JP2507423B2 - Ｌ―フェニルアラニン・アンモニアリア―ゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なＬ−フェニルアラニン・アンモニア
リアーゼ（以下、PALと略記する）のアミノ酸配列であ
り、その構造遺伝子であり、特にそれがロドスポリジウ
ム トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）のも
のであり、更にそれが他の宿主原核細胞及び真核細胞微
生物において発現するために必要な部分をそれに結合し
た新規な組換えDNAプラスミドであり、更にその組換えD
NAプラスミドで形質転換した微生物であり、更にその微
生物を用いてＬ−フェニルアラニン・アンモニアリアー
ゼ及びＬ−フェニルアラニン（以下、Ｌ−Pheと略記す
ることがある）を製造する方法である。

産業上の利用分野 この発明はＬ−フェニルアラニンの製造に利用され
る。

従来の技術および発明が解決した問題点 ロドスポリジウム・トルロイデスのPALがＬ−フェニ
ルアラニンの製造に利用されることは知られている。

PALを製造する方法は、特公昭44-10753号公報および
特開昭58-86082号公報に開示されている。

特公昭44-10753号公報はロドトルラ属の微生物をＬ−
フェニルアラニンと接触させて該酵素を生産することを
教示し、特開昭58-86082号公報はロドトルラ属の微生物
をイソロイシン、バリン、ロイシンなどのアミノ酸と接
触させて該酵素の生産を誘導する方法を教示している。

これらの方法によりPALを生産する場合には高価なア
ミノ酸とPAL生産能を有する微生物とを接触させる必要
があり、工業化には技術的にかなり問題があった。

一方、最近の分子生物学の進歩により異種の微生物由
来の蛋白質をコードするDNA鎖を他種の微生物に導入
し、形質転換させることが可能となって来た。

この遺伝子工学的技術を応用すれば、PAL生産能を有
する微生物を高価なアミノ酸と接触させてPALの誘導を
計る必要がなくなり、微生物の培養の管理も容易となる
ことが期待できる。

しかし、PALの製造遺伝子およびアミノ酸配列につい
ては未だに報告がなされていない。

問題を解決するための手段 上記の問題を解決するために、本発明者らは次のこと
を達成し、本発明を完成した。

（１） PALアミノ酸配列が後に示す通りのシーケンス
であることをロドスポリジウム・トルロイデスにおいて
明らかにした。

（２） PAL構造遺伝子を、プロモーター領域の３′末
端に結合させてなる新しい組換えDNAプラスミド（pSW 1
01、pYtrp 6、pKY 201）を作出した。

（３） この新しい組換えDNAプラスミドにより形質転
換された形質転換体〔大腸菌MT-10410（FERM BP-171
0）、MT-10414（FERM BP-1712）及びパン酵母MT-40390
（FERM BP-1711）〕を作出した。

（４） この新しい形質転換体を培養し、培養物中にPA
Lを産生蓄積させる、新しいPALの製造法を確立した。

（５） この新しい方法で産生されたPALを利用してア
ンモニア供与体と桂皮酸とに作用させ、Ｌ−フェニルア
ラニンを製造する方法を確立した。

本発明で用いられるPAL構造遺伝子はいくつかの工程
を実行することにより得られるが、そのうち最も本質的
なものは次の通りである。

（１） PALのメッセンジャーRNA（mRNA）の単離および
精製。

（２） 該mRNAを二本鎖DNA（ds-cDNA）に変換。

（３） オリゴ・dC尾を付加したds-cDNAの構築。

（４） 該オリゴ・dC付加−ds-cDNAとオリゴ・dG尾を
付加したベクターとの結合によるハイブリッドプラスミ
ドの構築。

（５） 微生物の形質転換とクローンの選択。

（６） DNA配列の解析によるPAL構造遺伝子部の形質の
確認。

（７） PAL酵素活性の発現の確認。

PAL構造遺伝子は、各種宿主（例えば大腸菌、枯草
菌、パン酵母等）で増殖可能なベクター上にあってかつ
該宿主内で機能するプロモーター領域の３′末端に結合
させることにより、PALを発現させ得る組換えDNAプラス
ミドを構築することができる。

この場合のプロモーター領域は、RNAポリメラーゼが
結合することによってmRNA合成を開始させるのに必要な
部分を含んだ領域であればいかなるものであってもよ
い。

このプロモーター領域には、翻訳開始領域も含まれ、
例えば、宿主が大腸菌の場合には、翻訳開始領域はシャ
インタルガーノ（Shine-Dalgarno）配列又はリボソーム
結合部位として知られるmRNA上の塩基配列にリボソーム
が結合する部位から翻訳開始コドン（例えばATG）まで
を含み、シャイン−ダルガーノの配列から翻訳開始コド
ンまでの間隔は約10塩基が好ましい。

