KR970001567B1 - 사람 갑상선 기원의 재조합 C-말단 α-아미드화 효소 - Google Patents

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Description

사람 갑상선 기원의 재조합 C-말단 α-아미드화 효소

제1-1 내지 1-4도는 파아지 클론λgt10ch201에서의 cDNA 영역의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.

제2-1 내지 2-3도는 파아지 클론λgt10chT2에서의 cDNA 영역의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.

제3-1 내지 3-4도는 파아지 클론λgt10ch101에서의 cDNA 영역의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.

제4도는 λgt10ch201에서의 cDNA 영역의 제한 효소 절단 지도(a) 및 cDNA 영역의 뉴클레오타이드 서열의 결정을 위한 전략(strategy)을 나타낸다.(b)

제5도는 λgt10chT2에서 cDNA 영역의 제한 효소 절단 지도(a) 및 cDNA 영역의 뉴클레오타이드 서열의 결정을 위한 전략을 나타낸다.(b)

제6도는 λgt10chT101에서의 cDNA 영역의 제한 효소 절단 지도(a) 및 cDNA 영역의 뉴클레오타이드 서열의 결정을 위한 전략(strategy)을 나타낸다.(b)

제7도는 제노푸스 라에비스 cDNA 라이브러리로부터 유래된 플라스미드 pXA799에서의 cDNA와 비교하여 λgt10chT201, λgt10chT2 및 λgt10chT101 및 λgt11chT40 및 λgt11chT28에서의 cDNA 영역 사이의 관계를 나타낸다.

제8도는 플라스미드 pUC18chT201 HintⅢ-BglⅡ의 작제 방법을 나타낸다.

제9도는 플라스미드 pUC19chT201 MPF의 작제방법을 나타낸다.

제10도는 플라스미드 P_LchT201 MPF-Sph의 작제 방법을 나타낸다.

제11도는 플라스미드 P_LchT201 MPF-S/B의 작제 방법을 나타낸다.

제12도는 플라스미드 pUC19chT201 -EcoRIO.7의 작제 방법을 나타낸다.

제13도는 플라스미드 pUC18-Sal의 작제 방법을 나타낸다.

제14도는 플라스미드 P_LchT201 MPF-Sal의 작제 방법을 나타낸다.

제15도는 플라스미드 P_LchT201 MPF-Bcl의 작제 방법을 나타낸다.

제16도는 플라스미드 pUC19chT201 MFK의 작제 방법을 나타낸다.

제17도는 플라스미드 P_LchT201 MPF-Sph의 작제 방법을 나타낸다.

제18도는 플라스미드 P_LchT201 MPK-S/B의 작제 방법을 나타낸다.

제19도는 플라스미드 P_LchT201 MPK-Sal의 작제 방법을 나타낸다.

제20도는 플라스미드 P_LchT201 MPF-Bcl의 작제 방법을 나타낸다.

제21도는 플라스미드 P_LchT2 MPF-Pst 및 P_LchT2 MFK-Pst의 작제 방법을 나타낸다.

제22도는 플라스미드 P_LchT2 MPF-Bcl 및 P_LchT2 MFK-Bcl의 작제 방법을 나타낸다.

제23도는 상술한 상이한 플라스미드로 형질전환된 에스케리챠콜라이 W3100에 의한 C-말단 α-아미드화 효소의 기질아미드화율(%)의 측면에서의 생산률을 나타낸다.

제24도는 플라스미드 pUC18-Hpa Ⅱ의 작제 방법을 나타낸다.

제25도는 플라스미드 PkDch201 MPF-Sph, -Sal, -S/B 및 -Bcl의 작제 방법을 나타낸다.

제26도는 플라스미드 PkDchT201-PstI의 작제 방법을 나타낸다.

제27도는 플라스미드 pUC18chT2 HindⅢ-BglⅡ의 작제 방법을 나타낸다.

제28도는 플라스미드 pUC18chT201~chT2의 작제 방법을 나타낸다.

제29도는 플라스미드 P_LchT2 KpnI-PstI의 작제방법을 나타낸다.

제30도는 플라스미드 PkDchT2 PstI의 작제 방법을 나타낸다.

제31도는 플라스미드 PkDchT2-Bcl의 작제 방법을 나타낸다.

제32(a) 및 32(b)도는 상술한 상이한 플라스미드로 형질감염된 COS-1 세포에 의한 C-말단 α-아미드화 효소의 생산률을 기질 아미드화율(%)의 측면에서 나타낸다.

제33(a), 33(b) 및 34도는 다양한 플라스미드로부터 유래된 C-말단 α-아미드화 효소의 아미노산 서열을 도식적으로 나타낸다.

발명의 분야

본 발명은 사람 갑상선 기원의 재조합 C-말단 α-아미드화 효소 및 이의 전구체, 이들 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA, DNA를 함유하는 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질 전환된 숙주 세포 및 형질전환된 세포를 사용하여 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

관련분야의 기술

진핵 세포에서, mRNA로부터 해독 후 몇몇 종류의 펩타이드 또는 단백질은 세포내 효소에 의해 변형되어 천연형 펩타이드 또는 단백질로 성숙함이 일반적으로 공지되어 있다(해독-후 변형). 그러나 진핵 생물 기원의 펩타이드 또는 단백질 제조에 널리 사용되는 이. 콜라이(E. Coli) 같은 원핵성 숙주는 발현된 펩타이드 또는 단백질의 해독-후 변형을 겪지 않기 때문에, 원핵성 숙주 세포를 사용한 재조합 DNA 기술에 의해 진핵성 펩타이드 또는 단백질을 직접적으로 생산하기가 때로 어렵다.

펩타이드 또는 단백질의 진핵성 세포의 해독-후 변형 특성중 하나는, 펩타이드 또는 단백질의 카복시 말단 (C-말단)의 α-위치가 아미드화되는 것으로서, 즉-COOH가 -CONH₂로 전환되는 것으로, 많은 생리적 활성 펩타이드 또는 단백질이 이러한 변형을 진행하여 몇몇 경우에 있어서는 상술한 펩타이드 또는 단백질의 변형이 이의 생리적 활성에 필수적임이 공지되어 있다. 예를 들면, 천연형 사람 칼시토닌의 C-말단 부위의 프롤린 아미드 잔기가 프롤린 잔기로 전화하면 본래 활성의 1/1,600으로 이의 생리적 활성이 감소된다.

조직 내에서의 α-아미드 형성 기작을 명백히 하는 중요성 및, 예를 들면 재조합 DNA 기술을 사용해 C-말단 α-아미드화된 펩타이드를 제조하기 위한 효소의 유망한 유용성으로 인해, 진핵 세포에 특징적인 C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 생합성에 관한 세부적 기작을 명백히 하기 위한 수 많은 시도가 이루어져 왔다. 이러한 과정에서 먼저 아미드화된 펩타이드의 전구체 구조는 아미드화된 펩타이드의 cDNA 분석으로부터 확실시됨으로써, 그 결과 이러한 아미드화된 펩타이드의 일반적 생합성 기작이, mRNA가 아미드화된 펩타이드의 전구체로 해독된 후 이의 C-말단 α-위치에서 C-말단 α-아미드화 효소에 의해 아미드화되어지는 것이라고 밝혀진다. 상술한 반응에서, C-말단 α-아미드화 효소에 대한 기질로서 C-말단 α-아미드화된 펩타이드의 전구체가 일반식 R-X-Gly(여기서, R은 펩타이드 또는 단백질의 N-말단 부위의 아미노산 서열을 나타내고, X는 이의 C-말단에서 α-아미드화되는 아미노산 잔기이며, Gly는 글리신 잔기이다)에 의해 표현되어짐을 주목한다.

한편, 돼지 뇌하수체에서, 브래드버그[참조 : Bradburg. A. F. etal., Nature 298, 686~688, 1982]는 최초로 합성 기질 D-Tyr-Val-Gly을 D-Tyr-Val-NH₂로 전환시키는 α-아미드화 활성의 특성을 나타내고, 기질내 C-말단 글리신이 α-아미드화에 있어서 질소-공여체로서 작용함을 설명하고 있다. 또한 에이퍼[참조 : Eipper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 80, 5144~5148, 1983] 등은 랫트의 뇌하수체선으로부터 유래된 α-아미드화 효소가 이러한 활성을 위해 산소 분자 이외에 구리 양이온 및 아스코르베이트를 필요로 함을 기술하고 있다. 문헌[참조 : Husain, I. et al., FEBS Lett., 152 227~281, 1983; 및 Kizer, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 81, 3228~3232, 1984] 또한 C-말단 α-아미드화 효소에 대해 기술하고 있으나 정제된 효소에 대한 기록은 없다. 최근 머티 등[참조 : Murthy A. S. N. et al., J. Biol. Chem., 261, 1815~1882, 1986]은 소의 뇌하수체선으로부터 C-말단 α-아미드화 효소를 부분적으로 정제하고, 상이한 분자량 및 전하를 갖는 몇몇 유형의 효소가 존재함을 나타냈다.

최근, 미주노 등은 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 피부로부터 균일하고 정제된 형태로 C-말단 α-아미드화 효소를 분리시키는데 성공하였고 [참조 : Mizuno. K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 137, 984~991, 1988, 및 일본국 특허원 제61-131089호에 해당하는 EP 제0249412 A3호], cDNA를 수득하며 서열 측정함으로써 제노푸스 라에비스 기원 피부의 C-말단 α-아미드화 효소의 전체적인 1차 아미노산 서열을 결정하는데 추가로 성공하였다[참조 : Mizuno, K. et al., Biochem. Biophys. Bes. Commun. 148, 546~552. 1987].

한편, 에이퍼 등[참조 : Eipper, B. et al., Mol. Endo. 1, 777~790, 1987]은 송아지 뇌하수체선의 C-말단 α-아미드화 효소의 cDNA를 클로닝하여, 송아지 뇌하수체선의 효소가 상술한 제노푸스 라에비스 기원의 효소와 명백히 상이함을 밝혔다.

상술한 기술은 진행성 기원의 많은 C-말단 α-아미드화 효소가 존재함을 나타내고, 이는 각각의 효소가 이외의 것과 상이한 특정한 기질 특이성을 가짐을 제시하고 있다 : 즉, 비록 현재까지는 완전히 입증되지 않았으나 특정 C-말단 α-아미드화 효소가 특정 C-말단 α-아미드화 펩타이드에 대해 존재하는 것이다.

한편, 만일 C-말단 α-아미드화 효소가 대량으로 생산될 수 있으면, 산업적으로 중요한 α-아미드화된 펩타이드를 대량으로 제조가능케 된다. 그럼에도 불구하고, 상술한 바와 같이, 만일 다양한 종류의 C-말단 α-아미드화 효소가 존재하고, 각각의 효소는 특정한 기질 특이성을 갖게 되어 특이 α-아미드화된 펩타이드 또는 단백질의 생합성에 책임이 있게 된다면, 목적하는 α-아미드화된 펩타이드 또는 단백질을 제조할 때 가장 적합한 C-말단 α-아미드화 효소를 선택함이 중요하다.

이에 따라, 에이퍼 및 미주노 등의 효소 이외의 신규한 C-말단 α-아미드화 효소를 분리시켜 특정 α-아미드화된 펩타이드의 제조를 위해 사용 가능하도록 이의 구조를 결정하고 이의 기질-특이성을 명확히 해야 한다.

발명의 요약

이에 따라, 본 발명은 신규한 C-말단 α-아미드화 효소 및 이의 제조방법 및 제조방법 중 유용한 클로닝된 유전자 및 발현 벡터를 제공한다.

보다 특이적으로, 본 발명은 사람 갑상선 기원의 C-말단 α-아미드화 효소를 제공하는데, 이는 일반식(I)에 의해 표현되는 단백질 또는 펩타이드를 일반식(Ⅱ)에 의해 표현되는 α-아미드화된 단백질 또는 펩타이드로 전환시키고, 이의 생물학적 활성 유도체는 효소 활성을 유지시킨다.

R-X-Gly (I)

(여기서 Gly는 C-말단에 존재하는 글리신이고, X는 α-아미드화되는 아미노산이며 R은 펩타이드 또는 단백질의 나머지 부위이다)

R-X-NH₂ (Ⅱ)

(여기서 X-NH₂는 C-말단 α-아미드화된 아미노산이고, R은 상술한 바와 같다)

효소 및 이의 유도체의 바람직한 양태는 하기와 같다. 약 120,000D 이하의 분자량을 갖는 C-말단 α-아미드화 효소 또는 효소 활성을 유지하는 이의 생물학적 활성 유도체; 약 40, 000D 내지 약 120, 000D 사이의 분자량을 갖는 C-말단 α-아미드화 효소 또는 효소 활성을 유지하는 이의 생물학적 활성 유도체; 제1도에 도시된 아미노산 서열 중 37번째 Pro에서 시작하여 378번째 Lys에서 종료하는 아미노산 서열을 포함하는 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 효소 활성을 유지하는 생물학적 활성 유도체; 제1도의 제1번 Met 및 37번 pro 사이에 존재하는 아미노산에서 출발하여 378번 Lys과 974번 Ser 사이에 존재하는 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 갖는, C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 효소 활성을 유지하는 생물학적 활성 유도체 ; 제1도의 1번 Met과 37번 Pro 사이에 존재하는 아미노산에서 출발하여 378번 Lys과 974번 Ser 사이에 존재하는 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 갖고, 10개 아미노산 이하를 함유하는 추가의 C-말단 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는, C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 효소 활성을 유지하는 생물학적 활성 유도체; 제3도의 1번 Met과 37번 Pro 사이에 존재하는 아미노산에서 출발하여 378번 Lys과 866번 Ser 사이에 존재하는 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 갖는, C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 효소 활성을 유지하는 생물학적 활성 유도체; 제3도의 1번 Met과 37번 Pro 사이에 존재하는 아미노산에서 출발하여 378번 Lys과 866번 ser 사이의 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 갖고, 10개 아미노산 이하를 함유하는 추가의 C-말단 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는, C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 활성을 유지하는 생물학적 활성 유도체.

