JPH05504063A - 小蛋白およびペプチドの産生に有用なral―4 - Google Patents
小蛋白およびペプチドの産生に有用なral―4Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
小蛋白およびペプチドの産生に有用なRA L −4発明の分野
本発明は、トリプトファン栄養要求株であり、かつ適当に形質転換された場合に
低分子量蛋白およびペプチドの単量体発現を増強することができるRAL−4と
称されるエシェリキア・コリ(E 5cherichia coli)の新規な
菌株に関するものである。
発明の背景
組換え微生物は、生物学的に重要な化合物、典型的には蛋白の発現のための重要
な道具として供することができる。原核生物における異種蛋白の発現は、農学お
よび生物医学の研究、臨床学的目的、および商業的使用のために比較的多量の同
種蛋白産物を得ることができる有用な手段を提供してきた。これまで、組換え蛋
白産生において最も一般的に使用されてきた原核生物はエシェリキア・コリ(イ
ー・コリ(E 、 cot i))である。より高分子量の蛋白、すなわち15
キロダルトン(kd)より大きい分子量を有する産生物はルーチン的に発現され
るが、小さい蛋白およびペプチドはあまりまたは全く発現されない。典型的には
、この問題は融合蛋白の使用を介して[ティ・エル・モウクス(T、 L、Mo
ks)ら、「細菌でのヒトインスリン様増殖因子■の発現:蛋白精製を促進する
ための最適化遺伝子融合ベクターの使用」 (“Expression of
Hu+san I n5ulin−Like GrowthFactor I
in Bacteria: Use or Optimized Gene F
usionVectors to Facilitate Protein P
urification″)、バイオケミストリー(B iochem、 )、
26 : 5239−5244(1987)]、または蛋白単量体の多コピーを
含む合成遺伝子の構築によって回避される。しかし、これらの方法の使用は発現
した蛋白の単離、切断、および収率において問題を生じる。[詳細な検討には、
ピー・ケイ・ゴーシュ(P、 K、 Ghosh)およびディー・ケイ・ビスワ
ズ(D、 K。
B iswas)、「エシェリキア・コリを介する治療学的ポリペプチドの産生
°展望」 (Production of Therapeutic Poly
peptidesThrough Esherichia Co11 : A
Perspective″)、ヒンダスタン・アンチバイオティクス・プルチン
(H1ndustan AntibioticsB ulletin) 30、
第1〜30頁(1988)およびエフ・エイ・オー・マートソン(F、A、O,
Martson)、「エシェリキア・コリにおいて合成された真核性ポリペプチ
ドの精製」゛(“The Purification ofEukaryoti
c Po1ypeptides 5ynthesized in Escher
ichiaColi”)、バイオケミカル・ジャーナル(Biochem、 J
、)240 : 1〜12(1986)参照]。
イー・コリで小さい単量体蛋白を発現させようと試みる研究者らが直面したさら
なる難点は細胞性蛋白分解酵素による分解速度である。例えば、イー・コリで蛋
白を発現させる試みでは、ジー・ブエル(G、BueH)らL「ソマトメジン−
C(ICF−I)をコードする合成遺伝子のイー・コリにおける発現の最適化」
(“Optimizing theExpression in E、 Co1
1 of a 5ynthetic Gene EncodingS omat
oIIledin −C(I G F −I )”)、ヌクレイツク・ア/ツズ
・リサーチ(Nucl、Ac1ds Res、)13: 1923−1938(
1985)コによって、λPLプロモーターの制御下で70アミノ酸、すなわち
単量体インスワン様増殖因子I(+GF−1)をフードする合成遺伝子が使用さ
れた。これらの研究者らは、発現したIGF−1蛋白が細胞内たり数百分子しか
存在せず、かつこの乏しい発現レベルが■GF−i産物の不安定性に起因するこ
とを見い出した。この仮定は、IonおよびhtpR(現在、rpoHと称され
る)遺伝子座に関する突然変異の菌株が誘発され、野生型細胞よりも33倍高い
レベルでIGF−■を発現することが判明した時に実証された。この研究結果は
、イー・ワイ・つtング(E 、 Y 、 Wong)ら(rエシェリキア・コ
リにおける分泌されたインスリン様増殖因子−1の発現」(“E xpress
1onof 5ecreted I n5ulin−Like Growth
Factor −1inE 5cherjchia Coli″)、ジーン(
Gene)68 : 193−203(1988)]によってさらに利用された
。彼らは、lamBおよびOmpFのシグナル配列を用いて単量体IGF−Iを
ペリプラズム空間に分泌させ、それによって細胞内蛋白分解のIGF−I蓄積へ
の影響を最小にした。これらのシステムは共にイー・コリでIGF−1を発現さ
せたが、いずれも産生基準に適合する発現レベルに達しなかっ本発明者らは、共
有結合性融合戦略に頼らずに、または縦列反復構造において蛋白の多コピーを含
む遺伝子を合成せずに、小蛋白およびペプチドを高レベルで産生できるイー・コ
リの菌株を同定しようとした。このような菌株を造成し得るもっともらしい手段
はイン・ビトロ化学的変異誘発因子の使用を介する。化学的突然変異誘発物質は
、所望の選択された表現型を有する細胞を同定するのに有力な技術として当業者
によく知られている。それらの長所は、形成される突然変異誘発物質の任意性な
らびに単一実験において暴露および選択され得る細胞数の多さにある。
このような突然変異誘発物質の1つはエチルメタンスルホネート(EMS)であ
る。EMSは06−アルキルグアニン残基の作製を助け、その結果、塩基対のミ
スマツチおよびG−CからA−Tへの塩基対転位を生じると思われる。細胞がこ
のような損傷の修復を行うことかできるいくつかの経路かあるが「ジー・シー・
つを−カー(G、 C,Walker)、7エンエリキア・コリにおけるテオキ
シリホ核酸損傷に対する突然変異誘発および誘発性応答J (”Mutsgen
esrsand I nducible Re5ponses to Deox
yribonucleic Ac1d Damagein Escherich
