NO300329B1 - Fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner - Google Patents

Fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner Download PDF

Info

Publication number
NO300329B1
NO300329B1 NO920671A NO920671A NO300329B1 NO 300329 B1 NO300329 B1 NO 300329B1 NO 920671 A NO920671 A NO 920671A NO 920671 A NO920671 A NO 920671A NO 300329 B1 NO300329 B1 NO 300329B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
protein
helper
amino acids
helper sequences
sequences
Prior art date
Application number
NO920671A
Other languages
English (en)
Other versions
NO920671L (no
NO920671D0 (no
Inventor
Dorothea Ambrosius
Carola Dony
Rainer Rudolph
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6425597&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO300329(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of NO920671D0 publication Critical patent/NO920671D0/no
Publication of NO920671L publication Critical patent/NO920671L/no
Publication of NO300329B1 publication Critical patent/NO300329B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
  • Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
  • Nitrogen- Or Sulfur-Containing Heterocyclic Ring Compounds With Rings Of Six Or More Members (AREA)
  • Adhesive Tapes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner som foreligger i en i det minste delvis inaktiv form, spesielt for aktivering av rekombinante proteiner fra prokaryote organismer.
Ved ekspresjon av rekombinante proteiner i prokaryoter oppstår proteinene i vertscellen ofte som i det minste delvis inaktive, vanskelig oppløselige aggregater (refrakti-le legemer, inklusjonslegemer IB), som til og med kan være forurenset med proteinene til vertscellen. Før disse proteinene f.eks. kan bli anvendt for terapeutisk eller diagnostiske formål, må de bli overført i deres aktive form.
Fremgangsmåte for renaturering av rekombinante proteiner er allerede kjent, og eksempelvis beskrevet i EP-A 0 114 506, WO 86/00610, WO 84/03711, US 4.530.787 og EP-Å 0.241.022. Med denne kjente fremgangsmåten blir det derimot ofte oppnådd lavt utbytte ved aktivering av naturlige proteinsekvenser. Problemet som ligger til grunn for oppfinnelsen, består dermed i å tilveiebringe en forbedring av renatureringsutbyttet til rekombinante proteiner. En spesiell mulighet for å oppnå dette, er å oppnå en fremgangsmåte der utbyttet kan bli bedre gjennom valg av renatureringsbetingelser. Dette er derimot ikke gjenstand for foreliggende oppfinnelse.
Løsningen på oppgaven ifølge oppfinnelsen, beror på den overraskende oppdagelsen av at renatureringsutbyttet til proteinene kan bli forhøyet når man ved deres N- eller/og C-terminus tilføyer ytterligere hjelpersekvenser.
En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er dermed fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner, spesielt av rekombinante proteiner fra prokaryoter som foreligger, i det minste delvis i inaktivert form.
Foreliggende oppfinnelse er følgelig kjennetegnet ved at man ved en i seg selv solubiliserings- eller/og renatureringsteknikk aktiverer et protein som på dets N- eller/og C-terminus inneholder ytterligere hjelpersekvenser med en lengde på 2 til 50 aminosyrer, der den relative hydrofobisiteten til disse hjelpersekvensene, beregnet som summen av den i tabell 1 angitte relative hydrofobisitet til enkelte aminosyrer, oppviser en negativ tallverdi der hjelpersekvensen oppviser en verdi for forholdet mellom relativ hydrofobisitet og antall aminosyrer på -2,0 kcal/mol eller mindre.
Begrepet "relativ hydrofobisitet" i foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i litteraturen T.E. Creighton (1983), Prooteins, Structure and Molecular Principles, W.H. Freeman and Company, New York, S. 142, tabell 4.4; G. von Heijne og C. Blomberg
(1979), J.Biol. Chem. 246, 2211-2217. Bestemmelse av verdien for den relative hydrofobisiteten til en aminosyre fremkommer derved f.eks. etter Nozaki/Tanford gjennom formidling av fordelingslikevekten til denne aminosyren mellom et ikke-polart oppløsningsmiddel (f.eks. etanol/dioksan) og vann. Den relative hydrofobisiteten er en energistørrelse og kan dermed angis i kcal/mol. En positiv verdi for den relative hydrofobisiteten betyr at det foreligger en preferanse for ikke-polare oppløsningsmidler, dvs. at det dreier seg om en upolar aminosyre. Har den relative hydrofobisiteten derimot en tallverdi som er mindre enn 0, dreier det seg om en polar aminosyre, som har en preferanse for vann i forhold til et ikke-polart oppløsningsmiddel. Ved slike aminosyrer blir det følgelig frigjort energi ved overgang f.eks. fra etanol til vann.