본 발명은 또한, (1) 효소 또는 이의 유도체를 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 원핵세포 또는 진핵세포를 배양하여 효소 또는 이의 유도체를 생성하고, (2) 배양물로부터 효소 또는 이의 유도체를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 상술한 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 생물학적 활성유도를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상술한 C-말단 α-아미드화 효소 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 추가로 상술한 유전자를 함유하는 플라스미드 및 파아지 벡터를 제공한다. 더우기, 본 발명은 플라스미드로 형질감염된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 제공한다.

바람직한 양태의 설명

본 발명가들은 이미 제노푸스 라에비스의 피부로부터 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 두 종류의 cDNA를 분리하여 이를 플라스미드 pXA457 및 pXA799로 클로닝시키는데 성공했다. 플라스미드 pXA799를 함유하는 이.콜라이 DHl/pXA799는 1987년 12월 3일 FERM BP-1586으로 FRI[Fermentation Resear

ch Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 1~3, Tsukuba-shil-chome, Ibaraki-ken, 301 Japan]에 기탁되어 있다(일본국 특허공개공보 제1-104168호; 제EP0299790 A2호). 또한, 에이퍼 등에 의해(상기 참조) 클로닝된 소의 뇌하수체선의 C-말단 α-아미드화 효소에 대한 cDNA에 의해 암호화된 일차 아미노산 서열을 본 발명가들에 의해 클로닝된 제노푸스 라에비스 C-말단 α-아미드화 효소에 대한 상술한 cDNA에 의해 암호화되는 일차 아미노산 서열과 비교함으로써, 효소 활성에 필수적인 것으로 입증된 N-말단 영역의 아미노산 서열이 상이한 기원의 모든 C-말단 α-아미드화 효소가 존재함에도 불구하는 효소 활성에 필수적인 도메인의 일차 아미노산 서열은 종과 조직 사이에서 보존됨을 의미한다. 이러한 개념을 근거로, 본 발명가들은 제노푸스 라에비스 기원의 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 탐침으로서 사용하여, 상이한 기원의 RNA로부터 유래된 cDNA 뱅크를 스크리닝하여 신규한 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA의 클로닝을 시도하고 있다.

이 경우, 널리 공지된 C-말단 α-아미드화 펩타이드인 사람 칼시토닌이 갑상선에서 생합성되어짐을 고려하여, 본 발명가들은 사람 갑상선으로부터 mRNA를 추출하여 cDNA 라이브러리를 제조한 후 탐침으로서 상술한 제노푸스 라에비스로부터 유래된 cDNA를 사용하여 라이브러리를 스크리닝 하였다. 그 결과, 상술한 공지의 C-말단 α-아미드화 효소의 아미노산 서열과는 명백히 상이한 일차 아미노산 서열을 갖는 신규한 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 두 종류의 cDNA를 수득하게 되었다. 더우기, 이와 같이 클로닝된 cDNA를 이. 콜라이를 형질전환하거나 동물세포, COSI(ATCC CRL 1680; Cell, 23, 175~182, 1981)을 형질 감염시키는데 사용해 클로닝된 유전자를 발현시키고, 발현산물은 합성 기질[¹²⁵I] Ac-Tyr-Phe-Gly을 사용하여 결정된 바와 같이 C-말단 α-아미드화 효소의 활성을 나타냄이 확인되었다.

본 발명에 따라, C-말단 α-아미드화 효소는 일반식 R-X-Gly(여기서 X는 C-말단 α-아미드화될 아미노산이고, Gly는 글리신이며 R은 펩타이드 또는 단백질의 잔존부위이다)에 의해 표현되는 펩타이드 또는 단백질의 일반식 R-X-NH₂에 의해 표현되는 펩타이드 또는 단백질로의 전환을 촉매한다. 본 발명의 C-말단 α-아미드화 효소는 사람 갑상선 기원의 천연 효소와 더불어 천연 효소의 아미노산 서열상의 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 상이한 아미노산(이때 하나 이상의 아미노산은 천연 효소의 아미노산 서열로 가해진다)에 의해 대체되거나, 하나 이상의 아미노산이 천연 효소의 아미노산 서열로부터 결실된 변형된 효소로서 상술한 효소 활성을 유지하는 효소를 포함한다.

하기에 본 발명을 보다 세부적으로 설명하고 있다.

(1) C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA의 분리

총 RNA를 사람 갑상선으로부터 제조하고, 총 RNA로부터 폴리(A)RNA를 올리고(dT) 셀룰로스 컬럼을 사용하여 제조한다. 그런 다음, 폴리(A)RNA를 사용하여 구블러 등[참조 : Gubler, V. and Hoffman. B. J., Gene 25, 263, 1983]의 방법에 따라 cDNA를 제조하여, 이와 같이 수득한 cDNA를 λgtⅡ 파아지 cDNA 라이브러리를 제조하기 위해 사용한다. 제노푸스 라에비스의 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pXA799를 Apa I 및 Dra I으로 분해시키고 약 2.8kb Apa I-Dra I DNA 단편을 닉해독(nick translation)에 의해[α^-32P]dCTP로 라벨링시켜 DNA 탐침을 제조한다. 그런 다음, 상술한 λgtⅡ cDNA 라이브러리를 DNA 탐침을 사용하여 스크리닝해 파아지 클론 λgt11chT28 및 λgt11ch40을 수득한다. 이들 두 개 클론의 분석 결과로써, 이들 클론이 전체적인 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 함유하지 않음이 밝혀졌다.

이와 상응하게, 전체적인 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 수득하기 위해 파아지 λgt10cDNA 라이브러리를 상술한 동일한 방법에 의해 상기 폴리(A) RNA로부터 제조한다. λgt10cDNA 라이브러리를 pXA799로부터 유래된 상술한 Apa I-Dra I DNA 탐침을 사용하여 스크리닝하여 파아지 클론 λgt10chT2를 수득한다. 또한, cDNA 라이브러리를 상술한 λgt11chT28 클론 중의 cDNA 영역으로부터 유래된 DNA 탐침을 사용하여 재스크리닝하여 파아지 클론 λgt10chT201를 수득한다. 추가로, cDNA 라이브러리를 λgt10ch201중의 35번 G 내지 425번 A 사이의 영역에 상응하는 라벨링된 SmaI-Xho I DNA 단편인 DNA 탐침을 사용하여 스크링닝하여 파아지 클론 λgt10ch101을 수득한다.

(2) C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA의 분석

상술한 바와 같이 수득된 파아지 DNA, 즉 λgt11chT28, λgt11chT40, λgt10chT201, λgt10chT2 및 λgt10chT101을 다양한 제한 효소로 절단하여 이들의 제한 효소 절단 지도를 제조한다. 파아지 λgt10chT201, λgt10chT2 및 λgt10chT101 중의 cDNA 영역에 대한 지도를 각각 제4(a), 5(a) 및 6(a)도에 도시하고 있다. 다음, 다양한 제한 효소로 λgt10chT201, λgt10chT2 및 λgt10chT101을 절단함으로써 제조된 각각의 DNA 단편을 M13 파아지내로 서브클로닝하여 생거 등의 방법[참조 : Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 34, 5463~5467, 1977]에 따라 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 파아지 클론 중의 cDNA 영역의 전체 뉴클레오타이드 서열을 제4(b), 5(b) 또는 6(b)도에 나타낸 전략에 따라 조합시킨다. 파아지 클론 λgt10chT201, λgt10chT2 및 λgt10chT101 중의 cDNA 영역의 뉴클레오타이드 서열은 각각 제1, 2 및 3도에 도시되어 있다.

(a) chT201 cDNA의 분석

파아지 클론 λgt10chT201 중의 cDNA 영역(chT201 cDNA로 지정)의 분석이 하기에 나타나 있다. : (1) chT201 cDNA는 3688개의 염기쌍으로 이루어지고 140번 뉴클레오타이드에서 시작하여 3061번 뉴클레오타이드에서 종료하는 긴판독 프레임을 함유한다.(제1도의 뉴클레오타이드 번호에 따른다) ; (2) 개환된 판독 프레임의 아미노산 서열은 N-말단 Met-Ala-Gly에서 시작하여 C-말단-Ser-Ser-Ser으로 종료하는 974개 아미노산 잔기로 이루어진다. (3) 제노푸스 라에비스에서 유도된 pXA799 중의 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 비교하여, chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 388번 아미노산에서 출발하여 494번 아미노산에서 종료하는 추가의 107개 아미노산 잔기를 함유하고(제1도에 도시된 아미노산 번호에 따른다) ; 상술한 추가의 아미노산 서열을 배제한 두 아미노산 서열간의 동질성은 DNA 수준으로 약 54%이고 단백질 수준에서 약 65%이다 ; (4) chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열 Asn-X-Ser(여기서 X는 411내지 413번 아미노산에 상응하는 어떠한 아미노산이다)에 의해 표현되는 아미노산 서열 및 서열 Asn-X-Thr(여기서 X는 762 내지 764번 아미노산에 상응하는 어떠한 아미노산 서열이다)에 의해 표현되는 아미노산 서열을 함유한다. 이들 아미노산 서열은 많은 이외의 당단백질의 분석으로부터 N-글리코실화된 부위로 간주되므로, chT201 cDNA에 의해 암호화된 단백질이 N-글리코실화되어 있을 가능성이 크다 ; (5) chT201 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이 이의 N-말단 부위에 소수성 아미노산 서열을 함유하고 소수성 서열은 분비 단백질의 특징인 시그날 서열로 간주되므로, C-말단 α-아미드화 효소는 전구체 단백질로서 발현된 후 가공되어 성숙한 단백질로 형성된다고 여겨진다. (6) chT201 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열은 864번 아미노산에서 시작하여 911번 아미노산에서 종료하는 영역을 함유하고, 이때 소수성 아미노산이 지속적으로 발생하며, 이 영역 직후에 염기성 아미노산 즉 아르기닌 및 라이신이 위치한다. 이러한 유형의 구조는 막 단백질의 전이막 도메인에서 빈번히 발견되기 때문에 본 발명의 C-말단 α-아미드화 효소가 막 단백질로서 존재할 가능성이 크다.

(b) 10chT2 cDNA의 분석

파아지 클론 λgt10chT2 내 cDNA 영역(chT2 cDNA로 지정됨)의 분석은 하기와 같이 나타난다 ; (1) chT2 cDNA는 첫 번째 뉴클레오타이드 T가 chT201cDNA의 409번 뉴클레오타이드와 상응하는 2863개 bp로 이루어져, 2번 뉴클레오타이드에서 시작하여 2329번 뉴클레오타이드에서 종료하는(제2도에 도시된 뉴클레오타이드 번호에 따라) 긴 판독 프레임을 함유한다. ; (2) 개환 판독 프레임에 상응하는 아미노산 서열은 N-말단 Asp-Phe-Lys에서 시작하여 C-말단-Ser-Ser-Ser에서 종료하는 776개 아미노산 잔기로 이루어지고, 이때 N-말단-Asp-Phe-Lys은 chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열 중 91번 아미노산에서 시작하는 -Asp-Phe-Lys 서열에 해당한다 ; (3)chT201에 의해 암호화되는 아미노산과 비교하여, chT2에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열중 388번 아미노산에서 시작하여 494번 아미노산에서 종료하는(제1도의 아미노산 번호에 상응한다) 107개 아미노산 잔기로 이루어지 아미노산 서열 부위에 상응하는 아미노산 서열이 결여되어 있다. 107개 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 서열 또한 pXA799 중의 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 결여되어 있다. 추가로, chT2 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열중의 897번 아미노산(제1도의 아미노산 번호에 상응)인 Ala가 결여되어 있다. 즉, chT2 cDNA에 암호화되는 아미노산 서열은 이것이 상술한 107개 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 서열부 및 chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 897번 아미노산 잔기 Ala에 상응하는 아미노산 서열 및 아미노산이 결여되었다는 점을 제외하고 chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열에서와 동일하다.

따라서, chT2 cDNA는 chT2 cDNA가 90번 Ⅱe에 대한 코돈 이하의 5'-말단 영역에 상응하는 5'-말단 영역이 결여된다는 점에서 불완전한 cDNA이다(참조 : 제2 및 7도).

(c) chT101 cDNA의 분석

파아지 클론 λgt10chT101의 cDNA 영역(chT101 cDNA로 지정됨)의 분석은 하기와 같다 : (1) chT101 cDNA는 3316bp로 이루어지고 56번 뉴클레오타이드에서 시작하여 2653번 뉴클레오타이드에서 종료하는 긴 판독 프레임을 함유한다. ; (2) 개환 판독 프레임에 상응하는 아미노산 서열은 N-말단 Met-Ala-Gly에서 출발하여 C-말단-Ser-Ser-Ser에서 종료하는 866개 아미노산 잔기로 이루어진다 ; (3) chT201 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 비교하여, chT101 cDNA에 암호화되는 아미노산 서열은, 388번 아미노산에서 시작하여 494번 아미노산에서 종료하는 107개 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 서열 부위에 상응하는 아미노산 서열 및 chT201 cDNA의 897번 Ala 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산이 결여되어 있는 점을 제외하고, chT201에 의해 암호화되는 것과 동일하다. 한편, chT2 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 비교하여 chT2 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 91번 Asp에서 시작하여 chT101 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 마지막 아미노산 Ser에서 종료하는 아미노산 서열에 상응한다. 따라서, chT101 cDNA는 chT2 cDNA에 결여된 5'-영역을 완전히 보완한다.

