JPH053790A - デヒドロペプチダーゼ−ｉ - Google Patents
デヒドロペプチダーゼ−ｉInfo
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- JPH053790A JPH053790A JP3115493A JP11549391A JPH053790A JP H053790 A JPH053790 A JP H053790A JP 3115493 A JP3115493 A JP 3115493A JP 11549391 A JP11549391 A JP 11549391A JP H053790 A JPH053790 A JP H053790A
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- JP
- Japan
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- dhp
- dna
- plasmid
- amino acid
- cdna
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 代謝系に関与する生理活性物質であると同時
にカルバペネム系抗生物質に特異的に作用するデヒドロ
ペプチダーゼ−Ｉ（ＤＨＰ−Ｉ）のＤＮＡ組換え技術に
よる製造。 【構成】 ブタ腎臓から得たＤＨＰ−ＩのmＲＮＡから
得たcＤＮＡをクローニングし、適当な発現ベクターに
挿入し、得られたＤＨＰ−Ｉ発現ベクターを用いて宿主
細胞を形質転換し、その培養物から活性な組換えＤＨＰ
−Ｉを回収する。また、ブタＤＨＰ−ＩをコードするＤ
ＮＡからプローブを調製し、ヒト腎cＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングしてヒトＤＨＰ−Ｉをコードするc
ＤＮＡを得、活性な組換えＤＨＰ−Ｉを調製する。
にカルバペネム系抗生物質に特異的に作用するデヒドロ
ペプチダーゼ−Ｉ（ＤＨＰ−Ｉ）のＤＮＡ組換え技術に
よる製造。 【構成】 ブタ腎臓から得たＤＨＰ−ＩのmＲＮＡから
得たcＤＮＡをクローニングし、適当な発現ベクターに
挿入し、得られたＤＨＰ−Ｉ発現ベクターを用いて宿主
細胞を形質転換し、その培養物から活性な組換えＤＨＰ
−Ｉを回収する。また、ブタＤＨＰ−ＩをコードするＤ
ＮＡからプローブを調製し、ヒト腎cＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングしてヒトＤＨＰ−Ｉをコードするc
ＤＮＡを得、活性な組換えＤＨＰ−Ｉを調製する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ組換え技術によ
るデヒドロペプチダーゼ−Ｉ(以下、ＤＨＰ−Ｉと称す
る)[Ｅ.Ｃ.３.４.１３.１１]の製造に関する。さらに詳
しくは、本発明は、ヒトＤＨＰ−ＩまたはブタＤＨＰ−
ＩをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを担持する発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、および
該形質転換体を培養することからなるＤＨＰ−Ｉの製造
方法、並びにそのようにして製造された遺伝子組換えＤ
ＨＰ−Ｉに関するものである。
るデヒドロペプチダーゼ−Ｉ(以下、ＤＨＰ−Ｉと称す
る)[Ｅ.Ｃ.３.４.１３.１１]の製造に関する。さらに詳
しくは、本発明は、ヒトＤＨＰ−ＩまたはブタＤＨＰ−
ＩをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを担持する発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、および
該形質転換体を培養することからなるＤＨＰ−Ｉの製造
方法、並びにそのようにして製造された遺伝子組換えＤ
ＨＰ−Ｉに関するものである。
【０００２】
【従来技術】ＤＨＰ−Ｉは主としてヒトおよびブタの腎
臓から単離、抽出されており、その生理学的作用の解明
もなされている。アダチ(Ｈ.Ａdachi)ら[Ｊ.Ｂioche
m.，１０５，９５７−９６１(１９８９)]は、ヒト腎臓
からＤＨＰ−Ｉを抽出精製し、そのＮ−末端アミノ酸配
列を明らかにすると共に、それがグルタチオンおよびロ
イコトリエンの代謝に重要な役割を担っていることを示
した。さらに、アダチら[Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．２６５(１９
９０)，３９９２−３９９５]は、ヒト腎臓および胎盤の
cＤＮＡライブラリーからＤＨＰ−ＩをコードするcＤＮ
Ａクローンを単離してクローニングし、ヌクレオチド配
列を決定して、全アミノ酸配列の推定を行った。
臓から単離、抽出されており、その生理学的作用の解明
もなされている。アダチ(Ｈ.Ａdachi)ら[Ｊ.Ｂioche
m.，１０５，９５７−９６１(１９８９)]は、ヒト腎臓
からＤＨＰ−Ｉを抽出精製し、そのＮ−末端アミノ酸配
列を明らかにすると共に、それがグルタチオンおよびロ
イコトリエンの代謝に重要な役割を担っていることを示
した。さらに、アダチら[Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．２６５(１９
９０)，３９９２−３９９５]は、ヒト腎臓および胎盤の
cＤＮＡライブラリーからＤＨＰ−ＩをコードするcＤＮ
Ａクローンを単離してクローニングし、ヌクレオチド配
列を決定して、全アミノ酸配列の推定を行った。
【０００３】上記のように、ＤＨＰ−Ｉは生体の代謝系
に関与する生理活性物質であると同時にカルバペネム系
抗生物質に特異的に作用する物質であることも分かって
いる。従って、ＤＨＰ−Ｉは、本来の生理活性に基づく
用途の外に、カルバペネム抗生物質の生体内での安定性
試験に用いられる試薬としても有用と考えられる。この
種の抗生物質のスクリーニング試薬は、新規で有効な抗
生物質を開発するためには、数多くの候補物質の中から
活性および安定性に関して最良の性質を有する物質の検
索が必須であるという理由から、医薬関連技術分野では
極めて重要である。
に関与する生理活性物質であると同時にカルバペネム系
抗生物質に特異的に作用する物質であることも分かって
いる。従って、ＤＨＰ−Ｉは、本来の生理活性に基づく
用途の外に、カルバペネム抗生物質の生体内での安定性
試験に用いられる試薬としても有用と考えられる。この
種の抗生物質のスクリーニング試薬は、新規で有効な抗
生物質を開発するためには、数多くの候補物質の中から
活性および安定性に関して最良の性質を有する物質の検
索が必須であるという理由から、医薬関連技術分野では
極めて重要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＤＨＰ−Ｉの生理学的
作用の一層の研究および開発を促進すると共に、カルバ
ペネム抗生物質のスクリーニング試薬として実用化する
には、充分量のＤＨＰ−Ｉが供給されねばならない。し
かしながら、従来行われていた腎臓から抽出し精製する
方法では、上記目的の達成に充分な量および純度のＤＨ
Ｐ−Ｉを得ることは不可能である。
作用の一層の研究および開発を促進すると共に、カルバ
ペネム抗生物質のスクリーニング試薬として実用化する
には、充分量のＤＨＰ−Ｉが供給されねばならない。し
かしながら、従来行われていた腎臓から抽出し精製する
方法では、上記目的の達成に充分な量および純度のＤＨ
Ｐ−Ｉを得ることは不可能である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の実
情に鑑み、遺伝子組換え技術により高純度のブタおよび
ヒトのＤＨＰ−Ｉを充分量、製造することを目的として
研究を重ね、ヒトおよびブタ腎臓のＤＨＰ−Ｉをコード
するcＤＮＡのクローニングに成功した。即ち、本発明
者らは、ブタ腎臓から得たＤＨＰ−ＩmＲＮＡを逆転写
してcＤＮＡを得、それをクローニングし、次いで、Ｄ
ＨＰ−ＩをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿
入し、得られたＤＨＰ−Ｉ発現ベクターを用いて宿主細
胞を形質転換し、形質転換体の培養物から活性なＤＨＰ
−Ｉを回収した。
情に鑑み、遺伝子組換え技術により高純度のブタおよび
ヒトのＤＨＰ−Ｉを充分量、製造することを目的として
研究を重ね、ヒトおよびブタ腎臓のＤＨＰ−Ｉをコード
するcＤＮＡのクローニングに成功した。即ち、本発明
者らは、ブタ腎臓から得たＤＨＰ−ＩmＲＮＡを逆転写
してcＤＮＡを得、それをクローニングし、次いで、Ｄ
ＨＰ−ＩをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿
入し、得られたＤＨＰ−Ｉ発現ベクターを用いて宿主細
胞を形質転換し、形質転換体の培養物から活性なＤＨＰ
−Ｉを回収した。
【０００６】ブタＤＨＰ−ＩをコードするＤＮＡのクロ
ーニングは、当該技術分野の常法に従って行われた。即
ち、ブタＤＨＰ−Ｉをブタ腎臓皮質から精製し、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってその分子量が
約４３Ｋダルトンであることを確認した。その中間部分
の約１５アミノ酸の配列に基づいてプローブを作成し
た。他方ＴotalＲＮＡを得、ＰolyＡ ＲＮＡから逆転写
酵素の作用によりcＤＮＡライブラリーを作成した。
ーニングは、当該技術分野の常法に従って行われた。即
ち、ブタＤＨＰ−Ｉをブタ腎臓皮質から精製し、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってその分子量が
約４３Ｋダルトンであることを確認した。その中間部分
の約１５アミノ酸の配列に基づいてプローブを作成し
た。他方ＴotalＲＮＡを得、ＰolyＡ ＲＮＡから逆転写
酵素の作用によりcＤＮＡライブラリーを作成した。
【０００７】このcＤＮＡライブラリーから上記ＤＮＡ
プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションの方
法によって所望のクローンをスクリーニングし、プラス
ミドppcＤＨＰ７１を得た。このものはＤＨＰ−ＩのＮ
−末端が欠失したポリペプチドのcＤＮＡを含有してい
ることが分かった。そこで、プラスミドppcＤＨＰ７１
にクローニングされているcＤＮＡの５'−末端から３７
塩基のＤＮＡ断片をプローブとして上記cＤＮＡライブ
ラリーを再度スクリーニングし、完全長のＤＨＰ−Ｉc
ＤＮＡを含有するプラスミドppcＤＨＰ２３を得た。こ
れらプラスミドppcＤＨＰ７１およびppcＤＨＰ２３にク
ローニングされているcＤＮＡの塩基配列および推定の
アミノ酸配列をそれぞれ、添付の図１〜２および図３〜
５に示す。これらのＤＮＡ配列は表１に示すように、塩
基配列並びにアミノ酸配列が一部異なる２種類のＤＨＰ
−ＩcＤＮＡである。
プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションの方
法によって所望のクローンをスクリーニングし、プラス
ミドppcＤＨＰ７１を得た。このものはＤＨＰ−ＩのＮ
−末端が欠失したポリペプチドのcＤＮＡを含有してい
ることが分かった。そこで、プラスミドppcＤＨＰ７１
にクローニングされているcＤＮＡの５'−末端から３７
塩基のＤＮＡ断片をプローブとして上記cＤＮＡライブ
ラリーを再度スクリーニングし、完全長のＤＨＰ−Ｉc
ＤＮＡを含有するプラスミドppcＤＨＰ２３を得た。こ
れらプラスミドppcＤＨＰ７１およびppcＤＨＰ２３にク
ローニングされているcＤＮＡの塩基配列および推定の
アミノ酸配列をそれぞれ、添付の図１〜２および図３〜
５に示す。これらのＤＮＡ配列は表１に示すように、塩
基配列並びにアミノ酸配列が一部異なる２種類のＤＨＰ
−ＩcＤＮＡである。
【０００８】次いで、完全長のＤＨＰ−Ｉを担持するプ
ラスミドppcＤＨＰ２３から切断したＤＨＰ−ＩのＮ−
末端配列をコードしているＤＮＡを含む断片にppcＤＨ
Ｐ７１に担持されている先端を欠失したＤＨＰ−ＩＤＮ
Ａを連結することにより、得られたＤＮＡを含有する、
哺乳類宿主細胞内で機能的な発現ベクター、プラスミド
pＤＨＰ２を構築した。他方、ppcＤＨＰ２３に担持され
ている完全長のＤＨＰ−ＩをコードするＤＮＡを含有す
る発現ベクター、プラスミドpＤＨＰ６を構築した。
ラスミドppcＤＨＰ２３から切断したＤＨＰ−ＩのＮ−
末端配列をコードしているＤＮＡを含む断片にppcＤＨ
Ｐ７１に担持されている先端を欠失したＤＨＰ−ＩＤＮ
Ａを連結することにより、得られたＤＮＡを含有する、
哺乳類宿主細胞内で機能的な発現ベクター、プラスミド
pＤＨＰ２を構築した。他方、ppcＤＨＰ２３に担持され
ている完全長のＤＨＰ−ＩをコードするＤＮＡを含有す
る発現ベクター、プラスミドpＤＨＰ６を構築した。
【０００９】
【表１】
ＤＮＡ配列の異なる部位 アミノ酸の変化
ppcDHP71 ppcDHP23 ppcDHP71 ppcDHP23
１６８ ５０８ Ｇln Ａrg
３０４ ６４４ 変化なし
４４５ ７８５ 変化なし
７１７ １０５７ Ｌeu Ｓer
７１８ １０５８ Ｌeu Ｓer
９１９ １２５９ 変化なし
９８８ １３２８ 変化なし
１０１６ １３５６ 変化なし
＊：ＤＮＡの番号はそれぞれクローニングされた
cＤＮＡの最初のヌクレオチドを１とした数
【００１０】これらの発現ベクターでマウスＬ９２９細
胞を形質転換(トランスフェクション)すると、同等の発
現効率を有する形質転換体(トランスフェクタント)、Ｐ
ＤＨＰ２−１およびＰＤＨＰ６−２が得られた(比活性
に換算した発現量、３３ng／ml)。さらに二回目のクロ
ーニングでは、pＤＨＰ２によるトランスフェクタント
から、高発現細胞ＰＤＨＰ２−１２−３(比活性に換算
した発現量、２５９ng／ml)が得られた。このことは、
プラスミドpＤＨＰ２に担持されている、連結されたＤ
ＮＡが成熟ブタＤＨＰ−ＩをコードするＤＮＡであるこ
とを示している。該プラスミドpＤＨＰ２にコードされ
ているＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列を図
１２〜１３に示す。
胞を形質転換(トランスフェクション)すると、同等の発
現効率を有する形質転換体(トランスフェクタント)、Ｐ
ＤＨＰ２−１およびＰＤＨＰ６−２が得られた(比活性
に換算した発現量、３３ng／ml)。さらに二回目のクロ
ーニングでは、pＤＨＰ２によるトランスフェクタント
から、高発現細胞ＰＤＨＰ２−１２−３(比活性に換算
した発現量、２５９ng／ml)が得られた。このことは、
プラスミドpＤＨＰ２に担持されている、連結されたＤ
ＮＡが成熟ブタＤＨＰ−ＩをコードするＤＮＡであるこ
とを示している。該プラスミドpＤＨＰ２にコードされ
ているＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列を図
１２〜１３に示す。
【００１１】次いで、ヒト腎臓のＤＨＰ−Ｉをコードす
るＤＮＡをクローニングした。ブタＤＨＰ−Ｉをコード
するcＤＮＡを含むプラスミドppcＤＨＰ２３のＳmaI−
ＫpnＩ断片をプローブとして用い、市販品から入手した
ヒト腎臓のcＤＮＡライブラリーをスクリーニングして
ヒトＤＨＰ−ＩをコードするcＤＮＡを得た。このＤＮ
Ａ配列および推定のアミノ酸配列を図６〜８に示す。こ
のヒト由来のＤＨＰ−ＩcＤＮＡは、ブタ由来のものと
約８０％の相同性を有している。
るＤＮＡをクローニングした。ブタＤＨＰ−Ｉをコード
するcＤＮＡを含むプラスミドppcＤＨＰ２３のＳmaI−
ＫpnＩ断片をプローブとして用い、市販品から入手した