Følgende tabell 1 inneholder en oppføring av verdiene for den relative hybrofobisiteten til de enkelte aminosyrene.
Det fremgår av tabellen at aminosyrene cystein, prolin og spesielt glutamat, aspartat, arginin og lysin oppviser en sterk negativ relativ hydrofobisitet.
Det er overraskende blitt fastslått at aktiveringen av rekombinante proteiner kan bli betydelig forbedret gjennom tilføying av hjelpersekvenser med en lengde på 2 til 50 aminosyrer på en proteinsekvens, når denne hjelpersekvensen totalt oppviser en negativ, relativ hydrofobisitet. Lengden på denne hjelpersekvensen utgjør fortrinnsvis 2 til 20, spesielt foretrukket 5 til 20 aminosyrer.
Det er videre foretrukket at kvotienten til denne hjelpersekvensen utgjør av relativ hydrofobisitet og antall aminosyrer, 2,0 kcal/mol eller mindre, spesielt foretrukket er fra 2,5 kcal/mol eller mindre og mest foretrukket er fra 2,8 kcal/mol eller mindre.
Tilføyelse av hjelpersekvensen på det rekombinante proteinet kan foregå ved hjelp av vanlige teknikker innen området molekylærbiologi. Dette skjer fortrinnsvis ved at man på den ene eller begge endene kobler til DNA-sekvensen som uttrykker det rekombinante proteinet en oligonukleotidsekvens som koder for en overnevnt protein-hjelpersekvens med en negativ hydrofobisitet. For dette formål blir eksmepelvis DNA-fragmenter isolert fra genet som skal bli uttrykt, som inneholder et området som koder for begynnelsen, hhv. slutten av det gjeldende genet. I disse DNA-fragmentene kan det deretter f.eks. under anvendelse av andre restriksjonsspalte-seter bli innført syntetiske oligonukleotider som inneholder de kodende områdene for hjelpersekvensen. En annen mulighet består i å erstatte de naturlige DNA-fragmentene fra genet fullstendig med oligonukleotidsekvenser. På denne måten kan det oppnås modifiserte DNA-sekvenser som i tillegg til informasjon angående et rekombinant protein, også inneholder informasjonen for de tilføyde hjelpersekvensene.
Som DNA-sekvenser som koder for de N-terminale hjelpersekvensene anvendes DNA-sekvenser, hvor deres kodonanvendelse er tilpasset ekspresjonsorganismen (E.L. Winnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, 1985, 224-241).
For E. coli som ekspresjonsorganisme blir det for de følgende aminosyrene anvendt følgende kodoner:
Et på denne måten modifisert DNA som koder for et rekombinant protein med tilføyde hjelpersekvenser, blir fortrinnsvis ført ved transformasjon i en vertcelle, fortrinnsvis i en prokaryotisk celle, speiselt foretrukket i en E.coli-celle. Deretter følger dyrkningen av de transformerte cellene i et egnet medium, oppslemming av cellene og isolering av de rekombinante proteinet som oppstår i en i det minste delvis inaktiv tilstand, som spesielt foreligger i form av inklusjonslegemer. Deretter foregår en solubilisering og renaturering av dette proteinet, fortrinnsvis ved en pH-verdi der proteinet kan innta dets native konformasjon. Disse fremgangsmåtetrinnene kan tilsvarende bli utført ved hjelp av kjent teknikk, som det f.eks. fremgår fra teknikkens stand som er nevnt i beskrivningsinnledningen. Fortrinnsvis foregår aktiveringen av proteinet ved hjelp av en puls-renaturering, som f.eks. kjent fra EP-A 0.241.022. Den gjennom foreliggende oppfinnelse oppnådde forbedringen av den kjente fremgangsmåteteknikken, beror spesielt på tilstede-værelsen av hjelpersekvensene som er koblet til N- eller/og C-terminusen til det rekombinantet proteinet. Dermed er hjelpersekvensene fortrinnsvis koblet til N-terminusen til proteinet som skal aktiveres. Kobling av hjelpersekvensen på C-terminusen frembringer derimot også positive resultater.