ターミネーター領域は宿主が大腸菌の如く原核生物で
あれば必ずしも必要とは言えないが、付加効果も知られ
ており、その宿主内で機能するターミネーター領域を有
する場合には、PAL構造遺伝子を、プロモーター領域の
３′末端とターミネーター領域の５′末端との間に挿入
すればよい。

例えば好ましいプロモーター領域として、トリプトフ
ァン（trp）プロモーター、乳糖（lac）プロモーター、
tacプロモーター、PLラムダプロモーター等があり、こ
れらのプロモーター領域を含むpBR322、pUC等のベクタ
ーが示される。

これらベクターを適当な制限酵素でプロモーター領域
３′末端部位を切断し同一粘着末端であればそのまま、
粘着末端のDNA塩基配列が合わなければ平滑末端を造成
し、リガーゼの作用により挿入すればよい。

なお、トリプトファンプロモーターについては後に一
括して示した参考文献１〜４があり、乳糖プロモーター
については参考文献５があり、tacプロモーターについ
ては参考文献６があり、PLラムダプロモーターについて
は参考文献７及び８があり更にターミネーター領域につ
いては参考文献９がある。

プロモーター領域の３′末端にPAL構造遺伝子を結合
させて構築した組換えDNAプラスミドは、公知の方法で
大腸菌を形質転換できる。

この形質転換は薬剤耐性、例えばアンピシリン耐性等
により、又は栄養要求性等の表現型として選択できる。
そしてこれらの表現型の細胞からさらにPAL活性を示す
細胞を選択する。

前述のようにして選択した形質転換は公知の方法で培
養する。培地としては、例えばブイヨン培地が、又はグ
ルコース若しくは他の栄養要求性に対応する物質を添加
した合成培地が挙げられる。

必要によりプロモーターを効率よく働かせるために
は、例えばイソプロピル−β−チオガラクトシド（IPTG
と略称する）もしくはインドールアクリル酸（IAAと略
称する）のような薬剤を加えることが出来る。

該形質転換体の培養は通常15〜43℃、好ましくは28〜
42℃で４〜48時間、好ましくは４〜20時間行い、必要に
より通気や攪拌を加えてよい。

パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）を宿主として
利用するときには、パン酵母の形質転換体を次のように
創製することができる。

大腸菌−酵母シャトル−ベクターYRp7（その取得法は
参考文献10）、およびpMA3a（取得法は参考文献11）等
パン酵母で機能するプロモーター領域、例えばグリセル
アルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモ
ーター領域（取得法は参考文献12）、あるいはアルコー
ルデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモーター領域（取得
法は参考文献13）等を挿入したのち、その３′末端側に
PAL構造遺伝子をコードするDNA断片をリガーゼで結合さ
せ、ついでアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のmRNA
の３′末非翻訳領域、あるいはグリセルアルデヒド３−
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のmRNAの３′末非翻訳領
域等を選択してPAL構造遺伝子の３′末にリガーゼで結
合させ、各mRNAの３′末非翻訳領域部をプラスミドと結
合して、該プラスミドを閉環する。閉環プラスミドを用
いて、公知の方法で大腸菌を形質転換する。

得られた形質転換体は、例えばアンピシリン耐性を表
現型として容易に選択が可能である。

該形質転換大腸菌の細胞よりプラスミドDNAをアルカ
リ抽出法に従って単離し、該プラスミドを用いて酵母の
栄養要求株、例えばMT-40391（leu2,trp1）を公知の方
法、またはそれらに準ずる方法によって形質転換する。

該形質転換酵母は宿主の栄養要求性の復帰により選ぶ
ことが可能である。

該形質転換酵母はそれ自体公知の培地で培養できる。
培地としてはアミノ酸無添加ウィッカム培地（参考文献
14）に該酵母の栄養要求物を添加し、グルコースを加え
た培地等が挙げられる。

該酵母の培養は通常15〜40℃で24〜72時間行い、必要
により通気や攪拌を加えることもできる。

微生物は培養後、公知の方法で培養液から菌体を集菌
し、集菌菌体を有機溶媒、界面活性剤等との接触もしく
は超音波、ガラスビーズ等による機械的処理もしくは微
生物に対する溶菌酵素、自己消化などの生化学的処理等
により細胞壁等を損傷して、培養菌体細胞内に生産蓄積
されたPALを抽出することができる。

上記のような方法で処理した処理物、又は培養後の集
菌菌体等を用いて公知の方法、例えば、特開昭56-26197
号公報に開示された方法で酵素反応を行えばＬ−フェニ
ルアラニンが得られる。

（発明の効果） 本発明により （１） PALのアミノ酸配列がロドスポリジウム・トル
ロイデスにおいて明らかにされた。（後記載のPALのア
ミノ酸配列参照） （２） PAL構造遺伝子をプロモーター領域の３′末端
に結合させてなる新しい組換えDNAプラスミド（pSW 10
1,pYtrp 6,pKY 201）が作出された。

