DK168823B1 - Fusionsproteiner, hvor ballastandelen består af peptider af interleukin 2, fremgangsmåde til deres fremstilling, deres anvendelse, genstruktur, der koder for et sådant fusionsprotein, vektor indeholdende en sådan genstruktur, og E. coli-celle indeholdende en sådan vektor. - Google Patents

Description

DK 168823 B1

Den foreliggende opfindelse angår fusionsproteiner med en andel af interleukin-2 (IL-2) og et onsket protein, en fremgangsmåde til fremstilling af fusionsproteinerne, en anvendelse af fusionsproteinerne, en genstruktur, der koder 5 for et sådant fusionsprotein, en vektor indeholdende en sådan genstruktur, og en E. coli-celle indeholdende en sådan vektor.

I EP offentliggørelsesskrift nr. 158.198 beskrives et fusionsprotein, som består af et peptid af humant inter-10 feron og et peptid af humant interleukin-2, og som udviser den biologiske aktivitet af begge peptider.

Der er endvidere allerede foreslået fusionsproteiner, der er karakteriseret ved en C- eller N-terminal andel, som i det væsentlige svarer til de første hundrede 15 aminosyrer af interleukin-2 (jfr. DE-patentansøgning nr. 3.541.856). Interleukin-2-andelen kan herved være afledt af pattedyr-interleukin-2, f.eks. af muse- eller rotte--interleukin-2, der er kendt fra offentliggjort EP-ansøg-ning nr. 91.539, fortrinsvis af humant interleukin-2.

20 Disse fusionsproteiner er overraskende stabile i værtscellen og kan på grund af deres ringe opløselighed let skilles fra de opløselige værtsegne proteiner.

Ved en videreudvikling af denne opfindelsesidé har det nu overraskende vist sig, at også væsentligt mindre 25 dele af interleukin-2-molekylet, som i modsætning til den fra EP-A-158.198 kendte teknik ikke er biologisk aktive, er engede som ballast-andel for sådanne fusionsproteiner.

Opfindelsen angår således fusionsproteiner med en andel af interleukin-2 og et ønsket protein, hvilke fusions-30 proteiner er ejendommelige ved en C- eller N-terminal andel, der i det væsentlige svarer til aminosyresekvensen af IL-2, fortrinsvis humant IL-2, men ikke er biologisk aktiv, med undtagelse af fusionsproteiner, hvis IL-2-andel i det væsentlige svarer til mindst de første 100 aminosyrer af IL-2.

35 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstil ling af fusionsproteiner ifølge opfindelsen, hvilken frem- DK 168823 B1 2 gangsmåde er ejendommelig ved, at et for fusionsproteinet kodende gen bringes til ekspression i E. coli.

Opfindelsen angår desuden anvendelsen af fusionsproteiner ifølge opfindelsen eller de ifølge opfindelsen frem-5 stillede fusionsproteiner til fremstilling af de ønskede proteiner.

Opfindelsen angår endvidere en genstruktur, kodende for et fusionsprotein ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår yderligere en vektor, indeholdende 10 en genstruktur ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår endelig også en E. coli-celle, indeholdende en vektor ifølge opfindelsen.

Der gås særlig fordelagtigt ud fra det syntetiske gen for humant interleukin-2 (i det følgende betegnet 15 IL-2), der er beskrevet i EP-A 163.249 og er gengivet i bilaget. Dette syntetiske gen indeholder en række af singulære restriktions-spaltningssteder, der gør det muligt at spalte det for IL-2 kodende DNA i "håndterlige" segmenter. Med disse segmenter kan ballastandelen for 20 fusionsproteiner skræddersyes efter byggeklodsprincippet, hvorved der alt efter kombinationen af segmenterne og arten af det ønskede protein fås let- til tungt-opløselige fusionsproteiner.

Ifølge opfindelsen er det altså muligt, alt efter 25 den mulige eller ønskede oparbejdning af produktet at styre den fordelagtigste opløselighed, altså en høj opløselighed, når produktet skal renses chromato-grafisk, f.eks. ved hjælp af en antistof-søjle, eller en ringe opløselighed, når der til forrensning skal 30 fraskilles værtsegne opløselige proteiner, f.eks. ved centrifugering.

En særlig fordel ved opfindelsen ligger deri, at der kan fremstilles fusionsproteiner med en meget lille ballastandel, da det relative udbytte af ønsket 35 protein herved forøges betydeligt.

DK 168823 B1 3

Et yderligere fortrin ved opfindelsen ligger i, at ballast-andelen kan konstrueres således, at den hindrer den rumlige struktur af det ønskede protein mindst muligt og således f.eks. ikke forhindrer en 5 opfoldning.

Ved spaltningen af fusionsproteinerne fås der foruden det ønskede protein ballastandelen, altså IL-2-derivatet, som ikke er biologisk aktivt.

Særlig hensigtsmæssige udførelsesformer for 10 opfindelsen forklares i det følgende ved hjælp af det syntetiske gen, som er beskrevet i EP-A 163.249.

