JPS62167799A - 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−２の最初の１００個のアミノ酸と実
質的に一致するＣ−又はＮ−末端部分を有する融合タン
パク質は既に提案されている（西独特許出願節Ｐ３，５
４１，８５６．７号明細書）。これらのうちインターロ
イキン−２部分は、哺乳類インターロイキン−２、例え
ば公開箱０．０９１，５３９号の欧州特許出願（以下、
“ＥＰ−Ａ″と略する）明細書に開示されているマウス
又はラットのインターロイキン−２に由来していてもよ
いが、ヒトインターロイキン−２に由来していることが
好ましい。これらの融合タンパク質は驚くべきことに宿
主細胞中で安定であって、しかもそれらの溶解性が低い
ため、宿主に固有の可溶性タンパク質から容易に分離す
ることができる。

この発明概念を更に発展させたものとして、インターロ
イキン−２分子の著しく小さな部分がこのタイプの融合
タンパク質の“バラスト（ｂａｌｌａｓｔ　）　”部分
として適していることは、驚くべきことに今ここに見出
されたのである。本発明は特許請求の範囲に規定されて
いる。好ましい態様は以下詳細に説明されている。

ＥＰ−Ａ第０．１６３．２４９号明細書で開示されかつ
表中に記載されたヒトインターロイキン−２（以下、“
ＩＬ−２”と略する）の合成遺伝子から始めることが特
に好都合である。この合成遺伝子は、ＩＬ−２をコード
するＤＮＡを分解して“扱いやすい（ＩＩｌａｎａｇｅ
ａｂ　Ｉ　ｅ）“セグメントにするためのいくつかの独
特な制限切断部位を存している。これらのセグメントを
用い、モジュラ−原理（ｇ＋ｏｄｕｌａｒ　ｐｒｌｎｃ
ｌｐｌｅ　）により融合タンパク質のバラスト部分を調
節するとかできるが、得られる融合タンパク質の溶解性
が高いか低いかは、セグメントの組合せと所望のタンパ
ク質の性質とにかかっている。

このように、本発明では、産物の可能な又は望ましい生
産のために最も有利となるように溶解性を調節すること
ができ、即ち産物がクロマトグラフィー、例えば抗体カ
ラムにより精製されるべき場合には高溶解性に、又は予
備精製として宿主に固有の可溶性タンパク質が例えば遠
心分離によって除去されるべき場合には低溶解性に調節
することができる。

本発明の特に有利な点は、非常に小さい“バラスト部分
″ををする融合タンパク質を生産することができること
であって、それにより所望のタンパク質の相対的収率が
著しく増大するようになる。

本発明のもう一つの利点は、“バラスト部分“が、所望
のタンパク質の空間構造をできる限り阻害せず、その結
果例えば折り重なり（ｆｏｌｄｉｎｇ　ｕｐ）を阻害す
ることのないような方法で構成され得る、ということで
ある。

融合タンパク質の切断により、所望のタンパク質ばかり
ではなく、所謂ＩＬ−２誘導体たる“バラスト部分“も
得られる。これはＩＬ−２活性（Ｔ−細胞増殖試験）を
有していても又はＩＬ〜２レセプターに結合していても
よい。本発明の“モジュラ−原理”は、したがって、多
かれ少なかれある程度のＩＬ−２生物活性を有するＩＬ
−２誘導体を“副産物“として産生ずるためにも利用す
ることができる。

本発明の特に有利な点は、ＥＰ−Ａ第 ０．１６３，２４９号明細書に記載された合成遺伝子に
関して以下に説明されている。この遺伝子は、制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより５′未満で、５ａｌＩ
により３′未満で切断される。このような遺伝子を構成
するために使用された酵素Ｐｓ　ｔ　Ｌ　Ｘｂａ　Ｉ及
びＳａｃ　Ｉ用の三つの独特な制限切断部位の他に、Ｍ
　ｌ　ｕ　Ｉ及びＰｖｕ　Ｉ用の独特な切断部位が存在
していることも好ましい。これら切断部位間に存在する
配列がＡ〜Ｆである場合には、合成遺伝子は概略的に（
ＥｃｏＲＩ）−Ａ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ−Ｂ−Ｍｌｕ　Ｉ−Ｃ
−ＸｂａＩ−Ｄ−ＳａｃＩ−Ｅ−ＰｖｕＩ−Ｆ−（Ｓａ
ｌＩ） で示される。

セグメントＡ〜Ｆは、このように本発明のモジュラ−系
にとって特に適切な“単位″である。上記表示において
、西独特許出願第 Ｐ３，５４１，８５６．７号明細書に記載された融合タ
ンパク質についての“バラスト部分”はセグメントＡ−
Ｅと一致し、同上出願に記載された完全ＩＬ−２遺伝子
を含有する２官能性タンパク質についての“バラスト部
分”はすべてのセグメントＡ〜Ｆと一致する。一方、本
発明の遺伝子構造は、セグメントＡ〜Ｆ、好ましくはこ
れらセグメントのうちの４個未満のセグメントからなる
別の組合せに関するものであるが、ここでセグメントＡ
は融合タンパク質のＮ−末端をコードしている。他のセ
グメント配列は任意的であって、場合により適切なアダ
プター又はリンカ−が使用される。適切なアダプター又
はリンカ−配列も“バラスト部分”のＣ−末端に導入す
ることができるが、この場合において、それらは酵素的
又は化学的に所望のタンパク質からの“バラスト部分“
の切除を可能ならしめ又は促進させるようなアミノ酸又
は短鎖アミノ酸配列をコードすることができる。