상술한 chT201 cDNA, chT2 cDNA 및 chT101 cDNA의 분석으로부터, 사람 갑상선 기원의 C-말단 α-아미드화 효소가 2가지 유형으로 분류될 수 있는 것같다 ; 하나는 chT2 cDNA 또는 chT101 cDNA에 의해 암호화되는 효소에 의해 나타나고 다른 것은 chT201 cDNA에 의해 암호화되는 효소에 의해 표현된다. chT201-유형 효소는 2개의 N-글리코실화 부위를 함유하고 chT201-유형의 ㅛ소는 1개의 N-글리콜실화 부위를 함유하는 것 같은데, chT201-유형 효소중의 두 개의 가능한 N-글리콜실화 부위중 하나가 chT2-유형 효소에는 존재하지 않는 107개 아미노산으로 이루어진 추가의 영역내에 존재하기 때문이다.

그럼에도 불구하고, chT201 cDNA 및 chT101 cDNA로부터 추정되는 효소 단백질은 현재까지 사람 갑상선으로부터 분리되지 않아, N- 및/또는 C-말단 부위의 가공 및 글리코실화를 포함하여 chT201 cDNA 및 chT101 cDNA에 상응하는 단백질의 생합성 기작은 명백하지 않다. 따라서, 이들 문제점을 해결하기 위해, chT201 cDNA 및 chT101 cDNA를 단편화하여 다양한 cDNA 유도체를 수득한 후, 이를 원핵성 세포 및 진핵성 세포내로 도입해 다양하게 변형된 단백질을 생산하고, 변형된 단백질을 하기에 기술한 바와 같이 이의 C-말단 α-아미드화 활성을 측정하기 위해 검정한다.

(3) 원핵 세포내 C-말단 α-아미드화 효소 유도체의 발현

C-말단 α-아미드화 효소 유도체가 이. 콜라이 세포 같은 원핵세포중에서 발현될 때, chT201 cDNA, chT2 cDNA 또는 chT101 cDNA의 N-말단 부위가 선택되어야 한다. 최근, 에이퍼 등[참조 : Eipper, B. et al., Mol. Endo. 1, 777~790, 1987]은 소 기원의 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 클로닝하였고 효소의 1차 아미노산 서열을 결정하였다. chT201 cDNA와 소 기원의 cDNA에 의해 암호화된 것 사이에는 아미노산 서열 수준에서 약92% 균일성이 있다. 에이퍼 등의 소 기원의 cDNA의 분석과 본 발명가들에 의한 제노푸스 라에비스의 pXA799 및 pXA457의 분석을 고려할 때, chT201 cDNA 또는 chT101 cDNA에 의해 암호화되는 단백질의 가공 부위가 30번 Arg과 31번 Phe 사이 또는 36번 Arg과 37번 Pro 사이에 존재하는 것으로 추정된다. 이에 따라, 효소 유도체를, 이의 N-말단이 제1 또는 3도에 도시된 아미노산 서열내 31번 Phe 또는 37번 Pro가 되도록 디자인한다. 또한, 비록 몇몇 경우에서는 유도체가 이의 C-말단에 발현 플라스미드 작제에 사용된 플라스미드 중의 다수 클로닝 부위로부터 유도된 추가의 아미노산 서열을 지님에도 불구하고, 효소 유도체의 C-말단이 제1 또는 3도에 도시된 아미노산 서열 중의 상이한 부위가 되도록 효소 유도체를 디자인한다. chT201-유형 효소 유도체를 암호화하는 DNA를 chT201 cDNA로부터 작제하고 ; chT101-유형 효소 유도체를 암호화하는 DNA를 chT201 cDNA의 5'-말단 부위 및 작제의 편이의 측면에서 chT101 cDNA 보다는 chT2 cDNA의 3'-말단 부위를 결합함으로써 작제한다.

제33(a) 및 33(b)또는 이. 콜라이 내에서의 발현을 위해 디자인된 효소 유도체를 도식적으로 나타낸다. 제33(a)도의 효소 유도체(chT201-유형 유도체)는 비록 모든 유도체가 이의 N-말단에 해독 개시 코돈에 상응하는 추가의 Met를 지니고, 이의 C-말단에 어떤 유도체는 상응하는 발현 벡터의 작제를 위해 사용된 플라스미드중에 존재하는 다수 클로닝 부위로부터 유도된 아미노산 서열 또는 추가의 아미노산 서열을 지님에도 불구하고 제1도에 도시된 아미노산 서열중 31번 Phe 또는 37번 Pro에서 시작하여 323번 Ala, 378번 Lys, 434번 Asp 또는 857번 Ile에서 종료한다.

C-말단 추가 아미노산 및 아미노산 서열은 제33(a)도의 박스 밖에 도시되어 있다. 제33(b)도에 도시된 효소 유도체(chT101-유형 유도체)는, 비록 모든 유도체가 N-말단에 해독 개시 코돈에 상응하는 추가의 아미노산 Met를 지니고, C-말단에서, 어떤 유도체는 상응하는 발현 벡터 작제에 사용된 플라스미드 중 존재하는 다수 클로닝 부위로부터 유래된 아미노산 서열 또는 추가의 아미노산을 지님에도 불구하고, 제3도에 도시된 아미노산 서열 중의 31번 Phe 또는 37번 Pro에서 시작하여 461번 Ala 또는 750번 Ile에서 종료한다. C-말단 추가 아미노산 및 아미노산 서열은 제33(b)도의 박스 밖에 도시되어 있다.

상술한 바와 같이 디자인된 효소 유도체의 발현에 있어서, 발현 벡터 P_LchT201 MPF-Sph, P_LchT201 MPF-Sal, P_LchT201 MPF-S/B, P_LchT201 MFK-Bcl, P_LchT201 MPF-Sph, P_LchT201 MFK-Sal, P_LchT201 MFK-S/B 및 P_LchT201 MPF-Bcl은 chT201-유형 유도체의 발현을 위해 작제되고, P_LchT2 MPF-Pst, P_LchT2 MPF-Bcl, P_LchT2 MFK-Pst, 및 P_LchT2 MFK-Bcl은 chT101 유형 유도체의 발현을 위해 작제된다. 제33(a) 및 33(b)도에서, 효소 유도체는 발현 벡터의 명칭에 의해 확인됨을 주목한다. 이들 발현 벡터 λ 파아지 기원의 PL 프로모터의 조절하에 chT201 cDNA로부터 유도된 chT101-유형 단백질을 암호화하는 cDNA 또는 chT201 cDNA 및 chT2 cDNA로부터 유도된 chT101-유형 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유한다. 이들 발현 벡터는 파아지 클론 λgt10chT201 및 λgt10chT2, 시판되어 입수 가능한 플라스미드 pUC18 및 pUC19 및 플라스미드 pUCP_LCI로부터 작제된다. 플라스미드 pUCP_LCI로 형질전환된 이. 콜라이가 이. 콜라이 SBM305로 지정되어 1989년 1월 11일 FERM BP-2240으로서 부다페스트 조약하에 FRI에 기탁되어 있음을 주목한다. pUCP_LCI에 대한 작제 공정은 일본국 특허원 제62-306867호 (EP 0299790 A2)에 기술되어 있다.

이들 발현 벡터는 이. 콜라이 같은 숙주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 이. 콜라이 W3110은 형질전환되어 상응하는 형질전환체 W3110/PLchT2

01 MPF-Sph, W3110/P_LchT201 MPF-Sal, W3110/P_LchT201 MPF-S/B, W3110/P_LchT201 MFK-Sph, MFP-Bcl, W3110/P_Lch201 W3110/P_LchT201 MFK-Sal, W3110/P_LchT201 MFK-S/B, W3110/P_Lch201 MFK-Bcl, W3110/P_LchT2 MFP-Pst, W3110/P_Lch2 MPF-Bcl, W3110/P_LchT2 MFK-Pst 및 W3110/P_LchT2 MFK-Bcl를 수득한다.

그런 다음 형질전환을 개별적으로 통상의 배지중에 배양시켜 배양된 세포를 수득하고, 이를 음파 파쇄해 침전된 분획중의 발현산물을 회수한다.

(4) 진핵 세포중의 C-말단 α-아미드화 효소 유도체의 발현

진행 세포중 발현을 위해, 제1도의 아미노산 서열중 1번 아미노산 Met에서 개시하여 323번 Ala, 378번 Lys, 434번 Asp, 568번 Ala 또는 857번 Ile에서 종료하는 chT201-유형 효소 유도체 및 제3도의 아미노산 서열중 1번 Met에서 개시하여 261번 Ala 또는 750번 Ile에서 종료하는 (비록 어떤 유도체는 추가의 아미노산 또는 아미노산 서열을 지님에도 불구하고) chT101-유형 효소 유도체를 디자인한다. 이들 효소 유도체는 제34도에 도식적으로 나타나 있다. 이 도면에서, 발현 벡터의 작제를 위해 사용된 플라스미드 중에 존재하는 다수 클로닝 부위로부터 유도된 추가의 아미노산 및 아미노산 서열이 박스 밖에 나타나 있다.

COS1 세포 같은 진핵성 세포중에서 상기-디자인된 효소 유도체를 발현하기 위하여, 파아지 클론 λgt10chT201 및 λgt10chT2, 시판되어 입수 가능한 플라스미드 pUC18 및 pUC19 및 플라스미드 pKD로부터 발현 플라스미드 pKDchT201-Sph, pKDchT201-Sal, pKDchT201-S/B, pKDchT201-Pst, pKDchT201-Bcl, pKDchT201-Pst 및 pKDchT2-Bcl을 작제한다. 플라스미드 pKD로 형질전환된 이. 콜라이는 이. 콜라이 SBM303으로 지정되어 1989년 1월 11일 FERM BP-2238로서 부다페스트 조약하에 FRI에 기탁되어 있다. 제34도에서, 효소 유도체는 발현 벡터의 명칭으로 확인되어짐을 주목한다. 이들 발현 벡터는 SV40 바이러스로부터 유래된 초기 프로모터의 조절하에 목적하는 효소 유도체를 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유한다. 추가로, 이들 발현 벡터는 COS1 세포 같은 동물 세포 및 통상의 배지 중에서 배양된 형질 감염된 세포를 형질 감염하는데 사용된다. 그런 다음 목적하는 효소 유도체를 배양 배지로부터 회수한다.

(5) 효소 활성의 검정

C-말단 α-아미드화 효소 활성을 검정하여 형질 감염된 숙주 내에서 발현된 단백질이 C-말단 α-아미드화 효소이고, C-말단 α-아미드화 효소가 이의 기질상에 작용할 때 아미드화된 펩타이드 또는 단백질이 생성되는 점을 확인한다. 이. 콜라이 중의 효소 발현의 검정을 위해, 이. 콜라이 세포를 파괴하고 파괴체를 원심분리해 발현 생성물의 주부위를 함유하는 침전물을 수득하여, 침전물을 6M 구아니딘 염화수소로 용해시켜 이와 같이 수득된 용액을 투석하여 검정 샘플을 수득한다. 효소 활성은 일반적으로 R-X-Gly로 표현되는 기질이 R-X-NH₂로 전환되는, 예를 들면 합성된 기질 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-Gly가 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-NH₂로 전환되는 반응으로서 검정된다.

즉, 먼저 표식된 기질(표식된 R-X-Gly)를 트리스-HCI완충 용액에서 시험 효소 용액과 반응시키고, 트리스-HCI 완충 용액 및 에틸아세테이트를 이 반응 혼합물에 가하여, 혼합 후 전체를 유기상 및 수성상을 분리하기 위해 원심분리한다. 비반응된 표식 기질의 주요 부분(표식된 R-X-Gly)이 수성상에 잔류하고, 아미드화된 표식생성물(표식된 R-X-NH₂) 유기상으로 이전되기 때문에, 기질 및 생성물은 쉽게 분리될 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 본 발명의 C-말단 α-아미드화 효소를 하기 방법에 따라 기질로서 합성 펩타이드 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-Gly를 사용하여 검정한다. [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-Gly(1pmole, 70,000 내지 150,000cpm)을 효소 제제와 함께, 0.2M 트리스-HCI 완충용액(PH 7.0), 2.0μM CuSo₄로, 0.25mM 아스코르브산, 25㎍ 가탈라제(Boehringer : 제조원), 0.1% 루브롤(PX형, Nakarai Chemicals)을 함유하는 최종 부피 250㎕ 중에서 배양한다. 반응 혼합물을 1 내지 4시간동안 37℃를 유지한 다음 1M 트리스-HCI 완충 용액(PH 7.0) 0.75㎖ 및 에틸 아세테이트/물 혼합물의 유기상 2㎖를 가한다. 2개의 상들을 볼텍스 혼합기내에서 격렬하게 혼합하고 3분동안 3,000rpm에서 원심분리 후에 분리된 유기상을 다른 시험 튜브로 옮긴다. 유기 및 수성층내의 방사능을 감마 신티레이션 계수기로 측정한다. 상술한 조건하에, 진정한 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-Gly 98%이상의 방사능이 수성상에서 유지되고 진정한 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-NH₂의 방사능 98% 이상이 유기상으로 이전된다.

전환의 수율을 총 방사능에 대한 에틸 아세테이트 상과 같은 유기상 중의 방사능율로부터 측정한다. 이 검정에서, 1단위를, 1시간동안 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-Gly과 같은 1pmole의 기질을 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-NH₂로 55% 전환시키는 효소 활성으로서 정의한다.

