JPH04505259A - 副甲状腺ホルモンの製造のための組換えdna法 - Google Patents
副甲状腺ホルモンの製造のための組換えdna法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
副甲状腺ホルモンの製造のための組換えDNA法発明の背景
発明の分野
本発明は、組換えDNA法を用いて細菌中で大量のヒト副甲状腺ホル%7l−8
4(hPTHl−84)またはその変異体を製造するための方法に関する。
微來炊術翌輩朋
副甲状腺ホルモン(P T )()は84アミノ酸残基のペプチドであり、哺乳
動物におけるカルシウム・ホメオスタシスの主要な調節物質の1つである。PT
Hは主に腎臓で作用してカルシウムの再吸収を刺激し、そして骨細胞に作用して
カルシウムの動員を刺激する。また、PTHは骨の整形過程の増強を導< [P
ottsら、 Adv、T’rotein Chew。
防に有望な作用を有しているかもしれない。
PTHの変異体または類似体はPTH受容体に結合することができ、PTHまた
は最近になって発見されたPTH関連ペプチド(腎細胞癌、肺癌および乳癌など
の多種の腫瘍によって産生され、現在では悪性腫瘍の過カルシウム血症の原因で
あると考えられている)上記の理由から、大量の精製が容易なヒトPTHの供給
源が多年にわたってめられていた。
大腸菌におけるPTHの直接発現がいくつかの報告に記載されている[Brey
elら、 3rd Euro 、Cong、Biotech、 、!: 363
−369 (1984)s B。
elラオよびMorelleら(上記)の試みによっては、RNAと9Jバク質
の不安定性の故に、極めて限られた量のホルモン(<500μg/L)しか得ら
れなかった。Rabbaniら(上記)は200μs/LのPTH収量を達成し
たが、これはN−末端で様々に先端切除されたペプチドを不純物として含んでい
た。純粋かつ無傷のPTH(1−84)を複雑な方法で精製すると、最終的な収
量はILの培養物あたりIOμgにすぎなかった。B ornら(上Sc)は、
ヒトプレプロPTHcDNAの複数フビープラスミドを用いて、主にPTH(3
−84)およびPTH(8−84)である先端切除hPTHを発現させたが、こ
れらは実質的にPTHの生物活性を欠いていた。
従って、容易に精製することができ、かつPTHの不活性形態/類似体を含まな
い、安定なPTHのさらに大量の製造を導く発現ベクターの必要性が認議されて
いた。この問題を解決するための1つの方法が、細菌宿主中での他のペプチドの
発現について記aする研究によって示唆されている[1takuraら、 5c
ience 198: 1056−1063 (1977); Riggs、米
国特許No、 4.366、246.微生物ポリペプチド発現のための方法、
(1982年12月28日)H1keharaら、 Proc、Natl、Ac
ad、Sci。
I takuraら(1977、上記)およびRigga(1984、上記)は
、外来タンパク質の細菌発現のための方法、特に所望の異種タンパク質(ヒトソ
マトスフチン)と大きな細菌性タンパク質(β−ガラクトシダーゼ)の間の融合
タンパク質の製造のための方法を教示している。この融合タンパク質は、外来タ
ンパク質の細胞内分解を防止する機能を供する。さらに、過剰発現された融合タ
ンパク質、特にβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質は細菌細胞中の細胞封
入体として蓄積されることが多く、従って単離および精製するのが比較的容易で
ある[Marston、 Biochea+、J、 240: 1−12 (1
986)]。ンマトスタチン遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のC−末端に
相内で挿入され、ンマトスタテン配列のN−末端にメチオニンが存在するように
して臭化シアンによって後に行う融合タンパク質の切断を可能にしている。
誘導可能な細菌性プロモーターであるlacプロモーターが、融合タンパク賀の
mRNAの転写を刺激するために挿入されている。非細菌性タンパク質(例えば
、MS2ファージ)を産生させるために大腸菌中で好ましいことがわかっている
アミノ酸コドンが使用されている。この融合タンパク質を70%ギ酸、6Mグア
ニジニウムHCI。
8Mvrc素、または2%SDSで可溶化し、次いで所望の産物であるソマトス
フチンをCNBr切断、アルコール抽出、およびクロマトグラフィーを用いて豊
