HU214881B

HU214881B - Rekombináns proteinek javított aktiválási eljárása

Info

Publication number: HU214881B
Application number: HU9200548A
Authority: HU
Inventors: Dorothea Ambrosius; Carola Dony; Rainer Rudolph
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh.
Priority date: 1991-02-21
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 1998-07-28
Also published as: ES2093122T3; IL101024A; JP2528232B2; US5578710A; HU9200548D0; NZ241570A; KR920016464A; FI920742A; NO300329B1; CA2061569C; JPH05244977A; ATE144284T1; CA2061569A1; DE59207351D1; IE920276A1; CZ282744B6; IL101024A0; FI106029B; ZA921230B; HUT68021A

Abstract

A találmány tárgya eljárás őlyan rekőmbináns prőteinek aktiválására,amelyek legalább részben inaktív főrmában vannak, őly módőn, hőgy akívánt prőteint egy őlyan, az N- és/vagy C-terminális őz kapcsőlt,2–50 aminősav hősszúságú segédszekvenciával együtt fejezik ki, melynekaz egyes aminősavak relatív hidrőfőbicitásának összegeként számítőttrelatív hidrőfőbicitása negatív, majd a kifeje ett prőteint önmagábanismert szőlűbilizálási és/vagy renatűrálási technikákat alkalmazvaaktiválják. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás rekombináns proteinek aktiválására, különösen prokariotákból származó rekombináns proteinek aktiválására.

Rekombináns proteinek prokariotákban való kifejeződésekor a proteinek a gazdasejtben gyakran legalábbis részben inaktív, nehezen oldódó aggregátumokként (zárványtestekként; refractile bodies, inclusion bodies, IB) keletkeznek, amelyek ezenkívül még a gazdasejt proteinjeivel is szennyezve lehetnek. Mielőtt az ilyenfajta proteinek például terápiás vagy diagnosztikai célokra való felhasználásra kerülhetnének, át kell ezeket aktív formáikba alakítani.

Rekombináns proteinek renaturálására szolgáló eljárások általánosan ismertek, és például az EP-A 0114506 számú európai közrebocsátási iratban, a WO 86/00610, WO 84/03711 nemzetközi közzétételi számú PCT közzétételi iratban az US 4,530,787 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és az EP-A 0241022 számú európai közrebocsátási iratban közölnek ilyeneket. Ezekkel az ismert eljárásokkal azonban természetes proteinszekvenciák aktiválásakor gyakran alacsony kitermeléseket kapnak. A találmány célkitűzése annak a problémának a megoldása volt, hogy a rekombináns proteinek renaturálásánál az eddigieknél jobb kitermeléseket éljünk el. Erre egy elvi lehetőség egy olyan eljárás kidolgozása lenne, amelynek során a kitermelések a renaturálási körülmények megfelelő megválasztásával javulhatnának. Ez azonban nem találmányunk tárgya.

A találmányunk céljául kitűzött feladat megoldása azon a meglepő felismerésen alapszik, hogy egy protein renaturálási kitermelése nő, ha N- vagy/és C-terminálisához kiegészítő segédszekvenciákat kapcsolunk.

Találmányunk tárgya tehát rekombináns proteinek, különösen prokariotákból származó rekombináns proteinek - amelyek legalábbis részben inaktív formában vannak - aktiválására szolgáló olyan eljárás, amelyre az jellemző, hogy önmagukban ismert szolubilizálási és/vagy renaturálási technikákkal aktiválunk egy olyan proteint, amely N- vagy/és C-terminálisán 2-50 aminosav hosszúságú kiegészítő segédszekvenciákat tartalmaz, amely segédszekvenciáknak az egyes aminosavaknak az 1. táblázatban megadott relatív hidrofobicitásainak összegeként számított relatív hidrofobicitása negatív számérték.

A találmány értelmezése szerinti „relatív hidrofobicitás” fogalma a következő irodalmi közleményekből származik: T. E. Creighton, Proteins, Structure and Molecular Principles, W. H. Freeman and Company, New York, 1983, 142. old., 4.4 táblázat; G. von Heijne and C. Blomberg, Eur. J. Biochem., 95, 175-181 (1979); és Y. Nozaki and C. Tanford, J. Bioi. Chem., 246, 2211-2217 (1971). Egy aminosav relatív hidrofobicitási értékének meghatározása például Nozaki/Tanford szerint ezen aminosav egy nem poláros oldószer (például etanol/dioxán) és víz közötti megoszlási egyensúlyának mérésével történik. A relatív hidrofobicitás energiamennyiség, és ezért kcal/mol értékben adjuk meg. A relatív hidrofobicitás esetében egy pozitív érték azt jelenti, hogy a nem poláros oldószer javára áll fenn előny, azaz egy nem poláros aminosavról van szó. Amennyiben viszont a relatív hidrofobicitás egy olyan számérték, amely 0-nál kisebb, úgy poláros aminosavról van szó, amelynek esetében víz javára áll fenn előny egy nem poláros oldószerrel szemben. Ilyenfajta aminosavak esetében következésképpen például etanolból vízbe való átmenetkor energia szabadul fel.