Som hjelpersekvenser er slike foretrukket som har minst 2 aminosyrer fra gruppen bestående av glutamat, aspartat, lysin, arginin og pol in, der lysin- og glutåmatrester er spesielt foretrukket og glutåmatrester er mest foretrukket. Videre er det speiselt foretukket når hjelpersekvensene inneholder to direkte på hverandre følgende av de ovennevnte ladete aminosyrene (dvs. glutamat, aspartat, lysin og arginin) med lignende ladning, fortrinnsvis to direkte på hverandre følgende lysin- eller glutåmatrester, spesielt foretrukket er to direkte på hverandre følgende glutåmatrester .
Ved senere terapeutisk anvendelse av de rekombinante proteinene oppnådd ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er det fordelaktig at de oppviser et spaltningssete ved overgangen mellom hjelpersekvens og det ønskede proteinet. Dermed kan proteinet oppnås med dets naturlig aminosyre-sekvens. Dette spaltningssetet kan være en sekvens som blir gjenkjent av en protease eller en kjemisk proteinspaltnings-sekvens (f.eks. BrCN), der et proteasespaltesete er foretrukket. Det er foretrukket at det ved spaltesetet dreier seg om et IgA-proteasespaltesete som beksrevet i WO 91/11520. De nøyaktige spaltningsbetingelsene fremgår likeledes fra WO 91/11520. Videre foretrukket er også et spaltningssete som er et spaltningssete for faktor Xa.
Et slikt spaltningssete i proteinsekvensen er ved anvendelse av det rekombinante proteinet ikke nødvendig innen analytik-ken.
Konkrete eksempler på hjelpersekvenser som er egnet for forbedring av proteinaktiveringen, er de nedenfor angitte sekvensene som er tilkoblet N-terminusen til et protein: Hjelpersekvensene SEQ ID NO: 5, 6, 7 og 9 med 2 påhverandre følgende glutåmatrester, gir de høyeste renatureringsut-byttene og er dermed mest foretrukne.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet for aktivering av rekombinante humane proteiner og derivatene derav, som f.eks. plasminogenaktivatorer, interferon, interleukin og granulozytt-koloni-stimulerende faktorer fremstillt i prokaryoter. Spesielt foretrukket dreier det seg om med proteinene som skal bli aktivert, om en granulozytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), som oppviser begynner-DNA-sekvensen ACACCA. Likeledes foretrukket er også derivater av G-CSF, som fremkommer fra EP-A 0.456.200.
Vektoren pKK177-3-G-CSF Bg ble deponert 28.03.1990 til Deutschen Sammlung flir Mikroorganismen, Grisebachstr. 8, D-3400 GSttingen under deponeringsnummeret DSM 5867.
Oppfinnelsen skal nå beskrives nærmere i de følgende eksemplene og tegningene. Figur 1 viser konsentras jonsavhengigheten til renatureringsutbyttet (argininkonsentrasjon 0,2 mol/l) for konstruksjoner, som inneholder sekvensene analog med sekvens 0 i tabell 2 (kurve 1), SEQ ID NO: 3 (kurve 2), SEQ ID NO: 5 (kurve 3) og SEQ ID NO: 8 (kurve 4). Figur 2 viser konsentras jonsavhengigheten til renatureringsutbyttet (argininkonsentrasjon 0,8 mol/l) for konstruksjoner som inneholder sekvensene analoge med sekvens 0 ifølge tabell 2 (kurve 1); SEQ ID nNO: 3 (kurve 2), SEQ ID NO: 5 (kurve 3) og SEQ ID nr.: 8 (kurve 4). Figur 3 viser avhengigheten av renatureringsutbyttet til argininkonsentrasjonen (kurvetetegnelsene er analoge figur 1 og 2).
Figur 4 viser reaktiveringsutbytte i avhengighet av inkuba-sjonstiden argininkonsentrasjon 0,2 mol/l, kurvebetegnelser analogt figur 1 og 2).
EKSEMPEL 1
Konstruksjon av vektorer.
Vektor pKK177-3 G-CSF Bg (DSM 5867) blir spaltet med EcoRI (delvis) og Apal og oligonukleotidet
blir skutt inn i det oppståtte lineæriserte vektorfragmentet (ca. 3450 bp).