ヒト腎臓のcＤＮＡライブラリーをスクリーニングして
ヒトＤＨＰ−ＩをコードするcＤＮＡを得た。このＤＮ
Ａ配列および推定のアミノ酸配列を図６〜８に示す。こ
のヒト由来のＤＨＰ−ＩcＤＮＡは、ブタ由来のものと
約８０％の相同性を有している。
【００１２】図６〜８に記載の塩基配列とアダチら（前
掲)により開示された塩基配列には幾つかの相違点があ
り、従って、コードされるアミノ酸配列に相違が認めら
れる。このような理由から、本発明のヒトＤＨＰ−Ｉｃ
ＤＮＡは文献記載のものと別物質と考えられる。
掲)により開示された塩基配列には幾つかの相違点があ
り、従って、コードされるアミノ酸配列に相違が認めら
れる。このような理由から、本発明のヒトＤＨＰ−Ｉｃ
ＤＮＡは文献記載のものと別物質と考えられる。
【００１３】次いで、得られたヒトＤＨＰ−ＩcＤＮＡ
を用いて動物細胞で機能的な発現ベクター、プラスミド
pＤＨＰ８を構築し、マウスＬ９２９細胞を形質転換し
て高発現クローンＰＤＨＰ８−１３−１５(比活性に換
算した発現量：１μg／ml)を得た。上記各形質転換体の
培養物から調製した酵素標品は、後述する実施例に示す
ように、グリシルデヒドロフェニルアラニンを基質とす
るＤＨＰ−Ｉアッセイで活性を示した。
を用いて動物細胞で機能的な発現ベクター、プラスミド
pＤＨＰ８を構築し、マウスＬ９２９細胞を形質転換し
て高発現クローンＰＤＨＰ８−１３−１５(比活性に換
算した発現量：１μg／ml)を得た。上記各形質転換体の
培養物から調製した酵素標品は、後述する実施例に示す
ように、グリシルデヒドロフェニルアラニンを基質とす
るＤＨＰ−Ｉアッセイで活性を示した。
【００１４】従って、本発明は、図３〜５、図６〜８ま
たは図１２〜１３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有
し、ＤＨＰ−Ｉ酵素活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡを提供するものである。これらのＤＮＡは受
託番号：微工研条寄第２７８０号、微工研条寄第２７８
１号および微工研条寄第２７８２号の下で通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている菌株Ｅ
scherichia coli ＭＭ２９４(pＤＨＰ２)、Ｅscherichi
a coli ＨＢ１０１(pＤＨＰ６)、Ｅscherichia coli Ｈ
Ｂ１０１(pＤＨＰ８)から常法通り単離することができ
る。
たは図１２〜１３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有
し、ＤＨＰ−Ｉ酵素活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡを提供するものである。これらのＤＮＡは受
託番号：微工研条寄第２７８０号、微工研条寄第２７８
１号および微工研条寄第２７８２号の下で通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている菌株Ｅ
scherichia coli ＭＭ２９４(pＤＨＰ２)、Ｅscherichi
a coli ＨＢ１０１(pＤＨＰ６)、Ｅscherichia coli Ｈ
Ｂ１０１(pＤＨＰ８)から常法通り単離することができ
る。
【００１５】また本発明は、上記ＤＮＡのいずれかを含
有する発現ベクターを提供するものである。さらに、本
発明は、上記いずれかの発現ベクターを保持する形質転
換体、並びに該形質転換体を培養し、その培養物からＤ
ＨＰ−Ｉを単離することからなる、成熟ＤＨＰ−Ｉの製
造方法に関するものである。さらに本発明は、上記の方
法で製造された成熟ＤＨＰ−Ｉを提供するものである。
有する発現ベクターを提供するものである。さらに、本
発明は、上記いずれかの発現ベクターを保持する形質転
換体、並びに該形質転換体を培養し、その培養物からＤ
ＨＰ−Ｉを単離することからなる、成熟ＤＨＰ−Ｉの製
造方法に関するものである。さらに本発明は、上記の方
法で製造された成熟ＤＨＰ−Ｉを提供するものである。
【００１６】本明細書中、“成熟ＤＨＰ−Ｉ"として
は、図３〜５(アミノ酸配列１〜３９３で示されるポリ
ペプチド)、図６〜８(アミノ酸配列１〜３９５で示され
るポリペプチド)または図１２〜１３(アミノ酸配列１〜
３９３で示されるポリペプチド)に示されるポリペプチ
ドと同一のアミノ酸配列を有し、グリコシル化の種類お
よび程度が異なるＤＨＰ−Ｉ酵素活性を有するポリペプ
チド、並びにそれら各ＤＨＰ−Ｉとは異なる末端(Ｎ−
末端および／またはＣ−末端)アミノ酸配列を有し、Ｄ
ＨＰ−Ｉの酵素活性を有するポリペプチドが挙げられ
る。遺伝子組換え手法でポリペプチドを生産する場合、
宿主細胞の種類により、目的ポリペプチドのグリコシル
化の種類や程度の異なったものが得られることや、いわ
ゆるポリペプチドの分泌生産法において、宿主細胞中で
発現された前駆体ポリペプチドの末端(Ｎ−末端および
／またはＣ−末端)アミノ酸配列がシグナル・ペプチダ
ーゼ等によりプロセッシングを受け、種々の末端アミノ
酸配列を持つポリペプチドが得られることは当業者に周
知である。従って、そのようなポリペプチドも本発明の
“成熟ＤＨＰ−Ｉ"の範囲に含まれることは、当業者な
らば容易に理解し得ることである。
は、図３〜５(アミノ酸配列１〜３９３で示されるポリ
ペプチド)、図６〜８(アミノ酸配列１〜３９５で示され
るポリペプチド)または図１２〜１３(アミノ酸配列１〜
３９３で示されるポリペプチド)に示されるポリペプチ
ドと同一のアミノ酸配列を有し、グリコシル化の種類お
よび程度が異なるＤＨＰ−Ｉ酵素活性を有するポリペプ
チド、並びにそれら各ＤＨＰ−Ｉとは異なる末端(Ｎ−
末端および／またはＣ−末端)アミノ酸配列を有し、Ｄ
ＨＰ−Ｉの酵素活性を有するポリペプチドが挙げられ
る。遺伝子組換え手法でポリペプチドを生産する場合、
宿主細胞の種類により、目的ポリペプチドのグリコシル
化の種類や程度の異なったものが得られることや、いわ
ゆるポリペプチドの分泌生産法において、宿主細胞中で
発現された前駆体ポリペプチドの末端(Ｎ−末端および
／またはＣ−末端)アミノ酸配列がシグナル・ペプチダ
ーゼ等によりプロセッシングを受け、種々の末端アミノ
酸配列を持つポリペプチドが得られることは当業者に周
知である。従って、そのようなポリペプチドも本発明の
“成熟ＤＨＰ−Ｉ"の範囲に含まれることは、当業者な
らば容易に理解し得ることである。
【００１７】下記実施例には、発現ベクターとして哺乳
類動物細胞内で機能するベクターの構築例のみが示され
ている。しかしながら、本発明でヒトおよびブタＤＨＰ
−ＩをコードするＤＮＡが開示されている結果、これら
に基づいて、酵母等の真菌類、並びに原核性細胞宿主に
導入したとき、該宿主にＤＨＰ−Ｉを発現、産生させ得
る発現ベクターを構築することは、当業者にとって容易
である。従って、本発明は、本発明のＤＮＡ配列に基づ
き、当該技術分野既知の方法で構築される発現ベクター
をも包含するものである。
類動物細胞内で機能するベクターの構築例のみが示され
ている。しかしながら、本発明でヒトおよびブタＤＨＰ
−ＩをコードするＤＮＡが開示されている結果、これら
に基づいて、酵母等の真菌類、並びに原核性細胞宿主に
導入したとき、該宿主にＤＨＰ−Ｉを発現、産生させ得
る発現ベクターを構築することは、当業者にとって容易
である。従って、本発明は、本発明のＤＮＡ配列に基づ
き、当該技術分野既知の方法で構築される発現ベクター
をも包含するものである。
【００１８】本発明のＤＨＰ−Ｉ ＤＮＡを発現させる
ために用い得る微生物細胞には、例えば、原核性の細菌
[大腸菌(Ｅscherichia coli)や枯草菌(Ｂacillus subti
lis)]および真核性の酵母[例えばパン酵母菌(Ｓaccarom
yces cerevisiae)]がある。また、哺乳類細胞には培養
ヒト細胞および培養動物細胞(例えばＣＨＯ細胞、Ｌ９
２９細胞等)が含まれる。さらには培養植物細胞も用い
得る。
ために用い得る微生物細胞には、例えば、原核性の細菌
[大腸菌(Ｅscherichia coli)や枯草菌(Ｂacillus subti
lis)]および真核性の酵母[例えばパン酵母菌(Ｓaccarom
yces cerevisiae)]がある。また、哺乳類細胞には培養
ヒト細胞および培養動物細胞(例えばＣＨＯ細胞、Ｌ９
２９細胞等)が含まれる。さらには培養植物細胞も用い
得る。
【００１９】微生物の例としてはエシェリヒア属に属す
る細菌(例えばＥ.coli ＨＢ１０１ＡＴＣＣ ３３６９
４、Ｅ.coli ＨＢ１０１−１６ ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７
２、Ｅ.coli ＭＭ２９４ ＡＴＣＣ ３１４４６、Ｅ.col
i ＤＨ１ ＡＴＣＣ ３３８４９ 等)およびパン酵母(例
えばＳ.cerevisiae ＡＨ２２ ＡＴＣＣ ３８６２６等)
がある。哺乳動物細胞の例としてはマウスＬ９２９細胞
およびチャイニーズ・ハムスター・オバリー(ＣＨＯ)細
胞等がある。
る細菌(例えばＥ.coli ＨＢ１０１ＡＴＣＣ ３３６９
４、Ｅ.coli ＨＢ１０１−１６ ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７
２、Ｅ.coli ＭＭ２９４ ＡＴＣＣ ３１４４６、Ｅ.col
i ＤＨ１ ＡＴＣＣ ３３８４９ 等)およびパン酵母(例
えばＳ.cerevisiae ＡＨ２２ ＡＴＣＣ ３８６２６等)
がある。哺乳動物細胞の例としてはマウスＬ９２９細胞
およびチャイニーズ・ハムスター・オバリー(ＣＨＯ)細
胞等がある。
【００２０】通常、原核生物である細菌、特に大腸菌を
宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは少なくとも
プロモーター、開始コドン、ＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ、終止コドンおよび自己複製可能ユ
ニット(単位)から構成される。真核生物、即ち酵母や哺
乳動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベクター
は、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペ
プチド、ＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
および終止コドンから構成されるのが好ましい。さらに
エンハンサー配列、ＤＨＰ−Ｉの５'−および３'−非コ
ード領域、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位
を挿入することもできる。
宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは少なくとも
プロモーター、開始コドン、ＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ、終止コドンおよび自己複製可能ユ
ニット(単位)から構成される。真核生物、即ち酵母や哺
乳動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベクター
は、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペ
プチド、ＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
および終止コドンから構成されるのが好ましい。さらに
エンハンサー配列、ＤＨＰ−Ｉの５'−および３'−非コ
ード領域、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位
を挿入することもできる。
【００２１】上記の自己複製可能単位は、形質転換体の
選択マーカー(たとえば、アンピシリン耐性)を含有して
いることが好ましい。細菌を宿主とする発現ベクターの
場合、プロモーターという語句は、プロモーター、オペ
レーターおよびシャイン−ダルガーノ(ＳＤ)配列(たと
えばＡＡＧＧ等)からなるプロモーター・オペレーター
領域を意味する。そのようなプロモーターの例として
は、慣用のプロモーター・オペレーター領域(たとえ
ば、ラクトースオペロン、ＰＬ−プロモーター、trp−
プロモーター等)が挙げられる。酵母を宿主とする発現
ベクターに用いられるプロモーターの例としてはpho５
プロモーターが挙げられる。
選択マーカー(たとえば、アンピシリン耐性)を含有して
いることが好ましい。細菌を宿主とする発現ベクターの
場合、プロモーターという語句は、プロモーター、オペ
レーターおよびシャイン−ダルガーノ(ＳＤ)配列(たと
えばＡＡＧＧ等)からなるプロモーター・オペレーター
領域を意味する。そのようなプロモーターの例として
は、慣用のプロモーター・オペレーター領域(たとえ
ば、ラクトースオペロン、ＰＬ−プロモーター、trp−
プロモーター等)が挙げられる。酵母を宿主とする発現
ベクターに用いられるプロモーターの例としてはpho５
プロモーターが挙げられる。
【００２２】哺乳動物細胞における発現ベクターに用い
られるプロモーターの例としては、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプ
ロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、マ
ウス・メタロチオネインI(ＭＭＴ)−プロモーター等が
挙げられる。好ましい開始コドンの例としてメチオニン
コドン(ＡＴＧ)が挙げられる。シグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡとしてはpho５およびＤＨＰ−Ｉのシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
られるプロモーターの例としては、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプ
ロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、マ
ウス・メタロチオネインI(ＭＭＴ)−プロモーター等が
挙げられる。好ましい開始コドンの例としてメチオニン
コドン(ＡＴＧ)が挙げられる。シグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡとしてはpho５およびＤＨＰ−Ｉのシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２３】ＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡは、たとえば、ＤＮＡ合成装置を用いて、部分合成
または全合成するか、あるいは形質転換体[たとえばＥ.
coliＭＭ２９４(ppcＤＨＰ２３)]から得られるベクター
(ppcＤＨＰ２３)に挿入されている天然ＤＨＰ−ＩのcＤ
ＮＡ、またはゲノムＤＮＡを常法通り処理する(たとえ
ば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスファターゼ
による脱燐酸化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる
燐酸化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション)
ことによって調製することができる。
ＮＡは、たとえば、ＤＮＡ合成装置を用いて、部分合成
または全合成するか、あるいは形質転換体[たとえばＥ.