A következő 1. táblázat tartalmazza az egyes aminosavak relatív hidrofobicitási értékeinek felsorolását:

7. táblázat

Aminosavak	Relatív hidrofobicitás (kcal/mol)
Gly	0
Leu	1,8
Ile	2,5
Val	L5
Alá	0,5
Phe	2,5
Cys	-2,8
Met	1,3
Thr	0,4
Ser	-0,3
Trp	3,4
Tyr	2,3
Gin	-0,3
Lys	-4,2
Asn	-0,2
Glu	-9,9
His	0,5
Asp	-7,4
Arg	-11,2
Pro	-3,3

A táblázatból kitűnik, hogy a cisztein, prolin és különösen a glutaminsav, aszparaginsav, arginin és lizin aminosavak erősen negatív relatív hidrofobicitással rendelkeznek.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy 2-50 aminosav hosszúságú segédszekvenciáknak egy proteinszekvenciához való kapcsolásával a rekombináns proteinek aktiválhatósága jelentősen javul, ha ezeknek a segédszekvenciáknak összességében negatív relatív hidrofobicitásuk van. Ezeknek a segédszekvenciáknak a hossza előnyösen 2-20, különösen előnyösen 5-20 aminosav. Előnyös továbbá, ha ezeknek a segédszekvenciáknak az esetében a relatív hidrofobicitásból és az aminosavak számából kapott hányados -2,0 kcal/mol vagy kevesebb, különösen előnyösen -2,5 kcal/mol vagy kevesebb és legelőnyösebben -2,8 kcal/mol vagy kevesebb.

A segédszekvenciáknak a rekombináns proteinhez való kapcsolása a molekuláris biológia területén szokásos technikák segítségével végezhető. Ez előnyösen úgy történik, hogy a kifejezendő rekombináns proteint kódoló DNS-szekvencia egyik vagy mindkét végéhez egy

HU 214 881 Β olyan oligonukleotid-szekvenciát kapcsolunk, amely egy előbbiekben leírt, negatív relatív hidrofobicitású protein-segédszekvenciát kódol. Ilyen célra például a kifejezendő génből olyan DNS-fragmentumokat izolálunk, amelyek egy olyan tartományt tartalmaznak, mely a megfelelő gén elejét, illetve végét kódolja. Ezekbe a DNS-fragmentumokba azután például más restrikciós hasítási helyek alkalmazásával betoldhatók olyan szintetikus oligonukleotidok, amelyek a segédszekvenciákat kódoló tartományokat tartalmazzák. Egy másik lehetőség az, hogy a génből származó természetes DNSfragmentumokat teljesen olígonukleotid-szekvenciákkal helyettesítjük. Ilyen módon olyan módosított DNSszekvenciák kaphatók, amelyek egy rekombináns protein információin kívül a kapcsolt segédszekvenciákra vonatkozó információt is tartalmazzák.

Az N-terminális segédszekvenciákat kódoló DNSszekvenciákként célszerűen olyan DNS-szekvenciákat alkalmaznak, amelyek kodonhasznosítása (codon usage) a kifejező organizmushoz van illesztve (E. L. Winnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, 1985, 224-241).

E. coli kifejező organizmus esetében a következő aminosavakra előnyösen az alább felsorolt kodonokat használják:

treonin	ACA
prolin	CCA
leucin	CTA
lizin	AAA
alanin	GCC
glutaminsav	GAA
Egy ily módon módosított DNS-t, amely egy segéd-

