JPS63291583A - Ｌ―フェニルアラニン・アンモニアリアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なＬ−フェニルアラニン・アンモニアリ
アーゼ（以下、ＰＡＬと略記、−する）のアミノ酸配列
であり、その構造遺伝子であり、特にそれがロドスボリ
ジウム　トルロイデス（Ｒｈｏｄｏ−ｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）のものであり、更にそれが
他の宿主原核細胞及び真核細胞微生物において発現する
為に必要な部分を結合した新規な塩基配列であり、更に
その塩基配列を含むベクターであり、更にそのベクター
で形質転換した微生物であり、更にその微生物を用いて
Ｌ−フェニルアラニン（以下、Ｌ−Ｐｈｅと略記するこ
とがある）を製造する新しい技術である。

良策上生租里光立 この発明はＬ−フェニルアラニンの製造に利用される。

従来のＩ術および　■が解決した問題点ロドスボリジウ
ム・トルロイデスのＰＡＬがＬ−フェニルアラニンの製
造に利用されることは知られている。

ＰＡＬを製造する方法は、特公昭４４−１０７５３号公
報および特開昭５８−８６０８２号公報に開示されてい
る。

また特公昭４４−１０７５３号公報はロドトルラ属の微
生物をＬ−フェニルアラニンよ接触させて該酵素を生産
することを教示し、特開昭５８−８６０８２号公報はロ
ドトルラ属の微生物をイソロイシン、バリン、ロイシン
などのアミノ酸と接触させて該酵素の生産を誘導する方
法を教示している。

これらの方法によりＰＡＬを生産する場合には高価なア
ミノ酸とＰＡＬ生産能を有する微生物とを接触させる必
要があり、工業化には技術的にはかなり問題があった。

一方、最近の分子生物学の進歩では、異種の微生物由来
の蛋白質をコードするＤＮＡ鎖を他種の微生物に導入し
、形質転換させることが可能となって来た。

この遺伝子工学的技術を応用すれば、ＰＡＬ生産能を有
する微生物を高価なアミノ酸と接触させてＰＡＬの誘導
を計る必要がなくなり、微生物の培養の管理も容易とな
ることが期待できる。

しかし、ＰＡＬの構造遺伝子およびアミノ酸配列につい
ては未だに報告がなされていない。

肌肌ｌ展人工ゑ亙汝旦王段 上記の問題を解決する為に、本発明では次の事′が行わ
れた。

（１１ＰＡＬアミノ酸配列配列に示した通りのシーケン
スであることがロドスポリジウム・トルロイデスにおい
て明らかにされた。

（２）　ＰＡＬ構造遺伝子をコードするＤＮＡ鎖をプロ
モーター領域の３″末端とターミネータ−領域の５′末
端との間に挿入してなる新しいプラスミド組換えＤＮＡ
（ｐＳＷ　１０１．ｐＹｔｒｐ　６．ｐＫＹ　２０１）
が作出された。

（３）　　この新しいプラスミド組換えＤＪＪＡを含有
する形質転換体〔大腸菌ＭＴ−１０４１Ｃ１（ＦＥＲＭ
　Ｐ−８８３４）、ＭＴ−１０４１４（ＦＥＲＭ　Ｐ−
８８７６）及びパン酵母ＭＴ−４０３９０（ＦＥＲＭ　
Ｐ−８８７５））が作出された。

（４）この新しい形質転換体を培養し、培養物中にＰＡ
Ｌを産生蓄積させる新しいＰＡＬの製造法が実施された
。

（５）　　この新しい方法で産生されたＰＡＬを利用し
てアンモニア供与体と桂皮酸とに作用させ、Ｌ−フェニ
ルアラニンを製造する新しい技術が実施された。

本発明で用いられるＰＡＬ構造遺伝子はいくつかの工程
を実行することにより得られるが、そのうち最も本質的
なものは次の通りである。

＋１）　ＰＡＬのメツセンジャー　ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ
）の単離および精製。

（２）咳ｍＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ　（ｄｓ−ｃＤＮＡ）
に変換。

（３）オリゴ・ｄＣ尾を付加したｄｓ−ｃＤＮＡの構築
。

（４）該オリゴ・ｄＣ付加−ｄｓ−ｃＤＮＡとオリゴ・
６６尾を付加したベクターとの結合によるハイブリッド
プラスミドの構築。

（５）微生物の形質転換とクローンの選択。

（６１ＯＮＡ配列の解析によるＰＡＬ構造遺伝子部の形
質の確認。

啄）　ＰＡＬ酵素活性の発現の確認。

ＰＡＬ構造遺伝子をコードするＤＮＡは、各種宿主（例
えば、大腸菌、枯草菌、パン酵母等）で増殖可能なベク
ターに含まれかつ該宿主内で機能するプロモーター領域
の３°末端とターミネータ−領域の５゛末端との間に挿
入することにより、ＰＡＬを発現させうる組換えＤＮＡ
プラスミドに構築することができる。

この場合のプロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼが結
合することによってｍＲＮＡ合成を開始させるのに必要
な部分を含んだ領域であればいかなるものであってもよ
い。

このプロモーター領域には、翻訳開始領域も含まれ、翻
訳開始領域はシャインーダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ
ｌｇａｒｎｏ）配列又はリポソーム結合部位として知ら
れるｍＲＮＱ上の塩基配列にリポソームが結合する部位
から翻訳開始コドン（例えばＡＴＧ）までを含み、シャ
インーダルガーノの配列から翻訳開始コドンまでの間隔
は約１０塩基が好ましい。

ターミネータ−領域は宿主が大腸菌の如く原核生物であ
れば必ずしも必要とは言えないが、付加効果も知られて
いる。

したがって、大腸菌を宿主に用いる場合には、ＰＡＬ構
造遺伝子をコードするＤＮＡを、大腸菌で増幅するプラ
スミド上にあってかつ大腸菌内で機能するプロモーター
領域の３゛末端に挿入すればよい。

例えば好ましいプロモーター領域として、トリプトファ
ン（ｔｒｐ）プロモーター、乳糖（Ｉａｃ）プロモータ
ー、ｔａｃプロモーター、ＰＬラムダプロモーター等が
あり、これらのプロモーター領域を含むｐＢＲ３２２、
ｐＵｃ等のベクターが示される。

これらベクターを適当な制限酵素でプロモーター領域の
３゛末端部位を切断し同一粘着末端であればそのまま、
粘着末端のＯＮ＾塩基配列が合わなければ平滑末端を造
成し、リガーゼの作用により挿入すればよい。

なお、トリプトファンプロモーターについては後に一括
して示した参考文献１〜４があり、乳糖プロモーターに
ついては参考文献５があり、ｔａｃプロモーターについ
ては参考文献６があり、ＰＬラムダプロモーターについ
ては参考文献７及び８があり更にターミネータ−領域に
ついては参考文献９がある。

プロモーター領域の３゛末端とターミネータ−領域の５
”末端との間にＰＡＬ構造遺伝子を挿入して構築した組
換えＤＮＡプラスミドは、公知の方法で大腸菌を形質転
換できる。

この形質転換体は薬剤耐性、例えばアンピシリン耐性等
により、又は栄養要求性等の表現型として選択できる。

そしてこれらの表現型の細胞からさらにＰＡＬ活性を示
す細胞を選択する。

前述のようにして選択した形質転換体は公知の方法で培
養する。培地としては、例えばブイヨン培地が、又はグ
ルコース若しくは他の栄養要求性に対応する物質を添加
した合成培地が挙げられる。