（３） この新しい組換えDNAプラスミドにより形質転
換された形質転換体が作出された。

（４） この新しい形質転換体を培養し、培養物中にPA
L産生蓄積させる新しいPALの製造法が確立された。

（５） この新しい方法で産生されたPALを利用してア
ンモニア供与体と桂皮酸とに作用させ、Ｌ−フェニルア
ラニンを製造する新しい技術が確立された。

（実施例） 以下、実施例により、本発明を各段階に分けて更に詳
しく説明する。

1.mRNA（PAL）の単離および精製。

ロドスボリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium t
oruloides IFO 559、この菌はATCC 10788としても収載
されている。）を２％グルコースを含む合成培地（第１
表）で、27℃で通気攪拌培養を行い、培養初期に添加し
たグルコースを全て消費した直後に、菌体を遠心分離し
て集菌し、湿菌体を滅菌した0.85％食塩水で洗浄後再度
遠心分離を行い、湿洗浄菌体を得た。

該湿洗浄菌体は直ちにPAL誘導培地（２％Ｌ−Pheを含
む0.17％Yeast Nitrogen Base（Difco社製、無硫安およ
び無アミノ酸タイプ））に菌体濃度0.5〜0.8％になるよ
うに懸濁し、27℃にて２時間震盪攪拌を行いPALを誘導
した。

２時間誘導処理を行った菌体はPAL誘導培地から遠心
分離で回収し、得られた湿菌体は等量の滅菌水に懸濁
後、該懸濁液を液体窒素中に滴下して凍結菌体とした。

凍結菌体10gを液体窒素中で乳鉢で粉砕を行い、50ml
の５％のSDSを添加した緩衝液Ｃ（0.1MNa₂HPO₄（pH7.
4）、0.15M食塩、１％デオキシコール酸ナトリウム、１
％TritonX-100）を加え、緩やかに30分間攪拌した。

30分後、50mlのフェノール・クロロホルム混液（フェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合容量
比25:24:1）50mlを加え、15分間攪拌混合した。

該混合液を遠心分離し水層を回収し、この水層に新た
に50mlのフェノール・クロロホルム混液を加え、15分間
攪拌後遠心分離し、更に水層を回収して再びフェノール
・クロロホルム混液抽出操作を２回繰り返した。

最後に得られた水層に食塩の終濃度が0.2Mになるよう
に滅菌した5M食塩水を加え、さらに2.5容の冷エタノー
ルを加え、−20℃以下に保存して核酸成分を沈澱させ
た。

この沈澱物を遠心分離により回収し、冷エタノールで
洗浄しその後、減圧乾燥を行なった。

該乾燥物を10mlの滅菌水に溶解し、65℃、５分間加熱
処理を行い、オリゴｄ（Ｔ）セルロースを用いたmRNAの
公知のマニアティス法（参考文献15）に準じてmRNAを単
離した。

得られたmRNAをサンプル緩衝液（5M尿素,1mMEDTA、0.
05％Bromophenolblue）に溶解後、65℃、２分間加熱処
理を行いRNAの高次構造を変性させた後、8M尿素−アク
リルアミドスラブゲル（アクリル濃度３％、8M尿素存
在）を用いて泳動用緩衝液（89mM Tris,89mMホウ酸、2m
M EDTA）中で電気泳動に供した。

泳動後、アクリルアミドゲルをエチジウムブロマイド
処理し、紫外線下でmRNAのバンドを発色させてmRNAの大
きさで2.0〜3.0kbの範囲を長さで三等分に分割し、スラ
ブゲルから各ゲル断片を切り出した。

各ゲル断片を透析チューブに封入し、泳動用緩衝液に
沈め、mRNAをゲルから電気的に溶出した。

透析チューブ内液にフェノール・クロロホルム混液を
加え抽出操作を２回繰り返し、残フェノールをエーテル
抽出後、水層の1/10容の3M酢酸ナトリウム水溶液（pH5.
2）を加え、さらに2.5容の冷エタノールを添加して−20
℃に保存し、mRNAを沈澱させた。

上記で得られたmRNAがPALmRNAを含有するものである
ことを確認するために、各mRNA画分から蛋白質に翻訳さ
せ、産生蛋白質をPAL特異抗体を用いて同定する方法を
行なった。

すなわち、各分画mRNAはウサギの網状赤血球溶解物を
用いた無細胞系のin vitro翻訳キットに供した（参考文
献16）。

ウサギ網状赤血球in vitro翻訳キットはPromega Biot
ec社のものを用い、標識アミノ酸としては³⁵Ｓ−メチオ
ニン（Amersham社）を用いた。

ウサギの網状赤血球in vitro翻訳システムで翻訳され
た蛋白質を確認するために、翻訳反応液に緩衝液Ｃを加
えて溶解し、不溶物を遠心分離で除き、上清に自製のウ
サギの抗PAL・IgGを加えて、氷上で30分間反応させ、反
応液に羊の抗ウサギIgG（自製）を加えて、氷上で30分
間反応させ、ウサギ抗体を沈澱させた。