Dette gen er ved 5'-enden spaltet med restriktionsendo-nucleasen EcoRI og ved 3'-enden med Sall. Ud over de tre singulære restriktionsspaltningssteder for enzymerne 15 Pstl, Xbal og SacI, der har tjent til konstruktion af dette gen, er også de singulære spaltningssteder for Mlul og Pvul anordnet gunstigt. Hvis sekvenserne, der ligger mellem disse spaltningssteder, betegnes A til F, kan det syntetiske gen gengives på følgende syste-20 matiske måde: (EcoRI)-A-Psti-B-Mlul-C-XbaI-D-SacI-E-PvuI-F-(Sall).

Segmenterne A til F udgør således særligt egnede 25 "byggesten" til det her omhandlede byggeklodssystem.

I denne gengivelse svarer "ballastandelen" for fusionsproteinerne svarende til DE-patentansøgning nr. 3.541.856 til segmenterne A til E, og det i den samme ansøgning nævnte bifunktionelle protein med det samlede IL-2-gen 30 svarer til alle segmenterne A til F. Derimod vedrører genkonstruktionerne ifølge opfindelsen andre kombinationer af segmenterne A til F, fortrinsvis med mindre end fire af disse segmenter, hvorved segmentet A koder N-terminussen af fusionsproteinet. Anordningen af de yderligere segmenter 35

O

DK 168823 B1 4 er vilkårlig, idet der eventuelt anvendes tilsvarende adaptorer eller linkere. Tilsvarende adaptor- eller linkersekvenser kan også indføres ved C-terminussen af . · "ballastandelen", der i dette tilfælde også kan kode 5 for aminosyrer eller korte aminosyresekvenser, som muliggør eller letter enzymatisk eller kemisk fraspalt-ning af "ballastandelen" fra det ønskede protein. Adaptor-eller linkersekvenserne kan naturligvis også tjene til at skræddersy "ballastandelen" til et bestemt fusionsprotein, 10 f.eks. til opnåelse af en ønsket opløselighed. Det har nemlig overraskende vist sig, at opløseligheden af fusionsproteinerne ikke er afhængig af molekyl-størrelsen, men at også relativt små molekyler kan udvise en ringe opløselighed. Med kendskab til disse sammenhænge, 15 der er forklaret i enkeltheder i eksemplerne, kan en fagmand således uden større eksperimentelt opbud ifølge opfindelsen fremstille fusionsproteiner med lille "ballastandel", der udviser bestemte ønskede egenskaber.

Når det ønskede protein er et eukaryotisk protein, 20 fås der altså ifølge opfindelsen fusionsproteiner, der udelukkende eller praktisk taget udelukkende består af eukaryotiske proteinsekvenser. Overraskende erkendes disse fusionsproteiner imidlertid ikke som fremmedpro-teiner af prokaryotiske værtsceller og nedbrydes ikke 25 hurtigt af værtsegne proteaser. Denne nedbrydning sker særligt hyppigt hos af cDNA-sekvenser kodede, værtsfremmede proteiner, der skal eksprimeres i bakterier.

Det har nu vist sig, at cDNA-sekvenser kan eksprimeres særdeles effektivt, når de "indlejres" i de her omhandlede 30 segmenter. Hertil kan der konstrueres specielle lektorer, der mellem de her omhandlede sekvenser indeholder en polylinker-sekvens^ der udviser flere kloningssteder for cDNA-sekvenserne. Hvis det indklonede cDNA ikke indeholder et stop-kodon, beskyttes den af cDNA-sekven-35 sen kodede polypeptidsekvens yderligere af polypeptidet, for hvilket det C-terminale segment koder.

O

5 DK 168823 B1

Spaltningen af fusionsproteinet kan på i og for sig kendt måde ske kemisk eller enzymatisk. Udvælgelsen af den egnede metode retter sig frem for alt efter amino-syresekvensen af det ønskede protein. Når dette 5 f.eks. ikke indeholder methionin, kan bindeleddet betyde Met, hvorved der sker en kemisk spaltning med chlor- eller bromcyan. Hvis der i bindeleddet ved carboxyterminussen foreligger cystein, eller bindeleddet betyder Cys, kan der ske en enzymatisk cysteinspecifik 10 spaltning eller en kemisk spaltning, f.eks. efter specifik S-cyanylering. Hvis der i broleddet ved carboxy-terminussen foreligger tryptophan, eller bindeleddet betyder Trp, kan der ske en kemisk spaltning med N--bromsuccinimid.

15 Ønskede proteiner, der i deres aminosyresekvens ikke indeholder Asp-Pro og er tilstrækkelig syrestabile, kan som fusionsproteiner med dette broled på i og for sig kendt måde spaltes proteolytisk. Herved fås proteiner, der N-terminalt indeholder prolin eller Oterminalt 20 indeholder asparaginsyre. På denne måde kan der altså også syntetiseres modificerede proteiner.

Asp-Pro-bindingen kan også gøres mere syrelabil, når dette broled er (Asp)n~Pro eller Glu-(Asp)n~Pro, hvori n betyder 1 til 3.