De i gapet innførte DNA-sekvensene tilsvarer den genetiske koden for de i tabell 2 nevnte aminosyrene, dvs. eksempelvis ble det for konstruksjon (2) innskutt et oligonukleotid med den genetiske koden for Met-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2). De gjennom liger ing av oligonukletidet i den spaltede vektoren resulterende plasmider ble transformert i E.coli HB101. For å oppnå en bedre regulerbarhet av tac-promoteren, ble cellene i tillegg transformert med en til pBPOlO (fremstilling ifølge europeisk patentsøknad nr. 91 111 155.7) kompatibelt plasmid som inneholder lacl^-genet. LaqlQ-genet har lenge vært kjent for fagfolk og kan lett oppnås. Som kompatible plasmider til pBPOlO utgjør f.eks. pACYC 177 (DSM 3693P) der lacl^-genet er skutt inn, eller derav avledete plasmider (jfr. f.eks. gen 85 (1989), 109-114 og EP-A 0.373.365). De resulterende klonene ble selektert på Kanamycin (50 jjg/ml )/ampicillin (50 jig/ml) og identifisert ved hjelp av restriksjonsanalyse. Ved spaltning med EcoRI og EcoRI oppnås fragmentene med lengder på ca. 3,15 kb, ca. 0,3 kb (med gjeldende konstruksjoner) og 4,85 kb.
EKSEMPEL 2
a) Fermentasjon
De ifølge eksempel 1 positivt identifiserte kloner ble
behandlet i 5 ml kultur i LB-medium med Kanamycin og Ampicillin (for konsentrasjoner, se eksempel 1) til en OD55Q på 0,5 og indusert med 5 mmol/1 IPTG og inkubert i 3 timer ved 37 * C. 10 OD av denne induserte kulturen ble høstet og av denne ble et totalcelleekstrakt fremstilt. Totalcelleekstrak-tet blir analysert på en SDS-Page-gel. ;Dersom hensikten er at det ønskede proteinet skal bli uttrykt, blir kulturen gjentatt i 1 liter målestokk, cellene høstet og en IB-preparering gjennomført. ;b) IB-preparering: ;Cellene blir høstet ved sentrifuger ing, tatt opp i 100 ml ;Tris-magnesiumbuffer (10 mmol/1 Tris, pH 8,0, 1 mmol/1 MgCl2) og oppslemmet med lysozym (0,3 mg/ml). ;Dette blir inkubert i 15 minutter ved 37°C og en French-pressegjennomgang blir gjennomført (8274 kPa). Deretter foregår en DNAse-fordøyning (2 mg DNAse I) ved 30 minutter og 37°C. ;Det tilsettes 20 ml 0,5 mol/l NaCl, 20 mmol/1 EDTA, pH 8,0 og 3 ml 20# Triton x 100, og dette inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur. ;Suspensjonen blir sentrifugert i 10 minutter ved 15.000 opm og 4°C. Pelleten blir tatt opp i 30 ml 50 mmol/1 Tris, pH 8,0. 50 mmol/1 EDTA og 0,596 Triton x 100 og behandlet med ultralyd. Dette blir igjen sentrifugert, resuspendert og behandlet med ultralyd. Denne prosedyren blir gjentatt to ganger. Til slutt blir dette sentrifugert, og pelletene oppnådd på denne måten, blir tilsatt som IB i eksempel 3. ;EKSEMPEL 3 ;Solubiliserlng/ renaturering ;a) Solubilisering ;Solubiliseringsbuffer: ;6 mol/l Guanidin-hydroklorid ;0,1 mol/l Tris-buffer, pH 8,0 ;1 mmol/1 EDTA ;100 mmol/1 DTE (ditioerytritiol) ;Dialysebuffer 1: ;6 mol/l guanidin-hydroklorid ;3 mmol/1 EDTA ved pH 3,0 ;1 g inklusjonslegemer ble tilsatt til 30 ml solubiliseringsbuffer, homogenisert i 5 minutter med ultralyd og inkubert i 1 time ved romtemperatur. HC1 tilsettes til det oppnås en pH-verdi på 3,0. Til slutt blir det uoppløselige materialet sentrifugert ut. ;Dette blir dialysert mot dialysebuffer 1, helt til DTE er fullstendig fjernet (< 1 mmol/1 DTE). ;b) Pulsreaktivering: ;Renatureringsbuffer: ;0,8 mol/l arginin-hydroklorid ;0,1 mol/l Tris-buffer, pH 8,0 ;0,5 mmol/1 GSH ;0,5 mmol/1 GSSG ;1 mmol/1 EDTA ;Dialysebuffer 2: ;10 mmol/1 Tris-buffer, pH 8,0 ;1 mmol/1 EDTA ;Pulsreaktiveringen foregår som beskrevet i EP-A 0.241.022. Det anvendes et oppsett ifølge fig. 5 i EP-A 0.241.022. ;Deretter blir det i tidsintervaller på 30 minutter oppnådd proteiner i reaksjonsvolumet (100 ml renatureringsbuffer), slik at proteinkonsentrasjonen i reakjsonsvolumet pr. puls stiger med 50 jjg/ml. Det blir totalt pulset 20 ganger (sluttkonsentrasjon ca. 1 mg/ml reaksjonsvolum). ;Etter pulsreaktiveringen blir det fra reaksjonsvolumene sentrifugert ut blakkinger og det totale reaksjonsvolumet blir dialysert mot dialysebuffer 2, frem mot fjerning av arginin (£ 50 mmol/1). (Overprøvingen foregår ved konduktivi-tetsmåling). Dialysen kan avlsuttes når konduktiviteten til dialysebufferet og rekajsonsvolumene er identiske). Reakti-veringsubyttene for de enkelte konstruksjonene, som ble bestemt ved hjelp av aktivitetstest, fremgår av tabell 2. ;EKSEMPEL 4 ;Bestemmelse av aktiviteten til G- CSF ;Aktiviteten til G-CSF blir testet med det murine leukjemilin-je-NFS60, som er fullstendig G-CSF-avhengig, som beskrevet i Biochem. J. 253 (1988) 213-218, Exp. Hematol. 17 (1989) 116-119, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83 (1986) 5010. For at faktoravhengigheten til cellene blir oppnådd inneholder mediet (RPMI-medium, Boehringer Mannheim GmbH, Best. nr. 2099445 med 1056 føtalt kalveserum) til oppholdelseskulturen permanent 1000 U/ml G-CSF. ;Det blir i denne testen direkte målt de fra G-CSF-stimulerte proliferasjoner av NFS60-celler gjennom innføring av <3>H-tymidin. Gjennomføring av testen foregår som følger: NFS60-celler, som befinner seg i den eksponensielle vekst-fasen (celletetthet maksimal lxlO<5> celler/ml) blir overført til mikrotiterplater (1x10^ celler/hull) og dyrket med en reduserende G-CSF-konsentrasjon. Den maksimale dosen G-CSF i hull 1 tilsvarer konsentrasjonen i oppholdskul turen (1000 U/ml, spesifikk aktivitet lxlO<8> U/mg protein). Fortynnelsen foregår i skritt på 10. ;Etter omtrent 24 timers inkubasjon foregår tilsetningen av <3>H-tymidin (0,1 jjCi/hull). Deretter blir cellene inkubert i ytterligere 16 timer. ;For vurdering av testen blir cellene innfrosset i mikrotiter-skåler slik at de blir lysert. Cellelysatet blir suget på et glassfiberfilter, spylt, tørket og målt i scintillasjons-telleren. Innføring av <3>H-tymidin er proporsjonal med G-CSF-induserte proliferasjonen til NFS60-cellene. ;Eksempel 5 ;Bestemmelse av renatureringsutbyttet med hensyn på konsentrasjonen av denaturert protein ved engangstilførsel. Utgangsmateriale: Inklusjonslegemer til konstruksjonene nr. 0, 3, 5 og 8 i tabell 2. ;Solubilisering og 1. Dialyse: ;IB-materialet ble solubilisert analogt eksempel 3, dialysert for fjerning av reduksjonsmidlet og til slutt innstilt på en proteinkonsentrasjon på 30 mg/ml (M.M. Bradford, Anal. Biochem. 72 (1976), 255). ;Renautrering: ;Reaktiveringen foregår i 0,8 mol/l, hhv. 0,2 mol/l arginin-hydroklorid, 10 mmol/1 EDTA, 0,5 mmol/1 GSH og 0,5 mmol/1 GSSG ved 20°C og pH 8,0. ;I de gjeldende renatureringsblandingene ble proteinkonsentra-sjonene innstilt mellom 0,3 og 3 mg/ml. Konsentrasjon av guanidin-hydroklorid ugjorde i alle blandingene 0,55 mol/l. ;Etter en inkubasjon på 3 t ved romtemperatur, ble reaksjonen stoppet gjennom surgjøring (pH 4,5). ;Forholdet mellom denaturert og renaturert protein ble bestemt gjennom HPLC. ;Løpebuffer A: 0,12* trifluoreddiksyre (v/v)
Løpebuffer G: 9056 acetonitril (v/v), 0,156
trifluoreddiksyre (v/v)
Gradient til B: 40 til 7056 i 30 min.
