JP2637392B2 - 遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法 - Google Patents
遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、宿主細胞としての原核
生物中の相当するDNA 配列の発現による生物活性β-NGF
の遺伝子操作による生産方法、組み換え修飾β-NGF、DN
A 配列、並びに発現ベクターおよび治療組成物中の組み
換え修飾β-NGFの使用に関する。
生物中の相当するDNA 配列の発現による生物活性β-NGF
の遺伝子操作による生産方法、組み換え修飾β-NGF、DN
A 配列、並びに発現ベクターおよび治療組成物中の組み
換え修飾β-NGFの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】神経成長因子(NGF) は約130,000 ダルト
ンの分子量を有する多成分タンパク質である。それは三
つのサブユニットα、βおよびγを含む。しかしなが
ら、知覚ニューロンおよび交感ニューロンの成長に影響
するその能力は単にβサブユニットによるものである。
生物活性がαサブユニットに特有のものであると考える
ことは今までのところ可能ではなかったし、一方、γサ
ブユニットは長い前駆体として最初に合成されるβ-NGF
の処理に重要な役割を果たす或る種の細胞種中に少なく
ともある。成熟β-NGFはおそらく118 個のアミノ酸を含
む。それは３個のジスルフィドブリッジを含み、そして
グリコシル化されていない。生物活性であるためには、
それは二量体として存在する必要がある。
ンの分子量を有する多成分タンパク質である。それは三
つのサブユニットα、βおよびγを含む。しかしなが
ら、知覚ニューロンおよび交感ニューロンの成長に影響
するその能力は単にβサブユニットによるものである。
生物活性がαサブユニットに特有のものであると考える
ことは今までのところ可能ではなかったし、一方、γサ
ブユニットは長い前駆体として最初に合成されるβ-NGF
の処理に重要な役割を果たす或る種の細胞種中に少なく
ともある。成熟β-NGFはおそらく118 個のアミノ酸を含
む。それは３個のジスルフィドブリッジを含み、そして
グリコシル化されていない。生物活性であるためには、
それは二量体として存在する必要がある。
【０００３】神経成長因子は神経疾患、例えば、アルツ
ハイマー病またはパーキンソン病の治療に特に重要であ
る。それ故、cDNA 配列が最初に1983年(Ullrichら、Na
ture303 巻(1983),821-825) に記載された後、タンパク
質を遺伝子操作により生産しようとする試みが既になさ
れている。こうして、β-NGFのDNA およびアミノ酸配列
そして仮説上のE.coli中の発現が欧州特許第0121338 号
明細書に記載されている。この欧州特許はβ-NGFの遺伝
子の単離方法およびその配列をこれから得た方法を示し
ているが、発現系がE.coli中の直接の発現に使用された
ことが単に記載されたにすぎなかった。しかしながら、
活性タンパク質をこの手段により得ることは可能ではな
かった。
ハイマー病またはパーキンソン病の治療に特に重要であ
る。それ故、cDNA 配列が最初に1983年(Ullrichら、Na
ture303 巻(1983),821-825) に記載された後、タンパク
質を遺伝子操作により生産しようとする試みが既になさ
れている。こうして、β-NGFのDNA およびアミノ酸配列
そして仮説上のE.coli中の発現が欧州特許第0121338 号
明細書に記載されている。この欧州特許はβ-NGFの遺伝
子の単離方法およびその配列をこれから得た方法を示し
ているが、発現系がE.coli中の直接の発現に使用された
ことが単に記載されたにすぎなかった。しかしながら、
活性タンパク質をこの手段により得ることは可能ではな
かった。
【０００４】欧州特許出願第0329175 号明細書は、トロ
ンビン開裂の認識配列がβ-NGF遺伝子の前に配置されて
いる融合遺伝子を使用する活性ヒトβ-NGFの生産を記載
している。この場合、その融合は融合タンパク質の発現
後にトロンビンにより開裂される。この方法の欠点の一
つは、とりわけ、生物活性β-NGFの低収率である。欧州
特許出願第0370171 号明細書は、バクロウイルス発現系
を使用する活性β-NGFの生産方法を記載している。この
方法では、ウイルスで感染された昆虫細胞が発現に使用
される。しかしながら、このような細胞の培養は非常に
複雑であり、またそれらが商業上重要な生産細胞として
使用し得ることを示すことがまだ可能ではなかった。
ンビン開裂の認識配列がβ-NGF遺伝子の前に配置されて
いる融合遺伝子を使用する活性ヒトβ-NGFの生産を記載
している。この場合、その融合は融合タンパク質の発現
後にトロンビンにより開裂される。この方法の欠点の一
つは、とりわけ、生物活性β-NGFの低収率である。欧州
特許出願第0370171 号明細書は、バクロウイルス発現系
を使用する活性β-NGFの生産方法を記載している。この
方法では、ウイルスで感染された昆虫細胞が発現に使用
される。しかしながら、このような細胞の培養は非常に
複雑であり、またそれらが商業上重要な生産細胞として
使用し得ることを示すことがまだ可能ではなかった。
【０００５】真核生物からの活性β-NGFの生産がBioche
m.Biophys.Research Commun.171(1990)116-122および欧
州特許出願第0414151 号明細書に記載されている。しか
しながら、真核細胞中の組み換えタンパク質の発現は複
雑であり、かつ費用がかかる。E.coli中のネズミβ-NGF
の発現がGene70(1988),57-65頁に記載されている。しか
しながら、生物活性β-NGFの収率が非常に小さかった。
m.Biophys.Research Commun.171(1990)116-122および欧
州特許出願第0414151 号明細書に記載されている。しか
しながら、真核細胞中の組み換えタンパク質の発現は複
雑であり、かつ費用がかかる。E.coli中のネズミβ-NGF
の発現がGene70(1988),57-65頁に記載されている。しか
しながら、生物活性β-NGFの収率が非常に小さかった。
【０００６】欧州特許出願第0450386 号明細書はE.coli
からのβ-NGFの生産方法を記載している。しかしなが
ら、この方法で得られた生産物は約85:15 の比の天然配
列を有するβ-NGFとN-末端メチオニン残基を有するβ-N
GFの混合物である。酵母中のヒトβ-NGFの発現がGene83
(1989),65-74頁に記載されている。また、この場合に
は、発現がごくわずかであり、しかも得られたβ-NGFの
活性が非常に弱いものであるにすぎない。
からのβ-NGFの生産方法を記載している。しかしなが
ら、この方法で得られた生産物は約85:15 の比の天然配
列を有するβ-NGFとN-末端メチオニン残基を有するβ-N
GFの混合物である。酵母中のヒトβ-NGFの発現がGene83
(1989),65-74頁に記載されている。また、この場合に
は、発現がごくわずかであり、しかも得られたβ-NGFの
活性が非常に弱いものであるにすぎない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明の目的
は、原核生物、特にE.coli中の活性ヒトβ-NGFのコスト
上有効な簡単な生産を可能にする方法を提供することで
あり、その方法により高い発現率を達成し、そして再生
後に、天然源から単離されたβ-NGFと同じ活性を有する
タンパク質を得ることが可能である。
は、原核生物、特にE.coli中の活性ヒトβ-NGFのコスト
上有効な簡単な生産を可能にする方法を提供することで
あり、その方法により高い発現率を達成し、そして再生
後に、天然源から単離されたβ-NGFと同じ活性を有する
タンパク質を得ることが可能である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】その目的は、本発明によ
れば、宿主細胞としての原核生物中の相当するDNA 配列
の発現による生物活性β-NGF（神経成長因子βサブユニ
ット）の遺伝子操作による生産方法により達成され、そ
の方法では、(a) 成熟β−ＮＧＦの１１８個のアミノ酸
配列または成熟β−ＮＧＦの１１８個のアミノ酸配列の
Ｎ−末端側から９個までのアミノ酸がプロテアーゼを使
用して開裂されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡ配列を原核宿主生物中で発現させ、(b) 発
現後に得られた不活性β−ＮＧＦの不溶性凝集物をシス
タミン／システアミン及びシスチン／システインから選
ばれる酸化還元系の助けによる可溶化およびパルス再生
により可溶性の活性形態に変換し、この際パルス再生
は、アルギニンの存在下２℃から１０℃の間の温度およ
び８−１０のｐＨで実施される。
れば、宿主細胞としての原核生物中の相当するDNA 配列
の発現による生物活性β-NGF（神経成長因子βサブユニ
ット）の遺伝子操作による生産方法により達成され、そ
の方法では、(a) 成熟β−ＮＧＦの１１８個のアミノ酸
配列または成熟β−ＮＧＦの１１８個のアミノ酸配列の
Ｎ−末端側から９個までのアミノ酸がプロテアーゼを使
用して開裂されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡ配列を原核宿主生物中で発現させ、(b) 発
現後に得られた不活性β−ＮＧＦの不溶性凝集物をシス
タミン／システアミン及びシスチン／システインから選
ばれる酸化還元系の助けによる可溶化およびパルス再生
により可溶性の活性形態に変換し、この際パルス再生
は、アルギニンの存在下２℃から１０℃の間の温度およ
び８−１０のｐＨで実施される。
【０００９】本発明の方法の使用は、β-NGFが原核生物
中で高収率で生産されることを可能にする。原核生物中
で、タンパク質は最初に不溶性凝集物、所謂封入体(IB)
の形態で生じ、次に可溶性の活性形態のみに変換され
る。このようにして、付加的なN-末端アミノ酸配列(N-
末端で延長されたβ-NGF) を含む生物活性β-NGFが得ら
れ、これがまた本発明の主題である。プロテアーゼの助
けによる付加的なアミノ酸（これらは成熟β-NGF鎖のア
ミノ酸の前に存在する）の開裂後に、成熟ヒトβ-NGFと
同じであるタンパク質を得ることが次に可能である。ヒ
トβ-NGFはグリコシル化されていないので、原核生物中
の生産はこの場合には天然生産物と比較して相違を生じ
ない。驚くことに、９個までの最初のN-末端アミノ酸が
β-NGFの活性を失わないで開裂し得ることが判明した。
このようなN-末端で短縮されたβ-NGFおよびその生産方
法がまた本発明の主題である。
中で高収率で生産されることを可能にする。原核生物中
で、タンパク質は最初に不溶性凝集物、所謂封入体(IB)
の形態で生じ、次に可溶性の活性形態のみに変換され
る。このようにして、付加的なN-末端アミノ酸配列(N-
末端で延長されたβ-NGF) を含む生物活性β-NGFが得ら
れ、これがまた本発明の主題である。プロテアーゼの助
けによる付加的なアミノ酸（これらは成熟β-NGF鎖のア
ミノ酸の前に存在する）の開裂後に、成熟ヒトβ-NGFと
同じであるタンパク質を得ることが次に可能である。ヒ
トβ-NGFはグリコシル化されていないので、原核生物中
の生産はこの場合には天然生産物と比較して相違を生じ
ない。驚くことに、９個までの最初のN-末端アミノ酸が
β-NGFの活性を失わないで開裂し得ることが判明した。
このようなN-末端で短縮されたβ-NGFおよびその生産方
法がまた本発明の主題である。
【００１０】本発明の方法に使用されるDNA 配列は、Ul
lrich ら、Nature303(1983),821-825 により記載された
ものに相当する。これに関して、cDNAは通常の方法で生
産し得る。また、天然遺伝子のエクソンからなるDNA 配
