KR950014493B1 - 제조합 단백질의 개선된 활성화 방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

제조합 단백질의 개선된 활성화 방법
제1도는 표 2의 서열 0(곡선 1), 3번 서열(곡선 2), 5번 서열(곡선 3) 및 8번 서열(곡선 4)에 해당하는 서열을 함유한 구조에 대해 농도(아르기닌 농도 0.2mol/ℓ)에 따른 복원수율의 변화를 표시한 것이다.
제2도는 표 2의 서열 0(곡선 1), 3번 서열(곡선 2), 5번 서열(곡선 3) 및 8빈 서열(곡선 4)에 해당하는 서열을 함유한 구조에 대해 농도(아르기닌 농도 0.8mo1/ℓ)에 따른 복원수율의 변화를 표시한 것이다.
제3도는 아르기닌 농도에 따른 복원수율의 변화를 표시한 것이다 (곡선 번호에 대한 설명은 제1도 및 제 2 도와 유사함).
제4도는 인큐베이션 시간에 대한 복원수율을 표시한 것이다. (아르기닌 농도는 0.2mol/ℓ, 곡선 번호에 대한 설명은 제1도 및 제2도와 유사함).
본 발명은 제조합 단백질의 활성화 방법, 특히 원핵생물의 재소합 단백질을 화성화하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질이 원핵생물내에서 발현될 때 이 단백질은 적어도 부분적으로 불활성이고 잘 녹지 않는 응집체(굴절체, 봉입체 IB)형태로 숙주 세프내에 생성되며 이것은 또한 숙주세포의 단백질로 오염될 수 있다. 이러한 단백질을 치료용 또는 진단용으로 사용하기 전에, 이들을 활성 형태로 전환시켜야 한다.
재조합 단백질의 복원방법은 일반적으로 공지되어 있는데 예를들어 EP-A 0 114 506호, WO 86/00610호, WO 84/03711호, US 4,530,787호 및 EP-A 0 241 022호에 기재되어 있다. 이들 공지 방법을 사용해 천연 단백질 서열을 활성화할 때 수율이 낮다. 그러므로 본 발명의 제1목적은 재조합 단백질의 복원 수율을 증가시키는 것이다. 원칙적으로 복원 조건을 선택하여 수율을 증가시키는 방법을 제공함으로써 상기 목적을 이룰 수 있다. 그러나, 이것이 본 발명이 다루려는 문제가 아니다.
본 발명의 목적을 성취하는데 있어서는 부가적인 헬퍼(helper) 서열을 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 부가할 때 단백질의 복원수율이 증가한다는 것에 기초하고 있다.
그러므로 본 발명은 적어도 부분적으로 불활성인 형대로 존재하는 재조합 단백질, 특히 원핵생물의 재조합 단백질을 활성화시키는 방법을 제공하는데 이 방법은 단백질을 공지의 가용화법 및/또는 복원방법으로 활성화시키는데 있어 이 단백질이 N-말단 및/또는 C-말단에 2-50개의 아미노산으로 된 부가적인 헬퍼 서열을 가지므로 개개의 아미노산에 대해 표 1에 자세히 기록되어 있는 상대적인 소수도 (hydrophobicity)의 총합으로 계산된 이들 헬퍼 서열의 상대적인 소수도가 음의 수치인 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에서 사용한 "상대적인 소수도"라는 맡은 인용문인 T. E Creighton(1983), Proteins, Structure and Molecular Principles, W. H. Freeman and Company, New York, p. 142, Table 4.4 ; G. von Heijne and C. Blomberg(1979) Eur. J. Biochem. 95, 175-181 및 Y. Nozaki and C. Tanford(l971), J. Biol. Chem. 246, 2211-2217로부터 유래한 것이다. 예를들어 Nozaki/Tanford에 따라 비극성 용매(예를들어 에탄올/디옥산)와 물간의 아미노산의 분배 평형을 측정함으로써 아미노산의 상대적인 소수도값을 측정한다. 이러한 상대적인 소수도는 에너지 양이므로 kca1/mo1로 표시된다. 상대적인 소수도가 양의 값이라는 것은 비극성 용매에 대해 친화성이 있다는 것으로서 즉, 그것이 비극성 아미노산임을 의미한다. 비고하여 상대적인 소수도가 0보다 작은 수치라면, 이것은 비극성 용매와 비교해 볼 때 물에 대한 친화성을 갖는 극성 아미노산이다. 결국 이러한 아미노산이 예를들어 에탄올로부터 물로 이동할 때 에너지가 방출된다.