ia Co11’)、マイクロバイオロジカル・リビュー(Microbiol
、Rev、)48 : 6O−93(1984)コ、EMSは細胞の適応修復系
を有効に誘発せず、一度銹発すると、エチル化損傷はメチル化損傷の処理を目的
とした酵素過程によっては有効に修復されないので、該EMSは特に有効な突然
変異誘発物質である。ビー・セジウィク(B 、 S edgwick)および
ティー・リンタール(T、 L 1ndahl)、「D N Aにおける06−
メチルグアニンおよび06−エチルグアニンの修復についての一般的なメカニズ
ム」(“A Co+u+on Mechanisffifor Repair
of○6−Methylguanine and O6−E thylguan
ineinDNA”)、ジャーナル・オフ゛・モレキユラー・バイオロジー(J
、Mo1.Biol、)154 : 169−175(1982)。したがって
、選択された蛋白について非常に特異的なイム/ブロッティング法を用いる有効
なスクリーニング処理と共にこの薬物を使用することによって、増強された発現
レベルを示す表現型を有する突然変異体の同定のために有効なシステムが作成さ
れる。
本発明は、標準的な組換え技術によって関心のある蛋白をフードするように形質
転換されると特定の蛋白の単量体コピーを産生てきるイー・フリの菌株を提供す
ることによって上記問題点を解決する。
情報の開示
ジー・ブエル(G、Buell)ら[「ソマトメジン−〇(IGF−1)をコー
ドする合成遺伝子のイー・コリにおける発現の最適化−1(“○ptimizi
ng the Expression in E、Co11 of a 5yn
theticGene Encoding Somatomedin−C(IG
F −1)″、ヌクレイ/り・アン、ズ・リサーチ(Nucl、Ac1ds R
es、)13: 1923−1938(1985)] (上記で検討した)は、
蛋白発現を増強するための技術としてのEMSの使用を示唆していない。さらに
、ジー・ブエルらにおけるIGF発現はファージ由来プロモーターの制御下にお
けるものであり、IGFはあまり発現されない。
イー・ワイ・ウメング(E 、 Y Wolg) [rエシェリキア・コ’)に
おける分泌されたインスリン様増殖因子−1の発現」(“E xpress 1
onof 5ecreted I n5ulin−Like Growth F
actor−11nEscherichia Co11”)、ンーン(Gene
)68: 193−203(1988)コによって使用された技術は、ペリプラ
ズム空間に蛋白を向けることによってプロテアーゼに対するIGFの暴露を最小
にする。
しかし、該文献は本明細書中で用いた手段を示唆していないか、または本発明は
該文献に開示されているシグナル配列の使用を必要としない。
前記に引用したティー・エル・モウクス(T、 L、Moks)うCr1Efl
でのヒト・インスリン様増殖因子Iの発現:蛋白精製を促進するための最適化遺
伝子融合ベクターの使用」(“Expression of HumanIns
ulin−Like Growth Factor I jn Bacteri
a: Use ofOptimized Gene Fusion Vecto
rs to Facilitate ProteinP urif 1cat
ion”)、バイオケミストリー(B iochem、 )26 : 5239
−5244(1987)コは、イー・コリにおけるヒトIGF−1の発現を開示
した。しかし、本発明はそこで用いられている融合ベクターを必要としない。
ワイ・サイト(Y、 S aito)ら[「ニアストロン系の使用によるエシェ
リキア・コリにおける合成ソマトメジンC遺伝子の直接発現」(Direct
Expression of a 5ynthetic Somatomedi
n CGenein Escherichia Co11 by Use of
a Two−Cistron System”)、ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー(J、Biochem、)101 : 1281−1288(19
87)]は、イー・コリにおける合成ソマトメジン−〇遺伝子の直接発現を開示
した。しかし、本発明はICF−I発現プラスミドに関してモ/ンストロン性で
ある。
プラスミドpSK4は本発明で使用され、「エシェリキア・フリにおけるヒト・
レニンの高レベル発現」(“High Level Expressionof
Human Ren1n in Escherichia Co11″)、ジ
ャーナル1オブ1バイオテクノロジー(J、Biotechnology)4
: 205−218(1986)においてビー・ニス・ケイテス(P、 S、
Kaytes)らによって開示されている。
エム・ケイ・オルソン(M、 K 、 O1son)ら[「リホソーム結合部位
配列における変性による異種ポリペプチド発現の増強J(E nhanceme
ntof Heterologous Po1ypeptide Expres
sion by Alterations 1nthe Ribosome−B
inding−3ite S equence″)、ジャーナル0オブバイオ
テクノロジー(J、Biotechnology)9 : 179−190(1
989)]は、本発明において使用されるpTrp2ベクターを開示している。
変異誘発因子としてのEMSの使用は、当業者によく知られている。本発明は、
以下のように改変したンエイ・ミラー(J、Miller)の方法[分子遺伝学
における実験、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−(Cold S
pring Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・
ハーバ−(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク(1972
)Eを使用する。
本発明において使用される方法は、組換えDNA実験およびファージ形質導入を
含む標準的な実験技術も含む。このような方法は、ティー・マニアティス(T、
Maniatis)ら[「分子クローニング」(“Mo1ecular Clo
ning″)、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−(Cold S