列を合成することが可能である。本発明の方法でタンパ
ク質の高収率を得るために、開始アミノ酸メチオニンの
コドンだけでなく、使用される宿主株中でよく発現され
るタンパク質のN-末端配列の３〜５個のアミノ酸に相当
することが知られているアミノ酸のコドンは、β-NGFの
DNA 配列の前に配置される。特にE.coli株を使用する場
合には、これはt-PA（組織プラスミノーゲンアクチベー
ター）のN-末端配列のアミノ酸Ser-Tyr-Gln-Val-Ile(SE
Q ID NO4) をコードするDNA 配列であることが好まし
い。これらは特にアミノ酸Ser-Tyr-Gln(SEQ ID NO3) を
コードするコドンである。
lrich ら、Nature303(1983),821-825 により記載された
ものに相当する。これに関して、cDNAは通常の方法で生
産し得る。また、天然遺伝子のエクソンからなるDNA 配
列を合成することが可能である。本発明の方法でタンパ
ク質の高収率を得るために、開始アミノ酸メチオニンの
コドンだけでなく、使用される宿主株中でよく発現され
るタンパク質のN-末端配列の３〜５個のアミノ酸に相当
することが知られているアミノ酸のコドンは、β-NGFの
DNA 配列の前に配置される。特にE.coli株を使用する場
合には、これはt-PA（組織プラスミノーゲンアクチベー
ター）のN-末端配列のアミノ酸Ser-Tyr-Gln-Val-Ile(SE
Q ID NO4) をコードするDNA 配列であることが好まし
い。これらは特にアミノ酸Ser-Tyr-Gln(SEQ ID NO3) を
コードするコドンである。
【００１１】その他に、β-NGF前駆体のプロ配列からの
少なくとも一部のアミノ酸が使用される場合、発現率に
対して顕著な影響があることが判明した。これに関し
て、コドンは成熟β-NGFのアミノ酸配列の直接前の前駆
体中に配置されるアミノ酸をコードするDNA 配列中に導
入されることが好ましい。特に、プロ配列の最後の７個
のアミノ酸(Arg-Thr-His-Arg-Ser-Lys-Arg)(SEQ ID NO
2) をコードするコドンが使用される。
少なくとも一部のアミノ酸が使用される場合、発現率に
対して顕著な影響があることが判明した。これに関し
て、コドンは成熟β-NGFのアミノ酸配列の直接前の前駆
体中に配置されるアミノ酸をコードするDNA 配列中に導
入されることが好ましい。特に、プロ配列の最後の７個
のアミノ酸(Arg-Thr-His-Arg-Ser-Lys-Arg)(SEQ ID NO
2) をコードするコドンが使用される。
【００１２】本発明の好ましい実施態様では、発現は宿
主細胞としてのE.coli、特に株E.coli C600 + (DSM 544
3)中で行われる。DNA 配列の発現に必要な因子は当業者
に知られており、これらはとりわけプロモーター、リボ
ソーム結合部位等を含み、これらは発現に通常使用され
るベクターに存在する。しかしながら、本発明の方法で
は、誘導プロモーターが使用されることが好ましく、そ
してこのプロモーターの誘導は対数増殖期中に行われる
ことが好ましい。この手段により、特に高いタンパク質
収率を得ることが可能である。何となれば、外来タンパ
ク質の発現は初期増殖期中に宿主細胞の死滅を既にもた
らさないからである。このような誘導プロモーターの例
はtac プロモーター（これはIPTGの添加により誘導し得
る）、trp プロモーターまたはλP L プロモーターであ
る。
主細胞としてのE.coli、特に株E.coli C600 + (DSM 544
3)中で行われる。DNA 配列の発現に必要な因子は当業者
に知られており、これらはとりわけプロモーター、リボ
ソーム結合部位等を含み、これらは発現に通常使用され
るベクターに存在する。しかしながら、本発明の方法で
は、誘導プロモーターが使用されることが好ましく、そ
してこのプロモーターの誘導は対数増殖期中に行われる
ことが好ましい。この手段により、特に高いタンパク質
収率を得ることが可能である。何となれば、外来タンパ
ク質の発現は初期増殖期中に宿主細胞の死滅を既にもた
らさないからである。このような誘導プロモーターの例
はtac プロモーター（これはIPTGの添加により誘導し得
る）、trp プロモーターまたはλP L プロモーターであ
る。
【００１３】E.coli中の発現後に封入体の形態で蓄積す
るタンパク質の可溶化、誘導体化および再生（これらは
また一緒にして再生と称される）は既に知られており、
例えば、欧州特許出願第0219874 号明細書に記載されて
いる。可溶化（それは不活性な可溶性タンパク質をもた
らす）は、変性剤、好ましくはグアニジウム塩酸塩また
は尿素を使用して行われ、この場合、４〜６モル/l（グ
アニジウム塩酸塩の場合）および５〜８モル/l（尿素の
場合）の変性剤の濃度が良好な結果を生じる。
るタンパク質の可溶化、誘導体化および再生（これらは
また一緒にして再生と称される）は既に知られており、
例えば、欧州特許出願第0219874 号明細書に記載されて
いる。可溶化（それは不活性な可溶性タンパク質をもた
らす）は、変性剤、好ましくはグアニジウム塩酸塩また
は尿素を使用して行われ、この場合、４〜６モル/l（グ
アニジウム塩酸塩の場合）および５〜８モル/l（尿素の
場合）の変性剤の濃度が良好な結果を生じる。
【００１４】起こりうる透析（これは絶対に必要ではな
いが、行われることが好ましい）の後に、タンパク質は
次に所望により誘導体化されて所望のジスルフィドを生
成し得る。好ましい実施態様では、誘導体化は本発明の
方法ではシスタミンまたはシスチンを使用して行われ
る。これらの化合物は75ミリモル/lまでの量でインキュ
ベーション混合物に添加されることが好ましい。
いが、行われることが好ましい）の後に、タンパク質は
次に所望により誘導体化されて所望のジスルフィドを生
成し得る。好ましい実施態様では、誘導体化は本発明の
方法ではシスタミンまたはシスチンを使用して行われ
る。これらの化合物は75ミリモル/lまでの量でインキュ
ベーション混合物に添加されることが好ましい。
【００１５】任意の誘導体化（再生はまた誘導体化しな
いで可能である）の後に、介在の透析が再度行われる。
また、可溶化タンパク質を再生する前に透析することが
可能である。再生は２モル/l未満、好ましくは0.5 モル
/l未満の尿素濃度を使用することが好ましく、そしてそ
れはトリス塩基もしくはトリス塩および／またはアルギ
ニンの存在下で（欧州特許出願第0219874 号と同様）欧
州特許出願第91 919 945.5号と同様にして行われる。こ
の方法を８〜10のpH範囲で行うことが好ましい。
いで可能である）の後に、介在の透析が再度行われる。
また、可溶化タンパク質を再生する前に透析することが
可能である。再生は２モル/l未満、好ましくは0.5 モル
/l未満の尿素濃度を使用することが好ましく、そしてそ
れはトリス塩基もしくはトリス塩および／またはアルギ
ニンの存在下で（欧州特許出願第0219874 号と同様）欧
州特許出願第91 919 945.5号と同様にして行われる。こ
の方法を８〜10のpH範囲で行うことが好ましい。
【００１６】可溶化タンパク質または誘導体化タンパク
質を最終の活性な可溶性形態に変換する再生は、本発明
によれば、シスチンおよび／またはシステイン、シスタ
ミンおよび／またはシステアミンを用いて行われる。誘
導体化が行われない場合、本発明の方法ではシスタミ
ン、またはシスチン、または酸化還元系シスタミン／シ
ステアミン、またはシスチン／システインで再生するこ
とが特に好ましい。しかしながら、タンパク質が混合ジ
スルフィドに変換された場合、即ち誘導体化された場
合、それは還元化合物のみで再生されることが好まし
い。この反応条件およびその他の反応条件に有利な濃度
はオリエンテーリング実験により容易に確立し得る。
質を最終の活性な可溶性形態に変換する再生は、本発明
によれば、シスチンおよび／またはシステイン、シスタ
ミンおよび／またはシステアミンを用いて行われる。誘
導体化が行われない場合、本発明の方法ではシスタミ
ン、またはシスチン、または酸化還元系シスタミン／シ
ステアミン、またはシスチン／システインで再生するこ
とが特に好ましい。しかしながら、タンパク質が混合ジ
スルフィドに変換された場合、即ち誘導体化された場
合、それは還元化合物のみで再生されることが好まし
い。この反応条件およびその他の反応条件に有利な濃度
はオリエンテーリング実験により容易に確立し得る。
【００１７】本願発明の方法では欧州特許出願第024102
2 号のパルス再生を行う。２〜10℃の温度が再生のため
に保たれる。何となれば、活性β-NGFの収率は温度を低
下するにつれて増大するからである。再生は２〜60時間
行われることが好ましい。延長された再生は生物活性タ
ンパク質の高収率をもたらす。先の操作により得られた
修飾された(N- 末端で延長された）組み換えβ-NGFから
天然β-NGFに相当する形態を得るために、配列(a) （開
始アミノ酸としてのメチオニン）、(b) （使用される宿
主中で高い発現率で発現し得るタンパク質のＮ−末端配
列の３〜５個のアミノ酸）および(c) （β−ＮＧＦ前駆
体のプロ配列からの４〜１０個のアミノ酸）は本発明に
よればトリプシン、エンドプロテイナーゼArg C または
同種の特異性のプロテアーゼで開裂される。アミノ酸メ
チオニン（配列a)は既にE.coli自体のプロテアーゼによ
り開裂される。
2 号のパルス再生を行う。２〜10℃の温度が再生のため
に保たれる。何となれば、活性β-NGFの収率は温度を低
下するにつれて増大するからである。再生は２〜60時間
行われることが好ましい。延長された再生は生物活性タ
ンパク質の高収率をもたらす。先の操作により得られた
修飾された(N- 末端で延長された）組み換えβ-NGFから
天然β-NGFに相当する形態を得るために、配列(a) （開
始アミノ酸としてのメチオニン）、(b) （使用される宿
主中で高い発現率で発現し得るタンパク質のＮ−末端配
列の３〜５個のアミノ酸）および(c) （β−ＮＧＦ前駆
体のプロ配列からの４〜１０個のアミノ酸）は本発明に
よればトリプシン、エンドプロテイナーゼArg C または
同種の特異性のプロテアーゼで開裂される。アミノ酸メ
チオニン（配列a)は既にE.coli自体のプロテアーゼによ
り開裂される。
【００１８】N-末端で９個までのアミノ酸だけ短縮され
ている組み換えβ-NGFを得るために、トリプシンまたは
トリプシンと同様の特異性を有するプロテアーゼが添加
される。本発明の方法を使用して、天然ヒトβ-NGFと同
じ活性を有し、かつ上記配列(a) 、(b) および(c) によ
り延長され、またはN-末端で９個までのアミノ酸だけ短
縮されている組み換え生物活性β-NGFを生産することが
可能である。本発明の方法の主な利点は、均一なタンパ
ク質が再現性よく得られ、これらは例えば欧州特許出願
第0450386 号明細書に記載されるようなタンパク質混合
物（N-末端メチオニン残基を有するβ-NGFとN-末端メチ
オニン残基を有しないβ-NGFの混合物）ではないことで
ある。エンドプロテイナーゼArg C またはプロテアーゼ
Kex2(PNAS86(1989)1434-1438;Biochemistry40(1991)367
-372)が開裂に使用される場合、天然配列を有する組み
換えβ-NGFが得られ、これは単離するのに容易であり
（例えば、モノ-Sカラムにより）、そして次に５％以下
の修飾β-NGFまたはβ-NGF開裂生産物の不純物を含む。
組み換えβ-NGFは２％以下のこれらの不純物を含むこと
が好ましい。プロテアーゼKex2が使用される場合、その
他にその他の哺乳類細胞タンパク質を全く含まないβ-N
GFを得ることが可能である。プロテアーゼ開裂は再生生
産物の精製の前または後に行うことができる。
ている組み換えβ-NGFを得るために、トリプシンまたは
トリプシンと同様の特異性を有するプロテアーゼが添加
される。本発明の方法を使用して、天然ヒトβ-NGFと同