必要によりプロモーターを効率よく働かせるためには、
例えばイソプロピル−β−チ、オガラクトシド（１，Ｐ
ＴＧと略称する）もしくはインドールアクリル酸（ＩＡ
Ａと略称する）のような薬剤を加えることが出来る。

該形質転換体の培養は通常１５〜４３℃、好ましくは２
８〜４２°Ｃで４〜４８時間、好ましくは４〜２０時間
行い、必要により通気や撹拌を加えてよい。

パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）を宿主として利用するときには、パン酵母の
形質転換体を次のように創製することができる。

大腸菌−酵母シャトル−ベクターＹＲｐ７（その取得法
は参考文献１０）、およびｐＭＡ３ａ　（取得法は参考
文献１１）等パン酵母で機能するプロモーター領域、例
えばグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子のプロモーター領域（取得法は参考文献１２）、あ
るいはアルコールデヒドロゲナーゼ！遺伝子のプロモー
ター領域（取得法は参考文献１３）等を挿入したのち、
その３゛末端側にＰＡＬ構造遺伝子をコードするＤＮＡ
断片をリガーゼで結合させ、ついでアルコールデヒドロ
ゲナーゼＩ遺伝子のｍＲＮＡの３°末非翻訳領域、ある
いはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子のｍＲＮＡの３°末非翻訳領域等を選択してＰＡＬ
構造遺伝子の３゛末にリガーゼで結合させ、各ｍＲＮＡ
の３”末非翻訳領域部をプラスミドと結合して、該プラ
スミドを閉環する。　閉環プラスミドを用いて、公知の
方法で大腸菌を形質転換する。

得られた形質転換体は、例えばアンピシリン耐性を表現
型として容易に選択が可能である。

該形質転換大腸菌の細胞よりプラスミドＤＮへをアルカ
リ抽出法に従って単離し、該プラスミドを用いて酵母の
栄養要求株、例えばＭＴ−４０３９１（１ｅｕ２゜ｔｒ
ｐｌ）　、もしくはＭＴ−４０３９２（ｔｒｐｌ、）を
公知の方法、またはそれらに準する方法によって形質転
換する。

該形質転換酵母は宿主の栄養要求性の復帰により選ぶこ
とが可能である。

該形質転換酵母はそれ自体公知の培地で培養できる。培
地としてはアミノ酸無添加ウィンカム培地（参考文献１
４）に該酵母の栄養要求物を添加し、グルコースを加え
た培地等が挙げられる。

該酵母の培養は通常１５〜４０℃、２４〜７２時間行い
、必要により通気や撹拌を加えることもできる。

微生物は培養後、公知の方法で培養液から菌体を集菌し
、集菌菌体を有機溶媒、界面活性剤等との接触もしくは
超音波、ガラスピーズ等による機械的処理もしくは微生
物に対する溶菌酵素、自己消化などの生化学的処理等に
より細胞壁等をｔ員傷して、培養菌体細胞内に生産蓄積
されたＰＡＬを抽出することができる。

上記のような方法で処理した処理物、又は培養後の集菌
菌体等を公知の方法、例えば、特開昭５６−２６１９７
号公報に開示された方法で酵素反応を行えばＬ−フェニ
ルアラニンが得られる。

（発明の効果） 本発明により （１１ＰＡＬのアミノ酸配列がロドスポリジウム・トル
ロイデスにおいて明らかにされた。（後記載のＰＡＬの
アミノ酸配列参照） ＋２）　ＰＡＬ構造遺伝子をコードするＤＮＡ鎖をプロ
モーター領域の３°末端とターミネータ−領域の５′末
端との間に挿入してなる新しいプラスミド組換えＤＮＡ
　（ｐＳＷ　１０１．ｐＹｔｒｐ　６．ｐＫＹ　２０１
）が作出された。

（３）　　この新しいプラスミド組換えＤＮＡを含有す
る形質転換体が作出された。

（４）　　この新しい形質転換体を培養し、培養物中に
ＰＡＬを産生蓄積させる新しいＰＡＬの製造法が実施さ
れた。

（５）　　この新しい方法で産生されたＰＡＬを利用し
てアンモニア供与体と桂皮酸とに作用させ、Ｌ−フェニ
ル了うニンを製造する新しい技術が実施された。

（実施例） 以下の詳細な記述は本発明を各段階に分けて説明するも
のである。

１　、　ｍＲＮＡ（ＰＡＬ）の単　および°製。

ロドスボリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒ
−ｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ　ＩＦＯ５５９、
この菌はＡＴＣＣ１０７８８としても収載されている。

）を２％グルコースを含む合成培地（第１表）で、２７
℃で通気攪拌培養を行い、培養初期に添加したグルコー
スを全て消費した直後に、菌体を遠心分離して集菌し、
湿菌体を滅菌した０、８５％食塩水で洗浄後再度遠心分
離を行い、湿洗浄菌体を得た。

第１表 該湿洗浄菌体は直ちにＰＡＬ誘導培地（２％Ｌ−Ｐｈｅ
を含む０．１７％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ
５ｅ　　（Ｄｉｆｃｏ社製、無硫安および無アミノ酸タ
イプ））に菌体濃度０．５〜０．８χになるように懸濁
し、２７℃にて震盪攪拌を行いＰＡＬを誘導した。

無処理の菌体及び２時間誘導処理を行った菌体はＰＡＬ
誘導培地からそれぞれ遠心分離で回収し、得られた湿菌
体は等量の滅菌水に懸濁後、該懸濁液を液体窒素中に滴
下して凍結菌体とした。

凍結菌体１０ｇを液体窒素中で乳鉢で粉砕を行い、５０
ｍ１（７）　５％ノＳＯＳを添加した緩衝液Ｃ（０，１
ＭＮａＪＰＯ４（ｐＨ７，４）　、０．１５Ｍ食塩、１
％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｔｒｉ　ｔｏｎＸ
−１００）を加え、緩やかに３０分間攪拌した。

３０分後、５０ｍ１のフェノール・クロロホルム混液（
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合
容量比２５：２４：１）５０ｍｌを加え、１５分間撹拌
ン昆合した。

該混合液を遠心分離し水層を回収し、この水層に新たに
５０ｍ　ｌのフェノール・クロロホルム混液を加え、１
５分間攪拌後遠心分離し、更に水層を回収して再びフェ
ノール・クロロホルム混液抽出操作を２回繰り返した。

最後に得られた水層に食塩を終濃度０．２Ｍになるよう
に滅菌した釦食塩水を加え、さらに２．５容の冷エタノ
ールを加え、−２０″Ｃ以下に保存して核酸成分を沈澱
させた。

この沈澱物を遠心分離により回収し、冷エタノールで洗
浄しその後、減圧乾燥を行なった。

該乾燥物を１０ｍ１の滅菌水に溶解し、６５℃、５分間
加熱処理を行い、オリゴｄ　（Ｔ）セルロースを用いた
ｍＲＮＡの公知のマニアナイス法（参考文献１５）に準
じてｍＲＮＡを単離した。

得られたｍＲＮＡをサンプル緩衝液（５Ｍ尿素、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、　０．０５％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕ
ｅ）に溶解後、６５℃、２分間加熱処理を行いＲＮＡの
高次構造を変性させた後、８Ｍ尿素−アクリルアミドス
ラブゲル（アクリル濃度３％、８Ｍ尿素存在）を用いて
泳動用緩衝液（８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸、
２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で電気泳動に供した。