coliＭＭ２９４(ppcＤＨＰ２３)]から得られるベクター
(ppcＤＨＰ２３)に挿入されている天然ＤＨＰ−ＩのcＤ
ＮＡ、またはゲノムＤＮＡを常法通り処理する(たとえ
ば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスファターゼ
による脱燐酸化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる
燐酸化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション)
ことによって調製することができる。
【００２４】終止コドンの例としては慣用されている終
止コドン(例えばＴＡＧ、ＴＧＡ、等)が挙げられる。自
己複製可能ユニットとは、それを含有する発現ベクター
の全ＤＮＡを宿主細胞中で自己複製しうるＤＮＡ配列で
あって、天然のプラスミド、人工的に修飾したプラスミ
ド(たとえば、天然プラスミドから調製したＤＮＡ断片)
および合成プラスミドが挙げられる。そのようなプラス
ミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とする場
合、例えばプラスミドpＢＲ３２２またはその人工修飾
体(pＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって得られた
ＤＮＡ断片)が挙げられ、酵母を宿主細胞とする場合、
例えば、pＪＤＢ２１９、pＪＤＢ２０７、pＭＭ１０２
が挙げられる。さらに、動物細胞用プラスミドとして
は、例えばプラスミドpＭＭ３２４、プラスミドpＳＶ２
dhfr ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭ
Ｔneo ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドpＳＶ２neo Ａ
ＴＣＣ３７１４９が挙げられる。
止コドン(例えばＴＡＧ、ＴＧＡ、等)が挙げられる。自
己複製可能ユニットとは、それを含有する発現ベクター
の全ＤＮＡを宿主細胞中で自己複製しうるＤＮＡ配列で
あって、天然のプラスミド、人工的に修飾したプラスミ
ド(たとえば、天然プラスミドから調製したＤＮＡ断片)
および合成プラスミドが挙げられる。そのようなプラス
ミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とする場
合、例えばプラスミドpＢＲ３２２またはその人工修飾
体(pＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって得られた
ＤＮＡ断片)が挙げられ、酵母を宿主細胞とする場合、
例えば、pＪＤＢ２１９、pＪＤＢ２０７、pＭＭ１０２
が挙げられる。さらに、動物細胞用プラスミドとして
は、例えばプラスミドpＭＭ３２４、プラスミドpＳＶ２
dhfr ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭ
Ｔneo ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドpＳＶ２neo Ａ
ＴＣＣ３７１４９が挙げられる。
【００２５】エンハンサー配列としては、例えばＳＶ４
０のエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化部
位としては、例えばＳＶ４０のポリアデニル化部位が挙
げられる。
０のエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化部
位としては、例えばＳＶ４０のポリアデニル化部位が挙
げられる。
【００２６】動物細胞、特に哺乳動物細胞を宿主とする
本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、プロモー
ター領域、５'−非コード領域、開始コドン、シグナル
ペプチドおよびＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、終止コドン、３'−非コード領域、およびポリ
アデニル化部位を上記慣用の手法により、適当なプラス
ミドに、上流から下流に向けて連続的かつ環状に連結し
て調製してもよい。また、細菌を宿主として用いる場合
には、プロモーター、開始コドン、ＤＨＰ−Ｉをコード
するＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域を、
適当な自己複製可能ユニットと共に、上流から下流に向
けて連続的に、所望により適当なＤＮＡ断片(例えば、
制限酵素認識配列を持つリンカー等)を用いて、常法(例
えば、制限酵素による消化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いた燐酸化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたライ
ゲーション)通り環状に連結することにより、所望の発
現ベクターを構築することができる。次に、本発明の発
現ベクターを選択した宿主細胞に導入する。当業者既知
の常法(例えば、動物細胞の場合、リン酸カルシウム
法、エレクトロポレーション法等)によって導入するこ
とにより、形質転換体が得られる。
本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、プロモー
ター領域、５'−非コード領域、開始コドン、シグナル
ペプチドおよびＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、終止コドン、３'−非コード領域、およびポリ
アデニル化部位を上記慣用の手法により、適当なプラス
ミドに、上流から下流に向けて連続的かつ環状に連結し
て調製してもよい。また、細菌を宿主として用いる場合
には、プロモーター、開始コドン、ＤＨＰ−Ｉをコード
するＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域を、
適当な自己複製可能ユニットと共に、上流から下流に向
けて連続的に、所望により適当なＤＮＡ断片(例えば、
制限酵素認識配列を持つリンカー等)を用いて、常法(例
えば、制限酵素による消化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いた燐酸化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたライ
ゲーション)通り環状に連結することにより、所望の発
現ベクターを構築することができる。次に、本発明の発
現ベクターを選択した宿主細胞に導入する。当業者既知
の常法(例えば、動物細胞の場合、リン酸カルシウム
法、エレクトロポレーション法等)によって導入するこ
とにより、形質転換体が得られる。
【００２７】本発明の実施に用いた幾つかのプラスミド
類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵
素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って使用
した。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構
築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養お
よび培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方法、あ
るいは文献記載の方法[Ｍolecular Ｃloning，Ｔ.Ｍani
atis et.al，ＣＳＨＬaboratory(１９８３)ＤＮＡ Ｃlo
ning，ＤＭ.Ｇlover，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ(１９８５)他]
に準じて行なった。
類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵
素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って使用
した。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構
築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養お
よび培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方法、あ
るいは文献記載の方法[Ｍolecular Ｃloning，Ｔ.Ｍani
atis et.al，ＣＳＨＬaboratory(１９８３)ＤＮＡ Ｃlo
ning，ＤＭ.Ｇlover，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ(１９８５)他]
に準じて行なった。
【００２８】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。実施例１ ブタＤＨＰ−ＩをコードするＤＮＡのクロー
ニング
く説明する。実施例１ ブタＤＨＰ−ＩをコードするＤＮＡのクロー
ニング
【００２９】１）ブタＤＨＰ−Ｉの精製
ブタ腎臓皮質部分(７５g)に１５０mlの１０mＭ燐酸バッ
ファー(pＨ７.０)を加え、氷冷下ホモジナイズした。懸
濁液を４℃で１時間、２４０００gにて遠心し、上清を
廃棄した。得られた沈澱物を３００mlの１０mＭ トリス
塩酸(pＨ９.０)、５０mＭ 塩化ナトリウムおよび０.０
１mＭ 塩化亜鉛に懸濁した。撹拌下、３００mlの１０％
トリトンＸ−１００溶液を懸濁液に加え、室温にて３時
間撹拌してＤＨＰ−Ｉを抽出した。この溶液を４℃で１
時間、１８６０００gにて遠心し、不溶画分を除いた。
遠心後の上清を５０mＭ トリス塩酸(pＨ９.０)、０.０
１mＭ 塩化亜鉛(ＴＺバッファー)に対して透析した。次
いで、ＴＺバッファーにて平衡化した３００mlのＤＥＡ
Ｅ トヨパール ６５０Ｍ(東ソー)カラムにかけて精製し
た。サンプルをカラムに加えて吸着させた後、カラムを
ＴＺバッファー、次いで０.０５％トリトンＸ−１００
を含んだＴＺバッファー(ＴＺＸバッファー)にて洗浄し
た。次いでＴＺＸバッファーから０.３Ｍ 塩化ナトリウ
ム−ＴＺＸバッファー迄の直線グラジエントでＤＨＰ−
Ｉを溶出させた。得られた活性画分(４００ml)をＴＺバ
ッファーにて透析した後、トリトンＸ−１００を０.０
５％になるように加えた。この試料をＴＺバッファーに
て平衡化した１００mlのブルー−セファロースＣＬ−６
Ｂ(ファルマシア)カラムに加え、ＴＺＸバッファーで溶
出した。活性画分はカラムの非吸着画分に得られた。次
いで、活性画分を０.５Ｍ 塩化ナトリウム−ＴＺＸバッ
ファーにて平衡化した５０mlの亜鉛キレートセファロー
ス６Ｂカラム(ファルマシア)にかけ、上記カラムの非吸
着画分を回収した(４００ml)。次いで得られた活性画分
をＡバッファー[０.１Ｍ 酢酸ナトリウム、１Ｍ 塩化ナ
トリウム、１mＭ 塩化マンガン、１mＭ塩化マグネシウ
ム、１mＭ 塩化コバルト、０.０１mＭ塩化亜鉛、０.０
５％トリトンＸ−１００(pＨ７.０)]にて平衡化した２
５mlのＣonＡセファロース４Ｂ(ファルマシア)カラムに
かけた。試料(２００ml)をカラムに加え、Ａバッファー
にてカラムを洗浄した後、１０mg／mlのメチル−α−マ
ンノシド、０.０５％ トリトンＸ−１００にて溶出させ
た。活性画分(６ml)を更に１０mＭ 燐酸バッファー(pＨ
７.０)、１４０mＭ塩化ナトリウム、０.０５％ トリト
ンＸ−１００にて平衡化したセファクリルＳ−３００
(ファルマシア)カラムにかけ、上記のバッファーにより
活性画分を回収した。精製ステップの比活性を表２に示
した。得られたブタＤＨＰ−ＩはＳＤＳポリアクリルア
ミド電気泳動の結果から約４３Ｋダルトンの蛋白質であ
った。
ファー(pＨ７.０)を加え、氷冷下ホモジナイズした。懸
濁液を４℃で１時間、２４０００gにて遠心し、上清を
廃棄した。得られた沈澱物を３００mlの１０mＭ トリス
塩酸(pＨ９.０)、５０mＭ 塩化ナトリウムおよび０.０
１mＭ 塩化亜鉛に懸濁した。撹拌下、３００mlの１０％
トリトンＸ−１００溶液を懸濁液に加え、室温にて３時
間撹拌してＤＨＰ−Ｉを抽出した。この溶液を４℃で１
時間、１８６０００gにて遠心し、不溶画分を除いた。
遠心後の上清を５０mＭ トリス塩酸(pＨ９.０)、０.０
１mＭ 塩化亜鉛(ＴＺバッファー)に対して透析した。次
いで、ＴＺバッファーにて平衡化した３００mlのＤＥＡ
Ｅ トヨパール ６５０Ｍ(東ソー)カラムにかけて精製し
た。サンプルをカラムに加えて吸着させた後、カラムを
ＴＺバッファー、次いで０.０５％トリトンＸ−１００
を含んだＴＺバッファー(ＴＺＸバッファー)にて洗浄し
た。次いでＴＺＸバッファーから０.３Ｍ 塩化ナトリウ
ム−ＴＺＸバッファー迄の直線グラジエントでＤＨＰ−
Ｉを溶出させた。得られた活性画分(４００ml)をＴＺバ
ッファーにて透析した後、トリトンＸ−１００を０.０
５％になるように加えた。この試料をＴＺバッファーに
て平衡化した１００mlのブルー−セファロースＣＬ−６
Ｂ(ファルマシア)カラムに加え、ＴＺＸバッファーで溶
出した。活性画分はカラムの非吸着画分に得られた。次
いで、活性画分を０.５Ｍ 塩化ナトリウム−ＴＺＸバッ
ファーにて平衡化した５０mlの亜鉛キレートセファロー
ス６Ｂカラム(ファルマシア)にかけ、上記カラムの非吸
着画分を回収した(４００ml)。次いで得られた活性画分
をＡバッファー[０.１Ｍ 酢酸ナトリウム、１Ｍ 塩化ナ
トリウム、１mＭ 塩化マンガン、１mＭ塩化マグネシウ
ム、１mＭ 塩化コバルト、０.０１mＭ塩化亜鉛、０.０
５％トリトンＸ−１００(pＨ７.０)]にて平衡化した２
５mlのＣonＡセファロース４Ｂ(ファルマシア)カラムに
かけた。試料(２００ml)をカラムに加え、Ａバッファー
にてカラムを洗浄した後、１０mg／mlのメチル−α−マ
ンノシド、０.０５％ トリトンＸ−１００にて溶出させ
た。活性画分(６ml)を更に１０mＭ 燐酸バッファー(pＨ
７.０)、１４０mＭ塩化ナトリウム、０.０５％ トリト
ンＸ−１００にて平衡化したセファクリルＳ−３００
(ファルマシア)カラムにかけ、上記のバッファーにより
活性画分を回収した。精製ステップの比活性を表２に示
した。得られたブタＤＨＰ−ＩはＳＤＳポリアクリルア
ミド電気泳動の結果から約４３Ｋダルトンの蛋白質であ
った。
【００３０】
【表２】
精製段階 比活性＊
粗抽出液 1
ＤＥＡＥ−トヨパール 58
ブルー−セファロース CL-6B 147
Zn−キレート化セファロース 6B 218
ConA セファロース 4B 526
セファクリル S-300 19425
＊：比活性は粗抽出液の蛋白あたりのグリシルデヒドロ
フェニルアラニン分解活性を１とした。
フェニルアラニン分解活性を１とした。
【００３１】２）ブタＤＨＰ−Ｉのアミノ酸部分配列の
決定 １)で精製したブタＤＨＰ−Ｉを３％ ２−メルカプトエ
タノールにて還元し、コスモシール５Ｃ４−３００カラ
ム(ナカライテスク)を用いたＨＰＬＣに繰り返し適用し
てサンプルからトリトンＸ−１００を除いた。得られた
トリトンＸ−１００を含まないＤＨＰ−Ｉ約４９μgを
アプライドバイオシステムズ社４７０Ａ型気相シーケン
サーにかけてそのＮ末端アミノ酸配列を決定した。決定
されたＮ末端配列を以下に示す。 Asp-Gln-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Val-Arg-lle-Met-Gln-As
p-
決定 １)で精製したブタＤＨＰ−Ｉを３％ ２−メルカプトエ
タノールにて還元し、コスモシール５Ｃ４−３００カラ
ム(ナカライテスク)を用いたＨＰＬＣに繰り返し適用し
てサンプルからトリトンＸ−１００を除いた。得られた
トリトンＸ−１００を含まないＤＨＰ−Ｉ約４９μgを
アプライドバイオシステムズ社４７０Ａ型気相シーケン
サーにかけてそのＮ末端アミノ酸配列を決定した。決定
されたＮ末端配列を以下に示す。 Asp-Gln-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Val-Arg-lle-Met-Gln-As
p-
【００３２】他方、１)で得たブタＤＨＰ−Ｉを再度０.
０５％ ＳＤＳ、１０mＭ 燐酸バッファー(pＨ７.０)で
平衡化したセファクリルＳ−３００カラムにかけ、トリ
トンＸ−１００を除いた。サンプル溶液に０.５％にな
るように２−メルカプトエタノールを加えて還元し、１
／１０量のリジルエンドペプチダーゼで切断した。反応
液をコスモシール５Ｃ４−３００カラムを用いるＨＰＣ
Ｌにかけアセトニトリル０％〜６０％の直線グラジエン
トで溶離した。ＨＰＣＬ測定で単一と思われる部分のピ
ークを同様のＨＰＣＬ条件下で回収した。これらのペプ
チド断片のアミノ酸配列をＮ末端配列決定と同様にして
決定した。
０５％ ＳＤＳ、１０mＭ 燐酸バッファー(pＨ７.０)で
平衡化したセファクリルＳ−３００カラムにかけ、トリ
トンＸ−１００を除いた。サンプル溶液に０.５％にな
るように２−メルカプトエタノールを加えて還元し、１
／１０量のリジルエンドペプチダーゼで切断した。反応
液をコスモシール５Ｃ４−３００カラムを用いるＨＰＣ
Ｌにかけアセトニトリル０％〜６０％の直線グラジエン
トで溶離した。ＨＰＣＬ測定で単一と思われる部分のピ
ークを同様のＨＰＣＬ条件下で回収した。これらのペプ
チド断片のアミノ酸配列をＮ末端配列決定と同様にして
決定した。
【００３３】ピーク１：Asp-Gln-Phe-(X)-Asp-Leu-Ala-
Val-(X)-lle-Met-Gln- ピーク２：Val-Ala-(X)-Leu-Val-Gly-(X)-Glu-Gly- ピーク３：Val-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Val-Gly-Phe-Gly-
Gly-Asp-Tyr-(X)-Gly-Val- 上記配列式において(Ｘ)は分析された配列が明確でない
ことを表す。
Val-(X)-lle-Met-Gln- ピーク２：Val-Ala-(X)-Leu-Val-Gly-(X)-Glu-Gly- ピーク３：Val-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Val-Gly-Phe-Gly-
Gly-Asp-Tyr-(X)-Gly-Val- 上記配列式において(Ｘ)は分析された配列が明確でない
ことを表す。
【００３４】ピーク１は不明の第４残基および第９残基
を除いて上記Ｎ末端アミノ酸配列と一致していることか
ら、これもまたＮ末端アミノ酸配列であると考えられ
る。残る２アミノ酸配列のうち、長い範囲に渡って明ら
かなピーク３の配列を用いてcＤＮＡクローニング用の
プローブを作成した。
を除いて上記Ｎ末端アミノ酸配列と一致していることか
ら、これもまたＮ末端アミノ酸配列であると考えられ
る。残る２アミノ酸配列のうち、長い範囲に渡って明ら
かなピーク３の配列を用いてcＤＮＡクローニング用の
プローブを作成した。
【００３５】３）ブタ腎臓cＤＮＡライブラリーの作製
（１）ブタ腎臓ポリＡ ＲＮＡの精製
total ＲＮＡの抽出
屠殺直後に摘出し、直ちにドライアイスにて保存したブ
タ(ＬＷＤケンボロー種)腎臓 ２０gにグアニジンチオシ
アネート溶液(５Ｍグアニジンチオシアネート、５０mＭ
トリス塩酸(pＨ７.５)、２５mＭ ＥＤＴＡ、８％ ２−
メルカプトエタノール)１００mlを加え氷冷下、２分間
ホモジナイズした。次いで、−２０℃に冷却した３０ml
のエタノールを加えて十分に混合した後、直ちに４℃で
１００００gにて遠心し、上清を吸引除去した。沈澱物
をグアニジンチオシアネート溶液５０mlに懸濁し、氷冷
下３０秒間ホモジナイズした。懸濁液を直ちに４℃にお
いて７０００gで、４分間遠心した後、上清を回収し、
これに１.２５mlの１Ｍ酢酸および−２０℃に冷却した
３７.５mlのエタノールを加えて充分混和した後、−２
０℃にて３時間冷却した。懸濁液を−１０℃、４０００
gにて１０分間遠心した後、上清を吸引除去し、沈澱物
を５０mlのグアニジン塩酸溶液(６Ｍグアニジン塩酸、
２５mＭ ＥＤＴＡ、１０mＭ ２−メルカプトエタノー
ル)に懸濁した。更に１Ｍ 酢酸 １.２５ml、−２０℃に
冷却したエタノール ２５mlを加えて充分混和した後、
−２０℃にて１２時間冷却した。懸濁液を−１０℃にお
いて４０００gで１０分間遠心し、上清を吸引除去し
た。同様に２５mlのグアニジン塩酸溶液に沈澱物を懸濁
し、更に１Ｍ 酢酸 ０.６２５ml、および−２０℃に冷
却したエタノール １２.５mlを加えて充分混和した後、
−２０℃にて３時間冷却した。得られた懸濁液を−１０
℃において４０００gで１０分間遠心し、上清を吸引除
去した。再度グアニジン塩酸溶液 ２５mlに沈澱物を懸
濁し、更に１Ｍ 酢酸０.６２５mlおよび−２０℃に冷却
したエタノール １２.５mlを加えて充分混和した後、−
２０℃にて１７時間冷却し、懸濁液を０℃、４０００g
にて１０分間遠心した後、上清を吸引除去した。沈澱物
を蒸留水 １５mlに溶解し、エタノール１５mlを加え−
２０℃に保存した。回収したtotal ＲＮＡは１３.３mg
であった。
タ(ＬＷＤケンボロー種)腎臓 ２０gにグアニジンチオシ
アネート溶液(５Ｍグアニジンチオシアネート、５０mＭ
トリス塩酸(pＨ７.５)、２５mＭ ＥＤＴＡ、８％ ２−
メルカプトエタノール)１００mlを加え氷冷下、２分間
ホモジナイズした。次いで、−２０℃に冷却した３０ml
のエタノールを加えて十分に混合した後、直ちに４℃で
１００００gにて遠心し、上清を吸引除去した。沈澱物
をグアニジンチオシアネート溶液５０mlに懸濁し、氷冷
下３０秒間ホモジナイズした。懸濁液を直ちに４℃にお
いて７０００gで、４分間遠心した後、上清を回収し、
これに１.２５mlの１Ｍ酢酸および−２０℃に冷却した
３７.５mlのエタノールを加えて充分混和した後、−２
０℃にて３時間冷却した。懸濁液を−１０℃、４０００
gにて１０分間遠心した後、上清を吸引除去し、沈澱物
を５０mlのグアニジン塩酸溶液(６Ｍグアニジン塩酸、
２５mＭ ＥＤＴＡ、１０mＭ ２−メルカプトエタノー
ル)に懸濁した。更に１Ｍ 酢酸 １.２５ml、−２０℃に
冷却したエタノール ２５mlを加えて充分混和した後、
−２０℃にて１２時間冷却した。懸濁液を−１０℃にお
いて４０００gで１０分間遠心し、上清を吸引除去し
た。同様に２５mlのグアニジン塩酸溶液に沈澱物を懸濁
し、更に１Ｍ 酢酸 ０.６２５ml、および−２０℃に冷
却したエタノール １２.５mlを加えて充分混和した後、
−２０℃にて３時間冷却した。得られた懸濁液を−１０
℃において４０００gで１０分間遠心し、上清を吸引除
去した。再度グアニジン塩酸溶液 ２５mlに沈澱物を懸
濁し、更に１Ｍ 酢酸０.６２５mlおよび−２０℃に冷却
したエタノール １２.５mlを加えて充分混和した後、−
２０℃にて１７時間冷却し、懸濁液を０℃、４０００g
にて１０分間遠心した後、上清を吸引除去した。沈澱物
を蒸留水 １５mlに溶解し、エタノール１５mlを加え−
２０℃に保存した。回収したtotal ＲＮＡは１３.３mg
であった。
【００３６】ポリＡ ＲＮＡの精製
上記ＲＮＡ溶液２４mlに０.５mlの５Ｍ 塩化ナトリウム
溶液及び１８mlのエタノールを加えて充分混和した後、
−７０℃にて１時間冷却し、４℃、２４０００gで５分
間遠心した後、上清を吸引除去した。沈澱物を５mlのＴ
Ｅ緩衝液(pＨ８.０)(１０mＭ トリス塩酸(pＨ８.０)、
１mＭ ＥＤＴＡ)に溶解した後、５mlの１Ｍ 塩化ナトリ
ウムを加え、このうち半量をオリゴ(dＴ)カラムにかけ
て精製した。５mlのＲＮＡ溶液を６５℃で５分間加熱
し、約１.０mlのオリゴ(dＴ)カラムにかけた。非吸着画
分を再度加熱した後カラムにかけ、５mlの洗浄バッファ
ー(１０mＭ トリス塩酸（pＨ７.５)、１mＭ ＥＤＴＡ、
０.５Ｍ 塩化ナトリウム)にて洗浄した。３mlの溶出バ
ッファー(１０mＭ トリス塩酸(pＨ７.５)、１mＭ ＥＤ
ＴＡ)にてポリＡ ＲＮＡ画分を回収した。回収した画分
に５Ｍ 塩化ナトリウムを加えて１Ｍ 塩化ナトリウム溶
液とした後、上記の方法にしたがって再度約０.２mlの
オリゴ(dＴ)カラムにかけた。回収されたポリＡ ＲＮＡ
画分(０.８ml)に３２μlの５Ｍ塩化ナトリウム溶液及び
２mlのエタノールを加え、充分混和した後、−７０℃で
１時間冷却した。混合液を２４０００gで３分間遠心し
た後、上清を除き、沈澱物をエタノールにて洗浄した
後、減圧乾燥した。ＲＮＡを１００μlのＴＥ(pＨ７.