25 Eksempler på enzymatiske spaltninger er ligeledes kendte, idet der også kan anvendes modificerede enzymer med forbedret specificitet (jfr. C.S. Craik et al.,

Science 228 (1985) 291-297). Hvis det ønskede eukaryo-tiske peptid er proinsulin, vælges der hensigtsmæssigt 30 en peptidsekvens, ved hvilken en med trypsin fraspaltelig aminosyre (Arg, Lys) er bundet til den N-terminale aminosyre (Phe) af proinsulin, f.eks. Ala-Ser-Met-Thr-Arg, da der da kan ske en arginin-specifik spaltning med proteasen trypsin.

35 Hvis det ønskede protein ikke indeholder aminosyre- sekvensen DK 168823 B1 6

Ile-Glu-Gly-Arg kan fusionsproteinet med det tilsvarende broled spaltes med faktor Xa (EP-A 25.190 og 161.973).

5 Fusionsproteinet fås ved ekspression på i og for sig kendt måde i E. coli.

DNA-sekvensen, som koder for det ønskede protein, indbygges på kendt måde i en vektor, som sikrer en god ekspression i E. coli.

10 Man vælger hensigtsmæssigt promotoren og operatoren blandt lac, tac, trp, Pj, eller PR af λ-fag, hsp, omp eller en syntetisk promotor, som den f.eks. er foreslået i DE-offentliggørelsesskrift nr. 3.430.683 (EP-A 173.149). Fordelagtig er tac-promotor-operator-sekvensen, som i mellem-15 tiden er blevet handelsgængs (f.eks. ekspressionsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).

Ved ekspressionen af det her omhandlede fusionsprotein kan det vise sig at være hensigtsmæssigt at 20 ændre enkelte tripletter for de første aminosyrer efter ATG-start-codonnet for at forhindre en eventuelt baseparring på mRNA-plan. Sådanne ændringer, ligesom ændringer, udeladelser eller tilføjelser af enkelte aminosyrer i IL-2-proteinandelen, 25 er gængse for en fagmand og ligeledes omfattet af opfindelsen. Der kan f.eks. nævnes en fjernelse af cystein eller en erstatning af cystein med andre aminosyrer for at forhindre en dannelse af uønskede disulfid-broer, således som det f.eks. er kendt fra EP-A 109.748.

30 Fig. 1-13 på tegningen anskueliggør som i et reaktions skema fremgangsmåden ved de i eksemplerne med samme numre beskrevne synteser. Til lettelse af oversigten er fremstillingen af udgangsmaterialerne og mellemprodukterne vist i fig. A til C. Til forbedring af overskueligheden 35 begynder henvisningstallene i fig. 1-13 med en ny lOer-række, altså i fig. 1 med (11). Henvisningstal

O

DK 168823 B1 7 for udgangsmaterialer, der ikke er genstand for den foreliggende opfindelse, eller på 0, altså f.eks. i fig. 2 (20). Figurerne er ikke tegnet i korrekt målestok, idet målestokken især i området af polylinker-sekvenserne er 5 strakt tilsvarende. IL-2-sekvenser er karakteriseret ved tykke linier, og strukturgener for ønskede proteiner er fremhævet på anden måde.

Fig. A viser en oversigt over de her omhandlede segmenter A til F henholdsvis segmentkombinationen A og B.

10 Udgangsmaterialet er plasmidet pl59/6, hvis fremstilling er indgående beskrevet i EP-A 163.249, og som er karakteriseret i fig. 5 i dette trykskrift.

Fig. B viser ekspressionsplasmidet pEWlOOO, hvis fremstilling er beskrevet i DE-patentansøgning nr.

15 3.541.856, og som er vist i dettes fig. 1. Ved tilsvarende dobbeltnedbrydning åbnes dette plasmid i polylinker--sekvensen, hvorved der fås de lineariserede plasmider (Exl) til (Ex4).

Fig. C viser fremstillingen af pUCl2-derivatet pW226 20 og af ekspressionsplasmidet pW226-l, der begge indeholder segmenterne A og F, adskilt af en polylinker-sekvens.

Fig. 1 viser fremstillingen af pUC12-derivatet pKH40 og ekspressionsplasmidet pK40, der koder for fusionsproteiner, hvori der efter proteinsekvensen sva-25 rende til segment A, altså de første 22 aminosyrer af IL-2, følger broleddet Thr-Arg, hvorefter der følger aminosyresekvensen af proinsulin.

Fig. 2 viser konstruktionen af plasmidet pSLll og ekspressionsplasmidet pSL12, der koder for 30 polypeptider, hvori der efter segmentet A følger et broled svarende til polylinkersekvenserne (2) og (20a), og hvorefter der følger aminosyresekvensen af proinsulin.

Fig. 3 viser konstruktionen af ekspressionsplasmidet pK50, der koder for et polypeptid, ved hvilket der 35 efter segmenterne A og B, altså de første 38 aminosyrer af IL-2, umiddelbart følger aminosyresekvensen af proinsulin.

O

DK 168823 B1 8

Fig. 4 viser konstruktionen af ekspressionsplasmidet pK51, der koder for et polypeptid, ved hvilket der efter segmenterne A og B følger et broled svarende til sekvenserne (42) og (41), efter hvilket der følger aminosyresekvensen 5 af proinsulin.