泳動後、アクリルアミドゲルをエチジウムブロマイド処
理し、紫外線下でｍＲＮへのバンドを発色させてｍＲＮ
Ａの大きさで２．０〜３．０ｋｂの範囲を長さで三等分
に分割し、スラブゲルから各ゲル断片を切り出した。

各ゲル断片を透析チューブに封入し、泳動用緩衝液に沈
め、ｍＲＮＡをゲルから電気的に溶出した。

透析チューブ内液にフェノール・クロロホルム混液を加
え抽出操作を２回繰り返し、残フェノールをエーテル抽
出後、水層の１７１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（
ｐＨ５，２）を加え、さらに２．５容の冷エタノールを
添加して一２０°Ｃに保存し、ｍ　Ｒ’Ｎ　Ａを沈澱さ
せた。

上記で得られたｍＲＮＡがＰＡＬｍＲＮＡを含有するも
のであることを確認するために、各ｍＲＮＡ画分から蛋
白質に翻訳させ、産生蛋白質をＰＡＬ特異抗体を用いて
同定する方法を行なった。

すなわち、各分画ｍＲＮＡはウサギの網状赤血球溶解物
を用いた無細胞系の翻訳キットに供した（参考文献１６
）。

ウサギ網状赤血球アッセイ用キットはＰｒｏｍｅｇａＬ
ｏ　ｔｅｃ社のものを用い、標識アミノ酸としては３５
Ｓ−メチオニンＣＡｍｅｒｓｈａｍ社）を用いた。

ウサギの網状赤血球ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳システムで翻
訳された蛍白質を確認するために、翻訳反応液に緩衝液
Ｃを加えて溶解し、不溶物を遠心分離で除き、上清に自
製のウサギの抗ＰＡＬ　−１ｇＧを加えて、氷上で３０
分間反応させ、反応液に羊の抗ウサギＩｇＧ（自製）を
加えて、氷上で３０分間反応させ、ウサギ抗体と沈澱さ
せた。

沈澱物を遠心分離して回収し、緩衝液Ｃで２回洗浄を行
い、該沈澱物を２％ＳＯ５，１０％β−メルカプトエタ
ノール混液と０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−リ９．ン酸（ｐＨ６
゜８）、１χＳＯＳ、５０χグリセリン混液とを３：１
の容量で混合した溶液に溶解し、９５°Ｃ２２分間処理
を行い、蛋白質のジスルフィド結合と切断し、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動（アクリルアミ
ド濃度１０％）をレムリの方法（参考文献１７）に準じ
て行い、泳動後のゲルを乾燥後、オートラジオグラフィ
ーによりＰＡＬの同定を行った。

２、ＰＡＬｍＲＮＡの二　ｔ”ｃＤＡＮ（ｄｓ−ｃＤＮ
Ａ）　ヘの・ＰＡＬ誘導誘導処理２稜 記の方法で精製し、得られたｍＲＮＡを、篩ν逆転写酵
素を作用させて、−重鎖ｃＤＡＮ分子に変換した（参考
文献１日）。

該−末鎖ＣＤＡＮ−１１１ＲＮＡ　ハイブリッドに、Ｒ
ＮａｓｅＨ。

ＤＮＡポリメラーゼＩおよびリガーゼを作用させてｍＲ
ＮＡを取除き二本鎖ｃＤＡＮ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）を構築
した。

３、３゛　　端にオリゴｄＣ尾を　するｄｓ−ｃＤＮＡ
の構築上記２．で得られたｄｓ−ｃＤＮＡに末端デオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を作用
させてｄｓ−ｃＤＮＡの３°末端にオリゴｄＣを付加さ
せた。

即ち、３　ｐｇ　ｄｓ−ｃＤＮＡをＴｄＴ緩衝液（１０
０ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ　７．２）、２ｍＭ塩
化コバルト、０。

２ｍＭジチオスレイトール〕と０．２ｍＭ　ｄＣＴＰを
含む反応液に溶解し、３７℃５分間前処理を行い、次い
で５０単位のＴｄＴを加え、３７℃１５分間反応を進行
させ、その後ＥＤＴＡが終濃度４０ｍＭになるように加
え、氷上に置き、フェノール・クロロホルム混液を加え
、ＴｄＴを変性失活させ、変性不溶化蛋白質を遠心除去
、上清をフェノール抽出、冷エタノール沈澱操作後、該
沈澱物を７０％エタノールで洗浄後減圧乾燥を行い、３
゛末端オリゴｄＣ付加ｄｓ−ｃＤＮＡを得た。

４、バイブリドプラスミドの構築 （ｐＵｃ９（オリゴｄｃ尾ををする）分子とｄｓ−ｃＤ
ＮＡ（オリゴｄｃ尾を有する）分子との結合） 前記の３．で得られたオリゴｄＣ付力ｆｆｄｓ−ｃＤＮ
Ａ　とプラスミドｐＵｃ９　（オリゴｄＧ尾付加。Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社（スウェーデン）より容易に入手可能
）分子とをｄＣ−ｄＧホモポリマー法として公知の方法
であるマニアティス法に準する方法で結合させた。

１、　−＋　　　　’　−−　　　ｔ　　’Ｐｅ−　−
５、ノ　云Ｉおよびクローンの′ｆ択 上記４．で得られたハイブリッドプラスミド（オリゴｄ
Ｇ付加ｐＵｃ９分子とオリゴｄＣ付加ｄｓ−ｃＤＮＡ分
子とからなる）をＣａＣ１ｚ処理した大腸菌にコンピテ
ント法で導入した。

約４万個の形質転換体のコロニーを得た後、後記の参考
例３に記述した方法に準じたコロニーハイブリダイジエ
ション法で、細胞の選択を行った。

その結果、陽性のコロニーの中から、プラスミドを抽出
し精製し、更に各種の制限酵素で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動によってＤＮＡ断片の大きさを調べた。

上記５．で得られた形質転換体からプラスミドルＳ間お
よびｐｓｓｌｌｌを得た。

つまり　ＰＡＬｍＲＮＡの完全なｃＤＮＡは、ｐＳＷ２
およびｐｓＷｌｌを組み合わせることにより可能なこと
が明らかとなったので、それぞれを含有する形質転換細
胞からプラスミドを抽出し精製し、制限酵素ＢａｎＩＩ
Ｉで切断後、ｐＳＷ２においては、制限酵素旧ｎｄ■で
切断し、アガロースゲル電気泳動による分画を行ない、
４．２Ｋｂの大きさのＤＮＡｌｉ片を回収してフェノー
ル・クロロホルム混液処理と冷エタノール沈澱操作をそ
れぞれ数回繰返して精製した。

一方、ρ５−１１は制限酵素Ｂａｎｎ１および旧ｎｄｌ
ｌ［で切断後、電気泳動により０．９ｋｂのＤＮＡ断片
を回収し精製した。

４．２Ｋｂおよび０．９ｋｂのおのおのＤＮＡ断片をリ
ガーゼにより環状にし、該生成物で大腸菌を形質転換し
た。

マーカーとしたアンピシリン耐性の転換体からプラスミ
ドを抽出し、各種の制限酵素を作用させて切断地図を作
成し、第１図に示した制限酵素切断地図の構造を有する
正しいＰＡＬ構造を有するｐＳＳｉ２０選択した。