개개의 아미노산에 대한 상대적인 소수도 값을 다음 표 1에 기록하였다.
[표 1]
시스테인, 프로라인, 특히 글루타메이트, 아스파테이트, 아르기닌 및 라이신의 상대적 소수도가 매우 큰 음의 수치임을 상기 표에서 알 수 있다.
2-50개의 아미노산으로 된 헬괴 서열의 총 상대적인 소수도가 음의 값이라면 이들 헬퍼 서열을 단백질 서열에 부가함으로써 재조합 단백질의 활성화 방법이 상당히 개선되었음을 발견하였다. 이들 헬퍼 서열의 길이는 바람직하게 2-20개의 아미노산이다.
또한 아미노산들의 상대적인 소수의 총합인 이들 헬퍼 서열의 상대적 소수도는 -2. 0kcal/mol 이하, 특히 바람직하게 -2.5kca1/mo1 이하, 가장 바람직하게는 -2. 8kca1/mol 이하이다.
분자 생물학 분야의 일반적인 방법을 사용해 헬퍼 서열을 재조합 단백질에 부가할 수 있다. 이것은 바람직하게 발현될 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 하나 또는 두개의 말단에 올리고누클레오타이드를 부가함으로써 행해지는데 이 올리고누클레오타이드는 상대적인 소수도가 음의 값인 상기 단백질 헬퍼 서열중의 하나를 암호화한다. 이런 목적을 위해 예를들어 당해 유전자의 말단부 또는 개시부를 암호하는 영역을 함유한 DNA 단편을 발현될 유전자로부터 분리한다. 다음에 상기 헬퍼 서열을 암호화하는 영역을 함유한 합성 올리고누클레오타이드를 예르들어 기타 제한 분해 부위를 사용해 상기 DNA 단편내에 삽입시킨다. 또한 상기 유전자의 천연 DNA 단편을 올리고누클레오타이드 서열로 완전히 대체시킬 수 있다. 이렇게 하여 재조합 단백질에 대한 정보이외에 부가한 헬퍼 서열에 대한 정보를 함유한 변형된 DNA 서열을 얻을 수 있다.
헬퍼 서열의 N-말단을 암호화하는 DNA 서열로서, 발현 미생물에 적당하게 사용되는 코돈(codon)을 갖고 있는 DNA 서열을 사용하는 것이 유리하다.
상기 경우 E. coli가 발현 미생물일 때, 다음과 같은 코돈이 다음 아미노산에 대해 바람직하다.
트레오닌 ACA
프롤라인 CCA
루신 CTA
라이신 AAA
알라닌 GCC
글루타민산 GAA
헬퍼 서열을 부가시킨 재조합 단백질을 암호화하는 상기와 같이 변형된 DNA를 전형에 의해 숙주세포, 바람직하게 원핵세포, 특히 바람직하게 E. coli 내로 도입시킨다. 연속해서 전형된 세포를 적당한 배지에서 배양하며, 이 세포를 용균시키고, 적어도 부분적으로 불활성인 상태, 특허 봉입체 형태로 존재하는 재조합 단백질을 분리한다. 다음에 이 단백질을 이것이 원래의 배열 상태로 될 수 있는 pH에서 가용화 및 복원시킨다.
이러한 방법의 단계들을 상기된 방법들과 같이 이미 공지되어 있는 방법으로 행할 수 있다. EP-A 0241 022호에 기재된 방법과 같은 펄스 복원법(pulse renaturatio)을 사용해 단백질을 바람직하계 활성화시킬 수 있다.
본 발명으로써 공지의 방법들을 개선시키는 것을 특히 재조합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 헬퍼 서열을 부가하는 것에 기초하고 있다. 상기 과정에서 헬퍼 서열을 활성화될 단백질의 N-말단에 부가한다. 그러나, 헬퍼 서열을 C-말단에 결합시키므로써 또한 긍정적인 결과를 얻을 수 있다.