pring Harbor Laboratory)(1982)1に見受けら
れる。
発明の概要
本発明は、受託番号NRRL B−18562を有するRAL−4と称されるイ
ー・コリの非天然菌株を提供するものである。
さらに詳しくは、本発明はトリプトファン欠乏異種蛋白をコードするRAL−4
の一形態を提供するものである。
最も詳しくは、本発明は、インスリン様増殖因子−I(IGF−■)または成長
ホルモン放出因子(GRF)の増強された単量体産生によって特徴付けられるR
AL−4の一形態を提供するものである。
本発明は、また、発現されるべき異種蛋白に存在しないアミノ酸に関するイー・
コリ栄養要求株を創製することによる異種蛋白の産生方法を提供するものでもあ
る。
本発明の方法の好ましい具体例は、適当な異種蛋白をコードするヘクターでイー
・コリ栄養要求株を形質転換し、適当な条件下で形質転換体を増殖し、蛋白の発
現を誘導し、発現した蛋白を精製することからなる異種蛋白を産生ずる手段を提
供するものである。いずれの適当な異種蛋白を使用してもよいが、該方法は、約
15キロダルトン以下の分子量を有する蛋白およびペプチドの発現に特に有用で
ある。
本発明のRAL−4および方法は一緒になって、異種蛋白、好ましくはIGF−
rおよびGRFの増強された産生のためのシステムの基礎を提供する。このシス
テムは、さらに、RAL−4の形質転換形態または他のトリプトファン栄養要求
株のいずれかの使用からなる。
発明の詳細な説明
本発明は、イー・フリの新規菌株および単量体形態の蛋白またはペプチドの増強
された発現によって特徴付けられるこの新規菌株の一形態を提供するものである
。この新規菌株はRAL−4と称され、イリノイ州ペオワア、米国農務省、ノー
ザーン・リージコナル・リサーチ・ラボラトリ−(NRRL)に1989年11
月11日に寄託され、受託番号B−18562を割り当てられた。
さらに、本発明は、異種蛋白の産生方法を提供するものでもある。
この方法は、発現されるべき異種蛋白に存在しないアミノ酸に関するイー・コリ
栄養要求株を創製することを含む。栄養要求株を創製し得るいずれの適当な手段
を使用してもよいが、P1ファージ形質導入が好ましい。次いで、蛋白をコード
する発現ベクターで該栄養要求株を形質転換し、発現を誘発し、蛋白を精製する
。適当に形質転換されたRAL−4、すなわちトリプトファン栄養要求株は、こ
の方法において使用する場合に特に有用である。別法として、この方法では、P
1ファージ形質導入によって栄養要求性とされたイー・コリDU99Bを使用し
てもよい。
以下の用語はこの記載および請求の範囲の全体にわたって使用しれ、以下のとお
り定義される:
「異種蛋白」は、遺伝子型か宿主微生物以外の微生物から誘導される蛋白を示す
。
「増強された産生」または「増強された発現」は、サザーンブロノト分析法によ
って測定した場合、野生型対照によって発現された量よりも多い蛋白発現のレベ
ルを意味する。
「栄養要求性」は、特定のアミノ酸を合成できないことを意味する。「栄養要求
株2は、栄養要求性であり、かつ培地に特定のアミノ酸か補足された場合にのみ
増殖できる微生物である。
rN RRLjは、イリノイ州ペオリア、米国農務省、ノーザーン・リージョナ
ル・リサーチ・ラホラトリーを示す。
他に特記しない限り、r+cF−■」は不特定起源のインスリン様増殖因子■で
あり、rGRF:は、不特定起源の成長ホルモン放出因子である。i Leu”
b−GRF jは、27位のメチオニンがロイシンで置換されたウシ成長ホルモ
ン放出因子である。
本発明者らは、ここに簡単に説明し、以下により詳しく説明する組換え技術と化
学的突然変異誘発とを組み合わせることによってRAL−4を産生じた。本発明
者らは、ブタ肝臓cDNAライブラリーからインスリン様増殖因子(IGF−1
)をコードする遺伝子を単離することによって開始した。別法として、c D
N Aはブタまたは他の種由来のIGFに関する公表されたアミノ酸配列を使用
して、合成される。次いで、酵素制限ならびにベクター組立体の発現を促進する
ために設計された制限部位を含有するリンカ−ならびに開始コドンおよびN−末
端コドンの添加によるcDNAの組換え工学によってIGF−I発現ベクターを
構築する。いずれの適当な制限部位をリンカ−中に工作してもよい。適当なN−
末端コドンおよび次なる形質転換において使用されるベクターの選択もまた当業
者の通常の技術範囲内である。この構築体(plGF105)を適当なベクター
に連結する。好ましい具体例において、本発明者らは、イー・コリのトリプトフ
ァンプロモーターおよびリポソーム結合部位を含むpBr基本ベクターps K
4を使用する。このプラスミドをpIGF105/Ptrpと称する。次いで
、pIGF 105/Ptrpを制限し、ICF−Iに関する70アミノ酸暗号
配列およびトリプトファンプロモーターを含有している断片をps K 4に連
結し、plGF70/Ptrpと称する。次いで、plGF70/Ptrpの制
限によって、C1al/BamHI断片(70アミノ酸IGF−I暗号領域を示
す)が得られ、これを単離し、Trpプロモーターをコードするベクターに連結
する。好ましくは、本発明者らは次なる突然変異誘発においてpTrp2を使用
する。
次いで、pTrp2を使用してイー・コリ菌株BST−1c(NRRLB−18
303)を形質転換し、E MSで処理する。生存する細胞をIGF−■の発現
について誘発する。異種蛋白の増強された発現を示すこれらの突然変異体を選択
し、RAL−4と称する。宿主細胞DNAに対する突然変異はプラスミド脱落に
よって確認する。本発明者らは、EMS誘発突然変異が宿主細胞に生じ、ざらに
RAL−4がトリプトファン栄養要求株であることも示した。
本発明者らは、トリプトファンを欠損している別の蛋白、すなわちつ7成長ホル
モン放出因子(bGRF)をコードするプラスミドで該菌株を形質転換すること
によるRAL−4の多面性も示した。この組換えにおける蛋白発現も野生型対照
より多かった。IGI−1およびGRFならびにそれらの使用は当技術分野にお
いてよく知られている。
本発明者らは、以下に詳細に説明するとおり、P1ファージ形質導入によりイー
・コリのさらなる栄養要求性菌株を創製した。p[GF70/Trp2のような
適当な発現ベクターによる形質転換の後、このような栄養要求株は、野生里親を
しのぐレベルで蛋白産物を発現できる。