７、クローンヒＤＮＡの声　配置のン 上記のプラスミドｐｓＷ１３を含むクローンから、その
プラスミドｐｓＷ１３を単離し、そのクローン化ＤＮＡ
断片・を種々の制限酵素で分解し、適当な制限酵素断片
についてそれぞれのＤＮＡのヌクレオチド配列分析をマ
クサム−ギルバート法（化学分解法）により、また、マ
ート法（参考文献１９）によるＤｉｄｅｏｘｙ法により
生化学的に行った。

得られたそれぞれのＤＮＡ断片の塩基配列の結果はコン
ピューター処理によりＤＮＡｆｆ１集を行い、その塩基
配列は後に示したＰＡＬの構造遺伝子を含むｃＤＮ＾の
塩基配列の通りであった。

８、姐社虹曳撓因（第１図参照） プラスミドｐＵｃ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）０．
９４に１０単位の制限酵素５ａｉｌを１４超の反応液（
７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、０．７ｍＭ　
ＥＤＴＡ、７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１７５ｍＭＮａＣ１，
７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．０１χウシ血
清アルブミン（以下ＢＳＡと略す））中で、３７℃１６
時間作用させ、フェノール・クロロホルム混液処理、エ
タノール沈澱操作を行い、開環線状ＤＮＡを得り。　該
線状ＤＮＡをニック・トランスレーション緩衝液（５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣｈ、０、１ｍＭジチオスレイトール、２χＢＳＡ、
　ｓｏｐＭｄＡＴＰ、８０超ＭｄＧＴＰ、　８０．Ｍ　
ｄＴＴＰ　、　８０βｄＣＴＰ）の存在下で、ＤＮＡポ
リメラーゼクレノフ断片（宝酒造０菊製）を室温で３０
分間作用させ、接着末端を平滑末端にした後、フェール
で除蛋白を行い、冷エタノールでＤＮＡを沈澱回収した
。このＤＮ＾断片に子牛肺臓由来リン酸ジェステラーゼ
（ＣＩ　Ｐ　：ベーリンガ社製）を作用させ、５゛末端
のリン酸基を除去し、線状ｐＵｃ１３の自己閉環を防い
だ。

一方ｐｓＷ１３を含有する細胞から、このプラスミドを
抽出し精製し、制限酵素Ｄｒａ　Ｉを反応液Ａ（４ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　０．４ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭＮａＣ１）中３７°Ｃで２８時
間作用させ、ついで食塩液を加えて食塩濃度を１００ｍ
Ｍとし、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄ［を３７℃で
１６時間作用させた。

反応終了液をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３Ｋ
ｂの大きさのＤＮＡ断片をゲル中から回収し、フェノー
ル抽出、フェノール・クロロホルム混ｆＦｉ処理、冷エ
タノール沈澱をそれぞれ３回繰返して後にＰＡＬｃＤＮ
Ａ断片を得た。

該ｃＤＮＡ断片に前述のニック・トランスレーション緩
衝液を加え、ＤＮＡポリメラーゼクレノフ断片を室温で
４５分間作用させ、フェノール・クロロホルム混液処理
、冷エタノール沈澱操作をそれぞれ３回繰返し、平滑末
端を両端に有するｃＤＮＡ断片を得た。

平滑末端を存するｐＵｃ１３断片と平滑末端を有するｃ
ＤＮＡ断片とをリガーゼで結合し、環状プラスミドルＳ
誓１０１を構築した。

このハイブリッドプラスミドＤＮＡを大腸菌に公知の方
法で形質転換し、アンピシリン耐性コロニーから細胞（
ＭＴ−１０４１０，ＦＥＲＭ　Ｐ−８８３４）を選び出
し、ＰＡＬ活性を測定した。

９、Ｙｔｒｐ６の構築　び形　転換 実施例８．に記述した方法で構築したｐｓＷｌｏｌをＰ
ｓ口及びＢａｍ旧で消化し、アガロースゲル電気泳動後
、３７０ｂｐのＩ）ＮＡ断片を回収し、それを２分し、
それぞれＢａｎ１およびＢｂｅｌで消化した。

消化後アクリルアミドゲル電気泳動により、Ｂａｎ　Ｉ
消化のものからは７ｏｂｐの大きさの断片を回収し、Ｂ
ｂｅｌ消化のものからは２８０ｂρの大きさのＤＮＡ断
片を回収した。

７０ｂｐの断片はＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、
Ｃ１ａｌ　（Ｂａｎ　ｍ　）　　リンカ−をリガーゼで
結合させた。

Ｃ１ａｌリンカ−を両端に結合したＤＮＡ断片をＢａｎ
　ｍ及びＢｂｅｌで消化し、先に調製したＢｂｅｌ断片
（２８０ｂｐ）およびｐＢＲ３２２をＢａｎ　ｍおよび
ＢａｍＨＩで消化して、アガロースゲル電気泳動により
４．ＯＫｂのＤＮ＾断片を回収したものとをリガーゼで
結合し、９ＳＹＡ１を得、これを大腸菌に公知のカルシ
ウム法で形質転換した。

実施例６．で構築したｐｓＷ１３をＸｂａｌで消化し、
粘着末端をＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、Ｈｉｎ
ｄｌＩＩリンカ−をリガーゼで結合して、ｐｓＷ１３Ｈ
を構築し、大腸菌に公知゛の方法で形質転換した。

ｐｓＹＡｌを含む大腸菌から公知の方法でｐｓＹＡｌを
抽出し、ＢａｍＨＩおよびＢａｎ　ｍで消化し、３５０
ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。

ｐｓＷ１３Ｈを含む大腸菌から公知の方法でｐｓＷ１３
１１を抽出し、抽出したｐｓＷ１３ＨをＢａｍ）Ｉ　Ｉ
および旧ｎｄＩＩ［で消化し、アガロースゲル電気泳動
により１．９Ｋｂの大きさのＤＮへ断片を回収した。

次に参考例５に記述した方法により構築したｐＦ　ｔｒ
ｐ２をＢａｎ　ＩＩＩおよびｔｌｉｎｄＩ［［で消化し
、アガロースゲル電気泳動により４．７Ｋｂの断片を回
収し、３５０ｂｐのＢａｍ１ｌ　Ｉ　＋　Ｂａｍ　ＩＩ
［断片および１．９ＫｂのＢ　ａ　ｍ　Ｉｔ１＋Ｈ４ｎ
ｄＩ［［断片をリガーゼで閉環し、ｐＳＹＡ２を構築し
た。

ｐＳＹＡ２をＢａｍＩＩＩで部分消化して生じた粘着末
端をＤＮＡポリメラーゼを用い平滑末端としりガーゼで
閉環しＮｒｕ　Ｉ切断点を有するｐＹｔｒｐ６を創製し
た。

ｐＹ　ｔｒｐ６を大腸菌に公知の方法で形質転換し、ア
ンピシリン耐性のコロニーから細胞を選び出し、ＰＡＬ
活性を測定した。ｐＹ　ｔｒｐ６の構築のフローシート
を第２図に示し、詳細を第３図より第５図に示す。ＰＡ
Ｌ活性を示す大腸菌形質転換株を肘−１０４１４（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−８８７６）とした。

１０、ＫＹ２０１の構築及び形　転換。

実施例９で造成したρＹｔｒｐ６をＮｒｕ　Ｉで消化後
、ＣＩＰ処理を行い、旧ｎｄＩＩ［リンカ−をリガーゼ
で結合し、旧ｎｄＩＩ［で消化後、アガロースゲル電気
泳動により、２，３ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。