富化している。選択的切断部位の考えに基づいて別の切断法についての示唆が為
されている:メチオニンを所望の連結点に挿入して臭化シアンの標的部位とする
ことができると同様に、アミノ酸特異性を有するタンパク質加水分解酵素によっ
て攻撃されうる特異的なアミノ酸部位を導入することができる。
I keharaら(1984、上記)は、ヒト成長ホルモン(hG H”)の
合成遺伝子の発現を促進して191アミノ酸のhG)(ペプチドの合成を高める
大腸菌trpプロモーターを含有するプラスミドを記載している。
この合成遺伝子は、大腸菌において最も頻繁なアミノ酸フドンを使用している。
Nagaiら[Nature 309: 810−812 (1984)コは、
たとえ適切なプロモーターおよびリポソーム結合配列を導入したときであっても
、大腸菌において真核性遺伝子を高レベルで発現させることの限界を指摘し、所
望のペプチドの効率的かつ容易な分離を高めるための有用な方法として、融合タ
ンパク質中での所望の遺伝子産物の産生を開示している。この目的を達成するた
めに、Nagaiらは血液凝固因子f Xaの切断部位として作用する4アミノ
酸の配列を導入し、ファー! シラムダcll遺伝子の一部に融合させたヒトβ
グロビン遺伝子の発1 現を行った。因子Xaによる切断によって、通常の方法
で大腸菌において発現されたほとんどの真核性タンパク質中に存在する、開始フ
ドンによってコードされている余分なN−末端メチオニンが削除他の文献は所望
の異種タンパク質と第2のタンパク質の間の融合タンパク質をフードしているプ
ラスミドの設計および使用を開示しており、これらの一部は、所望のタンパク質
の細菌中での発現を高めるためおよびその精製をさらに容易にするために、因子
Xaまたはトロンビンによって認識される切断部位を含んでいる[Germin
oら。
Proc、Natl、Aead、Sci、USA 81: 892−4696
(1984); 5choltissekら。
ら、 Eur、J、Biochet 174: 405−410 (1988)
;およびDyke@ら、 Eur、ムBioches、 174: 411−4
18 (1988)]。
W ingenderら[J、Biol、Chem、 264: 4367−4
373 (1989)]は、大腸菌中でのhPTHの発現を高めるために上記の
方法を適用することを試みた。Nagaiら(1985、上記)が記載したよう
に発現プラスミドのhPTH部位の上流に因子Xaの認識部位を導入し、因子X
aによるタンパク質加水分解切断を用いて融合タンパク質からhPTHを単離し
ようとする試みは、精製度の高い融合タンパク質およびプロテイナーゼを用いた
ときであっても不成功に終わった。
発明の簡単な要約
hPTl(およびその類似体(選択的なアンタゴニストであって、ある種の病的
状態においてPTH受容体に作用するアゴニストによって媒介される不都合な作
用を遮断することができる)が入手可能になることは、臨床的に大きな価値を有
するものと考えられる。この目的のためには、原核性の発現系が極めて有用であ
ろう。このような系は臨床および研究用に十分な原料を供給するだけでなく、構
造−機能の関係を調べるためおよびホルモン変異体を設計して特異的な働きをさ
せるためにタンパク質操作法を適用することをも可能にするであろう(例えば、
カルシウム動員と骨の再構成、アゴニスト作用とアンタゴニスト作用)。
本発明は、細菌中で効率的に発現させることができるヒト副甲状腺ホルモンをフ
ードしている組換えDNA分子に関する。このDNA分子は宿主において遺伝子
配列を発現させるためのコントロール領域を含有しており、このコントロール領
域はポリペプチド配列をコードしているリーダー配列と機能的に結合している。
このリーダー配列は長さが約600ヌクレオチド未満であり、選択的な酵素切断
部位をコードしているヌクレオチド配列に機能的に結合しており、このヌクレオ
チド配列は発現させようとする遺伝子配列の前に結合さらに、本発明は、リーダ
ーポリペプチド、選択した酵素切断部位、およびhPTH(1−84)またはそ
の変異体からなる融合タン/(り質に関する。
また、本発明は、上記の組換えDNA分子を用いて細菌中で、大量のヒト副甲状
腺ホルモン1−84(hPTH1−84)またはその変異体を製造するための方
法を包含するものである。
本発明の主要な利点の1つは、現在達成することができるレベルの50〜100
倍に改善された高濃度の精製hPTH1−84を製造しうることである。
本発明は、付加されたN−末端メチオニンを欠((それが存在しているときには
、ホルモン調製物の活性を減少させ、ヒト宿主に対してさらに免疫原性にする)