szekvenciákkal kapcsolt rekombinánst DNS-t kódol, transzformációval beviszünk egy gazdasejtbe, előnyösen egy prokariota sejtbe, különösen előnyösen egy E. coli sejtbe. Utána következik a transzformált sejtek valamilyen alkalmas táptalajban való tenyésztése, a sejtek feltárása és a legalább részben inaktív állapotban keletkezett rekombináns protin izolálása, amely főként zárványtestek formájában van jelen. Ezt követi ezen protein szolubilizálása és renaturálása, célszerűen olyan pHértéken, amelynél a protein natív konformációját fel tudja venni. Ezek az eljárási lépések már ismert technikák szerint végezhetők, ahogy az például a leírás bevezető részében tárgyalt technika állásából kiderül. A protein aktiválása előnyösen szakaszos adagolásos renaturálás (Pulsrenaturierung) segítségével történik, ahogy az például az EP-A 0241022 számú európai közrebocsátási iratból ismert. Az ismert eljárási technikáknak a találmány szerinti eljárás által elért javítása különösen a segédszekvenciák jelenlétén alapul, amelyek a rekombináns protein N- és/vagy C-terminális részéhez kapcsolódnak. A segédszekvenciák előnyösen az aktiválandó protein N-terminális részéhez kapcsolódnak. Segédszekvenciáknak a C-terminális részhez való kapcsolása is pozitív eredményeket hoz.

Segédszekvencákként különösen olyan szekvenciák előnyösek, amelyek legalább 2 aminosavat tartalmaznak a glutaminsav, aszparaginsav, lizin, arginin és prolin által alkotott csoportból, a lizin- és glutaminsav-maradék különösen előnyös, és a glutaminsav-maradék a legelőnyösebb. Továbbá különösen előnyös, ha a segédszekvenciák két közvetlenül egymás után következő azonos töltésű aminosavat tartalmaznak az előbb említett, töltéssel rendelkező aminosavak (azaz a glutaminsav, aszparaginsav, lizin és arginin) közül, előnyösen két közvetlenül egymást követő lizin- vagy glutaminsav-maradékot, különösen előnyösen két közvetlenül egymást követő glutaminsav-maradékot.

A találmány szerinti eljárással előállított rekombináns proteinek későbbi terápiás alkalmazásakor előnyös, ha a segédszekvencia és a kívánt protein közötti átmenetben egy hasítási helyet tartalmaznak. Ezáltal a protein természetes aminosav-szekvenciájának megfelelően nyerhető. Ez a hasítási hely lehet egy olyan szekvencia, amelyet egy proteáz vagy egy kémiai proteinhasító reagens (például bróm-cián) felismer; a proteáz hasítási hely az előnyös. Különösen előnyös, ha a hasítási hely IgA-proteáz hasítási hely, amilyet például a WO 91/11520 közzétételi számú PCT-közzétételi iratban írnak le. A pontos hasítási körülmények szintén a WO 91/11520 közzétételi számú PCT-bejelentésből vehetők. Előnyös továbbá egy olyan hasítási hely is, amely az Xa faktor egyik hasítási helye.

A proteinszekvenciában lévő ilyen hasítási hely a rekombináns proteinnek az analitikában való felhasználása esetén nem szükséges.

Konkrét példák olyan segédszekvenciákra, amelyek a protein-aktiválásra alkalmasak, a protein N-terminális részéhez kapcsolódó, alább felsorolt szekvenciák:

Met-Glu (1.számú szekvencia),

Met-Thr-Pro-Leu-Pto-Arg-Pro-Pro (2.sz. szekvencia), Met-Thr-Pro-Leu-His-His-Pro-Arg-Pro-Pro (3.sz. szekvencia), Met-Thr-Pro-Leu-Lys-Lys-Pro-Arg-Pro-Pro {4.sz. szekvencia), Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Pro-Pro (5.sz. szekvencia) ,

Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro (6.sz. szekvencia),

Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gln-Pro-Pro (7.sz. szekvencia), Met-Lys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-His-Pro-Arg-Pro-Pro (B.sz. szekvencia),

Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg (9.sz. szekvencia),

HU 214 881 Β

Met-Thr-Pro-Leu-Lys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys’-His-Pro-Arg-Pro-Pro {lO.sz. szekvencia).

A 2 egymás után következő glutaminsav-maradékot 5 tartalmazó 5., 6., 7. és 9. számú segédszekvenciák adják a legmagasabb renaturálási kitermeléseket, és ennélfogva ezek a legelőnyösebbek.

A találmány szerinti eljárás különösen prokariotákban előállított rekombináns humán proteinek és 10 ezek származékai, így például plazminogén aktivátorok, interferonok, interleukinok és granulocita telep stimuláló faktorok aktiválására megfelelő. Különösen előnyös, ha az aktiválandó protein egy granulocita telep stimuláló faktor (G-CSF), amelyet kódoló DNS-ben az ACACCA 15 kezdeti szekvencia megtalálható. Ugyanilyen előnyösek a G-CSF-nek az EP-A 0456200 számú európai közrebocsátási iratban közölt származékai is.