一方、Ｇ、ＡｍｍｅｒｅｒのＡＤＨＩ（アルコール脱水
素酸素■）を含む大腸菌とパン酵母のいずれにも機能す
るシャトルペククーＡＩＩＨ５（参考文献１３）をＨｉ
ｎｄ　ｍで消化し、ＣＩＰ処理を行い、ｐＹ　ｔｒｐ６
より調製した２、３ＫｂＤＮＡ断片をリガーゼを用いて
挿入し、プラスミドを構築した。

このプラスミドで大腸菌をコンピテント法で形質転換し
、アンピシリン耐性を示す細胞からプラスミドを公知の
方法で抽出し、正しい方向に挿入されているプラスミド
を選定した。

正しい方向に挿入されたとシーケンスが解析されたプラ
スミドをｐＫＹ２０１とした。このｐＫＹ２０１をパン
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）のし−ロイシン要求株（ｌｅｕ　２）をＫｌ法（
参考文献２０）により形質転換を行い、Ｌ−ロイシンを
含まない合成培地ＹＡＬ寒天培地（Ｂａｃｔｏ　　Ｙｅ
ａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　０゜６７χ、グ
ルコース０．５χ、硫酸アデニン０．００５χ、Ｌ−Ｉ
Ｊ　シフ　０．０５％、寒天１．５Ｘ）上に植菌し、２
５℃で３日間培養を行い、生育してきたコロニーから細
胞を分離し、ＰＡＬ活性を測定した。ＰＡＬ活性を示し
た細胞株をＭＴ−４０３９０（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８７５
）とした。

１１、形　転換体からＰＡＬの製造 形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉ、ＭＴ−１０４１４）をアン
ピシリン０、１ｍｇ／ｍｌ）添加ＬＢ培地に植菌し、３
５℃で１０時間振盪培養を行い、インドールアクリル酸
をエタノールに１０ｍｇ／ｍｌに溶解した溶液を培養液
中のインドールアクリル酸濃度が０．０２ｍｇ／ｍｌに
なるように無菌的に添加した。

インドールアクリルを添加した後、３５℃で６時間振盪
培養を行なった。

この後培養液から菌体を遠心分離して回収した。

菌体を０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）
に懸濁し、０．２５ｖｎ径のガラスピーズを加えダイノ
ミル（ＫＤＬ型）で破砕した。

処理液は遠心して残渣と上澄液に分離し、上澄液に硫安
を加えて塩析し、生じた沈澱を更に０．１ＭＴｒｉｓ−
塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に溶解し、ＤＥＡＥ−セルロ
ーズカラムクロマトグラフィーによってＰＡＬ活性区分
をとり、ゲル濾過で精製しＰＡＬ活性区分を濃縮し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による分子量測定、ＰＡ
Ｌ特異抗体を用いたイムノグロブリン法及び等電点電気
泳動による等電点測定を行った・ ＰＡＬ活性化区分蛋白はＰＡＬ特異抗体と抗原抗体反応
を行い、またｓｐｓ電気泳動法による分子量は約７７　
、０００であり等電点はｐｌ・５．５であった。

このイ直はＲｏｊＯｒＨｌｏｉｄｅｓのＰＡＬと一敗し
たのでこの結果からＰＡＬの生成を確認した。

１２、形　転Ｉ体をもちいたＬ−フェニルアラニンの型
造 Ｍ９培地（（ＮａｚＨＰＯ４６ｇ　、　ＫＨｚＰＯ４３
ｇ　、　ＮａＣｌ　０゜５ｇ　、　ＮＨ４Ｃｌ　Ｉｇを
蒸留水１１に溶解し、ｐＨ７，５にＫＯＨで調整後、オ
ートクレーブ殺菌（１２０℃、１０分間）処理〕１１に
２ｍｌのＩＭ−ＭｇＳＯ４，１０ｍ１の２０％グルコー
ス水溶液及びＯ，１ｍｌのＩＭ−ＣａＣ１ｚを０．２２
μｍ径のフィルター（ミリボア製：　ＭＩＬＬＥＸ　　
−ＧＳ）で除菌濾過して加え、ついでアンピシリンを０
．１ｍｇ／ｍｌになるように添加し、形質転換株（Ｅ、
ｃｏｌｉ：ＭＴ−１０４１４）を植菌した。

植菌後の培地は３７℃で６時間通気攪拌培養を行い、イ
ンドールアクリル酸をエタノールに１０ｍｇ／＊ｌに溶
解した溶液を培養液中のインドールアクリル酸濃度が０
．０２ｍｇ／ｍｌになるように無菌的に添加した。

インドールアクリル酸添加後、３７℃で４時間通気攪拌
培養を！続した。

所定時間後、培養液を遠心分離機にて処理し、培養菌体
を得た。

培養菌体５ｇを、４ｇの桂皮酸を９０＋ｎｉ！のアンモ
ニア水に溶解し硫酸を加えてｐｏｉｏ、ｏとし蒸留水を
加えて１９５ｍ１とした反応液に加え、３０℃に保ちゆ
るやかに攪拌しながら２０時間酵素を作用させた。

所定時間後、該反応液を遠心分離にて除菌後得た除菌上
清液を減圧下で濃縮し、濃縮液に硫酸を加えてｐＨ１，
５〜１．８とした。

硫酸酸性で生じた未反応桂皮酸の沈殿を濾別除去し、濾
液をアンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ”　”）　カラム
に導入した。濾液を導通後、樹脂カラムを水洗し、０．
２５Ｎ−アンモニア水で逆洗浄し、溶出液を回収し、蒸
発乾固させ粗Ｌ−フェニルアラニン２．８ｇを得た。

尚Ｌ−フェニルアラニンの同定はアミノ酸分析計によっ
た。

１３、形　転換　をもちいたし−フェニルアラニンの製
盈 合成培地ＹＡＬ（Ｂａｃｔｏ■　Ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒ
ｏｇｅｎ　ｂａｓｅＯ１６７χ、グルコース１．０χ、
硫酸アデニン０゜００１χ、Ｌ−リジン０．００５χ）
を０．４．１７　ｍ径無菌フィルターで除菌濾過し、坂
ロフラスコに２００ｍ１づつ分注した。この培地に形質
転換株（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＭＴ−４０３９０）
を植菌し、２５℃にて４４時間震盪培養を行った。

培養液４１を遠心分離して菌体を集菌し、冷水で洗浄し
て洗浄菌体を得た。

洗浄菌体Ｌｏｇを、４ｇの桂皮酸を９０ｍ１のアンモニ
ア水に溶解し塩酸を加えてｐＨ９，５とし蒸留水を加え
て１９０ｍ１とした反応液に加え、ゆるやかに攪拌しな
がら３０℃に保ち、３６時間反応させた。

所定時間後、反応液を減圧下で濃縮し、濃縮液に塩酸を
加えてｐＨ２以下とした。この溶液を１０℃に９時間保
ち、沈殿した未反応の桂皮酸及び不溶した菌体を濾別除
去し、濾液にリン酸トリブチルを等量加えて桂皮酸を抽
出した。

抽出後の水層は減圧下で濃縮乾固して固形分４ｇを得た
。この固形分を希塩酸に溶解し活性炭１ｇを加えて９０
℃で１０分間加熱後。濾過して活性炭を除去し、清澄な
溶液を得た。

