FI84080C - Foerfarande foer framstaellning av rennin och daeri anvaendbara hybridplasmider. - Google Patents

Description

84090

Menetelmä renniinin valmistamiseksi ja siinä tarvittavat yhdistelmäplasmidit - Förfarande för framställning av rennin och däri användbara hybridplasmider

Entsymaattinen proteiini renniini on jo kauan ollut tunnettu hyödyllisenä maidon kaseiinia koaguloivana 5 aineena juustonvalmistuksessa. Spesifisen proteolyytti-sen vaikutuksensa vuoksi sitä käytetään myös juuston-kypsytyksen yhteydessä. Aikaisemmin sitä on valmistettu kaupallisesti juoksuttimesta. Tällöin maidolla ruokitut vasikat teurastetaan ja neljäs maha tyhjennetään 10 ruuasta. Sitten mahat kuivataan, suolataan ja jäädytetään monimutkaisella menetelmällä. Tehtaalla mahat pestään, niistä poistetaan suola ja pintarasva. Ne venytetään telineillä ja kuivataan. Kuivattuja mahoja varastoidaan usein kylmässä ja sitten ne jauhetaan ja 15 sijoitetaan suuriin altaisiin, joissa suoritetaan renniinin uutto suolaliuosta kierrättämällä. Kuvattu rennii-ninvalmistusmenetelmä on kallis ja siihen liittyy monia vaikeuksia haluttaessa valmistaa tämän päivän maailmassa tarvittavia suuria renniinimääriä.

20 Tämän keksinnön tarkoituksena on saada aikaan eläviä soluja, jotka kykenevät tuottamaan suuria määriä rennii-niä viljelyolosuhteissa.

Edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on saada aikaan eläviä soluja, jotka kykenevät tuottamaan suuria 25 määriä prorenniiniä viljelyolosuhteissa.

Edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on saada aikaan eläviä soluja, jotka kykenevät tuottamaan suuria määriä pre-prorenniiniä viljelyolosuhteissa.

Vielä eräs tämän keksinnön kohde on tuottaa 30 renniiniä, prorenniiniä tai pre-prorenniiniä, jotka on saatu edellä mainittuina keksinnön kohteina olevista elävistä soluista, jotka sisältävät geneettistä materiaalia, joka on johdettu yhdistelmä-DNA-materiaalista.

2 84080

Vielä eräs tämän keksinnön kohde on tarjota spesialisoituneita renniinigeenejä, pre-prorenniini-geenejä ja prorenniinigeenejä.

Vielä eräs tämän keksinnön kohde on tarjota ^ menetelmiä, joilla voidaan valmistaa renniiniä, prorenniiniä tai pre-prorenniiniä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttämällä.

Vielä eräs tämän keksinnön kohde on tarjota sig-naalisekvenssejä käytettäviksi valittujen aminohappo-10 sekvenssien, kuten valittujen entsyymien tai proteiini-materiaalin, kuljettamiseen periplasmiselle alueelle, muihin solun alueisiin tai solun ulkopuolelle sopivan isännän avustuksella.

Edelleen eräs tämän keksinnön kohde on tarjota 15 erityisiä muunnettuja soluja, joita voidaan käyttää sellaisten polypeptidien tuottamiseen, joilla on renniini- tai maitoajuoksettava aktiviteetti.

Keksinnön mukaisesti sisältävät elävät solut geneettistä materiaalia, joka on johdettu yhdistelmä-20 DNA-materiaalista, ja kykenevät tuottamaan renniiniä tai pre-prorenniiniä tai prorenniiniä. Keksintö koskee myös renniiniä, prorenniiniä ja pre-prorenniiniä ja näiden geenejä, jotka on johdettu elävistä soluista.

Tämän keksinnön mukaisesti voidaan isäntäsolussa 25 tuottaa preprorenniiniä, kun kehitetään DNA-sekvenssi, joka koodittaa preprorenniiniä. Tässä sekvenssissä on kopioinnin (transkriptionaalinen) promoottori ja ribosomaalinen sidoskohta 5'-päässä, ja pre-prorenniiniä koodittavan DNA-palan ja promoottorin sekä 30 sidoskohdan sisältävän DNA-palan välistä etäisyyttä vaihdellaan. Sitten DNA siirretään isäntäsoluihin. Isäntäsolut kloonataan, ja klooneista valitaan ne, jotka tuottavat suuria määriä pre-prorenniiniä.

Menetelmässä, jolla saadaan aikaan prorenniinin 35 tai renniinin ilmeneminen isäntäsoluissa, valitaan 3 840S0 sellainen DNA-sekvenssi/ joka koodittaa pre-prorennii-niä, ja jossa on 5'-pää. 5'-päästä poistetaan se osa, joka koodittaa prorenniinin tai renniinin prekursori-polypeptidiä. Jäännös, jossa on prorenniiniä tai rennii-5 niä koodittava sekvenssi, liitetään synteettiseen DNA-palaseen, jossa on luennan alkukodoni 3'-päässä. Sitten jatketaan samoin kuin edellä siten, että sekvenssiin liitetään kopioinnin promoottori ja ribosomaalinen sidos-kohta ja toimitaan niin, että se matka, joka on pro-10 renniiniä tai renniiniä koodittavan DNA-palan ja promoottorin ja ribosomin sidoskohdan sisältävän DNA-palan välillä, vaihtelee pituudeltaan. Tämä materiaali siirretään isäntäsoluihin, suoritetaan kloonaus ja samoin kuin edellä valitaan halutut prorenniiniä tai rennii-15 niä tuottavat solut.

Kuvatulla menetelmällä valmistettu Escherichia coli on esimerkkikantana taltioitu American Type Culture Collection-kokoelmiin (12301 Park Warren Drive,

Rockville, Maryland 20852), jossa sille on annettu 20 numero 31929, ja kyseinen kanta CGE24 on E.coli-kannan BNN45 johdannainen.

Kuvatulla menetelmällä valmistetuista hiivoista on esimerkkikanta taltioitu American Type Culture Collection -kokoelmiin (12301 Park Warren Drive, Rockville, 25 Maryland 20852), jossa sille on annettu numero 20623, ja kyseinen kanta CGY116 on Saccharomyces cerevisiae-kannan CGY80 johdannainen.

Tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä voidaan pre-prorenniiniä, prorenniiniä ja renniiniä kutakin 30 saada edullisesti eristämällä pre-prorenniini-DNA- materiaali. Pre-prorenniini on prorenniinin prekursori, jota ei ole kuvattu kirjallisuudessa. Kun pre-pro-renniini-DNA-palat poistetaan, voidaan saada geneettinen materiaali, joka koodittaa prorenniiniä tai renniiniä.

35 Tämän keksinnön mukaiset pre-prorenniini-, 4 84080 prorenniini- ja renniinigeenit tarkoittavat mitä tahansa nukleotidisekvenssejä, jotka koodittavat pre-prorenniinin, prorenniinin tai vastaavasti ren-niinin aminohapposekvenssiä, poisluettuina pre-pro-5 renniiniä, prorenniiniä tai vastaavasti renniiniä koodattavassa genomisessa DNArssa intronit. Keksintö koskee myös näitä kolmea geeniä liittyneinä vektoreihin, jotka replikoituvat sopivassa isäntäsolussa.

10 Sopivimpia soluja ovat E.coli-solut, jotka kykene vät yhdistelmä-DNA-materiaalin ilmenemiseen ja tuottamaan haluttua entsymaattista proteiinia. Hiivasoluja ja muita soluja voidaan myös käyttää. Solut valitaan sillä perusteella, että ne kykenevät tuottamaan suuria 15 määriä haluttua entsymaattista proteiinia järkevissä kaupallisissa viljelyolosuhteissa.

Renniinientsyymi (EC 3.4.23.4), josta tässä hakemuksessa on kyse, tunnetaan myös nimellä kymosiini.

Se on pääasiallinen proteolyyttinen entsyymi, jota löytyy 20 märehtimisikää nuoremman vasikan mahasta, ja se aiheuttaa maidon juoksettumista. Renniiniä käytetään kaupallisesti juustonvalmistuksessa. Prorenniini on renniinin prekursorimuoto, jonka aminopäässä on 42 lisäaminohappoa, kuten on selostettu julkaisussa B.

25 Foltmann et ai. Proc .Nat. Acad. Sei. USA 74_ 2321-2324 (1977). Pre-prorenniini, jota selostetaan ensimmäisen kerran tässä hakemuksessa, on prorenniinin prekursorimuoto, jossa on lisäaminohappoja (mielellään 16 aminohappoa) prorenniinimolekyylin aminopäässä. Nämä lisä-30 aminohapot ovat luultavasti tärkeitä entsyymin erittymiselle mahan soluista. B.Foltmann ja muut ovat osoittaneet, että puhdistettu renniini on kahden muodon, A ja B, seos (B. Foltmann et ai. Proc.Nat.Acad.Sei.USA 74 2321-2324 (1977) ja J.Biol.Chem. 2J34 8447-8456 35 (1979). Molemmat muodot ovat aktiivisia, ja sekvenssi- tiedot osoittavat, että luultavasti ainoa ero on 5 84080 aspartaattitähde renniinin A asemassa 290 ja glysiini-tähde renniinin B samassa asemassa. Tämän keksinnön esimerkeissä tuotettu renniini on renniiniä A, mutta samoilla toimenpiteillä ja/tai yksinkertaisilla muunnok-5 silla voidaan tuottaa renniiniä B. Samoin voivat pre-ja pro-muodot esiintyä A- tai B-muodossa.

Tämän hakemuksen tarkoituksia varten prorenniini-geeni määritellään miksi tahansa nukleotidisekvenssiksi, joka koodittaa prorenniinimolekyyliä, jonka aminohappo-10 järjestys on kuvattu kirjallisuudessa (B.Foltmann, V.B.Pedersen, H.Jacobsen, D.Kauffman and G.Wybrandt,

Proc.Nat.Acad.Sei.USA 2i/ 2321-2324 (1977)).

Pre-prorenniinigeeni sisältää prorenniiniä koodattavan nukleotidisekvenssin sekä vielä 48 lisänukleotidia 15 5'-päässä koodittamassa pre-prorenniinientsyymin amino- päässä olevaa prekursoripolypeptidiä.

Renniinigeeni määritellään miksi tahansa nukleotidisekvenssiksi, joka koodittaa prorenniinimolekyyliä, lukuunottamatta niitä 126 nukleotidiä, jotka kooditta-20 vat prorenniinin proentsyymiosaa.

Elävät solut valmistetaan ensisijaisesti käyttämällä apuna tunnettuja DNA-menetelmiä, joita on lukuisia, ja lähtemällä liikkeelle materiaaleista, joita saadaan vasikan neljännestä mahasta.

25 Tähän keksintöön liittyen voidaan saatua rennii niä, pre-prorenniiniä ja prorenniiniä käyttää maidon-juoksetukseen juustonvalmistuksessa ja ehkä muissa kaupallisissa sovellutuksissa, kun halutaan juoksettaa maitoa juuston saamiseksi. Viljelymenetelmillä voidaan 30 tuottaa suuria määriä. Niinpä suuria ainemääriä voidaan tuottaa järkevillä tuotantonopeuksilla ja kustannuksilla. Geneettinen yhdistelmä-DNA-materiaali on käytännöllisesti katsoen identtisen vasikan pre-prorenniinin renniini-osan kanssa, kun tuotetaan renniiniä, käytännöllisesti 35 katsoen identtisen vasikan pre-prorenniinigeenin kanssa, kun tuotetaan pre-prorenniiniä, ja käytännöllisesti 6 84080 katsoen identtinen vasikan pre-prorenniinin prorenniini-osan kanssa, kun tuotetaan prorenniiniä. Yhdistelmä-DNA-materiaalin erot liittyvät pääasiassa siihen, että molekyyleissä ei ole introneja, joita saattaa 5 olla olemassa vasikan geeneissä.

Mitä tahansa sellaisia bakteerilajeja, jotka voidaan katsoa turvallisiksi yhdistelmä-DNA-työssä, voidaan käyttää, ja näitä ovat esim. Escherichia coli, erilaiset Bacillus-lajit, kuten Bacillus subtilis, erilaiset 10 Lactobacillus-lajit ja erilaiset Micrococcus-lajit, kuten Micrococcus fragilis. Isäntäsoluina voidaan käyttää myös hiivasoluja.

Joka kerta muodostuneen solun geneettinen informaatio sisältää uutta geneettistä materiaalia, joka on 15 johdettu yhdistelmä-DNA-materiaalista. Tämä materiaali sisältyy usein plasmidiin, joka kykenee replikoitumaan isäntäsolussa, ja plasmidiin on sisällytetty geneettinen materiaali luovuttajasolusta jossakin aikaisemmassa vaiheessa. Kun yhdistelmä-DNA-molekyyli on muodostettu ja 20 sijoitettu isäntäsoluun, isäntäsolu kasvaa ja lisääntyy oleellisesti ottaen normaaliin tapaan. Yhdistelmä-DNA:n koodittaman entsymaattisen proteiinin, joka voi olla renniini, pre-prorenniini tai prorenniini, tuotanto tapahtuu tämän keksinnön mukaisesti.

25 Isäntäsolu, johon haluttu yhdistelmä-DNA-materi- aali siirretään, on mielellään E.coli K-12-johdannainen. Hyödyllisiä johdannaisia ovat seuraavat: HB101, H.W. Boyer & D. Roulland-Dussoix (1969) J.Mol.Biol. 41 459-472, 30 C600, M. Mandel & A. Higa J.Mol.Biol. 53 159-162 (1970) ja C600-johdannaiset kuten: MVl ja MV12, V. Hershfield, H.W. Boyer, C.Yanofsky, M.A. Lovett & D.R.Helinski (1972) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71 3455-3459, 35 LE392, S.M. Tilghman, D.C. Tiemeier, F.Polsky, 7 84080 M.H. Edgell, J.G. Seidxnan, A. Leder, L.W. Enguist, B.Norman & P.Leder (1977) Proc.Natl Acad.Sci.USA 24 4406-4410, JM101, J.Messing (1979) Recombinant DNA Technical 5 Bulletin 2 43-48, W3110 ja johdannaiset, K.L.Korn & C. Yanofsky (1976) J.Mol.Biol. 103 395-409.

Soluja voidaan kasvattaa tavallisilla viljelymenetelmillä. E.colin kasvatusalustoiksi sopivat esim.

10 seuraavat:

Rikas alusta: LB litraa kohti lOg Bacto-tryptonia (Difco Laboratories, Detroit) 15 5 g Bacto-hiivauutetta (Difco Laboratories,

Detroit) 10 g Nacl 2 g glukoosia TY litraa kohti 20 10 g Bacto-tryptonia (Difco Laboratories,

Detroit) 1 g Bacto-hiivaa (Difco Laboratories, Detroit) 8 g Nacl 1 g glukoosia 25 Minimaalialusta: M9 litraa kohti:

NaHP04 6 g KH-PO. 3 g 2 4 v

NaCl 0.5 g 30 NH4C1 1 g

CaCl2 11 mg

MgSO47H20 0.2 g

Bl (tiamiini HC1) 5 mg kannan vaatimia aminohappoja (40 mg kutakin) 35 glukoosia 2 g 8 84030

Viljely voi tapahtua suspensiossa, agarpinnoilla tai muilla tavallisilla kudosten tai solujen viljelymenetelmillä.

Viljelyalusta voi olla mikä tahansa standardi-5 alusta, jota käytetään kyseessä olevien solujen kasvattamisessa. Voidaan esimerkiksi käyttää TY-alustaa, johon alunperin siirrostetaan soluja tasolle 1-4 %, ja tällöin etusijalle asetettavia kantoja ovat E.coli LE392 (E.coli C600 r^m^SupE, SupF, gal ) tai BNN45 _ K _ _ 10 (E. coli hsdR , hsdM , SupE, SupF, Bl met ) (Advanced Bacterial Genetics, R.W. Davis, D. Botstein, J. R. Roth, Cold Spring Harbor Laboratory/1980_7 s. 7.

Tavallisissa menetelmissä E.colia kasvatetaan 12 tiheyteen, joka on alueella 10-30 x 10 solua/litra 15 ja samalla syntyy haluttua entsymaattista proteiinia.

Voidaan käyttää erilaisia tunnettuja solujen-kasvatusväliaineita eivätkä ne muodosta osaa tästä keksinnöstä. Samoin voidaan käyttää mitä erilaisimpia kasvatusmenetelmiä ja -olosuhteita. Esimerkiksi vaikka 20 soluja kasvatetaankin mielellään lämpötilassa, joka on alueella 30-40°C, voidaan myös käyttää tämän alueen ulkopuolella olevia lämpötiloja.

Tämän keksinnön mukaisten solujen aikaansaamisen lähtökohtana on alalla tunnettu yhdistelmä-DNA-tek-25 niikka, jolla tuotetaan haluttu geneettinen materiaali, joka puolestaan siirretään isäntäsoluun, ja sen jälkeen isäntäsolu kloonataan.

Renniinigeeni, pre-prorenniinigeeni tai proren-niinigeeni, mikä näistä sitten lopulta halutaankin 30 kloonata organismissa, eristetään mielellään ensivaiheessa siten, että ensivaiheessa erotetaan pre-pro-renniinin geenin lähetti-RNA kudoksesta. Vasikan ollessa kyseessä tapahtuu erottaminen vasikan neljännestä mahasta. Lähetti-RNA voidaan eristää menetelmällä 35 Deeley et ai. (R.G. Deeley, J.I. Gordon, A.T.H. Burns, K. P. Mullinix, M. Bina:stein, R.F. Goldberger J.Biol.

9 84080

Chem. 252 8310-8319 (1977)) ja poly-A:lla rikastettu RNA voidaan valmistaa kromatografisesti oligo(dT) selluloosan avulla menetelmällä R.C. Desrosiers, K.H. Friderici & F.M. Rottman, Biochemistry 1^ 4367-5 4374 (1975).

Sitten lähetti-RNA muunnetaan tavallisilla menetelmillä kaksisäikeiseksi DNA:ksi. Ensin lähetti-RNA:sta valmistetaan tavallisilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä DNA:n komplementaarinen kopio kuten AMV-käänteiskopioija-10 entsyymiä käyttämällä. Kopio-DNA:n (cDNA) valmistuksessa voidaan käyttää esim. seuraavia menetelmiä: A. Efstratiadis, F.C. Kafatos, A.M. Maxam ja T. Maniatis, Cell 7 279-288 (1976), R.Higuchi, G.V. Paddock, R.Wall ja W.Salser, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 73, 15 3146-3150 (1976), D.L.Kacian ja J.C. Myers, Proc.

Nat. Acad. Sei. USA 73, 2191-2195 (1976), M.P. Wickens, G.N. Buell ja R.T. Schimke, J. Biol. Chem. 253, 2483-2495 (1978), G.M.Wahl, R.A. Padgett ja G.R. Stack, J. Biol. Chem., 254, 8679-8689 (1979). RNA-osa voidaan 20 hävittää rikkomalla säikeet tunnetulla tavalla edellä mainittuja menetelmiä käyttämällä tai denaturoimalla lämmön avulla menetelmän Wickens et ai. (1978) mukaisesti.

Seuraavaksi voidaan cDNA muuntaa kaksisäikei-25 seksi DNA:ksi käyttämällä apuna sellaisia entsyymejä, kuin E.colin DNA-polymeraasia tai AMV-käänteiskopioija-entsyymiä, edellä mainittujen julkaisujen sekä julkaisun J.I. Gordon, A.T.H. Burns, J.L.Christian & R.G.Deeley, J.Biol.Chem. 253, 8629-8639 (1978) mukaisilla menetel-30 millä.

Kolmanneksi voidaan kaksisäikeisen DNA:n kumpaankin päähän liittää synteettiset sidoksenmuodostajät käyttämällä esim. synteettisiä Hind III- tai Eco Rl-oligo-nukleotidisidoksenmuodostajia ja tavallisia menetelmiä, 35 kuten seuraavia: R.H. Scheller, T.L. Thomas, A.S. Lee, W.H.Klein, W.D. Niles, R.J. Britten ja E.H. Davidson, ίο 840 80

Science 196, 197-200 (1977), T.H. Fraser and B.J.

Bruce, ProC. Natl. Acad. Sci. USA 75 5936-5940 (1978), A. Ullrich, J.Shine, J. Chirgwin, R. Pieter, E. Tischer, W.J. Rutter & H.M. Goodman, Science 196, 5 1313-1319 (1977) , J. Shine, P.H. Seeburg, J.A. Martial, J.D. Baxter & H.M. Goodman, Nature 270, 494-499 (1977), tai P.H. Seeburg, J. Shine, J.A. Martial, J.D. Baxter & H.M. Goodman, Nature 270, 486-494 (1977).

Neljännessä vaiheessa DNA-molekyyli sisällytetään 10 kromosomiin tai liitetään vektoriin, joka voi olla plasmidi, virus tai kosmidi, kuten alalla tiedetään. Tällaisia vektoreita ovat mm. seuraavat: pBR322 (F.Bolivar, R.L.Rodriguez, P.J. Greene, M.C. Betlach, H.L. Heyneker, H.W. Boyer, J.H.

15 Crosa, S. Falkow, 1977 Gene 2 95-199) pMB9 (R.L. Rodriguez, F. Bolivara, H.M. Goodman, H.W. Boyer, M.C. Betlach; "Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression"^. P. Nierlich, W.J. Rutter, C.F. Fox, Eds._/ 471 Academic Press 20 New York 1976) - pSCIOI (S.N. Cohen, A.C.Y. Chang, H.W. Boyer, R.B. Helling 1973 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70 3240) XgtWES (D.Tiemeier, L.Enguist, P. Leder Nature 263 526-527) (1976) 25 - Xcharon-fagit (F.R. Blattner, et al Science 196 161-169) (1977) fl R229 (J.D. Boeke Molec, Gen. Genetics 181, 288-291) (1981) pJC75-58 (J.Collins Methods in Enzymology 68 30 309-326) (1979).

Myös tämä vaihe suoritetaan lopullisen isäntä-solun ulkopuolella. Hyödyllisiä menetelmiä tätä vaihetta varten on kuvattu edellä mainituissa viitteissä, jotka liittyvät sidoksenmuodostajiin, sekä seuraavissa julkai-35 suissa; V. Hershfield, H.W. Boyer, C. Yanofsky.

11 840S0 M.A. Lovett & P.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 71, 3455-3459 (1974), N.E. Murray & K. Murray,

Nature 251,476-482 (1974), F.R. Blattner et al,

Science 196, 161-169 (1977).

5 Viidennessä vaiheessa voidaan yhdistelmä-DNA- molekyyli siirtää isäntäsolun solulimaan käyttämällä apuna tavallisia menetelmiä, joita on kuvattu esim. seuraavissa julkaisuissa: M. Mandel & A. Higa (1970) J. Mol. Biol. 53 159-162, P.C. Wensink, D.J. Finnegan, 10 J.E. Donelson & D.S. Hogness, Cell 3, 315-325 (1974), S. N. Cohen, A.C.Y. Chang ja L. Hsu, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 69, 2110-2114 (1972) , H.M. Goodman, ja R.J. MacDonald, Methods in Enzymology 68, 75-90 (1979), E.M. Lederberg ja S.N. Cohen, J. Bact 119, 15 1072-1074 (1974).

Oikeat kloonit voidaan tunnistaa hybridisointivalin-nalla tai synteettisillä oligonukleotideilla kokeilemalla (T. Taniguichi, Y. Fujii, Kuriyama ja M.