A pKK 177-3 G-CSF Bg vektor a Német Mikroorganizmusgyűjteménynél (Deutsche Sammlung 20 von Mikroorganismen; DSM; Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen) 1990. március 28-án lett letétbe helyezve DSM 5867 számon.

A találmányt a továbbiakban a következő példákkal és ábrákkal szemléltetjük. 25

Az 1. ábra a renaturálási kitermelés koncentrációfüggőségét (argininkoncentráció 0,2 mol/1) mutatja olyan szerkezetek esetében, amelyek a 2. táblázatban megadott 0 szekvenciát (1 jelzési görbe), a szekvencialistában szereplő 3. számú szekvenciát (2 jelzésű görbe), a szekvencialistában szereplő 5. számú szekvenciát (3 jelzésű görbe) és a szekvencialistában szereplő 8.

számú szekvenciát (4 jelzésű görbe) tartalmazzák.

A 2. ábra a renaturálási kitermelés koncentrációfíiggőségét (argininkoncentráció 0,8 mol/1) mutatja olyan szerkezetek esetében, amelyek a 2. táblázatban megadott 0 szekvenciát (1 jelzésű görbe), a szekvencialistában szereplő 3. számú szekvenciát (2 jelzésű görbe), a szekvencialistában szereplő 5. számú szekvenciát (3 jelzésű görbe) és a szekvencialistában szereplő 8. számú szekvenciát (4 jelzésű görbe) tartalmazzák.

A 3. ábra a renaturálási kitermelésnek az argininkoncentrációtól való függőségét mutatja. (A görbék jelzései az 1. és 2. ábráknál megadottakhoz hasonlók.)

A 4. ábra a reaktiválási kitermelést mutatja az inkubációs idő függvényében (argininkoncentráció 0,2 moL/1, a görbék jelzése az 1. és 2. ábrákéhoz hasonló).

1. példa

A vektorok szerkesztése

A PKK177-3 G-CSF Bg (DSM 5867) vektort EcoRI-gyel (parciálisán) és Apai-gyei emésztjük, és az

EcoRI

AATTCGGAGGAAAAATTA I ATG.................

Apai

ACACCACTGGGCC

Met ................. G-CSF-szekvencia ATG nélkül oligonukleotidot a keletkező linearizált vektorfragmentumba (körülbelül 3450 bp) inszertáljuk.

All. számú szekvencia: AATTCGGAGGAAAAATTA 18

A 12. számú szekvencia:

ACACCACTGGGCC 13

A hézagba betoldott mindenkori DNS-szekvencia a

2. táblázatban megnevezett aminosavak genetikai kódjának felel meg, azaz például a 2 szerkezet esetében a Met-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro peptidszekvencia (2. számú szekvencia) genetikai kódjának megfelelő oligunkleotidot toldunk be. Az oligonukleotidoknak a hasított vektorba való ligálásával kapott plazmidokat E. coli HBlOl-be transzformáljuk. A tac-promoter jobb szabályzóképességének elérése céljából a sejteket még egy pBP010-zel (előállítását lásd a 91111155.7 számú európai közrebocsátási iratot) kompatibilis plazmiddal transzformáljuk, amely a lacFi gént tartalmazza. A lacfi gén a szakemberek által már hosszú ideje jól ismert és könnyen hozzáférhető. A pBP010-zel kompatibilis plazmidokként például a pACYC 177 (DSM 3693P), amelybe a lacl'i gén inszertálva van, vagy abból levezethető plazmidok [lásd például Gene, 85,109-114 (1989) és az EP-A 0 373 365 számú európai közrebocsátási iratot], A kapott kiónokat kanamicinre (50 pg/ml) és ampicillinre (50 pg/ml) szelektáljuk, és restrikciós ana35 lízissel azonosítjuk. EcoRI-gyel és EcoRV-tel végzett hasításkor körülbelül 3,15 kb, körülbelül 0,3 kb (a mindenkori megfelelő szerkezettel) és 4,85 kb hosszúságú fragmentumok keletkeznek.

2. példa

a) Fermentáció:

Az 1. példa szerint pozitívként azonosított kiónokat kanamicint és ampicillint (a koncentrációkat lásd az 1. példánál) tartalmazó LB-táptalajbán készített 5 ml-nyi tenyészetben 0,5 OD₅₅₀-ig tenyésztjük, és 5 mmol/1 IPTG-vel indukáljuk, majd 3 órát 37 °C-on inkubáljuk. Ebből az indukált tenyészetből 10 OD-t összegyűjtünk, és ebből össz-sejtkivonatot készítünk. Az össz-sejtkivonatot egy SDS-PAGE gélen analizáljuk.