ここで説明した種々の具体例は増殖因子である蛋白の発現に関してであるが、ア
ミノ酸トリプトファンを欠損しているいずれの蛋白の発現も同様の技術および適
切なベクターの使用によって増強できることは当業者に明白であろう。このよう
なペプチドの例は、コルチコトロピン放出因子(CRF)である。下垂体前葉か
らコルチコトルビンを放出させるこの41アミノ酸ペプチドは、その成熟配列に
おいてトリプトファン残基を欠損することがワイ・フルタニ(Y。
F urutani)ら[不イチャ(N ature)、301 : 537−
540(1983)2によって示された。
実施例3にはトリプトファンオペロンのファージ形質導入を介する増強された蛋
白発現を記載するが、ここで記載される技術は対応するオペロンが宿主細胞にお
いて分断される場合にトリプトファン以外のアミノ酸を欠損している蛋白の発現
を増大するのに用いられ得る。
本発明の技術が当業者によって商業的かつ工業的生産のための慣用手段によって
容易に適合させられ得ることも明らかであろう。例えば、微生物が利用可能なア
ミノ酸の量を制御することによって蛋白産生量が得られる。所望の細胞密度が達
成されるまで、必要なアミノ酸を供給することによって、原栄養体性増殖を続け
る。所望の密度で、該アミノ酸の供給源を除去し、かくして、所望の産物の発現
を誘導する。次いで、該産物を培養培地から容易に取り出し、精製することがで
きる。
最後に、当業者は、DU99b以外のイー・コリをイー・コリ栄養要求株を創製
するために使用し得ることを認識するであろう。他の適当な菌株としては、DH
5、JMl 03、K12、RV30B、W3110.HBlol、MC106
1、および5K107が挙げられる。
前記記載は、微生物を容易にかつ有効に形質転換して多量の異種蛋白を産生する
手段を提供するが、異種蛋白は形質転換微生物が栄養を要求するアミノ酸を欠損
していることは明らかである。
チャーhA、B、およびCは本発明の詳細な説明する。以下の約束を使用して、
プラスミドおよびDNA断片を説明する。
(1)単一線図は環状および線状の両方の二本鎖DNAを表す。
(2)星印(”)は表された分子が環状であることを示す。星印がないのは分子
が線状であることを示す。
(3)エンドヌクレアーゼ制限部位は当該線の上方に示す。
(4)遺伝子は当該線の下方に示す。
(5)遺伝子および制限部位間の距離はスケールどおりでない。該チャートはそ
れらの相対的位置を示すだけである。
当業者はRAL−4を生産するために使用される方法の多くが標準的な実験技術
を含むことを認識するであろう。組換え法はティー・マニアティス(T、Man
iatis)ら[「分子クローニングE(“Mo1ecularCloning
″)、コールド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−(Cold Sprin
g Harbor Laboratory)(1982)二に見受けられる。E
MS突然変異誘発を含むこれらは、実質的に、下記のとおり改変したジェイ・ミ
ラー(J 、 M 1ller)の方法[分子遺伝学における実験(Exper
iments in Mo1ecular Genetics)、コールド0ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ノ\−バー、ニュ
ーヨーク(1972)Iに従う。使用される全ての化学薬品および物質は公共の
供給源から容易に入手可能である。エチルメタンスルホン酸、アンビンリン、テ
トラサイクリン、クロロテトラサイクリンおよびフマル酸はミズーリ州セントル
イスのシグマ(SIGMA)から入手した。菌株の増殖を支持するために使用さ
れる培地はミノガン州デトロイトのディフコ(DIFCO)から入手した。緩衝
液を作成するのに使用した全ての化学薬品は試薬級以上のものであった。
SDS/PAGEおよびウェスタン分析における分析標準として使用するために
、組換えヒ)IGF−1蛋白はインディアナ州テア・オートのIMCERAから
購入した。
イー・コリ菌株BST−1c(λ’+rpoH++t、zhg::Tnl○)お
よびDU99b(λ’+ rpoH+ + t)は、各々、NRRL受託番号B
−183o3およびB−18590から入手可能である。プラスミドpSK4は
上記ピー・ニス・ケイテス(P、 S、 Kaytes)ら[「エンエリキア・
コリにおけるヒト・レニンの高レベル発現」(“HighL evelExpr
ession of Human Ren1n in Escherichia
Co11−)、ジャーナル・オブ・バイオチクノロノー(J 、 B iot
echnology)4 : 205−218(1,986)Iによって開示さ
れている。pUCヘクターはアメリカ合衆国ニューシャーシー州ビスカタウエイ
のファルマンア・ビー/エル・インコーポレイテッド(P harmacia
P / L 、 I nc、 )のような商業的供給源から入手可能である。他
のpBRおよびpURAベクターも商業的供給源から容易に入手可能である。
以下の実施例は説明的であるが限定されない本発明の具体例を示す。
実施例I
RAL−4の製造およびインスリン様増殖因子Iの発現A、、BST−1c/C
pIGF70/Trp2Fの構築ティー・マニアティス(T、Maniatis
)うf: 「分子クロー= 7 りJ(“Mo1ecular Ctoning
”)、コールド・スプリング+1 /\/\−+ ラホラトリー(Cold S
pring Harbor Laboratory)、ニューヨーク(1gB2
)1に記載された標準的技術を使用して、ブタ肝臓λgtllcDNAライブラ
リーからインスリン様増殖因子−1(IGF−I)相補的DNA(cDNA)を
単離する。ブタ以外の種由来のcDNAも同等によく作用するのてIGF−1c
DNAの該特定供給源は決定的ではない。さらに、種々の種に関する公表された
アミノ酸配列データは入手可能であり、当業者は対応するcDNAを合成するた
めにこのようなデータを使用してよい。[例えば・ウシ−エイ・オ不ガー(A、
、 Honegger)ら、「胎児および成熟ウシ血清におけるインスリン様
増殖因子Iおよびnj(I n5ulin−1ike Growth F ac
torsI and U in Fetal and Adult Bovin
e Serum”)、ジャーナル・Cオブ+バイオロジカル・ケミストリー(J