Fig. 5 viser konstruktionen af ekspressionsplasmidet pK52, der adskiller sig fra pK51 ved den indskudte Mlul--linker (51), der koder for aminosyresekvensen, som muliggør en spaltning med faktor Xa. pK52 kan også 10 fås ud fra pK50 (fig. 3) ved spaltning med Mlul og indføjning af den nævnte Mlul-li'nker.

Fig. 6 viser konstruktionen af ekspressionsplasmidet pK53 ud fra pK51 (fig. 4) , ligeledes ved indføjning af Mlul-linkeren.

15 Fig. 7 viser konstruktionen af ekspressionsplasmidet pSLl4 ud fra pSL12 (fig. 2) ved indføjning af fragmentet C i polylinkeren. Herved tilføjes segmentet C umiddelbart til segmentet A. I den følgende polylinker svarer de første to aminosyrer (hver gang Glu) til aminosyrerne 20 60 og 61 af IL-2. Således består IL-2-andelen altså af aminosyrerne 1-22 og 37-61. Den videre aminosyre-sekvens svarer til den, der koder for plasmidet pSL12 (fig. 2).

Fig. 8 viser konstruktionen af ekspressionsplasmidet 25 pPH31, der koder for et fusionsprotein, ved hvilket der efter segmenterne A til C følger et broled, der er vist i sekvensen (81), hvorefter der følger aminosyresekvensen af proinsulin.

Fig. 9 viser konstruktionen af plasmidet pK192, 30 der koder for et fusionsprotein, hvori der efter segmenterne A og B følger methionin og herefter aminosyresekvensen af hirudin.

Fig. 10 viser konstruktionen af plasmidet pW214, der koder for et fusionsprotein, hvor der efter segmenterne 35 A og B følger aminosyresekvensen, der muliggør en spaltning med faktor Xa, og hvorefter der følger aminosyresekvensen

O

9 DK 168823 B1 af granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor (CSF).

Fig. 11 viser konstruktionen af ekspressionsplas-midet pW233, der koder for et fusionsprotein, hvori der efter segmenterne A og C (svarende til aminosyrerne 1-22 5 og 37-61 af IL-2) følger broleddet Leu-Thr-Ile-Asp-Asp-Pro, hvorefter der følger aminosyresekvensen af CSF.

Fig. 12 viser konstruktionen af ekspressionsplas-midet pW234, der koder for et fusionsprotein med følgende aminosyresekvens: Efter segmentet A (aminosyre 1-22) 10 følger et broled Thr-Arg, herefter segmentet D (aminosyre 59-96 af IL-2), som yderligere bindeled Thr-Asp-Asp-Pro og endelig CSF.

Fig. 13 viser konstruktionen af plasmiderne pH200 og pH201 samt ekspressionsplasmidet pH202. Disse 15 plasmider har en polylinker anordnet mellem segmenterne A og F henholdsvis A, B og F, i hvis talrige spaltningssteder der kan klones fremmed-DNA. disse plasmider er særlig egnede til kloning af cDNA-sekvenser.

I de følgende eksempler, hvis nummerering stemmer 20 overens med figurerne, forklares opfindelsen nærmere.

Hvis der ikke er anført andet, er procentangivelserne på vægtbasis.

Eksempel A

25 Udgangsplasmidet pl59/6 er beskrevet i EP-A

163.249 (fig. 5). Den der som HIL-2M eller i teksten som "DNA-sekvens I" definerede sekvens er i fig. A opdelt i segmenterne A til F, der er begrænset af spaltningsstederne for enzymerne EcoRI, PstI, Mlul, 30 Xbal, SacI, Pvul og Sall. Ved dobbeltnedbrydning med de tilsvarende enzymer fås segmenterne (A) til (F) eller også sammenhængende segmenter, f.eks. med EcoRI og Mlul segmentet (A, B).

35 Eksempel B

Fremstillingen af ekspressionsplasmidet pEWlOOO

DK 168823 B1 10 er foreslået i DE-patentansøgning nr. 3.541.856 (fig. 1).

Dette plasmid er et derivat af plasmidet ptac 11 (Amann et al., Gene 25 (1983) 167-178), ved hvilket der i genkendelsesstedet for EcoRI er indbygget en syntetisk sekvens, der 5 indeholder et Sall-spaltningssted. Der fås på denne måde ekspressionsplasmidet pKK 177.3. Ved indføjelse af lac-re-pressoren (Farabaugh, Nature 274 (1978) 765-769) fås plasmidet pJF118. Dette åbnes ved det singulære restriktionsspaltningssted for Aval og forkortes ca. 1000 bp på kendt 10 måde ved exonucleasebehandling og ligeres. Der fås plasmidet pEWlOOO. Ved åbning af dette plasmid i polylinkeren med enzymerne EcoRI og Hindlll, Sall, PstI eller Smal fås de lineariserede ekspressionsplasmider (Exl), (Ex2), Ex3) og Ex4).