じ活性を有し、かつ上記配列(a) 、(b) および(c) によ
り延長され、またはN-末端で９個までのアミノ酸だけ短
縮されている組み換え生物活性β-NGFを生産することが
可能である。本発明の方法の主な利点は、均一なタンパ
ク質が再現性よく得られ、これらは例えば欧州特許出願
第0450386 号明細書に記載されるようなタンパク質混合
物（N-末端メチオニン残基を有するβ-NGFとN-末端メチ
オニン残基を有しないβ-NGFの混合物）ではないことで
ある。エンドプロテイナーゼArg C またはプロテアーゼ
Kex2(PNAS86(1989)1434-1438;Biochemistry40(1991)367
-372)が開裂に使用される場合、天然配列を有する組み
換えβ-NGFが得られ、これは単離するのに容易であり
（例えば、モノ-Sカラムにより）、そして次に５％以下
の修飾β-NGFまたはβ-NGF開裂生産物の不純物を含む。
組み換えβ-NGFは２％以下のこれらの不純物を含むこと
が好ましい。プロテアーゼKex2が使用される場合、その
他にその他の哺乳類細胞タンパク質を全く含まないβ-N
GFを得ることが可能である。プロテアーゼ開裂は再生生
産物の精製の前または後に行うことができる。
【００１９】こうして、更に本発明は、組み換え手段に
より生産され、５％以下、好ましくは２％以下の修飾β
-NGFまたはβ-NGF開裂生産物の形態の不純物を含み、好
ましくはその他の哺乳類細胞タンパク質を含まない天然
配列を有する単離β-NGFに関する。本発明によれば、タ
ンパク質が高収率で得られ、かつ高活性を有する。本発
明の方法の操作（この操作では、発現後に得られた不溶
性凝集物が最初に再生され、次に配列(a) 、(b) および
(c) のみが開裂される）は、生物活性に必要であるタン
パク質の正確な折りたたみおよびまた二量体化が開裂の
前に既に行われていることを保証する。この手段によ
り、例えばトリプシンに関するタンパク質内のプロテア
ーゼ開裂部位は最早接近可能ではなく、かつ配列(a) 、
(b) および(c)および、所望により、N-末端の９個まで
のアミノ酸のみを開裂することが可能である。
より生産され、５％以下、好ましくは２％以下の修飾β
-NGFまたはβ-NGF開裂生産物の形態の不純物を含み、好
ましくはその他の哺乳類細胞タンパク質を含まない天然
配列を有する単離β-NGFに関する。本発明によれば、タ
ンパク質が高収率で得られ、かつ高活性を有する。本発
明の方法の操作（この操作では、発現後に得られた不溶
性凝集物が最初に再生され、次に配列(a) 、(b) および
(c) のみが開裂される）は、生物活性に必要であるタン
パク質の正確な折りたたみおよびまた二量体化が開裂の
前に既に行われていることを保証する。この手段によ
り、例えばトリプシンに関するタンパク質内のプロテア
ーゼ開裂部位は最早接近可能ではなく、かつ配列(a) 、
(b) および(c)および、所望により、N-末端の９個まで
のアミノ酸のみを開裂することが可能である。
【００２０】天然有効性の活性タンパク質を生成するた
めの二量体化は再生中に行われる。N-末端で延長され、
または短縮された組み換えβ-NGFまたはプロ配列を開裂
した後に得られた分子のいずれもが、抗体による認識に
関してマウスからの天然2.5S-NGF と異ならない。それ
故、更に本発明は、成熟ヒトβ-NGFと比較して、使用さ
れる原核生物宿主細胞中で高い発現率で発現し得るタン
パク質のN-末端配列のアミノ末端で更に３〜５個のアミ
ノ酸を有し、またヒトβ-NGFのプロ配列の４〜10個のア
ミノ酸を有するN-末端で延長された組み換えβ-NGFに関
する。
めの二量体化は再生中に行われる。N-末端で延長され、
または短縮された組み換えβ-NGFまたはプロ配列を開裂
した後に得られた分子のいずれもが、抗体による認識に
関してマウスからの天然2.5S-NGF と異ならない。それ
故、更に本発明は、成熟ヒトβ-NGFと比較して、使用さ
れる原核生物宿主細胞中で高い発現率で発現し得るタン
パク質のN-末端配列のアミノ末端で更に３〜５個のアミ
ノ酸を有し、またヒトβ-NGFのプロ配列の４〜10個のア
ミノ酸を有するN-末端で延長された組み換えβ-NGFに関
する。
【００２１】これに関して、本発明のN-末端で延長され
た組み換えβ-NGFはtPA のプレプロ配列、特にアミノ酸
配列Ser-Thr-Glu を含むことが好ましい。本発明により
修飾されたβ-NGFは、プロ配列としての成熟アミノ酸配
列の前のβ-NGF前駆体中のプロ配列の最後のアミノ酸、
特に最後の７個のアミノ酸を含むことが好ましい。特に
好ましい修飾β-NGFのアミノ酸配列が図２に示される。
た組み換えβ-NGFはtPA のプレプロ配列、特にアミノ酸
配列Ser-Thr-Glu を含むことが好ましい。本発明により
修飾されたβ-NGFは、プロ配列としての成熟アミノ酸配
列の前のβ-NGF前駆体中のプロ配列の最後のアミノ酸、
特に最後の７個のアミノ酸を含むことが好ましい。特に
好ましい修飾β-NGFのアミノ酸配列が図２に示される。
【００２２】また、本発明は、本発明によりN-末端で延
長された組み換えβ-NGFをコードするDNA 配列に関する
だけでなく、本発明のDNA 配列を含む発現ベクターに関
する。これに関して、プラスミドの如き当業者に知られ
ているベクターが本発明の発現ベクターとして好適であ
る。このような発現ベクターは、特別な宿主生物中の発
現に必要な全ての成分、例えば、プロモーター、リボソ
ーム結合部位、終止配列等を含む。本発明によれば、発
現ベクターは誘導プロモーターを含むことが好ましい。
長された組み換えβ-NGFをコードするDNA 配列に関する
だけでなく、本発明のDNA 配列を含む発現ベクターに関
する。これに関して、プラスミドの如き当業者に知られ
ているベクターが本発明の発現ベクターとして好適であ
る。このような発現ベクターは、特別な宿主生物中の発
現に必要な全ての成分、例えば、プロモーター、リボソ
ーム結合部位、終止配列等を含む。本発明によれば、発
現ベクターは誘導プロモーターを含むことが好ましい。
【００２３】このような本発明の発現ベクターは例えば
図１に図示されているプラスミドpNGF1 である。N-末端
で延長または短縮されたβ-NGFはニューロンに対して天
然β-NGFと同じ効果を有する。それ故、また本発明は、
医薬中のその使用に関するだけでなく、この目的のため
に組み換え手段により本発明により生産されたβ-NGFの
使用に関する。
図１に図示されているプラスミドpNGF1 である。N-末端
で延長または短縮されたβ-NGFはニューロンに対して天
然β-NGFと同じ効果を有する。それ故、また本発明は、
医薬中のその使用に関するだけでなく、この目的のため
に組み換え手段により本発明により生産されたβ-NGFの
使用に関する。
【００２４】更にまた、本発明は、通常の担体および助
剤の他に、活性成分として、組み換え手段により生産さ
れ、かつN-末端で延長または短縮されている本発明の組
み換えβ-NGFを含む治療組成物に関する。本願で記載さ
れたプラスミドおよび微生物は“Deutsche Sammlung vo
n Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)",Masc
heroder Weg 1b,D-3300 Braunschweigに寄託され、下記
の寄託番号を有する。 E.coli C 600+ DSM5443 E.coli C 600+ 中のpUBS 520 DSM6786 E.coli C 600+ 中のpNGF1/pUBS 520 DSM6785 図面および配列プロトコルと組み合わせて以下の実施例
は本発明を更に詳しく説明する。 図面の説明 図１ この場合には本発明のプラスミドpNGF1 を略図形態で示
す。
剤の他に、活性成分として、組み換え手段により生産さ
れ、かつN-末端で延長または短縮されている本発明の組
み換えβ-NGFを含む治療組成物に関する。本願で記載さ
れたプラスミドおよび微生物は“Deutsche Sammlung vo
n Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)",Masc
heroder Weg 1b,D-3300 Braunschweigに寄託され、下記
の寄託番号を有する。 E.coli C 600+ DSM5443 E.coli C 600+ 中のpUBS 520 DSM6786 E.coli C 600+ 中のpNGF1/pUBS 520 DSM6785 図面および配列プロトコルと組み合わせて以下の実施例
は本発明を更に詳しく説明する。 図面の説明 図１ この場合には本発明のプラスミドpNGF1 を略図形態で示
す。
【００２５】図２ DNA レベルでコードされ、かつ配列ｂ（Ser-Tyr-Gln(SE
Q ID NO 3)) およびｃ（Arg-Thr-His-Arg-Ser-Lys-Arg
(SEQ ID NO 2)) を有する本発明の組み換えβ-NGFの一
次構造を示す。 図３ 再生溶液中のグアニジウム塩酸塩濃度に対する再生収率
の依存性を示す。再生は、20mgのIB/ mlを含む透析可溶
化剤を、種々の濃度のグアニジウム塩酸塩を含む0.7 モ
ル/lのアルギニン、1.0 モル/lの尿素、0.1 モル/lのト
リス、２ミリモル/lのEDTA、５ミリモル/lのシステアミ
ン、１ミリモル/lのシスタミン、pH8.7、４℃中で1/100
に希釈することにより行われる。
Q ID NO 3)) およびｃ（Arg-Thr-His-Arg-Ser-Lys-Arg
(SEQ ID NO 2)) を有する本発明の組み換えβ-NGFの一
次構造を示す。 図３ 再生溶液中のグアニジウム塩酸塩濃度に対する再生収率
の依存性を示す。再生は、20mgのIB/ mlを含む透析可溶
化剤を、種々の濃度のグアニジウム塩酸塩を含む0.7 モ
ル/lのアルギニン、1.0 モル/lの尿素、0.1 モル/lのト
リス、２ミリモル/lのEDTA、５ミリモル/lのシステアミ
ン、１ミリモル/lのシスタミン、pH8.7、４℃中で1/100
に希釈することにより行われる。
【００２６】図４ 再生溶液中のタンパク質濃度に対する再生収率の依存性
を示す。再生は、50mgのIB/ mlを含む透析可溶化剤を、
0.7 モル/lのアルギニン、2.0 モル/lの尿素、0.1 モル
/lのトリス、２ミリモル/lのEDTA、５ミリモル/lのシス
テアミン、１ミリモル/lのシスタミン、pH8.7 中で1/1
2.5〜1/1000に希釈することにより行われた。再生溶液
中のグアニジウム塩酸塩を、可溶化剤の添加後に全ての
溶液が0.48モル/lのグアニジウム塩酸塩を含むように、
可溶化剤の添加前に増加した。
を示す。再生は、50mgのIB/ mlを含む透析可溶化剤を、
0.7 モル/lのアルギニン、2.0 モル/lの尿素、0.1 モル
/lのトリス、２ミリモル/lのEDTA、５ミリモル/lのシス
テアミン、１ミリモル/lのシスタミン、pH8.7 中で1/1
2.5〜1/1000に希釈することにより行われた。再生溶液
中のグアニジウム塩酸塩を、可溶化剤の添加後に全ての
溶液が0.48モル/lのグアニジウム塩酸塩を含むように、
可溶化剤の添加前に増加した。
【００２７】図５ 再生溶液のpHに対する再生収率の依存性を示す。再生
は、50mgのIB/ mlを含む透析可溶化剤を、0.7 モル/lの
アルギニン、２モル/lの尿素、0.1 モル/lのトリス、２
ミリモル/lのEDTA、５ミリモル/lのシステアミン、１ミ
リモル/lのシスタミン、pH8.0 〜10.5、４℃中で1/200
に希釈することにより行われた。
は、50mgのIB/ mlを含む透析可溶化剤を、0.7 モル/lの
アルギニン、２モル/lの尿素、0.1 モル/lのトリス、２
ミリモル/lのEDTA、５ミリモル/lのシステアミン、１ミ
リモル/lのシスタミン、pH8.0 〜10.5、４℃中で1/200
に希釈することにより行われた。
【００２８】図６ 50ミリモル/lのトリス/HCl、１ミリモル/lのEDTA、pH7.