、Biol、Chem、)、261:569−575(1986); ヒト −
エム・エル・ベイン(M、L。
B ayne)ら、「血清結合蛋白に対して減少した親和性を有するヒト・イン
スリン様増殖因子■および2型インスリン様増殖因子レセプターの構造類似体」
(“S tructural Analogs of’ Human I n5
ulin−1ike Growth Factor I with Reduc
ed Affinity for SerumBinding Protein
s and the Type 2 1 n5ulin−1ike Growt
hFactor Receptor”)、ンヤーナル・オブ・ノぐイオロンカル
・ケミストリー(J 、 B iol、 Chem、 )、263 : 623
3−6239(1988):およびブタ −エイ・エフ・タノ\ノコール(A
、 F 、 T avakkol)ら、「ブタインスリン様増殖因子−1(pI
GF−I):m補的y’オ+ンリホ核酸クローニングおよび進化的に保存されt
こ1GFiペフ。
チドをコードするメノセンジャーリホ核酸の子宮発現」(“PorcineI
n5ulin−1ike G rowth F actor−T (p I G
F −I ):ComplimentaryDeoxyribonuclei
c Ac1d Cloning and Uterine Expressio
nof Messenger R1bonucleic Ac1d Encod
ing Evolutionarily81(1988)参照]。IGF−Iの
発現のためζこ使用されたベクターは二段工程で構築される。最初に、チャート
Aを参照して、AvallおよびBamHIを使用してIGF−1cDNAをI
I限して、全ブタ1GF−1領域および3′非翻訳領域80塩基24(bp)を
含む43obp断片を得る(prolGF−1)。prolGF Iの5°末端
を工作して、ClaT部位を含む短いリンカ−を受容し、イー・コリ翻訳開始の
ために必要とされるMetコドン、IGFi N末端グリシンフドン、およびA
vaU部位を付加する。これを、C1aIないしBamHIにわたり、ケイテス
(K aytes)(1986)によって記載されたイー・コリトリプトファン
プロモーターおよびリポソーム結合部位を含むpBR基本基本ヌクターs K
4に連結する。この105アミノ酸prolGF−1cDNAを含むIGF−1
プラスミド構築体をplGF 105/Ptrpと称する。この工程における第
2段階はチャートBに示すように全トリプトファンプロモーター領域およびアミ
ノ酸1〜69個を表すブタrGF−I暗号配列を含むpIGF105/Ptrp
のEcoRIからBgl、Iまでの断片の単離を含む。この断片の3゛末端を工
作してAlaコドンから下流に2つの翻訳停止コドン、HindI[1部位およ
び最後にBamHI部位を供給する。該蛋白の成熟70アミノ酸形態をコードす
るこのIGF−1構築体をpSK4ベクターEcoRIからBamHIまでに連
結し、pi GF 70/ Ptrpと称する。ベクターの正しい配列は、ジデ
オ牛シ配列決定法[エフ・ニス・サンガー(F 、 S 、 S anger)
ら、「読み終わりインヒビターによるDNA配列決定」 (“DNA ’Seq
uencing with Chain−Terminating I nhi
bitors”)、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンシズ・ニーニスエイ(P rocNatl、Acad、Sci、US
A)74 : 5463−5467(1977)]を使用して証明される。5’
C1a1部位およびいずれかの3″部位でのこれらのベクターの制限は、リポソ
ーム結合部位配列が変異したTrpプロモーターを含有するベクターの構築を容
易とした。エム・ケイ・オルソン(M、 K ○1son)ら、「リポソーム結
合部位配列の変性ニよる異種ボヮペプチド発現の増強J(“E nhancem
ent ofHeterologous Po1ypeptide Expre
ssion by Alterations 1nthe Ribosome−
B inding−3ite S equence”)、ジャーナル0オブ1バ
イオテクノロジー(J、Biotechnology)9 : 179−190
(1989)。EMS突然変異誘発実験および次なる特性付けにおいて使用され
るplGF70/Trp2ヘクターは、オルソン(同上)によって記載されたp
Trp2ベクターの下流へのpIGF70/PtrpのC1aI/BamHI断
片の連結によって構築される。
pi G F 70/Trp2を使用して、ディ・エイ・モリソン(D、 AM
orrison)[r形質転換および冷凍によるコンビタント細菌細胞の保存」
(“Transformation and Preservation or
CompetentBacterial Ce1ls by Freezin
g”)、Methods Enzymol、、68゜326−331(1979
)]によって開示された修飾CaCa2法に従って、イー・コリ菌株BST−1
cを形質転換する。プラスミドの存在は、抗生物質選択および制限地図作成によ
って確認される。トリプトファン100μ9/*Qの存在下、37°Cで増殖し
た画線培養プレートから単一コロニーを拾い上げ、0.1%グルコースを補足し
たLB中で中期対数期まで培養する。この培養物、BST−1c/CprGF7
0/Trp2Jを収穫し、ペレット化する。
B、エチルメタンスルホネート(EMS)突然変異誘発ミラー(前記)によって
開示された方法に従って、トリス緩衝化生理食塩水(TBS)にBST lc/
JpIGF70/Trp23細胞を再懸濁し、振盪しつつ37°CでEMS80
μQ/jIQを添加する。EMSは水溶液にあまり溶解しないので、この時点て
注意深く混合することは突然変異誘発に対して決定的である。EMSは有力な突
然変異誘発物質でもあるので、この時点から該試料を扱う際の注意は義務である
。30分後、該反応を急冷し、該細胞をペレット化し、洗浄し、新しい培養プレ
ートに移す。
C,IGF−■誘発
菌株を誘発して、2つの方法のうちの1つによってブタrGF−■の発現を評価
した。pBRまたはpUC基本ベクターについて、これは、LB/グルコース/
アンピシリン中で一晩イー・コリ菌株を培養し、次いで、誘発のためにこの飽和
培養物をM9/グルフース/1%CAA/alnl)中に1 : 100希釈す