15

Eksempel C

Det handelsgængse plasmid pUC12 åbnes med EcoRI og Sall, og det lineæriserede plasmid (1) isoleres.

Ved ligering af (1) med segmentet (A), den syntetiske 20 linkersekvens (2) og segmentet (F) fås plasmidet pW226 (3) .

Stammen E. coli 79/02 transformeres på kendt måde med plasmid-DNA af ligeringsblandingen. Cellerne udplades på agarplader, der indeholder isopropyl-β-D-25 -thiogalacto-pyranosid (IPTG), 5-brom-4-chlor-3--indolyl-6-D-galactopyranosid (X-gal) samt 20 pg/ml ampicillin (Ap). Af hvide kloner udvindes plasmid-DNA, og ved restriktionsanalyse og DNA-sekvensanalyse bekræftes dannelsen af plasmidet (3).

30 Fra plasmidet (3) udskæres og isoleres det lille EcoRI-Hindlll-fragment (4). Dette ligeres ved en T4-DNA-ligasereaktion med det lineariserede ekspres-sionsplasmid (Exl). Det dannede plasmid pW226-l (5) karakteriseres ved restriktionsanalyse.

35 Kompetente celler af stammen E. coli Mc 1061 transformeres med DNA fra plasmidet pW226-l. Kloner, som DK 168823 B1 11 o er resistente mod ampicillin, isoleres på Ap-holdige agarplader. Plasmid-DNA isoleres igen fra Mc"1061-celler og karakteriseres derefter på ny ved restriktionsanalyse. Kompetente celler af E. coli-stammen W 3110 transformeres 5 nu med plasmid-DNA, der er isoleret fra E. coli

Me 1061-celler. E. coli W 3110-celler benyttes i det følgende altid til ekspression. Svarende til de følgende betingelser gennemføres alle ekspressionsforsøg i de angivnes eksempler.

10 En kultur natten over af E. coli-celler, der indeholder plasmidet (5), fortyndes i forholdet ca.

1:100 med LB-medium (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) , som indeholder 50 pg/ml ampicillin, og væksten 15 følges ved OD-måling. Ved en OD-værdi på 0,5 indstilles kulturen til 1 mM IPTG, og bakterierne fracentrifugeres efter 150-180 minutter. Bakterierne koges i 5 minutter i en pufferblanding (7 M urinstof, 0,1% SDS, 0,1 M natriumphosphat, pH-værdi 7,0), og prøver anbringes på 20 en SDS-gelelektroforeseplade. Efter elektroforese fås der fra bakterier, som indeholder plasmidet (5), et proteinbånd, der svarer til størrelsen af det forventede protein (6 kD).

De angivne induktionsbetingelser gælder for 25 rystekulturer. Ved større fermenteringer er tilsvarende ændrede OD-værdier og eventuelt let varierede IPTG--koncentrationer hensigtsmæssige.

Det fremkomne protein udviser ingen biologisk aktivitet ved en celleproliferationstest med en IL-2-30 -afhængig cellelinie (CTLL 2).

Eksempel 1

Plasmidet (3) åbnes med Mlul og Sall, og de to dannede fragmenter skilles gelelektroforetisk fra hinanden.

35 Det store fragment (11) isoleres.

DK 168823 Bl

O

12

Det syntetiske oligonucleotid (12) ligeres med det for proinsulin kodende DNA med stumpe ender (13) (Wetekam et al., Gene 19 (1982) 179-183), hvorved der fås DNA-sekvensen (14). Denne spaltes med Mlul og 5 Sall, hvorved der fås DNA-sekvensen (15). Denne ligeres nu med fragmentet (11), hvorved der dannes plasmidet pKH40 (16). Dette karakteriseres ved restriktionsanalyse.

Plasmidet (16) nedbrydes med EcoRI og Hindlll, og det lille fragment (17) isoleres ved gelelektroforese.

10 Ved ligering med det lineariserede ekspressionsplasmid (Exl) fås ekspressionsplasmidet pK40 (18). Ved ekspressionen ifølge eksempel C fås et protein, som efter celle-oplukning findes i den opløselige cellulære proteinfraktion. Den intakte proinsulinsekvens påvises ved "Western Blot"-15 -teknik.

Eksempel 2

Udgangsproduktet er plasmidet pPH30, som er vist i (ikke offentliggjort) DE-patentans,øgning nr. 3.541.856 20 i fig. 3c. Svarende til den foreliggende opfindelse er IL-2-delsekvensen vist i fig. 2 som "A-E" (20). Enden af denne sekvens og broleddet indtil proinsulinsekvensen er i fig. 2 vist som (20a).

Plasmidet (20) nedbrydes med Pvul og Hindlll 25 og det lille fragment (22) isoleres. Endvidere åbnes plasmidet (3) med EcoRI og Pvul, og det lille fragment (23) isoleres. Desuden nedbrydes vektoren pUC12 med EcoRI og Hindlll, og det store fragment (21) isoleres. Ved ligering af fragmenterne (21), (23) og (22) fås plasmidet 30 pSLll (24).