沈澱物を遠心分離して回収し、緩衝液Ｃで２回洗浄を
行い、画沈澱物を２％SDS、10％β−メルカプトエタノ
ール混液と0.1M Tris−リン酸（pH6.8）、１％SDS、50
％グリセリン混液とを3:1の容量で混合した溶液に溶解
し、95℃、２分間処理を行い、蛋白質のジスルフィド結
合を切断し、SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気
泳動（アクリルアミド濃度10％）をレムリの方法（参考
文献17）に準じて行い、泳動後のゲルを乾燥後、オート
ラジオグラフィーによりPALの同定を行った。

2.PALmRNAの二本鎖cDNA（ds-cDNA）への変換 PAL誘導処理２時間後の細胞から得たmRNAを上記の方
法で精製し、得られたmRNAを、Awv逆転写酵素を作用さ
せて、一本鎖cDNA分子に変換した（参考文献18）。

該一本鎖cDNA-mRNAハイブリッドに、RNaseH,DNAポリ
メラーゼＩおよびリガーゼを作用させてmRNAを取除き二
本鎖cDNA（ds-cDNA）を構築した。

3.3′末端にオリゴdC尾を有するds-cDNAの構築 上記2.で得られたds-cDNAに末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ（TdT）を作用させてds-cDNAの
３′末端にオリゴdCを付加させた。

即ち、３μg ds-cDNAをTdT緩衝液〔100mMカコジル酸
カリウム（pH7.2）,2mM塩化コバルト、0.2mMジチオスレ
ィトール〕と0.2mM dCTPを含む反応液に溶解し、37℃５
分間前処理を行い、次いで50単位のTdTを加え、37℃15
分間反応を進行させ、その後EDTAが終濃度40mMになるよ
うに加え、氷上に置き、フェノール・クロロホルム混液
を加え、TdTを変性失活させ、変性不溶化蛋白質を遠心
除去、上清をフェノール抽出、冷エタノール沈澱操作
後、該沈澱物を70％エタノールで洗浄後減圧乾燥を行
い、３′末端オリゴdC付加ds-cDNAを得た。

4.ハイブリッドプラスミドの構築 （pUC9（オリゴdc尾を有する）分子とds-cDNA（オリゴd
c尾を有する）分子との結合） 前記の3.で得られたオリゴdC付加ds-cDNAとプラスミ
ドpUC9（オリゴdc尾付加。Pharmacia社（スウェーデ
ン）より容易に入手可能）分子とをdC-dGホモポリマー
法として公知の方法であるマニアティス法に準ずる方法
で結合させた。

5.形質転換およびクローンの選択 上記4.で得られたハイブリッドプラスミド（オリゴdG
付加pUC9分子とオリゴdC付加ds-cDNA分子とからなる）
をCaCl₂処理した大腸菌にコンピテント法で導入した。

約４万個の形質転換体のコロニーを得た後、後記の参
考例３に記述する方法に準じたコロニーハイブリダイジ
ェション法で、細胞の選択を行った。

その結果、陽性のコロニーの中から、プラスミドを抽
出し精製し、更に各種の制限酵素で切断し、アガロース
ゲル電気泳動によってDNA断片の大きさを調べた。

6.完全なPAL構造遺伝子を含有するds-cDNAの構築 上記5.で得られた形質転換体からプラスミドpSW2およ
びpSW11を得た。

つまりPALmRNAの完全なcDNAは、pSW2およびpSW11を組
み合わせることにより可能なことが明らかとなったの
で、それぞれを含有する形質転換細胞からプラスミドを
抽出し精製し、制限酵素BanIIIで切断後、pSW2において
は、制限酵素HindIIIで切断し、アガロースゲル電気泳
動による分画を行ない、4.2Kbの大きさのDNA断片を回収
してフェノール・クロロホルム混液処理と冷エタノール
沈澱操作をそれぞれ数回繰返して精製した。

一方、pSW11は制限酵素BanIIIおよびHindIIIで切断
後、電気泳動により0.8kbのDNA断片を回収し精製した。

4.2kbおよび0.8kbのおのおのDNA断片をリガーゼによ
環状にし、該生成物で大腸菌を形質転換した。

マーカーとしたアンピシリン耐性の転換体からプラス
ミドを抽出し、各種の制限酵素を作用させて切断地図を
作成し、第１図に示した制御酵素切断地図の構造を有す
る正しいPAL構造を有するpSW13を選択した。

7.クローン化DNAの塩基配列の決定 上記のプラスミドpSW13を含むクローンから、そのプ
ラスミドpSW13を単離し、そのクローン化DNA断片を種々
の制限酵素で分解し、適当な制限酵素断片についてそれ
ぞれのDNAのヌクレオチド配列分析をマクサム−ギルバ
ート法（化学分解法）により、また、マート法（参考文
献19）によるDideoxy法により生化学的に行った。