、細菌の細胞内での分解に耐性である安定な形態のhPTH1−84を製造する
ことを可能にする。
さらに、本発明は、有用な副甲状腺ホルモンのアゴニストまたはアンタゴニスト
として作用しつる、変j%N−末端を育するhPTH類似体を製造するためのプ
ラスミド構築物を作成することを可能にする。
図1は、因子Xa認識配列(FXR5)を含有するオリゴヌクレオチドフラグメ
ントおよびトロンビン認識配列を含有する類似フラグメントを示すものであり、
さらに制限部位の存在をも示すものである。特に重要な部位はArgコドンの3
”側の5jul部位であり、この部位がhPTHの暗号配列の5°末端との結合
を可能にする。
図2は、組換えhPTHの製造方法を図式的に示すものである。
出発プラスミドであるpGH−L9は、大腸菌のトリプトファンプロモーターお
よびヒトGHをコードしているヌクレオチド配列を含み、BglllおよびS
al r制限部位を含有している。FXR3を含む35ヌクレオチドのオリゴマ
ー(図1を参照)を、pGH−L9中のBglllSai1部位にクローニング
する。即ち、得られた中間体プラスミド(pT G 1 、示していない)は、
FXR3配列に結合したヒトGHのアミノ酸1〜138をコードしているヌクレ
オチドを含有している。この中間体プラスミドを5julで処理して、Argを
コードしているコドンの3゛側に平滑末端を創製する。hPT、Hをコードして
いる遺伝子配列をプラスミドpPTHm124からXbalで切り出し、平滑末
端にし、Xba1部位をフレノウ試薬を用いて充填し、得られた配列を中間体プ
ラスミドpTGl中にクローニングする。この方法により、hPTHのN−末端
コドンをFXRSフラグメントのArgフドンに隣接させることが可能である。
この新規に構築したプラスミドをpGFP−1と命名した。次いで、このプラス
ミドを大腸菌中で発現させると、hGH(1−138)、FXR3,およびhP
TH(1−84)配列を含有する融合タンパク質が産生された。因子Xaで切断
すると、N−末端のセリン残基が修飾されていない無傷のhPTH(1−84)
ホルモンが放出された。次いで、このhPTHをHPLCで精製した。
図3は、フクロネズミ腎細胞への組換えhPTH(1−84)および合成PTH
(1−34)の結合を示すものである。
図4は、U M R,Ill瘍細胞への組換えhPTH(1−84)および合成
PTH(1−34)の結合を示すものである。
図5は、組換えhPTH(1−84)および合成PTH(1−34)による刺激
に対する、フタロネズミ腎細胞の環状AMP応答を示すものである。
図6は、組換えhPTH(1−84)および合成PTH(1−34)による刺激
に対する、UMR腫瘍細胞の環状AMP応答を示すものである。
好ましい態様の説明
ヒト副甲状腺ホルモン(hPTH)は84アミノ酸残基のポリペプチドである[
hpTH(1−84)]。そのアミノ酸配列[Keutmann、 H,T。
叩: 7365−7369 (1981)]は既知である。
hPTH(1−84)のヌクレオチド配列は多数の既知供給源から得ることがで
きる。例えば、プラスミドpPTHml 24[Bornら、珂ec、Endo
crino1.1: 5−14 (1987)]がこの配列を含んでおり、本発
明のプラスミドpGFP−1を構築するために用いるDNAの供給源となる(図
2を参超)。
hPTHの生物学的活性およびこれら活性を測定するための方法は当分野で周知
である[例えば、Pottsら、 Adv、Protein Ches、 32
:323−395 (19112)を参照]。これらの活性には、腎細胞および
種々の腫瘍セルライン上の受容体への結合、ならびに環状AMP産主の刺激が含
まれる。
本明細書で用いるhPTHの「変異体」なる用語は、hPTHの生物学的活性に
実質的に類似した生物学的活性を有するポリペプチドを指す。このような生物学
的活性には、hPTHの受容体への結合、ならびにその後のこの受容体へのhP
THの結合または作用の阻害が含まれる。2つの分子が実質的に類似した構造を
有しているとき、または2つの分子が類似した生物学的活性を保持しているとき
に、一方の分子は他方の分子に「実質的に類似」していると言われる。
組換えhPTHの「変異体」には、組換えhPTHの「フラグメントエオヨび「
変異体」の両方が含まれる。
rhPTHのフラグメント」なる用語は、該分子の任意のポリペプチド小集団を
指すことを意味する。rhPTHの変異体」なる用語は、この「変異体」がhP
THの生物学的活性に類似する生物学的活性の少なくとも1つを有しているとい
