、
およびエタノール沈澱を行なった後、ＤＮＡを子牛の腸
のアルカリ性フォスファターゼ(Boehringer/Mannheim）
0.06単位で37℃で15分間、BufferCを含有する反応剤50
μl中で処理した。反応はＤＮＡのフェノール抽出およ
びエタノール沈澱によって終了させた。
【００４９】一方、組換えflファージ293-118／37２本
鎖ＤＮＡ約15μgをHind III (N.E.Biolabs）12単位で、
37℃で２時間、BufferH 100μl中で切断した。フェノー
ルおよびエーテル抽出、およびエタノール沈澱を行なっ
た後、ＤＮＡ（６μg)を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Bo
ehringer/Mannheim)10単位で、10℃で10分間、BufferD
40μl中で処理することによって平滑末端とした。次
に、上記のようにＴ4ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てリン酸化しておいたSal I合成オリゴヌクレオチドリ
ンカー(CRI, GGTCGACC)250pモルを、全ての成分の濃度
を一定に保つのに十分な緩衝液成分と一緒と添加した。
リンカーを、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ（N.E.Biolabs）900単
位で14℃で一夜インキュベーションすることによって該
ＤＮＡ上に結合させた。次に、10mM Tris ・ HCl(pH8)、
10mM MgCl2および180mM NaClから成る緩衝液５容積を添
加し、溶液を65℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、つい
でSalI制限エンドヌクレアーゼ(N.E.Biolabs）を１時間
当り20単位ずつ添加して、37℃で５時間インキュベーシ
ョンした。ＤＮＡをフェノール抽出し、エーテル抽出
し、エタノール沈澱させた後、それを水20μlに再溶解
させ、Bal II(N.E.Biolabs）５単位で、37℃で１時間、
BufferPを含有する反応剤30μlで消化させた。ついで反
応を200mM EDTA１／10容積で終了させ、２％アガロース
ゲルにかけた。BglII-Hind III(SalI-linkered)断片約1
000bpに相当する帯を切り取り、ＤＮＡを上記の冷凍−
解凍法によって回収した。
鎖ＤＮＡ約15μgをHind III (N.E.Biolabs）12単位で、
37℃で２時間、BufferH 100μl中で切断した。フェノー
ルおよびエーテル抽出、およびエタノール沈澱を行なっ
た後、ＤＮＡ（６μg)を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Bo
ehringer/Mannheim)10単位で、10℃で10分間、BufferD
40μl中で処理することによって平滑末端とした。次
に、上記のようにＴ4ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てリン酸化しておいたSal I合成オリゴヌクレオチドリ
ンカー(CRI, GGTCGACC)250pモルを、全ての成分の濃度
を一定に保つのに十分な緩衝液成分と一緒と添加した。
リンカーを、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ（N.E.Biolabs）900単
位で14℃で一夜インキュベーションすることによって該
ＤＮＡ上に結合させた。次に、10mM Tris ・ HCl(pH8)、
10mM MgCl2および180mM NaClから成る緩衝液５容積を添
加し、溶液を65℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、つい
でSalI制限エンドヌクレアーゼ(N.E.Biolabs）を１時間
当り20単位ずつ添加して、37℃で５時間インキュベーシ
ョンした。ＤＮＡをフェノール抽出し、エーテル抽出
し、エタノール沈澱させた後、それを水20μlに再溶解
させ、Bal II(N.E.Biolabs）５単位で、37℃で１時間、
BufferPを含有する反応剤30μlで消化させた。ついで反
応を200mM EDTA１／10容積で終了させ、２％アガロース
ゲルにかけた。BglII-Hind III(SalI-linkered)断片約1
000bpに相当する帯を切り取り、ＤＮＡを上記の冷凍−
解凍法によって回収した。
【００５０】BglIIおよびSalIエンドヌクレアーゼで切
断しておいた。エタノール沈澱させたpCGS16ＤＮＡを、
ゲル精製した293〜118/37 BglII-HindIII（SalI-linker
ed）ＤＮＡ断片と一緒に水13μl中に再溶解させ、２つ
の断片を、BufferLおよびＴ4ＤＮＡリガーゼ（N.E.Biol
abs）600単位を含有する反応剤20μl中で互いに結合さ
せた。CGE6株の細胞をCaCl2で処理し、上記のように結
合ＤＮＡで転換させた。プラスミドＤＮＡを５つの異な
るアンピシリン耐性転換株から精製し、BamHIまたはPst
IプラスSalIによる消化に付した。２％アガロースゲル
中の帯の部分は、完全なプロレンニン配列がプラスミド
pCGS28中に存在していることを示していた。
断しておいた。エタノール沈澱させたpCGS16ＤＮＡを、
ゲル精製した293〜118/37 BglII-HindIII（SalI-linker
ed）ＤＮＡ断片と一緒に水13μl中に再溶解させ、２つ
の断片を、BufferLおよびＴ4ＤＮＡリガーゼ（N.E.Biol
abs）600単位を含有する反応剤20μl中で互いに結合さ
せた。CGE6株の細胞をCaCl2で処理し、上記のように結
合ＤＮＡで転換させた。プラスミドＤＮＡを５つの異な
るアンピシリン耐性転換株から精製し、BamHIまたはPst
IプラスSalIによる消化に付した。２％アガロースゲル
中の帯の部分は、完全なプロレンニン配列がプラスミド
pCGS28中に存在していることを示していた。
【００５１】それ故、酵母CGY80株をA.Hinnen, J.B.Hic
ks、およびG.Fink(1978、上記参照)によって、プラスミ
ドＤＮＡで転換させ、ロイシン原栄養株（prototroph
s）を選択した。１つのこのような転換株CGX116を、１
／２世代に対して35S-L-メチオニン100μciでラベルし
た適当なアミノ酸補足剤を含有する最少培地中で、30℃