得られたそれぞれのDNA断片の塩基配列の結果はコン
ピューター処理によりDNA編集を行い、その塩基配列は
後に示したPALの構造遺伝子を含むcDNAの塩基配列の通
りであつた。

8.pSW101の構築（第１図参照） プラスミドpUC13（Pharmacia社製）0.9μｇに10単位
の制限酵素SalIを14μｌの反応液（7mMTris-HCl（pH7.
5）、0.7mM EDTA,7mM MgCl₂、175mM NaCl、7mM 2−メル
カプトエタノール、0.01％、ウシ血清アルブミン（以下
BSAと略す））中で、37℃16時間作用させ、フェノール
・クロロホルム混液処理、エタノール沈澱操作を行い、
開環線状DNAを得た。該線状DNAをニック・トランスレー
ション緩衝液（50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、
0.1mMジチオスレイトール、２％BSA、80μM dATP、80μ
MdGTP、80μM dTTP、80μM dCTP）の存在下で、DNAポリ
メラーゼクレノフ断片（宝酒造（株）製）を室温で30分
間作用させ、接着末端を平滑末端にした後、フェールで
除蛋白を行い、冷エタノールでDNAを沈澱回収した。こ
のDNA断片に子牛脾臓由来リン酸ジエステラーゼ（CIP:
ベーリンガ社製）を作用させ、５′末端のリン酸基を除
去し、線状pUC13の自己閉環を防いだ。

一方pSW13を含有する細胞から、このプラスミドを抽
出し精製し、制限酵素DraIを反応液Ａ（4mM Tris-HCl
（pH7.5）、0.4mM EDTA 50mM NaCl）中37℃で28時間作
用させ、ついで食塩液を加えて食塩濃度を100mMとし、
制限酵素EcoRIおよびHindIIIを37℃で16時間作用させた
れ。

反応終了液をアガロースゲル電気泳動に供し、2.3Kb
の大きさのDNA断片をゲル中から回収し、フェノール抽
出、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エタノール
沈澱をそれぞれ３回繰返して後にPALcDNA断片を得た。

該cDNA断片に前述のニック・トランスレーション緩衝
液を加え、DNAポリメラーゼクレノフ断片を室温で45分
間作用させ、フェノール・クロロホルム混液処理、冷エ
タノール沈澱操作をそれぞれ３回操作し、平滑末端を両
端に有するcDNA断片を得た。

平滑末端を有するpUC13断片と平滑末端を有するcDNA
断片とをリガーゼで結合し、環状プラスミドpSW101を構
築した。

このハイブリッドプラスミドDNAを大腸菌に公知の方
法で形質転換し、アンピシリン耐性コロニーから細胞
（MT-10410,FERM BP-1710）を選び出し、PAL活性を測定
した。

9.pYtrp6の構築及び形質転換 実施例8.に記述した方法で構築したpSW101をPstI及び
BamIで消化し、アガロースゲル電気泳動後、370bpのDNA
断片を回収し、それを２分し、それぞれBanIおよびBbeI
で消化した。

消化後アクリルアミドゲル電気泳動により、BanI消化
のものからは70bpの大きさの断片を回収し、BbeI消化の
ものからは280bpの大きさのDNA断片を回収した。

70bpの断片はDNAポリメラーゼで平滑末端にし、ClaI
（BanIII）リンカーをリガーゼで結合させた。

ClaIリンカーを両端に結合したDNA断片をBan III及び
BbeIで消化し、先に調製したBbeI断片（280bp）およびp
BR322をBanIIIおよびBamHIで消化して、アガロースゲル
電気泳動により4.0KbのDNA断片を回収したものとをリガ
ーゼで結合し、pSYA1を得、これを大腸菌に公知のカル
シウム法で形質転換した。

実施例6.で構築したpSW13をXbaIで消化し、粘着末端
をDNAポリメラーゼで平滑末端とし、HindIIIリンカーを
リガーゼで結合して、pSW13Hを構築し、大腸菌に公知の
方法で形質転換した。

pSYA1を含む大腸菌から公知の方法でpSYA1を抽出し、
BamHIおよびBanIIIで消化し、350bpの大きさのDNA断片
を回収した。

pSW13Hを含む大腸菌から公知の方法でpSW13Hを抽出
し、抽出したpSW13HをBamHIおよびHindIIIで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動により1.9Kbの大きさのDNA断片を
回収した。