アダプター又はリンカ−配列は、特定の融合タンパク質
についての”バラスト部分”を調節するために、例えば
所望の溶解性を達成するためにも当然利用することがで
きる。これと関連するが、融合タンパク質の溶解性は分
子の大きさとは無関係であり、逆に比較的小さな分子で
あっても低溶解性であることが驚くべきことに判明した
のである。

下記諸例中に詳細に説明されているこれらの関連性から
明らかなように、当業者であればさほど実験上の労苦を
することがなく、小さな“バラスト部分”を有しかつ特
定の望ましい性質を有する本発明の融合タンパク質を得
ることができる。

したがって、所望のタンパク質が真核細胞タンパク質で
ある場合には、本発明により得られる融合タンパク質は
全面的には又は事実上全面的に真核細胞タンパク質配列
からなる。しかしながら、驚くべきことに、タンパク質
は原核宿主細胞において外来タンパク質として認識され
ないため、宿主に回付のプロテアーゼにより急速に分解
されることはない。このような分解は、宿主にとって外
来でありかつ細菌中で発現すべきｃＤＮＡ配列によって
コードされるタンパク質の場合に特に頻発する。ｃＤＮ
Ａ配列が本発明のセグメント中に“埋め込まれ”ている
場合にこのｃＤＮＡ配列は極めて効果的に発現し得るこ
とが今ここに判明したのである。ｃＤＮＡ配列に関して
いくつかのクローニング部位を有するポリリンカー配列
を本発明の配列中に含有する特定のベクターを上記目的
のために製造することができる。複製されたＣＤＮＡが
停止コードンを有していない場合には、ｃＤＮＡ配列に
よりコードされるポリペプチド配列はＣ−末端セグメン
トがコードするポリペプチドによって付加的に保護され
る。

融合タンパク質は化学的又は酵素的に自体公知の方法に
より切断することができる。適切な方法をいかに選択す
るかは、特に所望のタンパク質のアミノ酸配列にかかっ
ている。後者が例えばメチオニンを有していない場合に
は、結合要素はＭｅｔを表わすことができ、このときに
は塩化もしくは臭化シアンによる化学的切断が行なわれ
る。

結合要素のカルボキシル末端にシスティンが存在する場
合、即ち結合要素がＣｙｓを表わす場合には、例えば特
異的Ｓ−シアニル化後にシスティン特異性の酵素的切断
又は化学的切断を行なうことができる。結合要素のカル
ボキシル末端にトリプトファンが存在する場合、即ち結
合要素がＴｒｐを表わす場合には、Ｎ−ブロモスクシン
イミドによる化学的切断が行われる。

自己のアミノ酸配列中にちＡｓｐ−Ｐｒｏを有せず、か
つ酸に対して十分に安定である所望のタンパク質は、融
合タンパク質が上記結合要素を有する場合に、自体公知
の方法によってタンパク質分解により切断することがで
きる。その結果、Ｎ−末端にプロリンを有するか又はＣ
−末端にアスパラギン酸を有するタンパク質が得られる
。したがって、この方法により改変タンパク質を合成す
ることもできる。

この結合要素（Ａｓｐ）　　−Ｐｒｏ又はＧｌｕ−（Ａ
ｓｐ）　　　−Ｐｒｏであり、ｎが１〜３を表わす場合
には、Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合は酸に対する安定が低くなる
ことがある。

酵素的切断の例も同様に公知であり、改善された特異性
をもつ改変酵素を使用することもできる（Ｃ，！Ｉｆ、
　Ｃｒａｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２
８（１９８５）２９１−２９７参照〕。所望の真核細胞
ペプチドがプロインシュリンである場合に選択される配
列は、トリプシンによる切断が可能なアミノ酸（Ａ　ｒ
　ｇ。

Ｌｙｓ）がプロインシュリンのＮ−末端アミノ酸（Ｐｈ
ｅ）結合しているペプチド配列、例えばＡｌａ−８ｅｒ
−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇであることが有利であるが、
その理由はこの場合においてアルギニン特異的切断がト
リプシンプロテアーゼによって行ない得るからである。

所望のタンパク質がアミノ酸配列： １１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ を有していない場合には、適切な結合要素を有する融合
タンパク質はＸａ囚子により切断することができる（Ｅ
Ｐ−Ａ第０．０２５，１９０号及び第０．１６１，９７
３号明細書）。

融合タンパク質は、自体公知の方法により適切な発現系
で発現させることによって得られる。すべての公知の宿
主−ベクター系、即ち、例えば補乳類細胞及び、酵母、
好ましくは細菌、特に大腸菌等の微生物はかかる目的の
ために適している。

所望のタンパク質についてコードするＤＮＡ配列は、選
択された発現系での満足すべき発現を確実化するベクタ
ー中に公知の方法で組込まれる。

細菌宿主においては、１ａｃｓ　ｔａｃ、ｅｒｐｓファ
ージλのＰ　もしくはＰＲ，ｈｓ　ｐ、ｏｍｐｌ。

又は例えば西独特許公開節３，４３０，６８３号（ＥＰ
−Ａ第０．１７３，１４９号）明細書で開示されている
ような合成プロモーターからなる群よりプロモーター及
びオペレーターを選択することが有利である。ｔａｃプ
ロモーター−オペレーター配列が有利であり、現在市販
されている〔例えば、発現ベクターｐＫＫ２２３−３、
ファルマシア（Ｐｂａｒａ＋ａｃｉａ　）、”Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｉｃａｌｓ。