Amennyiben ebből látható, hogy a kívánt protein kifejeződik, akkor a tenyésztést 1 literes méretben megismételjük, a sejteket learatjuk, és zárványtest (IB) preparálást végzünk.

b) Zárványtest (IB = inclusion body) preparálás:

A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 100 ml trisz-magnézium-pufferben (10 mmol/1 trisz, pH=8,0, 1 mmol/1 magnézium-klorid) szuszpendáljuk, és lizozimmal (0,3 mg/ml) feltárjuk.

percig 37 °C-on inkubálunk, és egy

French-Press-en 8,83 kPa (1200 psi) nyomással átnyo4

HU 214 881 Β matjuk. Ezt követi egy DNázos (dezoxiribonukleázos) emésztés (2 mg DNáz I) 30 percig 37 °C-on.

Utána 20 ml 0,5 mol/1 nátrium-kloridot és 20 mmol/1 EDTA-t tartalmazó 8,0 pH-jú oldatot és 3 ml 20%-os Triton* 100-at adunk hozzá, és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.

A szuszpenziót 10 percig 15 000 ford/percnél centrifugáljuk 4 °C-on. Az üledéket 30 ml 50 mmol/1 8,0 pH-jú triszt, 50 mmol/1 EDTA-t és 0,5% Triton* 100-at tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, és ultrahanggal kezeljük. Utána ismét centrifugálunk, reszuszpendálunk, és ultrahangos kezelést végzünk. Ezt a műveletsort még kétszer ismételjük. Végül centrifugálunk, és az így kapott üledéket használjuk a 3. példában zárványtestként.

3. példa

Szolubilizálás/renaturálás a) Szolubilizálás:

Szolubilizáló puffer:

mol/1 guanidin-hidroklorid 0,1 mol/1 8,0 pH-jú trisz-puffer 1 mmol/1 EDTA 100 mmol/1 DTE (ditioeritritol)

1. számú dializáló puffer:

mol/1 guanidin-hidroklorid 3 mmol/1 3,0 pH-jú EDTA g zárványtestet adunk 30 ml szolubilizáló pufferhoz, és 5 percig homogenizáljuk ultrahanggal, majd 1 órát inkubáljuk szobahőmérsékleten. Utána sósavat adunk hozzá, amíg a pH 3,0-ra csökkent. Végül az oldatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk.

Az oldatot az 1. számú dializáló pufferral szemben addig dializáljuk, amíg a DTE-t teljesen eltávolítottuk (1 mmol/l-nél kevesebb DTE).

b) Szakaszos adagolásos reaktiválás (Pulsreaktivierung):

Renaturáló puffer:

0,8 mol/1 arginin-hidroklorid

0,1 mol/1 trisz-puffer, pH=8,0

0,5 mmol/1 GSH

0,5 mmol/1 GSSG mmol/1 EDTA

2. számú dializáló puffer:

mmol/1 trisz-puffer, pH=8,0 mmol/1 EDTA

A szakaszos adagolásos reaktiválás az EP-A 0241 022 számú európai közrebocsátási iratban leírtak szerint történik. Ehhez az EP-A 0241 022 számú európai közrebocsátási irat 5. ábráján bemutatott berendezést használjuk.

A proteint 30 perces időközökben adjuk a reakcióközegbe (100 ml renaturáló puffer) úgy, hogy a proteinkoncentráció a reakcióelegyben adagonként 50 gg/mlrel nőjjön. Összesen 20-szor adagolunk (végkoncentráció körülbelül 1 mg/ml).

A szakaszos adagolásos reaktiválás után a reakcióelegyből centrifugálással eltávolítjuk a zavarosodást, és az egész oldatot az arginin teljes eltávolításáig (50 mmol/l-nél kevesebb arginin) dializáljuk a 2. számú dializáló pufferral szemben. (Az ellenőrzés célszerűen vezetőképesség-méréssel történik. A dialízis akkor fejezhető be, amikor a dializáló puffer és a reakcióelegy vezetőképessége azonos.) Az egyes szerkezetekre kapott reaktiválási kitermeléseket, amelyeket aktivitási vizsgálatok segítségével állapítottunk meg, a 2. táblázat mutatja.

HU 214 881 Β (Λ '(Ο o

*4—4

O

Cl

TJ oj

Π3 ε

xo

Λ

OJ > fO CO O C • H ε

η ό <r cn

I f

I o

I

Γ-.