で典型相に生育させ、ガラス溶球（250〜300μm）で３
分間うず巻を起こさせることによって溶解させた。抽出
物を遠心分離によって清澄化し、レンニン抗血清で免疫
沈澱させた。免疫沈澱物をＳＤＳ試料緩衝液に溶かし、
0.1％ SDSを含有する10％ポリアクリルアミドゲル中
で、U.K.LaemmliおよびM.Farreの方法（上記参照）に従
って電気泳動に付した。オートラジオグラフィーは、プ
ラスミドpCGS28を有するCGY116株がレンニン抗血清と反
応する蛋白の合成を指令し、かつプロレンニンに対して
予期された大きさであることを示していた。さらに、免
疫沈澱操作の間過剰のラベルされていないレンニンを存
在させるとプロレンニンの放射性の帯が消失する。した
がって、ＳセレビシエーCGY116株は、プロレンニンの最
初の４個アミノ酸の代りに、酵母ura3遺伝子からの４個
のアミノ酸に融合した子牛のプロレンニンを生産する。
B.Froltmanによって記載された標準方法(Methodsin Enz
nymology 第19巻、421〜436頁、1970）によるura3-プロ
レンニン融合蛋白の活性化は、“プロ”チモーゲン（酵
素原）ペプチド（この場合には４個の“外来性”アミノ
酸を含有する）が活性化の間に切断されるので、真正の
子牛のレンニンＡと全く同一の活性レンニンを生じさせ
る。プラスミドpCGS28を有するCGY116株はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC)に寄託され
ており、その受入番号は20623である。
ks、およびG.Fink(1978、上記参照)によって、プラスミ
ドＤＮＡで転換させ、ロイシン原栄養株（prototroph
s）を選択した。１つのこのような転換株CGX116を、１
／２世代に対して35S-L-メチオニン100μciでラベルし
た適当なアミノ酸補足剤を含有する最少培地中で、30℃
で典型相に生育させ、ガラス溶球（250〜300μm）で３
分間うず巻を起こさせることによって溶解させた。抽出
物を遠心分離によって清澄化し、レンニン抗血清で免疫
沈澱させた。免疫沈澱物をＳＤＳ試料緩衝液に溶かし、
0.1％ SDSを含有する10％ポリアクリルアミドゲル中
で、U.K.LaemmliおよびM.Farreの方法（上記参照）に従
って電気泳動に付した。オートラジオグラフィーは、プ
ラスミドpCGS28を有するCGY116株がレンニン抗血清と反
応する蛋白の合成を指令し、かつプロレンニンに対して
予期された大きさであることを示していた。さらに、免
疫沈澱操作の間過剰のラベルされていないレンニンを存
在させるとプロレンニンの放射性の帯が消失する。した
がって、ＳセレビシエーCGY116株は、プロレンニンの最
初の４個アミノ酸の代りに、酵母ura3遺伝子からの４個
のアミノ酸に融合した子牛のプロレンニンを生産する。
B.Froltmanによって記載された標準方法(Methodsin Enz
nymology 第19巻、421〜436頁、1970）によるura3-プロ
レンニン融合蛋白の活性化は、“プロ”チモーゲン（酵
素原）ペプチド（この場合には４個の“外来性”アミノ
酸を含有する）が活性化の間に切断されるので、真正の
子牛のレンニンＡと全く同一の活性レンニンを生じさせ
る。プラスミドpCGS28を有するCGY116株はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC)に寄託され
ており、その受入番号は20623である。
【００５２】CGY116株は、Ｓセレビシエ−CGY80株は（M
ATa.leu2-3, leu2-112, ura3-52, his3V, trp1-289,プ
ラスミドpCGS28を有する）である。プラスミドpCGS28は
次のように定義される（図６参照）。即ち該プラスミド
は、大部分のプラスミドpBR322(J.G.Sutcliffe〔1979〕
Cold Spring Harbor Symposium第43巻、77〜90頁）、Ec
oRI、酵母２μmプラスミド（J.L.HartleyおよびJ.E.Don
elson〔1980〕、Nature 286巻、860〜865頁）の断片、L
EU２遺伝子（A.Hinnen, J.HicksおよびG.R.Fink〔197
8〕Proc.Nat.Acad.Sci.USA、第75巻、1929〜1933頁)を
有する酵母の染色体ＤＮＡのSal I-XhoI断片、ura3遺伝
子(pRB71中と同様にBamHIから翻訳開始の11ヌクレオチ
ド３′サイト）及びヌクレオチド＃267のところのBamHI
サイトから該遺伝子の末端までのプロレンニンＡを含有
する。
ATa.leu2-3, leu2-112, ura3-52, his3V, trp1-289,プ
ラスミドpCGS28を有する）である。プラスミドpCGS28は
次のように定義される（図６参照）。即ち該プラスミド
は、大部分のプラスミドpBR322(J.G.Sutcliffe〔1979〕
Cold Spring Harbor Symposium第43巻、77〜90頁）、Ec
oRI、酵母２μmプラスミド（J.L.HartleyおよびJ.E.Don
elson〔1980〕、Nature 286巻、860〜865頁）の断片、L
EU２遺伝子（A.Hinnen, J.HicksおよびG.R.Fink〔197
8〕Proc.Nat.Acad.Sci.USA、第75巻、1929〜1933頁)を
有する酵母の染色体ＤＮＡのSal I-XhoI断片、ura3遺伝
子(pRB71中と同様にBamHIから翻訳開始の11ヌクレオチ
ド３′サイト）及びヌクレオチド＃267のところのBamHI
サイトから該遺伝子の末端までのプロレンニンＡを含有
する。
【００５３】配列番号１はプレ−プロレンニンＡのＤＮ
Ａを示す。尚プレ−プロレンニンＡ形は前記Foltmannら
による位置番号290（配列番号１における塩基配列の110
8〜1110に対応し、プロレンニンアミノ酸配列ではAlaか
ら286番目に対応）のところでアスパラギン酸塩残基の
代りにこの位置でグリシンを用いることによってプロレ
ンニンＢ形に変えることができる。
Ａを示す。尚プレ−プロレンニンＡ形は前記Foltmannら
による位置番号290（配列番号１における塩基配列の110
8〜1110に対応し、プロレンニンアミノ酸配列ではAlaか
ら286番目に対応）のところでアスパラギン酸塩残基の
代りにこの位置でグリシンを用いることによってプロレ
ンニンＢ形に変えることができる。
【００５４】また、配列番号１の配列に記載の塩基配列