次に参考例５に記述する方法により構築したpFtrp2を
BanIIIおよびHindIIIで消化し、アガロースゲル電気泳
動により4.7Kbの断片を回収し、350bpのBamH I＋Bam II
I断片および1.9KbのBamHI＋HindIII断片をリガーゼで閉
環し、pSYA2を構築した。

pSYA2をBamIIIで部分消化して生じた粘着末端をDNAポ
リメラーゼを用いて平滑末端としリガーゼで閉環し、Nr
uI切断点を有するpYtrp6を創製した。

pYtrp6を大腸菌に公知の方法で形質転換し、アンピシ
リン耐性のコロニーから細胞を選び出し、PAL活性を測
定した。pYtrp6の構築のフローシートを第２図に示し、
詳細を第３図より第５図に示す。PAL活性を示す大腸菌
形質転換株をMT-10414（FERM BP-1712）とした。

10.pKY201の構築及び形質転換。

実施例９で造成したpYtrp6をNruIで消化後、CIP処理
を行い、HindIIIリンカーをリガーゼで結合し、HindIII
で消化後、アガロースゲル電気泳動により、2,3KbのDNA
断片を回収した。

一方、G.AmmererのADHI（アルコール脱水素酸素Ｉ）
を含む大腸菌とパン酵母のいずれにも機能するシャトル
ペクターAHH5（参考文献13）をせHind IIIで消化し、CI
P処理を行い、pYtrp6より調製した2.3KbDNA断片をリガ
ーゼを用いて挿入し、プラスミドを構築した。

このプラスミドで大腸菌をコンピテント法で形質転換
し、アンピシリン耐性を示す細胞からプラスミドを公知
の方法で抽出し、正しい方法に挿入されているプラスミ
ドを選定した。

正しい方向に挿入されたとシーゲンスが解析されたプ
ラスミドをpKY201とした。このpKY201をパン酵母（Sacc
haromyces cerevisiae）のＬ−ロイシン要求株（leu2）
をKU法（参考文献20）により形質転換を行い、Ｌ−ロイ
シンを含まない合成培地YAL寒天培地（Bacto Yeast Nit
rogen base0.67％，グルコース0.5％，硫酸アデニン0.0
01％、Ｌ−リジン0.005％、ウラシル0.001％、寒天1.5
％）上に植菌し、25℃で３日間培養を行い、生育してき
たコロニーから細胞を分離し、PAL活性を測定した。PAL
活性を示した細胞株をMT-40390（FERM BP-1711）とし
た。

11.形質転換体からPALの製造 形質転換体（E.coli,MT-10414）をアンピシリン0.1mg
/ml）添加LB培地に植菌し、35℃で10時間振盪培養を行
い、インドールアクリル酸をエタノールに10mg/mlに溶
解した溶液を培養液中のインドールアクリル酸濃度が0.
02mg/mlになるように無菌的に添加した。

インドールアクリルを添加した後、35℃で６時間振盪
培養を行なった。

この後培養液から菌体を遠心分離して回収した。

菌体を0.1M Tris−塩酸緩衝液（pH8.5）に懸濁し、0.
25mm径のガラスビーズを加えダイノミル（KDL型）で破
砕した。

処理液は遠心して残渣と上澄液に分離し、上澄液に硫
安を加えて塩析し、生じた沈澱を更に0.1M Tris−塩酸
緩衝液（pH8.5）に溶解し、DEAE−セルローズカラムク
ロマトグラフィーによってPAL活性区分をとり、ゲル濾
過で精製しPAL活性区分を濃縮し、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量測定、PAL特異抗体を用いた
イムノアッセイ法を行った。

PAL活性化区分蛋白はPAL特異抗体と抗原抗体反応を行
い、またSDS電気泳動法による分子量は約77,000であっ
た。

この値はR.toruloidesのPALと一致したのでこの結果
からPALの生成を確認した。

12.形質転換体をもちいたＬ−フェニルアラニンの製造 M9培地〔（Na₂HPO₄6g、KH₂PO₄3g、NaCl0.5g、NH₄Ｃ
1gを蒸留水１に溶解し、pH7.5にKOHで調整後、オート
クレーブ殺菌（120℃、10分間）処理〕１に2mlの1M-M
gSO₄、10mlの20％グルコース水溶液及び0.1mlの1M-CaCl
₂を0.22μｍ径のフィルター（ミリポア製:MILLEX-GS）
で除菌濾過して加え、ついでアンピシリンを0.1mg/mlに
なるように添加し、形質転換株（E.coli:MT-10414）を
植菌した。

植菌後の培地は37℃で６時間通気攪拌培養を行い、イ
ンドールアクリル酸をエタノールに10mg/mlに溶解した
溶液を培養液中のインドールアクリル酸濃度が0.02mg/m
lになるように無菌的に添加した。

インドールアクリル酸添加後、37℃で４時間通気攪拌
培養を継続した。

所定時間後、培養液を遠心分離機にて処理し、培養菌
体を得た。

培養菌体5gを、4gの桂皮酸を90mlのアンモニア水に溶
解し硫酸を加えてpH10.0とし蒸留水を加えて195mlとし
た反応液に加え、30℃に保ちゆるやかに攪拌しながら20
時間酵素を作用させた。