ることを含む。この方法はpBRまたはp’UCベクターに基づ< IGF構築
を誘発するのに有効であるが、pu RAランナウェイベクターを含む誘発につ
いては充分ではない。pURAベクターを用いる誘発実験は、画線培養プレート
から単一の健康なコロニーを選択し、このコロニーを新しい誘発培地に接種する
ことによって開始される。この接種物を誘発培地中て所望の密度に培養し、細胞
を収穫し、次いで、SDS PAGEについて処理する。SDS PAGEは、
ニー・ケイ・レムリイ(UK 、 L aemmli)の方法[「バクテリオフ
ァー214頭部の組立間の構造蛋白の開裂」(“Clevage of S t
ructural Proteins During theAssembly
of the Head or Bacteriophage T 4″)、
(1972)]を使用して行った。イー・コリ蛋白由来のIGF−Iを最も良く
分解することが判明した不連続ゲルシステムは分離ゲル15%およびスタ・7キ
ングゲル4%からなっていた。ヒトIGFiに対して生じたウサギ・ポリクロー
ナル抗血清を使用してIGF−Tの免疫学的検出を行った。エイチ・タウビン(
H,T owbin)ら[「ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシー
トへの電気泳動移行:方法およびいくつかの応用」(“E 1ectropho
retic Transfer ofProteins from Polya
crylamide Ge1s to N1trocelluloseS he
ets : P rocesedure and S ome Applica
tions″)、プロシーディンゲス・オブ・す/ヨナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシズ・ユ−ニスエイ(P roc、 Natl、 Acad、 S c
i U S A)、76 : 4350−4354(1979)] i:よッテ
記載されたとおり、IGF−1標準250n9に対してウェスタンプロットを行
う。比較用標準としてIGF−■ 25On9の選択は、OD ssa当たりI
GF−■ 1μ9を含有する培養物のレーン当たり0.25 0D、、。から予
想されるものに関する標準のこの量によって生じるオートラジオグラフ信号強度
の適切さに基づいている。
D、プラスミド脱落
BST−1c/[pIGF70/Trp2]のプラスミド脱落誘導体をアンピシ
リン感受性についてのスクリーニングによって単離する。
グルコース0.1%およびトリプトファン100μg/ xi!を補足した無ア
ンビンリン培地培地に細胞を接種する。培養物を飽和まで外殖し、次いで、2回
目の増殖サイクルのために、新しい無アンビンリン培地に接種する。飽和した培
養物を希釈し、単一コロニーを単離することができる密度で、トリプトファン1
00μ9/x(lを補足した抗生物質■プレート上で平板培養する。これらのプ
レートから、アンピシリン100 l19/IQを補足した抗生物質■プレート
上にコロニーを拾い上げ、次いで、無アンピシリンプレート上に拾い上げた。ア
ンピシリンプレート上で増殖できなかったコロニーをさらに脱落について評価す
る。この方法を用いて脱落できない突然変異菌株を、リフアンピシン4または6
μg/xQを補足した無アンビンリン培地中で上記に従って外殖する。飽和に至
る増殖を2サイクル行った後、培養物を平板培養し、上記に従って、単一コロニ
ーをアンビンリンプレートおよび無アンピシリンプレート上に拾い上げる。再度
、アンピシリンプレート上で増殖できないコロニーをさらに分析し続ける。
E、RAL−4の同定
EMS 80と称されるEMSに対する暴露にもかかわらず生存する細胞集団を
、IGF−1発現突然変異体について検査する。平板培養された総集団約12X
103クローンから、+GF−I発現について免疫陽性に染色した14クロー
ンを単離し、さらに特性付けのためにサブクローン化した。誘発によって、6コ
ロニーが野生型宿主、すなわちBST−1c/[plGF70/Ptrp2]よ
りも多い充分な免疫反応性ブタIGFIを生産すると評価され、さらに考慮を要
する。発現表現型かプラスミドの突然変異または宿主−プラスミド突然変異の組
み合わせのいずれによって与えられるかを確立するために、6種の突然変異体の
各々を培養し、plGF70/Trp2プラスミドを単離する。同時に、各宿主
からプラスミドを脱落させるために実験を行う。選択された突然変異体6種のう
ち、自然に2種およびリフアンピシン4μg/xQの導入を介した2種の合計4
種が成功裏にプラスミドを脱落させた(上記したとおり)。突然変異体6種から
単離したプラスミドでBST−1cを形質転換する要因実験を設計し、逆に、脱
落された宿主4種の各々を野生型plGF70/Ptrp2で形質転換した。誘
発を行い、その結果は、E〜1Sに暴露された宿主から単離されたいずれのプラ
スミドも野生型プラスミドよりも発現を増強しなかったことを示唆した。しかし
、野生型プラスミドを担持する突然変異宿主の誘発は、突然変異宿主の1つが野
生型宿主−プラスミド混合物ならびに野生型宿主対応突然変異プラスミド混合物
よりも多いレベルのIGF−1を発現することを示した:この突然変異宿主はR
AL−4と称される。かくして、RAL−4の発現表現型は、宿主突然変異によ
って与えられるがプラスミド突然変異によっては与えられない。他の突然変異宿
主はBST−1cおよびRAL−4に対して中間レベルのrGF−1を発現し、
さらには特性付けられなかった。
F、RAL−4表現型変化の確認
1−トリプトファン100μ9/xQの存在下および不在下、Me2O,1%グ
ルコースプレート上で選択的に平板培養することによって、RAL−4において
トリプトファン栄養要求性を確認する。トリプトファンの不在下でRAL−4は
たとえあるとしても野生型BST−1cと比較してほとんど増殖を示さない。ト
リプトファン栄養要求性を軽減し、原栄養体性増殖を回復するために、ミラー(
〜i 1ller)(1,972)によって実質的に開示されているP1ファー
ジ形質導入によって、RA>4をTrp”に形質導入する。T rp”への形質
導入は原栄養体性増殖を回復する。RA、 L−4のテトラサイタリフ感受性誘
導体RA L −4(Tet”)を、ビー・アール・ボクナ−(B 、 R、B
ochner)らの方法口「テトラサイクリン耐性の欠失に関する陽性選択」