番号205〜252から成る開始(initiator）ＡＴＧコドンを
含有する16個のアミノ酸配列はプレ−プロレンニンを合
成する胃細胞からのプレ−プロレンニンの分泌を指令
し、したがって、この配列は、宿主細胞からペリプラス
ミック（periplasmic)スペースまたは培地へのそれらの
蛋白生成物の分泌を指令する。加えて、レンニン活性の
ためには不必要な、これらの余分のヌクレオチドは、ア
ミノ酸に翻訳されたとき、それが細胞内にある間に蛋白
加水分解に抵抗する酵素の安定化にある役割を演ずる。
これは、種々の宿主細胞およびシェルフ・アイテム(she
lf item)中のクローン化遺伝子生成物の安定化に対して
一般的な有用性をもつことができる。
番号205〜252から成る開始(initiator）ＡＴＧコドンを
含有する16個のアミノ酸配列はプレ−プロレンニンを合
成する胃細胞からのプレ−プロレンニンの分泌を指令
し、したがって、この配列は、宿主細胞からペリプラス
ミック（periplasmic)スペースまたは培地へのそれらの
蛋白生成物の分泌を指令する。加えて、レンニン活性の
ためには不必要な、これらの余分のヌクレオチドは、ア
ミノ酸に翻訳されたとき、それが細胞内にある間に蛋白
加水分解に抵抗する酵素の安定化にある役割を演ずる。
これは、種々の宿主細胞およびシェルフ・アイテム(she
lf item)中のクローン化遺伝子生成物の安定化に対して
一般的な有用性をもつことができる。
【００５５】また、プロレンニン分子の酵素原を形成す
る４２個のアミノ酸のための126個のヌクレオチドコー
ディングの配列である配列番号１中のヌクレオチド番号
253〜378のところの“プロ”または酵素原配列はレンニ
ンの不活性酵素原を形成し、活性レンニンを発生させる
ために除去される。不活性酵素原は長い貯蔵寿命（shel
f life)を有することができる。それはまたレンニン分
子を安定化させ、それ故、他のクローン化遺伝子の遺伝
子生成物を安定化させることに対して一般的な有用をも
つことができる。
る４２個のアミノ酸のための126個のヌクレオチドコー
ディングの配列である配列番号１中のヌクレオチド番号
253〜378のところの“プロ”または酵素原配列はレンニ
ンの不活性酵素原を形成し、活性レンニンを発生させる
ために除去される。不活性酵素原は長い貯蔵寿命（shel
f life)を有することができる。それはまたレンニン分
子を安定化させ、それ故、他のクローン化遺伝子の遺伝
子生成物を安定化させることに対して一般的な有用をも
つことができる。
【００５６】
配列番号：１ 配列の長さ：１４６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ウシ 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置:205..1350 特徴を決定した方法：E 配列の特徴 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置:379..1347 特徴を決定した方法：E 配列 AAGCTTGGGC GAGCGAGGGG TAGGCCATCC CCAGGATCCC GTCGAATTCG GCATAGGTGA 60 AGACGTCCCC GGGCTCCTGG GTGCTCAGGC CTACTGTCTG CTGGATGTCC ACAATGTTGG 120 AGACAGTGAC GGTGTCATAG CCCAGGATGC CCTGCATGCT GCCTGTCCCG TAGTGGATAG 180 ACAGCGGCTG GACCCAGATC CAAG ATG AGG TGT CTC GTG GTG CTA CTT GCT 231 Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala -55 -50 GTC TTC GCT CTC TCC CAG GGC GCT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC 279 Val Phe Ala Leu Ser Gln Gly Ala Glu Ile Thr Arg Ile Pro Leu Tyr -45 -40 -35 AAA GGC AAG TCT CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT GGG CTT CTG GAG 327 Lys Gly Lys Ser Leu Arg Lys Ala Leu Lys Glu His Gly Leu Leu Glu -30 -25 -20 GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AAG TAC TCC GGC 375 Asp Phe Leu Gln Lys Gln Gln Tyr Gly Ile Ser Ser Lys Tyr Ser Gly -15 -10 -5 TTC GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GAT AGT CAG 423 Phe Gly Glu Val Ala Ser Val Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln -1 1 5 10 15 TAC TTT GGG AAG ATC TAC CTC GGG ACC CCG CCC CAG GAG TTC ACC GTG 471 Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Leu Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val 20 25 30 CTG TTT GAC ACT GGC TCC TCT GAC TTC TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC 519 Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys 35 40 45 AAG AGC AAT GCC TGC AAA AAC CAC CAG CGC TTC GAC CCG AGA AAG TCG 567 Lys Ser Asn Ala Cys Lys Asn Hls Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser 50 55 60 TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG CCC CTG TCT ATC CAC TAC GGG ACA 615 Ser Thr Phe Gln Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr 65 70 75 GGC AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TAT GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC 663 Gly Ser Met Gln Gly Ile Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn 80 85 90 95 ATT GTG GAC ATC CAG CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG 711 Ile Val Asp Ile Gln Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly 100 105 110 GAC GTC TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GGG ATC CTG GGG ATG GCC TAC 759 Asp Val Phe Thr Tyr Ala Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr 115 120 125 CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA CCC GTG TTT GAC AAC ATG ATG 807 Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met 130 135 140 AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG 855 Asn Arg His Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg 145 150 155 AAT GGC CAG GAG AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC 903 Asn Gly Gln Glu Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr 160 165 170 175 TAC ACA GGG TCC CTG CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TGG 951 Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp 180 185 190 CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT 999 Gln Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys 195 200 205 GAG GGT GGC TGT CAG GCC ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC AAG CTG GTC 1047 Glu Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val 210 215 220 GGG CCC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GCC ACA 1095 Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr 225 230 235 CAG AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC GAC AAC CTG AGC TAC 1143 Gln Asn Gln Tyr Asp Glu Phe Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr 240 245 250 255 ATG CCC ACT GTG GTC TTT GAG ATC AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC 1191 Met Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr 260 265 270 CCC TCC GCC TAT ACC AGC CAG CAC CAG GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC 1239 Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Gln Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe 275 280 285 CAG AGT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT GTT TTC ATC 1287 Gln Ser Glu Asn His Ser Gln Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile 290 295 300 CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GCC AAC AAC CTC GTG GGG CTG 1335 Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu 305 310 315 GCC AAA GCC ATC TGATCACATC GCTGACCAAG AACCTCACTG TCCCCACACA 1387 Ala Lys Ala Ile 320 CCTGCACACA CACATGCACA CATGTACATG GCACATGTGC ACACACACAG ATGAGGTTTC 1447 CAGACCCAAG GTT 1460
【図１】プラスミドpCGE5を示す。
【図２】Hind IVで切断され、かつエクソヌクレアーゼB
al 31で消化されたプラスミドpCGE5を示す。
al 31で消化されたプラスミドpCGE5を示す。