Muramatsu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4003-4006 20 (1980), R.P. Ricciardi, J.S. Miller & B.E. Roberts,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 4927-2931 (1979), D.L. Montgomery, B.D. Hall, S. Gillam ja M. Smith,

Cell 14, 673-680/19787)·

Sitten vastamuunnettu isäntäsolu kloonataan ja 25 saadaan aikaan halutun materiaalin ilmeneminen. Esimerkiksi voidaan menetelmällä Guarete et ai. ja käyttämällä laktoosioperoniprcmoottoria (L. Guarete, G. Lauer, T. M. Roberts & M. Ptashne, Cell 20, 543-553 (1980), L. Guarete, T.M. Roberts & M. Ptashne, Science 209, 30 1428-1430 (1980) ) saavuttaa optimaalinen vieraan DNA:n ilmentyminen. Myös muita alalla tunnettuja promoottoreita voidaan käyttää ilmentymisen aikaansaamiseksi, kunhan vain kyseinen promoottori on aktiivinen halutussa bakteerisolussa, hiivasolussa tai muussa isäntäsolussa.

35 Tällaisia promoottoreita ovat mm. E.colin tryptofaani- 12 84080 operoni tai beta-laktamaasi-promoottorit ja S.cerevisiaen urasiili 3- tai invertaasi-promoottorit.

Tämän keksinnön mukaisen yksityiskohtaisen esimerkin avulla voidaan saada aikaan E.colin yhdistelmäkanto-5 ja, jotka tuottavat pre-prorenniini A:ta, prorenniini A:ta tai renniini A:ta.

1. RNA:n eristäminen

Paikallisesta teurastamosta saatiin maidolla ruokittujen vasikoiden mahakudosta tuoreena, ja 10 neljännen mahan seinämästä irroitettiin limakalvo ja se jäädytettiin kuivajäässä. 21 g limakalvokudosta revittiin rikki sekoittimella 200 ml:ssa kylmää puskuria (10°C), joka oli 50 mM Tris.HCl, pH 7,5 8Mguanidiini.

HC1 ja ImM ditiotreitolin suhteen. Liukenematon ma-15 teriaali poistettiin sentrifugoimalla 12 minuuttia Sorvali SA-600-roottorissa nopeudella 10 000 1/min.

200 ml:aan saatua emäliuosta lisättiin 100 ml jääkylmää absoluuttista etanolia. Kun seosta oli pidetty 1,5 tuntia -20°C:ssa, sakka pelletoitiin sentrifugoimalla 20 30 minuuttia -10°C:ssa nopeudella 3000 1/min. Pelletti liuotettiin 40 mlraan jääkylmää puskuria (EGAD), joka sisälsi 20 mM EDTA, pH 7, 20 mM NaOAc, pH 7, 8M guanidiini.HCl ja 1mM ditiotreitolia. Lisättiin 20 ml kylmää absoluuttista etanolia ja liuos sijoitettiin 45 minuu-25 tiksi -20°C:een. Sakka pelletoitiin sentrifugoimalla 20 minuuttia -10°C:ssa nopeudella 3000 1/min. Pelletti liuotettiin uudestaan 40 mitään kylmää EGAD-puskuria ja saostus 20 ml:11a kylmää etanolia, sentrifugointi ja pelletin uudelleenliuotus EGAD-puskuriin toistettiin 30 vielä kaksi kertaa. Lopuksi pelletti liuotettiin 16 mitään 20 mM EDTA, pH 7, ja uutettiin kolmesti kloro-formi-isobutanoliseoksella (4:1). Seuraavaksi lisättiin kaksinkertainen tilavuus 4,5M NaOAc, pH 5,2, vesikerrok-seen ja liuos sijoitettiin yön ajaksi -20°C:een.

13 84080 RNA-sakka otettiin talteen sentrifugoimalla 25 minuuttia -10°C:ssa nopeudella 10 000 1/min ja liuotettiin 30 ml:aan vettä. Näin saatiin 45 mg RNArta. RNA saostettiin siten, että lisättiin 1 ml 2M NaOAc, pH 5, ja 75 ml abso-5 luuttista etanolia ja sen jälkeen inkuboitiin yön yli -20°C:ssa. RNA pelletoitiin sentrifugoimalla (10 000 1/min, 10 min, -10°C) ja liuotettiin uudestaan 20 mitään vettä, kuumennettiin 60°C:een 10 minuutiksi, jäähdytettiin nopeasti jäällä ja laimennettiin 21 ml:11a 10 kaksinkertaiseksi väkevöityä sidospuskuria (20mM Tris.

HCl, pH 7,5, 2mM EDTA, pH 7, 0,4 % SDS ja 0,24M NaCl).

RNA sijoitettiin 4 ml:n oligo-D-T-selluloosapylvääseen, pylväs pestiin 45 ml:11a yksinkertaiseksi väkevöityä sidospuskuria ja sitten poly-A:ta sisältävä RNA eluoitiin 15 pesemällä pylväs sidospuskurilla, joka ei sisältänyt natriumkloridia. Näin saatiin noin 1 mg poly-A:ta sisältävää RNA:ta. Osalle poly-A:ta sisältävästä RNA:sta tehtiin translaatio in vitro kanin retikulo-syyttilysaattisysteemissä (H.R.B. Pelham and R.J. Jackson; 20 (1976) Eur.J.Biochem. 6T_ 247-256). Proteiinituotteet analysoitiin 10% polyakryyliamidigeeIillä. Havaittiin vain yksi pääproteiinikaista, joka saostui renniinin antiseerumilla, mikä osoitti, että poly-A:ta sisältävässä RNA:ssa oli läsnä renniinin lähetti-RNA:ta.

25 2. Kaksisäikeisen DNA-kopion (cDNA) valmistus

Noin 8,7 yg cDNAtta syntetisoitiin 20 yg:sta vasikan mahasta saatua poly-A:ta sisältävää RNA:ta siten, että inkuboitiin 1 tunti 42°C:ssa seoksessa,

jossa oli 50 mM Tris.HCl, pH 8,3, 100 mM KC1, 8 mM

30 MgCl2, 0,4 mM ditiotreitolia, 1mM kutakin deoksinukleo- siditrif osf aattia ja 20 μ9/πι1 oligo- (dT) -^-lS/ 3a joka sisälsi 100 yksikköä käänteiskopioijaentsyymiä ja 32 1 Ci/mmol a P-dCTOP. Reaktioseosta kuumennettiin 3 minuuttia 100°C:ssa, jäähdytettiin jäällä 3 minuuttia, i4 84080 suostunut proteiini poistettiin sentrifugoimalla ja puoleen emäliuoksesta lisättiin Hepes.KOH:ta, pH 6,9 kunnes väkevyydeksi tuli 100 mM, MgC^, kunnes väkevyydeksi tuli 5 mM, ditiotreitolia, kunnes väkevyy-5 deksi tuli 0,5mM ja deoksinukleosiditrifosfaatteja, kunnes väkevyydeksi tuli 0,12mM. Kun tätä seosta inku-boitiin E.colin DNA-polymeraasi I:n (300 yksikköä) kanssa 2 tuntia 16°C:ssa, saatiin 8,6 yg kaksisäikeistä cDNA:ta. DNA uutettiin fenolilla ja erotettiin liitty-mättömistä trifosfaateista kromatografisesti Sephadex G-100:lla (12 ml pylväs, 0,7 cm x 30 cm, eluenttina 20 mM Tris.HCl, pH 7,5 0,5 mM EDTA) ja saostettiin etanolilla yön aikana -20°C:ssa lisäämällä 1/10 tilavuutta 2M NaOAc, pH 5, ja 2,5 tilavuutta kylmää etanolia. 15 Kaksisäikeistä cDNA:ta (4,6 yg) käsiteltiin sitten puskurissa S 80,3 M NaCl, 30mM NaOAc, pH 4,6, 3mM ZnSO^) 1 tunti 37°C:ssa 1000 yksiköllä S1-nukleaasia. Reaktio katkaistiin lisäämällä EDTA niin, että väkevyydeksi tuli 10 mM, ja Tris.HCl, pH 8,3, niin, että väkevyydeksi tuli 20 200 mM/ ja sen jälkeen seos sijoitettiin Biogel A-150m -pylvääseen (0,7cm x 33 cm), tasapainotettiin ja elu-oitiin liuoksella, joka oli 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA ja 250 mM NaCl suhteen. Huippujakeet (kukin 0,5 ml), joissa oli suurimolekyylistä DNA:ta, kerättiin 25 yhteen ja saostettiin etanolilla lisäämällä 1/10 tilavuutta 2M NaOAc, pH 5, ja 2,5 tilavuutta kylmää absoluuttista etanolia.

3. Hind ΙΙΙ-sidoksenmuodostajien lisäys S1-käsiteltyä kaksisäikeistä cDNA:ta (1,7 yg) 30 inkuboitiin puskurissa T (25 mM Tris.HCl, pH8, 6,6 mM MgC^f 0,5 mM EDTA, 5 mM 5-merkaptoetanolia ja 0,5 mM kutakin deoksinukleosiditrifosfaattia) huoneenlämpö-tilassa 30 minuuttia T^ DNA-polymeraasin (2 yksikköä) kanssa. Materiaali uutettiin fenolilla ja eetterillä ja is 84080

saostettiin etanolilla lisäämällä 1/10 tilavuusosaa 2M NaOAc, pH 5, ja 2,5 tilavuusosaa etanolia. Tätä tasapäistä kaksisäikeistä cDNA:ta inkuboitiin seuraa-vaksi yön yli 12°C:ssa seoksessa, jossa oli 66 mM

5 Tris.HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl9, 5 mM 2-merkaptoeta- 32 nolia, 0,5 mM ATP, 300 pmol P-merkittyä synteettistä Hind III-sidostenrauodostajaa (100-kertainen ylimäärä cDNA-päihin verrattuna) ja 9 tasapääyksikköä DNA-ligaasia.

10 Reaktioseos säädettiin väkevyyteen 10mM EDTA, pH 8, ja fraktioitiin Biogel A-150m-pylväässä (0,7 cm x 20 cm). Jakeet (kukin 0,25 ml), jotka sisälsivät suurimolekyylistä DNA:ta, yhdistettiin ja saostettiin etanolilla. Tätä materiaalia käsiteltiin 45 minuuttia 15 37C ^Crssa Hind III-restriktioendonukleaasilla (9 yksikköä) liuoksessa, jossa oli 5,6 mM Tris.HCl, pH 7,6 ja 5,6 mM MgC^/ sitten uutettiin fenolilla ja uutettiin eetterillä ja saostettiin etanolilla lisäämällä 1/10 tilavuutta 1M NaOAc, pH 5, ja 2,5 tilavuutta absoluuttista 20 etanolia. Tämä kaksisäikeinen cDNA, jossa oli kohesii-viset Hind ΙΙΙ-päät, liitettiin sitten Fl-fagi CGF4:n kaksisäikeiseen DNA:hän, joka oli leikattu auki Hind III-restriktioendonukleaasilla ja käsitelty kahdesti vasikan suolen fosfataasilla menetelmällä H. Goodman 25 and R.J. MacDonald, (1979) Methods in Enzymology 68, 75-91, päätefosfaattien poistamiseksi. (Huom! fagi CGF4 muodostettiin siten, että f1-fagi R229 (J.D. Boecke, (1981), Mol.Gen.Genet. 2ίϋ.' 288-291 ) leikattiin EcoRI-endonukleaasilla, tehtiin tasapäiseksi T4 DNA-polyme-30 raasilla ja siihen liitettiin synteettiset Hind III-oligonukleotidisidostenmuodostajät, joita toimittaa Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts). Liittämisreaktioseos sisälsi 66 mM Tris.HCl, pH 7,6 6,6 mM MgCl2, 5 mM 2-merkaptoetanolia, 0,3 yg kaksi-35 säikeistä cDNArta, 0,2 yg CGF4 DNA:ta, 0,5 mM ATP ja 300 yksikköä kohesiivisten päiden T^ DNA-ligaasia.

16 84080

Liittämisreaktio kesti 29 tuntia 16°C:ssa.

4. E.coli BNN45:n transfektio yhdistelmä-CGF4 DNA:11a E.coli-kantaa CGE6 (BNN45; hsdR-, hsdM+, sup E, 5 sup F, Bl , met ) kasvatettiin tryptoniliemessä 37°C:ssa ravistelemalla ja solut korjattiin talteen sentrifugoi-malla 10 minuuttia nopeudella 7000 1/min, kun optinen tiheys OD7Q0 oli 0,5. Solut suspendoitiin uudelleen jääkylmään 50 mM CaC^-liuokseen (puolet alkuperäisestä 10 tilavuudesta) ja annettiin seisoa 30 minuuttia 0°C:ssa. Sitten suspensiota sentrifugoitiin 10 minuuttia 4°C:ssa nopeudella 7000 1/min ja solut suspendoitiin uudelleen jääkylmään 50 mM CaC^-liuokseen, jonka tilavuus oli 1/20 alkuperäisestä viljelytilavuudesta. Kun solujen 15 oli annettu seistä 60 minuuttia 0°C:ssa, ne käytettiin transfektioon. 20 mikrolitrasta liittämisreaktioseosta lisättiin puoli mikrolitraa 8 putkeen, joissa oli 50 yl steriiliä 50 mM Tris.HCl-puskuria, pH 7,6. 0,1 ml

CaC^-käsiteltyjä soluja lisättiin kuhunkin putkeen ja 20 seos laitettiin jään päälle 30 minuutiksi. Kun oli kuumennettu 2 minuuttia 37°C:ssa, lisättiin 0,2 ml CGE5:ttä (JM101: J. Messing, (1979), F'tra D36 pro AB lac IZVM15, taustana V (lac pro) SupEthi ) yön ajan viljeltynä ja 3 ml 0,7 % pehmeätä agaria ja saatu seos 25 kaadettiin kahdeksalle tryptoni-agarlevylle. Kun inku- boitiin yön ajan 37°C:ssa, saatiin 250 täplää levyä kohti.

5. Renniiniä koodittavan sekvenssin sisältävän yhdistelmä-CGF4:n identifiointi 30 Täplät siirrettiin nitroselluloosaan ja tutkittiin menetelmällä W.D. Benton and R.W.Davis (1977) Science 196, 180-182 käyttämällä ~^P-merkittyä cDNA:ta, joka oli tehty vasikan mahasta saadusta poly-A:ta sisältä- 32 västä RNA:sta käyttämällä a P-dCTP:tä ja käänteistrans-35 kriptaasia (T.P. St. John and R.W.Davis (1979) Cell 16 17 84080 443-452). Noin 80 yhdistelmäfagia, jotka hybridisoivat voimakkaasti merkityn cDNA:n vaikutuksesta, poimittiin levyiltä ja varastoitiin TY-väliaineeseen 4°C:een. Vahingoittumattoman fagin näytteitä lisättiin kasvatta-5 maila yön yli CGE5-soluilla, kerättiin talteen sentri-fugoimalla, käsiteltiin elektroforeesilla 2% agaroosi-geelissä, joka sisälsi 0,37M Tris.glysiiniä, pH 9,5 ja värjättiin etidiumbromidilla sen jälkeen, kun oli käsitelty yksi tunti 0,2N natriumhydroksidillä ja neutra-10 loitu 0,5M Tris.HCl:lla, pH 7,4. Liikkuminen on kääntäen verrannollinen fagi-DNA:n koon logaritmiin ja näin ollen voitiin valita kahdeksan fagia, joihin sisällytetyn DNA:n koko oli 1000 - 2000 emäsparia. Näistä kahdeksasta fagista valmistettiin kaksisäikeinen RFI DNA menetelmällä 15 P.B. Moses, J.D. Boeke, K. Horiuchi & N.D. Zinder (1980) Virology 104, 267. Tämä DNA leikattiin Hind 111:11a ja syntyneet fragmentit analysoitiin agaroosigeelillä niin, että saatiin varmistetuksi se, että liitetty osa oli Hind ΙΙΙ-kohdassa ja odotetun kokoinen. Lopuksi 20 neljästä yhdistelmäfagista saatu DNA (noin 5-10 yg kustakin) ja CGF4-vektorin DNA leikattiin Hind III :11a ja, kun fragmentit oli denaturoitu keittämällä 45 sekuntia ja jäädyttämällä kuivajään ja etanolin seoksessa, ne sidottiin nitroselluloosaan tartuttamalla DNA vedessä 25 pieniin nitroselluloosahiukkasiin, jotka oli esikäsi-telty 20 x SSC:llä ja kuivattu. Kun oli kuumennettu vakuumissa 75°C:ssa 1,5 tuntia, nitroselluloosaan sidotulle DNA:lie suoritettiin hybridivalinta menetelmällä J.S. Miller, R.P. Ricciardi, B.E. Roberts, B.M. Paterson 30 & M.B. Mathews (1980) J.Mol.Biol. J_42, 455-488 käyttä mällä jokaiseen hybridisointiin 2 yg poly-A:lla rikastettua vasikan mahan RNA:ta. Sitten eluoituneelle RNA:1le suoritettiin translaatio retikulosyyttilysaattisysteemissä 35 käyttämällä merkkinä S-metioniinia menetelmällä H.R.B.

35 Pelham & R.J. Jackson (1976) Eur.J.Biochem. 67, 247-256, ie 84080 ja saadut proteiinituotteet analysoitiin 10 % polyak-ryyliamidigeelillä, joka sisälsi 0,1 % SDS, menetelmän U. Laemmli (1970) Nature 227, 680-685 mukaisesti. Geeli-analyysitulokset osoittivat, että kaikki neljä tutkittua 5 fagi-DNA:ta hybridisoituivat renniinin lähetti-RNA:ksi, koska kaikki neljä valitsivat RNA-lajin, joka kanin retikulosyyttilysaatissa suoritetussa translaatiossa antaa proteiinituotteen, joka on identtinen pre-prorennii-nin kanssa kokonsa ja immunologisten kriteerien puolesta. 10 Jatkotutkimuksiin valittiin neljästä kaksi eli 293-207, jonka liitännäinen sisältää noin 1400 emäsparia (bp), ja 293-118/37, jonka liitännäinen sisältää noin 1250 emäsparia. DNA-liitännäisten emäsjärjestys määritettiin menetelmällä A.M. Maxam and W. Gilbert (1980) Methods 15 in Enzymology 68, 499-560. Nukleotidista 205 nukleotidiin 1350 edustaa DNA-sekvenssi pre-prorenniini A-geeniä (vrt. taulukko 1). Nukleotidisekvenssit 1-204 ja 1351— 1460 ovat liittyneet pre-prorenniiniin, mutta ne voidaan haluttaessa poistaa, eivätkä ne ole oleellisia geenin 20 käytölle ilmentymisessä. Taulukossa 1 esitetyn DNA- materiaalin hyödylliset osat voidaan erottaa ja käyttää tunnetuilla menetelmillä.

8 4 c ε o *93888333839Ι331Ι9382Ι33»9886918$ΙΙ383Ρ fg β 9 91 sa §3 33 33 89 SI 32 89 33 S3 21 53 3 2 9 SI 33 33 28 SI 3» S! 39 83 S3 33 31 23 9 9 9 S3 28 28 83 SI 93 SI S3 SI SI 88 SI 33 3 9 9 31 33 S3 SI 93 92 31 93 S3 81 99 33 93 9 8 8 93 33 S3 SI 98 33 81 93 SI S3 39 SI 33 2 9 2 93 33 93 S3 93 33 39 33 39 31 S8 33 93 9 9 2 33 33 81 23 28 SI 92 98 SS SI 92 28 39 9 8 8 21 33 28 28 39 SI S3 83 39 SI SI 93 81.3

9 8 83 81 33 S3 S3 83 21 SI 39 92 28 SI 29 I

s2323S9S393SI38ll2l393228SSI2S8|93|SI|S8pil8 9 9 21 33 39 92 33 89 33 33 21 89 83 28 99 9 8 8 83 83 83 19 92 98 89 33 33 83 S3 22 93 2 9 S 83 63 28 28 S3 33 93 93 28 S3 39 93 39 9 1 8 83 93 S3 81 93 33 83 S3 28 21 28 33 82 8 9 2 83 89 98 39 83 Ϊ3 29 99 33 91 39 39 89 9 8 9 33 33 83 21 SI 39 92 39 33 93 S3 33 SI 2 2 9 39 S3 92 21 33 89 28 SI 89 98 39 91 28 9 _ 9 8 83 83 89 93 81 S3 99 28 98 39 82 38 88 2 O 8 9 28 99 SI SI SI S3 SI 89 89 83 33 88 33 8 g *23233333Ι893333328329293328282183|33ρ9ξ83Η2 ä 8 2 SI S3 99 81 29 89 83 88 39 99 28 21 S3 3 s 9 i 3 33 33 33 S3 SI S3 33 28 33 33 92 88 8 9 9 2 21 93 99 93 39 93 31 39 28 S3 S3 89 S e

9 8 9 SS 21 SI §2 SI 38 33 83 93. 33 83 39 9 S

9 9 9 93 93 21 33 38 21 99 21 93 98 82 93 9 9 999 33 29 39 81 88 33 19 §3 33 93 28 83-8-3 9 2 9 28 28 33 99 93 93 83 91 28 93 SI S3 9 9

6 8 9 83 S3 92 33 83 88 33 28 93 53 33 28 8 I

3 9 3 82 SI §2 33 S3 SI S3 28 89 93 93 IS 9 9 20 84080 Tässä taulukossa on yhdistettynä sekä 293-207:n että 293-118/37 informaatio? yhdistelmäfagi 293-207 sisältää liitännäisen, jolla on taulukon 1 mukainen sekvenssi nukleotidista no. 1 vähintään nukleotidiin 5 no. 1360, lukuunottamatta nukleotideja 848-961, jotka pyyhitään yli, kun taas fagissa 293-118/37 on liitännäinen, joka sisältää sekvenssin nukleotidista no.

229 nukleotidiin no. 1460. Emäsjärjestysmääritysten mukaan renniinisynteesi alkaa metioniinikodonista 10 (nukleotidit 205-207) ja päättyy pre-prorenniinimole-kyyliin, jossa on 16 lisäaminohappoa verrattuna puhdistettuun prorenniiniin (Prorenniini B:n aminohappojärjestys on esitetty julkaisuissa B. Foltmann et ai. Proc. Nat.Acad.Sci. USA 1± 2321-2324 (1977) ja B. Foltmann et 15 ai. J.Biol. Chem. 254 8447-8456 (1979); taulukossa 1 esitetyt nukleotidisekvensitiedot ovat ensimmäinen ilmoitus pre-prorenniinin esiintymisestä). Kaksi yhdistelmä-f1-fagia, 293-207 ja 293-118/37, sisältävät yhdessä preprorenniini A:n koko molekyylin DNA-sekvenssin.

20 Pre-prorenniini A:n prorenniiniosa eroaa prorenniini B:stä aminohapon no. 290 kohdalla (aspartaatti rennii-nissä A ja glysiini renniinissä B, vert. Foltmann et ai. edellä; aminohapot on numeroitu Foltmannin mukaan). Aminohapon no. 204 kohdassa on esitetty asparagiini-25 kodoni, kun taas Foltmann on ilmoittanut aspartaatin tähän asemaan; kuitenkin tässä voi olla virhe aminohappojärjestyksen määrityksessä, koska aspartaatin ja glutamaatin amidit on vaikea erottaa happomuodoistaan, kun taas nukleotidijärjestyksen määrityksessä pystytään 30 kodonit helposti erottamaan toisistaan.