바람직한 헬퍼 서열은 글루타메이트, 아스파테이트, 라이신, 아르기닌 및 프롤라인으로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소한 2개의 아미노산을 함유하는 것이며 라이신 및 글루타메이트 잔기가 특히 바람직하고 글루타메이트 잔기가 가장 바람직하다. 또한 상기 헬퍼 서열이 상기 언급된 아미노산(즉, 글루타메이트, 아스파테이트, 라이신 및 아르기닌)중 동일한 전하를 갖는 연속하는 두개의 아이노산, 바람직하게 연속하는 두개의 라이신 또는 글루타메이트 잔기, 특히 바람직하게 연속하는 두개의 글루타메이트 잔기를 함유하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 방법으로 생성된 재조합 단백질을 나중에 치료용으로 사용한다면, 이것이 헬퍼 서열과 원하는 단백질사이의 접합부에 분해 부위를 갖는 것이 유리하다. 이것으로써 천연 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻을 수 있다. 상기 분해 부위는 프로테아제 또는 단백질에 대한 화학적 분해 시약(예를들어 BrCN)에 의해 인지되는 서열인데 프로테아제 분해 부위가 바람직하다. 상기 분해 부위가 WO 91/11520호에 기재되어 있는 바와같이 IgA 프로테아제 분해 부위인 것이 특히 바람직하다. 또한 정확한 분해 조건이 WO 91/11520호에 구체적으로 기재되어 있다. 팩터(factor)Xa에 대한 분해 부이가 또한 바람직하다.
분석하는데 있어 재조합 단백질을 사용할 경우 단백질 서열내 이러한 분해 부위는 필요하지 않다. 단백질 활성화를 증진시키는데 적당한 헬퍼 서열의 구체적인 예로는 단백질의 N-말단에 부가된 다음과 같은 서열들이 있다.
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연속하는 두개의 글루타메이트 잔기를 갖고 있는 5번, 6번, 7번 및 9번의 헬퍼 서열을 사용함으로써 복원수율이 최고로 되므로 이러한 서열이 가장 바람직하다.
본 발명의 방법은 플라스미노겐 활성화제, 인터페론, 인터루킨 및 과립구 콜로니 자극 인자와 같은 사람의 재조합 단백질 및 원핵생물내에서 생성된 이들의 유도체를 활성화시키는데 특히 적당하다. 활성화될 단백질이 ACACCA인 초기 DNA 서열을 갖는 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)인 것이 특히 바람직하다. EP-A 0 456 200호에 기제된 G-CSF의 유도체가 또한 바람직하다.
벡터 pkk 177-3-G-CSF Bg는 독일, 데-3400 과팅엔, 그리세바크 스트라쎄 8에 소재하는 독일의 미생물 기탁기관(DSM)에 DSM 5867이라는 기탁번호로 기탁되었다. 다음 실시예는 본 발명을 더 설명한다.
[실시예 1]
(백터의 구성)
백터 pkk 177-3 G-CSF Bg (DSM 5867)를 EcoRI(부분적으로) 및 ApaI으로 분해시키고 올리고누클레오타이드를
선형으로 만들어진 백터 단면 (약 3450bp)에 삽입시켰다.
AATTCGGAAAAATTA 서열번호 11
ACACCACTGGGCC 서열번호 12
상기 틈에 사용된 각가의 DNA 서열은 표 2에 기록된 아미노산에 대한 유전암호에 따르는데, 즉 Met-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro (2번 서열)에 대한 유전암호를 갖는 올리고누클레오타이드를 예를들어 구조(2)에 사용하였다. 상기 올리고누클레오타이드를 분해된 백터내로 리게이팅(ligating)시켜 얻은 플라지미드 E. coli HBl01내로 전형시컸다. tac 프로모터(promoter)를 더 양호하게 조절하기 위해, 부가적으로 상기 미생물을 1aCIq유전자를 함유한, pBP010(제조법은 유럽 특허 출원 제91 111 155.7호를 참조)과 화합하는 (compatible) 들라즈미드로 전형시켰다. 1acIq유전자는 오랜 동안 당업자에계 공지되어 있는 것으로서 용이하게 입수할 수 있다. pBP010과 화합하는 적당한 플라지미드의 예로는 예를들어 1acIq유전자를 삽입시킨 pACYC 177(DSM 3693P) 또는 이것으로부터 유도된 플라즈미드가 있다(예를들어 Gene 85(1989), 109-114 및 EP-A 0 373 365호 참조). 결과의 클론(c1ones)을 카나마이신(50μg/ml)/암피실린(50μg/ml) 상에서 선택하고 제한(restrictlon) 분석으로 동정(identifying)하였다. EcoRI 및 EcoRV로 분해시켰을 때 길이가 약 3.15kb, 약 0.3kb(각각의 구조와 함께), 및 4.85kb인 단편을 얻었다.