所定時間後、該反応液を遠心分離にて除菌後得た除菌
上清液を減圧下で濃縮し、濃縮液に硫酸を加えてpH1.5
〜1.8とした。

硫酸酸性で生じた未反応桂皮酸の沈殿を濾別除去し、
濾液をアンバーライトIR-120（Ｈ⁺）カラムに導入し
た。濾液を導通後、樹脂カラムを水洗し、0.25N−アン
モニア水で逆洗浄し、溶出液を回収し、蒸発乾固させ粗
Ｌ−フェニルアラニン2.8gを得た。尚Ｌ−フェニルアラ
ニンの同定はアミノ酸分析計によった。

13.形質転換体をもちいたＬ−フェニルアラニンの製造 合成培地YAL（Bacto Yeast nitrogen base0.67％、
グルコース1.0％、硫酸アデニン0.001％、Ｌ−リジン0.
005％、ウラシル0.001％）を0.4μｍ径無菌フィルター
で徐菌濾過し、坂口フラスコに200mlつづ分注した。こ
の培地に形質転換株（S.cerevisiae MT-40390）を植菌
し、25℃にて44時間震盪培養を行った。

培養液4lを遠心分離して菌体を集菌し、冷水で洗浄し
て洗浄菌体を得た。

洗浄菌体10gを、4gの桂皮酸を90mlのアンモニア水に
溶解し塩酸を加えてpH9.5とし蒸留水を加えて190mlとし
た反応液に加え、ゆるやかに攪拌しながら30℃に保ち、
36時間反応させた。

所定時間後、反応液を減圧下で濃縮し、濃縮液に塩酸
を加えてpH2以下とした。この溶液を10℃に９時間保
ち、沈殿した未反応の桂皮酸及び不溶した菌体を濾過除
去し、濾液にリン酸トリブチルを等量加えて桂皮酸を抽
出した。

抽出後の水層は減圧下で濃縮乾固して固形分4gを得
た。この固形分を希塩酸に溶解し活性炭1gを加えて90℃
で10分間加熱後、濾過して活性炭を除去し、清澄な溶液
を得た。

この溶液をアンモニア水でpH6.0とし、冷却して結晶
としてＬ−フェニルアラニンを得た。この結晶を濾別
後、濾液を濃縮し再び冷却して生成した結晶を回収し
て、先のＬ−フェニルアラニンの結晶と合わせ、減圧乾
燥を行い、結局Ｌ−フェニルアラニン2.0gを結晶として
得た。

参考例１ ロドスポリジウム・トルロイデスのPALをコ
ードする染色体DNAのクローニング ロドスポリジウム．トルロイデスの染色体DNAをギル
バート等（参考文献21）の方法に準じて調製した。すな
わち、該微生物から染色体DNAを抽出、制限酵素PstIお
よびBclIにて該染色体DNAを切断後、アガロースゲルに
よる電気泳動に供し、5.6kbの大きさのDNA断片をゲルか
ら電気透析法により回収した。

該DNA断片はpBR322を制限酵素PstIで切断した生成物
にリガーゼで挿入しPAL染色体DNAを含むpBR322ハイブリ
ッドプラスミドを組み立てた。

該ハイブリッドプラスミドで大腸菌を形質転換し、形
質転換大腸菌を得た。形質転換細胞から迅速プラスミド
抽出法（参考文献22）により、プラスミドDNAを抽出精
製し、これに各種制限酵素を作用させ、プラスミドの構
造を調べた。

参考例２ ³²Ｐ−標識化したPAL一本鎖cDNAの合成 実施例の2.に記述した方法によりPALmRNAから一本鎖c
DNAを合成するに際して、反応液中のdcTPの替わりにα
−³²P-dcTPを用いて、³²Ｐで標識した一本鎖cDNAを得
た。

この標識一本鎖cDNAにRNaseHを作用させて、mRNAを消
化後、フェノール処理、冷エタノール沈澱法によりDNA
を回収した。該一本鎖cDNAは参考例３のプローブとして
用いた。

参考例３ PAL染色体DNAとPBR322とのハイブリッドプラ
スミドを含有する形質転換大腸菌の検出 参考例１に記述した方法により得られた形質転換大腸
菌を参考例２の方法で調製した³²Ｐ−標識一本鎖cDNAを
プローブとして、コロニーハイブリダイジェーションを
行なった（参考文献23）。

形質転換大腸菌から陽性のコロニーを選び出し、該コ
ロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し精製
し、該プラスミドに各種制限酵素を作用させて、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、プラスミドの制限酵素切断図
を作成した。

また、該プラスミドにPALをコードする遺伝子該挿入
されていることを確認するため、該プラスミドを制限酵
素BamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動後3Kbの大き
さのDNA断片を回収し、脾臓DNaseI、大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩ、α−³²P-dcTPを用いたニックトランスレーショ
ン法により³²Ｐ標識DNAプローブを調製した。