Kloonattua renniinigeeniä, jota edusti fagi 293-118/37, käytettiin naudan perimän renniinigeenin --- kopion tai kopioiden tutkimiseen. Nämä kokeet tehtiin hybridisoimalla kloonattu renniini-DNA, joka oli merkitty 32 35 P:llä, pykälätranslaatiomenetelmällä (nick-translation) \ 2i 84080 (P.W.J. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes and P. Berg (1977) J.Mol.Biol. 113, 237-251) naudan DNA:ksi, joka oli leikattu erilaisilla restriktioentsyymeillä, erotettu agaroosigeelillä ja siirretty nitroselluloosamembraaniin 5 menetelmällä E.M. Southern (1975) J.Mol.Biol. 9J), 503-517). Tulokset osoittavat, että restriktioendonuk-leaasit, kuten Sacl ja Bgll, jotka eivät leikkaa kloonattua pre-prorenniini-cDNA-sekvenssiä, mutta leikkaavat naudan DNA:ta, kuitenkin saavat aikaan useampia kuin yhden 10 DNA-kaistan, joka hybridisoituu renniinisekvenssiksi.

Tästä päätellen (a) renniini-informaation perimäkopio sisältäisi lisä-DNA:ta, oletettavasti välisekvenssejä, joissa on restriktioentsyymien tunnistuskohtia, joita ei löydy renniini-cDNA:sta, tai (b) perimässä esiintyisi 15 useampi kuin yksi renniinigeeni ja eräät restriktioent-syymit suorittavat katkaisun näiden kopioiden välistä.

Viimeksimainittu mahdollisuus eliminoitiin hybridisoimalla restriktio- 32 entsyymillä leikattu naudan perimä-DNA P:llä merkityillä näytteillä, jotka oli johdettu kloonatun renniini-20 cDNA:n 5'- ja 3'-päästä. Kun käytetään esim. restriktio-endonukleaaseja EcoRI ja BamHI, saadaan tulokset, joiden mukaan perimässä on vain yksi renniini-informaatiota koodittava kopio. Tämä merkitsee sitä, että renniinin A- ja B-muodot, jotka B. Foltmann et ai. ovat havainneet 25 (J.Biol.Chem. 254, 8447-8456 (1979)), ovat mitä todennäköisimmin renniinigeenin kahden erilaisen vastingeenin tuotteita. Edelleen naudan perimän sisältämä renniinigeenin kopio sisältää välisekvenssejä, ja tässä suhteessa perimän kopio on erilainen kuin meidän kloonattu cDNA-30 geenimme, joka on identtinen pre-prorenniinin lähetti-RNA:n kanssa.

6. Pre-prorenniinin ilmentyminen E.colissa Plasmidi, pCGE5, joka oli suunniteltu saamaan aikaan preprorenniinin ilmentyminen E.colissa, rakennettiin 22 84080 liittämällä yhteen kolme agaroosigeelillä puhdistettua DNA-segmenttiä. Plasmidia pBR322 (4,5 yg) leikattiin restriktioendonukleaaseilla Hind III (N.E. Biolabs, 6 yksikköä) ja Pst I (N.E. Biolabs, 3 yksikköä) 1 5 tunnin ajan 37°C:ssa 50 ylrssa reaktioseosta, joka oli 50 mM NaCl, 7 mM Tris.HCl, pH 7,5, 7 mM MgC^ ja 6 mM 2-merkaptoetanolin suhteen. Kaksisäikeistä yhdistelmätagin 293-207 RFI DNA:ta (4 yg) leikattiin restriktioendonukleaasilla Κρη I (N.E. Biolabs, 10 10 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 ylrssa reaktioseosta,

joka sisälsi K-puskuria (6mM NaCl, 6 mM Tris.HCl, pH

7.5 6 mM MgC^ ja 6 mM 2-merkaptoetanolia). Noin 4.5 yg plasmidin pLG400 DNA:ta (L. Guarete, G. Lauer, T. Roberts, M. Ptasne, Cell 2_0, 543-553, 1980) leikattiin 15 Hind 111:11a (N.E. Biolabs, 6 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 ylrssa reaktioseosta, jossa oli H-puskuria (60 mM NaCl, 7 mM Tris.HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2). Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, 293-207:stä ja pLG400:sta saatu leikattu DNA käsiteltiin 20 erikseen T^ DNA-polymeraasilla (P-L Biochemicals, 10 yksikköä) 30 minuutissa 37°C:ssa 50 ylrssa reaktio-seosta, joka sisälsi T-puskuria (25 mM Tris.HCl, pH 8, 6.6 mM MgCl2, 5 mM 2-merkaptoetanolia, 0,5 mM EDTA ja 0,5 mM kutakin deoksinukleotiditrifosfaattia) niin, että 25 restriktioentsyymien leikkauskohdat saatiin tasapäi-siksi. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, pLG400:n DNArta leikattiin vielä Pst Irllä (N.E. Biolabs, 3 yksikköä) 2 tuntia 37°C:ssa 50 ylrssa P-puskuria (50 mM NaCl, 7 mM Tris.HCl, pH 30 7,5, 7 mM MgC^ ja 6 mM 2-merkaptoetanolia), kun taas 293-207:n DNArta leikattiin Hind Illrlla (N.E. Biolabs, 6 yksikköä) 2 tuntia 37°C:ssa 50 ylrssa H-puskuria.

Kukin kolmesta restriktioentsyymillä leikatusta DNA-valmisteesta uutettiin fenolilla ja eetterillä ja saos-35 tettiin etanolilla ja liuotettiin 30 ylraan vettä ja 23 84080 sijoitettiin preparatiiviseen horisontaaliseen 1% agaroosigeeliin. Kun oli suoritettu 3-4 tunnin elektroforeesi 70-80 voltissa 40mM Tris.asetaatissa, pH 7,2, geeli värjättiin etidiumbromidilla ja tutkittiin pitkä-aaltoisella ultraviolettivalolla. 293-207:stä leikattiin 500 emäsparin kaista, pLG400:sta leikattiin 6000 emäsparin kaista ja pBR322:sta leikattiin 800 emäs-parin kaista ja DNA uutettiin jäädyttämällä ja sulattamalla geelipalat (Thuring et ai, Anal.Biochem. 66, 213 (1975)). Kaikki kolme DNA-segmenttiä saostettiin etanolilla ja liuotettiin uudelleen veteen. Noin 0,15 pmoolia kutakin osaa liitettiin yhteen yön ajan 14°C:ssa 20 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli L-puskuria (66 mM Tris.HCl, pH 7,5, 6,7 mM MgC^, 10 mM ditiotreitolia, 0,75 mM ATP) ja DNA-ligaasia (N.E. Biolabs, 600 yksikköä). Transformaatiokelpoiset E.coli-kannan CGE6-solut valmistettiin tarkalleen kohdan 4 mukaisesti ja 5 yl yhteenliitettyä DNA:ta, joka oli 50 yltssa 50 mM Tris.HCl, pH 7,6, sekoitettiin 100 yl kanssa soluja 1 tunti 0°C:ssa, lämpökäsiteltiin 2 minuuttia 27°C:ssa ja laimennettiin kymmenkertaisesti tuoreella tryptoni-liemellä. Kun oli inkuboitu 1 tunti 37°C:ssa ravistelemalla, solut laitettiin tryptonilevyille, jotka sisälsivät ampisilliinia (20 yg/ml). Ampisilliinille vastustuskykyiset pesäkkeet poimittiin ja plasmidi-DNA valmistettiin ja analysoitiin restriktioentsyymeillä hajottamalla. Näiden kriteerien mukaan useissa kannoissa oli haluttu plasmidi pCGE5, taulukko 2.

24 84080

Taulukko 2 PstI

JVampr \

/ pCGE5 I

\ lacl''Z / ^^^93-207 insert

Hind III Hind III (tasapää) Κρη I (tasapää) DNA-sekvenssianalyysi osoitti, että 293-207-DNA:n ja pLG400-DNA:n välinen yhtymäkohta oli odotetun kaltainen, ja näin ollen pre-prorenniinin 5'-pää on kehässä fuusi-5 oitunut Guarete et ai:n Ι''Ζ-fuusion 3'-päähän. Plasmidi-DNA valmistettiin tavallisilla menetelmillä (D.B.

Clewell and D.R. Helinski, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 62 1159-1166 (1969)) kannasta, jossa oli pCGE5.

DNA-fragmentti, jossa oli laktoosi-operoni-promoottori 10 ja ribosomisidoskohta, eristettiin plasmidista pGLlOI (L.Guarete, G. Lauer, T.Roberts and M.Ptashne, Cell 2Q 543-553 (1981)) siten, että 10 yg DNArta leikattiin Pvu 11:11a (N.E. Biolabs, 7,5 yksikköä) ja Pst I:llä (N.E. Biolabs, 4 yksikköä) 2 tuntia 37°C:ssa 100 yl:ssa 15 reaktioseosta, joka sisälsi puskuria P. 850 emäsparin segmentti erotettiin preparatiivisesta agaroosigeelistä leikkaamalla kaista irti ja suorittamalla jäädytys ja 25 84080 sulatus edellä kuvatulla tavalla.

Plasmidin pCGE5 DNA:ta (40 yg) leikattiin Hind 111:11a (CRI/ 70 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 150 yg reaktioseosta, jossa oli puskuria H (ks. edellä).

5 Sitten tätä DNA:ta hajotettiin endonukleaasilla Bal 31 (N.E. Biolabs, 5 yksikköä) 10 minuuttia 30°C:ssa 200 yl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi puskuria B (0,6M NaCl, 12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2, 20 mM Tris.HCl, pH8, ja 1mM EDTA) (vert. taulukko 3).

10 TAULUKKO 3 (ampr

pCGE5 I

/ lacl''Z

*^Bal31 JJ

Hind III pre-prorenniini

Geelielektroforeettinen analyysi osoitti, että Bal 31-käsittely poisti riittävän määrän nukleotideja niin, että syntyi fragmenttisarja, jossa oli 5'-päät lähellä pre-prorenniinin ATG-alkukodonia. DNA:sta 15 tehtiin tasapäinen edellä kuvatulla tavalla käyttämällä DNA-polymeraasia, ja sitten DNA:ta (1 yg) hajotettiin osittain Pst I:llä (N.E. Biolabs, 0,06 yksikköä) 5 minuuttia 37°C:ssa 20 yl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi P-puskuria. Seuraavaksi tämä DNA liitettiin 20 yhteen 850 emäsparin DNA-fragmentin kanssa, joka sisälsi 84080 26 laktoosi-operoni-promoottorin ja ribosomisidoskohdan (0,2 pg) 20 ylrssa reaktioseosta, joka sisälsi DNA-ligaasi (CRI, 300 yksikköä) L-puskurissa.

Transformaatiokykyiset E.coli-kannan CGE7-solut 5 (NK5031, suIII+, lacVM5265, nalr, F , Bl ) valmistettiin aivan samoin kuin kannan CGE6 kohdalla, ja 100 yl solususpensiota transformoitiin 5 yl:lla reaktio-seosta, inkuboitiin, annettiin lämpöisku ja kasvatettiin fenotyyppisen ampisilliinin vastustuskyvyn 10 tarkoituksessa tarkalleen samoin kuin tapahtui edellä, kun CGE6 transformoitiin pCGE5:llä. Soluja kasvatettiin maljoilla, joissa oli MacConkey-laktoosialustaa ja ampisilliinia (20 yg/ml). Tummanpunaiset pesäkkeet, joissa havaittiin β-galaktosidaasia, poimittiin ja β-15 galaktosidaasiaktiivisuus määritettiin (J.Miller,

Experiments in Molecular Genetics, New York, Cold Spring Harbor Laboratory 1972). Plasmidi-DNA eristettiin näistä transformanteista kahdestatoista ja analysoitiin re-striktioentsyymei 11 ä hajottamalla ja agaroosi- tai poly-20 akryyliamidigeelielektroforeettisesti. Yksi kanta, CGR20, sisältää laktoosi-operoni-promoottorin, joka on noin 40 nukleotidia lähtien pre-prorenniini-I''Z-liitännäisen ATG-alkukodonista plasmidissa pCGE17 (vrt. taulukko 4), ja tuottaa keskimääräisiä määriä 25 β-galaktosidaasia (noin 1/3 täysin indusoidusta tasosta sellaisella laktoosi+-kannalla kuin CGE6).

27 84080

Taulukko 4 I pCGE17 j

\ / lacl' ' Z

\^°SDlaC ATG Rl pre-prorenniini

Jotta saataisiin syntymään plasmidi, joka sisältää koko preprorenniinigeenin liittyneenä laktoosi-promoottoriin ja ribosomisidoskohtaan, pCGE17-DNA:ta (4 yg) 5 leikattiin BGl II:lla (N.E. Biolabs, 6 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 90 yl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi P-puskuria. Sitten lisättiin Tris.HCl, pH 7,5 kunnes väkevyydeksi tuli 100 mM ja DNA:ta leikattiin Eco RI:llä (Boehringer/ Mannheim, 40 yksikköä) vielä 1 tunti 37°C:ssa. Seuraa-10 vaksi pBR322-DNA:ta (5 yg) leikattiin Pvu II:lla (N.E. Biolabs, 5 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 45 ylrssa reaktio-seosta, jossa oli P-puskuria, ja sen jälkeen lisättiin Tris.HCl, pH 7,5, kunnes väkevyydeksi tuli 100 mM ja Eco Riitä (Boehringer/Mannheim, 40 yksikköä) ja inkuboitiin 15 vielä 1 tunti 37°C:ssa. Lopuksi yhdistelmätagin 293-118/ 37 RFI DNA: ta (6 yg) leikattiin Hind Ulilla (N.E.

Biolabs, 6 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktio-seosta, jossa oli H-puskuria. Kun oli uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, leikattua DNA:ta käsiteltiin 20 t^ DNA-polymeraasilla (P-L Biochemicals, 10 yksikköä) huoneenlämpötilassa 30 minuuttia 50 ylrssa reaktio- 28 84080 seosta, jossa oli T-puskuria niin, että Hind Hikoilta saatiin tasapäiseksi. Sitten fenolilla uutettua, etanolilla seostettua ja uudelleenliuotettua DNA:ta leikattiin Bgl II:11a (N.E. Biolabs, 4 yksikköä) 1 5 tunti 37°C:ssa 30 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli P- puskuria. Kyseiset kolme restriktioentsyymeillä leikattua DNA-lajia sijoitettiin preparatiiviseen horisontaaliseen agaroosi-geeliin ja 370 emäsparin pCGE17-pala, 2300 emäsparin pBR322-pala ja 1000 emäsparin 293-118/37-pala leikattiin 10 irti ja eluoitiin jäädyttämällä ja sulattamalla agaroosi-viipale. Etanolisaostuksen jälkeen DNA liuotettiin uudelleen veteen ja noin 0,2 pmol kutakin palaa liitettiin yhteen 6 tuntia 14°C:ssa 20 yl:ssa reaktio-seosta, jossa oli L-puskuria ja DNA-ligaasia (N.E.

15 Biolabs, 300 yksikköä). E.coli-kanta CGE6 transformoitiin DNA-li itännäisellä edellä kuvatulla tavalla ja ampisilliinille vastustuskykyiset kannat poimittiin.

Kun plasmidi-DNA analysoitiin restriktioentsyymeillä katkaisemalla, osoittautui, että kanta CGE24 sisältää 20 plasmidin pCGE21 (vrt. taulukko 5), joka sisältää koko pre-prorenniinisekvenssin liittyneenä laktoosioperoni-promoottoriin ja ribosomisidoskohtaan.

TAULUKKO 5

Q(PvuII/Hind III

tasapäinen) rorenniini 29 84080

Kaksi analyysiä osoittaa, että tämä kanta syntetisoi autenttista vasikan pre-prorenniiniä. Ensinnäkin epäpuhtaat solu-uutteet inhiboivat jodinoidun renniinin sitoutumista antirenniiniseerumiin radioimmuunimääri-5 tyksessä, joka suoritettiin Peak et ai. menetelmällä (G.J. Peak, J. Morris and M.J. Buckman (1979) "Growth Hormones" in Methods of Hormone Radioimmunoassay, pp 223-244, B.M. Jaffe & H.R. Behrman, eds., Academic Press, New York, seuraavin muunnoksin: jodinoitua 10 renniiniä säilytetään seoksessa, jonka väkevyys on 50 mM natriumfosfaatin, pH 6, suhteen, 0,15 M NaCl ja 1 % BSA suhteen; RIA-puskuri on 0,05 M Tris.HCl, pH 8, 0,5 % ihmisen seerumialbumiinia ja 0,1 % natriumnitriit-tiä, ja inkubointi tapahtuu 4°C:ssa 18 tunnin aikana.

15 Inhiboitumismäärä osoittaa, että noin 0,8 pg pre- prorenniiniä on läsnä jokaisessa uutemillilitrassa (tai noin 4 yg pre-prorenniiniä soluviljelmän litraa kohti)). Toiseksi soluja pulssimerkittiin 30 minuuttia 35 keskieksponentiaalifaasissa S-metioniinilla, solut 20 hajotettiin ja immunosaostettiin antirenniiniseerumilla (vrt. J.S. Emtage et ai. Nature 283 171-175 (1980)).

Kun immunosakat analysoitiin 10% polyakryyliamidigee-lillä, jossa oli SDSrää (U.K. Laemmli & M. Favre, J.Mol.Biol. 80^ 575-599 (1973)) ja autoradiografoitiin, 25 havaittiin kaista, joka oli suunnilleen pre-prorenniinin kokoinen. Lisäksi havaittiin renniinin kokoa vastaava kaista, mikä merkitsi sitä, että bakteerit saattavat muuttaa pre-prorenniinin renniiniksi tai toinen translaation alkaminen voi tapahtua pre-prorenniinin sekvenssin 30 sisällä. Kumpaakaan kaistaa ei ollut läsnä immunosakoissa, jotka oli saatu emäkannasta CGE6, joka ei sisältänyt plas-midia. Tulokset osoittavat, että E.coli-kannat, joissa on plasmidi pCGE21, tuottavat pre-prorenniiniä noin 600 molekyyliä solua kohti. Suuremmat tuotantotasot 35 ovat mahdollisia, kun tämän saman kaavion mukaan

30 8 4 0SQ

laktoosi-operoni-prcmoottori liitetään lähemmäksi pre-prorenniinin alkukodonia.

Kannasta CGE24 saatujen uutteiden aktiivisuus testattiin myös maidonjuoksetuksen standardikokeilla, 5 B. Foltmann, Methods in Enzymology (1970) J_9, 421-436. Tulokset osoittavat, että tämä E.coli-kanta tuottaa solua kohti noin 100 molekyyliä aktiivista renniiniä tai aktiivista renniinifragmenttia, joka kykenee juoksettamaan maidon, kun taas kannasta CGE6, 10 joka ei sisällä renniini-DNA-sekvenssejä, saatu uute ei kykene juoksettamaan maitoa. Kanta CGE24, jossa on plasmidi pCGE21, on säilytettävänä American Type Culture Collection (ATCC)-kokoelmissa, joissa sen numero on 31929.

15 Kanta CGE24 on E.coli-kanta BNN45 (hsdR hsdM+ supE44 supF Bl met ) (Advanced Bacterial Genetics, R.W. Davis, D. Botstein, J.R. Roth, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1980, s. 7), joka sisältää plasmidin pCGE21, joka on määritelty alla olevassa kaa-20 viossa. Plasmidi sisältää osan plasmidista pBR322 (nukleotidit 2067-4360, ks. J.G. Sutcliffe (1979)

Cold Spring Harbor Symposium 4_3, 77-90) ja 95 emäsparin fragmentin, joka on kiinnittynyt EcoRI- ja Pvu II-kohtiin ja peräisin plasmidista pGLl01 (L. Guarete, 25 G. Lauer, T.M. Roberts and M. Ptashne (1 980) Cell 20, 543-553) ja liittynyt niihin 1300 nukleotidiin, jotka koodittavat pre-prorenniinimolekyyliä (peräisin yhdistelmä-f1-fageista 239-207 ja 293-118/37). Orientointi on sellainen, että laktoosi-operoni-promoottori panee liikkeelle 30 pre-prorenniiniproteiinin ilmenemisen E.colissa.

31 84080 TAULUKKO 6 95 nukleotidin Jk fragmentti \ f pGL 101:stä V 'preprorenni iniä koo- \ Pst I dittava sekvenssi 7. Metioniiniprorenniinin ilmentyminen E.colissa

Pre-prorenniinigeeni sisältää kolme restriktioendo-nukleaasin Hha I tunnistuskohtaa (tunnistaa GCGCrn, vrt. taulukko 1), joista yksi poistaa "pre"-signaalin 5 sekvenssin ja jäljelle jää prorenniinin sekvenssi miinus alaniinin kodonin ensimmäinen nukleotidi (c.) . Näin ollen analysoimme tämän osittaisen liha I-ha jotustuotteen, joka edustaa lähes vahingoittumatonta prorenniinigeeniä. RFI-kaksisäikeistä-DNA:ta, joka oli peräisin yhdistelmä-10 fagista 293-118/37, leikattiin 1 tunti 37°C:ssa 12 yksiköllä restriktioendonukleaasia Hind III (N.E. Biolabs)

32 8 4 O S O

50 yl:ssa H-puskuria. Noin 1230 emäsparin suuruinen liitännäinen, joka sisälsi renniini-DNA:n, puhdistettiin uuttamalla DNA kyseisestä 1% agaroosigeeli-kaistasta jäädytys-sulatusmenetelmällä. Noin 1,5 5 yg:lle tätä DNA: ta suoritettiin osittainen katkaisu

Hha I:llä inkuboimalla 5 minuuttia 37°C:ssa 0,25 yksikön kanssa Hha I:tä (N.E.Biolabs) 30 yl:ssa P-puskuria.

DNA, joka vastaa leikkaamatonta plus kerran leikattua palasta, josta puuttuu noin 25 nukleotidia 293-118/37:n ** 0 alusta, eristettiin 2% agaroosigeelikaistasta.

Plasmidin pBR322 DNA:ta (10 yg) leikattiin restriktio-endonukleaasilla Hind III (N.E. Biolabs, 9 yksikköä) 100 yl:ssa H-puskuria 1 tunti 37°C:ssa. DNA uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Noin 0,5 pmol kutakin DNA:ta (so. Hha 1:11. osittain leikattu 293-118/37 ja Hind III :11a leikattu pBR322) yhdistettiin, liuotettiin uudestaan 28 yl:aan vettä ja tehtiin tasa-päiseksi käsittelemällä DNA-polymeraasilia I (Boehringer/ Mannheim, 9 yksikköä) 40 yl:ssa reaktioseosta, jossa ^ oli D-puskuria (60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolia, 1 mM ATP ja 0,2 mM kutakin deoksi-nukleotiditrifosfaattia), 10 minuuttia 10°C:ssa. Synteettinen oligonukleotidi, joka sisälsi restriktioendo-nukleaasin Xba I sekvenssin plus ATGG:n (so. CCATCTAGATGG), J syntetisoitiin Collaborative Research, Inc:n triesteri- menetelmällä (K. Itakura et ai. J.Biol.Chem. 250 4592 32 (1975)) ja 5 yg kinasoitiin a -P-ATP:llä käyttämällä 6 yksikköä T^-polynukleotidikinaasia (P-L Biochemicals) 25 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli Y-puskuria (70 mM Tris.HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanolia ja 2 nmol ATP). Tämä 5'-merkitty oligonukleotidi lisättiin 40 yl:aan tasapäistä reaktioseosta ja myöskin lisättiin puskurin aineosia väkevyyden pitämiseksi vakiona sekä 600 yksikköä T^ DNA-ligaasia (N.E. Biolabs).