ＣＩ＋ｅｍｉｃａｌｓ　ａｎｄ　ＩＥｑｕｉｐａ＋ｅｎ
Ｌ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ−＋ｏｇｙ’
　１９８４年、第６３頁〕。

本発明による融合タンパク質の発現に際し、ｍＲＮＡレ
ベルでの塩基の対合を阻止するために、ＡＴＧ開始コー
ドン下流の最初の数個のアミノ酸に関して個々のトリブ
レットを改変することが有利のようである。このタイプ
の改変は、■ｔ、−２タンパク質部分における個々のア
ミノ酸の改変、削除又は付加と同様に、当業者にとって
周知であり、本発明は同様にそれらにも関する。望まし
くないジスルフィド結合の形成を防止するためのシステ
ィンの削除又は他のアミノ酸によるシスティンの置換は
、例えばＥＰ−Ａ第１０９，７４８号明細書に開示され
ているように、例示として述べられている。

第１〜１３図は、同一番号の例中に記載された合成方法
を工程図により説明するものである。理解を容易化させ
るために、出発物質及び中間体の製造法は第１４Ａ〜１
４Ｃ図に示されている。明確化のため、第１〜１３図の
参照番号はそれぞれ別の新しい１０位から始まり、第１
図では（１１）から始まる。本発明では言及していない
出発物質の参照番号は０で終わり、したがって例えば第
２図では（２０）となる。図は縮尺通りでは描かれてお
らず、特に尺度はポリリンカー配列領域において適度に
拡大されている。ＩＬ−２配列は太線で示されており、
所望のタンパク質についての構造遺伝子は他の方法で強
調されている。

本発明は下記諸例中で詳細に説明されており、その例の
番号は図の番号と一致する。他に記載のない限り、％は
重量に関する。

例Ａ（第１４Ａ図参照） 出発プラスミドｐ１５９／６はＥＰ−Ａ第０．１６３，
２４９号明細書（第５図）に記載されている。そこでＩ
Ｌ−２”として又は本明細書中“ＤＮＡ配列ｌ”として
記載されている配列は、酵素ＥＣ０ＲＩ％　ＰＳｔ　Ｌ
　Ｍｌｕ　ｌ５Ｘｂａ　Ｌ　Ｓａｃ　Ｉ％Ｐｖｕ　Ｉ及
び５ａ１１の切断部位を介して結合したセグメントＡ〜
Ｆとして第１４Ａ図では分けられている。適切な酵素で
二重切断すると、セグメント（Ａ）〜（Ｐ）又は隣接セ
グメントが得られ、例えばＥｃｏＲＩ及びＭｌｕＩによ
るとセグメント（Ａ、Ｂ）が得られる。

例Ｂ（第１４Ｂ図参照） 発現プラスミドｐＥＷ１０００の製造法は（公開前の）
西独特許出願第 Ｐ３，５４１，８５６．５号明細書（第１図）に開示さ
れている。このプラスミドはプラスミドｐ　ｔ　ａ　ｃ
　１１　（Ａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　２
５（１９８３）１Ｂ？−１７８）の誘導体であり、その
ＥｃｏＲＩ認識部位に５ａｌｌ切断部位含有合成配列が
組込まれたものである。このようにして発現プラスミド
ｐＫＫ１７７．３が得られる。ｌａｃリプレッサー（Ｆ
ａｒａｂａｕｇｈ、　Ｎａｔｕｒｅ　２７４（１９７８
）７６５−７８９）の挿入によりプラスミドｐＪＦ１１
８が得られる。これをＡｖａｌの唯一の制限切断部位で
開環し、公知の方法でエキソヌクレアーゼ処理して約１
０００ｂｐ短縮して、結合させる。それによってプラス
ミドｐＥＷ１０００を得る。酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩ［，５ａｌＩ％ＰｓｔｌもしくはＳｍａｌにより
ポリリンカー中でこのプラスミドを開環し、直鎖発現プ
ラスミド（Ｅｘｔ）　、（ＥＸ２）　、（Ｅｘ３）及び
（Ｅｘ４）を得る。

例Ｃ（第１４図Ｃ図参照） 市販プラスミドｐＵＣ１２をＥｃｏＲＩ及び５ａｌＩで
開環し、直鎖プラスミド（１）を分離する。（１）をセ
グメント（Ａ）、合成リンカ−配列（２）及びセグメン
ト（Ｆ）と結合して、プラスミドｐ　Ｗ　２２６　（３
）を得る。

大腸菌７９１０２株を公知の方法により結合混合体由来
プラスミドＤＮＡで形質転換する。細胞をイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）及びアンピシリン（Ａｐ）
２０μｇ／ｍｌ含有寒天プレート上で培養する。プラス
ミドＤＮＡを白色クローンから得、プラスミド（３）の
形成を制限分析及びＤＮＡ配列分析により確認する。

小さなＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ［フラグメント（４）
をプラスミド（３）から切断し、分離する。このフラグ
メントをＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により直鎖発現プラス
ミド（ＩＥｘｌ）と結合する。得たプラスミドｐＷ２２
６−１（５）を制限分析により確認する。