5 中の修飾された（N-末端で延長された）組み換えβ-N
GFのUVスペクトルを示す。 図７ マウスからの2.5 S-NGF と比較した組み換えβ-NGFのSD
S ゲルのクーマシーブルー染色を示す。
5 中の修飾された（N-末端で延長された）組み換えβ-N
GFのUVスペクトルを示す。 図７ マウスからの2.5 S-NGF と比較した組み換えβ-NGFのSD
S ゲルのクーマシーブルー染色を示す。
【００２９】図８ 修飾された（N-末端で延長された）組み換えβ-NGFのHP
LC溶離ダイアグラムを示す。 図９ 組み換え（N-末端で延長された）β-NGF（図9a) および
マウスからの2.5 S-NGF(図9b) のスペロース６溶離ダイ
アグラムを示す。
LC溶離ダイアグラムを示す。 図９ 組み換え（N-末端で延長された）β-NGF（図9a) および
マウスからの2.5 S-NGF(図9b) のスペロース６溶離ダイ
アグラムを示す。
【００３０】図１０ 未消化の組み換えβ-NGFのモノＳ溶離ダイアグラムを示
す。 図１１ トリプシンによる消化後のダイアグラムを示す。 図１２ エンドプロテイナーゼArg C による消化後のダイアグラ
ムを示す。SEQ ID NO 1 はN-末端配列SEQ ID NO 2 およ
び3 を有する組み換えβ-NGFのアミノ酸配列を示す。SE
Q ID NO 2 はβ-NGF前駆体のプロ配列の一部を示す。SE
Q ID NO 3 はtPA のN-末端アミノ酸配列の一部を示す。
SEQ ID NO 4 はtPA のN-末端アミノ酸配列の一部を示
す。SEQ ID NO 5 および6 はpNGF1 を構成するためのオ
リゴヌクレオチドを示す。SEQ ID NO 7 はrec.NGF のN-
末端アミノ酸配列を示す。SEQ ID NO 8 〜10は種々のN-
末端で短縮されたβ-NGF誘導体のN-末端アミノ酸配列を
示す。
す。 図１１ トリプシンによる消化後のダイアグラムを示す。 図１２ エンドプロテイナーゼArg C による消化後のダイアグラ
ムを示す。SEQ ID NO 1 はN-末端配列SEQ ID NO 2 およ
び3 を有する組み換えβ-NGFのアミノ酸配列を示す。SE
Q ID NO 2 はβ-NGF前駆体のプロ配列の一部を示す。SE
Q ID NO 3 はtPA のN-末端アミノ酸配列の一部を示す。
SEQ ID NO 4 はtPA のN-末端アミノ酸配列の一部を示
す。SEQ ID NO 5 および6 はpNGF1 を構成するためのオ
リゴヌクレオチドを示す。SEQ ID NO 7 はrec.NGF のN-
末端アミノ酸配列を示す。SEQ ID NO 8 〜10は種々のN-
末端で短縮されたβ-NGF誘導体のN-末端アミノ酸配列を
示す。
【００３１】
【実施例】実施例１ 組換え体β−NGF (recβ-NGF, β-NGFミニ融合) のE. C
oli における発現 ａ）発現プラスミドの構築 発現プラスミドを構築するために三調製物をライゲート
した。調製物ＡはプラスミドpBTac1の約4.6kb の大きな
EcoRI/BamHI フラグメントを構成している。このプラス
ミドに関しては、pBTac1を二つの制限酵素EcoRI とBamH
I で処理した。制限混合物をアガローズゲル上で分離し
た。約4.6kb のサイズを有するフラグメントを切り出
し、DNA をゲルから溶出した。調節物ＢをプラスミドpU
C18-NGF (British Biotechnology, Code BBG26) の制限
より構築した。二つの酵素BspMI とBamHI をその制限の
ために用いた。制限混合物をゲル電気泳動により分離
し、370bp のBspMI/BamHI フラグメントを調製用に入手
した。
oli における発現 ａ）発現プラスミドの構築 発現プラスミドを構築するために三調製物をライゲート
した。調製物ＡはプラスミドpBTac1の約4.6kb の大きな
EcoRI/BamHI フラグメントを構成している。このプラス
ミドに関しては、pBTac1を二つの制限酵素EcoRI とBamH
I で処理した。制限混合物をアガローズゲル上で分離し
た。約4.6kb のサイズを有するフラグメントを切り出
し、DNA をゲルから溶出した。調節物ＢをプラスミドpU
C18-NGF (British Biotechnology, Code BBG26) の制限
より構築した。二つの酵素BspMI とBamHI をその制限の
ために用いた。制限混合物をゲル電気泳動により分離
し、370bp のBspMI/BamHI フラグメントを調製用に入手
した。
【００３２】下記の配列を有する、合成で生成した２本
のオリゴヌクレオチドをアニールすることにより調製物
Ｃを生成した。 オリゴヌクレオチド１： 5'-AATTCTTATGTCTTACCAAAGAACTCACCGTAGCAAGCGC-3' (配列番号５） オリゴヌクレオチド２： 5-ATGAGCGCTTGCTACGGTGAGTTCTTTGGTAAGACATAAG-3' (配列番号６） 10μg につき各オリゴヌクレオチド２μg をアニーリン
グ反応に用いた; オリゴヌクレオチドを68℃で10分間イ
ンキュベートし、室温までさました。三調製物を既知の
方法によりライゲートし、プラスミドpUBS520 (Brinkma
nnら、1989，Gene85, 109-114 に記載) と共に E.coli
C600+ (DSM5443) を用いて形質転換した。所望のクロー
ンはアンピシリンとカナマイシンでの選択により見つか
り得る。生成したプラスミドpNGF1 は、図１に記載され
ており、出発プラスミドpBTac1とは、特に第２のScaI切
断部位を含むところが異なっている。コードされたタン
パク質のアミノ酸配列は図２に示されている。 ｂ）発現研究 生成したクローンのうちのひとつをβ-NGFミニ融合の発
現に関して調べた。これのために細胞を37℃で光学密度
0.4 (550nmで測定) になるまで培養した。β-NGF融合タ
ンパク質の発現を 5m mol/l のIPTG添加により誘発し
た。細胞をさらに４時間インキュベートし、続いて遠心
より濃縮した。封入体を既知の方法（実施例２参照）に
より調製し15％SDS ポリアクリルアミドゲルで分析し
た。この方法により、全タンパク質に対して20％の発現
収率を測定することが可能となった。 実施例２ 封入体（＝IBs)の調製 rec.β-NGFを含むIBs の調製に関して、実施例１に記載
された発現株E.Coli C600+ をプラスミドpHGF1 と共に1
0l発酵槽で８時間発酵した。発酵を始めてから約４時間
後の対数増殖期にIPTGを添加することによりβ-NGFの発
現を誘発した。
のオリゴヌクレオチドをアニールすることにより調製物
Ｃを生成した。 オリゴヌクレオチド１： 5'-AATTCTTATGTCTTACCAAAGAACTCACCGTAGCAAGCGC-3' (配列番号５） オリゴヌクレオチド２： 5-ATGAGCGCTTGCTACGGTGAGTTCTTTGGTAAGACATAAG-3' (配列番号６） 10μg につき各オリゴヌクレオチド２μg をアニーリン
グ反応に用いた; オリゴヌクレオチドを68℃で10分間イ
ンキュベートし、室温までさました。三調製物を既知の
方法によりライゲートし、プラスミドpUBS520 (Brinkma
nnら、1989，Gene85, 109-114 に記載) と共に E.coli
C600+ (DSM5443) を用いて形質転換した。所望のクロー
ンはアンピシリンとカナマイシンでの選択により見つか
り得る。生成したプラスミドpNGF1 は、図１に記載され
ており、出発プラスミドpBTac1とは、特に第２のScaI切
断部位を含むところが異なっている。コードされたタン
パク質のアミノ酸配列は図２に示されている。 ｂ）発現研究 生成したクローンのうちのひとつをβ-NGFミニ融合の発
現に関して調べた。これのために細胞を37℃で光学密度
0.4 (550nmで測定) になるまで培養した。β-NGF融合タ
ンパク質の発現を 5m mol/l のIPTG添加により誘発し
た。細胞をさらに４時間インキュベートし、続いて遠心
より濃縮した。封入体を既知の方法（実施例２参照）に
より調製し15％SDS ポリアクリルアミドゲルで分析し
た。この方法により、全タンパク質に対して20％の発現
収率を測定することが可能となった。 実施例２ 封入体（＝IBs)の調製 rec.β-NGFを含むIBs の調製に関して、実施例１に記載
された発現株E.Coli C600+ をプラスミドpHGF1 と共に1
0l発酵槽で８時間発酵した。発酵を始めてから約４時間
後の対数増殖期にIPTGを添加することによりβ-NGFの発
現を誘発した。
【００３３】８時間の発酵の後、遠心により690gのバイ
オマスを収穫した。バイオマスを3.5 lの0.1mol／l ト
リス／HCl, pH7に懸濁し、0.3gのリゾチームを添加した
後０℃で20分間インキュベートした。続いて完全な細胞
溶解を 600バーの高圧分散により行った。DNアーゼを0.
1mg/mlの最終濃度になるように、そしてMgSO4 を2 mmol
/lの最終濃度になるように溶解液に加え、溶液を20℃で
30分間インキュベートした。DNアーゼ処理の後、溶液を
等量の0.1 mol/l トリス／HCl,６％トリトンＸ−100,
1.5mol/l NaCl, 60mmol／l EDTA, pH7.0 で希釈し、水
浴中で20分間インキュベートした。続いて不溶解性成分
(IBs)を遠心により分離した。沈澱物を１lの0.5mol／l
グアニジニウムHCl (GdmCl), 20mmol/l EDTA, pH4.5
中に懸濁した。20℃で20分間インキュベートした後、IB
s を再び遠心することにより収穫した。続いて沈澱物を
1.5 lの0.1 mol ／l トリス／HCl, 20mmol/l EDTA, pH
6.5中に再懸濁した。20℃で30分間のインキュベートの
後、さらに別の遠心によりIBs を沈澱物中に得た。
オマスを収穫した。バイオマスを3.5 lの0.1mol／l ト
リス／HCl, pH7に懸濁し、0.3gのリゾチームを添加した
後０℃で20分間インキュベートした。続いて完全な細胞
溶解を 600バーの高圧分散により行った。DNアーゼを0.
1mg/mlの最終濃度になるように、そしてMgSO4 を2 mmol
/lの最終濃度になるように溶解液に加え、溶液を20℃で
30分間インキュベートした。DNアーゼ処理の後、溶液を
等量の0.1 mol/l トリス／HCl,６％トリトンＸ−100,
1.5mol/l NaCl, 60mmol／l EDTA, pH7.0 で希釈し、水
浴中で20分間インキュベートした。続いて不溶解性成分
(IBs)を遠心により分離した。沈澱物を１lの0.5mol／l
グアニジニウムHCl (GdmCl), 20mmol/l EDTA, pH4.5
中に懸濁した。20℃で20分間インキュベートした後、IB
s を再び遠心することにより収穫した。続いて沈澱物を
1.5 lの0.1 mol ／l トリス／HCl, 20mmol/l EDTA, pH
6.5中に再懸濁した。20℃で30分間のインキュベートの
後、さらに別の遠心によりIBs を沈澱物中に得た。
【００３４】IBs 中のβ-NGFの割合を測定するために、
500 mgのIBs(含水重量) を6 mol/lGdmcl, 0.1 mol/l
トリス／HCl, 0.1mol/l DTE, 5 mmol/l EDTA, pH8.5 の
溶液で10mlにし、１時間懸濁した。溶液のタンパク質含
有量は較正タンパク質としてBSA を用いBradford (Brad
ford, M.M., Anal. Biochem. 1976, 72, 248) のタンパ
ク質測定法により測定した。SDS ゲル電気泳動を用いて
タンパク質を分離した後溶解したIBs 中の全タンパク質
に対するβ-NGFの割合を試料レーンをデンシトメーター
測定により測定した。10l発酵ブロスから単離されたIBs
は6.0gのβ-HGFを含んでいた。実施例３ rec.β-NGFの可溶化と誘導体化 ａ）可溶化物の生成 IBs を6 mol/l Gdmcl, 0.1 mol/l DTE, 5 mmol/l EDTA,
0.1 mol/lトリス／HCl, pH8.5の溶液に5-50g IB/1l の
濃度で懸濁し、25℃で１時間の攪拌した。いくつかの場
合、この方法で調製された可溶化物をすぐに次の再生に
用いた。 ｂ）透析可溶化物の生成 別の方法として可溶化物のpHをHCl (25 ％) でpH3 に調
整して、酸性溶液を6mol/l Gdmcl, 5 mmol/l EDTA, pH3