K Q

Reaktioseosta inkuboitiin 14 C:ssa yön yli ja sitten se 33 84030 laimennettiin viidellä tilavuudella liuosta, joka oli 180 mM NaCl, 7 mM MgC^ ja 5 mM Tris.HCl, pH 8, suhteen. Kun oli kuumennettu 5 minuuttia 65°C:ssa, DNA käsiteltiin 45 yksiköllä Xba I-restriktioendonukleaasia (15 5 yksikköä lisättiin kerran tunnissa kolmen tunnin pituisen hajotuksen aikana). Lopuksi oligonukleotidimono-meerit erotettiin suuresta DNArsta geelisuodattamalla Bio-gel A-5m-pylväässä (0,68 x 36 cm, vrt. edellä). Poistunut DNA kerättiin yhteen, saostettiin etanolilla, 10 uudelleenliuotettiin 12 yl:aan vettä ja inkuboitiin liitäntäreaktiossa yön yli 14°C:ssa siten, että reaktio-seos sisälsi L-puskuria ja 300 yksikköä DNA-ligaasia (N.E.Biolabs). Viisi mikrolitraa tätä liitäntäreaktio-seosta käytettiin transformoimaan sopivat CGE6-kannan 15 solut edellä kuvatulla tavalla. Transformoituja soluja kasvatettiin tryptonilevyillä, jotka sisälsivät 20 yg/ml ampisilliinia, ja ampisilliinille vastustuskykyiset pesäkkeet poimittiin ja niiden herkkyys tetra-sykliinille seulottiin. Kun plasmidi-DNA analysoitiin 20 restriktioentsyymeillä hajottamalla (Xba I + Κρη I) ja polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, paljastui yksi kanta, joka sisälsi halutun plasmidin pCGE 181 (so. antaa 250 emäsparia sisältävän Xba I-Κρη I-frag-mentin).

25 Noin 5yg pCGE 181:n DNA:ta leikataan Xba I:llä (N.E, Biolabs, 4 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa on X-puskuria (150 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl, pH 7,9, 6 mM MgC^)· Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, DNA tehdään tasapäiseksi kä-30 sittelemällä T^ DNA-polymeraasilla (P-L Biochemicals, 10 yksikköä) 30 minuuttia 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktio-seosta, jossa on T-puskuria. Jälleen DNA uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. Vektori-DNA valmistetaan leikkaamalla 5 yg plasmidin pGL101 DNA:ta (L- Buarete 35 et ai. Cell 20 543-553 (1980)) Pvu II:lla (N.E.Biolabs, 5 yksikköä) 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli P-puskuria.

34 84080

Sitten uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja DNA liuotetaan ja fosfatoidaan käsittelemällä 0,06 yksiköllä vasikan suolen alkalista fosfataasia (Boehringer/Mannheim) 30 minuuttia 37°C:ssa 50 yl:ssa 5 reaktioseosta, jossa on C-puskuria. Pvu II:11a leikatun vektorin (0,2 pmol) ja Xba I:llä leikatun prorenniinin DNA-palasen (0,2 pmol) annetaan liittyä yhteen yön ajan 14°C:ssa 20 yl:ssa reaktioseosta, jossa on L-puskuria. Transformaatiokelpoiset CGE6-kannan solut 10 valmistetaan edellä kuvatulla tavalla ja transformoidaan 5 yl:lla liitäntäreaktioseosta. Saatuja soluja kasvatetaan tryptoniagarlevyillä, jotka sisältävät 20 yg/ml ampisilliinia. Ampisilliinille vastustuskykyiset pesäkkeet poimitaan ja plasmidi-DNA erotetaan ja 15 analysoidaan suorittamalla hajotus restriktioentsyy-meillä ja geelielektroforeesi. Löydetään kanta, joka sisältää prorenniini-DNA:n liittyneenä laktocsi-operoni-prcmoottoriin ja ribosomisidoskohtaan niin, että prorenniiniproteiinia valmistuu in vivo (so. ATG-20 alkukodoni, joka on lisätty prorenniinisekvenssiin, sijaitsee yhdeksän nukleotidin päässä laktoosi-operoni-ribosomisidoskohdasta). Syntetisoituvan prorenniinin määrä mitataan suorittamalla plasmidin sisältäville hajotetuille soluille radioimmuunimääritys käyttämällä 25 jodinoitua autenttista renniiniä ja antirenniiniseerumia.

Prorenniinituotteen koko määritetään elektroforeetti-35 sesti S-metioniinilla merkittyjen solu-uutteiden immu-nosakoista polyakryyliamidigeeleillä, jotka sisältävät SDS:ää.

30 8a. Metioniini-valiinirenniinin ilmentyminen E.colissa

Jotta saataisiin DNA, joka sisältää vain renniiniä koodit tavan sekvenssin, yhdistelmätagin 293-207 RFI DNA leikattiin uudestaan nukleaasilla Bal 31 ja liitettiin 35 f1-fagivektoriin. Liitäntätuotteet kloonattiin ja näin 35 84080 saatiin suuri joukko uudelleenleikattua renniini-DNA:ta. Tarkemmin sanottuna 8 yg 293-207:n fagi-RFI-DNA:ta leikattiin 1 tunti 37°C:ssa 6 yksiköllä Hind III:a (N.E. Biolabs) 20 ylrssa H-puskuria. Kun ^ oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, DNA liuotettiin uudestaan 20 yl:aan vettä ja käsiteltiin 30 minuuttia 30°C:ssa 1,25 yksiköllä Bal 31 (N.E. Biolabs) 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli B-puskuria. Reaktio pysäytettiin uuttamalla fenolilla 10 ja saostamalla etanolilla. Bal 31:llä leikatut DNA-jakeet, jotka olivat kooltaan alueella 500-1000 emäs-paria, eristettiin 1,5 % agaroosigeelistä edellä kuvatulla jäädytys-sulatusmenetelmällä. Uudelleenleikattu DNA tehtiin tasapäiseksi käsittelemällä 10 minuuttia 15 10°C:ssa DNA polymeraasi I:llä (Boehringer/Mannheim, 9 yksikköä) 40 ylrssa reaktioseosta, jossa oli D-puskuria. Synteettiset oligonukleotidisidoksenmuodos-tajat (tarkemmin sanottuna Hind III 8-meeri CAAGCTTG; 5,0 yg Collaborative Research, Inc rsta) kinasoitiin 32 20 P-ATP:llä käyttäen 6 yksikköä T^-polynukleotidi- kinaasia (P-L Biochemicals) 25 ylrssa reaktioseosta, jossa oli Y-puskuria. Tämä merkitty oligonukleotidi lisättiin 40 ylraan tasapäistä reaktioseosta ja myöskin lisättiin puskurikomponentteja pitämään väkevyys vakiona 25 ja 600 yksikköä T^ DNA-ligaasia (N.E. Biolabs). Reaktio-seosta inkuboitiin yön yli 14°C:ssa. Sitten reaktio-seos laimennettiin viisinkertaisesti 250 ylrlla liuosta, joka oli 60 mM NaCl ja 7 mM MgC^ suhteen, ja kuumennettiin 5 minuutti 65°C:ssa. Kun reaktioseos oli 30 jäähdytetty, siihen lisättiin kaikkiaan 45 yksikköä

Ilind III-restriktioendonukleaasia (N. E. Biolabs) siten, että 37°C:ssa lisättiin kerran tunnissa 15 yksikköä kaikkiaan kolmen tunnin ajan. Oligonukleotidisidoksen-muodostajamonomeerit poistettiin seoksesta eluoimalla 35 Biogel A-5m-pylväässä (0,68 x 36 cm, Bio Rad) pylväs- 36 ε 4 c ε o puskurissa (10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Poistunut huippu saostettiin etanolilla ja DNA (noin, 0,5 pmol) lisättiin 20 yl:aan liitäntäreaktioseosta, jossa oli L-puskuria, 600 yksik-5 köä DNA-ligaasia (N.E. Biolabs) ja noin 0,5 pmol fagit CGF4 RFI DNArta (Collaborative Genetics Inc.), joka oli leikattu Hind 111:11a ja fosfatoitu edellä kuvatulla tavalla. Kun oli liitetty 18 tuntia 14°C:ssa, valmistettiin 4 yl reaktioseoksen 40-kertaista 10 laimennusta 50 mM Tris.HCl, pH 7,6-puskuriin, jolla transfektoitiin sopivat kannan CGE6 solut. Trans-fektio ja täplien kasvattaminen levyillä suoritettiin tarkalleen samoin kuin edellä kohdassa 4. Levyä kohti saatiin noin 500 täplää, ja kun tehtiin kokeet Bentonin 15 ja Davisin menetelmällä (Science 196 180-182 (1977)) käyttämällä pykälätranslaatiolla (nick-translation) saatua pre-prorenniini-DNA:ta, joka oli plasmidissa pBR322 (menetelmä: P.W.J. Rigby et ai. (1977) J.Mol.

Biol. 113 237-251), osoittautui, että noin 15 % täplistä 20 sisälsi renniini-DNA:ta. Näistä noin 250 poimittiin ja säilytettiin tryptoniliemessä 4°C:ssa. Kun useiden näiden yhdistelmätagien DNA analysoitiin restriktio-entsyymeillä hajottamalla ja agaroosigeelielektrofo-reesilla, paljastui useita fageja, joissa oli Bal 31:llä 25 leikattu pre-prorenniini-DNA, joka oli sellainen, että liitetyn sekvenssin 5'-pää on lähellä renniiniä kooditta-van sekvenssin alkua (so. nukleotidi 379 taulukossa 1 esitetyssä sekvenssissä). Näistä fageista eristetään yksisäikeinen yhdistelmä-f1-fagi-DNA seuraavalla tavalla. 30 Ensinnä valmistetaan fagista varasto levylle siten, että 0,4 ml yön yli kasvatettua CGE5-viljelmää infektoidaan 50 yl:lla täplästä poimittua fagia. Tämä kaadetaan 150 mm tryptoniagarlevylie 7 ml:ssa 0,7 % pehmeäagaria. Viljelmää kasvatetaan yön yli ja fanit eluoidaan lisää-35 mällä 12 ml tryptonilientä levyyn ja inkuboimalla 2 tuntia. Sitten 3 ml tätä lientä saostetaan 0,6 ml :11a 37 8 4 0 8 0 polyetyleeniglykolia/NaCl-liuosta (25 % PEG ja 2,5 M NaCl) ja säilytetään 1 tunti 4°C:ssa (K.R. Yamamoto et ai. Virology 4^) 734-744 (1970)).

Sitten sentrifugoidaan ja fagit suspendoidaan 0,3 5 ml:aan TEN-puskuria (10 mM Tris. HCl, pH 8, 10 mM

NaCl, 0,5 m M EDTA). Sitten fagit saostetaan 30 yl:lla PEG/NaCl-liuosta, inkuboidaan 1 tunti 4°C:ssa ja sentri-fugoidaan. Fagit suspendoidaan uudelleen 50 yltään TEN-puskuria ja jokaiseen putkeen lisätään 5,5 yl 10 1% SDS. Kun on inkuboitu 10 minuuttia 55°C:ssa, lisätään 200 yl TEN ja liuokset uutetaan fenolilla ja etterillä ja saostetaan etanolilla. Yhdistelmä-f1-fagiin liitetyn DNA:n sekvenssi voidaan määrittää Sangerin menetelmällä (f. Sanger et ai. J.Mol.Biol. U3 161-178 (1 980)) 15 käyttämällä synteettistä oligonukleotidialuketta ("universal primer", jonka sekvenssi on TTGACGGGGAAAG, Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts).

Bal 31:llä uudelleenleikattujen liitännäisten kokoelmasta, jotka on kloonattu f1:ssä, löytyi ainakin yksi 20 fagi, jolle on annettu nimi 293-207-101, ja joka sisältää Hind ΙΙΙ-sidoksenmuodostajan liittyneenä renniinin 5'-päähän nukleotidissa 379 (so. glysiinin kodonissa, joka on kypsän renniinin N-päässä oleva aminohappo).

Fagin 293-207-101 RFI-DNA:ta (5 yg) hajotetaan Hind 25 III:lla (4 yksikköä, N.E. Biolabs) 1 tunti 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa on H-puskuria. Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, DNA liuotetaan uudestaan 20 ylraan vettä ja käsitellään 10 minuuttia 37°C;ssa 10 yksiköllä S1-nukleaasia (Boehringer/ 30 Mannheim) 50 ylrssa reaktioseosta, jossa on S-puskuria (vert. kohta 2 edellä). Tämä DNA uutetaan taas fenolilla ja saostetaan etanolilla. Seuraavaksi synteettiset oligonukleotidisidoksenmuodostajät (sekvenssi CCATCTAGATGG, 5 yg, Collaborative Research, Inc.) 32 35 kinasoidaan a P-ATP:llä käyttämällä 6 yksikköä T^-polynukleotidikinaasia (P-L Biochemicals) 25 yl:ssa

38 8 4 C S O

reaktioseosta, jossa on Y-puskuria. Tämä kinasoitu oligonukleotidi liitetään Hind ΙΙΙ-sidottuun liitännäiseen, joka oli käsitelty S1:llä (kuten edellä on kuvattu) ja puhdistetaan agaroosigeelistä jäädytys-5 sulatusmenetelmällä. Liitäntäreaktioseos sisältää noin 0,8 pmol Hind ΙΙΙ-sidottua S1-käsiteltyä renniini-DNA:ta, 100 pmol kinasoitua synteettistä sidoksen-muodostajaa ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia (N.E.

Biolabs) 20 yl:ssa L-puskuria. Inkubointi kestää 18 10 tuntia 14°C:ssa. Reaktioseos laimennetaan kuusinkertaisesti 100 yl:lla liuosta, joka on 180 mM NaCl, 7 mM MgCl2 ja 5 mM Tris.HCl, pH 8, suhteen. Kun on kuumennettu 5 minuuttia 65°C:ssa, lisätään 45 yksikköä restriktioendonukleaasia xba I (N.E. Biolabs) kolmessa 15 15 yksikön erässä kolmen tunnin ajan kestävässä inku- boinnissa 37°C:ssa. Oligonukleotidimonomeerit erotetaan suuresta DNA:sta suodattamalla Biogel A-5m-pylväässä (0.68 x 36 cm) pylväspyskurissa (ks. edellä).

Poistunut DNA saostetaan etanolilla ja käsitellään 20 t4 DNA-polymeraasilla (P-L Biochemicals, 10 yksikköä) 50 yl:ssa T-puskuria, niin että Xba:lla leikatut päät saadaan tasaisiksi. Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, DNA:ta käsitellään 1 tunti 37°C:ssa Eco RI:llä (N.E. Biolabs, 4 yksikköä) 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa 25 on R-puskuria (100 mM Tris.HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2). Renniinifragmentti (noin 350 emäsparia) voidaan eristää 2 % agaroosigeelistä. Fagin 293-118/37 RFI DNA:ta (5 yl) leikataan Hind 111:11a (N.E. Biolabs, 4 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, 30 jossa on H-puskuria. Kun on uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, DNA pitäisi tehdä tasapäiseksi käsittelemällä 30 minuuttia 37°C:ssa DNA-polymeraasilla (P-L Biochemicals, 10 yksikköä) 50 yl T-puskurissa.

Kun on ensin uutettu fenolilla ja saostettu etanolilla, -3 5 DNA: ta leikataan Eco RI:llä (N.E. Biolabs, 4 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa on 39 84080 R-puskuria. Tämä fagin 293-118/37 DNA-fragmentti, joka ulottuu Eco RIrstä Hind III:een (tasapää), (noin 660 emäsparia) eristetään 2% agaroosigeelistä. Plasmidi DNA:ta (5 yg), joka on saatu plasmidista pGLlOI, 5 leikataan Pvu II:11a (N.E. Biolabs, 4 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 yl:ssa P-puskuria ja sen jälkeen DNA uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. DNA käsitellään vasikan suolen alkalisella fosfa-taasilla (0,1 yksikköä, Boehringer/ Mannheim) 50 ylrssa 10 C-puskuria, uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. Suoritetaan liittämisreaktio 18 tunnissa 14°C:ssa käyttämällä 0,2 pmol sidoksenmuodostajilla varustettua renniini-DNA:ta (nukleotidit 379-731), 0,2 pmol renniini-DNA:ta, joka on saatu fagista 293-118/37 (nukleotidit 15 732-1456) ja 0,2 pmol Pvu II:lla katkaistua pGL101:tä 20 yl:ssa L-puskuria käyttämällä 300 yksikköä DNA-ligaasia (N.E. Biolabs). 5 mikrolitraa reaktioseosta •f + käytetään transformoimaan 100 yl Ca :11a käsiteltyjä CGE4-soluja (vrt. edellä). Kun useita ampisilliinille 20 vastustuskykyisiä pesäkkeitä poimitaan tryptonilevyiItä, joissa on 20 yg/ml ampisilliinia, ja suoritetaan analyysi restriktioendonukleaasien avulla, paljastuu yksi pesäke, jossa on plasmidi pCGE188, joka sisältää renniinisekvenssin oikeassa suunnassa niin, että 25 ilmentyminen tapahtuu laktoosi-operoni-promoottorista lähtien.

Syntetisoituneen renniinin määrä määritetään suorittamalla plasmidin sisältävälle hajotetulle solumassalle radioimmuunimääritys käyttämällä jodi-30 noitua autenttista puhdistettua renniiniä ja anti- renniiniseerumia. Renniinituotteen koko määritetään 35 S-mctioniini1la merkittyjen solu-uutteiden immuno-sakoille elektroforeesi polyakryyliamidigeeleillä, jotka sisältävät SDS:ää.

35 Lisäksi E.colin solu-uutteissa oleva aktiivisen renniinin määrä mitataan käyttämällä modifioitua 84080 40 mikromittakaavan versiota maidonjuoksetuksen standardi-määrityksessä (B. Foltmann Methods in Enzymology J_9 pp 421-436 (1970)).

8b. Metioniinirenniinin A ilmentyminen E.colissa 5 Seuraavaksi kuvatulla tavalla voidaan rakentaa plasmidi, joka sisältää renniini A:n geenin nukleo-tidisekvenssin, jota edeltää alkukodoni ATG, ja joka on lac-operoni-pranoottorin säätelyn alaisena. Rakentaminen vaatii kolmen erillisen plasmidin muodostamisen, 10 jotka yhdistetään vaiheittain niin, että saadaan lopputuote .

Ensimmäinen valmistettavista plasmideista sisältää alkukodonin ATG, joka sijaitsee välittömästi renniini-geenin ensimmäisten 350 nukleotidin edessä. Kaksisäi-15 keistä yhdistelmä-f 1 -f agi-293-1 1 8/37 : n DNA:ta (200 yg) hajotettiin Pst I-restriktioendonukleaasilla (N.E.

Biolabs, 20 yksikköä) 150 minuuttia 37°C:ssa 100 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli P-puskuria. Lisättiin 11 mikro-litraa 100 mM Tris.HCl, pH 7,5, ja 4 yl Eco Rl 20 (Boehringer/Mannheim, 80 yksikköä/yl) ja hajotusta jatkettiin 37°C:ssa vielä 60 minuuttia. Restriktiohajotus keskeytettiin lisäämällä 1/10 tilavuudesta 200 mM EDTA ja restriktio-DNA-fragmentit erotettiin agaroosigeeli-elektroforeesilla 0,6 % agaroosigeelissä, joka sisälsi 25 40 mM Tris. asetaattia, pH 8,3. Geeli värjättiin eti- diumbromidilla (0,5 yg/ml) ja se alue, joka sisälsi halutun 400 emäsparin osan, tehtiin näkyväksi pitkä-aaltoisella ultraviolettivalolla ja leikattiin irti.

DNA erotettiin geelistä jäädytys-sulatusmenetelmällä 30 ja saostettiin etanolilla. DNA liuotettiin uudestaan veteen ja sitä hajotettiin Mspl-restriktoendonukle-aasilla (N.E. Biolabs, 30 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli 10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl.,, 6 mM KC1 ja 1 mM ditiotreitolia.

41 84080 Tässä reaktiossa saatiin fragmentti, joka sisälsi seuraavan sekvenssin 5' C GGC TTC GGG GAG____ CG AAG CCC CTC____5' 5 lähellä renniinigeenin alkua (renniinigeenisekvenssin ensimmäinen kodoni on merkitty viivalla ja se edustaa nukleotideja 379-381 taulukossa 1). Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, tätä fragmenttia ja kahta pientä fragmenttia, jotka oli 10 saatu Mspl-hajotuksella, käsiteltiin E.colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla (Boehringer/ Mannheim, 3 yksikköä) 15 minuuttia 37°C:ssa 42 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli 0,05 mM deoksiadenosiinitri-fosfaattia, 6,6 mM Tris,HCl, pH 7,5 6,6 mM NaCl, 6,6 15 mM MgC^ ja 6,6 mM ditiotreitolia. Tässä reaktiossa poistui kaksi nukleotidia edellä kuvatusta sekvenssistä niin, että syntyi 5'C GGC TTC GGG GAG ....

AAG CCC CTC ____5' 20 Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä, deoksiadeno-siinitrifosfaatti erotettiin molekyylipainoltaan suuremmista osista siten, että lisättiin 0,5 yl 200 mM spermiiniä, inkuboitiin jäällä 15 minuuttia, sentri-fugoitiin 10 minuuttia 4-celsiusasteisessa mikrosentri-25 fugissa ja saatu pelletti sentrifugoitiin kahdesti 5 minuuttia kerrallaan 4°C:ssa 75 % etanolin läsnäollessa. Spermiini poistettiin siten, että pellettiin lisättiin 1 ml liuosta, joka oli 75 % etanolin, 0,3 M natriumasetaatin ja 10 mM magnesiumasetaatin suhteen, 30 inkuboitiin 1 tunti jäällä ja sentrifugoitiin edellä kuvatulla tavalla.

ΠΝΛ:η toinen käsittely E.colin DNA-polymeraasi l:n Klenow-fragmenti1la suoritettiin edellä kuvatulla 42 84080 tavalla siten, että aikaisemmassa reaktiossa käytetty 0,05 mM deoksiadenosiinitrifosfaatti korvattiin 0,05 mM deoksisytidiinitrifosfaatilla. Tällä menettelyllä saatiin fragmentti, jolla oli seuraava sekvenssi 5 5' C GGC TTC GGG GAG ____ CCC CTC ____5' lähellä renniinigeenin alkua. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, DNA liuotettiin veteen ja sitä käsiteltiin S1-nukleaasilla 10 (Boehringer/Mannheim, 100 yksikköä) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli S-puskuria. Tämä entsyymi poisti yksisäikeisen 5'-DNA:n fragmentista ja jäljelle jäi seuraava sekvenssi 5' GGG GAG ____ 15 CCC CTC____5’ Näin ollen renniinisekvenssin alku on DNA-fragmentin 5'-päässä. Synteettistä oligonukleotidia, joka sisälsi

Clal-katkaisukohdan, ja joka päättyi nukleotideihin ATG

(so. CATCGATG, Collaborative Research, Inc,. 5 ug) , 32 20 kinasoitiin a P-ATP:llä käyttämällä T4~polynukleo- tidikinaasia (P-L Biochemicals, 3 yksikköä) 30 minuuttia 37°C:ssa 25 μΐ*. ssa reaktioseosta, jossa oli Y-puskuria. Tämä kinasoitu sidoksenmuodostaja (noin 200 prnol) liitettiin käsiteltyyn DNA-fragmenttiin (noin 5 prnol) 25 inkuboimalla T^-DNA-ligaasin (N.E. Biolabs, 900 yksikköä) kanssa 15°C:ssa yön yli puskurissa L. Reaktio keskeytettiin kuumentamalla 5 minuuttia 65°C:ssa. Lisättiin 4 mikrolitraa 1Ox Clal-puskuria (1 x = 10 mM Tris.HCl, pH 8, 10 mM MgC^) ja 10 ug restriktioendonukleaasia 30 (Clal) Boehringer/Mannheim, 27 yksikköä). Saatua seosta inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa. Neljä mikrolitraa poistettiin analysoitavaksi polyakryyliamidigeelillä ja sen jälkeen lisättiin 1 μΐ 10x Clal-puskuria,

8 4 O S O

10 μΐ Clal-entsyymiä ja 3 yl vettä. Tätä reaktio-seosta inkuboitiin vielä tunti. Käsitelty DNA, joka sisälsi halutut renniinisekvenssit, puhdistettiin erottamalla 2% agaroosigeelissä, joka sisälsi 40 mM 5 Tris-asetaattipuskuria, pH 8,3. DNA tehtiin näkyväksi pitkäaaltoisella ultraviolettivalolla ja poistettiin geelistä edellä kuvatulla jäädytys-sulatusmenetelmällä.