ΓΊ

I o

OJ

I <r a m m

I I

CO >

táblázat

CM

	(Λ
	OJ
	AJ
	• *4	^4
>	α	o	m	X	σ'	θ'	CO	Ο»	οο	Α	<*Ί
Ή	• ^4	E
AJ	X		^4	co	o	σ'	σ>	Ο		Ο	<r
(0	o	^4			OJ	~4	οι	<Γ	<τ	04	<Γ
F*C	c^	CO		1
OJ	0	<J			1	1	1	1	1	1	1
X	Ci	Λ
	Ό	'm·*
	• f4
	X
1	OJ							ο
3	«Λ							σ'
AJ	'OJ
(0	^4		o	©	o	ο	ο		ο	ο	ο
C	'(0		^4	A	OJ	οι	Α		00	00	X
0)	u							ο
ex								00

Λ o

LÓ '

I rH l

X co o

i

O i

AJ u

X

Cc

CO o

o x

w ©

i

O o

u cc

I o

u

X i

O0

Ci <

o

U

IX i ο

X i

O u

(X i

Ci

X

H

OJ

X

0>

X o

cc co ^4

N

O)

X i

Cc co ©

OJ

C

N (O

XU

U

4->

c ♦H

Ka

Φ

N

Ül 'ti tj r—I '<D a

x

c

m

V3

•H

α

(0

c

Ü]

t

>

o

'Φ

©

X

1

N

•^4

1

V3

OO

O

AJ

o

©

14

tó

Ci

oj

Ci

1

<

XO

E

<N

ex

©

1

cn

AJ

1

o

u I

<0

(0

rtí

O

0

Ci

X

•

Ci

X

0

00

r4

ω

X

04

X

1

04

XO

V3

1

v>

V)

1

E

C

'íö

α

OO

o

©

‘H

0

• r4

»-1

I

Ci

1

X

^4

e

*<rj

X

α

<

X

α

1

tó |

ro

u

Ka

V3

VI

1

<S)

AJ

OJ

ο

0

O

OO

00

X

AJ

1 1

1

Ci

U

Ci

X

O

CO

1

α I

ο

ex

X

<

1

—4

X

fÖ

I

1

00

1

V3

tó

xO

C

0

ο

3

©

O

X

00

N

Φ

U

Ci

oj

1

Ci

•4

X

Cp

<o

CO

χ

ex

X

© 1

X

©

1

N

1

0»

S-l

•b

X

w

Ο

00

o

O

(/)

3

X

>

OJ

U

Ci

14

Ci

• f4

^4

X

1

• H

'0)

(X

χ

<

X

o

1

o

»<4

(J

I ÖŰ

1 00

1 o

1 Ci

1 O

1 (Λ

1 0J

00 Ci

tó

W XO

c 0J

Ül 'ti

X

Cl

Ci

X

Ci

X

f-4

<

AJ

>

<

IX

H

X

1—1

1

• *4

1“1

1

|

1

W

3

>

OJ

0

Ο

X

C

V)

X

<D

ro

• «4

N

X

Ci

r4

X

í“4

X

J 1

T3

AJ

V)

X

©

o

X

©

t r4

»~4 Ml)

X rrt

rX

tfí

X

QJ

X

CC bű u

<

>~4 ©

X X

I

X X

CN üi >1 ►q

X

CO ©

E xo

N

V3 ja r-4

N ω

0/ oj

OJ

0/

OJ

X o

X 1 O

X 0

X » o

X 1 O

X 1 ro

X » o

1 0 U

V5 ü »

Ka CU

c

Cl OJ N

N

ül 'íd .«

Cl

Ci

u

Ci

^4

Ci

X

o

1

χβ

ω

(0

X

<

X

1

Ka

E

'd

1

Ci

o

r4

ro

X

Ci

14

Cl

V3

Ci

X

Ci

E-i

XO

Ό

• ·

c

X

H

X

r«4

♦-4

fl)

H

X

H

1

ro

OJ

o

r^.

1

l

AJ

O

4J

AJ

X

«-4

c

AJ

4J

AJ

4J

OJ

Ci

Φ

♦

Ka

OJ

0J

OJ

X

5J

E

m

Φ

X

1

OJ

l

Cb

c

co

/-«»

X**.

z-s

o

en

A

Ό

r*«

OO

o

X

v

HU 214 881 Β

4. példa

A G-CSF aktivitás meghatározása

A G-CSF aktivitást az NFS60 rágcsáló (murine) leukémia sejtvonallal vizsgáljuk, amely a Biochem. J., 253, 213-218 (1988), az Exp. Hematol, 17, 116-119 (1989) és a Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5010 (1986)-ban leírtak szerint teljesen G—CSF-fuggő. A fenntartó tenyészet táptalajának (RPMI táptalaj, Boehringer Mannheim GmbH, Best. No. 2099445, 10% boíjú magzatszérummal) G-CSF-koncentrációját állandóan 1000 egység/ml-en tartjuk, hogy a sejtek faktorfüggősége fennmaradjon.