５)緩衝液に溶解した(回収ポリＡ ＲＮＡ:７２μg)。
溶液及び１８mlのエタノールを加えて充分混和した後、
−７０℃にて１時間冷却し、４℃、２４０００gで５分
間遠心した後、上清を吸引除去した。沈澱物を５mlのＴ
Ｅ緩衝液(pＨ８.０)(１０mＭ トリス塩酸(pＨ８.０)、
１mＭ ＥＤＴＡ)に溶解した後、５mlの１Ｍ 塩化ナトリ
ウムを加え、このうち半量をオリゴ(dＴ)カラムにかけ
て精製した。５mlのＲＮＡ溶液を６５℃で５分間加熱
し、約１.０mlのオリゴ(dＴ)カラムにかけた。非吸着画
分を再度加熱した後カラムにかけ、５mlの洗浄バッファ
ー(１０mＭ トリス塩酸（pＨ７.５)、１mＭ ＥＤＴＡ、
０.５Ｍ 塩化ナトリウム)にて洗浄した。３mlの溶出バ
ッファー(１０mＭ トリス塩酸(pＨ７.５)、１mＭ ＥＤ
ＴＡ)にてポリＡ ＲＮＡ画分を回収した。回収した画分
に５Ｍ 塩化ナトリウムを加えて１Ｍ 塩化ナトリウム溶
液とした後、上記の方法にしたがって再度約０.２mlの
オリゴ(dＴ)カラムにかけた。回収されたポリＡ ＲＮＡ
画分(０.８ml)に３２μlの５Ｍ塩化ナトリウム溶液及び
２mlのエタノールを加え、充分混和した後、−７０℃で
１時間冷却した。混合液を２４０００gで３分間遠心し
た後、上清を除き、沈澱物をエタノールにて洗浄した
後、減圧乾燥した。ＲＮＡを１００μlのＴＥ(pＨ７.
５)緩衝液に溶解した(回収ポリＡ ＲＮＡ:７２μg)。
【００３７】（２）cＤＮＡライブラリーの作成
リバーストランスクリプターゼ(逆転写酵素)による第
一鎖の合成 上記(１)で得た８μlのポリＡ ＲＮＡを含有するＴＥ緩
衝液を減圧乾固した後、２０μlの５mＭトリエタノール
アミン溶液に溶解した。６５℃で５分間加熱した後、以
下の溶液を加えて合成反応を行なった。 １Ｍ トリス塩酸(pＨ８.３)：２μl ０.１Ｍ 塩化マグネシウム：３.２μl ０.５Ｍ 塩化カリウム：２.４μl １０mＭ ＤＴＴ：１.２μl ２５mＭ dＮＴＰ：３.２μl(dＡＴＰ，dＣＴＰ，dＧＴ
Ｐ，ＴＴＰの等モル混合物) 蒸留水：２.８μl オカヤマ−バーグプライマー−ベクター(ファルマシ
ア)：３.２３μl(０.７pmol：１.４μg)
一鎖の合成 上記(１)で得た８μlのポリＡ ＲＮＡを含有するＴＥ緩
衝液を減圧乾固した後、２０μlの５mＭトリエタノール
アミン溶液に溶解した。６５℃で５分間加熱した後、以
下の溶液を加えて合成反応を行なった。 １Ｍ トリス塩酸(pＨ８.３)：２μl ０.１Ｍ 塩化マグネシウム：３.２μl ０.５Ｍ 塩化カリウム：２.４μl １０mＭ ＤＴＴ：１.２μl ２５mＭ dＮＴＰ：３.２μl(dＡＴＰ，dＣＴＰ，dＧＴ
Ｐ，ＴＴＰの等モル混合物) 蒸留水：２.８μl オカヤマ−バーグプライマー−ベクター(ファルマシ
ア)：３.２３μl(０.７pmol：１.４μg)
【００３８】混合液を軽く混和し、遠心(５００rpm×１
０秒)して反応容器の底に落とした後、３７℃で５分間
プレインキュベーションした。リバーストランスクリプ
ターゼ(バイオラッド)２μl(４０Ｕ)加え１時間反応し
た後、フェノール／クロロホルム溶液にて除蛋白し、エ
タノール沈澱にてＤＮＡ／ＲＮＡを回収し１０μlの蒸
留水に溶解した。
０秒)して反応容器の底に落とした後、３７℃で５分間
プレインキュベーションした。リバーストランスクリプ
ターゼ(バイオラッド)２μl(４０Ｕ)加え１時間反応し
た後、フェノール／クロロホルム溶液にて除蛋白し、エ
タノール沈澱にてＤＮＡ／ＲＮＡを回収し１０μlの蒸
留水に溶解した。
【００３９】dＣ付加反応
上記ＤＮＡ／ＲＮＡ溶液８.８μlに以下の溶液を加え、
反応を行なった。 ５×ターミナルトランスフェラーゼバッファー ：４
μl (０.７Ｍ カコジル酸ナトリウム、１５０mＭトリス塩酸
(pＨ６.８)) １０mＭ 塩化コバルト：２μl １０mＭ ＤＴＴ：０.４μl ０.５mＭ dＣＴＰ：２.８μl [α−32Ｐ]−dＣＴＰ(3000Ｃi／mmol):１μl ３７℃で５分間プレインキュベーションした後、ターミ
ナルトランスフェラーゼ１μl(２３Ｕ:ファルマシア)加
え、３７℃で１０分間反応した。次いで、０℃に冷却し
てその一部をとり、ＴＣＡ沈澱にてラベル取り込みを測
定した。Ｃ−テイルの長さが約１０塩基程度であること
を確認した後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノ
ール沈澱にてＤＮＡ／ＲＮＡを回収し、１０μlのＴＥ
緩衝液(pＨ７.５)に溶解した。
反応を行なった。 ５×ターミナルトランスフェラーゼバッファー ：４
μl (０.７Ｍ カコジル酸ナトリウム、１５０mＭトリス塩酸
(pＨ６.８)) １０mＭ 塩化コバルト：２μl １０mＭ ＤＴＴ：０.４μl ０.５mＭ dＣＴＰ：２.８μl [α−32Ｐ]−dＣＴＰ(3000Ｃi／mmol):１μl ３７℃で５分間プレインキュベーションした後、ターミ
ナルトランスフェラーゼ１μl(２３Ｕ:ファルマシア)加
え、３７℃で１０分間反応した。次いで、０℃に冷却し
てその一部をとり、ＴＣＡ沈澱にてラベル取り込みを測
定した。Ｃ−テイルの長さが約１０塩基程度であること
を確認した後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノ
ール沈澱にてＤＮＡ／ＲＮＡを回収し、１０μlのＴＥ
緩衝液(pＨ７.５)に溶解した。
【００４０】ＨindIII切断
で調製したＤＮＡ／ＲＮＡ溶液に１０μlの５×Ｈind
IIIバッファー[０.２５Ｍ 塩化ナトリウム、０.２５Ｍ
トリス塩酸(pＨ８.０)、５０mＭ 塩化マグネシウム、
０.５mg／ml ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)]、２０μlの
蒸留水及び１０μl[単位(１００Ｕ)]のＨindIIIを加え
３７℃で１時間反応した。フェノール／クロロホルム抽
出およびエタノール沈澱にてＤＮＡ／ＲＮＡを回収し、
１３μlのＴＥ緩衝液(pＨ７.５)に溶解した。
IIIバッファー[０.２５Ｍ 塩化ナトリウム、０.２５Ｍ
トリス塩酸(pＨ８.０)、５０mＭ 塩化マグネシウム、
０.５mg／ml ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)]、２０μlの
蒸留水及び１０μl[単位(１００Ｕ)]のＨindIIIを加え
３７℃で１時間反応した。フェノール／クロロホルム抽
出およびエタノール沈澱にてＤＮＡ／ＲＮＡを回収し、
１３μlのＴＥ緩衝液(pＨ７.５)に溶解した。
【００４１】リンカーＤＮＡとの結合
ＨindIII切断ＤＮＡ／ＲＮＡ溶液１１.７μlに９μlの
１Ｍ塩化ナトリウム、６７.３μlのＴＥ(pＨ７.５)、及
び２μlの０.１μg／mlオリゴdＧテイル化リンカー緩衝
液(ファルマシア)を加え、６５℃で５分間、４２℃で１
時間加熱した後、徐冷した。この溶液に氷冷下３６μl
の０.５Ｍ トリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)、３６μlの０.
１Ｍ 塩化マグネシウム、９０μlの０.１Ｍ 硫酸アンモ
ニウム、１８０μlの０.５Ｍ 塩化カリウム、９μlの１
０mＭ β−ニコチンアミドジヌクレオチド(β−ＮＡ
Ｄ)、４５μlの１mg／ml ＢＳＡ及び４１４μlの蒸留水
を加え、１２℃に調節した後、６μgのＥ.coli ＤＮＡ
リガーゼを加え、一昼夜１２℃にて反応した。
１Ｍ塩化ナトリウム、６７.３μlのＴＥ(pＨ７.５)、及
び２μlの０.１μg／mlオリゴdＧテイル化リンカー緩衝
液(ファルマシア)を加え、６５℃で５分間、４２℃で１
時間加熱した後、徐冷した。この溶液に氷冷下３６μl
の０.５Ｍ トリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)、３６μlの０.