Strømning: 1 ml/min. deteksjon ved 280 nm.
Resultatene er vist i figur 1 og 2.
EKSEMPEL 6
Renaturering avhengig av argininkonsentrasjonen
Som utgangsmateriale ble dialyserte solubilisater (proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml) av konsentrasjonen 0, 3, 5 og 8 (tab. 2) som ble fremstilt analogt eksempel 5.
Gjennom en engangstilførsel av denaturert protein ble proteinkonsent rasjonen i renatueringsbuf feren (0 til 0,8 mol/l arginin-hydroklorid, 100 mmol(l Tris, 10 mmol/1 EDTA, 0,5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG, romtemperatur ved pH 8) innstilt på 1 mg/ml.
Etter en inkubasjonstid på 3 t, ble reaksjonen stoppet ved surgjøring (pH 4,5). Den påfølgende vurderingen foregår med HPLC analogt eksempel 5.
Figur 3 viser resultatene.
EKSEMPEL 7
Kinetikken til reaktiveringen i 0,2 mol/l arginin-buffer Utgangsmateriale: Solubilisatene fra eksempel 6 ble tilsatt.
Reaktiveringen foregår i 0,2 mol/l argininhydroklorid, 100 mmol/1 Tris, 10 mmol/1 EDTA, 0,5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG, ved romtemperatur pH 8. Proteinkonsentrasjonen i reaksjons-blandingen ble innstilt gjennom engangstilførsel av 1 mg/ml og guanidinkonsentrasjonen til 0,55 mol/l. Etter 5, 10, 15, 60 og 180 minutter ble det tatt ut prøver, rekasjonen stoppet ved surgjøring (pH 4,5) og deretter ble reaksjonskinetikken oppnådd ved HPLC (jfr. eksempel 5).
Figur 4 viser reaksjonsutbyttet som funksjon av inkubasjons-tiden.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner som foreligger i en idet minste delvis inaktiv form, karakterisert ved at man ved en i seg selv kjent solubiliserings- eller/og renatureringsteknikk aktiverer et protein som på dets N- eller/og C-terminus inneholder ytterligere hjelpersekvenser med en lengde på 2 til 50 aminosyrer, der den relative hydrofobisiteten til disse hjelpersekvensene, beregnet som summen av den i tabell 1 angitte relative hydrofobisitet til enkelte aminosyrer, oppviser en negativ tallverdi der hjelpersekvensen oppviser en verdi for forholdet mellom relativ hydrofobisitet og antall aminosyrer på -2,0 kcal/mol eller mindre.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hjelpersekvensene påføres N-terminusen til proteinene som skal aktiveres.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hjelpersekvensene kobles til C-terminusen til proteinet som skal aktiveres.
4. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående kravene, karakterisert ved at hjelpersekvensene inneholder minst 2 aminosyrer fra gruppen bestående av glutamat, aspartat, lysin, arginin og prolin.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at hjelpersekvensene inneholder minst 2 glutåmatrester .
6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved at hjelpersekvensene inneholder to direkte på hverandre følgende lett ladete aminosyrer fra gruppen bestående av glutamat, aspartam, lysin og arginin.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at hjelpersekvensene inneholder to direkte på hverandre følgende glutåmatrester.
8. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående kravene, karakterisert ved at man aktiverer proteiner som oppviser et spaltesete ved overgangen mellom hjelpersekvensene og det ønskede proteinet.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at spaltesetet er et IgA-protease-spaltesete.
10. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående kravene, karakterisert ved at man aktiverer et protein som inneholder en N-terminal hjelpersekvens med en av følgende sekvenser:
11- Fremgangsmåte ifølge et av de foregående kravene, karakterisert ved at man arkiverer et protein som vedrører den granulocytt-koloni-stimulerende faktor (G-CSF) eller derivater derav.