Nyt tämä fragmentti oli valmis liitettäväksi sopivaan vektoriin.

10 Vektori-DNA:n valmistus alkoi hajottamalla 3,3 yg pBR322 DNA:ta 5,4 yksiköllä Clal-endonukleaasia (Boehringer/Mannheim) 1 tunti 37°C:ssa 30 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli Clal-puskuria. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, vektori-15 DNA:ta käsiteltiin 0.06 yksiköllä vasikan suolen alkalista fosfataasia (Boehringer/Mannheim) 15 minuuttia 37°C:ssa C-puskurissa. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, noin 1 pmol vektori-DNA:ta ja noin 2 pmol renniini-DNA-fragmenttia, joka oli 20 valmistettu edellä, sekoitettiin keskenään. Nämä kaksi DNA-palasta liitettiin toisiinsa 29 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli L-puskuria ja T^-DNA-ligaasia (N.E. Biolabs, 450 yksikköä). Transformaatiokelpoiset solut valmistettiin E.coli-kannasta CGE43 (F V(lac-pro)XIII, tunnettu myös 25 kantana LG90) osassa 4 kuvatulla tavalla ja transformoitiin yhteenliitetyllä DNA:11a. Ampisilliinille vastustuskykyiset pesäkkeet poimittiin levyiltä ja plasmidi-DNA analysoitiin restriktioentsyymeillä hajottamalla. On tarpeen analysoida näiden plasmidien 30 sekvenssit, jotta voitaisiin olla varmoja, että oikea rakenne, joka sisältää sidokscnmuodostajasekvenssin, CATCGATG, liittyy rcnni i n i gecn i sekvenssin GGG G AG ....

alkuun. Plasmidia, jossa oli haluttu oikea DNA-sekvenssi, 44 84080 nimitetään pCGE301:ksi, ja sitä käytetään yhdessä niiden kahden muun jäljempänä kuvatun plasmidin kanssa tuottamaan lopullinen plasmidi, joka johtaa metio-niinirenniinin ekspressiota E.colissa.

Tähän rakentamiseen tarvittavista kolmesta plas-midista toisen synnyttämiseksi piti subkloonata se yhdistelmäfagin 293-118/37 kaksisäikeisen DNA:n Hind II-fragmentti, joka sisälsi renniinin. Kolmea mikrogrammaa kaksisäikeistä f1 fagi 293-1 18/37 :n DNA:ta hajotettiin restriktioendonukleaasi11a Hind III (N.E. Biolabs, 3 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 10 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli H-puskuria, ja joka oli 7mM

2-merkaptoetanolin suhteen. Lisättiin 4 mikrolitraa Hind II:ta (N.E. Biolabs, 3 yksikköä) ja seosta inku-13 boitiin 37 C:ssa vielä 1 tunti. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, sekoitettiin noin 1,5 yg tätä DNA:ta noin 1 yg:n kanssa pBR322 DNA:ta (joka oli tätä ennen käsitelty Hind 111:11a ja vasikan suolen alkalisella fosfataa-7 Π silla edellä kuvatulla tavalla). Nämä kaksi DNA- fragmenttia liitettiin yhteen yön aikana 16°C:ssa 20 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli L-puskuria ja DNA-ligaasia (N.E. Biolabs, 600 yksikköä). Viidellä

mikrolitralla tätä seosta transformoitiin E.coli-7 R

kannan CGE6 solut ja ampisilliinille vastustuskykyiset pesäkkeet eristettiin edellä kuvatulla tavalla.

Kun leikattiin restriktioentsyymillä ja suoritettiin agaroosigeelielektroforeesi, ilmeni, että saadussa plamidissa, pDGE302, oli fagin 293-118/37 prorenniini-sekvenssi sijoitettuna pBR322:n Hindlll-kohtaan.

Renniiniä tuottavan plasmidin rakentamisessa tarvittava kolmas komponentti synnytettiin siten, että 2 yg pGLl01:n DNA:ta (L.Guarete, G. Lauer, T.M. Roberts and M. Ptashne, (1980), ks. edellä) käsiteltiin 35 restnktioendonukleaasilla Pvu II (N. E. Biolabs, 5 yksikköä) 1 tunti 37°C:ssa 20 yl:ssa reaktioseosta, « 84080 jossa oli H-puskuria, ja joka oli 10mM 2-merkaptoetanolin suhteen. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, DNA sekoitettiin kinasoidun synteettisen oligonukleotidin (CATCGATG, Collaborative 5 Research, Inc., noin 200 pmol) ja suoritettiin liittäminen DNA-ligaasilla (N.E. Biolabs, 900 yksikköä) yön aikana 16°C:ssa 30 ylrssa reaktioseosta, jossa oli L-puskuria. Reaktio keskeytettiin käsittelemällä 5 minuuttia 65 °C:ssa. Viidellä mikrolitralla tätä seosta 10 transformoitiin CaC^-käsitellyt E.coli-kannan CGE43-solut. Useista transformanteista valmistettiin plasmidi-DNA, joka hajotettiin restriktioentsyymillä ja suoritettiin agaroosigeelielektroforeesi halutun plasmidin, pCGE303, identifioimiseksi, joka on identtinen 15 plasmidin pGL101 kanssa muuten paitsi, että Pvu II-kohta on muunnettu Clal-kohdaksi.

Rakennettaessa lopullinen plasmidi, joka sisältää ATG-renniinisekvenssin lac-operoni-promoterin trans-kriptionaalisessa kontrollissa pitää juuri selostetut 20 kolme plasmidia yhdistää in vitro tavalla, jota selostetaan teoreettisesti seuraavassa.

Plasmidi pCGE301 hajotetaan restriktioentsyymeillä Κρη I ja Hind III ja saadut fragmentit käsitellään vasikan suolen alkalisella fosfataasilla. Plasmidi 25 pCGE302 hajotetaan restriktioendonukleaaseilla Κρη I,

Hind III ja Bgl II. Näissä kahdessa toimenpiteessä saadut fragmentit sekoitetaan keskenään ja liitetään yhteen. Tällä DNA:11a transformoidaan E.coli-kanta CGE43. Ampisilliinille vastustuskykyinen pääplasmidi-30 tuote on pCGE304, jossa on ATG liittyneenä koko renniiniä koodittavaan sekvenssiin.

Sitten plasmidi pCGE303 hajotetaan restrlktio-endonuk1eaaseilla Pst I ja Cla I ja käsitellään vasikan suolen alkalisella fosfataasilla. Myös plasmidi 35 pCGE304 hajotetaan Pst I:llä ja Cla I:llä. Näissä kahdessa toimenpiteessä saadut DNA-fragmentit 46 840£0 sekoitetaan keskenään ja liitetään yhteen ja käytetään CGE43-kannan transformointiin. Transformoiduista soluista johdetuista ampisilliinille vastustuskykyisistä plasmideista analysoitiin koko, suoritettiin hajotus 5 restriktioendonukleaaseilla ja määritettiin DNA-sekvenssit, ja tällöin löydettiin plasmidi pCGE305, joka sisältää ATG-renniinisekvenssin lac-operoni-prcmoottorin transkriptionaalisessa kontrollissa.

Ollessaan läsnä E.colissa tämä plasmidi ohjaa metio-10 niinirenniinin synteesiä.

9. Menetelmä, jolla voidaan saada aikaan pre-prorenniinin, prorenniinin ja renniinin ilmentyminen Saccharomyces cerevisiessa Näiden kolmen lajin eli siis pre-prorenniinin, 15 metioniini-prorenniinin ja metioniini-valiini-renniinin ilmentyminen voidaan saada aikaan S. cerevisiaessa käyttämällä promoottoria ja muita transkriptionaalisia ja translationaalisia kontrollialueita, jotka on saatu S. cerevisiaen urasiili 3-geenistä. Hiivan urasiili 20 3-geeni sijoitettiin plasmidiin(sukkulavektori (shuttle vector), joka voidaan valita hiivaa tai E.colia varten ja pitää yllä näissä), joka oli sellaisessa muodossa, että typistetty β-galaktosidaasi-geeni tai le Z-geeni (5'-päästä puuttuu 22 emäsparia) 25 oli liitettynä ura 3-geenin fragmentin 3'-päähän (3'-päästä puuttuu noin 900 emäsparia). Tämä on II-luokan poisto no. 35, jota on selostettu julkaisussa M. Rose, M.J. Casadaban and D.B. Botstein, Proc. Natl Acad.Sci. USA JQ_ 2460-2464 (1 981 ). Tässä plasmidissa 30 on hiivan β-galaktosidaasiaktiivisuus urasiili 3-geenin kontrollialueiden säätelyn alaisena. Tätä poistoa no. 35 käytetään seuraavalla tavalla, jotta saataisiin aikaan pre-prorenniinin, metioniini-prorenniinin ja metioniini-valiini-renniinin ekspressio S.cerevisiaessa.

47 840S0

Ensinnä suoritetaan urasiili 3;a koodattavan sekvenssin täydellisempi poisto leikkaamalla poiston no. 35 DNA auki restriktioendonukleaasilla BamH i, joka katkaisee ura 3-lac Z-liitoksen. Tämä DNA leika-5 taan vielä nukleaasilla Bal 31 niin, että keskimäärin 200 emäsparia poistuu. Seuraavaksi liitetään päihin synteettiset oligonukleotidisidoksenmuodostajät BamH I (CRI) ja DNA liitetään yhteen niin, että syntyy joukko plasmideja, jotka sisältävät BamH I-kohdan 10 vaihtelevilla etäisyyksillä urasiilikontrollialueesta.

Kun puhdistettu, restriktioentsyvmillä leikattu plasmidi-DNA analysoidaan geelielektroforeesilla, ilmenee plasmidi pCGS210, joka sisältää hyvin vähän ura 3:a koodittavia sekvenssejä. Tämä varmistuu, kun suoritetaan sekvenssin-15 määritys kohdasta BamH I menetelmällä Maxam and Gilbert. Tällaisesta Bal-uudelleenleikatusta kloonatusta plas-midista saatu DNA puhdistetaan. Tämä DNA on merkitty valinnan kannalta sopivasti, nimittäin E.colissa ampisilliinin vastustuskyky ja hiivassa leu 2-pro-20 totropia, ja se sisältää E.coliin ja hiivaan kuuluvat replikoitumisen aloituskohdat, jotka kaikki ovat peräisin plasmidista pRB45 (M. Rose, M.J. Casadaban, D. Botstein, ks. edellä), ja mukana on vielä ura 3-kontrollialue, jossa on alle 50 nukleotidia ura 3:a koodattavaa mate-25 riaalia. Erityisesti yksi näistä plasmideista, josta käytetään nimitystä pCGS210, sisältää vain 10-20 nukleotidia, jotka koodittavat ura 3:a, kun DNA:n sekvenssi analysoidaan menetelmällä Maxam and Gilbert.

Pre-prorenniinin, prorenniinin ja renniinin 5'-30 päätä koodittava DNA saadaan seuraavasti. Pre-prorenniiniä koodittava DNA, jossa on translaation alkukodoni ATG ja alle 20 nukleotidia ATG:n 5'-päässä, saadaan Bal 31:llä uudelleenleikatusta renniini-DNA-f1 fagi-kokoelmasta, jota on kuvattu edellä kohdassa 8, suo-35 rittamalla seulonta restriktioentsyymien ja geeli-elektroforeesin avulla ja määrittämällä sekvenssit 48 84080

Sangerin menetelmällä (F. Sanger et ai. J.Mol.Biol.

143 161-178 (1981)). DNA, joka koodittaa prorenniiniä ja sisältää translaation ATG-alkukodonin, saadaan plasmi-dista pCGE181, jota on kuvattu edellä kohdassa 7.

5 DNA, joka koodittaa renniiniä, ja jossa on translaation ATG-alkukodoni ja GTG-valiinikodoni (fagi 293-207-101), saadaan edellä kohdassa 8a kuvatusta renniini-DNA-f1 fagikokoelmasta, tai DNA, joka koodittaa metioniini-rennii-niä, saadaan plasmidista pCGE304, jota on kuvattu edellä 10 kohdassa 8b.

Jotta kullekin näistä DNA-palasista saataisiin aikaan ilmentyminen hiivassa, voidaan suorittaa seuraavat kokeet. Pre-prorenniiniä met-prorenniiniä, met-val-renniiniä tai met-renniiniä koodittava DNA leikataan ky-15 seisestä fagista tai plasmidista, joita on kuvattu edellä. Pala leikataan edelleen Smal:llä ja haluttua renniini-muotoa koodittava fragmentti puhdistetaan geelielektro-foreesilla. Samoin DNA-pala, joka ulottuu BamHI:stä (tylppä) Sall:een, ja joka koodittaa E.colin 'ZAYA-20 segmenttiä (β-galaktosidaasigeeni, josta puuttuu 22 emäs-paria 5'-päästä, sekä laktoosipermeaasin ja laktoositrans-asetylaasin geenit) eristetään pRB45:stä (M.Rose, M.J. Casadaban and D. Botstein (1981), ks. edellä). Seuraa-vaksi edellä kuvattu plasmidi pCGS210 leikataan ainoasta 25 BamHI-kohdasta ja sitten suoritetaan uudelleenleikkaus pienin välein Bal31-nukleaasilla (esim. käyttämällä samoja olosuhteita kuin L-Guarete, G.Lauer ja M. Ptashne (1980), ks. edellä) niin, että saadaan palanen, joka on menettänyt niin paljon DNA:ta, että kaikki jäljellä olevat ura 3:a 30 koodittavat sekvenssit ovat poistuneet, mutta kontrolli- sekvenssit ovat jäljellä. Tämä DNA leikataan myös Sällillä ja suurin fragmentti puhdistetaan geelillä. Suoritetaan kolmen molekyylin yhteenliittäminen käyttämällä tätä vektorifragmenttia ja pRB45:stä saatua BamHI(tylppä)-Sall-35 palasta ja joko pre-prorenniinin, met-prorenniinin tai 49 840S0 met-val-renniinin DNA:ta, ja puhdistetaan geelillä.

Osa tästä liitäntäreaktioseoksesta käytetään transformoimaan E.coli-kanta CGE4, ja punaiset pesäkkeet poimitaan levyiltä, joissa on MacConkey-laktoosia sekä ampi-5 silliinia. Haluttujen plasmidien rakenne varmistetaan eristämällä ja suorittamalla analyysi restriktioentsyy-meillä. Kun suoritetaan transformaatio hiivakantaan CGY 80 (ks. jäljempänä), valitaan leusiiniprototropian perusteella ja seulotaan sinisen värin perusteella, 10 kun käytetään kasvualustaa, jossa on minimiravinteet plus urasiilia (ylimäärin tai rajoittava määrä) plus leusiinia plus X-gal (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-β-D-galaktosidia, Bachein, Calif.), saadaan plasmideja, jotka ohjaavat tarvittavaa renniini-B-galaktosi-15 daasifuusioproteiinin luentaa urasiilikontrollissa.

Lopuksi halutun plasmidin sisältämä β-galaktosidaasia koodittava osa poistetaan leikkaamalla plasmidi Bglllrlla ja SalL:llä ja puhdistamalla suurin fragmentti geelillä. Tämä palanen liitetään fagin 293-118/37 Bglll-Hind III 20 (joka on muunnettu Sali-kohdaksi synteettisillä oligo- nukleotidisidoksenmuodostajilia, CRI)-fragmenttiin niin, että täydellinen pre-prorenniinin, prorenniinin tai renniinin geeni saadaan regeneroiduksi. Nämä plasmi-dit ohjaavat pre-prorenniinin, met-prorenniinin, 25 met-val-renniinin tai met-renniinin luentaa S. cerevisiae-hiivassa.

10. Prorenniinifuusioproteiinin ilmentyminen hiivassa Plasmidin pRB71 (M. Rose and D. Botstein, jätetty julkaistavaksi), joka muistuttaa edellä kuvattua (ja 30 M. Rose, M.J. Casadaban and D. Botstein, 1981, Proc.

Nat. Acad. Sei. USA 7j} 2460-2464) ura 3:n poistoa no. 35, paitsi, että vain 11 nukleotidia ura 3:a koodittavasta materiaalista säilyy BamHl-kohdan ja laktoosi-operoni-ZYA:n geneettisen materiaalin edellä, helpon saatavuuden 35 vuoksi rakennettiin plasmidi pCGS28, joka sisältää pro- 50 840S0 renniinigeenin liittyneenä ura 3:a koodittavan materiaalin 11 nukleotidiin niin, että S. cerevisiaessa syntetisoituu fuusioproteiini. Tämä fuusioproteiini muodostuu autenttisesta prorenniinimolekyylistä paitsi, 5 että prorenniinin neljä ensimmäistä aminohappoa on korvattu metioniini-seriini-lysiini-alaniinilla. Koska prorenniinin 42 ensimmäisen aminohapon menetys johtaa renniinituotannon aktivoitumiseen, ei näillä neljällä alkuaminohapolla pitäisi olla mitään vaikutusta lopulli-seen renniinituotteeseen. Tämän plasmidin rakentaminen on selostettu yksityiskohtaisesti seuraavassa.

Jotta saavutettaisiin prorenniinin tehokas ilmentyminen hiivassa, käytettiin ura 3-geenin promoottorialuetta. Tämä DNA-sekvenssi on kloonattu ja saatavissa 1^ plasmidissa (M.Rose, M.J. Casadaban and D. Botstein, 1981, Proc.Nat.Acad.Sci. USA 78, 2460-2464). M.Roselta saatu plasmidi pRB71 sisältää ura 3-promoottorialueen ja 11 nukleotidia urasiili 3-geenistä liittyneenä lacZ-geenin fragmenttiin, josta puuttuu ensimmäiset 22 nukleo-20 tidia. Näiden kahden epätäydellisen geenin välinen liitoskohta on restriktioendonukleaasin BamHI tunnistus-kohta. Tämä plasmidi sisältää myös EcoRI A-fragmentin, joka on peräisin hiivan 2 ym-plasmidista, hiivan leu2-geenin ja replikaation alkukohdan sekä ampisilliinin 25 vastustuskykygeenin, joka on peräisin pBR322:sta, vrt. M.Rose et ai. edellä. Näin ollen plasmidi voi kasvaa joko E.colissa tai S.cerevisiaessa, joissa sen läsnäolo voidaan todeta.

Jotta saataisiin aikaan prorenniinifuusioproteiinin 30 ekspressio hiivassa (so. liittyminen ura3-geenin ensimmäisiin 11 nukleotidiin ja ura3-promoottorin säätely), valmistetaan kaksi perusplasmidirakennetta. Ensimmäinen on ura3-prorenniini-lacZ-liitännäinen, joka hiivaan sijoitettuna antaa aktiivisen β-galaktosidaasifuusiopro-35 teiinin, mikä osoittaa, että ura3- promoottori ohjaa haluttujen fuusioituneiden geenien transkriptiota. Toisessa on 51 84080

IacZ-osa korvattu prorenniinin jäännöksellä ja tuloksena on hiivasolut, jotka tuottavat sellaisia prorenniini-molekyylejä, joissa on neljä ura3-geenin spesifioimaa aminohappoa.

5 Ensimmäisen rakentaminen suoritettiin siten, että prorenniinigeenin 5'-pää liitettiin pRB71:n BamHI-kohtaan, jolloin ura3, prorenniini ja IacZ tulivat kaikki samaan translationaaliseen lukukehykseen. Tämä saavutettiin seuraavalla tavalla. Kaksisäikeistä yhdistelmä-f1-10 fagi 293-118/37:n DNA:ta (12 yg), joka sisälsi koko prorenniinigeenin, leikattiin 7 yksiköllä restriktioendo-nukleaasia Smal (N.E. Biolabs) 2 tuntia 37°C:ssa 50 yl.-ssa reaktioseosta, joka oli 20 mM KC1 , 6 mM Tris. HCl, pH 8, 6 mM MgCl2 ja 6 mM 2-merkaptoetanolin suhteen. 15 DNA uutettiin fenolilla ja eetterillä ja saostettiin etanolilla. Seuraavaksi 250 pmol synteettistä BamHI-oligo-nukleotidisidoksenmuodostajaa (CRI, CCGGATCCGG), joka oli fosforyloitu 5'-päästään käyttämällä polynukleo-tidikinaasia kohdassa 7 kuvatulla tavalla, liitettiin 20 BamHI:llä leikattuun fagi-DNA:han yön aikana 14°C:ssa 40 ylrssa reaktioseosta, jossa oli D-puskuria ja 900 yksikköä T^ DNA-ligaasia (N.E. Biolabs). Liittämisen jälkeen reaktioseos laimennettiin viidellä tilavuudella puskuria, joka oli 180 mM NaCl, 7 mM MgC^ ja 5 mM Tris.

25 HCl/ pH 8, suhteen, kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa, jäähdytettiin jäällä ja hajotettiin 3 tuntia lisäämällä 15 yksikköä BamHI-endonukleaasia kerran tunnissa. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, DNA liuotettiin veteen ja suoritettiin elektro-20 foreesi 2% agaroosigeelissä. DNA eluoitiin kaistasta, joka vastasi noin 440 emäsparin BamHI-Smal(BamHI-sidok-senmuodostajilla varustettu)-fragmenttia, suorittamalla jäädytetyn geelipalan maserointi ja ottamalla neste talteen (jäädytys-sulatusmenetelmä). DNA-fragmentti saos-35 tettiin etanolilla ja liuotettiin 6 yl:aan vettä.

Noin 5 yg plasmidin pRB71 DNA:ta hajotettiin 20 yksiköllä 52 84 080

BamHI-endonukleaasia (N.E. Biolabs) 2 tuntia 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi X-puskuria, ja joka oli 6 mM 2-merkaptoetanolin suhteen. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etano-5 lilla, DNA liuotettiin 20 yl:aan vettä ja käsiteltiin 0,1 yksiköllä vasikan suolen alkalista fosfa-taasia (Boehringer/Mannheim) 30 minuuttia 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli C-puskuria.

Fenolilla uutettu ja etanolilla saostettu DNA liuo-10 tettiin 6 yl:aan vettä ja lisättiin liitosreaktio-seokseen, jossa oli 6 yl BamHI-Smal(BamHI-sidoksen-muodostajilla varustettu)-fragmenttia, ja liittäminen suoritettiin 600 yksiköllä T4 DNA-ligaasia (N.E.

Biolabs) yön aikana 14°C:ssa 20 ylrssa L-puskuria.

15 E.coli-kannan CGE6 solut transformoitiin liitännäis- DNAilla ja ampisilliinille vastustuskykyiset transformant it poimittiin edellä kuvatulla tavalla. Noin 200 transformanttia testattiin pesäkehybridisointimene-telmällä (M. Grunstein adn D.S. Hogness, 1975, Proc.Nat.