[실시예 2]
a) 발효
실시예 1에 따라 양성(positive)이라고 동정된 클론을 카나카이신과 암피실린(농도에 대해서는 실시예 1을 참조)을 함유한 LB 배지내 5ml 배양물에서 OD550이 0.5가 될 때까지 배양하고 5mmo1/1IPTG로 유도시키며 37℃에서 3시간 동안 인큐베이팅시켰다. OD가 10인 유도된 배양물을 수집하여 이것으로부터 전체 세포 추출물을 제조했다. 이러한 전체 세포 추출물을 SDS 페이지 젤상에서 분석하였다.
이것으로써 원하는 단백질이 발현된다는 것이 명백할 때, 배양하는 것일 1ℓ 규모로 반복하고 세포를 수집하며 IB를 제조한다.
b) IB제조
상기 세로를 원심분리로 수집하여 100ml의 Tris 마그네슘 완충액(10mmol/l Tris(pH 8.0), 1mmol/lMgCl2)에 용해시키며 러소자임(0.3mg/ml)으로 용군시켰다.
이것을 37℃에서 15분간 인큐베이팅하고 French프레스 (1200psi)에 1번 통과시켰다.
연속해서 DNAse(2mg DNAse I)를 사용해 27℃에서 30분간 분해시켰다.
20ml의 0.5mo1/l NaCl, 20mmol/l EDTA(pH 8.0) 및 3m1의 20% Triton×l00을 부가하고 상온에서 10분간 인큐베이팅하였다.
현탁액을 4℃ 및 15000rpm에서 l0분간 원심분리시켰다. 얻은 펠릿(pellets)을 30ml의 50mmol/l Tris(pH8), 50mmol/l EDTA 및 0.5% Triton×100에 용해시켜 초음파처리했다. 이것을 다시 원심분리하고 재현탁시키며 초음파처리하였다. 이런 과정을 2번 반복했다. 연속해서 이것을 원심분리하고 얻은 펠릿을 IBs로서 실시예 3에 사용했다.
[실시예 3]
(가용화/복원 방법)
a) 가용화
1g의 봉입체를 30ml의 가용화 완충액에 부가하고 초음파로 5분간 균질화하며 상온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. pH가 3.0이 될 때까지 HCl을 부가했다. 다음에 불용성 물질을 원심분리로 제거했다.
DTE가 완전히 제거될 때까지(≤1mmol/l DTE), 이것을 투석용 완충액 1에 대해 투석시켰다.
b) 펄스 재활성화
EP-A 0 241 022호에 기재된 바와같이 펄스 재활성화를 행하였다. EP-A 0 241 022호에 기재된 제5도의 장치를 사용했다.
이것을 위해 단백질을 30분 간격으로 반응 용량(100ml의 복원용 완충액)에 부가하여 반응 용량내 단백질농도를 펄스 당 50μg/ml씩 증가시컸다. 이것을 대략 20회 펄싱시켰다(최종 농도는 반응 용량 1ml당 약 1mg).
펄스 재활성화 후에 원심분리로 혼탁물을 상기 반응물로부터 제거하고 총 반응물을 아르기닌이 제거될 때까지(≤50mmol/l) 투석용 완충액 2에 대해 투석시켰다(이것을 전도도 측정으로써 검사하는 것이 편리하다. 투석용 완충액과 반응물의 전도도가 동일할 때 투석하는 것을 끝낼 수 있다). 활성 테스트로 측정했던 각각의 구조에 대한 재활성화 수율을 표 2에 기록하였다.
[표 2]
1은 본 발명에 따른 실시예가 아님.
2는 실시예 3에 따른 G-CSF 활성 테스트로 측정됨.
(1)-(10)은 N말단에 메티오닌 잔기 없이 G-CSF 서열에 결합된 1번-10번 서열임.
[실시예 4]
(G-CSF 활성의 측정)
G-CSF에 완전히 의존하는 쥐의 백혈병 라인 NFS60을 사용하여 Biochem. J 253(1988) 213-218, Exp. Hematol. 17(1989) 116-119, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(1086) 5010에 기술된 바와같이 G-CSF의 활성을 테스트하였다. 배양배지(10%송치 혈청을 함유한 RPMI배지, Boehringer Mannheim GmbH, Order No. 2099445)는 상기 세포의 상기 팩터 의존성을 유지시키기 위해 1000μ/mlG-CSF를 영구적으로 함유한다.