大腸菌Ｍｃ１０６１株のコンピテント細胞をプラスミド
ｐＷ２２６−１由来ＤＮＡで形質転換する。アンピシリ
ン耐性クローンをＡｐ含を寒天プレート上で分離する。

プラスミドＤＮＡをＭｃ１０６１細胞から再分離し、し
かる後制限分析により再度確認する。大腸菌Ｗ３１１０
株コンピテント細胞を大腸菌Ｍｃ１０６１細胞から分離
したプラスミドＤＮＡで形質転換する。大腸菌Ｗ３１１
０細胞を以後常に発現用として使用する。

以後の諸例中でのすべての発現実験は下記条件で行なわ
れる。

プラスミド（５）含有大腸菌細胞の一夜培養物をアンピ
シリン５０μｇ／ｍｌ含有Ｉ、Ｂ培地（Ｊ、ＩＩ。

Ｍｉｌｌｅｒ、　ＥｘｐｅｒｍｅｎＬｓ　ｉｎ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　１９７２　］で約１：１００の比に希釈
し、増殖を吸光度測定により追跡する。吸光度が０．５
のときに培養物をＩＰＴＧ中１ｍＭに調整し、１５０〜
１８０分間後細菌を沈降させる。細菌を５分間混合緩衝
液（７Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７，０）中で沸騰させ、試料をＳＤＳゲル電
気泳動プレートに塗布する。電気泳動後、プラスミド（
５）含有細菌は予期されたタンパク質の大きさく　６　
Ｋ　Ｄ　）に相当するタンパク質バンドを生じる。

以」二の誘導条件は、培養物を振盪する場合に妥当する
。大規模発酵の場合では、吸光度を適度に変更しかつ適
切であればＩＰＴ（４度をわずかに変更することが有利
である。

得られたタンパク質はＩＬ−２依存細胞系（ＣＴＬＬ２
）での細胞増殖試験において生物活性を示されない。

例　　１ プラスミド（３）をＭｌｕＩ及びＳ　ａ　１．１で開環
し、得られた二つのフラグメントをゲル電気泳動により
分離する。大きなフラグメント（１１）を分離する。

合成オリゴヌクレオチド（１２）をプロインシュリンを
コードするプラント末端Ｄ　Ｎ　Ａ　（１３）（Ｗｃｔ
ｃｋａｍ　ａｔ　ａｌ、＋　Ｇｅｎｅ　１９（１９８２
）　１７９−１８３　）と結合して、ＤＮＡ配列（１４
）を得る。後者をＭ　ｌ　ｕＩ及び５ａｉｌで切断し、
これによりＤＮＡ配列（１５）を得る。後者をフラグメ
ント（１１）と結合して、プラスミドｐ　Ｋ　Ｈ４０（
１Ｂ）を形成する。後者を制限分析により確認する。

プラスミド（１６）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍで消化
し、小さなフラグメント（１７）をゲル電気泳動により
分離する。直鎖状とした発現プラスミド（Ｅｘｔ）と結
合して、発現プラスミドｐ　Ｋ４０　（ｔｇ）を得る。

例Ｃで示す発現により、細胞破壊後の細胞性タンパク質
の可溶性画分に存在するタンパク質を得る。プロインシ
ュリン配列が完全であることを証明するために、ウェス
ターンプロット法を利用する。

例　　２ 出発物質はプラスミドｐＰＨ３０であるが、これは（未
公開の）西独特許出願箱 Ｐ３，５４１，８５６．７号明細書中の第３Ｃ図に示さ
れている。本発明での意味の範囲内において、第２図の
ＩＬ−２部分配列は“Ａ−Ｅ“（２０）として示されて
いる。この配列の末端から結合要素及びプロインシュリ
ン配列までは第２図中（２０ａ）として示されている。

プラスミド（２０）をＰｖｕ　Ｉ及びＨｉｎｄＩ［［で
消化し、小さなフラグメント（２２）を分離する。更に
、プラスミド（３）をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで開環し
、小さなフラグメント（２３）を分離する。しかもベク
ターｐＵＣ１２をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩ［で切断
し、大きなフラグメント（２１）を分離する。

フラグメント（２１）、（２３）及び（２２）を結合し
て、プラスミドｐ　Ｓ　Ｌ　１１　（２４）を得る。

プラスミド（２４）をＨｉｎｄｕで及び部分的にＥｃｏ
ＲＩで切断し、セグメントＡ及びプロインシュリン遺伝
千金をフラグメント（２５）を分離する。

（２５）を直鎖状とした発現プラスミド（Ｅｘｔ）に結
合して、発現プラスミドｐ　Ｓ　Ｌ　１２（２Ｂ）を得
る。

例Ｃで示される発現及びその後の操作により、可溶性融
合タンパク質を得る。インシュリン抗体でのウェスター
ンプロット分析により、このタンパク質が完全なインシ
ュリン配列を有していることを確認する。

例　　３ プラスミドｐ　ｔ　ｒｐＥＤ５−１（３０）（ｌｌａｌ
ｌｃｗｃｌｌ　ａｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎ０９（１９８０
）２７−４７　）をプロインシュリン遺伝子の増幅用に
使用する。プラスミドをＨｉｎｄｌｎ及び５ａｉｌで開
環して、大きなフラグメント（３１）を分離する。フラ
グメント（３１）をＤＮＡ配列（１４）と結合して、プ
ラスミドｐ　Ｈ１０６／４　（３２）を得る。