一方、実施例１に記述した方法で調製したmRNAをグリ
オキザール処理を行い変性させ、アガロースゲル電気泳
動に供した。

電気泳動後、ゲルからmRNAをナイロンペーパーに転写
し、これを前述の³²Ｐ標識DNAプローブを用いたノーザ
ン・ハイブリダイジェーションに供し（参考文献24）て
ハイブリッドプラスミドにはPAL遺伝子が含まれること
が確認できた。

参考例４ PAL遺伝子をコードするDNAの大きさの確認 参考例３に記述した方法で確認されたPAL染色体DNAを
含むハイブリッドプラスミドを形質転換大腸菌から抽
出．精製し、該ハイブリッドプラスミドに各種の制限酵
素を作用させた後、アガロースゲル電気泳動を行い、分
画DNA断片をサザン法でニトロセルロースフィルターに
転写し、参考例２の方法で調製した³²Ｐ−標識PAL−本
鎖cDNAをプローブとして、DNA-DNAハイブリダイジェー
ションを行った。

参考例５ トリプトファン（trp）プロモーター領域の
組立て 大腸菌のtrpオペロンの一部を含有するプラスミドpVV
1に制限酵素HinfIを作用させて、プラスミドpVV1を消化
した。

該消化プラスミドDNA断片をアガロースゲル電気泳動
で分離し0.9kbの大きさのDNA断片をゲルから実施例１に
記述した方法で回収した。

0.9kbのDNA断片のHinfIで生じた接着末端を実施例の
8.に記述した方法で平滑末端とした後、EcoRIリンカー
（GGAATTCC）をリガーゼで平滑末端の５′末端に結合し
た。

EcoRIリンカー結合DNA断片に制限酵素EcoRIを作用さ
せ、EcoRI切断接着末端付加DNA端縁を創製した（参考文
献25）。

該EcoRI接着末端付加DNA断片とpBR322のEcoRI消化物
を実施例の8.に記述した方法でCIP処理を行ったものを
リガーゼにより結合し、該結合生成物を制限酵素EcoRI
およびBglIIで消化し、消化生成物をアガロースゲル電
気泳動で分離して、0.4kbの大きさをもつDNA断片を回収
した。

該DNA断片には制限酵素TaqIの切断箇所が３箇所含ま
れるが、該DNA断片をTaqIで部分的に消化して345bpの大
きさのDNA断片を回収した。

該345bpDNA断片をpBR322をEcoRIおよびClaIで消化し
て得られる4.3kbのDNAと結合し、trpプロモーターを含
有するプラスミドpFtrp2を得た。

参考例６ PAL活性の測定方法 PAL産生能を有するプラスミドを含む微生物を培養
し、必要によりプラスミドのプロモーターの機能を高め
る誘導処理を行った後に培養した微生物は集菌した。

その菌体は超音波処理、ガラスビーズ破砕等の機械的
細胞壁破壊又は溶菌酵素や界面活性剤を作用させる化学
的方法で細胞内酵素類を可溶化した。

この後遠心分離によつて上澄部を得てこれを試料とし
た。

PAL活性はＬ−フェニルアラニンから桂皮酸を生成す
る酵素反応に示されるので、上澄液を25mMトリス−塩酸
緩衝液（pH8.8）で希釈し、その希釈液1.0mlを酵素反応
液（全量は5.0mlであり、トリス−塩酸緩衝液（pH8.8）
を25mM、Ｌ−フェニルアラニンを10mM含む）に加えて、
30℃で20分間反応させて検討した。

この後1mlの1N-HClを加えて反応を停止させ、生成し
た桂皮酸を、液体クロマトグラフィーによって測定し
た。

液体クロマトグラフィーは、分離カラムとしてカラム
YMCパックＡ−312（山村化学研（製）を用い、検出器に
は紫外分光光度計を検出波長260nmで用いた。

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3） 25.Nichols,B.P.et al.,Methods in Enzymology,101,15
5,（1983）」

【図面の簡単な説明】

第１図はpSW101を構築する手順のフローチャートであ
る。 第２図は、pYtrp6の構築フローチャートである。 第３図、第４図及び第５図はそれぞれ第２図に示したフ
ローチャートの内の１部分を詳しく示したpYtrp6の構築
フローチャートである。 第６図はpKY201の構築のフローチャートである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 牧口 信義 藤沢市本鵠沼２−12−23 審査官 谷口 博 (56)参考文献 特開 平１−503673（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．161（１) Ｐ．314−320（1985) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．150 Ｐ. 498−505（1982)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】形質転換された大腸菌又は酵母よって産生
   され、アミノ酸配列が下記のものであるロドスポリジウ
   ム・トルロイデス由来のＬ−フェニルアラニン・アンモ
   ニアリアーゼ。