う条件のもとで、完全分子またはそのフラグメントのいずれかに構造が実質的に
類似している分子を指すことを意味する。即ち、ある分子がhPTHの活性に類
似する生物学的活性(hPTH受容体への結合およびその後のhpTHの結合の
阻害を含む)の少なくとも1つを保持しているときには、一方の分子が他方に見
い出されない1またはそれ以上のアミノ酸を含有しているときであっても、また
、2つの分子中のアミノ酸残基の配列が同一ではないときであっても、本明細書
においてこの用語を用いるときにはhPTHの「変異体」であるとみなされる。
本発明で意図されているように、hPTHの変異体がhPTHの生物活性(hP
THの受容体に結合する能力およびhPTHのアンタボ」 ニストとして機能す
る能力を含む)を保持している限り、任意のhpTH変異体を発現させ、製造す
ることができる。
hPTHの変異体は組換え法によって製造する。一方または他方の末端からアミ
ノ酸残基を失っている末端切除の変異体を、ポリペプチドとして発現されうるポ
リヌクレオチドを合成することによって製造する。
ウシPTHの合成類似体であるPTH(3−34)は、インビトロで強力なPT
Hアンタゴーストであると認識されている。N−末端アミノ酸i2および1−7
を欠<hPTHの変異体はアゴニスト活性を欠き、アンタゴニスト活性の能力が
あることが示されている[Born−Lら、 Endocrinol、123:
184g−1853(1988)]。本発明の好ましいhPTH変異体は、N
−末端で末端切除された変異体である。変異体がN−末端から1個のアミノ酸を
切除したものであるときには、この変異体は残基No、lを欠いているが残基N
0.2〜84を含んでおり、hPTH(2−84)と呼ばれる。同様に、N−末
端が切除された変異体は、hPTH(3−84)、hPrH(4−84)などと
呼ばれる。
本発明の好ましい変異体は、hPTH(3−84)、(4−84)、(5−84
)、(6−84)、(7−84)、および(8−84)である。
「融合タンパク質」なる用語は、ヒトPTHまたはその変異体がそのN−末端の
ところで「選択的切断部位」に結合し、次いでこれがそのN−末端のところで別
のアミノ酸リーダーポリペプチド配列に結合している融合タンパク質を意味する
。融合タンパク質中の結合は、本発明の一部を構成する遺伝子配列から転写され
るmRNAに由来する、タンパク質生合成中に宿主細胞において生成される通常
のペプチド結合によっている。
「選択的切断部位」なる用語は、化学物質または酵素のいずれかによって選択的
に切断することができ、かつ予測可能な状態で切断することができるアミノ酸残
基または残基群を指す。選択的な酵素切断部位は、タンパク質加水分解酵素によ
って認識され、そして加水分解されるアミノ酸またはペプチド配列である。この
ような部位の例には、トリプシンまたはキモトリプシン切断部位が含まれる。
本発明の好ましい態様においては、この選択的切断部位は、血液凝固因子Xaに
よって認識され、そして切断される配列11e−G 1u−G 1y−A rg
からなる。他の態様では、この選択的切断部位は、トロンビンによって認識され
、そして切断される配列L eu−V al−P ro−A rgを有している
。
この酵素認識部位をコードしている配列の5゛側のオリゴヌクレオチド配列の大
きさは変化してよい。好ましい態様においては、13個のヌクレオチドを、ll
eのコドン(認識部位の最初)とリーダー配列の3°末端の間に設置する。他の
態様においては、さらに長い配列を用いることもできる。これら上流配列は、こ
れらをリーダー配列に隣接したDNA中にクローニングすることを可能にする適
当な制限部位を含んでいなければならない[因子X認識部位(FXR3)を含有
するオリゴヌクレオチドのBg111部位のように;図1および図2を磐照コ。
「リーダー配列」なる用語は、hPTHに結合されるポリヌクレオチド配列であ
って、選択的切断部位およびhPTHに融合した融合タンパク質として宿主細胞
中で発現される配列を意味する。「リーダーポリペプチド」なる用語は、融合タ
ンパク質中に得られる[リーダー配列Jの発現形態を指す。
ある態様では、約600ヌクレオチド未満のリーダー配列を利用する。別の態様
では、ヒト成長ホルモン(191アミノ酸残基)をコードしているヌクレオチド
配列を用い、その結果、リーダーポリペプチドがヒト成長ホルモンである融合タ
ンパク質が得られる[Ikeha−raら、 Proc、Natl、Acad、
Sci、USA 81: 5956−5960 (1984)]。他の態様では