この溶液をアンモニア水でｐＨ６，０とし、冷却して結
晶としてＬ−フェニルアラニンを得た。この結晶を濾別
後、濾液を濃縮し再び冷却して生成した結晶を回収して
、先のＬ−フェニルアラニンの結晶と合わせ、減圧乾燥
を行い、結局Ｌ−フェニルアラニン２．０ｇを結晶とし
て得た。

ロドスポリジウム、トルロイデスの染色体ＤＮＡをギル
バート等（参考文献２１）の方法に準じて調製した。す
なわち、該微生物から染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素
ＰｓｔｌおよびＢｃｌ　Ｉにて該染色体ＤＮＡを切断後
、アガロースゲルによる電気泳動に供し、５．６ｋｂの
大きさのＤＮＡ断片をゲルから電気透析法により回収し
た。

該ＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２を制限酵素ＰｓｔＴで切断
した生成物にリガーゼで挿入しＰＡＬ染色体ＤＮＡを含
むｐＢＲ３２２ハイブリッドプラスミドを組み立てた。

該ハイブリッドプラスミドで大腸菌を形質転換し、形質
転換大腸菌を得た。形質転換細胞から迅速プラスミド抽
出法（参考文献２２）により、プラスミドＤＮＡを抽出
精製し、これに各種制限酵素を作用させ、プラスミドの
構造を調べた。

参考例２３２Ｐ−標識化したＰＡＬ一本（ｃＤＮ＾の合
成実施例の２．に記述した方法によりＰＡＬｍＲＮＡか
ら一本鎖ｃＤＮＡを合成するに際して、反応液中のｄｃ
ＴＰの替わりにＣＸ−”Ｐ−ｄｃＴＰを用いて、２Ｚｐ
で標識した一本鎖ｃＤＮＡを得た。

この標識一本積ｃＤＮＡにＲＮａｓｅ）ｌを作用させて
、ｍＲＮＡを消化後、フェノール処理、冷エタノール沈
澱法によりＤＮＡを回収した。該一本積ｃＤＮＡは参考
例３のプローブとして用いた。

参考例３　　ＰＡＬ染色　ＤＮＡとＰＢＲ３２２とのハ
イブリッドプラスミドを人有するノ　転　　腸菌の羊出
参考例１に記述した方法により得られた形質！転換大腸
菌を参考例２の方法で調製したｆｆ２ｐ−標識一本鎖ｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａをプローブとして、コロニーハイブリタイ
ジエーションを行なった（参考文献２３）。

形質転換大腸菌から陽性のコロニーを選び出し、該コロ
ニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し精製し
、該プラスミドに各種制限酵素を作用させて、アガロー
スゲル電気泳動を行い、プラスミドの制限酵素切断図を
作成した。

また、該プラスミドにＰＡＬをコードする遺伝子が挿入
されていることを確認するため、該プラスミドを制限酵
素ＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後３Ｋ
ｂの大きさのＤＮＡ断片を回収し、肺臓ＤＮａｓｅ　Ｉ
　、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、α−”ｐ−ｄｃＴＰ
を用いたニックトランスレーション法により　２ｔｐ標
識ＤＮＡプローブを調製した。

一方、実施例１に記述した方法で調製したｍＲＮＡをグ
リオキザール処理を行い変性させ、アガロースゲル電気
泳動に供した。

電気泳動後、ゲルからｍＲＮＡをナイロンペーパーに転
写し、これを前述の３２Ｐ標識［ＩＮＡプローブを用い
たノーザン・ハイブリダイジェーションに供しく参考文
献２４）でハイブリッドプラスミドにはＰＡＬ遺伝子が
含まれることがｂＩＵｚできた。

参考例３に記述した方法で確認されたＰＡＬ染色体ＤＮ
＾を含むハイブリッドプラスミドを形質転換大腸菌から
抽出、精製し、該ハイブリッドプラスミドに各種の制限
酵素を作用させた後、アガロースゲル電気泳動を行い、
分画ＤＮＡ断片をサチン法でニトロセルロースフィルタ
ーに転写し、参考例２の方法で調製した３ｔｐ−標識Ｐ
ＡＬ一本鎖ｃ末鎖Ａをプローブとして、ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイプリダイジェーションを行った。

参考例５　トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター領笠
■凰文工 大腸菌のｔｒｐオペロンの一部を含有するプラスミドｐ
ＶＶｌに制限酵素旧ｎｆｌを作用させて、プラスミドｐ
ＶＶ１を消化した。

該消化プラスミドＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動
で分離し０．９ｋｂの大きさのＤＮＡ断片をゲルから実
施例１に記述した方法で回収した。

０．９ｋｂのＤＮＡ断片の旧ｎｆｌで生じた接着末端を
実施例の８．に記述した方法で平滑末端とした後、Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）をリガーゼで平滑
末端の５゛末端に結合した。

ＥｃｏＲＩリンカ−結合ＤＮＡ断片に制限酵素ＥｃｏＲ
１を作用させ、ＥｃｏＲＩ切断接着末端付加ＤＮＡ断片
を創製した（参考文献２５）。

該ＥｃｏＲＩ接着末端付加ＤＮ＾断片とｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲ■消化物を実施例の８．に記述した方法でＣＩ
Ｐ処理を行ったものをリガーゼにより結合し、該結合生
成物を制限酵素ＥｃｏＲＴおよびＢｇｌ　ＩＩで消化し
、消化生成物をアガロースゲル電気泳動で分離して、０
．４ｋｂの大きさをもつＤＮＡ断片を回収した。

該ＤＮＡ断片には制限酵素Ｔａｑ　Ｉの切断箇所が３箇
所含まれるが、該ＤＮＡ断片をＴａｑ　Ｉで部分的：こ
消化して３４５ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。

該３４５ｂｐＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩお
よびＣ１ａ　　Ｉで消化して得られる４、３ｋｂのＤＮ
Ａと結合し、　ｔｒｐプロモーターを含有するプラスミ
ドｐＦ　ｔｒｐ２を得た。

参考例６　　ＰＡＬ活性の測定ノ法 ＰＡＬ産生能を有するプラスミドを含む微生物を培養し
、必要によりプラスミドのプロモーターの機能を高める
誘導処理を行った後に培養した微生物は集菌した。

その菌体は超音波処理、ガラスピーズ破砕等の機械的細
胞壁破壊又は溶菌酵素や界面活性剤を作用させる化学的
方法で細胞内酵素類を可溶化した。

この後遠心分離によって上澄部を得てこれを試料とした
。

ＰＡＬ活性はＬ−フェニルアラニンから桂皮酸を生成す
る酵素反応に示されるので、上澄液を２５ｍＭ　）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，８）で希釈し、その希釈液１．
０ｍｌ！を酵素反応液（全量は５．０ｒｎ１であり、ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，８）を２５ｍ門、Ｌ−フェ
ニルアラニンを１０ｍＭ含む）に加えて、３０℃で２０
分間反応させて検討した。