(6) 효소 활성을 나타내는 단백질 유도체

상기 기술된 다양한 형질전환체 및 형질감염체를 배양함으로서 제공된 C-말단 α-아미드화 효소 활성을 제23, 32(a) 및 32(b)도에 나타내었다. 이 도면에서, 효소 활성을 아미드화된 생성물에 대한 기질의 전환율로 표현한다.

도면에서 나타낸 결과로부터, 비록 P_LchT201 MPF-Sph 또는 P_LchT201 MFK-Sph로 형질전환된 이.콜라이 및 pkDch201-Sph로 형질감염된 COS 1 세포들이 예를 들면, pkD로 형질감염된 숙주 이. 콜라이 또는 COS 1세포 같은 대조균주에 의해 제공된 것보다 높은 효소 활성을 제공하지 않는다 해도, 다른 모든 형질전환체 및 형질감염체는 상응하는 대조균주 보다 큰 효소 활성을 제공한다.

상응하는 대조균주의 효소 활성보다 더 큰 효소 활성을 제공하지 않는 벡터 P_LchT201 MFK-Sph, P_LchT201 MPF-Sph 및 pkDchT201-Sph내의 cDNA 삽입물은 제1도의 아미노산 서열의 323번 Ala에서 종결하지만, 상응하는 대조균주보다, 큰 효소 활성을 제공하는 벡터 P_LchT201 MFK-Sal, P_LchT201 MFK-Sal, 및 pkDchT201-Sal 내의 cDNA 삽입물은 제1(또한 제3도)도에 나타난 아미노산 서열의 378번 Lys에서 종결한다. 따라서 제1 및 제3도에서 나타낸 아미노산 서열의 37번 Pro에서 개시하고 378번 Lys에서 종결하는 아미노산 서열이 목적하는 효소 활성을 제공하기에 충분하다고 결론지을 수 있다. 이 영역의 아미노산 서열이 제1 및 제3도의 영역과 동일함에 주목한다.

따라서, 본 발명은 제1도에 나타난 아미노산 서열의 1번 아미노산 Met 내지 37번 Pro에서 선택된 어느 아미노산에서 시작하여 378번 Lys 내지 974번 Ser에서 선택된 어떤 아미노산에서 종결하는 아미노산 서열을 가지는 특정 chT201-유형 효소 유도체를 포함한다. 더욱 특이하게는, 본 chT201-유형 효소 유도체는 1번 Met으로부터 시작하여 974번 Ser에서 종결하는 천연 효소외에, P_LchT201 MFK-Sph, P_LchT201 MPF-Sph 및 pkDchT201-Sph에 의해 제공된 것을 제외하고, 제33(a) 및 34도에 도식적으로 나타낸 것들을 포함한다. 한편, 본 chT201-유형 효소 유도체들은 상기 기술한 특정 유도체들에 한정시켜서는 안된다. 378번 Lys, 434번 Asp 또는 857번 Ile에서 종결된 모든 시험 유도체들이 목적하는 효소 활성을 나타내기 때문에 378번 Lys에서 974번 Ser 사이의 어느 아미노산에서 종결하는 어떠한 유도체도 목적하는 효소 활성을 제공함이 분명하다. 이 유도체들은 짧은 cDNA 삽입체를 함유하는 발현 벡터를 작제함으로써 용이하게 수득될 수 있다. 짧은 cDNA 단편들은 엑소뉴클레아제 분해와 같은, 통상적인 방법으로서 용이하게 제조할 수 있다.

유사하게, 본 발명은 제3도의 아미노산 서열에서, 1번 아미노산 Met 내지 37번 Pro에서 선택된 아미노산에서 개시하여 378번 Lys 내지 866번 Ser에서 선택된 아미노산에서 종결하는 아미노산 서열을 갖는 어떤 chT101-유형 효소 유도체를 포함한다. 더욱 특이하게는, 본 chT101-유형 효소 유도체는 제3도에서 1번 Met에서 개시하고 866번 Ser에서 종결하는 천연 효소외에, 제33(b) 및 34도에서 도식적으로 나타낸 것들을 포함한다. 한편, 본 chT101-유형 효소 유도체는 상기 기술한 특정 유도체들에만 제한되지 않는다. 378번 Lys(chT201-유형과 유사), 461번 Ala 또는 750번 Ile 에서 종결하는 모든 시험된 유도체가 목적하는 효소 활성을 나타내기 때문에, 379번 Lys에서 866번 Ser 사이의 아미노산에서 종결하는 어떠한 유도체도 목적하는 효소 활성을 제공할 것이라는 점은 분명하다. 이 유도체들은 짧은 cDNA 삽입물을 함유하는 발현 벡터를 작제함으로써 쉽게 수득될 수 있다. 짧은 cDNA 단편은 엑소뉴클레아제 분해와 같은 통상적인 방법으로서, 쉽게 제조할 수 있다.

더우기, 본 발명의 효소 유도체들은 천연 서열에서 존재하지 않는, 추가적 아미노산 및 약 10개 이하의 아미노산을 함유하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 추가적 아미노산 또는 아미노산 서열은 필수적으로 발현 벡터를 작제하는데 사용되는 벡터에 존재하는 다수 클로닝 부위에 의해 도입된다.

(7) 효소의 용도

본 효소의 생성물을 α-아미드화된 펩타이드 제조에 사용할 수 있다. 이 방법에서, 이의 C-말단에 글리신 잔기를 갖는 기질 펩타이드를 수성 반응 배지, 바람직하게는 트리스-HCI과 같은 수성 완충 용액에서, 약 6내지 7의 PH, 약 37℃의 온도에서 개시펩타이드의 실제적 양이 상응하는 C-말단 α-아미드화 펩타이드로 전환하는데 충분한 시간 동안, 본 효소 생성물 중 하나와 배양한다. 실질적으로, 본 효소는 재조합DNA기술, 화학적 방법 또는 천연 균주에서 분리되어 그의 C-말단에 글리신을 갖는 전구체 펩타이드로부터 C-말단 α-아미드를 갖는 생리적 활성 펩타이드를 제조하는 데 사용될 수 있다.

비록 본 발명이 이. 콜라이 숙주, 및 동물 세포에서 cDNA를 사용하여 C-말단 α-아미드화 효소의 제조방법을 세부적으로 기술한다해도 본 cDNA는 효모 세포와 같은 다른 숙주에서 목적효소를 발현하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 이제 비록 제한된 의미는 아니지만, 하기 실시예들로서 추가로 설명할 수 있다.

실시예 1

사람 갑상선으로부터 폴리(A) RNA의 제조

(1) 총 RNA의 제조

먼저, 사람 갑상선 14g을 총 RNA를 제조하는데 사용하고 PC9조직 10㎖/2g(페놀 : CHCI₃: 이소아밀알코올=24:24:10, 10mM 트리스-HCI, PH9.0, 100mM NaCl, 5mM EDNA로 포화됨) 및 NETS 조직 용액 10㎖/2g(100mM 트리스-HCI, pH 9.0, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 5% SDS)를 갑상선에 가하고 갑상선의 세포를 폴리트론(plolytron)에 의해 파괴한다. 파괴물을 20분 동안 3,000rpm에서 원심분리하여 수성층을 수득하고 잔여 페놀 층을 NETS 용액과 혼합하며, 이 혼합물을 상기 기술한 것과 같이, 원심분리하여 수성층을 수득한다. 수성층을 배합하고, 배합된 수성층을 동일 용적의 CHCI₃를 가한 다음, 혼합물을 20분 동안 3,000rpm에서 원심분리하여 수성 용액을 수득한다 ; 여기에 에탄올 2배 용적을 가하고, 혼합물을 -20℃에서 밤새 정치시켜 에탄올 침전물을 형성한다.

혼합물을 3,000rpm 및 4℃에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하고 이것을 80% 에탄올로 세척 및 진공하에 건조시킨다. 건조된 침전물을 구아니딘 티오시아네이트 용액(4.2M 구아니딘 티오시아네트, 0.1M 아세트산 나트륨, 5mM EDTA, pH 5.0) 1㎖/g에 재용해시키고, CsCl 용액 4㎖(5M CsCL, 0.1M 아세트산나트륨, 5mM EDTA, pH 5.0)를 SW40T1 원심분리 뉴브에 넣고, 침전물의 구아니딘 오시아네이트 용액을 튜브내 CsCl 용액상으로 덮는다. 33,000rpm 및 25℃에서 15시간 동안 원심분리 후 튜브 저부의 RNA 침전물을 80% 에탄올로 세척하고, 침전물을 ETS 용액 500㎕에 용해시킨다(10mM 트리스-HCI, pH 7.5, 10mM EDTA, 0.5% SDS). 그런 다음 동용적의 PC9 용액을 이 용액에 가하고, 교반후, 혼합물을 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 수성층을 수득한다. 이 수성층에 동용적의 에틸 에테르를 가하고 교반후, 혼합물을 10,000rpm 에서 1분간 원심분리하여 수성 용액을 수득한다. 그 다음 용액에 2배 용적의 에탄올을 가하고, 혼합물을 -80℃에서 30분간 정치하여 에탄올 침전물을 형성시킨 다음 13,000rpm 및 4℃에서 15분간 원심분리하여 침전물을 분리시킨다. 상층액을 제거후, 침전물을 80% 에탄올로 세척하고 진공하에 건조시킨다. 건조된 침전물을 멸균된 증류수에 재용해시켜 약 7㎎의 총 RNA를 수득한다.

(2) 폴리(A) RNA 제조

올리고(dT)셀룰로스 컬럼을 폴리(A) RNA를 제조하는데 사용한다. 올리고(dT) 셀룰로스 0.5g을 컬럼에 채우고, 이것을 증류수 10㎖로 세척하고 10N NaOH 10㎖, 5mM EDTA를 증류수로 세척하고 컬럼을 증류수로 완전히 세척한다. 컬럼을 1×로딩(loading) 완충용액(20mM 트리스-HCI, pH 7.6, 0.5M NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS) 10㎖로 평행시키고, 증류수 13.5㎖ 중의 총 RNA 7㎎을 65℃에서 5분간 가열하여, 등용적의 2×로딩 완충 용액을 이 용액에 가한 다음, 혼합물을 컬럼에 적용한다. 흘러 통과한 분획을 65℃에서 5분간 다시 가열하고 다시 컬럼에 적용한다. 컬럼을 로딩 완충 용액 4㎖ 및 20mM 트리스-HCI(pH 7.6) 4㎖, 0.1M NaCl, 1mM EDTA 및 0.1% SDS로 세척한다. 폴리(A) RNA를 그 다음 용출 완충 용액(10mM 트리스-HCI, pH 7.5, 1mM EDTA, 0.05% SDS) 4㎖로 용출하고 용출된 분획에 2M의 아세트산 나트륨(pH 5.0) 1/10 용적 및 에탄올 2배 용적을 가하여 폴리(A) RNA를 회수함으로써, 총 RNA 7㎎으로부터 폴리(A) RNA 144㎍을 수득한다.

실시예 2

λgtⅡ cDNA 라이브러리의 제조

실시예 1에서와 같이 사람 갑상선에서 제조된 폴리(A)RNA 5.6㎍로부터, 이본쇄 cDNA를 아머샴 cDNA 합성키트(Amersham cDNA Symthesis kit)를 사용하여 제조한다. 다음, 이본쇄 cDNA를 λgtⅡ 파아지에 클론하고, 하기의 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 제조한다.

이본쇄 cDNA 용액 100㎕에 10% SDS 10㎕ 및 0.25M EDTA 10㎕를 가하고, PC9 120㎕를 다시 가한다. 교반후, 혼합물을 10분 동안 10,000rpm에서 원심분리하여 수성 용액을 수득하고, 여기에 4M의 아세트산 암모니움 120㎕ 및 에탄올 480㎕를 가하면, 혼합물을 -80℃에서 밤새 정지하여 침전물을 형성시킨 다음, 20분동안 13,000rpm에서 원심분리하여 침전물을 분리하고, 그 다음 이것을 80% 에탄올로 세척하여 진공하에 건조시킨다. 침전물을 1×TE 용액 (10mM 트리스-HCI, pH 7.5, 1mM EDTA) 100㎕로 재용해하고, 에탄올 침전물을 4M 아세트산 암모니움으로 실행한다. 에탄올 침전물을 건조시키고 증류수 10㎕에 재용해하고, 이 용액에 5×EcoRI 메틸라아제 완충 용액(400mM 트리스-HCI, pH 8.0, 40mM EDTA, 8mM DTT), 800μM S-아데노실메티오닌 2㎕, EcoRI 메틸라제 0.4㎕(100 : 일본국 타가로 수조 제조원) 및 증류수 3.6㎕를 가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분간 배양하고 반응 혼합물에 동용적의 PC9을 가하고, 교반후, 혼합물을 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 수용액을 수득한다. 3M의 아세트산 나트륨 1/10 용적 및 에탄올 2용적을 가한후에, 혼합물을 -80℃에서 30분간 처리하여 침전물을 형성시킨다. 혼합물을 원심분리하여 침전물을 분리하고, 이것을 80% 에탄올로 세척하고 건조시킨다. 에탄올 침전물에 10×결합완충 용액(660mM 트리스-HCI, pH 7.6, 66mM MgCl₂) 1㎕, 20mM ATP 0.2㎕, 5'-인산화된 EcoRI 링커(12량체, 0.1㎍/㎕, 일본국 타카라 수조제조원) 15㎕, 및 T4 DNA 리가제(타가라 수조 제조원)1㎕(5단위)를 가하고, 반응 혼합물을 15℃에서 밤새 배양한다. 배양후, 혼합물을 65℃에서 10분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키고, 20mM 트리스-HCI(pH 7.5)10㎕, 100mM NaCl을 가하고 난 후에, EcoRI 2㎕(20단위)를 가하고, 반응 혼합물을 37℃에서 5시간동안 배양한다. 배양 후, 반응 혼합물을 PC9으로 처리하고, 1×TE를 가함으로써 최종 부피를 30㎕로 조정한다. 혼합물을 TES 완충 용액(10mM 트리스-HCI, pH 7.5, 1mM EDTA, 50mM NaCl)으로 평형시킨 바이오겔(Biogel) A50m 컬럼에 적용하고 TES완충 용액으로 용출시킨다. 주 피크 분획을 수득하고, 이 분획에 EcoRI으로 절단한 후 5'-탈인산화된 λgtⅡ 파아지 (Pharmacia) 0.5㎍을 가하고 에탄올 침전 반응을 실행한다. 이 침전물에 10×의 결합 완충 용액 1.5㎕, 증류수 8㎕, 0.1M DTT 1.5㎕, 10mM ATP 1.5㎕ 및 T4 DNA 리가제 1.5㎕(7.5단위)를 가하고, 반응혼합물을 12℃에서 밤새 배양한다. 그 다음 반응 혼합물을 5㎕를 스트라타진(Stratagene)의 기가 팩 골드(Giga pzck gold)를 사용하여 시험관내에서 λ 파아지 팩키징하여, 그 결과 약 500,000 클론으로 구성된 사람 갑상선 기원의 cDNA 라이브러리를 수득한다.