Plasmidet (24) nedbrydes med Hindlll og partielt med EcoRI, og fragmentet (25), som indeholder segmentet A og proinsulingenet, isoleres. Ved ligering af (25) i det lineariserede ekspressionsplasmid (Exl) fås eks-35 pressionsplasmidet pSL12 (26).

O

13 DK 168823 B1

Ekspressionen ifølge eksempel C og den efterfølgende oparbejdning giver et opløseligt fusionsprotein. "Western Blot"-analyse med insulin-antistoffer bekræfter, at dette protein indeholder den intakte insulinsekvens.

5

Eksempel 3

Til forstærkning af proinsulingenet anvendes plasmidet ptrpED5-l (30) (Hallewell et al. Gene 9 (1980) 27-47). Dette åbnes med Hindlll og Sall, og det store 10 fragment (31) isoleres. Fragmentet (31) ligeres med DNA-sekvensen (14), hvorved der fås plasmidet pH106/4 (32).

Plasmidet (32) nedbrydes med Sall og Mlul og det lille fragment (15) isoleres. Det lineariserede 15 ekspressionsplasmid (Ex2), segmentet (A, B) og fragmentet (15) ligeres nu, hvorved der fås ekspressionsplasmidet pK50 (33).

Ekspressionen af det kodede fusionsprotein gennemføres ifølge eksempel C. Cellerne fracentrifugeres derefter 20 fra kulturvæsken og opbrydes i en "French-Press". Proteinsuspensionen adskilles nu ved centrifugering i sine opløselige og uopløselige proteinbestanddele. De to fraktioner analyseres ved hjælp af gelelektroforese på kendt måde på 17,5%'s SDS-polyacrylamidgeler og 25 efterfølgende farvning af proteinerne med farvestoffet Coomassie Blue. Det viser sig overraskende, at fusionsproteinet findes i det uopløselige bundfald. "Western Blot"-analyse med insulin-antistoffer bekræfter, at der foreligger intakt proinsulin i fusionsproteinet.

30 Sedimentet fra "French-Press"-oplukningen kan nu videreanvendes direkte til isolering af proinsulin.

Eksempel 4

Udgangsproduktet er plasmidet pPH20 (40), som er 35 vist i DE-patentansøgning nr. 3.541.856 i fig. 3c. Ved opskæring af dette plasmid med EcoRI, opfyldning af de

O

DK 168823 B1 14 udragende ender og spaltning med Hindlll fås fragmentet (41) , af hvilket DNA-sekvensen af den her interessante del af (40) fremgår.

Ved ligering af det lineariserede ekspressionsplasmid 5 (Ex4) med segmentet (A, B), det syntetiske oligonucleotid (42) og fragmentet (41) fås plasmidet pK51 (43).

Eksempel 5

Ved ligering af det lineariserede ekspressionsplasmid 10 (Ex2) med segmentet (A, B), det syntetiske oligonucleotid (51) og DNA-sekvensen (15) fås plasmidet pK52 (52).

Den rigtige orientering af oligonucleotidet (51) bestemmes ved sekvensanalyse. Plasmidet koder for et fusionsprotein, der indeholder aminosyresekvensen sva-15 rende til oligonucleotidet (51) og således kan spaltes med aktiveret faktor Xa.

Plasmidet (52) kan fås på følgende måde:

Hvis plasmidet (33) spaltes partielt med Mlul, og det fremkomne åbnede plasmid (53) ligeres med DNA-20 -sekvensen (51), fås ligeledes plasmidet pK52.

Eksempel 6

Hvis plasmidet (43) spaltes partielt med Mlul, og det fremkomne lineariserede plasmid (61) ligeres med 25 syntetiske DNA-sekvens (51), fås plasmidet pK53 (62). Dette koder ligeledes for et fusionsprotein, der kan spaltes med aktiveret faktor (Xa). Den rigtige orientering af sekvensen (51) fastlægges som i eksempel 5 ved DNA-sekvensanalyse.

30

Eksempel 7

Plasmidet (26) spaltes med Xbal og partielt med Mlul, og det store fragment (71) isoleres. Ved ligering med segmentet (C) fås plasmidet pSL14 (72). Efter 35 ekspression og celleoplukning findes fusionsproteinet i den opløselige cellulære proteinfraktion.

15 DK 168823 B1

O

Eksempel 8

Plasmidet (20) spaltes med Xbal og partielt med EcoRI, og de udragende ender opfyldes, hvorved der fås DNA-sekvensen (81). Ved ligering under "blunt end"-5 -betingelser fås plasmidet pPH31 (82). Fusionsproteinet findes i den uopløselige cellulære proteinfraktion.

Eksempel 9

Som· udgangsmateriale anvendes plasmidet (90), 10 som er beskrevet i EP-A 171.024 (fig. 3). Dette plasmid omsættes med Sall og derefter med Accl, og det lille fragment (91) isoleres. Dette ligeres med det syntetiske oligonucleotid (92), hvorved der fås DNA-sekvensen (93). Denne spaltes med Mlul, hvorved der fås DNA-15 -fragmentet (94).