20 Acad.Sci.USA ^72,3961-3965) käyttämällä koettimena 32 a P-merkittyä yhdistelmätagi 293-207 DNA:ta, jolle oli suoritettu pykälätranslaatio. Tämän kriteerin perusteella lähes 20 % transformanteista sisälsi renniini-sekvenssejä. Kymmenestä transformantista valmistettiin 25 plasmidi-DNA ja liitännäisen suunta määritettiin frag-menttisarjasta, joka oli saatu Pstl-endonukleaasilla hajottamalla. Yhdellä plasmidilla, pCGS16, joka sisälsi prorenniinifragmentin oikeassa suunnassa, transformoitiin S.cerevisiae-kanta CGY80 (MATa, leu2-3, leu2-112, 30 his3, trpl-289, ura3-52) käyttämällä menetelmää A. Hinnen, J.B. Hicks and G. Fink (1978), Proc. Nat.Acad.Sci.USA 75, 1929-1933. Hiivatransformantit, jotka kykenivät leu2-geenin ansiosta kasvamaan ilman lisättyä leusiinia, viirutcttiin minimikasvualustalevyille, joissa oli 53 840 80 väriäsynnyttävää X-gal-substraattia (tarkalleen samaa kuin edellämainitussa julkaisussa M.Rose et ai.) ja lisäksi urasiilia, tryptofaania ja histidiiniä. Kaikki tutkitut transformantit tuottivat sinisiä pesäkkeitä minimaali-5 sessa X-gal-kasvualustassa ja tämä osoitti β-galaktosi-daasin tuotantoa. Tämä merkitsee sitä, että ura3-prorenniini-lacZ-fuusioproteiinia valmistuu, ja että kunkin kolmen proteiinin translationaalinen lukukehys on sama.

10 Tämän tuloksen perusteella oli oletettavissa, että samanlainen plasmidi voisi ohjata ura3-prorenniini-fuusioproteiinin ekspressiota, jos (3-galaktosidaasi-sekvenssit korvataan prorenniinigeenin loppuosalla.

Näin ollen 8 yg plasmidia pCGS16 hajotettiin 5 yksiköllä 15 restriktioendonukleaasia Bglll (N.E. Biolabs) 1 tunti 37°C:ssa 80 yl:ssa P-puskuria. Sitten reaktioseokseen lisättiin 10 yl 1M NaCl ja 6 yl vettä ja DNA:ta hajotettiin vielä 1 tunti 37°C:ssa endonukleaasilla Sali.

Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu 20 etanolilla, DNA:ta käsiteltiin 0,06 yksiköllä vasikan suolen alkalista fosfataasia (Boehringer/Mannheim) 15 minuuttia 37°C:ssa 50 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli C-puskuria. Reaktio katkaistiin uuttamalla DNA fenolilla ja saostamalla se etanolilla.

25 Tällä välin noin 15 yg yhdistelmäfagin 293- 118/37 kaksisäikeistä DNA:ta leikattiin 12 yksiköllä Hind III:a (N.E. Biolabs) 2 tuntia 37°C:ssa 100 yl:ssa H-puskuria. Kun oli uutettu fenolilla ja eetterillä ja saostettu etanolilla, DNA (6 yg) tehtiin tasapäiseksi 30 käsittelemällä 10 yksiköllä E.colin DNA-polymeraasia (Boehringer/Mannheim) 10 minuuttia 10°C:ssa 40 yl:ssa D-puskuria. Seuraavaksi lisättiin 250 pmol synteettisttä Sall-oligonukleotidisidoksenmuodostajaa (CRT, GGTCGACC), joka oli fosforyloitu käyttämällä T^ polynukleotidi-35 kinaasia edellä kuvatulla tavalla, ja samalla lisättiin

54 8 4 O SO

riittävästi puskuria, jotta kaikkien aineosien väkevyys pysyi vakiona. Sidoksenmuodostajät liitettiin DNA:hän inku-boimalla 900 yksikön kanssa DNA-ligaasia 8N.E. Biolabs) yön yli 14°C:ssa. Lisättiin viisi tilavuutta puskuria,

5 joka oli 10 mM Tris.HCl, pH 8, 10 mM MgC^ ja 180 mM

NaCl suhteen, liuosta kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa, jäähdytetttiin jäällä ja inkuboitiin vielä 5 tuntia 37°C:ssa lisäämällä 20 yksikköä restriktioendonukleaasia Sali (N.E. Biolabs) kerran tunnissa. Kun DNA oli uutettu fenolilla ja 10 eetterillä ja saostettu etanolilla, se liuotettiin 20 yl:aan vettä ja hajotettiin 5 yksiköllä BglII:ta (N.E.Biolabs) 1 tunti 37°C.ssa 30 μΐ tilavuudessa, joka sisälsi P-pusku-ria. Reaktio keskeytettiin lisäämällä 1/10 tilavuutta 200 mM EDTA ja seos siirretiin 2% agaroosigeeliin. Kaista, 15 joka vastasi noin 1000 emäsparin Bglll-Hind III (sall-sidoksenmuodostajilla varustettu)-fragmenttia leikattiin ja DNA otettiin talteen edellä kuvatulla jäädytys-sulatusmenetelmällä.

Etanolilla saostettu pCGS16-DNA, joka oli leikatttu 20 restriktioendonukleaaseilla Bglll ja Sali, liuotettiin 13 ylraan vettä ja mukaan liuotettiin myös geelipuhdis-tettu 293-118/37 Bglll-Hind II (Sall-sidoksenmuodosta-jilla varustettu) fragmentti Bglll-Hind II (Sall-sidoksenmuodostajilla varustettu) fragmentti ja nämä kaksi 25 palaa liitettiin yhteen 20 yl:ssa reaktioseosta, jossa oli L-puskuria ja 600 yksikköä DNA-ligaasia (N.E. Biolabs). Kannan CGE6 solut, jotka oli käsitelty CaC^tlla, transformoitiin liitännäis-DNA:11a edellä kuvatulla tavalla. Plasmidi-DNA puhdistettiin viidestä erilaisesta 30 ampisilliinille vastustuskykyisestä transformantista ja suoritettiin hajotus BamHI.-llä tai Pstlrllä plus Sällillä. Kaistojen asemat 2% agaroosigeelissä osoittivat, että koko prorenniinisekvenssi on läsnä plasmidissa pCGS23.

Näin ollen hiivakanta CGY80 transformoitiin plasmidi-35 DNA:11a menetelmällä A.Hinnen, J.B. Joels amd G. Fink (1978, ks. edellä) ja leusiiniprototrofit valittiin.

84080

Yhtä tällaista transformanttia, CGY116, kasvatettiin eksponentiaaliseen vaiheeseen minimaalikasvualustassa, joka sisälsi tarvittavia lisäaminohappoja, ja merkittiin 35 100 uCi:llä S-L-metioniiniä puolen sukupolven ajan 30°C:ssa ja solut hajotettiin pyörittämällä lasipallojen 5 kanssa (250-300 μπι) 3 minuuttia. Uute kirkastettiin sentri-fugoimalla ja immunosaostettiin renniiniantiseerumilla. Immunosakka liuotettiin SDS-näytepuskuriin ja sille suoritettiin elektroforeesi 10% polyakryyliamidigeelissä, joka sisälsi 0,1 % SDS, menetelmällä U.K. Laemmli and M. Favre 10 (ks. edell.). Autoradiografia osoitti, että kanta CGY116 kantaa plasmidia pCGS28 ja ohjaa sellaisen proteiinin synteesiä, joka reagoi renniinin antiseerumin kanssa ja vastaa kooltaan prorenniiniä. Lisäksi immunosaostuksessa läsnäoleva merkitsemättömän renniinin ylimäärä eliminoi 15 radioaktiivisen kaistan, joka muuten on läsnä prorenniinin asemassa. Näin ollen S. cerevisiao-kanta CCY116 tuottaa vasikan prorenniiniä, joka on liittyneenä neljään hiivan ura3-geenistä johtuvaan aminohappoon, jotka ovat prorenniinin ensimmäisten neljän aminohapon tilalla. Jos ura3-prorenniinifuusioproteiini aktivoidaan tavallisilla 20 menetelmillä (B. Foltman, Methods in Enzymology 1_9 421-436, 1970), pitäisi syntyä aktiivinen renniini, joka on identtinen autenttisen vasikanrenniini A:n kanssa, koska "pro"-zymogeenipeptidi (mukaanlukien tässä tapauksessa neljä "vierasta" aminohappoa) lohkeaa pois akti-25 voinnissa. Kanta CGY 116, joka sisältää plasmidin pCGS28, on taltioitu American Type Culture Collection (ATCC)-kokoelmiin, joissa sille on annettu numero 20623.

Kanta CGY116 on S. cerevisiae-kanta CGY80 (MAT, leu2-3, leu2-112, ura3-52, his3V, trp1-289, sisältäen 30 plasmidin pCGS28, joka määritellään seuraavasti, ks.

taulukkoa 7 jäljempänä). Plasmidi sisältää suurimman osan plasmidista pBR322 (J.G. Sutcliffe (1979) Cold Spring Harbor Symposium 4J, 77-90), hiivan 2 ym-plasmidin 56 84080

Eco Rl, A-fragmentin (J.L. Hartely and J.E. Donelson (1980) Nature 286, 860-865), hiivan kromosomaalisen DNA:n Sal I - Xho I-fragmentin, jossa on leu 2-geeni (A.Hinnen, J. Hicks and G.R. Fink (1978) Proc.Nat.

5 Acad.Sci. USA, 7j), 1 929-1 933), hiivan koromosomaalisen DNA-fragmentin, jossa on ura3-geenin osa (HI:stä kohtaan 11 nukleotidia 3' ja edelleen kohtaan, josta luenta alkaa kuten pRB71:ssä) sekä prorenniini A:n geenin, joka ulottuu nukleotidissa no. 267 olevasta 10 BamHI-kohdasta geenin loppuun.

TAULUKKO 7 ura 3 ΘΗΙ o 1η· Λ 1

Sal I

Palatkaamme jälleen taulukkoon 1, jossa esitetty prorenniini A:n nukleotidi- ja aminohapposekvenssi edustaa useiden tämän keksinnön sisältämien materiaalien nukleotidisekvenssejä. Nämä materiaalit voidaan leikata 15 esitetystä nukleotidisekvenssistä tavallisilla menetelmillä. Samoin voidaan pre-prorenniini A-muoto muuttaa prorenniini B-muodoksi sijoittamalla asemaan no. 290 57 84080 glysiinitähde tässä olevan aspartaattitähteen paikalle. Hyödyllisiä taulukon 1 mukaisia pre-prorenniini A:sta johdettuja tuotteita, jotka on saatu tämän keksinnön sisältämällä menetelmällä, ovat mm. seuraavat nukleo-5 tidisekvenssit, jotka muodostavat osan yhdistelmä-DNA-materiaalista: 1. Renniinin aktiivisuuden omaavan polypeptidin geneettinen koodi, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1 numerosta 379 numeroon 1350, 10 ja joka toistetaan seuraavassa: 58 84080

GOG GAG GTC GGC AGC GTC COC CTG AOC AAC TAC CTG CAT ACT CAG TiC ΠΤ GGG AAG ATC OX GUI \IlL ALA SR \AL WO LEU THR ASM TYR LEU ASP EER GLM TYR PHE GLY LYS ZLE

TAC CTC GGG AOC COG COC CAC GAG TOC AOC GTG CTG TTT GAC ACT GOC TCC TCT GAC TIC ΤΛ LEU GLY THR WO WO GLN GLU WE THR UAL LEU WE ASP T« GLY EER EER ASP WE

5 TOG GTA COC TCT ATC TAC TOC AAG AGC AAT GOC TOC AAA AAC CAC CAS CSC TIC GAC COG WP \RL WO SR HE TYR CYS LYS EER ASN ALA CYS LYS A5N HIS GLM ARC WE ASP WO

AGA AAG TCC TOC AOC TTC CAG AAC CTG GGC AAG COC CTG TCT ATC CMC TAC GOG ACA GOC ARG LYS SR EER THR WE GUI ASN LEU GLY LYS WO LEU SER ILE HZS TYR GLY THR GLY

1Q AGC ATC CAG GOC ATC CTG GGC TAT GAC AOC GTC ACT CTC TOC AAC ATT GTG GAC ATC CAG

SER ST GLN GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR UAL THR UAL SER ASN ZLE UAL ASP ZLE GLN

CAG ACA GTA GGC CTC AGC AOC CAG GAG COC GGG GAC GTC TTC AOC TAT GOC GAA TTC GAC GLM THR \AL O.Y IEU SER THR GLN Oil WO GLY ASP UAL WE THR TYR ALA GLU WE AS» GOG ATC CTG GGG ATC GOC TAC COC TOG CTC GOC TCA GAG TAC TOG ATA COC GTC ΤΓΤ GAC ax zle ieu ax ter ala tyr wo eer leu ala eer glu tyr eer zle wo wl we asp

1 5 AAC ATC ATC AAC AGG CAC CTG GTG GOC CAA GAC CTG TTC TOG GIT TAC ATC GAC AQG AAT

Aai lET ST ASN ARG HIS LEU UAL ALA GLN ASP IEU THE EER UAL TYR MET ASP ARG ASN

GGC CAG GAG AGC ATC CTC ACG CTC GGG GOC ATC GAC COG TCC TAC TAC ACA GGG TOC CTC GLY GLN GLU SER MET IEU THR IEU GLY ALA ZLE ASP WO SER TYR TYR THR GLY SER IEU

?n CAC TOG GTG COC GTG ACA GTC CAG CAC TAC TOG CAG TTC ACT GTG GAC ACT GTC AOC ATC

HIS WP URL WO UAL THR \AL GLN GLN TYR TRP GLN WE THR UAL ASP SER MU· THR ZLE

AGC GGT GTG GIT GTG GOC TCT GAG GOT GOC TOT CAG GOC ATC CTG GfC ACG GGC AOC TOC SR GLY UAL UAL URL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GLN ALA HE IEU ASP THR GLY THR SER

AAG CTG GTC GGG COC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GOC ATT GGA GGC ACA CAG LYS IEU URL GLY PRO SR SER ASP ILE IEU ASN ILE GLN GLN ALA HE GLY ALA THR GLN

25 AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TOC GAC AAC CTC AGC TAC ATC COC ACT GTG GTC

AS GLN TYR ASP GLU WE ASP HE ASP CYS ASP ASN LEU SR TYR ST PRO THR URL URL

TIT GAG ATC AAT GGC AAA ATC TAC CO CTC AOC CCC TCC GOC TAT AOC AOC CAG GAC CAG WE GLU ZLE ASN GLY LYS ST TYR WO IEU THR PRO SER ALA TYR THR SER GLN ASP OLM

GGC TTC TGT AOC AGT GGC TIC CAG ACT GAA AAT CAT TOC CAG AAA TOG ATC CTG GGG GAT JU ΟΛ PHE CYS THR SR GLY PHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS WP ILE IEU GLY ASP

GW TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC ΤΠ GAC AGG GOC AAC AAC CTC GIG GGG CTG GOC «L WE HE AFG GLU TYR TYR SEE URL PHE ASP ARG ALA ASN ASN IEU URL GLY LEU ALA

AAA GOC ATC TGA LYS ALA ILE

59 84060 2. Pre-prorenniinin aktiivisuuden omaavan polypeptidin geneettinen koodi, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1 numerosta 205 numeroon 1350, ja joka toistetaan seuraavassa

5 ATS AOG TGT CTC GTG GTC CIX CTT OCT GTC TIC OCT CTC TCC CAG GGC

»ET AFG CYS IEU VAL VAL IEU IEU ALA MU, FHE ALA IEU SER GLN GLY

GOT GAG ATC AOC AOG ATC CCT CIG TAC AAA GGC AAS TCT CTC AOG AAG GOG CTG AAG GAG CAT

ALA GUI ILE THR AFG ILE FRO IEU TYR LYS GLY LYS SER IEU AFG LYS ALA IEU LYS GLU BIS

GGS CTT CTC GAG GAC TTC CTC CAG AAA CAG CAG TAT GOC ATC AOC AOC AAG TAC TCC GGC TTC

IU α,Υ IEU IEU au ASP FHE IEU GLN LYS GLN GLN TYR GLY ILE EER SER Lffi TYR SER O.Y FHE

GGG GAG GTC GOC AGC GTC COC CTC AOC AAC TAC CTC GAT ACT CAG TAC ITT GGG AAG ATC

GLY GLU VAL ALA SER VAL ERO LEU THR ASM TYR IEU ASP £ER GLN TYR FHE GLY LYS ΠΕ

TAC CTC GGG ACC COG COC CAG GAG TTC AOC GTC CTC TTT GAC ACT GGC TCC TCT GAC TTC

TYR IEU GLY THR FRO FRO GLN GLU FHE THR MU, IEU FHE ASP T» GLY SER SER ASP FHE

15 TGS GTA COC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AKT GOC TGC AAA AAC CMC CMS COC TTC GAC CCG

TFP VAL FRO SER ILE TYR CYS LYS SER ASN ALA CYS LYS ASN HIS GLN AFG FHE ASP HO

AGA AAG TOG TCC AOC TTC CAG AAC CTC GGC AMS COC CTC TCT ATC CAC TAC GGG ACA GGC

AFG LYS SR SER THR FHE GLN ASN LEU GLY LYS H» IEU SER ILE HIS TYR GLY THR GLY

AGC ATC CAG GGC ATC CTG GGC TAT GAC AOC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTC GAC ATC CAG

20 SER »ET ON GLY ILE IEU GLY TYR ASP THR MU, THR VAL EER ASN ILE VAL ASP ILE CLN

CAG ACA GTA GGC CTC AGC AOC CAG GAG COC GGG GAC GTC TTC AOC TAT GOC GAA TTC GAC

ON THR VAL GLY IEU SER THR GLN GLU FRO GLY ASP MU, FHE THR TYR ALA Oi) FHE ASP

GGG ATC CTG GGG ATC GOC TAC COC TOG CTC GOC TCA GAG TAC TCG ΑΊΑ COC GTC TTT GAC

GLY ILE IEU GLY »ET ALA TYR FRO SER IEU ALA SR GLU TYR EER ILE FRO MU, FHE ASP

25 AAC ATC ATS AAC AGC CAC CTG GIG GOC CAA GAC CTG TTC TOG GIT TAC ATC GAC AOG ΑΛΤ

ASN »ET »ET ASN AFG HIS LEU VAL ALA GLN ASP IEU FHE SER VAL TYR »ET ASP AFG ASN

GGC CAG GAG AGC ATS CTC AOG CTC GGG GOC ATC GAC COG TCC TAC TAC ACA GGG TCC CTG

GLY GLN GLU SR »ET LEU THR LEU O.Y ALA ILE ASP FRO SER TYR TYR THR GLY SER IEU

on CAC TQG GTC COC GTC ACA GTC CAG CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTC GAC AGT GTC AOC ATC

HIS THP VAL IRO VAL THR VAL GLN GLN TYR TRP GLN FHE THV VAL AS> SER MU, TW ILE

AGC GOT GTC GTT GTC GOC TCT GAG GGT GGC TGT CAS GOC ATC CTC GAC AOG GGC AOC TOC

SR GLY WL MU, \AL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GLN ALA ILE IEU ASP THR GLY TW SER

AAG CTC GTC GGG COC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GOC ATT GGA GOC ACA CAG

LYS IEU VAL GLY IRO SER SR ASP ILE LEU ASN ILE GLN GLN ALA ILE GLY ALA THR GLN

84080 60

AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TOC GAC AAC CTG AGC TAC ATC OOC ACT GTG GTC AS) GUI TYR ASP GLU SUE AS» IS AS* CYS ASP ASN LEU SER TYR MCT BRO TM ML WL

TTO GAG ATC AKT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CGC TCC GOC TAX ACC M3C CMS GAC CAG ME GLU IS ASN GLY LYS IET TYR MO IEU THR MO SER ALA TYR THR £ER GLN ASP GLN

5 2? ΞΞ 2? A0C AGT β® TTC CAG ACT GAA AAT CAT TOC CAG AAA TOG ATC CTG GOG GAT

GLY ME CYS THR SR GLY PHE GLN SER GLU ASN HIS SR GLN LYS TOP ILE SU GLY ASP

^ 0X5 TAT TAC AQC GTC TTT GAC AGG GCC AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC WL PHE ILE ATG GLU TYR TYR SER VAL PHE ASP ARG ALA ASN ASN LEU UAL GLY LEU ALA

10 AAA GCC ATC TGA

LYS ALA ILE

3. Prorenniinin aktiivisuuden omaavan polypeptidin geneettinen koodi, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 1 numerosta 253 numeroon 1350, ja 15 joka toistetaan seuraavassa.

GCT GAG ATC AOC AOG ATC CCT CTC TAC AAA GQC AAG TCT CTC AOG AAG GOG CTG AAG GAG CAT ALA GLU HE THR ARG HE MO I£U TYR LYS GLY LYS SER IEU ARG LYS ALA IEU LYS GLU HIS

GGG CTT CTG GAG GAC TTC CTC CAG AAA CMS CAG TAT GGC ATC AGC AGC AAG TAC TCC GGC TTC GLY IEU IEU GLU ASP PHE IEU GLN LYS GLN GLN TYR GLY ILE SR SR LYS TYR SR GLY PHE

20

GGG GAG GTG GOC AGC GTC COC CTG AOC AAC TAC CTG GAT ACT CAG TAC TTT GGG AAG ATC (3Λ GLU UAL ALA SER UAL MO IEU THR ASN TYR IEU ASP SR GLN TYR PHE GLY LYS ILE

TAC CTC GGG AOC COG COC CAG GAG TTC AOC GTC CTC TTT GAC ACT GGC TCC TCT GAC TTC TYR IEU GLY TM MO MO GLN GLU PHE THR ML IEU PHE ASP TM GLY SR SER ASP PHE

TGG GTA COC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAX GOC TOC AAA AAC CMC CAG CGC TTC GAC CCG 25 TOP ML MO SR ILE TYR CYS LYS SER ASN ALA CYS LYS ASN HIS GLN ARG PHE ASP PRO

AGA AAG TOG TCC AGC TTC CAG AAC CTG GGC AAG COC CTC TCT ATC CMC TAC GGG MCA GQC ARG LYS SR SR TM ME GLN ASN IEU GLY LYS MO IEU SER ILE HIS TYR GLY TM GLY

AOC ATC CAG GGC ATC CTG GQC TAT GAC AOC GTC ACT GTC TOC AAC ATT GTC GAC ATC CAG SER ST GLN GLY ILE SU GLY TYR ASP TM ML TM ML SER ASN ILE ML ASP HE GLN

30 CAG ACA GTA GGC CTC AGC AOC CAG GM* COC GGG GAC GTC TTC AOC TAX GOC GAA TTC GAC GUI TM ML GLY SU SR TM GLN GLU MO GLY ASP ML PHE TM TYR ALA GLU ME ASP

GOG ATC CTG GGG ATC GOC TAC COC TOG CTC GOC TCA GAG TAC TOG ATA COC GTG TTT GAC GLY IS LEU GLY ST ALA TYR PRO SR SU ALA SER GLU TYR SER IS PRO ML PHE ASP

OC AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTC GOC CAA GAC CTC TTC TOG GTT TAC ATC GAC AOG AAT ASN ST MET ASN ARG HIS SU ML ALA,GLN ASP SU PHE SER ML TYR ST ASP ARG ASN

GGC CAG GAG AGC ATC CTC AOG CTC GGG GOC ATC GM: COG TCC TAC TAC ACA GQG TCC CTC GLY GLN GLU SER ST SU TM SU GLY ALA IS ASP PRO SER TYR TYR TM GLY SER SU

61 84080

CAC TOG GTG COC GTS ACA GTG CM* CM* TAC TOG CAG TTC ACT GTG GM?ACT GIC ACC ATC HIS TUP \AL FRO VAL THR VAL GLN GUI TYR TIP GLN PHE THR VAL ASP £ER VAX. THR ILE

AOC GOT GTG GTT GTG GCC TOT GAG GOT GGC TOT CAG GCC ATC CTG GfC AOG GGC ACC ICC BER O.Y VAL VAL VAL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GLN ALA ILE LEU ASP THR GLY THR EER

5 AM* CTG GTC GGG COC AGC AQC GAC ATC CIC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GOC ACA CAG

LYS LEU VAL GLY HtO SER SER ASP ILE IEU ASN ILE GLN BJ) ALA ILE GLY ALA THR GLN

AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TGC GAC AAC CTG AGC TAC ATG COC ACT GTG GTC ASN GLN TYR ASP GLU FHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU SER TYR t£T SUO THR VAL VAL

ITT GAG ATC AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC COC TOC GOC TAT ACC AGC CAG GAC CAG 10 SHE <2iU Π£ ASM GLY LYS HST TYR BIO I£U THR FRO SER ALA TYR THR SER GUI ASP GLM

GGC TIC TGT AOC AGT GGC TTC CAG ACT GAA AAT CAT TOC CAG AAA TOG ATC CTG GGG GAT GLY FEE CYS THR SR GLY FHE GUI CER GLU ASN HIS SR GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP

GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GOC AAC AAC CTC GTS GGG CTG GOC VAL FHE ILE ARG GLU TYR TYR SR VAL FHE ASP ARG ALA ASN ASN IEU VAL GLY LEU ALA

15 AAA GOC ATC TGA

LYS ALA ILE

4. Pre-prorenniinisignaalisekvenssi, joka koodittaa 16 aminohappoa, ja joka sisältää ATG-alkukodonin, muodostuu nukleotideistä 205-252 taulukossa 1. Tämä 20 sekvenssi ohjaa pre-prorenniinin erittymistä niistä mahasoluista, jotka syntetisoivat sitä, ja näin ollen sen uskotaan olevan hyödyllinen kiinnittyneinä muihin kloonattuihin geeneihin ohjaamassa niiden proteiinituotteiden erittymistä isäntäsoluista periplasmiseen 25 tilaan tai viljelyväliaineeseen. Lisäksi nämä ylimääräisen nukleotidit, joita ei tarvita renniiniaktiivi-suuden kannalta, voivat aminohapoiksi muunnettuina stabiloida entsyymiä proteolyyttisen hajoamisen suhteen vielä solunsisässäolon aikana. Tällä seikalla saattaa 30 olla yleistä hyötyä, kun kloonattujen geenien tuotteita halutaan stabiloida erilaisissa isäntäsoluissa tai varastoinnin aikana.