【図３】プラスミドpCGE17を示す。
【図４】プラスミドpCGE21を示す。
【図５】プラスミドpCGE21中のpBR322およびpGL101から
のヌクレオチドの配置を示す。
のヌクレオチドの配置を示す。
【図６】プラスミドpCGS28を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ドナルド・テイラー・モイアー アメリカ合衆国 マサチユーセツツ 02154，ウオルサム，バージニア・ロード 39 (72)発明者 アリソン・タウントン・リグビー アメリカ合衆国 マサチユーセツツ 01773，リンコルン，フアラー・ロード （番地なし) (72)発明者 ジエラルド・フランシス・ヴオヴイス アメリカ合衆国 マサチユーセツツ 02154，ウオルサム，バコン・ストリート 350 (56)参考文献 特開 昭58−9867（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−109499（ＪＰ，Ａ) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，1977（74）Ｐ．2321−2324 ＡＧＲＩＣ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．, 1980（44）Ｐ．1373−1381
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１の配列に記載の塩基
配列番号２０５〜１３４７のＤＮＡから得られる遺伝子
を含有し、かつプレ−プロレンニンを発現することので
きる細菌または酵母を培養し、該プレ−プロレンニンを
得、次いでレンニンを得るために該プレ−プロレンニン
を切断することを特徴とするレンニンの製造方法。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１の配列に記載の塩基
配列番号２５３〜１３４７のＤＮＡから得られる遺伝子
を含有し、かつプロレンニンを発現することのできる細
菌または酵母を培養し、該プロレンニンを得、次いでレ
ンニンを得るために該プロレンニンを切断することを特
徴とするレンニンの製造方法。
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Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5525484A (en) * | 1981-01-16 | 1996-06-11 | Genome Therapeutics Corp. | Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin |
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| JPS5832896A (ja) * | 1981-08-24 | 1983-02-25 | Teruhiko Beppu | 複合プラスミド及びそれを含有する微生物 |
| AU560472B2 (en) * | 1981-08-25 | 1987-04-09 | Celltech Limited | Yeast expression vectors |
| BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| JP2608540B2 (ja) * | 1982-05-19 | 1997-05-07 | ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ | クルイベロミセス種のためのクローニング系 |
| IL68797A0 (en) * | 1982-07-01 | 1983-09-30 | Genex Corp | Cloned bovine calf chymosin and calf prochymosin genes,their preparation,plasmids containing them and microorganisms transformed by those plasmids |
| IE56372B1 (en) * | 1982-12-22 | 1991-07-03 | Genentech Inc | Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production |
| US4961938A (en) * | 1982-12-22 | 1990-10-09 | Genentech, Inc. | Preparation of cheese with rennin from recombinant microbial cells |
| US4935369A (en) * | 1982-12-22 | 1990-06-19 | Genentech, Inc. | Isolation of active microbially produced bovine rennin |
| US4661454A (en) * | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
| JPS59166086A (ja) * | 1983-03-09 | 1984-09-19 | Teruhiko Beppu | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
| DE3480006D1 (en) * | 1983-05-19 | 1989-11-09 | Unilever Nv | Improvements in the expression of newly introduced genes in yeast cells |
| EP0128743A3 (en) * | 1983-06-07 | 1985-12-27 | Genex Corporation | Expression of foreign genes in yeast |
| AU3036684A (en) * | 1983-07-07 | 1985-01-10 | Genex Corp. | Production of bovine calf chymosin |
| US4935354A (en) * | 1983-07-14 | 1990-06-19 | Genentech, Inc. | Rennin from recombinant microbial cells for preparation of cheese |