プラスミド（３２）を５ａｌＩ及びＭｌｕＩで消化して
、小さなフラグメント（１５）を分離する。直鎖状とし
た発現プラスミド（Ｅｘ２）　、セグメント（Ａ、Ｂ）
及びフラグメント（１５）を結合して、発現プラスミド
ｐ　Ｋ　５０　（３３）を得る。

コードされた融合タンパク質の発現を例Ｃで示したよう
に行なう。細胞を培養ブイヨン中から沈降させ、フレン
チプレス（Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ）で破壊する。タ
ンパク質懸濁物を遠心分離し、その可溶性及び不溶性の
両タンパク質成分に分離する。二つの画分を公知の方法
で１７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのゲル電気
泳動に付し、しかる後タンパク質をクマシー（Ｃｏｏａ
＋ａｓｓｌｏ　）ブルー染料で染色することにより分析
する。驚くべきことに、融合タンパク質は不溶性沈降物
中に存在していることが判明した。インシュリン抗体で
のウェスターンプロット法分析により、完全プロインシ
ュリンが融合タンパク質中に存在していることを確認す
る。

フレンチプレス破壊による沈降物は更にプロインシュリ
ン分離用として直ちに使用することができる。

例４ 出発物質はプラスミドｐ　Ｐ　Ｈ２０（４０）であり、
これは西独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．７号明細
書の第３Ｃ図に記載されている。このプラスミドをＥｃ
ｏＲＩで切断し、突出端を埋填し、ＨｉｎｄＩＩＩで切
断してフラグメント（４１）を得るが、そこには本発明
において重要な（４０）の一部のＤＮＡ配列が存在して
いる。

直鎖状とした発現プラスミド（Ｅｘ４）をセグメント（
Ａ、Ｂ）　、合成オリゴヌクレオチド（４２）及びフラ
グメント（４１）と結合して、プラスミドｐＫ５１（４
３）を得る。

例５ 直鎖状にした発現プラスミド（Ｅｘ２）をセグメント（
Ａ、Ｂ）　、合成オリゴヌクレオチド（５１）及びＤＮ
Ａ配列（１５）と結合して、プラスミドｐ　Ｋ　５２　
（５２）を得る。オリゴヌクレオチド（５１）の正確な
配向性を配列分析により確認する。このプラスミドは、
オリゴヌクレオチド（５１）に対向するアミノ酸配列を
含有する融合タンパク質をコードしており、このため活
性因子Ｘａで切断することができる。

プラスミド（５２）は、下記方法によっても得ることが
できる。

プラスミド（３３）をＭ　１　ｕ　Ｉで部分的に切断し
、得られた開環プラスミド（５３）をＤＮＡ配列（５１
）と結合して、同様にプラスミドｐＫ５２を得る。

例　　６ プラスミド（４３）をＭ　ｌ　ｕ　Ｉで部分的に切断し
、得られた直鎖状プラスミド（６１）を合成りＮＡ配列
（５１）と結合して、プラスミドｐ　Ｋ　５　Ｂ　（１
３２）を得る。

後者は、活性因子Ｘａで切断することができる融合タン
パク質を同様にコードしている。配列（５１）の正確な
配向性を例５のようにＤＮＡ配列分析により確認する。

例　　７ プラスミド（２Ｇ）をＸｂａＩで及び部分的にＭ　ｌ　
ｕ　Ｉで切断して、大きなフラグメント（７１）を分離
する。セグメント（Ｃ）と結合させてプラスミドｐ　Ｓ
　Ｌ　１４　（７２）を得る。発現及び細胞破壊後、融
合タンパク質は細胞性タンパク質の可溶性画分中に存在
する。

例８ プラスミド（２０）をＸｂａＩで部分的に及びＥｃｏＲ
Ｉで切断し、突出端を埋填して、ＤＮＡ配列（８１）を
得る。プラント末端条件下で結合させてプラスミドｐ　
Ｐ　Ｈ３１（８２）を得る。融合タンパク質は、細胞性
タンパク質の不溶性画分中に存在する。

例９ 使用する出発物質はＥＰ−Ａ第 ０．１７１，０２４号明細書（第３図）に記載されたプ
ラスミド（９０）である。このプラスミドを５ａｌｌＬ
、かる後ＡｃｃＩと反応させて、小さなフラグメント（
旧）を分離する。後者を合成オリゴヌクレオチド（９２
）と結合して、ＤＮＡ配列（９３）を１する。後者をＭ
ｌｕＩで切断して、ＤＮＡフラグメント（９４）を得る
。

プラスミド（３３）をＭｌｕＩで部分的に及び５ａｌｌ
で消化して、大きなフラグメント（９５）を分離する。

後者をＤＮＡ配列（９４）と結合して、発現プラスミド
ｐ　Ｋ　１９２　（９Ｂ）を得る。後者は、ＩＬ−２の
最初の３８個のアミノ酸の後にメチオニン次いでヒルジ
ンアミノ酸配列が続く融合タンパク質をコードするもの
である。融合タンパク質は、細胞性タンパク質の可溶性
画分中に存在する。