A vizsgálatban az NFS60-sejtek G-CSF által stimulált szaporodását követően mérjük a ³H-timidinbeépüléssel. A vizsgálat kivitelezése a következőképpen történik:

Az exponenciális növekedési fázisban lévő NFS60sejteket (sejtsűrűség maximálisan l><10⁵ sejt/lyuk) mikrotiter lapokra viszünk át (1 χ 10^{4 *} sejt/lyuk), és csökkenő koncentrációjú G-CSF jelenlétében tenyésztjük. A maximális G-CSF-dózis az 1. lyukban a fenntartó tenyészetben lévő koncentrációnak (1000 egység/ml, fajlagos aktivitás lxlO⁸ egység/mg protein) felel meg. A hígítás lépésenként tízszeres.

Körülbelül 24 óra inkubálás után történik a ³Htimidin (0,1 pC/lyuk) hozzáadása. Utána a sejteket még további 16 óra hosszat inkubáljuk.

A vizsgálat kiértékelése céljából a sejteket a mikrotiter lemezen megfagyasztjuk, hogy lizáljanak. A sejtlizátumot egy üvegrost-szűrőre szívatjuk, öblítjük, megszárítjuk, és szcintillációs számlálóban mérjük. A ³H-timidinbeépülés egyenesen arányos az NFS60sejtek G-CSF által indukált szaporodásával.

5. példa

A renaturálási kitermelés meghatározása a denaturált proteinkoncentrációjának függvényében egyszeri adagolás esetén

Kiindulási anyag: a 2. táblázatban megadott 0., 3., 5. és 8. számú szerkezetnek megfelelő zárványtestek.

Szolubilizálás és 1. dialízis:

A zárványtest-anyagot a 3. példában leírtakhoz hasonlóan szolubilizáljuk, dialízissel eltávolítjuk a redukálószert, és végül a proteinkoncentrációt 30 mg/ml-re beállítjuk [Μ. M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 252 (1976)].

Renaturálás:

A reaktiválás 0,8 mol/1, illetve 0,2 mol/1 argininhidrokloridot, 10 mmol/1 EDTA-t, 0,5 mmol/1 GSH-t (redukált glutation) és 0,5 mmol/1 GSSG-t (oxidált glutation) tartalmazó oldatban 20 °C-on és 8,0 pH-nál történik.

Az egyes renaturálási kísérletekben 0,3 és 3 mg/ml közötti proteinkoncentrációkat állítunk be. A guanidinhidroklorid koncentrációja minden kísérletben 0,55 mol/1.

Szobahőmérsékleten végzett 3 órás inkubáció után a reakciót savanyítással (pH=4,5) leállítjuk.

A denaturált és renaturált protein arányát HPLC-vel határozzuk meg.

„A” futtató puffer: 0,12 térf%-os trifluor-ecetsav.

„B” futtató puffer: 90 térf%-os acetonitril, 0,1 térf% trifluor-ecetsav.

Gradiens elúció: a „B” puffer aránya 40%-ról 70%ra nő 30 perc alatt.

Átfolyási sebesség: 1 ml/perc.

Detektálás: 280 nm-nél.

Az eredményeket az 1. és 2. ábrán mutatjuk be.

6. példa

Renaturálás az argininkoncentráció függvényében

Kiindulási anyagokként a 0., 3., 5. és 8. (2. táblázat) szerkezetű dialízált szolubilizátumok szolgálnak (proteinkoncentráció 10 mg/ml), amelyeket az 5. példa analógiájára állítunk elő.

A renaturálási pufferban (0-0,8 mol/1 argininhidroklorid, 100 mmol/1 trisz, 10 mmol/1 EDTA, 0,5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG, szobahőmérséklet, pH=8) a proteinkoncentrációt denaturált protein egyszer hozzáadásával 1 mg/ml-re állítjuk be.

A reakciót 3 órás inkubálási idő után savanyítással (pH=4,5) leállítjuk. Az ezt követő kiértékelés az 5. példához hasonlóan HPLC-vel történik.

Az eredményeket a 3. példa mutatja.