| US4721673A (en) * | 1983-09-01 | 1988-01-26 | Genex Corporation | Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin |
| US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
| US4935370A (en) * | 1983-12-23 | 1990-06-19 | Pfizer Inc. | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria |
| NL8400687A (nl) * | 1984-03-02 | 1985-10-01 | Unilever Nv | Recombinant plasmiden; recombinant plasmiden bevattende bacterien; werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een zuivelproduct; werkwijze voor het bereiden van een eiwit. |
| JPS60188077A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Teruhiko Beppu | 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド |
| JPS60188093A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Teruhiko Beppu | 枯草菌に於ける形質発現プラスミド |
| US5082775A (en) * | 1984-05-11 | 1992-01-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents |
| ATE71147T1 (de) * | 1984-05-11 | 1992-01-15 | Berlex Lab | Verfahren zur herstellung eines im wesentlichen nichtloeslichen polypetids unter verwendung nichtionischer detergentien. |
| GB2178431B (en) * | 1985-07-15 | 1989-11-22 | Bioteknika International | Genetically engineered yeast strains |
| US6004785A (en) * | 1985-08-29 | 1999-12-21 | Genencor International Inc. | Heterologous polypeptides expressed in filamentous fungi, processes for making same, and vectors for making same |
| US5364770A (en) * | 1985-08-29 | 1994-11-15 | Genencor International Inc. | Heterologous polypeptides expressed in aspergillus |
| US4937189A (en) * | 1985-10-18 | 1990-06-26 | Pfizer Inc. | Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants |
| US5766912A (en) * | 1986-03-17 | 1998-06-16 | Novo Nordisk A/S | Humicola lipase produced in aspergillus |
| US5536661A (en) * | 1987-03-10 | 1996-07-16 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of protein products in aspergillus |
| JPH0673456B2 (ja) * | 1986-04-26 | 1994-09-21 | 三共株式会社 | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼ |
| EP0254249B1 (en) * | 1986-07-22 | 1992-08-19 | Ciba-Geigy Ag | Preparation of binding factor related polypeptides |
| GB2200118A (en) * | 1987-01-23 | 1988-07-27 | Allelix Inc | Synthetic chymosin-and prochymosin-encoding DNA segments |
| US4977089A (en) * | 1987-01-30 | 1990-12-11 | Eli Lilly And Company | Vector comprising signal peptide-encoding DNA for use in Bacillus and other microorganisms |
| US5162226A (en) | 1987-08-24 | 1992-11-10 | University Of Tennessee Research Corp. (U.T.R.C.) | Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products |
| JPH02109984A (ja) * | 1988-12-01 | 1990-04-23 | Teruhiko Beppu | 複合プラスミド及びそれを含有する微生物 |
| US5139943A (en) * | 1989-06-13 | 1992-08-18 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of microbially produced chymosin |
| US5151358A (en) * | 1989-06-13 | 1992-09-29 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of naturally produced chymosin |