상기 테스트는3H-티미딘을 함침시키므로써 G-CSF에 의해 자극된 NFS60 세포의 증식을 직접 측정하는 것이다. 이러한 테스트를 다음과 같은 방법으로 행한다.
지수적 증식기에 있는 NSF60 세포(세포 밀도는 1ml당 많아야 1×105개의 세포임)를 미량적정 플래이트에 옮기고 (웰(well)당 1×104개의 세포), G-CSF 농도를 감소시키면서 배양하였다. 웰 하나당 G-CSF의 최대량은 상기 배양물의 농도(1000μ/ml, 특이 활성은 단백질 1mg당 1×108U)에 상응하였다. 희석시키는 것을 10의 배수로 행하였다.
약 24시간 인큐베이팅한 후에,3H-티미딘(0.1μCi/웰)을 부가했다. 다음에 이 세포를 16시간 동안 더 인큐베이팅하였다.
상기 테스트를 평가하기 위해 세포를 미량적정 플래이트내에서 동결시키므로써 용균시켰다. 이러한 세포 용해물을 유리섬유 필터상에 흡입시키고 헹구어 건조시켜 신틸레이션 카운터(scintillation counter)로 측정하였다.3H-티미딘을 G-CSF에 의해 유도된 NFS60 세포의 증식에 비례하여 함침시켰다.
[실시예 5]
단일 부가후 변성된 단백질의 농도에 따른 복원수율의 변화 측정
출발물질 : 표 2의 0, 3, 5 및 8번 구조를 갖는 봉입체
가용화 및 제1투석 : IB 불질을 실시예 3에 따라 가용화시키고 투석시겨 환원제를 제거한 다음 단백질 농도를 30mg/ml로 조절하였다(M. M. Bradford, Anal Biochem. 72(1976)255)
복원 : pH 8.0인 20℃의 0.5mmol/l GSSG, 0.5mmol/l GSH, 10mmol/l EDTA, 및 0. 8mol/ l 또는 0.2mol/l 아르기닌 하이드로클로라이드에서 재활성화를 행하였다.
각각의 복원 제제내 단백질 농도를 0.3-3mg/ml이 되게 조절하였다. 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 모든 제제에서 0.55mol/l였다.
상온에서 3시간 동안 인큐베이팅한 후에 산성화(pH 4.5)로 반응을 정지시겼다.
변성 단백질 내 복원 단백질의 비율을 HPLC로 측정하였다.
유동성 완충액 A : 0.12%(v/v) 트리플루오로아세트산
유동성 완충액 B : 90%(v/v) 아세트니트릴, 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산
B의 변화도 30분내에 40-70%
유량 1ml/분, 280mm에서 검출.
결과를 제1도 및 제2도에 표시하였다.
[실시예 6]
(아르기닌 농도에 따른 복원 수율의 변화)
실시예 5와 유사하게 제조하여 표 2의 0, 3, 5 및 8번 구조를 갖는 투석시킨 가용화물(단백질 농도는 10mg/ml)을 출발 물질로서 사용했다.
복원용 완충액(pH 8이고 상온인 0-8mol/l 아르기닌 하이드로클로라이드, 100mmol/l Tris, 10mmol/l EDTA, 0.5mmol/l GSH, 0.5mmol/l GSSG)내 단백질 농도를 변성 단백질의 단일 부가로 1mg/ml가 되도록 조절하였다.
3시간 동안 인큐베이팅한 후에 산성화(pH 4.5)로 반응을 정지시컸다. 다음에 실시예 5와 유사하게 HPLC로 측정하였다. 결과를 제3도에 표시하였다.
[실시예 7]
0.2mol/l 아르기닌 완충액내에서의 전활성화 동역학
출발물질 : 실시예 6의 가용화물을 사용했다.
pH가 8이고 상온인 0.2mol/l 아르기닌 하이드로글로라이드 100mmol/l Tris, 10mmol/l EDTA, 0.5mmol/l GSH, 0.5mmol/l GSSG에서 재활성화를 행하였다. 반응 제제내 단백질 농도를 단일 부가로 1mg/ml가 되게 조절하고 구아니딘 농도를 0. 55mol/l로 조절하였다. 샘플을 5, 10, 15, 60 및 180분에 취하였는데 각각의 경우에 산성화(pH 4.5)로 반응을 정지시킨 다음 재활성화 동역학(kinetics)을 HPLC로 측정했다.(실시예 5를 참조)
인큐베이션 시간에 따른 재활성화 수율의 변화를 제4도에 표시하였다.