１Ｍ 塩化マグネシウム、９０μlの０.１Ｍ 硫酸アンモ
ニウム、１８０μlの０.５Ｍ 塩化カリウム、９μlの１
０mＭ β−ニコチンアミドジヌクレオチド(β−ＮＡ
Ｄ)、４５μlの１mg／ml ＢＳＡ及び４１４μlの蒸留水
を加え、１２℃に調節した後、６μgのＥ.coli ＤＮＡ
リガーゼを加え、一昼夜１２℃にて反応した。
【００４２】ＲＮaseＨによるmＲＮＡの分解反応とＤ
ＮＡポリメラーゼによる第二鎖の合成 上記反応溶液に１.５μlの２５mＭ dＮＴＰ、１５μlの
１０mＭ β−ＮＡＤ、４μgのＥ.coli ＤＮＡリガー
ゼ、１０ＵのＲＮaseＨ、１５ＵのＤＮＡポリメラーゼI
を加え総量１０００μlとした後、１２℃、次いで２５
℃にて各１時間反応した。
ＮＡポリメラーゼによる第二鎖の合成 上記反応溶液に１.５μlの２５mＭ dＮＴＰ、１５μlの
１０mＭ β−ＮＡＤ、４μgのＥ.coli ＤＮＡリガー
ゼ、１０ＵのＲＮaseＨ、１５ＵのＤＮＡポリメラーゼI
を加え総量１０００μlとした後、１２℃、次いで２５
℃にて各１時間反応した。
【００４３】大腸菌ＭＭ２９４の形質転換
上記で調製した反応溶液にて大腸菌ＭＭ２９４を形質
転換した。形質転換後、一部を１００μg／mlのアンピ
シリンを含むＬ培地プレートに播き、独立クローンの数
を求めた(４.９×１０4個)。残りの形質転換混合液に１
０００mlの１０μg／mlアンピシリンを含むＬ培地を加
え、３７℃にて一晩培養した。培養液の一部に１６％に
なるよう、滅菌した８０％グリセロールを加え、１.２
５mlずつ滅菌したポリプロピレンチューブ(ＷＨＥＡＴ
ＯＮ社：２ml ＣＲＹＵＬＥ ＶＩＡＬ)に分注した後、
−８０℃冷凍庫に保管し、ブタ腎臓cＤＮＡライブラリ
ーとした。
転換した。形質転換後、一部を１００μg／mlのアンピ
シリンを含むＬ培地プレートに播き、独立クローンの数
を求めた(４.９×１０4個)。残りの形質転換混合液に１
０００mlの１０μg／mlアンピシリンを含むＬ培地を加
え、３７℃にて一晩培養した。培養液の一部に１６％に
なるよう、滅菌した８０％グリセロールを加え、１.２
５mlずつ滅菌したポリプロピレンチューブ(ＷＨＥＡＴ
ＯＮ社：２ml ＣＲＹＵＬＥ ＶＩＡＬ)に分注した後、
−８０℃冷凍庫に保管し、ブタ腎臓cＤＮＡライブラリ
ーとした。
【００４４】４）ブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡのクローニン
グ （１）プローブの作成 上記２)で精製して得たブタＤＨＰ−Ｉの部分アミノ酸
配列を基にプローブとするオリゴデオキシヌクレオチド
(Ｂ８−１；Ｂ８−１１)を自動核酸合成機(アプライド
バイオシステム社モデル３８１Ａ)を用いて合成した。 B8-1 GTAGTCGCCGCCGAAGCCTACGGC B8-11 GAAGCCCACAGCAGCAGCGCCAGCCAC
グ （１）プローブの作成 上記２)で精製して得たブタＤＨＰ−Ｉの部分アミノ酸
配列を基にプローブとするオリゴデオキシヌクレオチド
(Ｂ８−１；Ｂ８−１１)を自動核酸合成機(アプライド
バイオシステム社モデル３８１Ａ)を用いて合成した。 B8-1 GTAGTCGCCGCCGAAGCCTACGGC B8-11 GAAGCCCACAGCAGCAGCGCCAGCCAC
【００４５】得られたオリゴマーＢ８−１及びオリゴマ
ーＢ８−１１それぞれ１μgを１.７μlの１０×キナー
ゼバッファー(０.７Ｍトリス塩酸(pＨ７.６)、０.１Ｍ
塩化マグネシウム、５０mＭ ジチオスレイトール(ＤＴ
Ｔ))、５０μＣiの[γ−32Ｐ]ＡＴＰ、５ＵのＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え総容積１７μlとして３７
℃で２時間反応した。反応混合液に２μlの１０％ＳＤ
Ｓ溶液及び２５０mＭ ＥＤＴＡ溶液をそれぞれ加えた
後、７０℃で１０分間加熱した。これを１０mlのセファ
デックスＧ５０スーパーファイン(ファルマシア)のカラ
ムにて精製した。ＴＥ緩衝液(pＨ８.０)にて最初に溶出
される放射活性の画分を回収した(１−５×１０7cpm／
総容積)。
ーＢ８−１１それぞれ１μgを１.７μlの１０×キナー
ゼバッファー(０.７Ｍトリス塩酸(pＨ７.６)、０.１Ｍ
塩化マグネシウム、５０mＭ ジチオスレイトール(ＤＴ
Ｔ))、５０μＣiの[γ−32Ｐ]ＡＴＰ、５ＵのＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え総容積１７μlとして３７
℃で２時間反応した。反応混合液に２μlの１０％ＳＤ
Ｓ溶液及び２５０mＭ ＥＤＴＡ溶液をそれぞれ加えた
後、７０℃で１０分間加熱した。これを１０mlのセファ
デックスＧ５０スーパーファイン(ファルマシア)のカラ
ムにて精製した。ＴＥ緩衝液(pＨ８.０)にて最初に溶出
される放射活性の画分を回収した(１−５×１０7cpm／
総容積)。
【００４６】（２）ライブラリーのスクリーニング
蒸留水 １lに１０gのバクトトリプトン、５gの酵母エキ
ス、５gの塩化ナトリウム及び１５gのアガロースを加え
て加熱滅菌した後、その約５０mlを直径１５０mmのシャ
ーレに播き、固化させた。このようにして固化させたＬ
アガロース培地のプレート上に滅菌したニトロセルロー
スフィルター(ＨＡＴＦ：ミリポア)を敷き、さらに、こ
の上に、上記で作成したcＤＮＡライブラリーの菌液の
１０3希釈溶液を１００μl播いて(約２×１０4クローン
の菌)、３７℃で１２時間培養した。滅菌したろ紙(３Ｍ
Ｍ：ワットマン)上に、菌の生育したフィルターの菌生
育面が上になるように置き、さらにその上に同様の大き
さの滅菌ニトロセルロースフィルターを重ねた後、加圧
して菌をトランスファーした。２枚のフィルターを重ね
あわせたままロットリングインクにてマークを付し、２
枚の菌の付着したフィルターを作成した。１枚はそのま
ま、Ｌアガロース培地上にて再度３７℃で３時間培養し
た後、４℃にてマスタープレートとして保存した。もう
一方は同様にＬアガロースプレート上で、３７℃におい
て３時間培養した後、２００μg／mlのクロラムフェニ
コールを含むＬアガロース培地のプレートに移し、３７
℃で１６時間培養した。このフィルターを１０％ ＳＤ
Ｓ溶液を染込ませたろ紙上に菌の生育した面を上にして
置き、５分間放置した。続けて同様に０.５Ｎ 水酸化ナ
トリウム、１.５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液にて５分間、
１.５Ｍ 塩化ナトリウム、０.５Ｍ トリス塩酸(pＨ８)
水溶液にて５分間の２回操作した。次いで、このフィル
ターを８０％エタノール溶液に浸して２分間洗浄した
後、室温にて３０分間風乾した。乾燥したフィルターを
ろ紙に挟み真空乾燥機にて８０℃で２時間減圧下加熱乾
燥した後、乾燥したフィルターをハイブリバッグ(コス
モバイオ)に入れ、１枚あたり５mlのプレハイブリダイ
ゼーションバッファー(４×ＳＳＣ(０.６Ｍ 塩化ナトリ
ウム、０.０６Ｍ クエン酸ナトリウム)、０.１％ ＳＤ
Ｓ、０.２％ フィコール、０.２％ ポリビニルピロリド
ン、０.２％ ＢＳＡ、１０mＭＥＤＴＡ、１００μg／ml
tＲＮＡ)を加えて密封した。このバッグを４２℃にて
４時間インキュベーションした。バッグを開封してバッ
ファーをよく除いた後、再度一枚につきプレハイブリダ
イゼーションバッファー２.５mlおよび２.５×１０6cpm
の(１)で作成したプローブ(Ｂ８−１)を加えて密封した
後、４２℃にて１６時間インキュベーションした。バッ
グを開封し、バッファーを完全に除去した後、フィルタ
ーを５０mlの４×ＳＳＣ−０.１％ ＳＤＳ溶液にて５分
間、室温で洗浄した。更に同量の溶液にて４２℃で１０
分間洗浄した。フィルターをろ紙上で１０分間乾燥した
後、オートラジオグラフィーを行なった(−８０℃にて
２０時間露光した後現像する)。フィルムに現れたオー
トラジオグラムのシグナルの位置に相当する付近の菌の
コロニー(直径５〜１０mmの範囲、約１０〜１００クロ
ーン)をマスタープレートからつり上げアンピシリン５
０μg／mlを含むＬ培地にて増殖させた。
ス、５gの塩化ナトリウム及び１５gのアガロースを加え
て加熱滅菌した後、その約５０mlを直径１５０mmのシャ
ーレに播き、固化させた。このようにして固化させたＬ
アガロース培地のプレート上に滅菌したニトロセルロー
スフィルター(ＨＡＴＦ：ミリポア)を敷き、さらに、こ
の上に、上記で作成したcＤＮＡライブラリーの菌液の
１０3希釈溶液を１００μl播いて(約２×１０4クローン
の菌)、３７℃で１２時間培養した。滅菌したろ紙(３Ｍ
Ｍ：ワットマン)上に、菌の生育したフィルターの菌生
育面が上になるように置き、さらにその上に同様の大き
さの滅菌ニトロセルロースフィルターを重ねた後、加圧
して菌をトランスファーした。２枚のフィルターを重ね
あわせたままロットリングインクにてマークを付し、２
枚の菌の付着したフィルターを作成した。１枚はそのま
ま、Ｌアガロース培地上にて再度３７℃で３時間培養し
た後、４℃にてマスタープレートとして保存した。もう
一方は同様にＬアガロースプレート上で、３７℃におい
て３時間培養した後、２００μg／mlのクロラムフェニ
コールを含むＬアガロース培地のプレートに移し、３７
℃で１６時間培養した。このフィルターを１０％ ＳＤ
Ｓ溶液を染込ませたろ紙上に菌の生育した面を上にして
置き、５分間放置した。続けて同様に０.５Ｎ 水酸化ナ
トリウム、１.５Ｍ 塩化ナトリウム水溶液にて５分間、
１.５Ｍ 塩化ナトリウム、０.５Ｍ トリス塩酸(pＨ８)
水溶液にて５分間の２回操作した。次いで、このフィル
ターを８０％エタノール溶液に浸して２分間洗浄した
後、室温にて３０分間風乾した。乾燥したフィルターを
ろ紙に挟み真空乾燥機にて８０℃で２時間減圧下加熱乾
燥した後、乾燥したフィルターをハイブリバッグ(コス
モバイオ)に入れ、１枚あたり５mlのプレハイブリダイ
ゼーションバッファー(４×ＳＳＣ(０.６Ｍ 塩化ナトリ
ウム、０.０６Ｍ クエン酸ナトリウム)、０.１％ ＳＤ
Ｓ、０.２％ フィコール、０.２％ ポリビニルピロリド
ン、０.２％ ＢＳＡ、１０mＭＥＤＴＡ、１００μg／ml
tＲＮＡ)を加えて密封した。このバッグを４２℃にて
４時間インキュベーションした。バッグを開封してバッ
ファーをよく除いた後、再度一枚につきプレハイブリダ
イゼーションバッファー２.５mlおよび２.５×１０6cpm
の(１)で作成したプローブ(Ｂ８−１)を加えて密封した
後、４２℃にて１６時間インキュベーションした。バッ
グを開封し、バッファーを完全に除去した後、フィルタ
ーを５０mlの４×ＳＳＣ−０.１％ ＳＤＳ溶液にて５分
間、室温で洗浄した。更に同量の溶液にて４２℃で１０
分間洗浄した。フィルターをろ紙上で１０分間乾燥した
後、オートラジオグラフィーを行なった(−８０℃にて
２０時間露光した後現像する)。フィルムに現れたオー
トラジオグラムのシグナルの位置に相当する付近の菌の
コロニー(直径５〜１０mmの範囲、約１０〜１００クロ
ーン)をマスタープレートからつり上げアンピシリン５
０μg／mlを含むＬ培地にて増殖させた。
【００４７】以上の操作を５枚のフィルターについて行
ない、約１０万クローンの菌から４０個以上の陽性クロ
ーンを得た。これらの陽性クローンを含む菌の混合体を
更に先に述べた方法と同様にして再度スクリーニング
し、クローンを単離した。直径９０mmのシャーレを用い
フィルターあたり約２００〜５００クローンの菌が生育
するように菌を播き、陽性クローンを単離した。これら
のクローンを更にプローブＢ８−１１を用いてスクリー
ニングすることにより、ブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含む
クローン(ＭＭ２９４／ppcＤＨＰ７１)を得た。
ない、約１０万クローンの菌から４０個以上の陽性クロ
ーンを得た。これらの陽性クローンを含む菌の混合体を
更に先に述べた方法と同様にして再度スクリーニング
し、クローンを単離した。直径９０mmのシャーレを用い
フィルターあたり約２００〜５００クローンの菌が生育
するように菌を播き、陽性クローンを単離した。これら
のクローンを更にプローブＢ８−１１を用いてスクリー
ニングすることにより、ブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含む
クローン(ＭＭ２９４／ppcＤＨＰ７１)を得た。
【００４８】（３）ＤＮＡマッピング及び配列の決定
上記(２)で得た、cＤＮＡを含むプラスミドppcＤＨＰ７
１を種々の制限酵素にて切断し、cＤＮＡのおおまかな
マッピングを行った。更にそれらの内の断片をＭ１３フ
ァージのmp１８あるいはmp１９にサブクローニングし
た。これらサブクローニングされたファージのssＤＮＡ
を用い、ジデオキシ法［サンガー.エフ等、Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci.、７４、５４６３〜５４６７]でＤＮＡの
配列を決定した。ＤＮＡ配列は全てＤＮＡ配列決定機
(アプライドバイオシステム社モデル３７０Ａ)を用いて
決定した。得られたＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸
配列に、先に部分決定したブタＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配
列と一致する部分が存在していたことから、このクロー
ンから得られたcＤＮＡはブタＤＨＰ−Ｉのものである
と推定された。但し、このcＤＮＡにはＤＨＰ−ＩのＮ
末端配列に相当する配列がなく、不完全長のcＤＮＡで
あることが明らかになった。プラスミドppcＤＨＰ７１
の塩基配列および推定のアミノ酸配列を図１〜２に示
す。
１を種々の制限酵素にて切断し、cＤＮＡのおおまかな
マッピングを行った。更にそれらの内の断片をＭ１３フ
ァージのmp１８あるいはmp１９にサブクローニングし
た。これらサブクローニングされたファージのssＤＮＡ
を用い、ジデオキシ法［サンガー.エフ等、Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci.、７４、５４６３〜５４６７]でＤＮＡの
配列を決定した。ＤＮＡ配列は全てＤＮＡ配列決定機
(アプライドバイオシステム社モデル３７０Ａ)を用いて
決定した。得られたＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸
配列に、先に部分決定したブタＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配
列と一致する部分が存在していたことから、このクロー
ンから得られたcＤＮＡはブタＤＨＰ−Ｉのものである
と推定された。但し、このcＤＮＡにはＤＨＰ−ＩのＮ
末端配列に相当する配列がなく、不完全長のcＤＮＡで
あることが明らかになった。プラスミドppcＤＨＰ７１
の塩基配列および推定のアミノ酸配列を図１〜２に示
す。
【００４９】（４）完全長cＤＮＡのクローニングのた
めの再スクリーニング 上記(３)で得られたブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡは翻訳領域
のＮ−末端をコードした部分を欠失した不完全なcＤＮ
Ａであったので、完全なcＤＮＡを得るために更にスク
リーニングを行なった。先に得られたクローンＭＭ２９
４／ppcＤＨＰ７１のcＤＮＡの５'末端近傍の３７塩基
を合成してプローブとして用いた。 TTTGTGGGCGGCCAGTTCTGGTCCGCGTACG
めの再スクリーニング 上記(３)で得られたブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡは翻訳領域
のＮ−末端をコードした部分を欠失した不完全なcＤＮ
Ａであったので、完全なcＤＮＡを得るために更にスク
リーニングを行なった。先に得られたクローンＭＭ２９
４／ppcＤＨＰ７１のcＤＮＡの５'末端近傍の３７塩基
を合成してプローブとして用いた。 TTTGTGGGCGGCCAGTTCTGGTCCGCGTACG
【００５０】スクリーニングは上記の方法と同様にして
行なった。１０万クローンの菌をスクリーニングし約
１.５kbpの完全長のcＤＮＡを持つクローンＭＭ２９４
／ppcＤＨＰ２３を得た。このcＤＮＡのマップおよび配
列を図３〜５に示した。プラスミドppcＤＨＰ７１と、p
pcＤＨＰ２３のＤＮＡ塩基配列の比較の結果、前記の表
１に示す相違点が見出された。
行なった。１０万クローンの菌をスクリーニングし約
１.５kbpの完全長のcＤＮＡを持つクローンＭＭ２９４
／ppcＤＨＰ２３を得た。このcＤＮＡのマップおよび配
列を図３〜５に示した。プラスミドppcＤＨＰ７１と、p
pcＤＨＰ２３のＤＮＡ塩基配列の比較の結果、前記の表
１に示す相違点が見出された。
【００５１】実施例３ 発現プラスミドpＤＨＰ２およ
びpＤＨＰ６の構築 これら発現プラスミドの構築模式図を図９および図１０
に示した。 １）プラスミドpＤＨＰ１の構築 １０μm(〜１０μg)のppcＤＨＰ２３に８０μmの５×Ｐ
stI切断バッファー(０.５Ｍ 塩化ナトリウム、５０mＭ
トリス塩酸(pＨ７.５)、５０mＭ 塩化マグネシウム、
０.５mg／mm ＢＳＡ)、３５０μmの蒸留水および制限酵
素ＰstI ５μm加え、３７℃で２時間インキュベーショ
ンした。反応混合液を等量のフェノール／クロロホルム
(１／１)にて抽出した後、secブタノールを加えて約１
５μmまで濃縮した。この溶液に１.５μmの３Ｍ 酢酸ナ
トリウムおよび３７.５μmのエタノールを加え、−８０
℃で１０分冷却した後、１５０００rpmで３分間遠心
し、ＤＮＡを沈澱させて回収した。ＤＮＡを７０％ エ
タノールにて洗い、減圧乾燥した後、２０μmのＴＥ緩
衝液(pＨ８.０)に溶解し、得られたＤＮＡの量を測定し
た。
びpＤＨＰ６の構築 これら発現プラスミドの構築模式図を図９および図１０
に示した。 １）プラスミドpＤＨＰ１の構築 １０μm(〜１０μg)のppcＤＨＰ２３に８０μmの５×Ｐ
stI切断バッファー(０.５Ｍ 塩化ナトリウム、５０mＭ
トリス塩酸(pＨ７.５)、５０mＭ 塩化マグネシウム、
０.５mg／mm ＢＳＡ)、３５０μmの蒸留水および制限酵
素ＰstI ５μm加え、３７℃で２時間インキュベーショ
ンした。反応混合液を等量のフェノール／クロロホルム
(１／１)にて抽出した後、secブタノールを加えて約１
５μmまで濃縮した。この溶液に１.５μmの３Ｍ 酢酸ナ
トリウムおよび３７.５μmのエタノールを加え、−８０
℃で１０分冷却した後、１５０００rpmで３分間遠心
し、ＤＮＡを沈澱させて回収した。ＤＮＡを７０％ エ
タノールにて洗い、減圧乾燥した後、２０μmのＴＥ緩
衝液(pＨ８.０)に溶解し、得られたＤＮＡの量を測定し
た。
【００５２】この反応液２μmとＳpeIリンカー(ＡＣＴ
ＡＧＴＴＧＣＡ)１００ngに４μmの５×リガーゼバッフ
ァー(２５０mＭ トリス塩酸(pＨ７.６)、５０mＭ 塩化
マグネシウム、２５％(w／v)ポリエチレングリコール８
０００、５mＭ ＤＴＴ)、２μmの２０mＭ ＡＴＰ、２μ
mのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、蒸留水で総量２０μmと
し、３７℃で１時間インキュベーションした。大腸菌Ｍ
Ｍ２９４をこの反応混合液全量で形質転換した。１００
μg／mmアンピシリンの入ったＬ培地プレート４枚に形
質転換した菌を播き、３７℃で一昼夜インキュベーショ
ンした。生育した菌を選び、１２クローンを１.５mmの
１００μg／mmアンピシリンを含むＬ培地にて３７℃で
６時間培養した。これらの菌からアルカリ法にてプラス