다음, cDNA 라이브러리를 하기 방법에 의해 증폭시킨다. 이. 콜라의 VCS 257(surF로부터 유도됨 : Maintais, T. at al., Molecular Cloning, 1982, Cold Spring Harbor)을 TB 배지(박토트립톤 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, pH 7.5)내 37℃에서 밤새 배양하여 접종물을 제조한다. TB 배지 40㎖를 1/100 접종물을 접종하고, 30℃에서 밤새 배양한다. 배양물을 3,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상측액을 버린 후, 침전된 세포에 10mM MgSO₄16㎖를 가한다. 그 다음, cDNA 라이브러리 파아지를 500, 000pfu(플라그 형성 단위)양으로 세포 현탁액에 가하고 전체를 37℃에서 20분간 정치한다. 배양물에 NZY 연성 한천 배지 30㎖(10g/ℓ NZ 아민, 5g/ℓ NCl, 5g/ℓ 효모 추출물, 2g/ℓ MgSO₄·7H₂O 및 , 10g/ℓ 한천, pH 7.5)를 가하고, 혼합물을 페트리디쉬(23×23㎝)내 1.5% 한천을 함유하는 NZY 배지상에서 도말하다. 37℃에서 6시간 동안 배양 후, SM 완충 용액(5.8g/ℓ NaCl 50㎖, 2g/ℓ MgSO4·7H2O, 1M 트리스-HCI, pH 7.5 ; 2% 젤라틴 5㎖/ℓ)30㎖를 페트리 디쉬에 가하고, 디쉬를 4℃에서 밤새 정치한다. 파아지를 함유하는 SM 완충 용액을 파자이 스톡 용액으로서 회수한다. 이 제조방법으로 4×10¹¹pfu/㎖ 파아지를 함유하는 증폭된 cDNA 라이브러리를 제조할 수 있다.

실시예 3

신규한 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 함유하는 λgtⅡ 파아지의 분리

(1) DNA 탐침의 제조

사람 갑상선에서 유도된 cDNA 라이브러리로부터 신규한 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유하는 파아지 클론을 분리하기 위해 DNA 탐침은 완전한 제노푸스 라에비스 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pXA799를 제한 효소 ApaI 및 DraI으로 완전히 분해하고 전체 암호화 영역을 함유하는 약 2.8kb의 ApaI-DNA 단편을 한천 겔 전기 영동으로서 분리함으로써 제조한다. 다음, ApaI-DraI DNA 단편을 닉 해독에 의해 [α-³²P]dCTP로 방사 표식한다.

(2) 플라크 하이브리드화

밤새 배양하여 제조한 이 콜라이 세포 및 λgtⅡ 파아지 15000pfu를 연성 한천 NZY 한천 배지상에서 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하여 플라크를 형성한다. 페트리 디쉬 6개를 준비한다. 니트로셀룰로스 필터(22×22Cm ; Sehleicher Schnell)를 한천 배지상에 5분간 올려 놓은 후, 니트로셀룰로스 필터를 알칼리 변성용액(0.1N NaOH, 1.5M NaCl)상에 10분간 놓고, 그 후에 중성의 완충 용액(0.5M 트리스-HCI, pH 7.5, 1.5M NaCl)상에 10분간 놓는다. 다음에, 니틀로세룰로스 필터를 2×SSC 용액(20×SCC=175.3g/ℓ NaCl, 88.2g/ℓ 삼나트륨 시트레이트)으로 세척하고, 공기 건조시켜, 감압하에 120분동안 80℃에서 굽는다.

니트로셀루로스를 그런 다음 중합체 쌕(sack)에 넣고, 여기에 예비 하이브리드화 용액 60㎖[3×SSC, 20% 포름아미드, 50mM 트리스-HCI(pH 7.5), 0.25mM EDTA, 1×덴하르트 용액(Denhardt's solution, 1×Denhardt=알부민, 폴리비닐 피롤리돈 및 피콜 각 0.2㎎/㎖), 20㎍/㎖ 연어 정자 DNA]를 도입하고, 예비 하이브리드화 반응을 37℃에서 3시간 동안 수행한다. 예비 하이브리드화 용액을 버린 후, 탐침 2, 000, 000cpm/쌕 및 상기-기술한 예비 하이브리드화 용액 10㎖를 쌕에 가하고, 37℃에서 밤새 하이브리드화 반응을 수행한다. 다음, 필터를 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 함유하는 3×SSC 500㎖ 중 37℃에서 40분간 2회 세척한다. 니트로셀루로스를 공기 건조시키고 자동 방사선 사진술을 실행한다.

이 방법에서, 제노푸스 라에비스 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA를 함유하는 ApaI-DraI DNA 탐침과 하이브리드화된 두개의 파아지 클론을 90,000 파이지를 함유하는 cDNA 라이브러리로부터 수득한다. 이 클론들을 λgt11chT28 및 λgt11chT40으로 지정한다. λgt11chT28 및 λgt11chT40의 파아지 DNA를 마니아티스등[참조 : T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Molecular Cloning 1982]에 따라 제조하고, EcoRI으로 파아지 DNA λgt11chT28 및 λgtchT40를 분해하여 약 0.7kb cDNA 삽입물 및 약 2.2kb의 cDNA 삽입물 각각을 수득한다.

각각의 cDNA에 대해 제한 효소 절단 지도를 제조하고, 다양한 제한 효소로 절단하여, 생성된 DNA 단편을 M13 파아지내에 서브 클론화하고, 디데옥시 종결 반응 방법 [참조 : Sanger, F. et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 34, 5463-5467, 1977]에 따라 타카라 DNA 서열 키트(일본국 Takara Shuzo)을 사용하여, 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 그 결과, λgt11chT28이 pXA 799에 의해 암호화되는 단백질의 중심 부위와 유사한 단백질을 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유하고 ; λgt11chT40이 pXA 799에 의해 암호화되는 단백질의 C-말단 1/2과 유사한 단백질을 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유함이 밝혀졌다(제7도). 따라서, λgt11chT28 및 λgt11chT40 양자가 사람갑상선 기원의 C-말단 α-아미드화 효소를 부분적으로 암호화한다고 추정된다.

따라서, 전체 효소를 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유하는 파아지 클론을 수득하기 위해, 동일한 cDNA 라이브러리를 스크링한다. 하지만, 목적하는 클론을 분리할 수 없으므로, 다른 cDNA 라이브러리를 하기와 같이 제조한다.

실시예 4

λgt10 cDNA 라이브러리의 제조

실시예 1에서 제조된 폴리(A) RNA 4㎍을 cDNA 합성 키트(Pharmacia)를 사용하여 이본쇄 cDNA를 제조하는데 사용한다. 생성된 이본쇄 cDNA 및 λgt10 파이지(Stratagene) 3㎍을 12℃에서 밤새 T4 DNA 리가제를 사용하여 결합하고, 시험관내 패키징한다. 결국 약 2×10⁶클론을 함유하는 λgt10 cDNA 라이브러리를 수득한다.

실시예 5

목적하는 효소를 암호화하는 cDNA를 함유하는 λgt10chT2, λgt10chT201 및 λgt10chT101 및 λgt10chT101 파아지 클론의 분리

(1) DNA 탐침의 제조

사람 갑상선 기원의 전체 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유하는 파아지 클론을 분리하기 위해, 실시예3 (1)에서 제조된 Apa I-Dra I DNA 탐침 외에, 추가적인 DNA 탐침을 상기에서 제조한 λgt11chT28을 EcoRI으로 절단함으로써 제조하여 0.7kb EcoRI DNA 단편을 수득한 후 닉 해독에 의해 [α-³²P]dCTP로 방사 표식한다.

(2) 하이브리드화

λgt10 cDNA 라이브러리 약 280,000 클론을 실시예3(2)에서 기술한 것과 같이 지시 균주로서의 이. 콜라이 C600hfl^-를 사용하여 23x23Cm 페트리 디쉬 상에 도말한다.

37℃에서 밤쇄 배양후에, 형성된 플라그를 실시예3(2)에 기술된 것처럼 니트로셀룰로스 필터로 전이시켜, 알칼리 변성, 중화시키고 감압하에 80℃에서 공기 건조하고, 90분 동안 굽는다. 니트로셀룰로스필터를 중합체쌕에 넣고, 여기에 부가적으로 20%의 포름아미드를 함유하는 상기-기술한 예비 하이브리드화 용액 50㎖를 도입시킨다. 쌕을 37℃에서 3시간 동안 배양하고, 용액을 버린 후 ApaI-DraI DNA 탐침 10,000,000cpm 및 20% 포름아미드를 함유하는 예비 하이브리드화 용액 10㎖를 쌕내로 도입한 다음, 37℃에서 밤새 배양한다. 다음, 필터를 0.1% SDS를 함유하는 3×SSC 용액 500㎖으로 2회 세척한 후, 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC 용액으로 37℃, 2회 세척한다. 공기 건조후, 필터를 자동 방사선 사진술로 측정한 결과로서 pXA 799로부터 유래된 ApaI-DraI 탐침과 하이브리드화된 하나의 양성 클론을 수득하고, 이를 λgt10T2로 지정한다. λgt10 cDNA 라이브러리의 340,000 클론 및 λgt11chT28에서 유도된 EcoRI DNA 탐침 10, 000, 000cpm이 사용된 점을 제외하고 상기에서 기술한 것과 동일한 과정을 반복한다. 50% 포름아미드를 함유하는 예비 하이브리드화 용액을 제외하고 상기 기술한 바와 같이 예비 하이브리드화 및 하이브리드화를 수행하고, 그 결과로서, λgt11chT28로부터의 EcoRI DNA 탐침 0.7kb와 하이브리드화된 두개의 양성클론을 수득하고, 이를 λgt10chT201 λgt10chT202로 지정한다.

파아지 DNA를 통상의 방법에 의해 이처럼 수득된 3개의 클론을 위해 제조하고, cDNA 삽입물의 길이를 시험하기 위해, 각각의 파아지 DNA를 EcoRI으로 분해한다. 그 결과, λgt10chT2는 약 2.4kb 및 0.4kb의 두개 DNA 단편을 제공하는데, 이는 2.8kb의 cDNA가 삽입된 것을 나타낸다. 한편 λgt10chT201은 약 202kb, 0.8kb, 및 0.7kb의 3가지 DNA 단편을 제공하는데, 이는 3.7kb cDNA가 삽입된 것을 나타낸다.

(3) λgt10chT2 및 λgt10chT201에 삽입된 cDNAs 뉴클레오타이드 서열의 결정

λgt10chT201 및 λgt10chT2 파아지 DNA를 다양한 제한 효소로 분해하고, 생성된 단편을 한천 겔 전기 영동으로 분리하여, cDNA 영역의 제한 효소 절단 지도를 제조한다. 제4(a) 및 제5(a)도에 이 결과를 나타내었다. 다음, 각각의 cDNA 삽입물의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해, DNA 단편을 M13 파아지내로 서브 클론시키고, 뉴클레오타이드 서열을 타카라 DNA 서열 키트(일본국 Takara Shuzo)및 시퀀네이즈 DNA 서열분석 키트(Sequenase(^TM) DNA sequencing kit, 미합중국 Biochemical Corporation)로, 디데옥시 종결방법에 따라서 결정한다. 제4(b) 및 5(b)도에 서열 분석에 사용한 전략을 나타내었다. 파아지 클론 λgt10chT201 내의 cDNA 뉴클레오타이드 서열(chT201 cDNA 약술)을 제1도에 도시하고 ; λgt10chT2내의 cDNA의 뉴클레오타이드 서열(chT2 cDNA로 약술)을 제2도에 도시한다.