| WO1991013971A1 (en) * | 1990-03-13 | 1991-09-19 | Hawaii Biotechnology Group, Inc. | Neurospora expression system |
| IE914007A1 (en) * | 1990-11-19 | 1992-05-20 | Univ Illinois | A protein being genetically engineered to provide¹orientability and a substrate having an oriented layer of¹proteins |
| ES2171454T3 (es) * | 1993-06-04 | 2002-09-16 | Whitehead Biomedical Inst | Proteinas de estres y sus usos. |
| US7157089B1 (en) * | 1996-11-26 | 2007-01-02 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Immune responses using compositions containing stress proteins |
| WO2001004344A2 (en) * | 1999-07-08 | 2001-01-18 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Induction of a th1-like response in vitro |
| US7390936B1 (en) | 1999-08-23 | 2008-06-24 | Sembiosys Genetics Inc. | Commercial production of chymosin in plants |
| US6964851B2 (en) * | 1999-12-07 | 2005-11-15 | Stressgen Biotechnologies Corp. | Compositions and methods for detecting stress-inducible proteins |
| ATE438408T1 (de) * | 2000-01-14 | 2009-08-15 | Whitehead Biomedical Inst | Induktion zytotoxischer lymphozyten durch hitzeschockprotein-fusionsproteine hängt von der atp-bindungsdomäne in hsp ab und is cd4+ unabhängig |
| ES2263637T3 (es) * | 2000-06-26 | 2006-12-16 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Hpv-e7 para el tratamiento del papilomavirus humano. |
| IL157251A0 (en) * | 2001-02-05 | 2004-02-19 | Stressgen Biotechnologies Corp | Hepatitis b virus treatment |
| US7482148B2 (en) * | 2004-03-30 | 2009-01-27 | Sudershan Biotech Ltd. | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4136201A (en) * | 1967-12-06 | 1979-01-23 | Gb Fermentation Industries, Inc. | Microbial rennin |
| FR2441659A1 (fr) * | 1978-11-14 | 1980-06-13 | Anvar | Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant |
| US4332892A (en) * | 1979-01-15 | 1982-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| GB2052516B (en) * | 1979-06-01 | 1983-06-29 | Searle & Co | Plasmid vectors production and use thereof |
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
-
1981
- 1981-12-01 US US06/325,481 patent/US4666847A/en not_active Expired - Lifetime
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-
1982
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- 1982-01-15 GB GB8201120A patent/GB2091271B/en not_active Expired
- 1982-01-15 DK DK15182A patent/DK15182A/da not_active Application Discontinuation
- 1982-01-16 ES ES508813A patent/ES8401132A1/es not_active Expired
-
1983
- 1983-08-16 ES ES524986A patent/ES8700320A1/es not_active Expired
-
1994
- 1994-10-04 JP JP6264642A patent/JPH07108221B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| ＡＧＲＩＣ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．，１９８０（４４）Ｐ．１３７３−１３８１ |
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，１９７７（７４）Ｐ．２３２１−２３２４ |
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