7. példa

A reaktiválás kinetikája 0,2 mohi arginin-pufferban

Kiindulási anyag: a 6. példában kapott szolubilizátumokat használjuk.

A reaktiválás 0,2 mol/1 arginin-hidrokloridot, 100 mmol/1 íriszt, 10 mmol/1 EDTA-t, 0,5 mmol/1 GSH-t, 0,5 mmol/1 GSSG-t tartalmazó oldatban, szobahőmérsékleten, 8 pH-nál történik. A proteinkoncentrációt a reakcióelegyben egyszeri beadagolással 1 mg/mlre, a guanidin-hidroklorid-koncentrációt 0,55 mol/l-re állítjuk be. Mintákat veszünk 5, 10, 15, 60 és 180 perc elteltével, a reakciót mindenkor savanyítással (pH=4,5) állítjuk le, és utána a reaktivitási kinetikát HPLC-vel mérjük (lásd 5. példa).

A 4. ábra mutatja a reaktiválási kitermelést az inkubálási idő függvényében.

Szekvenciák listái (iii) Szekvenciák száma: 12

Az 1. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 2 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

Met Glu

A 2. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 8 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu Pro Arg Pro Pro

5

A 3. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 10 aminosav

HU 214 881 Β (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu His His Pro Arg Pro Pro 1 5 10

A 4. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 10 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu Lys Lys Pro Arg Pro Pro 1 5 10

Az 5. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 11 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu Glu Glu Gly Pro. 1 5

A 6. számú szekvencia jellemzői: (A) szekvenciahossz: 14 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu Glu Glu Gly Thr Pro Leu Pro Arg Pro Pro 1 5 10

A 7. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 9 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu Glu Glu Gin Pro Pro 1 5

A 8. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 13 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris A szekvencia leírása

Met Lys Alá Lys Arg Phe Lys Lys His Pro Arg Pro Pro 1 5 10

A 9. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 11 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu Glu Glu Gly Ile Glu Gly Arg 1 5 10

A 10. számú szekvencia jellemzői: 30 (A) szekvenciahossz: 16 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris A szekvencia leírása

Met Thr Pro Leu Lys Alá Lys Arg Phe Lys Lys His Pro Arg Pro Pro 1 5 10

All. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 18 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szálasság: egyszálas (D) topológia: lineáris 45

A szekvencia leírása

AATTCGGAGG AAAAATTA 18

A 12. számú szekvencia jellemzői:

(A) szekvenciahossz: 13 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szálasság: egyszálas (D) topológia: lineáris

A szekvencia leírása

ACACCACTGG GCC 13

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás legalább részben inaktív formában lévő rekombináns protein aktiválására, azzal jellemezve, hogy a kívánt proteint egy olyan, az N- és/vagy C-terminálishoz kapcsolt,
2-50 aminosav hosszúságú segéd- 55 szekvenciával együtt fejezzük ki, melynek az egyes aminosavak relatív hidrofobicitásának összegeként számított relatív hidrofobicitása negatív, majd a kifejezett proteint önmagában ismert szolubilizálási és/vagy renaturálási technikákat alkalmazva aktiváljuk.

50 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia relatív hidrofobicitása és az aminosavak számának hányadosaként kapott viszonyszám -2,0 kcal/mol vagy kisebb számérték.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia relatív hidrofobicitása és az aminosavak számának hányadosaként kapott viszonyszám -2,5 kcal/mol vagy kisebb számérték.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia az aktiválan60 dó protein N-terminálisához kapcsolódik.

HU 214 881 Β
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia az aktiválandó protein C-terminálisához kapcsolódik.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia legalább 2 aminosavat tartalmaz a glutaminsav, aszparaginsav, lizin, arginin és prolin által alkotott csoportból.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia legalább 2 glutaminsav-maradékot tartalmaz.
8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia két közvetlenül egymás után következő, azonos töltésű aminosavat tartalmaz a glutaminsav, aszparaginsav, lizin és arginin által alkotott csoportból.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a segédszekvencia két közvetlenül egymás után következő glutaminsav-maradékot tartalmaz.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan proteineket aktiválunk, amelyek a segédszekvencia és a kívánt protein közötti átmenetben egy hasítási helyet tartalmaznak.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási hely egy proteáz által felismerhető szekvencia.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási hely egy IgA-proteáz hasítási hely.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási hely egy Xa-faktor hasítási hely.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan proteint aktiválunk, amely N-terminális segédszekvenciaként a

Met-Glu (1. számú szekvencia),