この後１ｍｉ！のｌＮ−ＨＣｌを加えて反応を停止させ
、生成した桂皮酸を、液体クロマトグラフィーによって
測定した。

液体クロマトグラフィーは、分離カラムとしてカラムＹ
ＭＣパンクＡ−３１２（山村化学研（製）を用い、検出
器には紫外分光光度計を検出波長２６０ｎｍで用いた。

Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｇ
ｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＧｌｙＳｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｔｙｒ　　ＣｙｓＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ
　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ
　　Ｌｅｕ　　Ａｌａｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１０ＡＴＧ　　ＧＣＡ　　
ＣＣＣＴＣＧ　　ＣＴＣＧＡＣＴＣＧ’ＡＴＣＴＣＧ　
　ＣＡＣＴＣＧ　　ＴＴＣＧＣ八　八ＡＣＧＧＣＧＴＣ
ＧＣＡ　　ＴＣＣＧＣＡ　　ＡＡＧＣＡＧ　　ＧＣＴ　
　ＧＴＣＡＡＴ　　ＧＧＣＧＣＣＴＣＧ　　ＡＣＣＡＡ
ＣＣＴＣＧＣＡ　　ＧＴＣＧＣＡ　　ＧＧＣＴＣＧ　　
ＣＡＣＣＴＧ　　ＣＣＣＡＣＡ　　ＡＣＣＣＡＧ　　Ｇ
ＴＣＡＣＧ　　ＣＡＧ　　ＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧ
ＡＧ　　ＡＡＧＡＴＧ　　ＣＴＣＧＣＣＧＣＧ　　ＣＣ
Ｇ　　ＡＣＣＧＡＣＴＣＧ　　ＡＣＧ　　ＣＴＣＧＡＡ
　　ＣＴＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＴＣＧ　　ＣＴＣＡＡＣ
ＣＴＣＧＧ八へＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧ　　ＧＣＣＧＣ
Ｇ　　ＡＧＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧＣＡＧＧＣＣＴ　　Ｇ
ＴＣＣＧＣＧＴＣＡＡＧ　　ＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧ
　　ＡＴＣＣＧＣＴＣＡ　　へへＧ　　ＡＴＴ　　ＧＡ
ＣＡＡＡ　　ＴＣＧ　　ＧＴＣＧＡＧ　　ＴＴＣＴＴＧ
　　ＣＧＣＴＣＧ　　ＣＡＡ　　ＣＴＣＴＣＣＡＴＧ　
　ＡＧＣＧＴＣＴＡＣＧＧＣＧＴＣＡＣＧ　　ＡＣＴ　
　ＧＧＡ　　ＴＴＴ　　ＧＧＣＧＧＡ　　ＴＣＣＧＣＡ
ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＧ　　ＧＡＣＧＣＣＡＴ
ＣＴＣＧ　　ＣＴＣＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
１３１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１ａｎ八Ｉａ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　
　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　
　ＬｅｕＨｉｓ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａｇｒｇ　　Ａｒ
ｇ　　１ｎｒ　　ｌｈｒ　　（ｉｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ５２１　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ζ９ｎＲ
ｒｇ　１Ｊｌｕ　　１ｌｌｒ　　ｔ’ｈｅ　’ｒｒｐ　
Ｓｅｒ　　Ａｌａ　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　ＴｈｒＣＡＣＴ
ＣＴＣＧＣＡ　　ＴＣＣＣＴＴＣＣＡＴ　　ＡＣＣＣＴ
ＡＴＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＴＡＧＧＡＣＴＣＧ
　　ＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧ　　ＧＡＣＴＣＧＧＡＴＣ’
ＴＣＧＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣ
ＴＧＣＣＴ　　ＣＴＣＴＡＧＡＣＣＧ　　ＴＧＴＣＧＧ
ＴＡＴＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＴ　　ＴＧＴＧＡＡＴＡＣ
Ａ　　ＡＧＣＡＧＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡ八ＡＡ
ＡＡＡＡＡへ−−ＡＡＡ ４、　特開昭６０−９１９８７号公報 ｗｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ、ＩＩＪＩ、　　Ｌｂｂ、（１’
１３〕　」