例１０ 使用する出発物質はプラスミドｐ　Ｈ０２３（１００）
であり、これはＥＰ−Ａ第０．１８３，３５０号明細書
に記載されており、アメリカン・タイプ・カルチア−・
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ（：ｕｌｔ
ｕｒｅ　Ｃｏｔ　Ｉｅｃｔｉｏｎ）の寄託番号ＡＴＣＣ
３９０００号として一般的に人手できる。このプラスミ
ドを５ｆａＮＩで切断し、突出端を埋填し、しかる後Ｐ
ｓｔｌとの反応を行ない、小さなフラグメント（１０１
）を分離する。直鎖状発現プラスミド（Ｅｘａ）をセグ
メント（Ａ、Ｂ）　、合成オリゴヌクレオチド（１０２
）及びフラグメント（１０１）と結合して、発現プラス
ミドｐＷ２１４　（１０３）を得る。このプラスミドは
、ＩＬ−２の最初の３８個のアミノ酸の後に、オリゴヌ
クレオチド（１０２）由来であってかつＸａ因子で分子
を切断させ得る配列、次いでＣＳＦアミノ酸配列配列く
融合タンパク質をコードするものである。細胞破壊後、
融合タンパク質は細胞性タンパク質の不溶性画分中に存
在する。

例１１ 出発物質ｐＷ２１６（１１０）は、西独特許出願節Ｐ３
，５４５，５６８．３号明細書（第２ｂ図）に開示され
ている。このプラスミドでは、セグメントＡ−Ｅ（Ｐｖ
ｕＩ切断部位）に相当するＩＬ−２配列の後に、アミノ
酸Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ　−Ｐｒｏをコードするリンカ−
１すぐその後にＣ８Ｆアミノ酸配列、が続いている。Ｉ
Ｌ−２及びＣＳＦ間の結合配列により、融合タンパク質
をタンパク質分解によって切断することができる。

配列（１１１）を、Ｐｖｕ　Ｉ及びＨｉｎｄｎ［で切断
することにより、プラスミド（１１０）から分離する。

プラスミド（３）をＭｌｕＩ及びＸｂａＩで切断して、
大きなフラグメント（１１２）を分離する。後者をセグ
メント（Ｃ）と結合して、プラスミドｐＷ２２７　（１
１３）を得る。このプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄｍと反応させ、短鎖フラグメント（１１４）を分離す
る。このフラグメントが直鎖状発現プラスミド（Ｅｘｔ
）と結合している場合には、プラスミドｐＷ２２７−１
　（１１５）が得られる。プラスミドは、ＩＬ−２由来
ではあるもののＩＬ−２活性を有していていないタンパ
ク質をコードするものである。

プラスミド（１１３）を更にＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで
切断し、短鎖フラグメント（１１Ｂ）を分離する。

直鎖状発現フラグメント（ＩＥｘｌ）をフラグメント（
１１Ｂ）及び（ｉｌｌ）と結合して、発現プラスミドｐ
Ｗ２３３（１１７）を得る。後者は不溶性融合タンパク
質をコードしているが、この融合タンパク質は上記リン
カ−の存在によりタンパク質分解によって切断すること
ができる。

例１２ プラスミド（３）をＸｂａＩ及びＳａｃ　Ｉで切断し・
大きなフラグメント（１２１）を単離する。セグメント
（Ｄ）と結合させてプラスミドｐ　Ｗ　２２３（１２２
）を得る。後者をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断
して、小さなフラグメント（１２３）を分離する。直鎖
状発現プラスミド（Ｅｘｔ）をフラグメント（１２３）
と結合させて発現プラスミドｐＷ２２８−１　（１２４
）を得る。このプラスミドは生物学的に不活性のＩＬ−
２２導体をコードしている。プラスミドをＥｃｏＲＩ及
びＰｖｕＩで消化して、短鎖フラグメント（１２５）を
分離する。直鎖状発現プラスミド（Ｅｘｌ）をフラグメ
ント（１２５）および（ｌｌｌ）と結合させて、発現プ
ラスミドｐＷ２３４（１２Ｂ）を得る。後者は難溶性融
合タンパク質をコードしており、この融合タンパク質も
同様にタンパク質分解によって切断することができる。

例１３ 適切なプラスミドの製造のために、特にｃＤＮＡ配列の
発現のために、まずポリリンカー配列（１３１）を合成
する。

直鎖状プラスミド（１）をセグメント（Ａ）、ポリリン
カー配列（１３１）及びセグメント（Ｐ）と結合させて
、プラスミドｐ　Ｈ２００（１３２）を得る。

プラスミド（１３２）をＥｃｏＲＩ及びＭｌｕＩと反応
させて、大きなフラグメント（１３３）を分離する。後
者をセグメント（Ａ、Ｂ）と結合して、プラスミドｐ　
Ｈ２０１（１３４）を得る。

プラスミド（１３４）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｎＩと
反応させ、短鎖フラグメント（１３５）を分離する。

このフラグメントを直鎖発現プラスミド（Ｅｘｔ）と結
合し、発現プラスミドｐ　Ｈ２０２（１３Ｂ）を得る。

プラスミド（ｔａｅ）をＢａｍＨＩで閉環し、発現すべ
きｃＤＮＡを直鎖プラスミド中に市販ＢａｍＨＩアダプ
ターを介して組込む。ｃＤＮＡの配向性に従い、すべて
の第三の配列が読取り枠中で（Ａ、Ｂ）と結合している
。ｃＤＮＡ配列が停止コードンを有していない場合には
、それがコードするポリペプチド配列はセグメント（Ｐ
）に対応するアミノ酸配列によって付加的に保護されて
いる。