Plasmidet (33) nedbrydes partielt med Mlul og Sall, og det store fragment (95) isoleres. Dette ligeres med DNA-sekvensen (94), hvorved der fås ekspressionsplasmidet pK192 (96). Dette koder for et fusionsprotein, i hvilket 20 der efter de første 38 aminosyrer af IL-2 følger methionin og herefter aminosyresekvensen af hirudin. Fusionsproteinet findes i den opløselige cellulære proteinfraktion.

Eksempel 10 25 Som udgangsmateriale anvendes plasmidet pHG23 (100), som er beskrevet i EP-A 183.350 og er almindeligt tilgængeligt fra American Type Culture Collection under nr. ATCC 39.000. Dette plasmid spaltes med SfaNI, de udragende ender opfyldes, der omsættes derefter med 30 PstI, og det lille fragment (101) isoleres. Ved ligering af det lineariserede ekspressionsplasmid (Ex3) med segmentet (A, B), det syntetiske oligonucleotid (102) og fragmentet (101) fås ekspressionsplasmidet pW214 (103). Dette plasmid koder for et fusionsprotein, hvori 35 der efter de første 38 aminosyrer af IL-2 følger sekvensen af oligonucleotidet (102), der muliggør spaltning af %

O

DK 168823 B1 16 molekylet med faktor Xa, hvorefter der følger aminosyre-sekvensen af CSF. Efter celleoplukning findes fusionsproteinet i den uopløselige cellulære proteinfraktion.

5 Eksempel 11

Udgangsplasmidet pW216 (110) er foreslået i DE-patentansøgning nr. 3.545.568 (fig. 2b). I dette plasmid følger der efter IL-2-sekvensen svarende til segmenterne A til E (Pvul-spaltningssted) en linker, der 10 koder for aminosyrerne Asp-Asp-Pro, umiddelbart efterfulgt af aminosyresekvensen for CSF. Forbindelsessekvensen mellem IL-2 og CSF muliggør proteolytisk spaltning af fusionsproteinet.

Fra plasraidet (110) isoleres der ved spaltning 15 med Pvul og Hindlll sekvensen (111).

Plasmidet (3) spaltes med Mlul og Xbal, og det store fragment (112) isoleres. Dette ligeres med segmentet (C), hvorved der fås plasmidet pW227 (113). Dette plasmid omsættes med EcoRI og Hindlll, og det korte 20 fragment (114) isoleres. Hvis dette fragment ligeres med det lineariserede ekspressionsplasmid (Exl), fås plasmidet pW227-l (115). Plasmidet koder for et af IL-2 afledt protein, som ikke har nogen IL-2-aktivitet.

Plasmidet (113) spaltes endvidere med EcoRI og 25 Pvul, og det korte fragment (116) isoleres. Ved ligering af det lineariserede ekspressionsplasmid (Exl) med fragmenterne (116) og (111) fås ekspressionsplasmidet pW233 (117). Dette koder for et uopløseligt fusionsprotein, som på grund af den ovennævnte linker kan spaltes 30 proteolytisk.

Eksempel 12

Plasmidet (3) spaltes med Xbal og SacI, og det store fragment (121) isoleres. Ved ligering med 35 segmentet (D) fås plasmidet pW228 (122). Dette spaltes med EcoRI og Hindlll, og det lille fragment (123)

O

17 DK 168823 B1 isoleres. Ved ligering af det lineariserede ekspressions-plasmid (Exl) med fragmentet (123) fås ekspressionsplasmidet pW228-l (124). Dette plasmid koder for et biologisk inaktivt IL-2-derivat. Dette nedbrydes med EcoRI og 5 Pvul, og det korte fragment (125) isoleres. Ved ligering af det lineariserede ekspressionsplasmid (Exl) med fragmenterne (125) og (111) fås ekspressionsplasmidet pW234 (126). Dette koder for et tungtopløseligt fusionsprotein, som ligeledes kan spaltes proteolytisk.

10

Eksempel 13

Til konstruktion af plasmider, der især er egnet til ekspression af cDNA-sekvenser, syntetiseres først polylinkersekvensen (131).

15 Ved ligering af det lineariserede plasmid (1) med segmentet (A), polylinkersekvensen (131) og segmentet (F) fås plasmidet pH200 (132).

Plasmidet (132) omsættes med EcoRI og Mlul, og det store fragment (133) isoleres. Hvis dette ligeres 20 med segmentet (A, B), fås plasmidet pH201 (134).

Plasmidet (134) omsættes med EcoRI og.Hindlll, og det korte fragment (135) isoleres. Ved ligering af dette fragment med det lineariserede ekspressionsplasmid (Exl) fås ekspressionsplasmidet pH202 (136).

25 Plasmidet (136) åbnes med BamHI, og i det lineariserede plasmid indføjes cDNA, som skal ekspri-meres, ved hjælp af en handelsgængs BamHI-adapter.

Alt efter orienteringen af cDNA er hver tredje sekvens i aflæsningsrasteret sluttet til (A, B). Når cDNA- 30 -sekvensen ikke indeholder noget stop-codon, beskyttes den deraf kodede polypeptidsekvens yderligere af amino-syresekvensen svarende til segmentet (F).