で数回透析した。この透析物を再生およびそれに続く誘
導体化のために用いた。 ｃ）誘導体の生成 誘導体（混合したジスルフィド）の生成のために、透析
可溶化物のpHを5NNaOHの添加によりpH8.5 に調整した。
続いてそれを１容量の6 mmol/l Gdmcl, 0.2 mol/l トリ
スHCl, 5 mmol/l EDTA, pH8.5 の溶液で希釈し、固体状
の酸化グルタチオン (GSSG), シスタミンまたはシスチ
ンを75 mmol/l の濃度になるまで加え20℃で１時間イン
キュベートした。シスチンの場合、インキュベーション
はpH8.5の代りにpH9.5 で行った。続いて溶液のpHを25
％HCl でpH3 に調整し、6mol/l GdmCl, 1 mmol/l EDTA,
pH3.0で数回透析した。実施例４ rec.β-NGFの再生 実施例３で生成された可溶化物と誘導体から生物学的に
活性のあるβ-NGFを調製するために、不活性で可溶性形
態のβ-NGFを含む溶液を種々の再生緩衝中で12.5-1000
倍に希釈した。最適再生条件を決定するために、タンパ
ク質濃度、pH、温度およびアルギニン、トリス／HCl,尿
素、GdmCl,酸化グルタチオン (＝GSSGまたはGSH), シス
チン、システイン、シスタミン、システアミンの濃度を
変化させた。結果を表1-3 および図3-5 に示す。
500 mgのIBs(含水重量) を6 mol/lGdmcl, 0.1 mol/l
トリス／HCl, 0.1mol/l DTE, 5 mmol/l EDTA, pH8.5 の
溶液で10mlにし、１時間懸濁した。溶液のタンパク質含
有量は較正タンパク質としてBSA を用いBradford (Brad
ford, M.M., Anal. Biochem. 1976, 72, 248) のタンパ
ク質測定法により測定した。SDS ゲル電気泳動を用いて
タンパク質を分離した後溶解したIBs 中の全タンパク質
に対するβ-NGFの割合を試料レーンをデンシトメーター
測定により測定した。10l発酵ブロスから単離されたIBs
は6.0gのβ-HGFを含んでいた。実施例３ rec.β-NGFの可溶化と誘導体化 ａ）可溶化物の生成 IBs を6 mol/l Gdmcl, 0.1 mol/l DTE, 5 mmol/l EDTA,
0.1 mol/lトリス／HCl, pH8.5の溶液に5-50g IB/1l の
濃度で懸濁し、25℃で１時間の攪拌した。いくつかの場
合、この方法で調製された可溶化物をすぐに次の再生に
用いた。 ｂ）透析可溶化物の生成 別の方法として可溶化物のpHをHCl (25 ％) でpH3 に調
整して、酸性溶液を6mol/l Gdmcl, 5 mmol/l EDTA, pH3
で数回透析した。この透析物を再生およびそれに続く誘
導体化のために用いた。 ｃ）誘導体の生成 誘導体（混合したジスルフィド）の生成のために、透析
可溶化物のpHを5NNaOHの添加によりpH8.5 に調整した。
続いてそれを１容量の6 mmol/l Gdmcl, 0.2 mol/l トリ
スHCl, 5 mmol/l EDTA, pH8.5 の溶液で希釈し、固体状
の酸化グルタチオン (GSSG), シスタミンまたはシスチ
ンを75 mmol/l の濃度になるまで加え20℃で１時間イン
キュベートした。シスチンの場合、インキュベーション
はpH8.5の代りにpH9.5 で行った。続いて溶液のpHを25
％HCl でpH3 に調整し、6mol/l GdmCl, 1 mmol/l EDTA,
pH3.0で数回透析した。実施例４ rec.β-NGFの再生 実施例３で生成された可溶化物と誘導体から生物学的に
活性のあるβ-NGFを調製するために、不活性で可溶性形
態のβ-NGFを含む溶液を種々の再生緩衝中で12.5-1000
倍に希釈した。最適再生条件を決定するために、タンパ
ク質濃度、pH、温度およびアルギニン、トリス／HCl,尿
素、GdmCl,酸化グルタチオン (＝GSSGまたはGSH), シス
チン、システイン、シスタミン、システアミンの濃度を
変化させた。結果を表1-3 および図3-5 に示す。
【００３５】再生溶液中の再生された生物学的活性のあ
るβ−NGF の濃度は、β-NGFにより刺激される、ニワト
リ胚の分裂した背根神経節からの感覚性ニューロンの樹
状突起（＝DRG 検定＝背根神経節アッセイ) Levi-Monta
lcini, R., Meyer H. and Hamburger, V. 1954, Cancer
Res., 14, 49-57; Varon, S., Nomura, J., Perez-Pol
o, J.R. and Shooter, E.M., 1972, Meth. in Neuroche
mistry 3, 203-229; EP-A 0335 673, p. 14-15, 実施例
C)を発芽させる能力を利用して決定し、サイドイッチ酵
素免疫アッセイ (β-NGF-ELISA) も用いた。
るβ−NGF の濃度は、β-NGFにより刺激される、ニワト
リ胚の分裂した背根神経節からの感覚性ニューロンの樹
状突起（＝DRG 検定＝背根神経節アッセイ) Levi-Monta
lcini, R., Meyer H. and Hamburger, V. 1954, Cancer
Res., 14, 49-57; Varon, S., Nomura, J., Perez-Pol
o, J.R. and Shooter, E.M., 1972, Meth. in Neuroche
mistry 3, 203-229; EP-A 0335 673, p. 14-15, 実施例
C)を発芽させる能力を利用して決定し、サイドイッチ酵
素免疫アッセイ (β-NGF-ELISA) も用いた。
【００３６】DRG 検査のために、24時間インキュベーシ
ョンした後再生溶液を50 mmol/l トリス／HCl pH7.5 で
透析し、続いて遠心により不純物を除去した。純粋な上
清または培地 (F14 培地; Coon, M.G. and WeiB, M.C.,
1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 852-859)で希
釈された上清の 100μl アリコートを培地 750μl およ
び分裂神経節の細胞懸濁 150μl と24ウエル細胞培養プ
レート (Costar Company) 中で混合し、37℃で48時間イ
ンキュベートした。形成した樹状突起を有する細胞の数
を生物学的活性の尺度として定量化した。マウスの顎下
腺からの2.5S-NGF (Boehringer Mannheim Company)の既
知の濃度を有する溶液を対照標準として用いた。β-NGF
-ELISAのために、50 mmol/l トリス／HCl pH7.5 で透析
した再生溶液もDRG 検査とその結果を比較するために用
いた。さもなければ、再生溶液を遠心により不純物を除
去した直後に用いた。
ョンした後再生溶液を50 mmol/l トリス／HCl pH7.5 で
透析し、続いて遠心により不純物を除去した。純粋な上
清または培地 (F14 培地; Coon, M.G. and WeiB, M.C.,
1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 852-859)で希
釈された上清の 100μl アリコートを培地 750μl およ
び分裂神経節の細胞懸濁 150μl と24ウエル細胞培養プ
レート (Costar Company) 中で混合し、37℃で48時間イ
ンキュベートした。形成した樹状突起を有する細胞の数
を生物学的活性の尺度として定量化した。マウスの顎下
腺からの2.5S-NGF (Boehringer Mannheim Company)の既
知の濃度を有する溶液を対照標準として用いた。β-NGF
-ELISAのために、50 mmol/l トリス／HCl pH7.5 で透析
した再生溶液もDRG 検査とその結果を比較するために用
いた。さもなければ、再生溶液を遠心により不純物を除
去した直後に用いた。
【００３７】ELISA による再生β-NGFを測定するため
に、0.3 μg 抗体／ml, 50 mmol/l NazCO3, 0.1 ％アジ
化ナトリウム、pH9.6 からなる0.1 ml抗体溶液と各ウエ
ルを４℃で16時間インキュベートすることにより、マウ
ス 2.5S-NGF (Boehringer Mannheim Company) に対する
モノクローナル抗体で96ウエルマイクロタイタープレー
ト (Nunc-Immuno Company; Maxisorp F96 型) を塗布し
た。0.2 mlの50 mmol/lトリス/HCl, 0.2 mol/l Nacl, 1
0 mmol/l CaCl2, 0.2％トリトンX-100, 0.1％アジ化ナ
トリウム、pH7.0 で３回洗浄した後、β-NGFを含む再生
溶液およびその希釈物 (１％BSA 補充の洗浄緩衝液で)
の100 μl アリコートを各ウエルに分注した。対応する
透析し遠心した溶液を細胞検査と比較するために用いる
か、さもなければ再生溶液を遠心による不純物除去の直
後に用いた。濃度範囲0.1 μg/ml−20pg／mlのマウス顎
下腺からの2.5S-NGF (Boehringer Mannheim Company)の
連続希釈も参照標準として各プレートで検査した。37℃
で２時間のインキュベーションの後、溶液を３回洗浄す
ることにより取り除いた。続いてβ−ガラクトシダーゼ
と結合したマウス2.5S-NGFに対するモノクローナル抗体
の溶液 0.1ml (Boehringer Mannheim Company; 1%BSAを
含む洗浄緩衝液中の0.4U/ml)を各ウエルに加え、37℃で
４時間インキュベートした。
に、0.3 μg 抗体／ml, 50 mmol/l NazCO3, 0.1 ％アジ
化ナトリウム、pH9.6 からなる0.1 ml抗体溶液と各ウエ
ルを４℃で16時間インキュベートすることにより、マウ
ス 2.5S-NGF (Boehringer Mannheim Company) に対する
モノクローナル抗体で96ウエルマイクロタイタープレー
ト (Nunc-Immuno Company; Maxisorp F96 型) を塗布し
た。0.2 mlの50 mmol/lトリス/HCl, 0.2 mol/l Nacl, 1
0 mmol/l CaCl2, 0.2％トリトンX-100, 0.1％アジ化ナ
トリウム、pH7.0 で３回洗浄した後、β-NGFを含む再生
溶液およびその希釈物 (１％BSA 補充の洗浄緩衝液で)
の100 μl アリコートを各ウエルに分注した。対応する
透析し遠心した溶液を細胞検査と比較するために用いる
か、さもなければ再生溶液を遠心による不純物除去の直
後に用いた。濃度範囲0.1 μg/ml−20pg／mlのマウス顎
下腺からの2.5S-NGF (Boehringer Mannheim Company)の
連続希釈も参照標準として各プレートで検査した。37℃
で２時間のインキュベーションの後、溶液を３回洗浄す
ることにより取り除いた。続いてβ−ガラクトシダーゼ
と結合したマウス2.5S-NGFに対するモノクローナル抗体
の溶液 0.1ml (Boehringer Mannheim Company; 1%BSAを
含む洗浄緩衝液中の0.4U/ml)を各ウエルに加え、37℃で
４時間インキュベートした。
【００３８】さらに一巡の洗浄後、20mlの100 mmol/lヘ
ペス、150 mmol/l NaCl, 2 mmol/lMgCl2, 0.1％アジ化
ナトリウム, 1 % BSA, pH7中にクロロフェノール レッ
ド−β-D−ガラクトピラノシド40 mg を有する溶液 0.2
mg で各ウエルを満たした。発色に依るが、試料の吸光
度を10−60分後にELISA 読み取り機 (例えば、オースト
リアのSLT-Lab instruments Company のType EAR400AT)
で測定した。再生溶液中のβ-NGF濃度はマウスからの2.
5S-NGFによる検量線に基づいて計算した。
ペス、150 mmol/l NaCl, 2 mmol/lMgCl2, 0.1％アジ化
ナトリウム, 1 % BSA, pH7中にクロロフェノール レッ
ド−β-D−ガラクトピラノシド40 mg を有する溶液 0.2
mg で各ウエルを満たした。発色に依るが、試料の吸光
度を10−60分後にELISA 読み取り機 (例えば、オースト
リアのSLT-Lab instruments Company のType EAR400AT)
で測定した。再生溶液中のβ-NGF濃度はマウスからの2.