ミドを回収し、制限酵素ＳpeIにて正しい断片がクロー
ニングされたクローンであるかどうかを調べ、目的のプ
ラスミドpＤＨＰＮ１を得た。
ＡＧＴＴＧＣＡ)１００ngに４μmの５×リガーゼバッフ
ァー(２５０mＭ トリス塩酸(pＨ７.６)、５０mＭ 塩化
マグネシウム、２５％(w／v)ポリエチレングリコール８
０００、５mＭ ＤＴＴ)、２μmの２０mＭ ＡＴＰ、２μ
mのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、蒸留水で総量２０μmと
し、３７℃で１時間インキュベーションした。大腸菌Ｍ
Ｍ２９４をこの反応混合液全量で形質転換した。１００
μg／mmアンピシリンの入ったＬ培地プレート４枚に形
質転換した菌を播き、３７℃で一昼夜インキュベーショ
ンした。生育した菌を選び、１２クローンを１.５mmの
１００μg／mmアンピシリンを含むＬ培地にて３７℃で
６時間培養した。これらの菌からアルカリ法にてプラス
ミドを回収し、制限酵素ＳpeIにて正しい断片がクロー
ニングされたクローンであるかどうかを調べ、目的のプ
ラスミドpＤＨＰＮ１を得た。
【００５３】２）プラスミドpＤＨＰ１の構築
１)と同様に、プラスミドpＤＨＰＮ１を制限酵素ＡatII
及びＳpeIにて切断し、反応混合液を全量１％のアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、約０.４５Ｋbp付近のバンド
を切り出してドライアイスで凍らせた後、ＤＮＡを含む
溶液を絞り出した。同様に、プラスミドppcＤＨＰ７１
を制限酵素ＡatII及びＳmaIで切断し、反応混合液を全
量１％のアガロースゲル電気泳動にかけ、約０.９Ｋbp
付近のバンドを切り出してドライアイスで凍らせた後、
ＤＮＡを含む溶液を絞り出した。
及びＳpeIにて切断し、反応混合液を全量１％のアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、約０.４５Ｋbp付近のバンド
を切り出してドライアイスで凍らせた後、ＤＮＡを含む
溶液を絞り出した。同様に、プラスミドppcＤＨＰ７１
を制限酵素ＡatII及びＳmaIで切断し、反応混合液を全
量１％のアガロースゲル電気泳動にかけ、約０.９Ｋbp
付近のバンドを切り出してドライアイスで凍らせた後、
ＤＮＡを含む溶液を絞り出した。
【００５４】次いで、プラスミドpＵＣＲＥＮ２(pＵＣ
８(ファルマシア)のＢglII−ＨindIIIにレニンのcＤＮ
ＡをクローニングしたプラスミドにＳalＩおよびＳpeＩ
リンカーを付加したプラスミド)を制限酵素ＳpeI及びＢ
alIにて切断し、反応混合液を全量１％のアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、大きなバンドを切り出してドライア
イスで凍らせた後、ＤＮＡを含む溶液を絞り出した。こ
れら３つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにて結合反
応を行なった後、反応混合物で大腸菌ＭＭ２９４を形質
転換した。得られたクローンの中から目的のプラスミド
pＤＨＰ１を得た。
８(ファルマシア)のＢglII−ＨindIIIにレニンのcＤＮ
ＡをクローニングしたプラスミドにＳalＩおよびＳpeＩ
リンカーを付加したプラスミド)を制限酵素ＳpeI及びＢ
alIにて切断し、反応混合液を全量１％のアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、大きなバンドを切り出してドライア
イスで凍らせた後、ＤＮＡを含む溶液を絞り出した。こ
れら３つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにて結合反
応を行なった後、反応混合物で大腸菌ＭＭ２９４を形質
転換した。得られたクローンの中から目的のプラスミド
pＤＨＰ１を得た。
【００５５】３）発現プラスミドpＤＨＰ２の構築
上記１)と同様の方法に従い、プラスミドpＤＨＰ１を制
限酵素ＳpeI及びＳalIにて切断し、アガロースから回収
したブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むＤＮＡ断片とプラス
ミドpＭＭ３２４(pdＢＰＶＭＭＴneo(ＡＴＣＣ３７２２
４)由来のＭＭＴプロモーターpＫＶ１０(ファルマシア)
由来のＳＶ４０のアーリースプライス領域、ポリアデニ
ル化部位およびpＮＥＯ(ファルマシア)由来のＮeo γ遺
伝子を持つプラスミド)を制限酵素ＳpeI及びＳalIにて
切断し、アガロースから回収した大きなＤＮＡ断片とを
リガーゼの存在下で結合反応に付した。反応混合物で大
腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。得られたクローンの中
から目的のプラスミドpＤＨＰ２を得た。更にプラスミ
ドpＤＨＰ２にて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得
られたクローン(ＨＢ１０１／pＤＨＰ２)から大量にプ
ラスミドＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを塩化セシ
ウムを用いた密度勾配超遠心で精製した後セファロース
ＣＬ４Ｂカラムにかけて混在するＲＮＡを除き、動物細
胞をトランスフェクションさせるプラスミドＤＮＡとし
た。プラスミドpＤＨＰ２に担持されているブタＤＨＰ
−ＩをコードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ
酸配列を図１２〜１３に示す。
限酵素ＳpeI及びＳalIにて切断し、アガロースから回収
したブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むＤＮＡ断片とプラス
ミドpＭＭ３２４(pdＢＰＶＭＭＴneo(ＡＴＣＣ３７２２
４)由来のＭＭＴプロモーターpＫＶ１０(ファルマシア)
由来のＳＶ４０のアーリースプライス領域、ポリアデニ
ル化部位およびpＮＥＯ(ファルマシア)由来のＮeo γ遺
伝子を持つプラスミド)を制限酵素ＳpeI及びＳalIにて
切断し、アガロースから回収した大きなＤＮＡ断片とを
リガーゼの存在下で結合反応に付した。反応混合物で大
腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。得られたクローンの中
から目的のプラスミドpＤＨＰ２を得た。更にプラスミ
ドpＤＨＰ２にて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得
られたクローン(ＨＢ１０１／pＤＨＰ２)から大量にプ
ラスミドＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを塩化セシ
ウムを用いた密度勾配超遠心で精製した後セファロース
ＣＬ４Ｂカラムにかけて混在するＲＮＡを除き、動物細
胞をトランスフェクションさせるプラスミドＤＮＡとし
た。プラスミドpＤＨＰ２に担持されているブタＤＨＰ
−ＩをコードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ
酸配列を図１２〜１３に示す。
【００５６】４）プラスミドpＤＨＰ４の構築
上記１)に示した方法に従い、１０μgのプラスミドpＤ
ＨＰＮ１を制限酵素ＫpnIにて切断した後、直鎖状ＤＮ
Ａを回収した。１０μgのＤＮＡを総量４０μm中に２μ
mのマングビーンヌクレアーゼを含んだ反応液にて室温
で２時間処理した。等量のフェノール／クロロホルムに
て抽出した後、１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウムを加
え、更に２.５倍量のエタノールを加えて−８０℃で１
０分間冷却した後、１５０００rpmで３分間遠心し、Ｄ
ＮＡを沈澱させて回収した。このＤＮＡ断片に１４μm
の蒸留水、４μmの１０×クレナウバッファー（０.５Ｍ
トリス−Ｈcl（pＨ７.６）、０.１Ｍ 塩化マグネシウ
ム)、１μmの２５mＭ dＮＴＰ、及び１μmのＤＮＡポリ
メラーゼＩ・クレナウ断片を加え室温で２時間反応し
た。この反応液２μmとＳalIリンカー(ＧＧＴＣＧＡＣ
Ｃ)１００ngをリガーゼの存在下、結合反応に付した。
反応混合物で大腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。得られ
たクローンの中から目的のプラスミドpＤＨＰ４を得
た。
ＨＰＮ１を制限酵素ＫpnIにて切断した後、直鎖状ＤＮ
Ａを回収した。１０μgのＤＮＡを総量４０μm中に２μ
mのマングビーンヌクレアーゼを含んだ反応液にて室温
で２時間処理した。等量のフェノール／クロロホルムに
て抽出した後、１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウムを加
え、更に２.５倍量のエタノールを加えて−８０℃で１
０分間冷却した後、１５０００rpmで３分間遠心し、Ｄ
ＮＡを沈澱させて回収した。このＤＮＡ断片に１４μm
の蒸留水、４μmの１０×クレナウバッファー（０.５Ｍ
トリス−Ｈcl（pＨ７.６）、０.１Ｍ 塩化マグネシウ
ム)、１μmの２５mＭ dＮＴＰ、及び１μmのＤＮＡポリ
メラーゼＩ・クレナウ断片を加え室温で２時間反応し
た。この反応液２μmとＳalIリンカー(ＧＧＴＣＧＡＣ
Ｃ)１００ngをリガーゼの存在下、結合反応に付した。
反応混合物で大腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。得られ
たクローンの中から目的のプラスミドpＤＨＰ４を得
た。
【００５７】５）発現プラスミドpＤＨＰ６の構築
上記１)と同様にして、プラスミドpＤＨＰ４を制限酵素
ＳpeI及びＳalIにて切断し、アガロースから回収したブ
タＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むＤＮＡ断片と、プラスミドp
ＭＭ３２４を制限酵素ＳpeI及びＳalIにて切断し、アガ
ロースから回収した大きなＤＮＡ断片とをリガーゼの存
在下、結合反応に付した。反応混合物で大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換した。得られたクローンの中から目的のプ
ラスミドpＤＨＰ６を得た。更にプラスミドpＤＨＰ６に
て大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得られたクローン
(ＨＢ１０１／pＤＨＰ６)から大量にプラスミドＤＮＡ
を回収した。回収したＤＮＡを塩化セシウムを用いた密
度勾配超遠心で精製した後、セファロースＣＬ４Ｂ(フ
ァルマシア)カラムにかけて混在するＲＮＡを除き、動
物細胞をトランスフェクションさせるプラスミドＤＮＡ
とした。
ＳpeI及びＳalIにて切断し、アガロースから回収したブ
タＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むＤＮＡ断片と、プラスミドp
ＭＭ３２４を制限酵素ＳpeI及びＳalIにて切断し、アガ
ロースから回収した大きなＤＮＡ断片とをリガーゼの存
在下、結合反応に付した。反応混合物で大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換した。得られたクローンの中から目的のプ
ラスミドpＤＨＰ６を得た。更にプラスミドpＤＨＰ６に
て大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得られたクローン
(ＨＢ１０１／pＤＨＰ６)から大量にプラスミドＤＮＡ
を回収した。回収したＤＮＡを塩化セシウムを用いた密
度勾配超遠心で精製した後、セファロースＣＬ４Ｂ(フ
ァルマシア)カラムにかけて混在するＲＮＡを除き、動
物細胞をトランスフェクションさせるプラスミドＤＮＡ
とした。
【００５８】実施例４ ブタＤＨＰ−Ｉの発現
１）発現プラスミドpＤＨＰ２及びpＤＨＰ６によるマウ
スＬ９２９細胞のトランスフェクションと産生細胞のク
ローニング ５×１０5個のＬ９２９細胞を９cmのペトリデッシュに
播き１０mmのＤＭＥＭ培地中にて一昼夜培養し、トラン
スフェクションする３時間前に培地を交換した。この細
胞を下記の如くに調製したＤＮＡ(３０μg)−燐酸カル
シウム沈澱懸濁液を用いてトランスフェクションした。
ＤＮＡ−燐酸カルシウム沈澱は以下のようにして作成し
た。
スＬ９２９細胞のトランスフェクションと産生細胞のク
ローニング ５×１０5個のＬ９２９細胞を９cmのペトリデッシュに
播き１０mmのＤＭＥＭ培地中にて一昼夜培養し、トラン
スフェクションする３時間前に培地を交換した。この細
胞を下記の如くに調製したＤＮＡ(３０μg)−燐酸カル
シウム沈澱懸濁液を用いてトランスフェクションした。
ＤＮＡ−燐酸カルシウム沈澱は以下のようにして作成し
た。
【００５９】滅菌蒸留水 ８８０μmに上記実施例３で得
たプラスミドＤＮＡ３０μgを溶解した溶液に１２０μm
の２Ｍ塩化カルシウムを加える。この溶液を、通気下に
撹拌している１mmの２×ＨＳＢ(１.０gのＨＥＰＥＳ、
１.６gの塩化ナトリウムを滅菌した蒸留水１００mmに溶
解させた溶液)と２０μmの７０mＭの燐酸バッファー(７
０mＭ 燐酸２水素１ナトリウム、７０mＭ 燐酸水素２ナ
トリウムにてpＨ７.１に調製したもの)との溶液に徐々
に加えた。トランスフェクション後の細胞１０mmを１０
％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地(ニッスイ)にて３７℃で一昼夜
培養し、再度培地交換した後、一昼夜培養した。更に、
１０mmの０.５mg／mm Ｇ４１８を含む培地で一昼夜培養
した後、ペトリデッシュ上に生育してきた細胞を１／１
０に希釈し、１０枚の新しいペトリデッシュに播き、
０.５mg／mm Ｇ４１８を含む培地にて培養した。培地は
４日毎に新しいものと交換した。コロニーが十分形成さ
れた後(約１０日前後)、コロニーを分離して９６穴プレ
ートに移し、１００μmの培地を加えて一昼夜培養し、
翌日４０μＭ硫酸亜鉛−２％ＦＣＳ−２mＭ 酪酸ナトリ
ウムの誘発培地に交換し、一昼夜培養した。ネガティブ
コントロールとしてトランスフェクションしていないＬ
９２９細胞及び誘発培地への交換を行わない組換え細胞
を用いた。ＤＨＰ−Ｉを発現しているトランスフェクタ
ントの選択及び高産生細胞のクローニングはグリシルデ
ヒドロフェニルアラニン(ＧＤＰ)を基質としたＤＨＰ−
Ｉのアッセイによる活性の測定に基づいて選択し、行っ
た。
たプラスミドＤＮＡ３０μgを溶解した溶液に１２０μm
の２Ｍ塩化カルシウムを加える。この溶液を、通気下に
撹拌している１mmの２×ＨＳＢ(１.０gのＨＥＰＥＳ、
１.６gの塩化ナトリウムを滅菌した蒸留水１００mmに溶
解させた溶液)と２０μmの７０mＭの燐酸バッファー(７
０mＭ 燐酸２水素１ナトリウム、７０mＭ 燐酸水素２ナ
トリウムにてpＨ７.１に調製したもの)との溶液に徐々
に加えた。トランスフェクション後の細胞１０mmを１０
％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地(ニッスイ)にて３７℃で一昼夜
培養し、再度培地交換した後、一昼夜培養した。更に、
１０mmの０.５mg／mm Ｇ４１８を含む培地で一昼夜培養
した後、ペトリデッシュ上に生育してきた細胞を１／１
０に希釈し、１０枚の新しいペトリデッシュに播き、
０.５mg／mm Ｇ４１８を含む培地にて培養した。培地は
４日毎に新しいものと交換した。コロニーが十分形成さ
れた後(約１０日前後)、コロニーを分離して９６穴プレ
ートに移し、１００μmの培地を加えて一昼夜培養し、
翌日４０μＭ硫酸亜鉛−２％ＦＣＳ−２mＭ 酪酸ナトリ
ウムの誘発培地に交換し、一昼夜培養した。ネガティブ
コントロールとしてトランスフェクションしていないＬ
９２９細胞及び誘発培地への交換を行わない組換え細胞
を用いた。ＤＨＰ−Ｉを発現しているトランスフェクタ
ントの選択及び高産生細胞のクローニングはグリシルデ
ヒドロフェニルアラニン(ＧＤＰ)を基質としたＤＨＰ−
Ｉのアッセイによる活性の測定に基づいて選択し、行っ
た。
【００６０】アッセイの方法は以下の通りである。９６
穴プレートにブタ腎臓由来の精製ＤＨＰをスタンダード
として５０μmの１mg／mm ＧＤＰを各ウエルに加え、３
３０nmの波長での反応速度(時間あたりの吸光度の変化)
を測定し、吸光度の変化から標準直線を求めた。次い
で、サンプルの誘発培地を除去し同様の条件で測定し、
標準直線から発現量を計算して求めた。このようにして
ＤＨＰ−Ｉを発現しているトランスフェクタントを選択
した後、更にこの細胞をクローニングすることにより高
産生細胞(ＰＤＨＰ２−１２−３：発現量２５９ng／mm)
を得た。同様にしてpＤＨＰ６によりトランスフェクシ
ョンすることにより発現細胞(ＰＤＨＰ６−２)を得た
(発現量：１３３ng／mm)。
穴プレートにブタ腎臓由来の精製ＤＨＰをスタンダード
として５０μmの１mg／mm ＧＤＰを各ウエルに加え、３
３０nmの波長での反応速度(時間あたりの吸光度の変化)
を測定し、吸光度の変化から標準直線を求めた。次い
で、サンプルの誘発培地を除去し同様の条件で測定し、
標準直線から発現量を計算して求めた。このようにして
ＤＨＰ−Ｉを発現しているトランスフェクタントを選択
した後、更にこの細胞をクローニングすることにより高
産生細胞(ＰＤＨＰ２−１２−３：発現量２５９ng／mm)
を得た。同様にしてpＤＨＰ６によりトランスフェクシ
ョンすることにより発現細胞(ＰＤＨＰ６−２)を得た
(発現量：１３３ng／mm)。
【００６１】実施例５ ヒトＤＨＰ−ＩcＤＮＡのクロ
ーニング １）プローブの作成 上記実施例２で調製した完全長のブタＤＨＰ−ＩcＤＮ
Ａクローン(ＭＭ２９４／ppcＤＨＰ２３)から得られた
プラスミドppcＤＨＰ２３を制限酵素ＳmaI及びＫpnIで
切断して得たＤＮＡ断片(ブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含
む)をプローブとして用いた。上記ＤＮＡ断片を[α−32
Ｐ]dＣＴＰを用いたニックトランスレーションキット
(宝酒造)にてラベルした後、１０mmのセファデックスＧ
５０スーパーファイン(ファルマシア)カラムにて精製し
た。ＴＥ緩衝液(pＨ８.０)にて最初に溶出される放射活
性の画分を回収した(２×１０8cpm／総容積)。
ーニング １）プローブの作成 上記実施例２で調製した完全長のブタＤＨＰ−ＩcＤＮ
Ａクローン(ＭＭ２９４／ppcＤＨＰ２３)から得られた
プラスミドppcＤＨＰ２３を制限酵素ＳmaI及びＫpnIで
切断して得たＤＮＡ断片(ブタＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含
む)をプローブとして用いた。上記ＤＮＡ断片を[α−32
Ｐ]dＣＴＰを用いたニックトランスレーションキット
(宝酒造)にてラベルした後、１０mmのセファデックスＧ
５０スーパーファイン(ファルマシア)カラムにて精製し
た。ＴＥ緩衝液(pＨ８.０)にて最初に溶出される放射活
性の画分を回収した(２×１０8cpm／総容積)。
【００６２】２）ライブラリーのスクリーニング
市販のヒト腎臓λgt１０cＤＮＡライブラリー(東洋紡)
を用い、１５０mmのプレート１枚あたりに約２×１０4
のプラークが現れるよう、ファージ液と指示菌を一緒に
播き、３７℃にて６時間培養した。プレートを４℃にて
１時間冷却した後、室温にてニトロセルロースフィルタ
ー(ＨＡＴＦ：ミリポア)をプレート上に置き、ロットリ
ングインクにてフィルターにマークし２分間放置した。
得られたフィルターを０.５Ｎ 水酸化ナトリウム、１.