NO920671A 1991-02-21 1992-02-20 Fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner NO300329B1 (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4105480A DE4105480A1 (de) 1991-02-21 1991-02-21 Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO920671D0 NO920671D0 (no) 1992-02-20
NO920671L NO920671L (no) 1992-08-24
NO300329B1 true NO300329B1 (no) 1997-05-12

Family

ID=6425597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO920671A NO300329B1 (no) 1991-02-21 1992-02-20 Fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5578710A (no)
EP (1) EP0500108B1 (no)
JP (1) JP2528232B2 (no)
KR (1) KR950014493B1 (no)
AT (1) ATE144284T1 (no)
AU (1) AU641081B2 (no)
CA (1) CA2061569C (no)
CZ (1) CZ282744B6 (no)
DE (2) DE4105480A1 (no)
DK (1) DK0500108T3 (no)
ES (1) ES2093122T3 (no)
FI (1) FI106029B (no)
GR (1) GR3021395T3 (no)
HU (1) HU214881B (no)
IE (1) IE920276A1 (no)
IL (1) IL101024A (no)
MX (1) MX9200709A (no)
NO (1) NO300329B1 (no)
NZ (1) NZ241570A (no)
ZA (1) ZA921230B (no)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5718893A (en) * 1984-04-15 1998-02-17 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
SE9301057L (sv) * 1993-03-30 1994-10-01 Pharmacia Ab Beredning med kontrollerad frisättning
US5536495A (en) * 1994-04-15 1996-07-16 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
US20030053982A1 (en) 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
WO2002020767A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Massachusetts Institute Of Technology G-csf analog compositions and methods
CN100404673C (zh) 2001-02-19 2008-07-23 默克专利有限公司 鉴定t细胞表位的方法及制备具有降低的免疫原性的分子的用途
NZ530545A (en) 2001-07-11 2006-10-27 Maxygen Holdings Ltd Specific conjugates comprising a polypeptide exhibiting G-CSF activity and a non-polypeptide moiety
US7557195B2 (en) 2002-03-20 2009-07-07 Biopolymed, Inc. Stoichiometric conjugates of biocompatible polymers at the unpaired cysteine residue of the wild-type G-CSF
US7666627B2 (en) * 2002-08-08 2010-02-23 Targetex Kft. Folded recombinant catalytic fragments of multidomain serine proteases, preparation and uses thereof
US7785601B2 (en) 2002-12-31 2010-08-31 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US7695723B2 (en) 2002-12-31 2010-04-13 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US7220407B2 (en) 2003-10-27 2007-05-22 Amgen Inc. G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction
ATE544463T1 (de) 2004-11-05 2012-02-15 Univ Northwestern Verwendung von scf und g-scf bei der behandlung von hirnischämie und neurologischen störungen
MX2007015156A (es) 2005-06-01 2008-02-15 Maxygen Holdings Ltd Polipeptidos g-csf pegilados y metodos para la produccion de los mismos.
EP2049524A2 (en) * 2006-07-24 2009-04-22 Tetralogic Pharmaceuticals Corporation Iap inhibitors
WO2009023566A2 (en) 2007-08-09 2009-02-19 Genzyme Corporation Method of treating autoimmune disease with mesenchymal stem cells
WO2009046015A2 (en) 2007-09-30 2009-04-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Combination therapies for treating type 1 diabetes
US8283372B2 (en) 2009-07-02 2012-10-09 Tetralogic Pharmaceuticals Corp. 2-(1H-indol-3-ylmethyl)-pyrrolidine dimer as a SMAC mimetic
JP5840148B2 (ja) 2010-03-04 2016-01-06 フェニックス インク． 変性させることなく可溶性組換えインターフェロンタンパク質を産生する方法
CN102892780B (zh) 2010-03-17 2015-07-29 通益制药有限公司 获得生物活性的重组人g-csf的方法
US8455218B2 (en) 2010-04-01 2013-06-04 Pfenex, Inc. Methods for G-CSF production in a Pseudomonas host cell
SG11201408530YA (en) * 2012-08-02 2015-03-30 Hoffmann La Roche Method for producing monomeric and multimeric molecules and uses thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4532207A (en) * 1982-03-19 1985-07-30 G. D. Searle & Co. Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase
DK55685A (da) * 1985-02-07 1986-08-08 Nordisk Gentofte Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet
US4530787A (en) * 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
US5082775A (en) * 1984-05-11 1992-01-21 Berlex Laboratories, Inc. Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents
US4948729A (en) * 1985-03-25 1990-08-14 Cetus Corporation Production of soluble recombinant proteins
US4783415A (en) * 1985-03-28 1988-11-08 Meiji Seika Kabushiki Kaisha Gene coding for signal peptides and utilization thereof
US5087564A (en) * 1985-06-20 1992-02-11 Monsanto Company Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase
DE3636903A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-02 Hoechst Ag Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil
JPH0618781B2 (ja) * 1986-10-18 1994-03-16 中外製薬株式会社 感染症治療剤
US5013653A (en) * 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
DE3852074D1 (de) * 1987-03-20 1994-12-15 Creative Biomolecules Inc Verfahren zur reinigung von rekombinanten polypeptiden.