Hvis cDNA ikke er tilsluttet i det rigtige aflæsningsraster, fås en forskydning af aflæsningsrasteret ved, at

QC

man f.eks. spalter de cDNA-holdige (oprindelige eller

O

DK 168823 B1 18 formerede) plasmider med Mlul eller Xbal (hvis cDNA ikke indeholder spaltningssteder for disse enzymer) og de udragende ender opfyldes ved Klenow-polymerase-reaktion.

5 10 15 20 25 30 35 DK 168823 B1 19

Bill AG

DNA-sekvens I

Triplet nr. 012 aminosyre Met Ala Pro

Nucleotid nr. .

Kod. Strang 5» AA jjq ATG 6C{j ccg

Ikké-kod. streng_^_G TAC CGC GGC

(BeoRI) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Thr Ser Ser Ser Thr lys Lys Thr Gin Leu 20 30 40

ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG

TGG AGA AGA AGA TGG TTT TT C TGA GTT GAC

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Gin Leu Glu His Leu leu Leu Asp leu Gin 50 60 70_

CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG

GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC

PstI

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100

ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA

TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT

33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Asn Pro Lys Leu Thr Ar« Met Leu Thr Phe 110 120 130

AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC

TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG

Mlul DK 168823 B1 20 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160

AAA TTC TAC AT5 CCG AAA AAA GCT ACC GAA

TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT

53 54 55 56 57 58 59 60 61 62

Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu 170 1 80 _ 190

CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG

GAC TTT GT G GAG GT C ACA GAT CTT CTT CTC

Xbal 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 200 210 220

CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG

GAC TTT GGC GAC CTC CTT C AA GAC TTG GAC

73 74 75 76 77 78 79 80 81 82

Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu A rg Pro 230 240 250

GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG

CGA GT C AGA TTT TTA AAG GT G GAC GCA GGC

83 84 85 86 87 88 89 90 91 92

Ars Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 260 270 280

CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC

GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG

93 94 95 96 97 98 99 100 101 102

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 _ 300 310

GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG

CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC

Saol DK 168823 B1 21 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340

TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG

AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC

113 114 115 116 117 118 119 120 121 122

Thr , Ile Val Glu Phe Leu Asn Ar* Trp Ile 350 360 370

ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC

TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG

Pvul 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132

Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr leu 380 390 400

ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG

TGG AAG ACG GT C AGC TAG TAG AGA TGG GAC

133 134 135

Thr 410__ ACC TGA TAG 3' TGG ACT ATC AGC T 5' (Sall)

Claims (10)

1. Fusionsproteiner med en andel af interleukin-2 (IL-2) og et ønsket protein, kendetegnet ved, en C- eller N-terminal andel, der i det væsentlige svarer til 5 aminosyresekvensen af IL-2, fortrinsvis humant IL-2, men ikke er biologisk aktiv, med undtagelse af fusionsproteiner, hvis IL-2-andel i det væsentlige svarer til mindst de første 100 aminosyrer af IL-2.

2. Fusionsproteiner ifølge krav 1, kendeteg-10 net ved, at genet, der koder for IL-2-andelen, omfatter en del af DNA-sekvens I (jf. side 19-21).

3. Fusionsprotein ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det for IL-2-andelen kodende gen i det væsentlige består af 1, 2 eller 3 af segmenterne A til F 15 af IL-2-genet (EcoRI)-A-Pstl-B-Mlul-C-Xbal-D-Sacl-E-Pvul-F-(Sall) i vilkårlig rækkefølge, eventuelt forbundet via adaptor-20 eller linkersekvenser.

4. Fusionsproteiner ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at der mellem IL-2-sekvensen og aminosyresekvensen af det Ønskede protein er anordnet en aminosyre eller aminosyresekvens, 25 der muliggør kemisk eller enzymatisk fraspaltning af det ønskede protein fra IL-2-andelen, fortrinsvis aminosyre Met, Cys, Trp, Lys eller Arg eller en aminosyresekvens, der C-terminalt indeholder disse aminosyrer.

5. Fusionsprotein ifølge krav 4, kendeteg- 30 net ved, at aminosyresekvensen er Asp-Pro eller Ile-Glu-Gly--Arg eller C-terminalt indeholder en sådan aminosyresekvens.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af fusionsproteiner ifølge et eller flere af kravene 1-5, kendetegnet ved, at et for fusionsproteinet kodende gen bringes 35 til ekspression i E. coli. O DK 168823 B1 23

7. Anvendelse af fusionsproteiner ifølge krav 1-5 eller de ifølge krav 6 fremstillede fusionsproteiner til fremstilling af de ønskede proteiner.

8. Genstruktur, kodende for et fusionsprotein 5 ifølge krav 1-5.

9. Vektor, indeholdende en genstruktur ifølge krav 8, især et af plasmiderne pW226, pW226-l, pK40, pSC12, pK50, pK51, pK52, pK53, PSL14, pPH31, pKl92, pW214, pW227, pW227-l, pW233, pW228, pW228-l, pW234, 10 pH200, pH201, pH202.

10· E. coli-celle, indeholdende en vektor ifølge krav 9. 15 20 25 30 35