５Ｍ 塩化ナトリウム溶液にて５分間処理して変性させ
た後、１.５Ｍ 塩化ナトリウム、０.５Ｍ トリス塩酸(p
Ｈ８)溶液にて５分間中和した。更にこのフィルターを
２×ＳＳＣ溶液に浸して２分間洗浄した後、室温にて３
０分間風乾した。乾燥したフィルターをろ紙に挟み真空
乾燥機にて８０℃２時間減圧乾燥した。乾燥したフィル
ターをハイブリバッグ(コスモバイオ)に入れ、１枚あた
り５mmのプレハイブリダイゼーションバッファー(５×
ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ、０.１％ フィコール、０.１
％ ポリビニルピロリドン、０.１％ ＢＳＡ、３０％ ホ
ルムアミド、１００μg／mm tＲＮＡ)を加えて密封し
た。４２℃にて５時間インキュベーションした。バッグ
を開封し、バッファーをよく除いた後、再度一枚につき
プレハイブリダイゼーションバッファー２.５mmおよび
上記の如く作成したプローブ２.５×１０6cpmを加えて
密封し、４２℃にて１６時間インキュベーションした。
バッグを開封しバッファーを完全に除去した後、フィル
ターを５０mmの４×ＳＳＣ−０.１％ ＳＤＳ溶液にて５
分間室温で洗浄した。更に同量の溶液にて４２℃で１０
分間洗浄した。フィルターをろ紙上で１０分間乾燥した
後、オートラジオグラフィーにかけた(−８０℃にて２
０時間露光した後現像する)。フィルムに現れたオート
ラジオグラムのシグナルの位置に相当する付近のファー
ジプラーグ(直径５〜１０mmの範囲、約１０〜１００ク
ローン)をプレートからつり上げ１mmのファージ希釈液
(０.１Ｍ 塩化ナトリウム−８mＭ 硫酸マグネシウム−
１Ｍトリス塩酸(pＨ７.５)−２％ゼラチン)に懸濁させ
た。得られたファージ液の力価を測った後、これらの陽
性プラークを含むファージ液を上記と同様にしてスクリ
ーニングし、クローンを単離した。直径９０mmのシャー
レを用い、フィルターあたり約２００〜５００プラーク
のファージが得られるようにプレーティングし、スクリ
ーニングすることにより、陽性クローンを単離した。こ
のようにして約１×１０5のプラーク(６枚のプレート)
をスクリーニングし、ヒトＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むフ
ァージクローン(λＤＨＰ−Ｉ＃３−１)を得た。
を用い、１５０mmのプレート１枚あたりに約２×１０4
のプラークが現れるよう、ファージ液と指示菌を一緒に
播き、３７℃にて６時間培養した。プレートを４℃にて
１時間冷却した後、室温にてニトロセルロースフィルタ
ー(ＨＡＴＦ：ミリポア)をプレート上に置き、ロットリ
ングインクにてフィルターにマークし２分間放置した。
得られたフィルターを０.５Ｎ 水酸化ナトリウム、１.
５Ｍ 塩化ナトリウム溶液にて５分間処理して変性させ
た後、１.５Ｍ 塩化ナトリウム、０.５Ｍ トリス塩酸(p
Ｈ８)溶液にて５分間中和した。更にこのフィルターを
２×ＳＳＣ溶液に浸して２分間洗浄した後、室温にて３
０分間風乾した。乾燥したフィルターをろ紙に挟み真空
乾燥機にて８０℃２時間減圧乾燥した。乾燥したフィル
ターをハイブリバッグ(コスモバイオ)に入れ、１枚あた
り５mmのプレハイブリダイゼーションバッファー(５×
ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ、０.１％ フィコール、０.１
％ ポリビニルピロリドン、０.１％ ＢＳＡ、３０％ ホ
ルムアミド、１００μg／mm tＲＮＡ)を加えて密封し
た。４２℃にて５時間インキュベーションした。バッグ
を開封し、バッファーをよく除いた後、再度一枚につき
プレハイブリダイゼーションバッファー２.５mmおよび
上記の如く作成したプローブ２.５×１０6cpmを加えて
密封し、４２℃にて１６時間インキュベーションした。
バッグを開封しバッファーを完全に除去した後、フィル
ターを５０mmの４×ＳＳＣ−０.１％ ＳＤＳ溶液にて５
分間室温で洗浄した。更に同量の溶液にて４２℃で１０
分間洗浄した。フィルターをろ紙上で１０分間乾燥した
後、オートラジオグラフィーにかけた(−８０℃にて２
０時間露光した後現像する)。フィルムに現れたオート
ラジオグラムのシグナルの位置に相当する付近のファー
ジプラーグ(直径５〜１０mmの範囲、約１０〜１００ク
ローン)をプレートからつり上げ１mmのファージ希釈液
(０.１Ｍ 塩化ナトリウム−８mＭ 硫酸マグネシウム−
１Ｍトリス塩酸(pＨ７.５)−２％ゼラチン)に懸濁させ
た。得られたファージ液の力価を測った後、これらの陽
性プラークを含むファージ液を上記と同様にしてスクリ
ーニングし、クローンを単離した。直径９０mmのシャー
レを用い、フィルターあたり約２００〜５００プラーク
のファージが得られるようにプレーティングし、スクリ
ーニングすることにより、陽性クローンを単離した。こ
のようにして約１×１０5のプラーク(６枚のプレート)
をスクリーニングし、ヒトＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むフ
ァージクローン(λＤＨＰ−Ｉ＃３−１)を得た。
【００６３】３）プラスミドpＵＣλ３−１の構築
５０μgのλＤＨＰ−Ｉ＃３−１に１５μmのＨindIII切
断バッファー、および各５μmの制限酵素ＨindIIIおよ
びＢglIIを加え３７℃一昼夜インキュベーションした。
反応混合液を全量１％のアガロースゲル電気泳動にか
け、３Ｋbp付近のバンドを切り出しドライアイスで凍ら
せた後、ＤＮＡを含む溶液を絞り出した。この溶液(約
２００μm)をフェノール／クロロホルム(１／１)にて抽
出した後、secＢuＯＨにて約１５μmまで濃縮した。エ
タノール沈澱にてＤＮＡを沈澱させ、７０％ エタノー
ルにて洗浄し、減圧乾燥した後、２０μmのＴＥ緩衝液
(pＨ８.０)に溶解した。
断バッファー、および各５μmの制限酵素ＨindIIIおよ
びＢglIIを加え３７℃一昼夜インキュベーションした。
反応混合液を全量１％のアガロースゲル電気泳動にか
け、３Ｋbp付近のバンドを切り出しドライアイスで凍ら
せた後、ＤＮＡを含む溶液を絞り出した。この溶液(約
２００μm)をフェノール／クロロホルム(１／１)にて抽
出した後、secＢuＯＨにて約１５μmまで濃縮した。エ
タノール沈澱にてＤＮＡを沈澱させ、７０％ エタノー
ルにて洗浄し、減圧乾燥した後、２０μmのＴＥ緩衝液
(pＨ８.０)に溶解した。
【００６４】５μm(〜５μg)のpＵＣ９に５μmのＨindI
II切断バッファー、９μmの蒸留水、および各２μmの制
限酵素ＨindIIIおよびＢamＨＩを加え、３７℃で一昼夜
インキュベーションした。反応混合液を７０℃で１０分
加熱し酵素を失活させた。上記で得たＤＨＰ−ＩcＤＮ
Ａ断片を含む溶液１０μmとpＵＣ９ベクター断片を含む
溶液１０μmに６μmの５×リガーゼバッファー、３μm
の２０mＭ ＡＴＰおよび２μmのＴ４ＤＮＡリガーゼ加
えて３７℃で１時間インキュベーションした。大腸菌Ｊ
Ｍ８３をこの反応混合液１５μmで形質転換した。１０
０μg／mmアンピシリン、１００μmの１００mＭ ＩＰＴ
Ｇおよび１００μmの２％ Ｘ−gal(５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド)の入っ
たＬ培地プレート４枚に形質転換した菌を播き、３７℃
で一昼夜インキュベーションした。
II切断バッファー、９μmの蒸留水、および各２μmの制
限酵素ＨindIIIおよびＢamＨＩを加え、３７℃で一昼夜
インキュベーションした。反応混合液を７０℃で１０分
加熱し酵素を失活させた。上記で得たＤＨＰ−ＩcＤＮ
Ａ断片を含む溶液１０μmとpＵＣ９ベクター断片を含む
溶液１０μmに６μmの５×リガーゼバッファー、３μm
の２０mＭ ＡＴＰおよび２μmのＴ４ＤＮＡリガーゼ加
えて３７℃で１時間インキュベーションした。大腸菌Ｊ
Ｍ８３をこの反応混合液１５μmで形質転換した。１０
０μg／mmアンピシリン、１００μmの１００mＭ ＩＰＴ
Ｇおよび１００μmの２％ Ｘ−gal(５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド)の入っ
たＬ培地プレート４枚に形質転換した菌を播き、３７℃
で一昼夜インキュベーションした。
【００６５】生育した菌の内、白色のコロニーを選び、
１２クローンを１.５mmの１００μg／mmアンピシリンを
含むＬ培地にて３７℃で８時間培養した。これらの菌か
らアルカリ法にてプラスミドを回収し、制限酵素にて正
しい断片がクローニングされたクローンであるかどうか
を調べ、目的のプラスミドpＵＣλ３−１を得た。４）
ＤＮＡマッピング及び配列の決定cＤＮＡを含むプラス
ミドpＵＣλ３−１を種々の制限酵素にて切断し、cＤＮ
Ａのおおまかなマッピングを行ない、更にそれらの内の
断片をＭ１３ファージのmp１８あるいはmp１９にサブク
ローニングした。これらのサブクローニングされたファ
ージのssＤＮＡを用い、ジデオキシ法にてＤＮＡの配列
を決定した。得られたＤＮＡ配列から推定されるアミノ
酸配列は先に部分決定したブタＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配
列と高いホモロジーがあった。これらの結果を図６〜８
に示す。
１２クローンを１.５mmの１００μg／mmアンピシリンを
含むＬ培地にて３７℃で８時間培養した。これらの菌か
らアルカリ法にてプラスミドを回収し、制限酵素にて正
しい断片がクローニングされたクローンであるかどうか
を調べ、目的のプラスミドpＵＣλ３−１を得た。４）
ＤＮＡマッピング及び配列の決定cＤＮＡを含むプラス
ミドpＵＣλ３−１を種々の制限酵素にて切断し、cＤＮ
Ａのおおまかなマッピングを行ない、更にそれらの内の
断片をＭ１３ファージのmp１８あるいはmp１９にサブク
ローニングした。これらのサブクローニングされたファ
ージのssＤＮＡを用い、ジデオキシ法にてＤＮＡの配列
を決定した。得られたＤＮＡ配列から推定されるアミノ
酸配列は先に部分決定したブタＤＨＰ−Ｉのアミノ酸配
列と高いホモロジーがあった。これらの結果を図６〜８
に示す。
【００６６】実施例６ 発現プラスミドの構築
１）プラスミドpＤＨＰspe１の構築
実施例３と同様にして、プラスミドpＵＣλ３−１を制
限酵素ＳmaIにて切断したＤＮＡ断片とＳpeＩリンカー
ＤＮＡ(pＧＡＣＴＡＧＴＣ)とのリガーゼによる結合反
応を行なった後、大腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。得
られたクローンの中から目的のプラスミドpＤＨＰspe１
を得た。
限酵素ＳmaIにて切断したＤＮＡ断片とＳpeＩリンカー
ＤＮＡ(pＧＡＣＴＡＧＴＣ)とのリガーゼによる結合反
応を行なった後、大腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。得
られたクローンの中から目的のプラスミドpＤＨＰspe１
を得た。
【００６７】２）プラスミドpＤＨＰ７の構築
１０μgのプラスミドpＤＨＰspeIを制限酵素ＳacＩにて
切断した後回収し、総量４０μm中に２μmのマングビー
ンヌクレアーゼを含んだ反応液にて室温で２時間処理し
た。フェノール／クロロホルム抽出後、次いでエタノー
ル沈澱してＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片に１４μ
mの蒸留水、４μmの１０×クレナウバッファー、１μm
の２５mＭ dＮＴＰ、及び１μmのＤＮＡポリメラーゼＩ
・クレナウ断片を加え室温で２時間反応した。この反応
液２μmとＳalＩリンカー(ＧＧＴＣＧＡＣ)１００ngを
リガーゼ存在下にて結合反応に付した後、大腸菌ＭＭ２
９４を形質転換した。得られたクローンの中から目的の
プラスミドpＤＨＰ７を得た。
切断した後回収し、総量４０μm中に２μmのマングビー
ンヌクレアーゼを含んだ反応液にて室温で２時間処理し
た。フェノール／クロロホルム抽出後、次いでエタノー
ル沈澱してＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片に１４μ
mの蒸留水、４μmの１０×クレナウバッファー、１μm
の２５mＭ dＮＴＰ、及び１μmのＤＮＡポリメラーゼＩ
・クレナウ断片を加え室温で２時間反応した。この反応
液２μmとＳalＩリンカー(ＧＧＴＣＧＡＣ)１００ngを
リガーゼ存在下にて結合反応に付した後、大腸菌ＭＭ２
９４を形質転換した。得られたクローンの中から目的の
プラスミドpＤＨＰ７を得た。
【００６８】３）プラスミドpＤＨＰ８の構築
上記１)記載の方法と同様にして、プラスミドpＤＨＰ７
を制限酵素ＳpeＩ及びＳalＩにて切断し、アガロースか
ら回収したＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むＤＮＡ断片と、プ
ラスミドpＭＭ３２４を制限酵素ＳpeＩ及びＳalＩにて
切断しアガロースから回収した大きなＤＮＡ断片とをリ
ガーゼによる結合反応に付し、反応混合物で大腸菌ＭＭ
２９４を形質転換した。得られたクローンの中から目的
のプラスミドpＤＨＰ８を得た。更にプラスミドpＤＨＰ
８にて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得られたクロ
ーン(ＨＢ１０１／pＤＨＰ８)から大量にプラスミドＤ
ＮＡを回収した。回収したＤＮＡを塩化セシウムを用い
た密度勾配超遠心で精製した後、セファロースＣＬ４Ｂ
カラムにかけて混在するＲＮＡを除き、動物細胞をトラ
ンスフェクションするプラスミドＤＮＡとした。プラス
ミドpＤＨＰ８の構築模式図を図１１に示す。
を制限酵素ＳpeＩ及びＳalＩにて切断し、アガロースか
ら回収したＤＨＰ−ＩcＤＮＡを含むＤＮＡ断片と、プ
ラスミドpＭＭ３２４を制限酵素ＳpeＩ及びＳalＩにて
切断しアガロースから回収した大きなＤＮＡ断片とをリ
ガーゼによる結合反応に付し、反応混合物で大腸菌ＭＭ
２９４を形質転換した。得られたクローンの中から目的
のプラスミドpＤＨＰ８を得た。更にプラスミドpＤＨＰ
８にて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得られたクロ
ーン(ＨＢ１０１／pＤＨＰ８)から大量にプラスミドＤ
ＮＡを回収した。回収したＤＮＡを塩化セシウムを用い
た密度勾配超遠心で精製した後、セファロースＣＬ４Ｂ
カラムにかけて混在するＲＮＡを除き、動物細胞をトラ
ンスフェクションするプラスミドＤＮＡとした。プラス
ミドpＤＨＰ８の構築模式図を図１１に示す。
【００６９】実施例７ ヒトＤＨＰ−Ｉの発現及び同定
１）プラスミドpＤＨＰ８によるマウスＬ９２９細胞の
トランスフェクションと産生細胞のクローニング 実質上、実施例４と同様に行った。５×１０5細胞Ｌの
９２９細胞を９cmのペトリデッシュに播き１０mmのＤＭ
ＥＭ培地中にて一昼夜培養し、トランスフェクションす
る３時間前に培地を交換した。この細胞をＤＮＡ(３０
μg)にて燐酸カルシウム法を用いてトランスフェクショ
ンした。トランスフェクタントを４０μＭ 硫酸亜鉛−
２％ ＦＣＳ−２mＭ 酪酸ナトリウムの誘発培地にて一
昼夜培養した後、グリシルデヒドロフェニルアラニンを
基質とするＤＨＰ−Ｉのアッセイ法(実施例６参照)にて
ＤＨＰ−Ｉの活性を測定しＤＨＰ−Ｉを発現している細
胞を得た。ネガティブコントロールとしてトランスフェ
クションしていないＬ９２９細胞及び誘発培地に交換し
ない組換え細胞を用いた(ＰＤＨＰ８−１３−２５：発
現量１μg／mm)。
トランスフェクションと産生細胞のクローニング 実質上、実施例４と同様に行った。５×１０5細胞Ｌの
９２９細胞を９cmのペトリデッシュに播き１０mmのＤＭ
ＥＭ培地中にて一昼夜培養し、トランスフェクションす
る３時間前に培地を交換した。この細胞をＤＮＡ(３０
μg)にて燐酸カルシウム法を用いてトランスフェクショ
ンした。トランスフェクタントを４０μＭ 硫酸亜鉛−
２％ ＦＣＳ−２mＭ 酪酸ナトリウムの誘発培地にて一
昼夜培養した後、グリシルデヒドロフェニルアラニンを
基質とするＤＨＰ−Ｉのアッセイ法(実施例６参照)にて
ＤＨＰ−Ｉの活性を測定しＤＨＰ−Ｉを発現している細
胞を得た。ネガティブコントロールとしてトランスフェ
クションしていないＬ９２９細胞及び誘発培地に交換し
ない組換え細胞を用いた(ＰＤＨＰ８−１３−２５：発
現量１μg／mm)。
【図１】 ブタ腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードする、Ｎ−末端を欠失したＤＮＡ(ppcＤＨＰ７１)
の塩基配列および推定のアミノ酸配列の前部分を示す模
式図。
ードする、Ｎ−末端を欠失したＤＮＡ(ppcＤＨＰ７１)
の塩基配列および推定のアミノ酸配列の前部分を示す模
式図。
【図２】 ブタ腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードする、Ｎ−末端を欠失したＤＮＡ(ppcＤＨＰ７１)
の塩基配列および推定のアミノ酸配列の後部分を示す模
式図。
ードする、Ｎ−末端を欠失したＤＮＡ(ppcＤＨＰ７１)
の塩基配列および推定のアミノ酸配列の後部分を示す模
式図。
【図３】 ブタ腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードする、完全長のＤＮＡ(ppcＤＨＰ２３)の塩基配列
および推定のアミノ酸配列の前部分を示す模式図。
ードする、完全長のＤＮＡ(ppcＤＨＰ２３)の塩基配列
および推定のアミノ酸配列の前部分を示す模式図。
【図４】 ブタ腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードする、完全長のＤＮＡ(ppcＤＨＰ２３)の塩基配列
および推定のアミノ酸配列の中間部分を示す模式図。
ードする、完全長のＤＮＡ(ppcＤＨＰ２３)の塩基配列
および推定のアミノ酸配列の中間部分を示す模式図。
【図５】 ブタ腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードする、完全長のＤＮＡ(ppcＤＨＰ２３)の塩基配列
および推定のアミノ酸配列の後部分を示す模式図。
ードする、完全長のＤＮＡ(ppcＤＨＰ２３)の塩基配列
および推定のアミノ酸配列の後部分を示す模式図。
【図６】 ヒト腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列の
前部分を示す模式図。
ードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列の
前部分を示す模式図。
【図７】 ヒト腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列の
中間部分を示す模式図。
ードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列の
中間部分を示す模式図。
【図８】 ヒト腎臓由来のデヒドロペプチダーゼＩをコ
ードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列の
後部分を示す模式図。
ードするＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列の
後部分を示す模式図。
【図９】 プラスミドpＤＨＰ２の構築模式図。
【図１０】 プラスミドpＤＨＰ４およびpＤＨＰ６の構
築模式図。
築模式図。
【図１１】 プラスミドpＤＨＰ８の構築模式図。
【図１２】 プラスミドpＤＨＰ２に担持されているデ
ヒドロペプチダーゼＩ前駆体をコードするＤＮＡの塩基
配列および推定のアミノ酸配列の前部分を示す模式図。
ヒドロペプチダーゼＩ前駆体をコードするＤＮＡの塩基
配列および推定のアミノ酸配列の前部分を示す模式図。
【図１３】 プラスミドpＤＨＰ２に担持されているデ
ヒドロペプチダーゼＩ前駆体をコードするＤＮＡの塩基
配列および推定のアミノ酸配列の後部分を示す模式図。
ヒドロペプチダーゼＩ前駆体をコードするＤＮＡの塩基
配列および推定のアミノ酸配列の後部分を示す模式図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 9/50 7823−4Ｂ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 5/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 丹羽 峰雄
京都府向日市上植野町切之口７−15
(72)発明者 小林 正和
兵庫県宝塚市花屋敷松ガ丘23−４
Claims (8)
- 【請求項１】 デヒドロペプチダーゼ−Ｉの酵素活性を
有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
であって、図３〜５、図６〜８または図１２〜１３のい
ずれかに記載のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ。 - 【請求項２】 図１２〜１３記載の成熟デヒドロペプチ
ダーゼ−Ｉのアミノ酸配列をコードする請求項１のＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 図３〜５記載の成熟デヒドロペプチダー
ゼ−Ｉのアミノ酸配列をコードする請求項１のＤＮＡ。 - 【請求項４】 図６〜８記載の成熟デヒドロペプチダー
ゼ−Ｉのアミノ酸配列をコードする請求項１のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１のＤＮＡを含有する発現ベクタ
ー。 - 【請求項６】 請求項５の発現ベクターを含有する形質
転換体。 - 【請求項７】 図３〜５、図６〜８または図１２〜１３
のいずれかに記載の成熟デヒドロペプチダーゼ−Ｉのア
ミノ酸配列で示されるポリペプチド。 - 【請求項８】 請求項６の形質転換体を培地に培養し、
得られる培養物からデヒドロペプチダーゼ−Ｉを採取す
ることを特徴とするデヒドロペプチダーゼ−Ｉの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3115493A JPH053790A (ja) | 1990-04-19 | 1991-04-18 | デヒドロペプチダーゼ−ｉ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-103962 | 1990-04-19 | ||
| JP10396290 | 1990-04-19 | ||