5. Taulukossa 1 edustavat numerot 253-378 "pro"-eli zymogeeninukleotidisekvenssiä, ja tämä 126 nukleo- 35 tidin muodostama sekvenssi koodittaa 42 aminohappoa, jotka muodostavat prorenniinimolekyyIin zymogeeniosan.

62 84080 Tämä sekvenssi muodostaa renniinin inaktiivisen zymo-geenin, jonka poistamisen jälkeen saadaan aktiivinen renniini. Inaktiivisella zymogeenilla voi olla pitkä varastointiaika. Se saattaa myös stabiloida renniini-5 molekyylin ja näin ollen siitä voi olla myös yleistä hyötyä muiden kloonattujen geenien tuotteiden stabiloinnissa.

Tässä selostuksessa käytetty termi "yhdistelmä-DNA-materiaalista johdettu genettinen materiaali" 10 tarkoittaa isäntäsolujen geneettistä materiaalia, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA:11a ja kloonattu niin, että saadaan soluja, jotka sisältävät halutun tuotteen geneettisen informaation. Yhdistelmä-DNA-mate-riaalia käytetään tavallisessa merkityksessä tarkoitta-15 maan sellaista DNA:ta, joka on johdettu kahdesta tai useammasta lähteestä ja liitetty tai pujotettu yhteen yhdeksi molekyyliksi, mutta tällä tarkoitetaan myös syntetisoitua DNA:ta, joka on saatu esim. kemiallisella synteesillä. On selvää, että yhdistelymenetelmillä, 20 joita käytetään alkuperäisen yhdistelmä-DNA-materiaalin eristämiseen ja valmistamiseen, voidaan tuottaa isäntä-soluja, jotka sitten kloonataan ja kasvatetaan tarvitsematta käyttää geneettisiä yhdistelymenetelmiä uudelleen. Tällaisessa tapauksessa katsotaan kloonatut solut joh-25 detuiksi sellaisista soluista, jotka alunperin käsiteltiin yhdistelmä-DNA-menetelmillä, ja niiden katsotaan sisältävän sen geneettisen materiaalin, joka johdettiin yhdistelmä-DNA-materiaalista.

Kuten edellä selostettiin, muodostetaan yhdistelmä-30 DNA-molekyylejä, jotka sisältävät geenejä, jotka koodattavat vähintään yhtä polypeptidiä, jolla on maitoa juoksettava vaikutus, tai josta voidaan valmistaa tällaisia polypeptidejä.

Vaikka kuvassa 1 onkin esitetty spesifiset prorenniini-, 35 pre-prorenniini- ja renniinigeenit, on selvää, että 63 84080 tässä selostuksessa käytetyt termit tarkoittavat myös näiden funktionaalisia ekvivalentteja/ joissa on mahdollisia muutoksia nukleotidi- tai aminohapposekvensseissä, mutta nämä muutokset eivät oleellisesti vaikuta lopulli-5 sen renniinituotteen maidonjuoksetuskykyyn tai katalyyttiseen aktiivisuuteen. Niinpä renniinissä, pre-prorennii-nissä ja prorenniinissä käytetty laaja termi "renniini" tarkoittaa mitä tahansa aminohapposekvenssiä, joka juoksettaa nisäkkään maitoa, kuten naudanmaitoa tai 10 vuohenmaitoa, ja näinollen se voi sisältää valittuja renniinifragmentteja, joiden sekvenssejä tunnetaan ennestään. Renniiniin, pre-prorenniiniin ja prorenniiniin voi olla liittyneinä ei-toiminnallisia aminohapposekvenssejä, jotka voidaan poistaa tavallisilla menetelmillä 15 polypeptidin halutun aktiivisuuden kohottamiseksi.

Kuten edellä mainittiin, vasikan renniini esiintyy kahdessa rinnakkaisessa muodossa, A ja B, jotka eroavat toisistaan aminohapposekvenssin kohdassa 290 ja mahdollisesti myös kohdassa 204. Vaikka tässä onkin selostettu 20 A-muodon geenin kloonaus ja ekspressio, voidaan B-rennii-nin geeni saada helposti aikaan A-muodon geenistä yksinkertaisilla menetelmillä, joita selostetaan pääpiirteissään seuraavassa. B-renniinin ilmentyminen voidaan saavuttaa aivan samoin, kuin tässä on kuvattu A-muodon 25 kohdalla. B-renniinin geenin aikaansaamiseksi voidaan syntetisoida kemiallisesti oligonukleotideja, jotka kattavat muutettavat alueet ja sisältävät halutut muutokset. Esimerkiksi kaksi 20-meeristä oligonukleo-tidia, joista toisen sekvenssi on identtinen nukleoti-30 dien 847-866 (taulukko 1) kanssa paitsi, että nukleotidi 856 on vaihdettu A:sta G:ksi, ja toisen sekvenssi on identtinen nukleotidien 1099-1118 (taulukko 1) kanssa paitsi, että nukleotidi 1109 on vaihdettu A:sta G:ksi, voidaan syntetisoida ja käyttää käynnistämään toisen DNA-35 säikeen synteesi f1 fagi 293-118/37:n kaksisäikeisestä 64 84080 DNA:sta, joka oli pykälöity satunnaisesti ja muunnettu yksinkertaisiksi säikeiksi endonukleaasi 111:11a menetelmällä R.B.Wallace et ai, Science (1980) 209 1396— 1400. Saatu kaksisäikeinen renkaanmuotoinen DNA voidaan 5 liittää yhteen DNA-polymeraasilla ja käyttää sopivan E. coli-kannan transformointiin. Näin saadaan fagiseos, jossa jotkut sisältävät A-renniinin geenin, jotkut modifioidun A-renniinin geenin, jossa on yksi tai molemmat muutokset. Kun haluttujen restriktiofragmenttien 10 DNA-sekvenssit määritetään, voidaan valita halutut muutokset sisältävät fagit, ja täydellinen B-renniini-geeni voidaan saada aikaan pujottamalla osat yhteen halutussa restriktiokohdassa. Jos A-renniini halutaan muuntaa B-renniiniksi, joka eroaa vain kohdassa 290, 15 tarvitaan vain alueen 1099-1118 kattava synteettinen oligonukleotidi, eikä sekvenssiä 847-866 käytetä lainkaan.

Vaikka tämän keksinnön mukaisen menetelmän selostuksessa lähdetään RNA-materiaalista, on myös mahdollista 20 aloittaa eristämällä perimän DNArsta saatu geeni. Tässä tapauksessa häiritsevät sekvenssit poistettaisiin ensin tai käytettäisiin sopivaa isäntäorganismia, joka kykenee muokkaamaan RNA:n häiritsevien sekvenssien poistamiseksi.

On myös mahdollista aloittaa syntetisoimalla haluttu 25 RNA tai DNA tai näiden osia kemiallisesti ja sen jälkeen käyttää tässä selostettuja menetelmiä joko renniinin, pre-prorenniinin ja/tai prorenniinin ekspression aikaansaamiseksi. Lisäksi tässä selostetuilla menetelmillä voidaan saada aikaan kloonattuja geenejä, jotka koodittavat 30 maitoajuoksettavia proteiineja, joita muut eliöt, kuten lampaat, vuohet, siat tai vesipuhvelit, tuottavat, ja jotka ovat renniininkaltaisia entsyymejä.

Claims (11)

65 84080

1. Menetelmä pre-prorenniiniä tai prorenniiniä koodattavan geenin ilmentämiseksi hiiva- tai bakteerisoluissa, jonka pre-prorenniinin nukleotidisekvenssi ja aminohapposekvenssi ovat ATG AGG TGT CTC GTG GTG CTA CTT GOT GTC TTC GOT CTC TCC CAG OGC ►ET ARG CVS LEU VAL VAL LEU L£U ALA VAL PHE ALA LEU SER GIN GLY GGT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CTG TAC AAA GGC AAG TCT CTC AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT ALA GLU ILE ΊΤΕ AFG ILE PRO LEU TYR LYS GLY LYS SER LEU ARG LYS ALA LEU LYS GLU HI S GGG CTT CTG GAG GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AAG TAC TCC GGC TTC GLY LEU LEU GLU ASP PHE LEU GLN LYS G LL G LL TYR GLY I IE SER SER LYS TYR SER GLY PHE GGG GAG GTG QCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GAT AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC GLY G a' VAL ALA SER VAL PRO LEU TfR ASN TYR LEU ASP SER GLN Ti® PHE GLY LYS ILE TAC CTC GGG ACC OCG CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TCT GAC TTC TVK LEU GLY TfR PRO PRO GLN GLU PHE THR VAL LEU PHE ASP THR GLY SR SER ASP PHE TGG GPA OCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT QCC TGC AAA AAC CAC CAG OGC TTC GAC OCG TRP VAL PRO 9R ILE TYR CVS LYS 9® ASN ALA CYS LYS ASN HIS GLN ARG PHE ASP PRO AGA AAG TCG TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC AAG OCC CTG TCT ATC CAC TAC OGG ACA GGC ARG LYS SER SER TW PHE GLN ASN LEU GLY LYS FRO LEU SER ILE HIS TYR GLY THR GLY AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TAT GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG SER f£T GLN GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR VAL THR VAL SER ASN ILE VAL ASP ILE GLN CAG AGA GTA GGC CTG AGC PCC CAG GAG OCC GGG GAC GTC TTC ACC TAT QCC GAA TTC GAC GLN TrR VAL GLY LEU SER TW GLN GLU PRO GLY ASP VAL PHE TK* TYR ALA GLU PHE ASP GGG ATC CTG GGG ATG GGC TAC OCC TCG CTC OCC TCA GAG TAC TCG ATA OCC GTG ΤΓΓ GAC GLY ILE LEU GLY ►ET ALA TYR PRO SER LEU ALA SER GLU TYR SER ILE PRO VAL PHE ASP AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT ASN MET f-ET ASN ARG HIS LEU VAL ALA GLN ASP LEU PHE SER VAL TYR MET ASP ARG ASN GGC CAG GAG AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC OCG TCC TAC TAC ACA GGG TCC CTG GLY GLN GLU SER LET LEU TfR LEU GLY ALA ILE ASP PRO SER TYR TYR THR GLY 9R LEU CAC TGG GTG CCC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC Λ3Τ GTC ACC ATC HES TOP VAL PRO VAL Ttf< VAL GLN GIN TYR TOP GIN PHE THR VAL ASP SER VAL THR ILE AGC QGT CTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GCC ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC SER GLY VAL VAL VAL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GIN ALA ILE LEU ASP THR GLY THR SER AAG CTG GTC GGG CCC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GCC ACA CAG LYS LEU VAL GLY FRO 9» 9® ASP ILE LEU ASN ILE GLN GLN ALA TT.F GLY ALA THR GLN AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAG TGC GAG AAT CTC AGC TAC ATC OCC ACT GTC GTC A9) GLN TYR ASP GLU PHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU SER TYR 1ΈΤ FRO THR VAL VAL 66 84080 ΤΤΓ GAG ATC AAT G(T AAA ATG TAG CCA CTG ACC CQC TOC GOC TAT AOC AGC CAG GAC CAG FHE GLU ILE ASM GLY LYS hLT TYR FRO LEU THR iRO SER ALA TYR THR SER GLN ASP GLN GCC TTC TGT AOC ACT GOC TTC CAG ACT GAA AAT CAT TOC CAG AAA TOG ATC CTG GOG GAT GLY FHE CYS THR SER GLY FHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP GIT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AOC GTC TTT GAC AGG GOC AAC AAC CTC GTG GOC CTG GOC VAL FHE ILE ARG GLU TYR TYR SER VAL FHE ASP ARG ALA ASN ASN LEU VAL GLY LEU ALA AAA GOC ATC TGA LYS ALA ILE tai muu nukleotidisekvenssi, joka koodittaa samaa aminohapposekvenssiä kuin esitetty pre-prorenniinin nukleotidisekvenssi, tai nukleotidisekvenssi, joka koodittaa pre-prorenniinin sellaisen funktionaalisen ekvivalentin aminohapposekvenssiä, jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin se, jota esitetty pre-prorenniinin nukleotidisekvenssi koodittaa, ja jonka prorenniinin nukleotidisekvenssija aminohappo-sekvenssi ovat OCT GAG ATC ACC AGG ATC OCT CTG TAC AAA GGC AAG TCT CTG AGG AAG QCG CTG AAG GAG CAT ALA GLU ILE THR ARG ILE PRO LEU TYR LYS GLY LYS 6ER LEU ARG LYS ALA LEU LYS GLU HIS 03G CTT CTG GAG GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AAG TAC ICC GGC TTC GLY LEU LEU GLU ASP PHE LEU GLN LYS GLN GLN TYR GLY ILE SR SR LYS TYR SR GLY PHE GGG GAG CTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC AAC TAC CTG GAT AGT CAG TAC TTT QGG AAG ATC GLY GLU \AL ALA SER VAL PRO LEU THR ASN TYR LEU ASP SER GLN TYR PHE GLY LYS ILE TAC CTC GGG ACC OCG CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT QGC TCC TCT GAC TTC TYR LEU GLY TW FRO FRO GLN GLU PHE THR VAL LEU PHE ASP THR GLY SER SR ASP PHE TGG CT A CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC MT GCC TGC AAA MC CAC CAG CGC TTC GAC OCG TRP VAL PRO SER ILE TYR CYS LYS SER ASN ALA CYS LYS ASN HIS GLN ARG PHE ASP FRO AGA MG TCG TCC ACC TTC CAG MC CTG QGC MG OCC CTG TCT ATC CAC TAC GGG ACA OGC ARG LYS SER SER Ttf* PHE GIN ASN LEU GLY LYS PRO LEU SER ILE HIS TYR GLY THR GLY AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TAT GAC ACC CTC ACT GTC TCC MC ATT CTG GAC ATC CAG SER RET GIN GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR VAL THR VAL SR ASN ILE VAL ASP ILE GLN CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GTC TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GIN THR VAL GLY LEU SR TSt GIN GLU PRO GLY ASP VAL PHE THR TYR ALA GLU PHE ASP G3G ATC CTG GGG ATG GCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA OCC GTG TTT GAC GLY ILE LEU GLY MET ΑΙΑ TYR FRO SER LEU ALA SER GLU TYR SR ILE PRO VAL PHE ASP MC ATG ATG MC AGG CAC CTG GTG GCC CAA GAC CTG TTC TCG CTT TAC ATG GAC AGG MT ASN »CT RET ASN ARG HIS LEU VAL ALA GIN ASP LEU PHE SER VAL TYR KET ASP ARG ASN GGC CAG GAG AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC OCG TCC TAC TAC ACA GGG TCC CTG GLY GIN GLU SER hET LEU TIR LEU GLY ALA ILE ASP PRO SER TYR TYR THR GLY SR LEU 67 8 4 0 8 0 CAC 1GG CTG CCC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC ACT GTC ACC ATC HIS TRP VAL PRO VAL TH* VAL GLN GLN TYR TRP GIN PHE THR VAL ASP SER VAL TOR ILE AGC GGT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GCC ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC SER GLY VAL VAL VAL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GLN ALA ILE LEU ASP THR GLY TOR SIR AAG CTG GTC GGG CCC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GG A GCC ACA CAG LYS LEU VAL GLY PRO SER SER ASP ILE LEU ASN ILE GLN GLN ALA ILE GLY ALA THR GLN AAC CAG TAC GAT GAG ITT GAC ATC GAC TGC GAC AAC CTG AGC TAC ATG OCC ACT GTG GTC ASN GLN TYR ASP GLU PHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU SER TYR KET PRO THR VAL VAL ITT GAG ATC AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC CCC TCC GCC TAT ACC AGC CAG GAC CAG PHE GLU ILE ASN GLY LIS KET TYR PRO LEU THR FRO SER ALA TYR THR SER GIN ASP GIN GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CAG ACT GAA AAT CAT TOC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT GLY PHE CYS THR ££R GLY PHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GCC AAC AÄC CTC GTG GOG CTG GOC VAL PHE ILE ARG GLU TYR TYR SER VAL IHE ASP ATG ALA ASN ASN LEU VAL GLY LEU ALA AAA GOC ATC TGA LYS ALA ILE tai muu nukleotidisekvenssi, joka koodittaa samaa aminohapposekvenssiä kuin esitetty prorenniinin nukleotidisekvenssi, tai nukleotidisekvenssi, joka koodittaa prorenniinin sellaisen funktionaalisen ekvivalentin aminohapposekvenssiä, jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin se, jota esitetty prorenniinin nukleotidisekvenssi koodittaa, tunnettu siitä, että eristetään mainittu geeni, geenin 5'-päähän kiinnitetään geneettinen promootto-rinukleotidisekvenssi, niin että muodostuu yhdistelmä-DNA-molekyyli, edellyttäen, että kun halutaan aikaansaada prorenniinin ilmentyminen, edellä määritellyn prorenniinin nukleotidisekvenssin 5'-päähän liitetään ATG-kodoni, kyseinen yhdistelmä-DNA-molekyyli siirretään transformoimalla isäntäsoluihin, ja näitä soluja kasvatetaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pre-pro-renniinin ilmentämiseksi hiiva- tai bakteerisoluissa, tunnettu siitä, että 68 84080 eristetään pre-prorenniiniä koodittava DNA-sekvenssi, tämän sekvenssin 5'-päähän kiinnitetään kopioinnin promoottori ja ribosomaalinen sidoskohta ja vaihdellaan sitä etäisyyttä, joka on pre-prorenniiniä koodittavan DNA:n alun ja promoottorin ja sidoskohdan sisältävän DNA-segmen-tin välillä, transformoidaan DNA isäntäsoluihin, kloonataan isäntäsolut ja valitaan niistä ne, joiden pre-prorenniinin tuotantokyky on suuri.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä proren-niinin ilmentämiseksi hiiva- tai bakteerisoluissa, tunnettu siitä, että eristetään pre-prorenniiniä koodittava DNA-sekvenssi, j ossa on 5'-pää, poistetaan 5'-päästä se osa, joka koodittaa prorenniini-prekursoripolypeptidiä, liitetään jäännökseen synteettinen DNA-palanen, jonka 3'-päässä on luennan alkukodoni, sekvenssin 5'-päähän kiinnitetään kopioinnin promoottori ja ribosomaalinen sidoskohta ja vaihdellaan sitä etäisyyttä, joka on prorenniiniä koodittavan DNA:n alun ja promoottorin ja sidoskohdan sisältävän DNA-segmentin välillä, transformoidaan DNA isäntäsoluihin, kloonataan isäntäsolut ja valitaan niistä ne, joiden prorenniinin tuotantokyky on suuri.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiivana käytetään Saccharomyces ce-revisiaeta.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerina käytetään Escherichia colia.