제1도에 도시한 바와 같이, chT201 cDNA는 약 3.7kb의 길이를 가지고, 5'-말단 비-암호화 영역, 긴판독 프레임, 및 3'-말단 비-암호화 영역을 포함하는 완전한 길이의 cDNA이다. 한편, chT2 cDNA는 완전한 길이의 cDNA의 5'-말단 영역을 결여한 것으로 나타난다. chT201 cDNA 및 chT2 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 비교할 때 chT201 cDNA는 107개 아미노산을 암호화하는, 321개의 여분 뉴클레오타이드를 함유하는데 이는 chT2 cDNA에는 부재한다. 다른 영역은 대략적으로 chT201 cDNA 및 chT2 DNA 양자에 있어 대략적으로 동일하다. 제7도에 나타난 바와 같이, 제노푸스 라에비스에서 유래된 pXA 799 중의 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 비교할때, chT2 cDNA는 pXA 799에서의 cDNA와 유사하다. 한편, chT 201 cDNA는 107개의 아미노산을 암호화하는 321개 뉴클레오타이드를 함유하는데, 이느 pXA 799 중의 cDNA에는 부재한다.

이것은 사람 갑상선에 유래된 C-말단 α-아미드화 효소의 2가지 유형이 존재한다는 것을 암시한다.

(4) λgt10chT101 파아지 클론의 분리

상기에서 기술한 것과 같이, chT201 cDNA와 chT2 cDNA의 비교는, 예를 들면, 321개의 추가적 뉴클레오타이드를 갖는 chT201 cDNA에 의해 암호화된 효소 및 321개 뉴클레오타이드를 갖지 않는 chT2 cDNA에 의해 암호화된 효소인, 사람 갑상선 기원의 C-말단 α-아미드화 효소의 2가지 유형이 존재함을 암시한다.

그러나 chT2 cDNA는 추정된 완전한 길이의 cDNA의 5'-말단 영역이 결여되어 있고, 따라서 chT2-유형인 완전한 길이의 cDNA를 수득하기 위해, λgt10cDNA 라이브러리를 다시 스크링닝한다.

DNA 탐침을 SmaI 및 XhOI로 chT201 cDNA를 절단함으로써 제조하여 5'-비암호화 영역 및 5'-말단 부위 암호화 영역을 함유하는 280bp DNA를 단편을 수득하고, 닉 해독에 의해 DNA 단편을 〔α-³²P〕dCTP로 표식한다. 플라크 하이브리드화를 실시예 5(2)에서 기술한 방법에 따라, λgt10cDNA 라이브러리의 1.280,000 클론, 380bp의 DNA 탐침, 및 50% 포름아미드를 함유하는 예비 하이브리드화 용액을 사용하여, 하나의 양성 클론을 수득한다. 이 클론을 λgt10chT101로 지정한다. λgt10chT101의 파아지 DNA를 통상적인 방법으로 제조하고, λgt10chT101 중의 cDNA 삽입물(chT101 cDNA로 약술) 길이를 파아지 DNA 절단으로써 결정한다. 결국, 0.7kb, 09kb, 및 2.6kb의 3개 cDNA 단편이 제공되어, λgt10chT101 파아지 클론이 4.2kb의 cDNA 삽입물을 함유함을 보여준다.

(5) λgt10chT101 중의 cDNA 삽입물의 뉴클레오타이드 서열의 결정

λgt10chT101 파아지 DNA를 다양한 제한 효소로 절단하고, 생성된 단편을 한천 겔 전기 영동으로 분리하여 chT101 cDNA의 제한 효소 절단지도를 제조한다. 제6(a)도에 이 결과를 나타내었다. 다음, DNA 단편을 M13파아지중에 서브 클론하고, 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 종결화 방법에 따라 시퀀나아제(^TM)DNA 서열 분석 키트를 사용하여 결정한다. 제6(b)도에는 서열 분석을 위한 전략을 나타내고 있다. chT101 cDNA의 뉴클레오타이드 서열, 및 상응하는 아미노산 서열을 제3도에 나타내었다. 비록 chT101 cDNA가 2.6kb, 0.9kb, 및 0.9kb의 EcoRI 단편 3개로 구성된다 해도, 0.9kb의 cDNA 단편이 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하지 않기 때문에, 0.9kb cDNA 단편의 뉴클레오타이드 서열은 제3도에서 배제되었다. 제2 및 3도에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 비교에서 알 수 있듯이, 비록 chT101 cDNA가 전체 효소를 암호화하고 chT2 cDNA가 이의 N-말단 영역이 결실된 동일 효소를 암호화하고 있다해도, chT101 cDNA 및 chT2 cDNA 모두가 동일한 효소를 암호화한다.

pXA 799 cDNA, chT201 cDNA, chT2 cDNA, chT101 cDNA, chT40 cDNA, 및 chT28 cDNA 사이의 관계를 제7도에 나타내었다.

실시예 6

chT201-유형 단백질 유도체를 발현하는 벡터 P_LchT201 MPF-Sph, P_LchT201 MPF-S/B, P_LchT201 MPF-Sal, 및 P_LchT201 MPF-Bcl의 작제

이. 콜라이에서 chT201 cDNA 내에 암호화된 단백질 유도체(뉴클레오타이드 140-3061)를 발현하기 위해, 발현 벡터로 형질전환된 이.콜라이 W3110뿐 아니라, 발현 벡터 P_LchT201 MPF-Sph, P_LchT201 MPF-S/B, P_LchT201 MPF-SalI, 및 P_LchT201 MPF-Bcl을 하기와 같이 제조한다.

(1) pUC 18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ의 작제(제8도)

제8도는 나타난 바와 같이, λchT201 파아지 DNA를 Hind Ⅲ 및 Bgl Ⅱ로 절단하여 chT201 cDNA의 전 암호화 영역 및 λgt10 파아지의 일부 영역을 포괄하는 약 5 kb의 cDNA 단편을 분리한다. 한편, pUC18을 Hind Ⅲ 및 Bam HI으로 절단한다. 양 DNA 단편을 결합하여 중간체 플라스미드 pUC18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 작제하고, 이. 콜라이를 형질전환시키는데 사용하며, 형질전환체를 이. 콜라이 SBM302로서 지정하는데, 이는, 1989년 1월 11일, 부다페스트 조약하에 FERM BP-2237로서 FRI에서 기탁되었다.

(2) P_LchT201 MPF-Sph의 작제(제9 및 제10도)

chT201 cDNA에 의해 암호화된 단백질의 N-말단 영역내 가공부위2개 즉, Arg(30)-Pro(31) 사이의 결합 및 Arg(36)-Pro(37) 사이의 결합이 존재한다. Pro(37)로 개시하는 단백질 유도체를 발현하기 위해서, 플라스미드 pUC19chT201 MPF를 작제한다.

제9도에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pUC19chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 Kpn I 및 Hind Ⅲ로 절단하여, Kpn I-Hind III DNA 단편(E I)을 분리하고, DNA 단편 YSO53을 5'-EcoRI 말단, 해독 개시 코돈 ATG, 37번 Pro 내지 YSO54를 합성한다. DNA 단편 YSO53 및 43번 Leu에 대한 코돈 및 3'-Kpnl 말단이 순서대로 배열되도록 합성한다. 추가로, 상보성 DNA 단편 YSO54를 T4 폴리뉴클레오타이드키나제 및 ATP를 사용하여 5'-인산화시키고, 65℃에서 10분간 어닐링시켜 제9도에 나타낸 이-본쇄 DNA 단편을 제조한다. 한편, pUC19를 EcoRI 및 Hind Ⅲ로 절단한다. 합성 DNA 단편, EI 단편, 및 선형의 pUC19를 결합하고, 이. 콜라이 W3110을 형질전환하는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT201 MPF-Sph 및 상응하는 형질전환체, 이. 콜라이 W3110/P_LchT201 MPF-Sph를 수득한다.

(4) P_LchT201 MPF-S/B의 작제(제11도)

제11도에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pUC18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 Xho I 및 Sau 3A1(1439번 위치에서 cDNA 절단)으로 절단하여 DNA 단편 E4를 수득하고, pUC19chT201 MPF를 EcoRI 및 Xho I로 절단하여 DNA 단편 E 5를 수득한다. 플라스미드 pUCP_L-CI EcoRI 및 BamHI으로 절단한다. 다음, DNA 단편 E4 및 E5 선형의 pUCP_L-CI를 결합하고 이. 콜라이 W3110을 형질전환하는데 사용하여 플라스미드 P_LchT201 MPF-S/B 및 상응하는 형질전환체, 이. 콜라이 W3110/PLchT2

01 MPF-S/B를 수득한다.

(5) P_LchT201 MPF-Sal의 작제

P_LchT201 MPF-Sal을 작제하기 위해서, 먼저 플라스미드 pUC19chT201-EcoRI 0.7 및 pUC18-Sal을 작제한다.

(a) pUC19chT201-EcoRI 0.7의 작제(제12도)

제12도에 나타낸 바와 같이, λchT201 파아지 DNA를 EcoRI으로 절단하여 0.73kb EcoRI DNA 단편을 수득한다. 한편, pUC19를 EcoRI으로 절단한다. 0.73kb EcoRI DNA 단편 및 선형의 pUC19를 결합하여 이. 콜라이 JM109를 형질전환시켜 플라스미드 pUC19chT201-EcoRI 0.7 및 상응하는 형질전환체 이. 콜라이 JM109/pU

C19chT201-EcoRI 0.7을 수득한다.

(b) pUC18-Sal의 작제(제13도)

제13도에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pUC19chT201-EcoRI 0.7을 EcoRI 및 Hinf I로 절단하여 (1250 위치에서 cDNA 절단) DNA 단편 E6을 수득한다. chT201 cDNA에서 378번 Lys 바로 하부에 해독중지 코돈 TGA을 도입하기 위해, 이 5'-말단에 Hinf 접착성 말단을 갖는 DNA 단편 YSO59 및 이에 상보성이고 이의 5'-말단에 SalI 접착성 말단을 갖는 YSO60을 합성한다. YSO59 및 YSO60을 T4 폴리뉴클레오타이드키나제 및 ATP를 사용하여 5'-인산화시키고, 65℃에서 10분간 어닐링시킨다. 다른 한편, pUC18을 EcoRI 및 Sal I으로 절단한다. 다음 어닐링된 YSO59 및 YSO60, E6 DNA 단편 및 선형의 pUC18을 결합하고 이. 콜라이 JM109를 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 pUC18-Sal 및 상응하는 형질전환체 이. 콜라이 JM109/pUC18-Sal을 수득한다.

(c) P_LchT201 MPF-Sal의 작제(제14도)

제14도에 도시된 바와 같이, P_LchT201 MPF-Sph를 BstEⅡ로 절단한 다음 EcoRI으로 부분적으로 분해하고, EcoRI-BstⅡ DNA 단편 E7을 수득한다. 한편, pUC18-Sal I 및 BstEⅡ로 절단하여 BstE-SalI DNA 단편 E8을 수득한다. 추가로, pUCP_L-CI를 EcoRI 및 SalI으로 절단한다. DNA 단편 E7 및 E8, 및 선형의 pUC18을 결합하고 이. 콜라이 W3110을 형질전환하는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT201 MPF-Sal 및 상응하는 형질전환체 이. 콜라이 W3110/P_LchT201을 수득한다.

(6) P_LchT201 MPF-Bcl의 작제(제15도)

제15도에 도시된 바와 같이, P_LchT201 MPF-S/B를 XhoI 및 BamHI으로 절단하여 (421 위치에서 cDNA 절단) XhoI 및 BamHI 단편 E9을 수득한다. 한편, pUC18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ을 XhoI 및 BclI으로 절단하여(2707 위치에서 cDNA 절단)XhoI-BclI DNA 단편 E10을 수득한다. DNA 단편 E9 및 E10을 결합하고, 이. 콜라이 W3110을 형질전환하는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT201 MPF-Bcl 및 상응하는 형질전환체, 이. 콜라이 W3110/P_LchT201 MPF-Bcl을 수득한다.

실시예 7

chT201-유형 단백질 유도체를 발현하는 이. 콜라이. 벡터 P_LchT201 MFK-Sph, P_LchT201 MFK-S/B, P_LchT201 MFK-Sal 및 P_LchT201 MFK-Bcl의 작제

이. 콜라이에서 chT201 cDNA(뉴클레오타이드 140-3061) 내에 암호화된 단백질 유도체를 발현시키기 위해, 발현 벡터 P_LchT201 MFK-Sph, P_LchT201 MFK-S/B, P_LchT201 MFK-Sal 및 P_LchT201 MFK-Bcl 및 상응하는 이. 콜라이 W3110 형질전환체를 하기와 같이 제조한다.

(1) pUC19chT201 MFK의 작제(제16도)

31번 Phe로 개시하는 단백질 유도체를 발현시키기 위해, 먼저 플라스미드 pUC19chT201 MFK를 작제한다. 이 목적을 위해서, 제16도에 나타난 바와 같이, 5'-EcoRI 말단, 해독 개시 코돈 ATG, 31번 Phe에 대한 코돈 및 3'-DraI 평활 말단을 순서대로 갖는 DNA 단편 YSO55 및 상보성인 DNA 단편 YSO56을 합성한다. 이들 합성 DNA 단편을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 ATP를 사용하여 5'-인산화시키고, 65℃에서 10분간 어닐링시켜 제16도에 도시된 이본쇄 DNA 단편을 제조한다. 플라스미드 pUC18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 PstI(1844위치에서 cDNA 절단) 및 DraI(233 위치에서 cDNA 절단)로 절단하여 Pst I-DraI DNA 단편 E11을 수득한다. 합성 DNA 단편, DNA 단편 E11, 및 선형의 pUC19를 결합하고, 이. 콜라이 JM109를 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 pUC19chT201 MFK 및 상응하는 형질전환체 이. 콜라이 JM109/pUC19chT201 MFK을 수득한다.