5S-NGFによる検量線に基づいて計算した。
【００３９】以後特にことわらない限り、再生溶液を24
時間のインキュベーション期間の後分析した。 表１ 再生条件に関してβ-NGF-GSSG 誘導体 (C ＝15 m
g IB/ml)の再生収率の測定におけるDRG 検査とβ-NGF E
LISAとの相互関係 全ての緩衝液は 0.1 mol/l トリス/HCl, 1 mmol/l EDT
A を含み、20℃でpH8.0 であった。
時間のインキュベーション期間の後分析した。 表１ 再生条件に関してβ-NGF-GSSG 誘導体 (C ＝15 m
g IB/ml)の再生収率の測定におけるDRG 検査とβ-NGF E
LISAとの相互関係 全ての緩衝液は 0.1 mol/l トリス/HCl, 1 mmol/l EDT
A を含み、20℃でpH8.0 であった。
【００４０】補充物および変更したものは表に示されて
いる。 誘導体溶液 再生緩衝液 DRG 検査 ELISA* の希釈 補充物 での活性 シグナル 1/20 --- + ＜ 5 % 1/20 1 mmol/l GSH ++ 25 % 1/20 1 mmol/l GSH+0.5 mol/l Arg +++ 100 % 1/20 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg ++ 75 % 1/20 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 7.0 ++ 31 % 1/20 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 9.0 ++ 48 % 1/100 --- + ＜ 5 % 1/100 1 mmol/l GSH + 20 % 1/100 1 mmol/l GSH+0.5 mol/l Arg ++ 76 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg ++ 46 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 7.0 ++ 36 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 8.0 ++ 52 % 1/100 1 mmol/l GSH+0.5 mol/l Tris/HCl / 33 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Tris/HCl / 91 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Tris/HCl ++ 100 % +0.5 mol/l Arg * ELISA の値を、各々同一の希釈での最大シグナルに関連させた。 表２ 再生中における再生収率の温度への依存 6 mol/l GdmCl, 2 mmol/l EDTA, pH3 で透析された50mg
IB/ml を有する可溶化物を0.7 mol/l Arg, 2.0 mol/l尿
素、0.1 mol/l トリス、2 mmol/l EDTA, 5 mmol/l シス
テアミン、1 mmol/ シスタミン中で 100倍に希釈するこ
とにより、再生を行う。再生β-NGFをELISA により測定
した。 温 度 再生時間 β-NGF (h) [mg/l] 4℃ 10 0.8 4℃ 24 1.4 4℃ 48 2.6 20℃ 10 0.17 20℃ 24 0.4 20℃ 48 0.4 表３ 可溶化物と誘導体の再生収率の、再生溶液中の酸
化還元系への依存 種々の酸化還元成分を含み、5mg/mlのタンパク質濃度を
有する誘導体および可溶化物を透析前および後に、0.5
mol/l Arg, 0.1mol/l トリス/HCl, 1 mmol/l EDTA, pH
8.5中で1/100 に希釈した。
いる。 誘導体溶液 再生緩衝液 DRG 検査 ELISA* の希釈 補充物 での活性 シグナル 1/20 --- + ＜ 5 % 1/20 1 mmol/l GSH ++ 25 % 1/20 1 mmol/l GSH+0.5 mol/l Arg +++ 100 % 1/20 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg ++ 75 % 1/20 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 7.0 ++ 31 % 1/20 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 9.0 ++ 48 % 1/100 --- + ＜ 5 % 1/100 1 mmol/l GSH + 20 % 1/100 1 mmol/l GSH+0.5 mol/l Arg ++ 76 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg ++ 46 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 7.0 ++ 36 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Arg pH 8.0 ++ 52 % 1/100 1 mmol/l GSH+0.5 mol/l Tris/HCl / 33 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Tris/HCl / 91 % 1/100 1 mmol/l GSH+1.0 mol/l Tris/HCl ++ 100 % +0.5 mol/l Arg * ELISA の値を、各々同一の希釈での最大シグナルに関連させた。 表２ 再生中における再生収率の温度への依存 6 mol/l GdmCl, 2 mmol/l EDTA, pH3 で透析された50mg
IB/ml を有する可溶化物を0.7 mol/l Arg, 2.0 mol/l尿
素、0.1 mol/l トリス、2 mmol/l EDTA, 5 mmol/l シス
テアミン、1 mmol/ シスタミン中で 100倍に希釈するこ
とにより、再生を行う。再生β-NGFをELISA により測定
した。 温 度 再生時間 β-NGF (h) [mg/l] 4℃ 10 0.8 4℃ 24 1.4 4℃ 48 2.6 20℃ 10 0.17 20℃ 24 0.4 20℃ 48 0.4 表３ 可溶化物と誘導体の再生収率の、再生溶液中の酸
化還元系への依存 種々の酸化還元成分を含み、5mg/mlのタンパク質濃度を
有する誘導体および可溶化物を透析前および後に、0.5
mol/l Arg, 0.1mol/l トリス/HCl, 1 mmol/l EDTA, pH
8.5中で1/100 に希釈した。
【００４１】収率をβ-NGF ELISAで測定し、最大収率を
有する調製物に対して標準化した。 変性β-NGF 酸化還元成分 相対的収率 (%) GSSG 誘導体 0.5 mmol/l GSH 61 GSSG 誘導体 0.5 mmol/l システアミン 63 GSSG 誘導体 0.5 mmol/l システイン 51 システアミン 誘導体 0.5 mmol/l GSH 28 システアミン 誘導体 0.5 mmol/l システアミン 41 システアミン 誘導体 0.5 mmol/l システイン 35 透析してない可溶化物 2 mmol/l シスタミン 99 透析してない可溶化物 10 mmol/l シスタミン 50 透析後の可溶化物 5 mmol/l GSH/l mmol/l GSSG 35 透析後の可溶化物 5 mmol/l システアミン + 1 mmol/l シスタミン 100 透析後の可溶化物 3 mmol/l GSH/l mmol/l GSH 67 透析後の可溶化物 3 mmol/l システアミン + 1 mmol/l シスタミン 99 実施例５ rec.β-NGFのパルス再生 IB物20g を400 mlの6 mal/l GdmCl, 0.1 mol/lトリス/H
Cl, 0.1 mol/l DTE, 2mmol/l EDTA, pH8.5 中に溶解
し、20℃で１時間インキュベートした。続いて、溶液の
pHを25％HCl でpH3 に調整し、４℃で10lの6 mol/l Gdm
Cl, 2 mmol/l EDTA, pH3 で３度透析した。透析物の100
mlアリコートを12−16時間の間隔で、30分以内に４℃
で20lの0.7 mol/l Arg, 2 mol/l尿素、0.1 mol/l トリ
ス、2 mmol/l EDTA, 5 mmol/l システアミン、1 mmol/l
シスタミン、pH9.1 にポンプを用いて注入した。 表４ 種々の量の透析した可溶化物の添加後、再生調製物中のELISA によるβ-NGF濃度 パルス数 添加した可溶化物 β-NGF 濃度 (mg/l) 1 100 ml 3.5 2 200 ml 5.3 4 400 ml 8.5 実施例６ 再生溶液からの生物学的に活性のあるrec.β-NGFの精製 固体硫酸アンモニウムを実施例５で調製した再生溶液に
20％の飽和になるまで少しずつ添加し、氷上で１時間攪
拌した。続いて溶液のpHを25 % HClでpH3 に調整した。
30分のインキュベーションの後、それを7N NaOH でpH8
に滴定した。混濁は遠心 (4 ℃, 20,000g で１時間）ま
たは、低タンパク質吸着を有する好適な膜を通すろ過
（例えば、日本のKuraray Co. Ltd,のEvaflux 4A中空フ
ァイバー・カートリッジ) により取り除いた。続いてβ
-HGFを含有する澄んだ溶液を50 mmol/l トリス/HCl, 1
mmol/l EDTA, 20 ％飽和の(NH4)2 SO4, pH7.5 で前もっ
て平衡した TSKブチルカラム (Pharmacia Company)にか
けた。試料をかけるのが終了した後、それをプロッター
がベースラインに達するまで50 mmol/l トリス/HCl,1 m
mol/l EDTA, pH7.5で洗浄した。溶出を50 mmol/l の酢
酸ナトリウム、1 mmol/l EDTA, pH4.5中の50％エチレン
グリコールで行った。溶出したフラクションのβ-NGFの
含有量をELISA を用いて検査した (実施例４参照）。β
-NGFを含むフラクションをプールし、0.5 mol/l NaCl,
50 mmol/l リン酸ナトリウム、10％グリセロール、1 mm
ol/l EDTA, pH6.0で平衡化したセファクリルS200カラム
(Pharmacia Company, Sweden)にかけた。カラムを同じ
緩衝液で溶出した。
有する調製物に対して標準化した。 変性β-NGF 酸化還元成分 相対的収率 (%) GSSG 誘導体 0.5 mmol/l GSH 61 GSSG 誘導体 0.5 mmol/l システアミン 63 GSSG 誘導体 0.5 mmol/l システイン 51 システアミン 誘導体 0.5 mmol/l GSH 28 システアミン 誘導体 0.5 mmol/l システアミン 41 システアミン 誘導体 0.5 mmol/l システイン 35 透析してない可溶化物 2 mmol/l シスタミン 99 透析してない可溶化物 10 mmol/l シスタミン 50 透析後の可溶化物 5 mmol/l GSH/l mmol/l GSSG 35 透析後の可溶化物 5 mmol/l システアミン + 1 mmol/l シスタミン 100 透析後の可溶化物 3 mmol/l GSH/l mmol/l GSH 67 透析後の可溶化物 3 mmol/l システアミン + 1 mmol/l シスタミン 99 実施例５ rec.β-NGFのパルス再生 IB物20g を400 mlの6 mal/l GdmCl, 0.1 mol/lトリス/H
Cl, 0.1 mol/l DTE, 2mmol/l EDTA, pH8.5 中に溶解
し、20℃で１時間インキュベートした。続いて、溶液の
pHを25％HCl でpH3 に調整し、４℃で10lの6 mol/l Gdm
Cl, 2 mmol/l EDTA, pH3 で３度透析した。透析物の100
mlアリコートを12−16時間の間隔で、30分以内に４℃
で20lの0.7 mol/l Arg, 2 mol/l尿素、0.1 mol/l トリ
ス、2 mmol/l EDTA, 5 mmol/l システアミン、1 mmol/l
シスタミン、pH9.1 にポンプを用いて注入した。 表４ 種々の量の透析した可溶化物の添加後、再生調製物中のELISA によるβ-NGF濃度 パルス数 添加した可溶化物 β-NGF 濃度 (mg/l) 1 100 ml 3.5 2 200 ml 5.3 4 400 ml 8.5 実施例６ 再生溶液からの生物学的に活性のあるrec.β-NGFの精製 固体硫酸アンモニウムを実施例５で調製した再生溶液に
20％の飽和になるまで少しずつ添加し、氷上で１時間攪
拌した。続いて溶液のpHを25 % HClでpH3 に調整した。
30分のインキュベーションの後、それを7N NaOH でpH8
に滴定した。混濁は遠心 (4 ℃, 20,000g で１時間）ま
たは、低タンパク質吸着を有する好適な膜を通すろ過
（例えば、日本のKuraray Co. Ltd,のEvaflux 4A中空フ
ァイバー・カートリッジ) により取り除いた。続いてβ
-HGFを含有する澄んだ溶液を50 mmol/l トリス/HCl, 1
mmol/l EDTA, 20 ％飽和の(NH4)2 SO4, pH7.5 で前もっ
て平衡した TSKブチルカラム (Pharmacia Company)にか
けた。試料をかけるのが終了した後、それをプロッター
がベースラインに達するまで50 mmol/l トリス/HCl,1 m
mol/l EDTA, pH7.5で洗浄した。溶出を50 mmol/l の酢
酸ナトリウム、1 mmol/l EDTA, pH4.5中の50％エチレン
グリコールで行った。溶出したフラクションのβ-NGFの
含有量をELISA を用いて検査した (実施例４参照）。β
-NGFを含むフラクションをプールし、0.5 mol/l NaCl,
50 mmol/l リン酸ナトリウム、10％グリセロール、1 mm
ol/l EDTA, pH6.0で平衡化したセファクリルS200カラム
(Pharmacia Company, Sweden)にかけた。カラムを同じ
緩衝液で溶出した。
【００４２】β-NGFを含む溶出物中のフラクションを15
mS の導電性があるように水で希釈し、20 mmol/l リン
酸ナトリウム、1 mmol/l EDTA, pH6.0で平衡したＳセフ
ァローズカラム（Pharmacia Co.)にかけた。続いて、そ
れを平衡緩衝液で洗浄した。溶出は上記緩衝液中の1.2
mol/l NaClまでの勾配で行った。β-NGFを含むフラクシ
ョンをプールし、続いて分析を必要とする場合は、それ