、このリーダーポリペプチドは約50アミノ酸からなる。さらに別の態様では、
このリーダーポリペプチドは約100アミノ酸からなる。
本発明で用いるリーダー配列は、完全なヒト成長ホルモンポリペプチドをコード
するのに必要なヌクレオチド数よりも少ない、即ち、ヒト成長ホルモンの短縮さ
れた変異体をコードしているものであってもよい(これが融合タンパク質に発現
される)。好ましい態様においては、このリーダー配列は、ヒト成長ホルモンの
残基1〜138をコードしているヌクレオチド配列からなる。
リ 過剰発現されたときに細胞封入体中に見い出され、不溶性であることが多い
融合タンパク質を、当分野で周知の方法によって他の細菌性タンパク質から精製
する。好ましい態様では、この不溶性の融合タンパク質を、細胞溶解の後に遠心
して洗浄し、グアニジン−HCtで再溶解する。これは、透析による変性物質の
除去の後に可溶性のままであることができる[屈折力のあるタンパク質の精製に
ついては、JOne&の米国特許No、 4.512.922 ; 01g01
1の米国特許No、 4.518.526 ; Builderらの米国特許N
o、 4.511.502およびNo、4.620.948を参照]。
組換えhPTHは、種々の方法のいずれかを用いることにより、可溶化した融合
タンパク質から天然不純物を実質的に含まないように精製することができる。本
明細書においては、ある化合物が細菌または真核宿主細胞において発現された後
にその化合物に伴われる物質から実質的に精製されたときに、その化合物は「天
然不純物を実質的に含まない」と言う。通常のクロマトグラフィー分離法を用い
てhPTHを精製することができる。
別法では、このペプチドを免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製
してもよい[Rot+san、^、ら、 Biochim、Biophy++、
Acta 341: 114−121 (1981); 5aira+m、M、
R,,J、Chromato 、 215: 143−152 (1981)
; N1elsen、 L、 s、ら、Biochemistry 21: 6
410−[1415(1982); Woekley、 J、ら、Bioche
mj、217: 535−542 (1984); Paucha、E、ら、J
、Vi68 (1985)]。
部分的または実質的な精製の後に、融合タンパク質を選択的切断部位に対応する
酵素で処理する。別法では、さらに不純な状態にある融合タンパク質を、屈折力
のある形態であっても酵素で処理することができる。必要なら、得られた成熟h
PTHまたはその変異体をさらに精製することができる。
酵素処理のための条件は当業者に既知である。
DNA配列の発現は、このDNA配列が転写および翻訳調節情報を含むDNA配
列に「機能的に結合」していることを必要とする。
機能的な結合とは、コントロールまたは調節DNA配列および発現させようとす
るDNA配列が、遺伝子を発現させるような仕方で結合している結合を指す。遺
伝子発現に必要な「コントロール領域」の正確な性質は生物の種類によって変わ
るであろうが、通常は、プロモーター領域を含むであろう。原核生物では、この
プロモーター領域は、プロモーター(RNA転写の開始を指令する)ならびにR
NAに転写されたときにタンパク質合成の開始を合図するであろうDNA配列の
両方を含んでいる。通常、真核細胞における調節領域はRNA合成の開始を指令
するに十分なプロモーター領域を含有している。
2つのDNA配列の間の結合の性質が次のようであるときに、この2つのDNA
配列は機能的に結合していると言われる=(1)フレームシフト突然変異を導入
する結果にならない;(2)融合タンパク質をコードしている配列の転写を指令
するプロモーター領域配列の能力に悪影響を及ぼさない;または(3)プロモー
ター領域配列によって転写させようとする融合タンパク質コード化配列の能力に
悪影響を及ぼさない。即ち、プロモーターがDNA配列を転写させることができ
るなら、該プロモーター領域は該DNA配列に機能的に結合している。
原核細胞(f!qえば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属、ストレプトマイセ
ス属など)中でhPTH分子またはその変異体もしくは機能的誘導体を発現させ
るためには、hPTHをコードしている配列を機能的な原核性プロモーターに機
能的に結合させることが必要である。このようなプロモーターは構成性またはよ