(“Po5itive 5election for Loss of Tet
racyclineResistence”)、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジ−(J。
Bacteriology)143 : 926−933(1980)]によっ
て単離する。フマル酸処理によりTet’としおよびP1形質導入によりTrp
”としたRAL−4をpl GF70/−T−Trp2で形質転換し、上記セク
ションに記載したとおりIGF−1発現のために誘発した。
予想されたとおり、栄養要求性RAL−4親と比較して、RAL−4(Trp”
、 Tet’)突然変異株は、RAL 4(Trp−、Tetつカウンターバー
トよりも優れており、かつBST−1c野生型の原栄養体性増殖と同一である増
殖特性を示す。誘発データは、Trp″RAL−4突然変異株がTrp−菌株に
匹敵するレベルのIGF−1を発現せず、その上に、IGF−1発現が非常に重
いゲル負荷の場合を除いてはほとんと検出てきなかったことを示す。これらのデ
ータはトリプトファン生合成とIGF−1発現との間の相関関係を意味するが、
発現のための遅い外殖要求(trp−RA L −4突然変異株によって示され
る)のような別の説明も可能である。しかし、これらの結果は、RAL−4かト
ソブトファン栄養要求株であり、当該栄養要求性がIGF−1発現には必要であ
るが、当該表現型はテトラサイクリン耐性を2要としないことを示す。
実施例2
成長ホルモン放出因子のRA L −4発現合成つ7成長ホルモン放出因子(b
G RF )を含むプラスミドをRAm−4に形質転換する。このプラスミドb
BGRF1は、27位のメチオニンがロイ7ンによって置換されているbG R
F ((L eu”)bGRF)をフードするpBR322基本発現ベクターで
ある。この類似物は、ティ・ケンプ(T 、 K empe)ら[バイオ/テク
ノロジー(B io/ T echnology) 4.565−568(19
86)]によって充分な生物学的活性を有することが示された。ウシに加えて、
他の種由来の成長ホルモン放出因子は本発明の範囲内のものである。様々な種由
来のGRFsに関する配列は、エヌ・リング(N、 L ing)ら[「成長ホ
ルモン放出因子」(Growth Hormone Releasing Fa
ctors”)、Ann、Rev、Biochem、54 : 403−423
(1985)]によって編集された。アプライド・バイオシステムズ(AppN
sd BioSystems)380B DNA合成器でウソ・オリゴヌクレオ
チドを合成する。
脱保護の後、変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によってオリゴヌク
レオチドを精製し、次いで、エヌ・ロイ・シーワアウルト(N、Y、Theri
ault)ら[ヌクレオシドおよびヌクレオチド(Nucleosides a
nd Nucleotides)5.15−32(19s 6)lに従って、ウ
ォーターズ(Waters) S ep −P ak C−18カートリツジで
脱塩した。エヌ・ロイ・シーリアウルト(N、 Y 、 T heriault
)らのプロトコールニバイオテクニクス(B 1otechniques) 6
.470−474(1988)2に従って、該オリゴヌクレオチドをT4 DN
Aリガーセで連結する。該連結生成物を、非変性条件下で12%ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製し、電気溶離によって単離する。
合6i(L eu”)bG RF遺伝子ならびに開始コドンおよび翻訳コドンを
pTrpのC1al−HindIn領域にクローン化しくチ+−)C参?、)、
これは、エム・ケイ・オルソン(M、 K 、 O1son)ら[「リポソーム
結合部位配列における変性による異種ポリペプチド発現の増強」(“Enhan
cement of Heterologous Po1ypeptide E
xpression byA Iterations in the R1bo
soie−B inding−3ite S equence″)、ジャーナル
・オブ・バイオテクノロジー(J 、 B iotechnology) 9
: 179−190(1989)]によって開示されたイー・コリ・トリプトフ
ァンプロモーターのCon5D突然変異株の下流に遺伝子を配列する。誘発、次
に5DS−PAGEおよびウェスタンブロッティングにより、RAL−4が同一
のプラスミドで形質転換されたBST−1c野生型細胞を凌ぐレベルで免疫反応
性bG RFペプチドを発現することが確認される。かくして、RAL−4に存
在する突然変異は対立遺伝子特異的でなく、より小さいペプチドの発現を増大す
ることができる。発現されたbGRF配列は、この5kd蛋白がトリプトファン
を含有しないことを示す。かくして、RAL−4で増強された発現に関する主要
基準は、異種蛋白自体からのトリプトファンの欠失にある。
実施例3
ファージ形質導入によるRAL−4発現表現型の創製トリプトファンオペロンの
トリプトファンB遺伝子座へTnl OトランスポゾンをP1ファージ形質導入
することによって、トリプトファン栄養要求株をイー・コリ菌株DU99bて産
生した。この構造遺伝子の産物は、トリプトファン生合成に必要な酵素であるト
リブトファンンンター−M(EC4,2,1,20)のベータサフ゛ユニ。
トチアル。trpB ::Tnl Oトランスポゾンにつ0ての遺伝的供給源は
、チャクラパーティ、ニス・エル(Chakrabarti、 S、 L、)お
よびエル・ゴリニ(L、Gorini) [ブロン−ディンゲス◆オブ―ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ(Proc、Natl、Acad、Sc
i、)2084−2087(1972)Eによって開示されたイー・コ1ノ菌株
EC−〇であった。P1ファージ形質導入にお(Aて使用される方法(よ、ジエ
イ・ミラー(J 、Miller)、[「分子遺伝学(こお1する実験」(E
xperiments in 〜Iolecular Genetics”)、
コール ド 1 スフ″1ノ ング・ハーバ−・ラボラトリ−(Cold S
pring Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・