ｃＤＮＡが正しい読取り枠中に結合していない場合には
、読取り枠の移動は、例えばｃＤＮＡ含有（最初の又は
複製された）プラスミドをＭｌｕＩ又はＸｂａＩで切断
しくｃＤＮＡがこれら酵素の切断部位を有していないと
きに限る）、クレノウボリメラーゼ反応により突出端を
埋填することによって行なわれる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＵｃ１２誘導体たるｐＫＨ４０及び発現プラ
スミドｐＫ４０の製造法を示すフローシートである。こ
れらのプラスミドは、セグメントＡに対応するタンパク
質配列、即ちＩＬ−２の最初の２２個のアミノ酸の後に
、結合要素Ｔｈｒ−Ａｒｇ、次いでプロインシュリンア
ミノ酸配列が続く融合タンパク質をコードしている。 第２図は、プラスミドｐＳＬ１１及び発現プラスミドｐ
ＳＬ１２の構造を示す説明図である。これらのプラスミ
ドは、セグメントＡの後にポリリンカー配列（２）及び
（２０ａ）に相当する結合要素次いでプロインシュリン
アミノ酸配列が続くポリペプチドをコードしている。 第３図は、発現プラスミドｐＫ５０の構造を示す説明図
である。このプラスミドは、セグメントＡ及びＢ１即ち
ＩＬ−２の最初の３８個のアミノ酸、に直接プロインシ
ュリンアミノ酸配列が続くポリペプチドをコードしてい
る。 第４図は、発現プラスミドｐＫ５１の構造を示す説明図
である。このプラスミドは、セグメントＡおよびＢの後
に配列（４２）及び（４１）に相当する結合要素、次い
でプロインシュリンアミノ酸配列、が結合したポリペプ
チドをコードしている。 第５図は、ＭｌｕＩリンカ−（５１）が挿入されている
点でｐＫ５１と異なる発現プラスミドｐＫ５２の構造を
示す説明図である。このプラスミドは、Ｘａ因子で切断
されるアミノ酸配列をコードしている。ｐＫ５２は、Ｍ
ｌｕＩで切断しかつ上記Ｍ１ｕＩリンカ−を組込むこと
によって、ｐＫ５０（第３図）からも得ることができる
ものである。 第６図は、Ｍ　１　ｕ　Ｉリンカ−の同様の組込みによ
ってｐＫ５１（第４図）から得られる発現プラスミドｐ
Ｋ５３の構造を示す説明図である。 第７図は、フラグメントＣのポリリンカーへの組込みに
よってｐｓｉ、１２　（第２図）から得られる発現プラ
スミドｐｓＬ１４の構造を示す説明図である。それによ
り、セグメントＣがセグメントＡに直接結合することに
なる。下記ポリリンカーにおいて、最初の２個のアミノ
酸（いずれもＧｌｕ）はＩＬ−２の６０位及び６１位の
アミノ酸と一致する。したがって、ＩＬ−２部分は１〜
２２位及び３７〜６１位のアミノ酸からなる。その後の
アミノ酸配列は、プラスミドｐｓＬ１２（第２図）によ
りコードされたアミノ酸配列と一致する。 第８図は、発現プラスミドｐＰＨ３１の構造を示す説明
図である。このプラスミドは、セグメントＡ−Ｃの後に
配列（８１）で示される結合要素、次いでプロインシュ
リンアミノ酸配列、が続く融合タンパク質をコードして
いる。 第９図は、プラスミドｐＫ１９２の構造を示す説明図で
ある。このプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後にメ
チオニン、次いでヒルジンアミノ酸配列、が続く融合タ
ンパク質をコードしている。 第１０図は、プラスミドｐＷ２１４の構造を示す説明図
である。このプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後に
Ｘａ因子で切断されるアミノ酸配列、次いで顆粒球／マ
クロファージコロニー刺激因子（ＣＳＰ）アミノ酸配列
、が続く融合タンパク質をコードしている。 第１１図は、発現プラスミドｐＷ２３３の構造に示す説
明図である。このプラスミドは、セグメントＡ及びＣ（
ＩＬ−２の１〜２２位及び３７〜６１位のアミノ酸と一
致する）の後に結合要素Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ、次いでＣＳＦのアミノ酸配列、が
続く融合タンパク質をコードしている。 第１２図は、発現プラスミドｐＷ２３４の構造を示す説
明図である。このプラスミドは、次のアミノ酸配列：即
ち、セグメントＡ（１〜２２位のアミノ酸）の後に結合
要素Ｔｈｒ−Ａｒｇ、次いでセグメントＤ　（ＩＬ−２
の５９〜９６位のアミノ酸）、もう一つの結合要素Ｔｈ
ｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ、及び最後にＣ８Ｆ、が続
く融合タンパク質をコードしている。 第１３図は、プラスミドｐＨ２００及びｐＨ２０１、並
びに発現プラスミドｐＨ２０２の構造を示す説明図であ
る。これらのプラスミドは、セグメントＡ〜Ｆ間又はＡ
、Ｂ−Ｆ間にポリリンカーを有しており、その多数の切
断部位に外来ＤＮＡを組込んでこれを復製することがで
きる。 これらのプラスミドは、ｃＤＮＡ配列を複製するために
特に適している。 第１４Ａ図は、本発明のセグメントＡ〜Ｆ並びにセグメ
ントＡ及びＢの組合せについての概略図である。出発物
質はプラスミドｐ１５９／６であって、その製造法はＥ
Ｐ−Ａ第 ０．１６３，２４９号明細書で詳細に記載されており、