| JP3115493A JPH053790A (ja) | 1990-04-19 | 1991-04-18 | デヒドロペプチダーゼ−ｉ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH053790A true JPH053790A (ja) | 1993-01-14 |
Family
ID=26444525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3115493A Pending JPH053790A (ja) | 1990-04-19 | 1991-04-18 | デヒドロペプチダーゼ−ｉ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH053790A (ja) |
Cited By (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2260858A2 (en) | 2003-11-06 | 2010-12-15 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands |
| WO2014159981A2 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Spirogen Sarl | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| WO2016037644A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| WO2016090050A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Genentech, Inc. | Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof |
| EP3088004A1 (en) | 2004-09-23 | 2016-11-02 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
| WO2017059289A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Genentech, Inc. | Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use |
| WO2017165734A1 (en) | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Genentech, Inc. | Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay |
| EP3235820A1 (en) | 2014-09-17 | 2017-10-25 | Genentech, Inc. | Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof |
| WO2017201449A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Genentech, Inc. | Protac antibody conjugates and methods of use |
| WO2017205741A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Genentech, Inc. | Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates |
| WO2017214024A1 (en) | 2016-06-06 | 2017-12-14 | Genentech, Inc. | Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use |
| US9889207B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-02-13 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US9919056B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-03-20 | Adc Therapeutics S.A. | Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates |
| US9931414B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-04-03 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US9931415B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-04-03 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US9950078B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-04-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US9956299B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-05-01 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates |
| US10010624B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-07-03 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10029018B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-07-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US10420777B2 (en) | 2014-09-12 | 2019-09-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US10544223B2 (en) | 2017-04-20 | 2020-01-28 | Adc Therapeutics Sa | Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate |
| US10695433B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-06-30 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10736903B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-08-11 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-anti-PSMA antibody conjugates |
| US10751346B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-08-25 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine—anti-PSMA antibody conjugates |
| US10780096B2 (en) | 2014-11-25 | 2020-09-22 | Adc Therapeutics Sa | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10799595B2 (en) | 2016-10-14 | 2020-10-13 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
| US11059893B2 (en) | 2015-04-15 | 2021-07-13 | Bergenbio Asa | Humanized anti-AXL antibodies |
| US11135303B2 (en) | 2011-10-14 | 2021-10-05 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US11160872B2 (en) | 2017-02-08 | 2021-11-02 | Adc Therapeutics Sa | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US11318211B2 (en) | 2017-06-14 | 2022-05-03 | Adc Therapeutics Sa | Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC |
| US11352324B2 (en) | 2018-03-01 | 2022-06-07 | Medimmune Limited | Methods |
| US11370801B2 (en) | 2017-04-18 | 2022-06-28 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
| US11524969B2 (en) | 2018-04-12 | 2022-12-13 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof as antitumour agents |
| US11612665B2 (en) | 2017-02-08 | 2023-03-28 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US11649250B2 (en) | 2017-08-18 | 2023-05-16 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
| US11702473B2 (en) | 2015-04-15 | 2023-07-18 | Medimmune Limited | Site-specific antibody-drug conjugates |
-
1991
- 1991-04-18 JP JP3115493A patent/JPH053790A/ja active Pending
Cited By (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2260858A2 (en) | 2003-11-06 | 2010-12-15 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands |
| EP3088004A1 (en) | 2004-09-23 | 2016-11-02 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
| US11135303B2 (en) | 2011-10-14 | 2021-10-05 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US9919056B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-03-20 | Adc Therapeutics S.A. | Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates |
| US9931415B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-04-03 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US11779650B2 (en) | 2012-10-12 | 2023-10-10 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10695433B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-06-30 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10335497B2 (en) | 2012-10-12 | 2019-07-02 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US10799596B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-10-13 | Adc Therapeutics S.A. | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10780181B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-09-22 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10751346B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-08-25 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine—anti-PSMA antibody conjugates |
| US9889207B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-02-13 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US10736903B2 (en) | 2012-10-12 | 2020-08-11 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-anti-PSMA antibody conjugates |
| US9931414B2 (en) | 2012-10-12 | 2018-04-03 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US11771775B2 (en) | 2012-10-12 | 2023-10-03 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| WO2014159981A2 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Spirogen Sarl | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US9950078B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-04-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US9956299B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-05-01 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates |
| US10010624B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-07-03 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US10029018B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-07-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US10188746B2 (en) | 2014-09-10 | 2019-01-29 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| WO2016037644A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| US10420777B2 (en) | 2014-09-12 | 2019-09-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
| EP3235820A1 (en) | 2014-09-17 | 2017-10-25 | Genentech, Inc. | Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof |
| US10780096B2 (en) | 2014-11-25 | 2020-09-22 | Adc Therapeutics Sa | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| WO2016090050A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Genentech, Inc. | Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof |
| US11059893B2 (en) | 2015-04-15 | 2021-07-13 | Bergenbio Asa | Humanized anti-AXL antibodies |
| US11702473B2 (en) | 2015-04-15 | 2023-07-18 | Medimmune Limited | Site-specific antibody-drug conjugates |
| WO2017059289A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Genentech, Inc. | Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use |
| WO2017165734A1 (en) | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Genentech, Inc. | Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay |
| WO2017201449A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Genentech, Inc. | Protac antibody conjugates and methods of use |
| WO2017205741A1 (en) | 2016-05-27 | 2017-11-30 | Genentech, Inc. | Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates |
| WO2017214024A1 (en) | 2016-06-06 | 2017-12-14 | Genentech, Inc. | Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use |
| US10799595B2 (en) | 2016-10-14 | 2020-10-13 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
| US11160872B2 (en) | 2017-02-08 | 2021-11-02 | Adc Therapeutics Sa | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US11813335B2 (en) | 2017-02-08 | 2023-11-14 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US11612665B2 (en) | 2017-02-08 | 2023-03-28 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
| US11370801B2 (en) | 2017-04-18 | 2022-06-28 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
| US10544223B2 (en) | 2017-04-20 | 2020-01-28 | Adc Therapeutics Sa | Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate |
| US11318211B2 (en) | 2017-06-14 | 2022-05-03 | Adc Therapeutics Sa | Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC |
| US11938192B2 (en) | 2017-06-14 | 2024-03-26 | Medimmune Limited | Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC |
| US11649250B2 (en) | 2017-08-18 | 2023-05-16 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
| US11352324B2 (en) | 2018-03-01 | 2022-06-07 | Medimmune Limited | Methods |
| US11524969B2 (en) | 2018-04-12 | 2022-12-13 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof as antitumour agents |
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