6. Yhdistelmäplasmidi hiiva- tai bakteerisolujen transformoimiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää mainituissa hiiva- tai bakteerisoluissa toimivan replikaation aloituskohdan, mainituissa hiiva- tai bakteerisoluissa toimivan promoottorin ja kyseiseen promootio- 69 84 080 riin toimivasti liittyneenä prorenniinin nukleotidisek-venssin QCT GAG ATC ATC AGG ATC OCT CTG TAC MA GGC MG TCT CTG AGG MG GCG CTG MG GAG CAT ALA GUJ 1L£ T» ARG ILE PRO LEU TYR LYS GLY LYS 6ER LEU ARG LYS ALA LEU LYS GLU HIS GGG CTT CTG GAG GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC MG IAC TCC GGC TTC GLY LEU LEU GLU ASP PHE LEU G LM LYS GLM GLN TYR GLY ILE SER SER LYS TYR SER GLY PHE GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG ACC MC TAC CTG GAT AGT CAG TAC TTT GGG MG ATC GLY GLU VAL ALA SER VAL PRO LEU TK* ASM TYR LEU ASP SER GLM TYR PHE GLY LYS ILE TAC CTC GGG ACC OCG CCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TCT GAC TTC TYR LEU GLY TK* ERO PRO GLM G LL) PHE THR VAL LEU PHE ASP THR GLY SIR SER ASP PHE 1GG GTA OCC TCT ATC TAC TCC MG AGC MT GCC TCC AAA MC CAC CAG CGC TTC GAC OCG TRP VAL PRO SER ILE TYR CYS LYS SER ASM ALA CYS LYS ASN HIS GLM ARG PHE ASP PRO AGA MG TCG TCC ACC TTC CAG MC CTG GGC MG OCC CTG TCT ATC CAC TAC GGG AGA GGC ARG LYS SER SER TK* PHE GLM ASN LEU GLY LYS ERO LEU SER ILE HIS TYR GLY TOR GLY AGC ATG CAG GGC ATC CTG GGC TAT GAC ACC GTC ACT GTC TCC MC ATT GTG GAC ATC CAG SER RET GLM GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR VAL TK< VAL SER ASN ILE VAL ASP ILE GLM CAG ACA GTA GGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC GGG GAC GTC TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GLM THR VAL GLY LEU SER TK* GLM GLU PRO GLY ASP VAL PHE TK* TYR ALA GLU PHE ASP GGG ATC CTG GGG ATG OCC TAC CCC TCG CTC GCC TCA GAG TAC TCG ATA OCC GTG ITT GAC GLY ILE LEU GLY RET ALA TYÖ* PRO SER LEU ALA SER GLU TYR S3* ILE PRO VAL PHE ASP MC ATG ATG MC AGG CAC CTG GTG GCC CAA GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG MT ASN KET RET ASN ARG HIS LEU VAL A1A GLN ASP LEU PHE SER VAL TYR RET ASP ARG ASN OSC CAG GAG AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC CCG TCC TAC TAC ACA GGG TCC CTG GLY GLN GLU SER RET LEU TK* LEU GLY ALA ILE ASP PRO SER TYR TYR TOR GLY SER LEU CAC TCG GTG CCC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TCG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC HIS TRP VAL PRO VAL TK* VAL GLM GLM TYÖ* TRP GLM PHE THR VAL ASP S3* VAL TOR ILE AGC GGT GTG GTT GTG GCC TCT GAG GGT GGC TCT CAG GCC ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC ffiR GLY VAL VAL VAL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GLN ALA ILE LEU ASP THR GLY TOR SIR MG CTG GTC GGG OCC AGC AGC GAC ATC CTC MC ATC CAG CAG GCC ATT QGA GCC ACA CAG LYE LEU VAL GLY PRO SER S3* ASP ILE LEU ASN ILE GLM GLM ALA ILE GLY ALA TOR GLM MC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TCC GAC MC CTG AGC TAC ATG OCC ACT GTG GTC ASN GLN TYR ASP GLU PHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU £ER TYR RET PRO TOR VAL VAL TTT GAG ATC AAT GGC MA ATG TAC OCA CTG ACC OCC TCC GCC HAT ACC AGC CAG GAC CAG PHE GLU ILE ASN GLY LYS KET TYR PRO LEU TK* PRO S3* ALA TYR TK* SER GLN ASP GLM GGC TTC TGT ACC AGT GGC TTC CAG AGT GM AAT CAT TCC CAG AM TQG ATC CTC GGG GAT GLY PHE CYS THR SER GLY PHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC ITT GAC AGG GOC AAC AAC CTC GTC GGG CTG GCC VAL PHE ILE ARG GLU TYR TYR S3* VAL PHE ASP ARG ALA ASN ASN LEU VAL GLY LEU ALA 70 84080 AM GCC ATC TGA LYS ALA ILE

7. Plasmidi pCGS28, joka sisältää prorenniiniä koodattavan geenin ja on liittyneenä Saccharomyces cerevisiae-hi ivakantaan CGY116, ATCC 20623.

8. Yhdistelmäplasmidi hiiva- tai bakteerisolujen transformoimiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää mainituissa hiiva- tai bakteerisoluissa toimivan replikaation aloituskohdan, mainituissa hiiva- tai bakteerisoluissa toimivan promoottorin ja kyseiseen promoottoriin toimivasti liittyneenä pre-prorenniinin nukleotidi-sekvenssin ATG AGG TGT CTC GTG GTG CTA CTT GCT GTC TTC OCT CTC TCC CAG OGC ►ET ARG CYS LEU VAL VAL LEU LEU ALA VAL PHE ALA LEU SER GIN GLY OCT GAG ATC ACC AGG ATC OCT CTG TAC AAA GGC MG TCT CTC AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT ALA GLU IL£ TW ARG ILE PRO LEU TYR LYS GLY LYS SER LEU ARG LYS ALA LEU LYS GLU H1S GGG CTT CTG GAG GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AAG TAC TCC GGC TTC GLY LEU LEL) GLU ASP PHE LEU GLN L^S GLN GIN TYR GLY ILE SER SX LYS TYR SSt GLY PHE GGG GAG GTG GCC AGC GTG OCC CTG ACC AAC TAC CTG GAT AGT CAG TAC TTT GGG AAG ATC GLY GLU VAL ALA S)R VAL PRO LEU TIR ASN TYR LEU ASP SER GIN TYR PHE GLY LYS ILE TAC CTC GGG ACC OCG OCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG ITT GAC ACT GGC TCC TCT GAC TTC TIR LEU GLY TIR PRO PRO GIN GLU PHE THR VAL LEU PHE ASP THR GLY SER SR ASP PHE TGG GTA OCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC MT OCC TGC AAA AAC CAC CAG OGC TTC GAC OCG TRP VAL PRO SER ILE TYR CSG LYS SER ASN ALA CYS LYS ASN HIS GIN ARG PHE ASP PRO AGA MG TCG TCC ACC TTC CAG AAC CTG GGC MG OCC CTG TCT ATC CAC TAC OGG ACA GGC ARG LYS SER SER TIR PHE GIN ASN LEU GLY LYS PRO LEU SER ILE HIS TYR GLY THR GLY AGC ATG CAG GGC ATC CTG OGC TAT GAC ACC GTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG £ER KET GIN GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR VAL THR VAL SER ASN ILE VAL ASP ILE GIN CAG ACA GTA OGC CTG AGC ACC CAG GAG OCC OGG GAC GTC TTC ACC TAT GCC GAA TTC GAC GIN TIR VAL GLY LEU SER TIR GIN GLU PRO GLY ASP VAL PHE TIR TYR ALA GLU PHE ASP OGG ATC CTG OGG ATG GCC TAC OCC TCG CTC OCC TCA GAG TAC TCG AXA OCC GTG TTT GAC GLY ILE LEU GLY f-ET ALA TYR PRO SER LEU ALA GLU TYR SER ILE PRO VAL PHE ASP AAC ATG ATG MC AGG CAC CTG GTG OCC CAA GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG MT ASN M)T »ET ASN AHG HIS LEU VAL ALA GLN ASP LEU PHE SER VAL TYR KET ASP ARG ASN GGC CAG GAG AGC ATG CTC AEG CTG OGG GCC ATC GAC OCG TCC TAC TAC ACA OGG TCC CTC GLY GIN GLU SER RET LEU TIR LEU GLY ALA ILE ASP PRO SER TYR TYR THR GLY SER LEU CAC TGG GTG OCC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC HIS TRP VAL PRO VAL TIR VAL GLN GIN TYR TRP GIN PHE THR VAL ASP SER VAL THR ILE 7i 84080 AGC QGT GTG GTT GTG OCC TCT GAG GGT QGC TCT CAG GCC ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC SER GLY VAL VAL VAL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GLN ALA ILE LEU ASP THR GLY TOR 2R AAG CIG GTC GGG COC AGC AQC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GCC ACA CAG LYS LEU VAL GLY FRO SIR SER ASP ILE LEU ASN ILE GLN GLN ALA ILE GLY ALA THR GLN AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TOC GAC AAC CTC AGC TAC ATC COC ACT GTC GTC ASN GLN TYR ASP GLU FHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU SER TYR MET FRO THR VAL VAL TTT GAG ATC AAT GOC AAA ATC TAC CCA CTC ACC CCC TOC GCC TAT ACC AGC CAG GAC CAG FHE GLU ILE ASN GLY LYS EET TYR FRO LEU THR FRO SER ALA TYR THR SER GLN ASP GLN GGC TIC TGT ACC AGT GGC TIC CAG AGT GAA AAT CAT TOC CAS AAA TOG ATC CTC GGG GAT GLY FHE CYS THR SER GLY FHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP GTT TIC ATC CGA GAS TAT TAC AGC GTC TIT GAC AGG GCC AAC AAC CTC GTC GGG CTC GCC VAL FHE ILE ARG GLU TYR TYR SER VAL FHE ASP ARG ALA ASN ASN LEU VAL GLY LEU ALA AAA GOC ATC TGA LYS ALA ILE

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen yhdistelmäplasmidi, tunnettu siitä, että se on plasmidi pCGE21, liittyneeni! Escherichia coli-bakteerikantaan CGE24, ATCC 31929.

10. Yhdistelmäplasmidi hiiva- tai bakteerisolujen transformoimiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää mainituissa hiiva- tai bakteerisoluissa toimivan replikaation aloituskohdan, mainituissa hiiva- tai bakteerisoluissa toimivan promoottorin ja kyseiseen promoottoriin toimivasti liittyneenä renniinin nukleotidisekvenssin GGG GAG GTG GCC AGC GTG CCC CTG A CC AAC TAC CTG GAT ACT CAG TAC TTT GGG AAG ATC GLY GLU VAL ALA SER VAL FRO LEU THR ASN TYR LEU ASP SER GLN TYR FHE GLY LYS tt .f TAC CTC GGG ACC COG COC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TOC TCT GAC TTC TYR LEU GLY THR ERO FRO GLN GLU FHE THR VAL LEU FHE ASP THR GLY SER SER ASP FHE TOG GTA CCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT GOC TGC AAA AAC CAC CAG OQC TTC GAC COG TOP VAL PRO SK ILE TYR CYS LYS SER ASN ALA CYS LYS ASN H IS GUJ ARG FHE ASP FRO AGA AAG TCG TOC ACC TTC CAG AAC CTC GGC AAG COC CTG TCT ATC CAC TAC GGG ACA GGC ARG LYS SER SR THR FHE GLN ASN IEU GLY LYS FRO LEU SER ILE HIS TYR GLY THR GLY AGC ATC CAG GGC ATC CTG GGC TAT GAC ACC GTC ACT CTC TOC AAC ATT GTC GAC ATC CAG SER MET GLN GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR VAL THR VAL SER ASN ILE VAL ASP ILE GLN CAG ACA GTA GOC CTC AGC ACC CAG GAG COC GGG GAC GTC TTC ACC TAT GOC GAA TTC GAC GLN THR VAL GLY IEU SR THR GLN GLU FRO GLY ASP VAL FHE THR TYR ALA GLU PHE ASP GGG ATC CTG GGG ATC GOC TAC CCC TOG CTC GOC TCA GAG TAC TOG ATA CCC GTC TTT GAC GLY ILE IEU GLY FET ALA TYR FRO SER IEU ALA SER GLU TYR SER ILE IRO VAL PHE ASP AAC ATC ATC AAC AGG CAC CTG GTC GOC CAA GAC CTG TIC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT ASN MET MET ASN ARG HIS IEU VAL ALA GLN ASP LEU FHE SER VAL TYR FET ASP ARG ASN GGC CAG GAG AGC ATG CTC AOG CTG GGG GOC ATC GAC CCG TOC TAC TAC ACA GGG ICC CTG GLY GLN GLU SER FET IEU THR IEU GLY ALA ILE ASP FRO SR TYR TYR THR GLY SER IEU 72 84080 CAC TOG GTG COC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AGT GTC ACC ATC HIS TRP VAL WO VAL THR VAL GLN GLN TYR TRP GLN PHE THR VAL ASP SER VAL THR ILE AGC GGT GTG GTT GTG GOC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GOC ATC CTG GAC AOG QGC ACC TCC SER GLY VAL VAL VAL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GLN ALA ILE LEU ASP THR GLY THR SER AAG CTG GTC GGG COC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GCC ACA CAG LYS I£U VAL GLY WO SER SER ASP ILE LEU ASN ILE GLN GLN ALA ILE GLY ALA THR GLN AAC CAG TAC GAT GAG TTT GAC ATC GAC TQC GAC AAC CTG AGC TAC ATG COC ACT GTG GTC ASN GLN TYR ASP GLU PHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU SER TYR MET WO THR VAL VAL TTT GAG ATC AAT GGC AM ATG TAC CCA CTG ACC COC TOC GOC TAT ACC AGC CAG GAC CAG FHE GLU ILE ASN GLY LYS MET TYR PRO LEU THR WO SER ALA TYR THR SER GLN ASP GLN GGC TIC TGT ACC AGT GGC TTC CAG ACT GM AAT CAT TOC CAG AM TOG ATC CTG GGG GAT GLY WE CYS THR SER GLY PHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AGC GTC TTT GAC AGG GCC AAC AAC CTC GTG GOG CTG GOC VAL PHE ILE ARG GLU TYR TYR SER VAL PHE ASP ARG ALA ASN ASN LEU VAL GLY LEU ALA AM GOC ATC TGA LYS ALA ILE

11. Menetelmä renniinin tai sen funktionaalisen ekvivalentin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan hiiva- tai bakteerisoluja, jotka sisältävät yhdistelmäplasmidin, jossa on pre-prorenniiniä koodittava geeni, jolla pre-prorenniinillä on seuraava nukleotidisek-ven:;:; i ATG AGG TGT CTC GTG GTG CTA CTT QCT GTC TTC QCT CIO TCC CAG GGC ►ET ARG CYS LEU VAL VAL LEU LEU ALA VAL PHE ALA LEU SER GIN GLY GOT GAG ATC ACC AGG ATC OCT CTG TAC AAA GGC MG TCT CTG AGG MG QCG CTG MG GAG CAT ALA GLU ILE TW ARG ILE PRO LEU TYR LYS GLY LYS SER LEU ARG LYS ALA LEU LYS GLU HI S GGG CTT CTG GAG GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC MG TAC TCC GGC TTC GLY LEU LEU GLU ASP PHE LEU GIN LYS GLN GIN TYR GLY ILE SER SER LYS TYR SER GLY PHE GGG GAG GTG GCC AGC GTG OCC CTG ACC MC TAC CTG GAT AGT CAG TAC TTT GGG MG ATC GLY GLU VAL ALA SER VAL PRO LEU TW ASN TYR LEU ASP S:R GIN TYR PHE GLY LYS ILE TAC CTC GGG ATC OCG OCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT GGC TCC TCT GAC TTC TYR LEU GLY TW PRO PRO GLN GLU PHE THR VAL LEU PHE ASP THR GLY SER SER ASP PHE TGG GTA CCC TCT ATC TAC TGC MG AGC MT OCC TGC AAA MC CAC CAG CGC TTC GAC OCG TRP VAL PRO SER ILE TYR CYS LYS ST* ASN ALA CYS LYS ASN HIS GLN ARG PHE ASP PRO AGA AAG TCG ICC ACC TTC CAG MC CTG GGC MG OCC CTG TCT ATC CAC TAC GGG ACA GGC ARG LYS SER SER TIK PUI: GLN ASN LEU GLY LYS PRO LEU SER ILE HIS TYR GLY THR GLY AGC ATG CAG GGC AIV CIX, GGC TAT GAC ACC GTC ACT GTC TCC MC ATT GTG GAC ATC CAG SEK KET GLN GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR VAL THR VAL SER ASN ILE VAL ASP ILE GIN 73 84080 CAG ACA CTA GGC CTG AGO ACC CAG GAG OCC GGG GAC GTC TTC ACC TAT OCC GAA TTC GAC GLN TTO VAL GLY LEU SER THR GLN GLU PRO GLY ASP VAL PHE TTO TYR ALA GLU PHE ASP GGG ATC CTG GGG ATG GCC TAC OCC ICG CTC OCC TCA GAG TAC TCG ATA OCC GTG ΤΓΤ GAC GLY ILE LEU GLY KET ALA TYR PRO SER LEU ALA SER GLU TYR SER ILE PRO VAL PHE ASP AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG OCC CAA GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT ASN KET KET ASN ARG HIS LEU VAL ALA GLN ASP LEU PHE SER VAL TYR KET ASP ARG ASN GGC CAG GAG AGC ATG CTC ACG CTG GGG GCC ATC GAC OCG TCC TAC TAC ACA QGG TCC CTG GLY GUJ GLU ££R KET LEU TKR LEU GLY ALA I IE ASP PRO SER TYR TYR THR GLY $R LEU CAC TCG GTG CCC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TCG CAG TTC ACT GTG GAC ACT GTC ACC ATC HIS TOP VAL PRO VAL TKf< VAL GLN GLN TYR TOP GLN PHE THR VAL ASP SER VAL THR ILE AGC OCT GTG GTT GTG GCC TGT GAG GGT GGC TCT CAG GCC ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC SER GLY VAL VAL VAL ALA CVS GLU GLY GLY CVS GUJ ALA ILE LEU ASP TOR GLY TOR SER AAC CTC GTC GGG COC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT GGA GCC ACA CAG LYS IEU \AL GLY PRO SR ffiR ASP ILE IEU ASN ILE GLN GLN ALA ILE GLY ALA THR GLN AAC CAG TAG GAT GAG TTT GAC ATC GAC TOC GAC AAC CTG AGC TAC ATG COC ACT GTG GTC ASN GLN TYR ASP GLU PHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU SER TYR KET ERO THR VAL VAL TIT GAG ATC AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTC ACE COC TOC GCC TAT ACC AGC CAG GAC CAG ME GLU ILE ASN GLY LYS KET TYR ERO LEU THR TOO SER ALA TYR THR SER GUJ ASP GLN GGC TTC TGT ACC ACT GGC TTC CAG ACT GAA AAT CAT TOC CAG AAA TOG ATC CTC GGG GAT GLY EHE CYS THR SER GLY PHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP GTT TTC ATC CGA GAG TAT TAC AOC GTC ITT GAC AGG GCC AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC VAL TOE ILE ARG GLU TYR TYR SER VAL PHE ASP ARG ALA ASN ASN IEU VAL GLY LEU ALA AAA GCC ATC TGA LYS ALA ILE tai muu nukleotidisekvenssi, joka koodittaa samaa aminohapposekvenssiä kuin esitetty pre-prorenniinin nukleotidisekvenssi, tai nukleotidisekvenssi, joka koodittaa pre-prorenniinin sellaisen funktionaalisen ekvivalentin aminohapposekvenssiä, jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin se, jota esitetty pre-prorenniinin nukleotidisekvenssi koodittaa, tai prorenniiniä koodittava geeni, jolla prorenniinillä on seuraava nukleotidisekvenssi OCT GAG ATC ACC AGG ATC OCT CTG TAC AAA GGC AAG TCT CTG AGG AAG GCG CTG AAG GAG CAT ALA GLU ILE TTO ARG ILE PRO LEU TYR LYS GLY LYS 6ER LEU ARG LYS ALA LEU LYS GLU HIS GGG CTT CTG GAG GAC TTC CTG CAG AAA CAG CAG TAT GGC ATC AGC AGC AAG TAC TCC GGC TTC GLY LEU LEU GLU ASP PHE LEU GUJ LYS GUJ GLN TYR GLY ILE SER SIR LYS TYR SER GLY PHE 74 84080 GGG GAG CTG GCC AGC GTG (XC CTG ACC AAC TAC CTG GAT /CT CAG TAC TIT OGG AAG ATC GLY GLU VAL ALA EER \AL PRO LEU THR ASN TYR LEU ASP SER GLM TYR PHE GLY LYS ILE TAC CTC QGG ACC OCG OCC CAG GAG TTC ACC GTG CTG TTT GAC ACT OGC TCC TCT GAC TTC TYR LEU GLY TIP PRO PRO GLN GLU PHE THR VAL LEU PHE ASP THR GLY SER SER ASP PHE 1GG GTA OCC TCT ATC TAC TGC AAG AGC AAT OCC TGC AAA AAC CAC CAG OGC TTC GAC OCG TRP VAL PRO aR ILE TYR CYS LYS SER ASN ALA CYS LYS ASN HIS GLN ARG PHE ASP PRO AGA AAG ICG TCC ACC TTC CAG AAC CTG OGC AAG OCC CTG TCT ATC CAC TAC QGG ACA OGC ARG LYS EER SER ThF PHE GUI ASN LEU GLY LYS FRO LEU EER ILE HIS TYR GLY THR GLY AGC ATG CAG OGC ATC CTG GGC TAT GAC ACC CTC ACT GTC TCC AAC ATT GTG GAC ATC CAG SER KET GLN GLY ILE LEU GLY TYR ASP THR VAL THR VAL SER ASN ILE VAL ASP ILE GLN CAG ACA GTA OGC CTG AGC ACC CAG GAG CCC QGG GAC GTC TTC ACC TAT OCC GAA TTC GAC GLN THR VAL GLY LEU SER TW GLN GLU PRO GLY ASP VAL PHE THR TYR ALA GLU PHE ASP GGG ATC CTG OGG ATG GCC TAC OCC TCG CTC OCC TCA GAG TAC ICG ATA OCC GTG ΤΓΤ GAC GLY ILE LEU GLY KET ALA TYR PRO EER LEU ALA SER GLU TYR SER ILE PRO VAL PHE ASP AAC ATG ATG AAC AGG CAC CTG GTG GCC CAA GAC CTG TTC TCG GTT TAC ATG GAC AGG AAT ASN KET KET ASN ARG HIS LEU VAL ALA GIN ASP LEU PHE SER VAL TYR KET ASP ARG ASN GGC CAG GAG AGC ATG CTC ACG CTG OGG OCC ATC GAC OCG TCC TAC TAC ACA OGG TCC CTG GLY GLN GLU SER KET LEU THR LEU GLY ALA ILE ASP PRO SER TYR TYR TOR GLY SR LEU CAC TGG GTG OCC GTG ACA GTG CAG CAG TAC TGG CAG TTC ACT GTG GAC AST GTC ACC ATC HIS TRP VAL PRO VAL TTO VAL GLN GIN TYR TRP GLN PHE THR VAL ASP SR VAL TOR ILE AGC QGT GTG GTT GTG OCC TGT GAG GGT GGC TGT CAG GCC ATC CTG GAC ACG GGC ACC TCC SER GLY VAL VAL VAL ALA CYS GLU GLY GLY CYS GIN ALA ILE LEU ASP TOR GLY THR SER AAG CTG GTC GGG OCC AGC AGC GAC ATC CTC AAC ATC CAG CAG GCC ATT QGA GCC ACA CAG LYS LEU VkL GLY PRO SER a» ASP ILE LEU ASN ILE GIN GIN ALA ILE GLY ALA TOR GIN AAC CAG TAC GAT GAG ITT GAC ATC GAC TGC GAC AAC CTG AGC TAC ATG OCC ACT CTG CTC ASN GIN TYR ASP GLU PHE ASP ILE ASP CYS ASP ASN LEU SER TYR KET PRO THR VAL VAL TTT GAG ATC AAT GGC AAA ATG TAC CCA CTG ACC OCC TCC GCC TAT ACC AGC CAG GAC CAG PHE GLU IIE ASN GLY LYS MET TYR FRO LEU THR PRO SER ALA TYR THR SER GLN ASP GLN GGC TTC TGT AOC ACT GGC TTC CAG ACT GAA AAT CAT TCC CAG AAA TGG ATC CTG GGG GAT GLY TOE CYS THR SER GLY PHE GLN SER GLU ASN HIS SER GLN LYS TRP ILE LEU GLY ASP GTT TTC ATC CGA GPC TAT TAC AGC GTC TTT GAC AOG GCC AAC AAC CTC GTG GGG CTG GCC VAL TOE ILE AFG GLU TYR TYR SER VAL TOE ASP ARG ALA ASN ASN LEU VAL GLY LEU ALA AAA GOC ATC TGA LYS ALA ILE tai muu nukleotidisekvenssi, joka koodittaa samaa aminohapposekvenssiä kuin esitetty prorenniinin nukleotidisekvenssi, tai nukleotidisekvenssi, joka koodittaa prorenniinin sellaisen funktionaalisen ekvivalentin aminohapposek- 75 84080 venssiä, jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin se, jota esitetty prorenniinin nukleotidisekvenssi koodittaa, otetaan pre-prorenniini tai prorenniini tai niiden funktionaaliset ekvivalentit talteen mainituista soluista ja katkaistaan pre-prorenniini, prorenniini tai niiden funktionaalinen ekvivalentti, jolloin saadaan renniini tai sen funktionaalinen ekvivalentti. 76 84080