らを透析により再度緩衝剤処理した。 表５ ELISA で測定された20l再生溶液からのrec.β-NGF精製収率 精製ステップ β-NGF 収 率 (mg) (%) 再生溶液 170 100 TSK-ブチル前 143 84 TSK-ブチル後 92 54 S200後 80 47 S-セファローズ後 61 36 実施例７ 精製 rec. β-NGFの特徴決定 ａ）UV分光光度計による濃度の測定 精製試料中のβ-NGFの濃度を測定するために、50 mmol/
l トリス/HCl, 1 mmol/l EDTA, pH7.5で透析した試料の
240-340nm のUVスペクトルをUV/Vis分光光度計(例え
ば、USA のHewlett-Pac,....Co, のダイオードアレイ分
光光度計Type HP8452A) で測定した。溶液中のβ-NGF濃
度を280 nmでの試料の吸光度から計算した。この目的の
ために、この波長で吸収するアミノ酸の含有量から生じ
る、理論的モル吸光係数である21200 ±100M-1cm-1 (We
tlaufer, D.B., 1962, Adv. in Protein Chemistry, Vo
l. 17, 375-383; Gill, S.C. and von Hippel, P.H., A
nal.Biochem. 182, 319-326) を用いた。14000Dを分子
量として用いた。吸光度により計算された値は、ELISA
により測定されたそれよりも約50％低いβ-NGF濃度を示
した。この考えられる理由は参照標準として用いられた
(マウスからの) 2.5 S-NGF の純度が低いので、ELISA
で測定された値が、rec.β-NGFについて非常に高くなる
のである。 ｂ）純度の分析およびSDS ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を用いた分子量の測定 Midgetシステム (Pharmacia Co, Sweden) の17％ゲルを
用いた。280 nmでの吸光度およびマウスの顎下腺からの
2.5 S-NGF 8.4 μg または2.1 μg に基づいて計算され
た試料は各々10 mmol/l DTE およびrec.β-NGF 6μg ま
たは1.5 μg 含んでいた。予想されたように Rec. β-N
GFは、約12.5 KD の2.5 S-NGF よりも約15KDのいくらか
大きい分子量を有している。ダイマー rec. β-NGFの分
子量範囲において種々の強度を有するバンドがあること
は試料調製および試料の年齢に関係しており、試料調製
中のジスルフィド架橋を有する分子の形成によるもので
ある。rec.β-NGFを有するゲルレーンのデンシトメータ
ーの測定 (Vltrascan XLレーザーデンシトメーター、Ph
armacia Co. Sweden) は93％モノマーおよび７％ダイマ
ーを示した。 ｃ）RP C18-HPLC を用いる純度の分析 20μg のrec.β-NGFを0.1 % TFA で平衡化したVydac 30
0, C18, 5 μ, 125 ×4 mmカラムにかけ、0-40％ B (B
＝アセトニトリル/0.1% TFA)の段階勾配で20分間そして
40-100% B で20-25 分間、1 ml／分の流速で溶出した。
280 nmで励起した後、340 nmでの蛍光発光 (Merck/Hita
chi F-1050蛍光分光光度計) を検出に用いた。溶出曲線
を統合すると92％の純度を得た。同じ様な結果は280 nm
でのUV検出により得られた。β-NGFとしての溶出ピーク
の同定は、集めて、Speed Vac により濃縮した後ELISA
およびＮ末端配列決定により調べた。 ｄ）SEC-HPLCを用いたrec.β-NGFの純度分析 280 nmで1.3 の吸光度を有する精製rec.β-NGF溶液30μ
l をスーパーローズ-6カラム、Type HR 10/30 (Pharmac
ia Co. Sweden)にかけ、0.7 mol/l アルギニン、0.1 mo
l/l トリス、pH8.5 を用い、0.5 ml／分の流速で溶出し
た。280 nmでの吸光度を検出した。図９はマウスの2.5
S-NGF 試料と比較した溶出曲線を示す。 ｅ）Ｎ末端配列分析 RP-HPLC により単離され、続いて実施例7cにより濃縮さ
れたβ-NGFをＮ末端配列分析に用いた。Ｎ末端配列を、
ガス相、タンパク質配列分析装置（モデル477A, USA の
Applied Biosystems Co)を用いて決定した。PTH アミノ
酸当り約400 pmolの信号強度で下記の配列を見い出し
た。
mS の導電性があるように水で希釈し、20 mmol/l リン
酸ナトリウム、1 mmol/l EDTA, pH6.0で平衡したＳセフ
ァローズカラム（Pharmacia Co.)にかけた。続いて、そ
れを平衡緩衝液で洗浄した。溶出は上記緩衝液中の1.2
mol/l NaClまでの勾配で行った。β-NGFを含むフラクシ
ョンをプールし、続いて分析を必要とする場合は、それ
らを透析により再度緩衝剤処理した。 表５ ELISA で測定された20l再生溶液からのrec.β-NGF精製収率 精製ステップ β-NGF 収 率 (mg) (%) 再生溶液 170 100 TSK-ブチル前 143 84 TSK-ブチル後 92 54 S200後 80 47 S-セファローズ後 61 36 実施例７ 精製 rec. β-NGFの特徴決定 ａ）UV分光光度計による濃度の測定 精製試料中のβ-NGFの濃度を測定するために、50 mmol/
l トリス/HCl, 1 mmol/l EDTA, pH7.5で透析した試料の
240-340nm のUVスペクトルをUV/Vis分光光度計(例え
ば、USA のHewlett-Pac,....Co, のダイオードアレイ分
光光度計Type HP8452A) で測定した。溶液中のβ-NGF濃
度を280 nmでの試料の吸光度から計算した。この目的の
ために、この波長で吸収するアミノ酸の含有量から生じ
る、理論的モル吸光係数である21200 ±100M-1cm-1 (We
tlaufer, D.B., 1962, Adv. in Protein Chemistry, Vo
l. 17, 375-383; Gill, S.C. and von Hippel, P.H., A
nal.Biochem. 182, 319-326) を用いた。14000Dを分子
量として用いた。吸光度により計算された値は、ELISA
により測定されたそれよりも約50％低いβ-NGF濃度を示
した。この考えられる理由は参照標準として用いられた
(マウスからの) 2.5 S-NGF の純度が低いので、ELISA
で測定された値が、rec.β-NGFについて非常に高くなる
のである。 ｂ）純度の分析およびSDS ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を用いた分子量の測定 Midgetシステム (Pharmacia Co, Sweden) の17％ゲルを
用いた。280 nmでの吸光度およびマウスの顎下腺からの
2.5 S-NGF 8.4 μg または2.1 μg に基づいて計算され
た試料は各々10 mmol/l DTE およびrec.β-NGF 6μg ま
たは1.5 μg 含んでいた。予想されたように Rec. β-N
GFは、約12.5 KD の2.5 S-NGF よりも約15KDのいくらか
大きい分子量を有している。ダイマー rec. β-NGFの分
子量範囲において種々の強度を有するバンドがあること
は試料調製および試料の年齢に関係しており、試料調製
中のジスルフィド架橋を有する分子の形成によるもので
ある。rec.β-NGFを有するゲルレーンのデンシトメータ
ーの測定 (Vltrascan XLレーザーデンシトメーター、Ph
armacia Co. Sweden) は93％モノマーおよび７％ダイマ
ーを示した。 ｃ）RP C18-HPLC を用いる純度の分析 20μg のrec.β-NGFを0.1 % TFA で平衡化したVydac 30
0, C18, 5 μ, 125 ×4 mmカラムにかけ、0-40％ B (B
＝アセトニトリル/0.1% TFA)の段階勾配で20分間そして
40-100% B で20-25 分間、1 ml／分の流速で溶出した。
280 nmで励起した後、340 nmでの蛍光発光 (Merck/Hita
chi F-1050蛍光分光光度計) を検出に用いた。溶出曲線
を統合すると92％の純度を得た。同じ様な結果は280 nm
でのUV検出により得られた。β-NGFとしての溶出ピーク
の同定は、集めて、Speed Vac により濃縮した後ELISA
およびＮ末端配列決定により調べた。 ｄ）SEC-HPLCを用いたrec.β-NGFの純度分析 280 nmで1.3 の吸光度を有する精製rec.β-NGF溶液30μ
l をスーパーローズ-6カラム、Type HR 10/30 (Pharmac
ia Co. Sweden)にかけ、0.7 mol/l アルギニン、0.1 mo
l/l トリス、pH8.5 を用い、0.5 ml／分の流速で溶出し
た。280 nmでの吸光度を検出した。図９はマウスの2.5
S-NGF 試料と比較した溶出曲線を示す。 ｅ）Ｎ末端配列分析 RP-HPLC により単離され、続いて実施例7cにより濃縮さ
れたβ-NGFをＮ末端配列分析に用いた。Ｎ末端配列を、
ガス相、タンパク質配列分析装置（モデル477A, USA の
Applied Biosystems Co)を用いて決定した。PTH アミノ
酸当り約400 pmolの信号強度で下記の配列を見い出し
た。
【００４３】 H2N-Ser-Tyr-Gln-Arg-Thr-His-Arg-Ser (配列番号 7) E.coliにおいてＮ末端アミノ酸メチオニンは、すでに明
らかに切断されている。 ｆ）rec.β-NGFの生物学的活性と抗β-NGF抗体によるそ
の阻害 β-NGFの生物学的活性測定のためのDRG 検査を実施例４
に記載されているように行った。用いられた試料は280
nmでの吸光度およびマウスの顎下腺からの2.5S-NGF に
よるタンパク質測定した後、単離されたrec.β-NGFであ
った。試料を培地で希釈して200, 20 および20 ng/mlに
し、その100 μl のアリコートを750 μl の培地と混合
し、150 μl の細胞懸濁物をインキュベートした。阻害
のために、検査混合物中の抗体濃度が200 ng/ml になる
ようにモノクローナル抗−β-(2.5S) NGF 抗体を含む培
地を用いて細胞検査を行った。結果は表６に示されてい
る。 表６ rec.β-NGFの生物学的活性および抗−β-NGF抗体によるその阻害 β-NGF種 β-NGF濃度 抗 体 生物学的活性 (ng/ml) (ng/ml) rec. β-NGF 20.0 --- +++ rec. β-NGF 2.0 --- +++ rec. β-NGF 0.2 --- ++ rec. β-NGF 20.0 200 +/- rec. β-NGF 2.0 200 - rec. β-NGF 0.2 200 - 2.5 S β-NGF 20.0 --- +++ 2.5 S β-NGF 2.0 --- ++ 2.5 S β-NGF 0.2 --- ++ 2.5 S β-NGF 20.0 200 + 2.5 S β-NGF 2.0 200 - 2.5 S β-NGF 0.2 200 - 実施例８ Ｎ−末端短縮のrec.β-NGF分子の生成および特徴決定 Ｎ末端短縮rec.β-NGF分子を生成するために、精製した
試料を50 mM トリス/HCl, pH 7.7で透析した。濃度は、
280 nmでの試料の吸光度により0.7mg/mlと測定された
(実施例7a参照) 。
らかに切断されている。 ｆ）rec.β-NGFの生物学的活性と抗β-NGF抗体によるそ
の阻害 β-NGFの生物学的活性測定のためのDRG 検査を実施例４
に記載されているように行った。用いられた試料は280
nmでの吸光度およびマウスの顎下腺からの2.5S-NGF に
よるタンパク質測定した後、単離されたrec.β-NGFであ
った。試料を培地で希釈して200, 20 および20 ng/mlに
し、その100 μl のアリコートを750 μl の培地と混合
し、150 μl の細胞懸濁物をインキュベートした。阻害
のために、検査混合物中の抗体濃度が200 ng/ml になる
ようにモノクローナル抗−β-(2.5S) NGF 抗体を含む培
地を用いて細胞検査を行った。結果は表６に示されてい
る。 表６ rec.β-NGFの生物学的活性および抗−β-NGF抗体によるその阻害 β-NGF種 β-NGF濃度 抗 体 生物学的活性 (ng/ml) (ng/ml) rec. β-NGF 20.0 --- +++ rec. β-NGF 2.0 --- +++ rec. β-NGF 0.2 --- ++ rec. β-NGF 20.0 200 +/- rec. β-NGF 2.0 200 - rec. β-NGF 0.2 200 - 2.5 S β-NGF 20.0 --- +++ 2.5 S β-NGF 2.0 --- ++ 2.5 S β-NGF 0.2 --- ++ 2.5 S β-NGF 20.0 200 + 2.5 S β-NGF 2.0 200 - 2.5 S β-NGF 0.2 200 - 実施例８ Ｎ−末端短縮のrec.β-NGF分子の生成および特徴決定 Ｎ末端短縮rec.β-NGF分子を生成するために、精製した
試料を50 mM トリス/HCl, pH 7.7で透析した。濃度は、
280 nmでの試料の吸光度により0.7mg/mlと測定された
(実施例7a参照) 。
【００４４】短縮rec.β-NGF分子を下記の消化混合物中
でエンドプロテイナーゼトリプシンおよびArg C で消化
することにより生成した。 ａ）rec. NGF＋トリプシン：22℃ 200 μl のrec.β-NGF透析物 ＋60μl のトリプシン配列等級溶液(100μg/200 μl,
0.1 mol/lトリス、pH8.0) ｂ）rec. NGF＋エンドプロテイナーゼArgC：37℃ 200 μl rec.β-NGF透析物 ＋20μl の50 mmol/l CaCl2, 50 mmol/l DTE, 100 mmol
/lトリス/HCl, pH7.6＋40μl のエンドプロテイナーゼA
rg C 溶液(40 μl の250 mmol/lトリス/HCl, 25mmol/l
DTE, 2.5 mmol/l EDTA, 5 mmol/CaCl2, pH 7.8 中に20
μg) ｃ）プロテアーゼなしのrec.β-NGF : 22 ℃ 200 μl のrec.β-NGF透析物 ＋60μl の50 mmol/l トリス/HCl, pH 7.7 さらに、rec.β-NGFの代りに透析緩衝液を含む、類似の
対照溶液とプロテアーゼと共に調製した。混合物を対応
する温度で５時間インキュベートした。続いて、混合物
各々200 μl を20 mmol/l リン酸ナトリウム、pH 6.0で
平衡化したモノＳカラムType HR 5/5 (Pharmacia Co.)