EP0371041A1 (en) * 1987-06-24 1990-06-06 Novo Nordisk A/S A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
ZA901719B (en) * 1989-03-19 1991-01-30 Akzo Nv Hog cholera virus vaccine and diagnostics
US5191063A (en) * 1989-05-02 1993-03-02 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence
US5115102A (en) * 1989-07-21 1992-05-19 Monsanto Company Variant proteins and polypeptides possessing enhanced affinity for immobilized-metal affinity matrices
WO1992003477A1 (en) * 1990-08-20 1992-03-05 Novo Nordisk A/S Biologically active compound, a process for the preparation thereof and use of the same

Also Published As

Publication number Publication date
NZ241570A (en) 1994-09-27
CA2061569A1 (en) 1992-08-22
AU641081B2 (en) 1993-09-09
CS49992A3 (en) 1992-09-16
HU9200548D0 (en) 1992-04-28
MX9200709A (es) 1992-09-01
EP0500108A2 (de) 1992-08-26
FI106029B (fi) 2000-11-15
GR3021395T3 (en) 1997-01-31
FI920742A (fi) 1992-08-22
AU1094892A (en) 1992-08-27
JP2528232B2 (ja) 1996-08-28
NO920671L (no) 1992-08-24
JPH05244977A (ja) 1993-09-24
ATE144284T1 (de) 1996-11-15
HU214881B (hu) 1998-07-28
CA2061569C (en) 2000-10-24
CZ282744B6 (cs) 1997-09-17
HUT68021A (en) 1995-04-04
DE59207351D1 (de) 1996-11-21
FI920742A0 (fi) 1992-02-20
IL101024A (en) 1996-06-18
EP0500108B1 (de) 1996-10-16
NO920671D0 (no) 1992-02-20
DE4105480A1 (de) 1992-08-27
US5578710A (en) 1996-11-26
ES2093122T3 (es) 1996-12-16
EP0500108A3 (en) 1993-04-07
IL101024A0 (en) 1992-11-15
KR920016464A (ko) 1992-09-24
KR950014493B1 (ko) 1995-12-02
IE920276A1 (en) 1992-08-26
ZA921230B (en) 1992-11-25
DK0500108T3 (da) 1997-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO300329B1 (no) Fremgangsmåte for aktivering av rekombinante proteiner
US5756308A (en) Refolding variant of bone morphogenetic protein-8
DK168823B1 (da) Fusionsproteiner, hvor ballastandelen består af peptider af interleukin 2, fremgangsmåde til deres fremstilling, deres anvendelse, genstruktur, der koder for et sådant fusionsprotein, vektor indeholdende en sådan genstruktur, og E. coli-celle indeholdende en sådan vektor.
US8298789B2 (en) Orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH) (1-34)
NO176481B (no) Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein
NO175640B (no)
CN111117977B (zh) 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
US20160168226A1 (en) Process for production of insulin and insulin analogues
AU700605B2 (en) Production of peptides using recombinant fusion protein constructs
WO1996017942A9 (en) Production of peptides using recombinant fusion protein constructs
WO1997001627A1 (en) High-level expression and efficient recovery of ubiquitin fusion proteins from escherichia coli
NO328339B1 (no) Fremgangsmate for rekombinant fremstilling av heterologt polypeptid.
US20070099283A1 (en) Recombinant proteinase k
EP0220482B1 (en) Novel plasmid and use thereof
EP0205038A1 (en) Polypeptide, process for preparing it, microorganism and pharmaceutical use
CN111269916B (zh) 一种适合大肠杆菌表达的人骨形成蛋白2编码基因
NO851308L (no) Genetisk ekspresjon av somatostatin som hybridpolypeptid
JPH08103278A (ja) 活性型ヒトａｌｔの製造方法
CN114774397A (zh) 牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白
CN114249839A (zh) 一种ⅲ型胶原蛋白的融合蛋白、表达系统、药物组合物及应用
NO316704B1 (no) Fremgangsmate for rensing av serinproteaser ved anvendelse av et immobilisert polypeptid med samme aktivitet som inhibitor DE-3 fra E. caffra, samt fremstilling og anvendelse av nevnte polypeptid