(2) P_LchT201 MFK-Sph의 작제(제17도)

제17도에 나타낸 바와 같이, P_LchT201 MPF-Sph를 Sph 및 XhoI으로 절단하여 Sph-XhoI DNA 단편 E12를 수득한다. 플라스미드 pUC19chT201 MFK를 EcoRI 및 XhoI로 절단하여 EcoRI-XhoI DNA 단편 E13을 수득하고, pUCP_LCI를 EcoRI 및 SphI으로 절단한다. DNA 단편 E12, E13, 및 선형의 pUCP_LCI을 결합하고 이. 콜라이 W3110을 형질전환시키는데 사용하여 플라스미드 P_LchT201 MFK-Sph 및 상응하는 형질전환체, 이. 콜라이 W3110/P_LchT201 MFK-Sph를 수득한다.

(3) P_LchT201 MFK-S/B의 작제(제18도)

제18도에 도시된 바와 같이, P_LchT201 MPF-S/B를 XhoI 및 BamHI으로 절단하여 XhoI-BamHI DNA 단편 E4를 수득한다. 플라스미드 pUC19chT201 MFK를 EcoRI 및 XhoI으로 절단하여 EcoRI - XhoI DNA 단편 E15를 수득한다. pUCP_LCI를 EcoRI 및 BamHI로 절단한다. 다음, DNA 단편 E14 및 E15, 및 선형의 pUCP_LCI를 결합하고 이. 콜라이 W3110을 형질전환하는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT201 MFK-S/B 및 상응하는 형질전환체, 이. 콜라이 W3110/P_LchT201 MFK-S/B를 수득한다.

(4) P_LchT201 MFK-Sal의 작제(19도)

제19도에 도시된 바와 같이, P_LchT201 MPF-Sal을 XhoI 및 PstI으로 절단하고 XhoI-PstI DNA 단편 E16을 수득한다. 한편, P_LchT201 MFK-S/B를 XhoI 및 PstI으로 절단하여 XhoI-PstI DNA 단편 E17을 수득한다. DNA 단편 E16 및 E17 결합시키고 이. 콜라이 W3110을 형질전환하는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT201 MFK-Sal 및 상응하는 형질전환체 이. 콜라이 W3110/P_LchT201 MFK-Sal을 수득한다.

(5) P_LchT201 MFK-Bcl의 작제(제20도)

제20도에 나타낸 바와 같이, P_LchT201 MPF-S/B를 XhoI 및 BamHI으로 절단하여 XhoI - BamHI DNA 단편 E18을 수득한다. 한편, pUC18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 XhoI 및 BclI으로 절단하여 XhoI-BclI DNA 단편 E19를 수득한다. 다음, DNA 단편 E18 및 E18를 결합하고 이. 콜라이 W3110을 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT201 MFK-Bcl 및 상응하는 형질전환체, 이. 콜라이 W3110/P_LchT201 MFK-Bcl을 수득한다.

실시예 8

chT101-유형 단백질 유도체를 발현하는 이. 콜라이. 벡터 P_LchT2 MPF-Pst, P_LchT2 MFK-Pst, P_LchT2 MPF-Bcl 및 P_LchT2 MFK-Bcl의 작제

비록 chT20 cDNA에 N-말단 암호화 영역이 결여되었다해도, chT2 cDNA의 결여된 영역은 상응하는 chT201 cDNA 영역으로 보충하여, chT101 cDNA와 동일한 cDNA를 작제한다. 따라서, chT101-유형 C-말단 α-아미드화 효소 유도체를 발현하는 이. 콜라이 벡터를 작제하기 위해, chT2 cDNA 및 chT201 cDNA를 사용한다.

(1) P_LchT2 MPF-Pst 및 P_LchT2 MFK-Pst의 작제(제21도)

제21도에 나타낸 바와 같이, P_LchT201 MPF-Bcl을 XhoI 및 PstI으로 절단하여 XhoI-PstI DNA 단편 E20을 수득한다. 한편, 실시예 10(4)에서 작제된 pUC18ch

T2 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를(제27도) XhoI 및 BamHI 및 PstI으로 절단하여 XhoI-PstI DNA 단편 E22을 수득한다. 다음, DNA 단편 E20 및 E22를 결합하고, 이. 콜라이 W3110을 형질전환하는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT2 MPF-Pst 및 상응하는 형질전환체, 이. 콜라이 W3110/P_LchT2 MFK-Pst를 수득한다.

P_LchT201 MFK-Bcl이 P_LchT201 MPF-Bcl 대신 사용되는 점을 제외하고는 상기에 기술된 방법과 동일하게 실시하여 플라스미드 P_LchT2 MFK-Pst를 수득한다.

(2) P_LchT2 MPF-Bcl 및 P_LchT2 MFK-Bcl

제22도에 나타낸 바와 같이, P_LchT201 MPF-Bcl을 XhoI로 절단한 다음 XbaI으로 부분적으로 분해하여 XhoI-XbaI DNA 단편 E23을 수득한다. 한편, 실시예 10(4)에서 작제된 pUC18chT2 Hind Ⅲ-Bgl I(제27도)을 XhoI 및 XbaI으로 절단하여 XhoI-XbaI DNA 단편 E25를 수득한다. 다음, DNA 단편 E23 및 E25를 결합하고 이. 콜라이 W3110을 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT2 MPF-Bcl을 수득한다.

상기에 기술된 방법을 P_LchT2 MFK-Bcl을 P_LchT2 MPF-Bcl 대신 사용하는 것 외에 반복하여 플라스미드 P_LchT2 MPF-Bcl 및 상응하는 형질전환체 이. 콜라이 W3110/P_LchT2 MFK-Bcl을 수득한다.

실시예 9

형질전환된 이. 콜라이에 의해 제공되는 C-말단 α-아미드화 활성

상기에서 제조된 이. 콜라이 형질전환체, W3110/P_LchT201 MPF-Sph, W3110/P_LchT201 MPF-Sal, W3110/P_LchT201 MPF-S/B, W3110/PLchT201 MPF-Bcl, W3110/P_LchT201 MPF-Sph, W3110/P_LchT201 MFK-Sal, W3110/P_LchT201 MPF-S/B, W3110/P_LchT201 MPF-Bcl, W3110/P_LchT2 MPF-Pst, W3110/P_LchT2 MPF-Bcl및 W3110/P_LchT2 MFK-Bcl을 앰피실린 50㎍/㎖가 보충된 슈퍼 브로쓰내 32℃에서 밤새 배양한다. 대조로서 이. 콜라이 W3110(형질전환되지 않음)을 32℃에서 앰피실린을 함유하지 않는 슈퍼 브로쓰내에서 밤새 배양한다. 효모 추출물, 24g, 트립톤 12g, 글리세롤 5㎖, 및 1M 인산염 완충 용액(pH 7.6) 100㎖를 물에 용해하여, 총 용적이 1ℓ가 되도록 슈퍼 브로쓰 배지를 제조한다. 다음, 배양물을 동일 조성물을 갖는 신선한 배지 5㎖로 660nm에서 0.1OD/㎖까지 접종하고, 배양은 660nm에서 흡광도가 0.3oD/㎖가 될때까지 32℃에서 수행한다. 이때, 온도를 32℃에서 42℃로 변화시키고, 배양을 3시간 더 계속한다. 660nm에서 흡광도 5OD를 갖는 배양된 브로쓰를 13,000rpm에서 2분 동안 원심분리하여, 세포를 수거하고, 상층액을 버린 다음, 세포를 0.1% 트립톤을 함유하는 PBS(-)(0.8% NaCl, 0.02% KCI, 0.15% Na₂HPO₄및 KH₂PO₄) 300㎕ 중에 현탁시키고, 현탁액을 초음파 처리하여 세포를 파열시킨다. 파열질을 13,000rpm에서 2분간 원심분리하고, 상층액을 버리고, 침전물을 PBS(-) 300㎕에 현탁시킨다. 현탁액을 13,000rpm에서 2분간 원심분리하고, 상층액을 버린다. 침전물을 6M 구아니딘 하이드로클로라이드(10mM 트리스-HCI, pH 7.0, 및 50μM CuSO₄를 함유)500㎕에 용해시키고 용액을 초음파 처리한다. 다음, 용액을 4M 구니딘 하이드로클로라이드(10mM 트리스-HCI, pH 7.0, 50μM CuSO₄함유)에 대해 1시간 동안 투석하고, 이후, 투석물을 다시 2M 구아니딘 하이드로클로라이드 (10mM 트리스-HCl, pH 7.0, 50μM CuSO₄함유)에 대해 밤새 투석한다. 투석물을 C-말단 α-아미드화 활성을 측정하기 위해 검정한다.

검정은 하기와 같이 미주노 등[Mizuno et al., B. B. R. C. 137, 984에서 991, 1986]에 따라서 수행한다. 즉, 샘플 25㎕를 물로 희석하여 총 부피가 100㎕가 되게 하고, 이 용액에 10mM N-에틸말레이미드 25㎕, 10mM 아스크르브산 25㎕, 200μM CuSO₄25㎕, 20㎎/㎖ 카탈라제 1.25㎕, 1% 루브롤 25㎕, [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-Gly(17,000cpm) 2pmol, 및 1M 트리스-HCI(pH 7.0) 50㎕를 가하고, 반응 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 배양한다. 반응후, 반응 혼합물에 1M 트리스-HCI(pH 7.0) 750㎕ 및 에틸 아세테이트를 가하고, 전체를 혼합하여 원심분리한다. 에틸 아세테이트 층 및 수성층을 그 다음 분리하고, 두 분획의 방사능을 γ-카운터로 측정하고, 에틸 아세테이트 층으로 전이된 방사성 비를 계산한다. C-말단 아미드화된 산물, [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-NH₂가 상기 방법에서 선별적으로 에틸 아세테이트층으로 전이되는 것이 확인되었다. 제23도에 이 결과를 나타낸다.

제23도에 나타낸 바와 같이, W3110/P_LchT201 MPF-Sph 및 W3110/P_LchT

201 MFK-Sph는 C-말단 아미드화 활성을 나타내지 않는다. 따라서, 323번 Ala까지의 작은 단백질은 충분한 효소 활성을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있다. 한편, 378번째 Lys 이상으로 확장된 더 큰 단백질은 목적하는 효소 활성을 나타낸다. 추가로, 단백질 유도체의 N-말단 부위, 즉 제1도에서 나타낸 서열중 1번 Met, 31번 Pro 또는 37번 Pro는 효소 활성에 영향을 미치지 않는다.

이. 콜라이 형질전환에 의해 제공된 효소 활성은 비교적 낮은데, 이것은 아마도 글리코실화의 결여 또는 이. 콜라이에 의해 생성된 단백질 유도체의 부정확한 폴딩(folding)에 의한 것임을 주목한다.

따라서, 동물 세포에 의해 효소 유도체의 제조방법은 하기와 같이 시도된다.

실시예 10

동물 세포 발현 플라스미드 pkDchT201-Sph, pkDchT201-Sal, pkDchT20

1-S/B, pkDchT201-Pst, pkDchT2-Bcl, pkDchT2-Pst 및 pkDchT2-Bcl의 작제

효소 유도체 발현을 위해, 플라스미드 pkDchT2-Pst 및 pkDchT-Bcl(cht2-형 C-말단 α-아미드화 효소 유도체의 발현을 위한) 뿐 아니라 플라스미드 pKDchT201-Sph, pKDchT201-Sal, pKDchT201-S/B, pKDchT201-Pst 및 pKDchT201-Bcl(chT201-유형 C-말단 α-아미드화 효소 유도체의 발현을 위한)를 chT201 cDNA 또는 chT201 cDNA 및 chT201 cDNA로부터 작제한다. 이 플라스미드는 제1도(도는 제3도)에서 나타낸 아미노산 서열중 1번 아미노산에서 개시하고, 제1 또는 3도에 나타낸 아미노산 서열중 상이한 아미노산에서 종결하는 단백질을 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유한다.

이 플라스미드는 또한 순서대로 SV40(Simian Virus 40) 초기 프로모터, RNA 스플라이싱 및 폴리 A 부가에 책임이 있는 토끼 β-글로빈 유전자로부터 유래된 인트론, SV40 초기 프로모터 조절하에 목적하는 효소 유도체를 암호화하는 cDNA, 및 토끼 β-글로빈 유전자에서 유래된 폴리 A 부가 시그날을 함유한다.

상기 기술된 발현 플라스미드의 작제에 사용된 플라스미드 pkD를 함유하는, 이. 콜라이 SBM303은 부다페스트 조약하에 1989년 1월 11일, FERM BP-2238로 FRI에 기탁되었음을 주목한다.

(1) pUC18-Hpa Ⅱ의 작제(제24도)

제24도에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pUC18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 HapA Ⅱ로 절단하여 435bp의 DNA 단편을 수득하고, 이것을 dNTPs 존재하에 클레나우 효소를 사용하여 충전시켜 평활 말단을 제조한다. 플라스미드 pUC18을 SmaI으로 절단한다. 453bp DNA 및 선형의 pUC18을 결합하고, 이. 콜라이 JM109를 형질전환 시키는데 사용하여, 플라스미드 pUC18-Hpa Ⅱ를 수득한다.

(2) 플라스미드 pkDchT201-Sph, pkDchT201-Sal, pkDchT201-S/B 및 pkDchT201-Bcl(제25도)의 작제

플라스미드 pUC18-Hpa Ⅱ를 KpnI Hind Ⅲ로 절단하여 DNA 단편 C1을 수득하고, P_LchT201 MPF-Sph를 KpnI 및 Hind Ⅲ로 절단하여 DNA 단편 C2를 수득한다. 다음, pkD를 Hind Ⅲ로 절단한다. 다음 DNA 단편 C1 및 C2, 및 선형의 플라스미드 pkD를 결합하고, 이. 콜라이 DH1을 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 pkDchT201-Sph를 수득한다.