り好ましくは調節可能(即ち、誘導可能または抑制解除可能)のいずれであって
もよい。
構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのintプロモーター、p
B R322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター、およびpPR3
25のクロラムフ二ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモ
ーターなどが含まれる。誘導可能な原核性プロモーターの例には、バクテリオフ
ァージλの主右側および左側プロモーター(PLおよびp、)、大腸菌のtrp
、 recA、 1acZ、 1aclおよびgalプロモーター、枯草菌のα
−アミラーゼプロモーター[Ulmanen、 1.ら、 J、Bacteri
ol、 162: 176−182 (1985)]およびσ−28特異的なプ
ロモーター[G11aan、M、Z、ら、 Gene 32: 11−20 (
19g4)]、ハシラス属のバクテリオファージのプロモーター[Grycza
n、 T、 J、 、 ENY (1982)]、ならびにストレプトマイセス
属のプロモーター[1a rd +JM、ら、 Mo1.Gen、Genet、
203: 468−478 (1986)]が含まれる。原核性のプロモータ
ーは概説されている[G11ck、 B、 R,、J、 I nd、 Micr
obiol。
1: 277−282 (1987); CenaLie+*po、Y、、Bi
ochimie 68: 505−516 (1986);およびGottes
man、S、、Ann、Rev、Genet、18: 415−442 (19
84)コ。
本発明の発現ベクターを得るための種々のDNAフラグメントの結合は、平滑末
端または付着末端にした連結用末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、適
切な付着末端の充填、所望ではない結合を避けるためのアルカリおよびホスファ
ターゼ処理、ならびに適当なりガーゼによる連結を用い、常法に従って行う。こ
の遺伝子構築物は、融合タンパク質の5°遺遺伝子列に機能的に結合した誘導可
能なプロモーターをコードしており、融合タンパク質の効率的な発現を可能にす
る。
で誘導することができる大腸菌trpプロモーターである。
原核細胞における適切な発現には、遺伝子コード化配列の上流のリポソーム結合
部位の存在が必要である。このようなリポソーム結合部位は開示されている[例
えば、Gold、 L、ら、Ann、 Rev、 Mfcrobiol。
真核細胞(例えば、酵母、菌類、哺乳動物細胞または植物細胞など)での発現が
所望であるときには、そのような真核宿主において転写を指令することができる
プロモーターを用いることが必要である。好ましい真核性プロモーターには、マ
ウスメタロチオネイン!遺伝子のプロモーター[Hamer、 o、ら、 JJ
ol、Apl)1.Gen、 4: 27:l−288(1982)] ; ヘ
ルペスウィルスのTKプロモーター[McKnight、S、、 Cel子のプ
ロモーター[Johnston、 S、 A、ら、 Proc、Natl、Ac
ad、Sci、USA ?9:6971−6975 (1982); 5ilv
er、P、A、ら、Proe、Natl、Acad、Sci、USA 81:5
951−5955 (1984)]が含まれる。
導入された遺伝子配列を、受容宿主において自律的な複製が可能なプラスミドま
たはウィルスベクターに導入するのが好ましい。この目的に多種多様のベクター
の任意のものを用いることができる。
特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択する際の重要な因子には次のも
のが含まれる:即ち、ベクターを含んでいる受容細胞を、ベクターを含んでいな
い受容細胞から認識および選択する際の容易さ;特定の宿主において望ましいベ
クターのコピー数;ならびに、異なる種の宿主細胞の間でベクターを「往復」さ
せうろことが所望であるか否かなどである。好ましい原核性ベクターには、大腸
菌中で腹製することができるプラスミド、例えば、pBR322、Co1E1、
pSC101,pACYC184、πVXなどが含まれる。
このようなプラスミドは、例えば、Maniatis、 T 、ら[Mo1ec
ular C1onin 、 A Laborator Manual中、 C
o1d Spring Harbor Press、 ColdSpring