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｓｗ　１０１を構築する手順のフローチャー
トである。 第２図はｐＹｔｒｐ　６の構築フローチャートである。 第３図、第４図及び第５図はそれぞれ第２図に示したフ
ローチャートの内の１部分を詳しく示したｐＹｔｒｐ６
の構築フローチャートである。 第６図はｐＫＹ　２０１の構築のフローチャートである
。 特許出願人　　三井東圧化学株式会社 図　　　面 Ｅｅｏ　Ｒ１ 第　　２　　　　図 第３図 第　　４　　図 第　　５　　図 ｉｎｄ１１ 手続（甫正書（自発） 昭和６２年１０月９日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殴 Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリアーゼのアミノ酸
配列、その構造遺伝子、これを含む新たなベクター、こ
れによる形質転換体及びこれを用いるＬ−フェニルアラ
ニンの製造方法。 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称（３１
２）　　三井東圧化学株式会社−４，補正により増加す
る発明の数　　零５、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
憫 ６、補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲を別紙のように訂正する
。 （２）明細書第１７頁下３行目に「まれ、翻訳開始領域
はシャインタルガー」とあるのを「まれ、例えば、宿主
が大腸菌の場合には、翻訳開始領域はシャインタルガー
」と訂正する。 （３）同じく第２１頁１３行目の「、もしくはＭＴ−４
０３９２（ｔｒｐｌ）　ｊを削除する。 （４）同じく第２４真下９行目に「２７°Ｃにて震盪撹
拌を」とあるのを「２７°Ｃにて２時間震盪撹拌を」と
訂正する。 （５）同じく第２４真下７行目に「無処理の菌体及び２
時ＩＨ１誘導処理」とあるのを１２時間誘導処理」と訂
正する。 （６）同じく第２８頁の９．１２．１４および１６６行
目それぞれｒｃＤＡ）ｊ」とあるのをいずれも’　ｃＤ
ＮＡ　Ｊと訂正する。 （７）同じ（第３１真の７および９行目にｒｏ、９ｋｂ
　Ｊとあるのをいずれもｒｏ、８ｋｂ　Ｊと訂正する。 （８）同じく第３７真下４〜３行目に「硫酸アデニン０
．００５χ、Ｌ−リジン０．０５χ」とあるのを「硫酸
アデニン　０．００１χ、し−リジン０．００５χ、ウ
ラシル０．００１χ」と訂正する。 （９）同じく第３９頁５行目にｒ　ｓｐｓ電気泳動法」
とあるのをｒ　ＳＤＳ電気泳動法」と訂正する。 ００）同じく第４１頁６〜７行目に「硫酸アデニン０．
００１χ、し−リジン０．００５χ」とあるのを「硫酸
アデニンｏ、ｏｏｉχ、Ｌ−リジンｏ、ｏｏｓχ、ウラ
シル０．００１χ」と訂正する。 ００同じく第３７真下４〜３行目に「 ０２１同じく第５７真下１２行目の塩基配列の終わりの
部分がｒ　ＴＣＧＣＡＴＧＧＣＴ　Ｊとあるのをｒ　Ｔ
ＣＧＣＡＴＣＧＣＴ　Ｊと訂正する。 以上 別紙 「２、特許請求の範囲 １）アミノ酸配列が Ｍｅｔ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅ
ｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　ＨｉｓＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　
Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙ
ｓＧｌｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　
Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＬｅｕＡｌａ　Ｖａｌ＾ｌａ
　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　
ＴｈｒＧｌｎ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｓ
ｐ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＭｅｔ　Ｌｅｕ　
Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ
　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＡｓｐ　Ｖ
ａｌ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　　−Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖ
ａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ｌ１
ｅ０Ａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　
Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅｌｏｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　　１１０Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａ
ｌａ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ
　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＧｌｎ　Ｌｙｓ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅ
ｕ　ＣｙｓＧｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　
Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＡｒｇ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ
　Ｓｅｒ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖ
ａｌ＾ｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ１ｉｅ　
Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａ
ｒｇ　Ｇｌｙ　ＨｉｓＳｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ
　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａＬｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　
Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　ＴｈｒＰｒｏ　　Ｉｌｅ　Ｖ
ａｌ　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　　
Ｉｌｅ　５ｅｒ＾１ａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ１１ｅ　
Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ旧ｓ
　Ｐｒｏ　ＡｓｎＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｖ
ａｔ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＧｌｕ
　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　
Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ＾１ａ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　
　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　
　Ｖａｔ　　ＬｅｕＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　
Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　　ＡｓｎＧ
ｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｔ　　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓ
ｅｒ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　ＴｈｒＬｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｉ
＋　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ
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　　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇであるロドスボリジウム・
トルロイデス由来のＬ−フェニルアラニン・アンモニア
リアーゼ。 ２）Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリアーゼ構造遺
伝子であって、次に示す１から７１６までのアミノ酸を
この順序にコードしている次に示した塩基配列。 Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｍ
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ａ　５ＴＯＰ３）塩基配列が、特許請求の範囲第１項に
記載の１から７１６までのアミノ酸をこの順序にコード
する、特許請求の範囲第２項に記載の塩基配列と実質的
に構造遺伝子として同じ機能を有するＬ−フェニルアラ
ニン・アンモニアリアーゼ構造遺伝子。 ４）Ｃ−末端に停止コドンを有する特許請求の範囲第２
項又は第３項に記載の塩基配列。 ５）停止コドンの少なくとも一つがＴＡＧ若しくはＴ丁
Ａである特許請求の範囲第４項記載の塩基配列。 ６）酵母ロドスボリジウム・トルロイデスをＬ−フェニ
ルアラニン・アンモニアリアーゼ誘導条件下に培！し、
この細胞からＬ−フェニルアラニン・アンモニアリアー
ゼｍＲＮＡを含む両分を分離し、逆転写酵素を用いてこ
のｍＲＮＡから単１１ｃＤＮＡを作製し、これを２末鎖
ｃＤＮへに変換した後にこのＤＮＡをベクターに挿入し
、このベクターを宿主細胞に形質軸ｌ＾させ、ｃＤＮＡ
ライブラリーを作製し、このライブラリーよりＬ−フェ
ニルアラニン・アンモニアリアーゼ構造遺伝子をコード
するｃＤＮＡをクローン化することを特徴とするロドス
ボリジウム・トルロイデス由来のＬ−フェニルアラニン
・アンモニアリアーゼ構造遺伝子をコードするＩＩＮＡ
の製造法７）特許請求の範囲第１項に記載のアミノ酸配
列のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
鎖をプロモーター領域の３゛−末端とターミネータｉｉ
域の５°−末端との間に挿入してなる組換えＤＮＡ。 ８）新規な組換えＩＩＩＮＡであるｐＳＷ　１０１　。 ９）新規な組換えＤＮ＾であるｐＹ　ｔｒρ６゜１０）
新規なｍ換えＤＮＡであるｐＫＹ　２０１゜１１）特許
請求の範囲第７項に記載の組換えＤＮＡを含有する形質
組換体であることを特徴とするＬ−フェニルアラニン・
アンモニアリアーゼ産生能を有する微生物。 １２）新規な大腸菌？１Ｔ−１０４１０又はＭＴ−１０
４１４゜１３）新規なパン酵母ＭＴ−４０３９０。 １４）特許請求の範囲第１１項から１３項までのいずれ
かに記載の形質組換体を培養し、培養物中にＬ−フェニ
ルアラニン・アンモニアリアーゼを生成蓄積させること
を特徴とするＬ−フェニルアラニン・アンモニアリアー
ゼの製造法。 １５）特許請求の範囲第１１項から１３項までのいずれ
かに記載の形質組換体を培養し、培養物中にＬ−フェニ
ルアラニン・アンモニアリアーゼを生成蓄積させこれに
アンモニア供与体と桂皮酸とに作用させることを特徴と
するＬ−フェニルアラニンの製造方法、」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ酸配列が 【遺伝子配列があります】 であるロドスポリジウム・トルロイデス由来のＬ−フェ
   ニルアラニン・アンモニアリアーゼ。 ２、Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリアーゼ構造遺
   伝子であって、次に示す１から７１６までのアミノ酸を
   この順序にコードしている次に示した塩基配列。 【遺伝子配列があります】 ３、塩基配列が、特許請求の範囲第１項に記載の１から
   ７１６までのアミノ酸をこの順序にコードする、特許請
   求の範囲第２項に記載の塩基配列と実質的に構造遺伝子
   として同じ機能を有するＬ−フェニルアラニン・アンモ
   ニアリアーゼ構造遺伝子。 ４、Ｃ−末端に停止コドンを有する特許請求の範囲第２
   項又は第３項に記載の塩基配列。 ５、停止コドンの少なくとも一つがＴＡＧ若しくはＴＴ
   Ａである特許請求の範囲第４項記載の塩基配列。 ６、酵母ロドスポリジウム・トルロイデスをＬ−フェニ
   ルアラニン・アンモニアリアーゼ誘導条件下に培養し、
   この細胞からＬ−フェニルアラニン・アンモニアリアー
   ゼｍＲＮＡを含む画分を分離し、逆転写酵素を用いてこ
   のｍＲＮＡから単鎖ｃＤＮＡを作製し、これを２本鎖ｃ
   ＤＮＡに変換した後にこのＤＮＡをベクターに挿入し、
   このベクターを宿主細胞に形質転換させ、ｃＤＮＡライ
   ブラリーを作製し、このライブラリーよりＬ−フェニル
   アラニン・アンモニアリアーゼ構造遺伝子をコードする
   ｃＤＮＡをクローン化することを特徴とするロドスポリ
   ジウム・トルロイデス由来のＬ−フェニルアラニン・ア
   ンモニアリアーゼ構造遺伝子をコードするＤＮＡの製造
   法。 ７、特許請求の範囲第１項に記載のアミノ酸配列のポリ
   ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ鎖をプロ
   モーター領域の３′−末端とターミネーター領域の５′
   −末端との間に挿入してなる組換えＤＮＡ。 ８、新規な組換えＤＮＡであるｐＳＷ１０１。 ９、新規な組換えＤＮＡであるｐＹｔｒｐ６。 １０、新規な組換えＤＮＡであるｐＫＹ２０１。 １１、特許請求の範囲第７項に記載の組換えＤＮＡを含
   有する形質組換体であることを特徴とするＬ−フェニル
   アラニン・アンモニアリアーゼ産生能を有する微生物。 １２、新規な大腸菌ＭＴ−１０４１０又はＭＴ−１０４
   １４。 １３、新規なパン酵母ＭＴ−４０３９０。 １４、特許請求の範囲第１１項から１３項までのいずれ
   かに記載の形質組換体を培養し、培養物中にＬ−フェニ
   ルアラニン・アンモニアリアーゼを生成蓄積させること
   を特徴とするＬ−フェニルアラニン・アンモニアリアー
   ゼの製造法。 １５、特許請求の範囲第１１項から１３項までのいずれ
   かに記載の形質組換体を培養し、培養物中にＬ−フェニ
   ルアラニン・アンモニアリアーゼを生成蓄積させこれに
   アンモニア供与体と桂皮酸とに作用させることを特徴と
   するＬ−フェニルアラニンの製造方法。