P_LchT201 MPF-Sal을 P_LchT201-MPF-Sph 대신 사용하는 것 외에, 동일한 방법을 반복하여 플라스미드 pkDchT201-Sal을 수득한다.

다음, P_LchT201 MPF-S/ B를 P_LchT201MPF-Sph 대신 사용하는 것 외에, 동일한 방법을 반복하여 플라스미드 pkDchT201-S/B를 수득한다.

더우기, P_LchT201 MPF-Bcl을 P_LchT201-MPF-Sph 대신 사용하는 것 외에, 동일한 방법을 반복하여 플라스미드 pkDchT201-Bcl을 수득한다.

(3) pkDchT201-Pst의 작제(제26도)

제26도에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pUC18chT201 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 PstI 및 XhoI으로 절단하여 DNA 단편 C6을 수득한다. 한편, pkDchT201 MPF-Sal을 XhoI으로 완전하게 분해한 다음, PstI으로 부분 분해하여, DNA 단편 C7을 수득한다. DNA 단편 C6 및 C7을 결합하고 이. 콜라이 DH1을 형질전환시키는데 사용하여 플라스미드 pkDchT201-Pst를 수득한다.

(4) pkDchT2 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ의 작제(제27도)

제27도에 도시된 바와 같이, λgt10chT2 파아지 DNA를 Hind Ⅲ 및 Bgl Ⅱ로 절단하여 chT2 cDNA 암호화 영역 및 λgt10 파아지 영역을 함유하는 DNA 단편을 수득한다. 한편, pUC18을 Hind Ⅲ 및 BamHI으로 절단한다. 다음, λgt10chT2로부터의 DNA 단편, 및 선형의 pUC18을 결합하고, 이. 콜라이 JM109을 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 pUC18chT2 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 수득한다. 플라스미드 pUC18chT2 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ로 형질전환된 이. 콜라이를 이. 콜라이 SBM304로서 지정하고, 이를 부다페스트 조약하에 1989년 1월 11일, FERM BP-2239로서 FRI에 기탁했다.

(5) pUC18chT201-chT2의 작제(제28도)

제28도에 도시된 바와 같이, pUC18 Hpa Ⅱ를 Hind Ⅲ 및 SspI으로 절단하여 DNA 단편 C8을 수득하고, 플라스미드 pUC18chT2 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 Hind Ⅲ 및 SspI으로 절단하여 DNA 단편 C9을 수득한다. 추가로 pUC18은 Hind Ⅲ로 절단한다. 다음, DNA 단편 C8 및 C9, 및 선형의 pUC18을 결합하고 이. 콜라이 JM109를 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 pUC18chT201-chT2를 수득한다.

(6) P_LchT2 KpnI-PstI의 작제(제29도)

제29도에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pUC18chT2 Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ를 KpnI 및 PstI으로 절단하여 DNA 단편 C10을 수득하고, 플라스미드 pUCP_LCl을 KpnI으로 절단한다. 다음, DNA 단편 C10 및 선형의 pUCP_LCl를 결합하고 이. 콜라이 JM109를 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 P_LchT2 KpnI-pstI을 수득한다.

(7) pkDchT2-Pst의 작제(제30도)

제30도에 나타낸 바와 같이, pUC18 Hpa Ⅱ를 Hind Ⅲ 및 SspI으로 절단하여 DNA 단편 C11을 수득하고, 플라스미드 P_LchT2 Kpn I-Pst I을 SspI 및 Hind Ⅲ로 절단하여 DNA 단편 C12을 수득한다. 추가로 플라스미드 pkD는 Hind Ⅲ로 절단한다. 다음, DNA 단편 C11 및 C12, 및 선형의 pkD를 결합하고 이. 콜라이 DH1을 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 pkDchT2-Pst를 수득한다.

(8) pkDchT2 Bcl의 작제(제31도)

제31도에 나타낸 바와 같이, pUC118chT201-chT2를 Hind Ⅲ 및 BclI으로 절단하여 DNA 단편 C13을 수득하고, 플라스미드 pUCP_LCl을 BamHI 및 Hind Ⅲ로 절단하여 DNA 단편 C14를 수득한다. 추가로, 플라스미드 pkD를 Hind Ⅲ로 절단한다. 다음, DNA 단편 C13 및 C14, 및 선형의 pkD를 결합하고 이. 콜라이 DH1을 형질전환시키는데 사용하여, 플라스미드 pkDchT2-Bcl을 수득한다.

상기 기술된 작제 방법에 따라서, chT201 cDNA에서 유래된 5개의 발현 플라스미드, pkDchT201-Sph, pkDchT201-Sal, pkDchT201-S/B, pkDchT201-Pst, 및 pkDchT201-Bcl, 및 chT2 cDNA 및 chT201 cDNA에서 유래되어 chT101-유형 단백질 유도체를 암호화하는 2개의 발현 플라스미드 pkDchT2-Pst, pkDchT2-Bcl을 작제한다.

실시예 11

COS1 세포에서 단백질 유도체의 발현

사람 갑상선 기원의 C-말단 α-아미드화 효소 발현을 하기와 같이 시험한다.

(1) 형질감염

플라스미드 pkD, pkDchT201-Sph, pkDchT201-Sal, pkDchT201-S/B, pkDchT201-Bcl, pkDchT201-Pst, pkDchT2-Pst 및 pkDchT2-Bcl을 통상적인 방법으로서 상응하는 이. 콜라이 형질전환체로부터 제조하고, 각 플라스미드 DNA 30㎍을 에탄올로 침전시키고, 에탄올 침전물을 80% 에탄올로 세척하고 진공하에 건조시킨다. 건조된 DNA를 멸균 증류수 720㎕에 용해시키고, 이 용액에 세포 펙트 형질감염 키트(Cell Phect transfection kit, Pharmacia)의 A 완충 용액 720㎕을 가하고, 전체를 완전히 혼합하여 실온에서 10분간 방치한다. 다음, 동일한 키트의 B 완충 용액 1440㎕를 가하고, 전체를 완전히 혼합하고 15분 동안 실온에 정치하여, 인산 칼슘-DNA 복합체를 형성시킨다.

한편, COS1 세포를 페트리 디쉬 10㎖당 7.5×10₅세포 농도로 배지 30개 내에서 밤새 배양하고, 각 페트리디쉬에 신선 배지 10㎖를 가한 후, 다시 4시간 동안 배양한다. 이 배양물에 페트리 디쉬당 960㎕의 인산 칼슘-DNA 복합체를 가하고, 배양물을 4시간 동안 배양하여, 상충액을 흡입 제거하고, 페트리 디쉬를 태 송아지 혈청-유리 배지 5㎖로 세척한다. 다음, 20% 글리세롤을 함유하는 배지 2.5㎖를 디쉬에 가하고 1분간 정치한다. 글리세롤-함유 배지를 제거한 후에, 페트리 디쉬를 배지 8㎖로 세척하고, 배지 10㎖를 페트리 디쉬에 가하고, 배양을 3일 동안 수행한다. 일반적으로, 배지는 10%의 태 송아지 혈청을 함유하는 들베코의 최소 필수 배지(Dulbecco's MEM)이고, 배양은 50% CO₂대기하에서 37℃에서 수행한다.

실시예 12

배양물의 C-말단 α-아미드화 활성의 측정

상기에서 기술한 바와 같이, 형질감염된 COS1세포를 3일간 배양 후에, 상층액을 수득하고 15,000rpm에서 4분 동안 원심분리하여 상충액을 수득하고, 상충액의 C-말단 α-아미드화 활성을 검정하여 측정한다. 미주노등(상기 참조)에 따라서 검정을 수행하고, [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-Gly에서 [¹²⁵I]-Ac-Tyr-Phe-NH₄로의 전환을 측정한다. 제32(a) 및 32(b)도에 이 결과를 도시하였다. 이 결과는 16시간 동안 상측액 100㎕와 반응시킴으로써 수득하였다.

제32(a) 및 32(b)도에 나타낸 바와 같이, (1) chT201 cDNA 및 chT2 cDNA 각각에 의해 암호화된 두 단백질은 C-말단 α-아미드화 효소 활성을 가지고 ; (2) 활성은 chT201 cDNA 또는 chT2 DNA에 의해 암호화된 완전한 길이의 일차 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의해서 뿐 아니라, chT201 cDNA 또는 chT2 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열의 부위를 갖는 짧아진 단백질에 의해서도 제공된다.

실질적으로, COS1 세포로 도입되는 경우, C-말단 절단된 단백질 유도체를 암호화하는 pkDchT201-Bcl, pkDchT2-Bcl, pkDchT201-Pst, pkDchT2-Pst, pkDchT201-S/B, 및 pkDchT201-Sal과 같은 발현 벡터는 배양 상층액내에서 분명한 C-말단 α-아미드화 효소 활성을 나타낸다.

제1도에 나타낸 바와 같이 아미노산 서열에서 1번 Met 내지 323번 Ala의 아미노산 서열을 암호화하는 pkDchT201-Sph는 그러나, 목적하는 효소 활성을 나타내지 않는다. 따라서, 323번 Ala에서 또는 그 전에서 종결하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이 C-말단 α-아미드화 효소 활성을 나타내기에 불충분하지마, 378번 Lys까지 또는 그 이상 연장된 아미노산 서열을 갖는 단백질은 이것을 나타내기에 충분하다는 것이 밝혀졌다.

본 발명에 따라서, 다량의 C-말단 α-아미드화 효소를 사람 갑상선 기원 유래된 클론된 cDNA를 사용하여 제조할 수 있다. 따라서, 약제학적 또는 의학적 분야 및 다른 산업 분야에서 유용하고 중요한 C-말단 α-아미드화 펩타이드 또는 단백질을 경계적으로 제조할 수 있다.

부다페스트 조약의 규정 13-2를 참조하여 미생물 수탁기관은 하기와 같다.

수탁기관 : 퍼맨테이션 리서어치 인스티튜트(Fermentation Research Institute), 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지(Agency of Industrial Science and technology) 주소 : 일본국 301, 이바라키-켄, 쓰쿠바시 1-초메, 1-3 수탁된 미생물의 분류, 기탁번호 및 기탁일 :

1. 이. 콜라이 DH1/PXA799 FERM BP-1586 1987년 12월 3일

2. 이. 콜라이 SBM302 FERM BP-2237 1989년 1월 11일

3. 이. 콜라이 SBM303 FERM BP-2238 1989년 1월 11일

4. 이. 콜라이 SBM304 FERM BP-2239 1989년 1월 11일

5. 이. 콜라이 SBM305 FERM BP-2240 1989년 1월 11일

Claims (11)

1. 일반식 R-X-Gly(여기서 Gly는 C-말단에 존재하는 글리신이고, X는 α-아미드화되는 아미노산이며, R은 단백질 또는 펩타이드의 나머지 부위이다)에 의해 표현되는 단백질 또는 펩타이드를 일반식 R-X-NH₂(여기서 X-NH₂는 C-말단 α-아미드화된 아미노산이고 R은 단백질 또는 펩타이드의 나머지 부위이다)에 의해 표현되는 α-아미드화된 단백질 또는 펩타이드로 전환시키는, 제1도에 도시된 아미노산 서열의 37번 Pro에서 개시하여 378번 Lys에서 종료하는 아미노산 서열, 또는 제3도에 도시된 아미노산 서열의 37번 Pro에서 개시하여 378번 Lys에서 종료하는 아미노산 서열을 포함하는, 사람 갑상선 기원의 C-말단 α-아미드화 효소.
2. 제1항에 있어서, 분자량이 약 120,000D 이하인 C-말단 α-아미드화 효소.
3. 제1항에 있어서, 분자량이 약 40,000D 내지 약 120,000D 이하인 C-말단 α-아미드화 효소.
4. 제1항에 있어서, 제1도에 도시된 아미노산 서열 중 1번 Met와 37번 Pro 사이에 존재하는 아미노산에서 개시하여 378번 Lys과 974번 Ser 사이에 존재하는 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 함유하는 C-말단 α-아미드화 효소.
5. 제1항에 있어서, 제1도에 1번 Met와 37번 Pro 사이에 존재하는 아미노산에서 개시하여 378번 Lys과 974번 Ser 사이에 존재하는 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 지니고, 추가의 C-말단 아미노산 또는 10개 아미노산 이하로 이루어진 아미노산 서열을 지니는, C-말단 α-아미드화 효소.
6. 제1항에 있어서, 제3도의 1번 Met와 37번 Pro 사이에 존재하는 아미노산에서 개시하여 378번 Lys과 866번 Ser 사이에 존재하는 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 지니는 C-말단 α-아미드화 효소.
7. 제1항에 있어서, 제3도의 1번 Met와 37번 Pro 사이에 존재하는 아미노산에서 개시하여 378번 Lys과 866번 Ser 사이에 존재하는 아미노산에서 종료하는 아미노산 서열을 지니고, 추가의 C-말단 아미노산 또는 10개 이하인 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 지니는, C-말단 α-아미드화 효소.
8. (1) 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 배양하여 효소를 생성하는 단계, 및 (2) 배양물로부터 효소를 회수하는 단계들을 포함함을 특징으로 하여, 제1항에 따른 C-말단 α-아미드화 효소를 제조하는 방법.
9. 제1항에 따른 C-말단 α-아미드화 효소를 암호화하는 DNA.
10. P_LchT201, P_LchT2, pkDchT201 및 pkDchT2 계열을 포함하는 그룹 중에서 선택된, 제9항에 따른 DNA를 함유하는 플라스미드.
11. 제10항에 따른 플라스미드로 형질 감염된, 세균, 효모 및 포유 동물 세포를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 원핵 세포 또는 진핵 세포.