Harbor、 NY (1982)]が開示している。バシラス属プラスミド
にはpC194、pc221、pT127などが含まれる。このようなプラスミ
ドは、例えば、G ryeZanl ”r、 [The Mo1ecular
Biologyor the Bacilli中+ Academic Pre
ss、 NY (1982)、 pp、307−329コが開示している。適当
なストレプトマイセス属プラスミドには、p■J 101 [Kendall、
1[、J、ら、J、Bacteriol、169: 417?−4183(LH
7)]、およびφC31などのストレプトマイセスバクテリオファージ[Cha
ter、 K、 F、ら、 Si++th International Sy
m osium on ActinoaycetalesBiology中、^
kademiai Kaido、 Budapest、 I(ungary (
1986)+ pp、45−54]が含まれる。シ二−ドモナス属プラスミドは
、John、J、F、ら[Rev、 Inrect、Dis、 8: 693−
704 (1986)]、およびI zaki、 K、 [江ムムBacter
io1.33: 729−742 (197g)コが概説している。
好ましい真核性プラスミドにはBPV、ワクシニア、SV40.2−ミクロンサ
ークルなどが含まれる。このようなプラスミドは当分野で周知である[Boti
tein、 o、ら+ Miasi Wntr、Symp、 19: 265−
274(1982); Broach、J、R,、The Mo1ecular
Biology of the Yeast Saccharomyces:
Life Cycle and Inheritance中+ Co1d S
pring HarborLaboratory、 Co1d Spring
Harbor、 IIY+ p、445−470 (1981); Broac
h、 J、 R,、Ce旦28: 203−204 (1982); Boll
on、D、P、ら、J、(lin、He5ato1.oncol、 to: a
9−48 (1980); Maniatis、T、、 Ce1l Biolo
: A Co+a肛江μ臣込e Tre畦江り二邑しム」1狙」鼾シ徂畦勉中
、 Acade■ic Pregs、 NY、 pp、56a−608(198
G)]。
本発明に好ましい細菌宿主は大腸菌である。別の態様では、別の細菌種を用いる
ことができる。さらに別の態様では、例えば酵母、糸状菌などの真核細胞を用い
ることができる。これらの細胞種の使用は当分野で周知である。発現プラスミド
中のレプリコンおよびコントロール配列に適合する任意の宿主を用いてタンノ(
り質を発現させることができる。通常は、宿主細胞に適合する種から導いたレプ
リコンおよびコントロール配列を含有するベクターを、この宿主と組合せて使用
する。このベクターは、レプリフン部位、ならびに感染細胞または形質転換細胞
において表現型選択を与えることができる特別の遺伝子を担持しているのが普通
である。また、融合タンパク質の発現を他の調節配列の制御下に置くこともでき
、この配列は形質転換されていない状態の生物にホモローガスであってもよい。
次いで、hPTHをその周知の用途のすべてに対して使用することができる。
実施例1 ヒトPTH(1−84)の製造pGFP−1(図2を参照)で形質転
換した大腸菌(10ml)をLBアンピシリン培地(IL)に接種した。培養物
の光学密度が600 nml二連したときに、3β−インドールアクリル酸(4
0s+g)を加え、この培養物を37℃で16時間誘導した。5000xgで1
0分間遠心することによって細胞をベレット化し、TE−スクロース(100a
l)に再懸濁し、これにリソチーム(100mg)を加えた。0℃で1.5時間
インキュベートした後、MgC1yを201Mの濃度となるように、そしてDN
アーゼ■を50ag/slの濃度となるように加え、さらに1.5時間インキュ
ベートした。0.2M NaC1,1%デオキシコール酸、1.6%Non1d
et P 40.20饋M トリス−HC1(pH7,5)、2mMEDTA、
および0.5−Mジチオトレイトール(DTT)を含む溶液(200霞l)を加
え、0℃で1.5時間インキュベートすることによって細胞を溶解した。この溶
菌液を5000xgで10分間の遠心によってベレット化した。このベレ・ノド
を0.5%Triton X−100、l*MEDTA、および0.5@MDT
Tで4回洗浄し、遠心することによって融合タンパク質に富むペレ、2トを得た
。
この融合タンパク質のペレ・yトを50−1の6Mグアニジン−HCl、205