しかもそのプラスミドは該公報の第５図で規定されてい
る。 第１４Ｂ図は発現プラスミドｐＥＷ１０００を示す説明
図である。このプラスミドの製造法は西独特許出願筒Ｐ
３．５４１，８５６．７号明細書に記載されかつその第
１図に示されている。このプラスミドは適切な二重切断
によってポリリンカー配列中で開環され、それにより直
鎖プラスミド（Ｅｘｌ）　〜（Ｅｘ４）が得られる。 第１４Ｃ図はｐＵｃ１２誘導体たるｐＷ２２６及び発現
プラスミドｐＷ２２６−１の製造法を示す説明図である
。いずれのプラスミドもポリリンカー配列から分離され
たセグメントＡ及びＦを有している。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 （１２）・＋１３１−Ｔ１４１ ＥｃｏＲｌ （１６）、、、ａｍ　［ＥｃｏＲｌ）−Ａ−ＭＩｕＩ−
（Ｂ１−Ａ２’）−５ａＩＩ−（Ｈｉｎｄ　ｌｌｌ１　
（１７）（３３）目ａｒｔ。 ＦＩＧ、１０ ［１００） ”’　　１ｓａｃｌｌ−Ｅ　−ｔＰｖｕＩｌ　ＩＥＩＰ
ｖｕＩ 恒二ｆＰｖｕＩｌ　−Ｆ−ｆｓａｌｌｌ　、　ｆＦＩａ
ｌｌ ”−（ＥｃｏＲ１］−Ａ−Ｐｓｔ−Ｂ−（ＭｌｕＩｌ　
　（Ａ、Ｂ）ｌｕｌ 巨［Ｅｘ４１ ｍａｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インターロイキン−２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列
   と実質的に一致するが、１００個よりも有意に少ないア
   ミノ酸からなるＣ−又はＮ−末端部分を含有する融合タ
   ンパク質。 ２、アミノ酸配列がヒトＩＬ−２のアミノ酸配列と一致
   するものである、特許請求の範囲第１項記載の融合タン
   パク質。 ３、ＩＬ−２をコードする遺伝子が第１表のＤＮＡ配列
   Ｉの一部を含有している、特許請求の範囲第２項記載の
   融合タンパク質。 ４、ＩＬ−２部分をコードする遺伝子が、アダプター又
   はリンカー配列を介してしかも任意の配列で、ＩＬ−２
   遺伝子： （ＥｃｏＲＩ）−Ａ−ＰａｔＩ−Ｂ−ＭｌｕＩ−Ｃ−Ｘ
   ｂａＩ−Ｄ−ＳａｃＩ−Ｅ−ＰｖｕＩ−Ｆ−（ＳａｌＩ
   ） のセグメントＡ〜Ｆのうちの１、２又は３個から実質的
   に構成される、特許請求の範囲第３項記載の融合タンパ
   ク質。 ５、ＩＬ−２配列と所望のタンパク質アミノ酸配列との
   間に、化学的又は酵素的にＩＬ−２部分から所望のタン
   パク質を切除し得るアミノ酸又はアミノ酸配列が存在し
   ている、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項
   に記載の融合タンパク質。 ６、アミノ酸がＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、 ＬｙｓもしくはＡｒｇであるか、又はアミノ酸配列がＣ
   −末端にこれらアミノ酸を有している、特許請求の範囲
   第５項記載の融合タンパク質。 ７、アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｐｒｏであるか、又はＣ末
   端にこのアミノ酸配列を有する、特許請求の範囲第６項
   記載の融合タンパク質。 ８、アミノ酸配列がＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇで
   あるか、又はＣ−末端にこのアミノ酸配列を有する、特
   許請求の範囲第６項記載の融合タンパク質。 ９、宿主細胞中で融合タンパク質をコードする遺伝子を
   発現させることからなる、特許請求の範囲第１項〜第８
   項のいずれか１項に記載の融合タンパク質の生産法。 １０、遺伝子を発現ベクター中に組込んで、細菌細胞中
   で発現させる、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、使用される細菌細胞が大腸菌である、特許請求の
   範囲第１０項記載の方法。 １２、特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に
   記載の融合タンパク質又は特許請求の範囲第９項〜第１
   １項のいずれか１項に記載のようにして得ることができ
   る融合タンパク質の、所望のタンパク質生産用としての
   用途。 １３、特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に
   記載の融合タンパク質をコードする遺伝子構造。 １４、特許請求の範囲第１３項に記載された遺伝子構造
   を含有するベクター。 １５、プラスミドｐＷ２２６、ｐＷ２２６−１、ｐＫ４
   ０、ｐＳＣ１２、ｐＫ５０、ｐＫ５１、ｐＫ５２、ｐＫ
   ５３、ｐＳ２１４、ｐＰＨ３１、ｐＫ１９２、ｐＷ２１
   ４、ｐＷ２２７、ｐＷ２２７−１、ｐＷ２３３、ｐＷ２
   ２８、ｐＷ２２８−１、ｐＷ２３４、ｐＨ２００、 ｐＨ２０１、ｐＨ２０２。 １６、特許請求の範囲第１４項又は第１５項記載のベク
   ターを含有する宿主細胞。