서열에 대단 목록
(iii) 서열번호 : 12
(2) 1번 서열에 관한 정보 :
(2) 2번 서열에 관한 정보 :
(2) 3번 서열에 관한 정보 :
(2) 4번 서열에 관한 정보 :
(2) 5번 서열에 관한 정보 :
(2) 6번 서duf에 관한 정보 :
(2) 7번 서열에 관한 정보 :
(2) 8번 서열에 관한 정보 :
(2) 9번 서열에 관한 정보 :
(2) 10번 서열에 관한 정보 :
(2) 11번 서열에 관한 정보 :
(xi 11번서열
AATTCGGAGG AAAAATTA
(2) 12번 서열에 관한 정보 :
(i) 12번 서열

Claims (15)

  1. 적어도 부분적으로 불활성인 형태로 존재하는 재조합 단백질의 활성화 방법으로서, N-말단 또는 C-말단 또는 N-말단 및 C-말단에 2-50개의 아마노산으로 된 부가적인 헬퍼 서열을 가지고 있는데 개개의 아미노산에 대해 표1에 기록되어 있는 개개의 상대적 소수도(relative hydrophobicity)의 총합으로 계산된 이들 헬퍼 서열의 상대적 소수도가 음의 값을 갖는 단백질을 공지의 가용화법 및 복원방법으로 활성화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헬퍼 서열의 다수의 아미노산에 대한 상대적인 소수도 비율이 -20kcal/mol 이하인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 헬퍼 서열의 다수의 아미노산에 대한 상대적인 소수도 비율이 -2.5kca1/mol 이하인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 서열을 활성화시킬 단백질의 N-말단에 부가하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 헬퍼 서열을 활성화시킬 단백질의 C-말단에 가하는 방법.
  6. 제1항에있어서, 상기헬퍼 서열이 글루타메이트, 아스파테이트, 라이신, 아르기닌 및 프롤라인으로 구성된 그룹에서 선택된 두개 이상의 아마노산을 함유하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 헬퍼 서열이 두개 이상의 글루타메이트 잔기를 함유하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 헬퍼 서열이 글루타메이트, 아스파테이트, 라이신 및 아르기닌으로 구성된 그룹에서 선택된, 동(同) 전하를 갖는 두개의 연속적인 아미노산을 함유하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 헬퍼 서열이 두개의 연속적인 글루타메이트 잔기를 함유하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 헬퍼 서열과 목적하는 단백질 사이의 접합부에 분해 부위를 갖는 단백질을 활성화 시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 분해 부위가 프로테아제에 의해 인지된 서열인 방법
  12. 제11항에 있어서, 분해 부위가 IgA 프로테아제 분해 부위인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 분해 부위가 팩터(factor) Xa 분해 부위인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 다음과 같은 서열중 하나를 갖는 N-말단 헬퍼 서열을 함유하고 있는 단백질을 활성화시키는 방법.
    Me t -G l u (1번 서열)
    M e t-T h r - P r o - L e u - P r o - A r g - P r o - P r o (2번서열)
    M e t -T h r - P r o - L e u - H i s - H i s - P r o -A r g - P r o - P r o (3번 서 열)
    M e t - T h r - P r o - L e u - L y s - L y s - P r o - A r g - P r o - P r o(4번서열)
    M e t - T h r - P r o - L e u - G l u - G l u - G l y - P r o -A r g - P r o - P r o (5번 서열)
    M e t - T h r - P r o - L e u - G l u - G l u - G l y - T h r - P r o - L e u - P r o - A r g - P r o- P r o (6번 서열)
    M e t - T h r - P r o - L e u - G l u - G l u - G l n - P r o - P r o (7번 서열)
    M e t - L y s - A l a - L y s - A r g - P h e - L y s - L y s - H i s - P r o - A r 9 - P r o - P r o (8번 서열)
    M e t - T h r - P r o - L e u - G l u - G l u - G l y - I l e - G l u - G l y - A r g (9번 서열)
    M e t - T h r - P r o - L e u - L y s - A l a - L y s - A r g - P h e - L y s - L y s - H i s - P r o - A r g - P r o - P r o (10번 서열)
  15. 제1항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 또는 이것의 유도체인 단백질을 활성화시키는방법.
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