へ 1 ml/分の流速で加え、０−1.2 mol/l NaClの直線勾
配で溶出した。280 nmでの吸光度を検出した。プロテア
ーゼのみを有する対照混合物は、最初の10分以内クロマ
トグラフィーで溶出されるものであることを示した。短
縮に依るが、β-NGFを含むフラクションは、少なくとも
滞留時間10分まで溶出しなかった。rec.β-NGFを含む消
化混合物のクロマトグラフィーの溶出曲線は図10に示さ
れている。各々の場合において13-19 分の滞留時間を有
する溶出ピークを集めた。トリプシンを有する消化混合
物の２つのピークを別々に集めた。
でエンドプロテイナーゼトリプシンおよびArg C で消化
することにより生成した。 ａ）rec. NGF＋トリプシン：22℃ 200 μl のrec.β-NGF透析物 ＋60μl のトリプシン配列等級溶液(100μg/200 μl,
0.1 mol/lトリス、pH8.0) ｂ）rec. NGF＋エンドプロテイナーゼArgC：37℃ 200 μl rec.β-NGF透析物 ＋20μl の50 mmol/l CaCl2, 50 mmol/l DTE, 100 mmol
/lトリス/HCl, pH7.6＋40μl のエンドプロテイナーゼA
rg C 溶液(40 μl の250 mmol/lトリス/HCl, 25mmol/l
DTE, 2.5 mmol/l EDTA, 5 mmol/CaCl2, pH 7.8 中に20
μg) ｃ）プロテアーゼなしのrec.β-NGF : 22 ℃ 200 μl のrec.β-NGF透析物 ＋60μl の50 mmol/l トリス/HCl, pH 7.7 さらに、rec.β-NGFの代りに透析緩衝液を含む、類似の
対照溶液とプロテアーゼと共に調製した。混合物を対応
する温度で５時間インキュベートした。続いて、混合物
各々200 μl を20 mmol/l リン酸ナトリウム、pH 6.0で
平衡化したモノＳカラムType HR 5/5 (Pharmacia Co.)
へ 1 ml/分の流速で加え、０−1.2 mol/l NaClの直線勾
配で溶出した。280 nmでの吸光度を検出した。プロテア
ーゼのみを有する対照混合物は、最初の10分以内クロマ
トグラフィーで溶出されるものであることを示した。短
縮に依るが、β-NGFを含むフラクションは、少なくとも
滞留時間10分まで溶出しなかった。rec.β-NGFを含む消
化混合物のクロマトグラフィーの溶出曲線は図10に示さ
れている。各々の場合において13-19 分の滞留時間を有
する溶出ピークを集めた。トリプシンを有する消化混合
物の２つのピークを別々に集めた。
【００４５】集めたピークのフラクションにおけるβ-N
GF濃度を、280 nmでの試料の吸光度により測定した。re
c.β-NGFを含む溶液各々の 1 nmol をRP-C18 HPLC によ
り濃縮し、Ｎ−末端配列をガス相配列決定により決定し
た。さらに、短縮β-NGF分子の生物学的活性を測定する
ために集めたフラクションの試料をDRG 検査の20, 10お
よび 5 ng/mlのβ-HGF濃度に希釈した。抗β-NGF抗体に
よる生物学的活性の阻害を実施例7fに記載されているよ
うに行った。
GF濃度を、280 nmでの試料の吸光度により測定した。re
c.β-NGFを含む溶液各々の 1 nmol をRP-C18 HPLC によ
り濃縮し、Ｎ−末端配列をガス相配列決定により決定し
た。さらに、短縮β-NGF分子の生物学的活性を測定する
ために集めたフラクションの試料をDRG 検査の20, 10お
よび 5 ng/mlのβ-HGF濃度に希釈した。抗β-NGF抗体に
よる生物学的活性の阻害を実施例7fに記載されているよ
うに行った。
【００４６】配列分析および細胞検査の結果は表７およ
び８に要約されている。 表７ タンパク質分解における短縮β-NGF分子のＮ末端配列 用いられた モノＳでの 最初のA.A. プロテアーゼ β-NGFの Ｎ − 末 端 配 列 の位置* 滞留時間 --- 18.5 分 Ser Tyr Gln Arg Thr His Arg Ser - 9 (配列番号７） トリプシン 13.4 分 Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser +10 (配列番号８） トリプシン 14.2 分 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His + 1 (配列番号９) Arg C 14.6 分 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His + 1 (配列番号10) * 各々の場合において、最初に同定されたアミノ酸 (＝A.A)の記載された位置 は、図２中のアミノ酸の番号を表す。 表８ DRG 検査におけるＮ末端短縮β-NGFの生物学的活性 β-NGF種 β-NGF濃度 抗 体 生物学的活性 (ng/ml) (ng/ml) rec. β-NGF 20 --- +++ (未消化) 10 --- +++ 20 200 - トリプシン 20 --- +++ 消 化 10 --- +++ ピーク 13.4 分 20 200 - トリプシン消化 20 --- +++ ピーク 14.2 分 10 --- +++ 20 200 - Arg C 20 --- +++ 消 化 10 --- +++ 20 200 - 配 列 表（１）一般情報： (i) 出願人： (ii) 発明の名称： (iii) 配列の数： 10 (iv) コンピュータ読み取り形式： 該当せず (v) 現在の出願データ： 出願番号： （２）配列番号１の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 129 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： タンパク質 (xi) 配列： 配列番号 NO:1:
び８に要約されている。 表７ タンパク質分解における短縮β-NGF分子のＮ末端配列 用いられた モノＳでの 最初のA.A. プロテアーゼ β-NGFの Ｎ − 末 端 配 列 の位置* 滞留時間 --- 18.5 分 Ser Tyr Gln Arg Thr His Arg Ser - 9 (配列番号７） トリプシン 13.4 分 Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser +10 (配列番号８） トリプシン 14.2 分 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His + 1 (配列番号９) Arg C 14.6 分 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His + 1 (配列番号10) * 各々の場合において、最初に同定されたアミノ酸 (＝A.A)の記載された位置 は、図２中のアミノ酸の番号を表す。 表８ DRG 検査におけるＮ末端短縮β-NGFの生物学的活性 β-NGF種 β-NGF濃度 抗 体 生物学的活性 (ng/ml) (ng/ml) rec. β-NGF 20 --- +++ (未消化) 10 --- +++ 20 200 - トリプシン 20 --- +++ 消 化 10 --- +++ ピーク 13.4 分 20 200 - トリプシン消化 20 --- +++ ピーク 14.2 分 10 --- +++ 20 200 - Arg C 20 --- +++ 消 化 10 --- +++ 20 200 - 配 列 表（１）一般情報： (i) 出願人： (ii) 発明の名称： (iii) 配列の数： 10 (iv) コンピュータ読み取り形式： 該当せず (v) 現在の出願データ： 出願番号： （２）配列番号１の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 129 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： タンパク質 (xi) 配列： 配列番号 NO:1:
【００４７】
【化１】
【００４８】（２）配列番号２の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 7 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列： 配列番号 NO:2:
【００４９】
【化２】
【００５０】（２）配列番号３の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 3 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列： 配列番号 NO:3:
【００５１】
【化３】
【００５２】（２）配列番号４の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 5 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列： 配列番号 NO:4:
【００５３】
【化４】
【００５４】（２）配列番号５の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 40 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列： 配列番号 NO:5:
【００５５】
【化５】
【００５６】（２）配列番号６の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 40 塩基対 （Ｂ）型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列： 配列番号 NO:6:
【００５７】
【化６】
【００５８】（２）配列番号７の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 8 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列： 配列番号 NO:7:
【００５９】
【化７】
【００６０】（２）配列番号８の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 8 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列： 配列番号 NO:8:
【００６１】
【化８】
【００６２】（２）配列番号９の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 8 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列： 配列番号 NO:9:
【００６３】
【化９】
【００６４】（２）配列番号10の情報： (i) 配列の特徴： （Ａ）長さ： 8 アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列： 配列番号 NO:10:
【００６５】
【化１０】
【図１】この場合には本発明のプラスミドpNGF1 を略図
形態で示す図。
形態で示す図。
【図２】本発明の組み換えβ-NGFの一次構造を示す図。
【図３】再生溶液中のグアニジウム塩酸塩濃度に対する
再生収率の依存性を示す図。
再生収率の依存性を示す図。
【図４】再生溶液中のタンパク質濃度に対する再生収率
の依存性を示す図。
の依存性を示す図。
【図５】再生溶液のpHに対する再生収率の依存性を示す
図。
図。
【図６】組み換えβ-NGFのUVスペクトルを示す図。
【図７】組み換えβ-NGFのSDS ゲルのクーマシーブルー
染色を示す図。
染色を示す図。
【図８】修飾された（N-末端で延長された）組み換えβ
-NGFのHPLC溶離ダイアグラムを示す図。
-NGFのHPLC溶離ダイアグラムを示す図。
【図９】組み換え（N-末端で延長された）β-NGF（図9
a) およびマウスからの2.5 S-NGF(図9b) のスペロース
６溶離ダイアグラムを示す。
a) およびマウスからの2.5 S-NGF(図9b) のスペロース
６溶離ダイアグラムを示す。
【図１０】未消化の組み換えβ-NGFのモノＳ溶離ダイア
グラムを示す図。
グラムを示す図。
【図１１】トリプシンによる消化後のダイアグラムを示
す図。
す図。
【図１２】エンドプロテイナーゼArg C による消化後の
ダイアグラムを示す図。
ダイアグラムを示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ライナー ルドルフ ドイツ連邦共和国 8120 ヴァイルハイ ム フェルベールガッセ 17 (72)発明者 アンネ スターン ドイツ連邦共和国 8122 ペンツバーク カルヴェンデルシュトラーセ 10
Claims (10)
- 【請求項１】(a) 成熟β−ＮＧＦの１１８個のアミノ酸
配列または成熟β−ＮＧＦの１１８個のアミノ酸配列の
Ｎ−末端側から９個までのアミノ酸がプロテアーゼを使
用して開裂されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡ配列を原核宿主生物中で発現させ、(b) 発
現後に得られた不活性β−ＮＧＦの不溶性凝集物をシス
タミン／システアミン及びシスチン／システインから選
ばれる酸化還元系の助けによる可溶化およびパルス再生
により可溶性の活性形態に変換し、この際パルス再生
は、アルギニンの存在下２℃から１０℃の間の温度およ
び８−１０のｐＨで実施される、工程からなる原核宿主
細胞中での該ＤＮＡ配列の発現による生物活性β−ＮＧ
Ｆ（神経成長因子）の製造方法。 - 【請求項２】 可溶化後、得られたβ−ＮＧＦを透析
および／またはシスタミン／システアミンまたはシスチ
ン／システインによって誘導体化する請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 プロテアーゼを使用して成熟β−ＮＧ
Ｆの１１８個のアミノ酸配列のＮ−末端側からの９個ま
でのアミノ酸を開裂する請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 該プロテアーゼがトリプシン、エンド
プロテイナーゼＡｒｇＣおよび同種特異性のプロテアー
ゼからなる群から選択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 可溶化がグアニジウム塩酸塩および尿
素から選ばれる変性剤を使用して行われる請求項１に記
載の方法。 - 【請求項６】 シスチンまたはシスタミンが誘導体化
に使用される請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】 再生がシスチンおよび／またはシステ
イン、シスタミンおよび／またはシステアミンを用いて
行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 シスタミン、シスチンならびにシスタ
ミン／システアミンおよびシスチン／システインから選
ばれる酸化還元系を用いる再生が先に誘導体を行わない
で行われる請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 可溶化、透析、誘導体化および再生が
２−１０℃の温度で行われる請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】(a) 不活性な、１１８個のアミノ酸配列
の成熟β−ＮＧＦの不溶性凝集物を得、(b) 不活性なβ
−ＮＧＦの該不溶性凝集物をシスタミン／システアミン
及びシスチン／システインから選ばれる酸化還元系の助
けによるパルス再生により可溶化し、この際パルス再生
は、アルギニンの存在下２℃から１０℃の間の温度およ
び８−１０のｐＨで実施し、そして(c) 生物活性β−Ｎ
ＧＦを単離する工程からなるβ−ＮＧＦを活性化する方
法。
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