ハーバ−、ニューヨーク(1972)]ニヨって開示されており、以下により詳
細に記載する。
イー・コリ菌株DU 99bをトリプトファン栄養要求株に形質導入するのに使
用したイー・コリ菌株EC−0(trpB::Tnl O)を、0.1%グルコ
ースおよび15μg/zQテトラサイクリンを補足したLB中で飽和まで培養し
た。この培養物100μQ容量を取り出し、5 mM CaC(bを補足したL
B培地10mgに加えた。これにP1ファージ1μQを添加し、EC−0/PL
混合物を、細胞溶解が明らかになるまで200RPMで振盪しつつ、37°Cて
インキュベートした。クロロホルム100μQ容量を添加し、該混合物を37℃
でさらに10分間保持した。10. OOOxcav*での遠沈によって細胞デ
ブリスを除去し、上清を回収し、再度、クロロホルム100μgを補足し、P1
ファージストックとして4℃で貯蔵した。
標準技術を用いて、イー・フリ菌株DU99bの形質導入を行った。略言すると
、01%グルコースを補足したLB培地中でDU99b細胞を飽和まで培養した
。これから飽和培養1屑ρを取り出し、4℃で10分間、8000 XG、v、
て該細胞をペレット化した。細胞ベレットを10 xM MgS O、,5iM
CaCQto、5次Q中に再懸濁した。この懸濁液にEC−〇 Piファージ
ストック250μ夕を添加し、得られた混合物を150RPMで30分間ゆっく
りと振盪しつつ30℃でインキュベートした。このインキュベートに次いて、1
Mクエン酸ナトリウム0.5mQを添加し、前記のとおり細胞をペレット化した
。得られた細胞ベレットを1Mクエン酸ナトリウム0゜5+++Qおよび0.1
%グルコースを補足したLB培地1峠に再懸濁した。この混合物を37℃で1時
間インキ二ヘートしてテトラサイクリン耐性を発生させ、該細胞をテトラサイク
リン15μ9/ xQ、を補足したABII/寒天プレート上で平板培養した。
コロニーをつくる細胞集団から、15を選択し、15μ9/ y(!テトラサイ
クリンを補足したABII/寒天上で精製した。精製した細胞を、15μ汁うQ
テトラサイクリンを補足した〜19最小塩寒天プレート上に線条接種してトリプ
トファン栄養要求株の存在を証明した。
遺伝型的にtrpB::Tnl Oおよび表現型的にトリプトファン栄養要求株
であると確立したDU 99b細胞を、pI GF70/Trp2発現ヘクター
て形質転換した。誘発後の5DS−PAGEに次ぐウェスタン分析により、DU
99b)リブトファン栄養要求株がDU99b対照細胞のものを凌ぎ、かつRA
L−4突然変異体のものと同一のレベルで免疫反応性IGF−1を発現できるこ
とが確認された。
かくして、trpB遺伝子内てP1ファージ形質導入によって創製されたトリプ
トファン栄養要求株はRAL、−4発現表現型を創製することができる。さらに
また、トリプトファンオペロンの構造遺伝子のいずれかの不活性化によってトリ
プトファン栄養要求株の造成がRAL−4発現表現型を造成するのに充分である
ということが明らかであろう。
チで−)A、plGF 105の構築
(a)AvaIIおよびBamHlてIGF−1cDNAを消化してprolG
(b)prolGF−1を工作してCIa IおよびA va 11制限部位お
よびMetコドンを含ませる。
(c)断片AをpS K 4に連結してpl G F 10 i5/ PLrp
を得る。
p工GF105/Ptrp
チャートB、plGF 70/Ptrpの構築(a )pl G F 105/
PtrpをEcoRIおよび8g冊で消化し、工作してBamHlおよびHi
nd[I[を含ませてp[GF70を得る。
(b)piGF70をpSK4に連結してpl GF 70/Ptrpを得る。
plGF70/Ptrp
チーートCpBGRF 1の構築
(aXLeu”)bGRFを工作してフラン牛ングメチオニンフドン、BgIl
lおよびBamHI部泣、開始=トン、5°C1aIE位および3′Hindl
I[部位を含ませる。
(b)pTrpをC1alおよびHindllTて消化し、断片BをC1al
−H1ndIiI連結する。
要 約 書
本発明は、トリプトファン栄養要求株であって、蛋白およびペプチドの増強され
た発現を示すイー・コリ(E、coli)の新規菌株RAL−4を提供する。さ
らに、本発明は、RAL−4の使用または発現されるべき異種蛋白に存在しない
アミノ酸に関する宿主細胞栄養要求株の創製のいずれかによる蛋白およびペプチ
ドの増強された発現を達成するための方法を提供する。本発明の具体例において
、■GF−1およびGRFは野生型対照で見られるレベルを超えるレベルで発現
される。
Claims (18)
- 1.受託番号NRRLB−18562を有するRAL−4と称されるイー・コリ (E.coli)の菌株。
- 2.さらに、異種蛋白をコードするヌクレオチド塩基からなる請求項1記載のイ ー・コリ。
- 3.異種蛋白が分子量約15キロダルトン以下である請求項2記載のイー・コリ 。
- 4.異種蛋白がIGF−Iである請求項3記載のイー・コリ。
- 5.異種蛋白がブタIGF−Iである請求項3記載のイー・コリ。
- 6.異種蛋白がGRFである請求項3記載のイー・コリ。
- 7.異種蛋白がLeu27bGRFである請求項3記載のイー・コリ。
- 8.(a)適当な異種蛋白をコードするベクターでイー・コリ栄養要求株を形質 転換し; (b)適当な条件下で該形質転換体を増殖し;(c)蛋白の発現を誘導し; (d)発現された蛋白を精製する ことからなる異種蛋白の製造方法。
- 9.栄養要求株がRAL−4である請求項8記載の方法。
- 10.生産された蛋白がIGF−Iである請求項9記載の方法。
- 11.生産された蛋白がブタIGF−Iである請求項9記載の方法。
- 12.生産された蛋白がGRFである請求項9記載の方法。
- 13.生産された蛋白がしeu27bGRFである請求項9記載の方法。
- 14.栄養要求株がP1ファージ形質導入によって創製される請求項8記載の方 法。
- 15.生産された蛋白がIGF−Iである請求項14記載の方法。
- 16.生産された蛋白がブタIGF−Iである請求項14記載の方法。
- 17.生産された蛋白がGRFである請求項14記載の方法。
- 18.生産された蛋白がLeu27bGRFである請求項14記載の方法。
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