Mトリス−HCI(pH7,5)、0.5−M DTT、および1@MEDTA
に溶解し、融合タンパク質が1mg/+ilになるようにした。
この溶液を、50mM)リス−HCI(pH7,8)、0.1MNaC+に対し
て透析した。
活性化した因子Xを100mgの融合タンパク質あたり1mgの比で加え、この
混合物を37°Cで2時間インキュベートした。次いで、この溶液をHPLCR
PC−18システムにかけ、直線の30〜70%アセトニトリル/H,O勾配液
で溶離した。PTH分画は38%アセトニトリルで溶出することがわかった。こ
の分画を凍結乾燥し、後に行う分析用に水に再懸濁した。
GH−PTH融合タンパク質は疎水性であり、68%アセトニトリルで溶出する
ことがわかった。因子Xaで処理した後には、このハイブリッドタンパク質のピ
ークは顕著に減少し、同時に38%アセトニトリルのところにPTHのピークが
現れた。
通常、ハイプリントGH−PTHの収量はILの培養物あたり約50+mgであ
った。5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によると、上記の因子X処
理条件により、融合タンパク質のhPTH(1−84)およびGHフラグメント
への50%の変換が得られた。
実施例2 組換えhPTH(1−84)のアミノ酸組成およびN4端配列の分析
アミノ酸組成の分析は、hpTH(1−84)に対する予想アミノ酸組成と一致
していた。hpTH(1−84)のガス相マイクロ配列決定によって、最初の1
8アミノ酸の配列を確認した。重要なことは、N−末端の1位がセリンであるこ
とがわかったことである。他の研究者が記載しているように[Rabbaniら
、 1988;上記]、得られたhpTHの重要な部分の中にブロックされたア
ミノ末端が存在するという事実は認められなかった。
実施例3 組換えhpTH(1−84)の生物学的活性上記の実施例1の記載の
ように製造された組換えペプチドについて、2種類の細胞型に対する結合を調べ
た。図3に示した結果がられかるように、組換えhPTH(1−84)は、約3
nMの半一最大結合でもって7クロネズミ腎細胞に特異的に結合した。この結果
は、約1 1nMの半一最大結合を示す合成PTH(1−34)の結合に類似し
ていた。図4はUMRラット骨肉腫セルラインを用いた同様の研究を示すもので
あり、ここでは、合成PTH(1−34)の約2nMに対し、組換えhpTH(
1−84)は約10nMの半一最大値で結合した。
環状AMP生成を誘導する生物学的活性が図5および図6に示されている。組換
えhPTH(1−84)は約10nMのEC,、でフクロネズミ腎細胞中の環状
AMPを刺激し、合成PTH(1−34)は約4nMのEC,。を有していた(
図5)。UMR細胞では、組換えhPTH(1−84)は約3nMのEC,、で
環状AMPを刺激し、一方、合成PTH(1−34)は約0.1nMのEC5o
を有していた(図6)。即ち、この組換えペプチドは、既知の活性フラグメント
の活性とほとんどプラスミドpGFP−1を含有する大腸菌株DHIは1989
年5月12日にAmerican Type Cu1ture Co11ect
ion (Rockville、 MD)に寄託されており、受託番号ATCC
67977が付与されている。
本発明をその具体的な態様との関係において説明したが、さらに修飾を加えるこ
とができることは理解されよう。本出願は、広く本発明の原理に従うあらゆる変
異形、使用ま、たは適合を包含することを意図するものであり、本発明が属して
いる分野の既知または通常の実施の範嗜に含まれ、添付した請求の範囲に記載し
たような上記説明の本質的特徴に当てはめることができる本開示からの逸脱を包
含するものである。
、、、LnnL/)
0 Q (り CJ
組換えhPTHの製造方法
■■■■■■
口匪I!ヨ
OK細胞の結合
(ペプチドNogM
(ペプチド月ogM
(ペプチド)log(M)
OK細胞中でのAMPの産生
(ペプチド)log(M)
国際調査報告
I−−^−−−5売葡1026笥
PCT/13890702650
A?rAm
gAO(πRε:
Parathyroid hornme、 CaS regist17 nu+
nber ’IX)2−64−6+ 5equence。
c’Jtyn@f、 f’ugion、 vector、 cleavり、 t
hrombin、 n tarm釦?、−termin?、 trunc@t?
csu’boxyIIltem紬?、 Ctem鋤?、 ca内内喘石曲?。
gyywth hO丁e、 f’usion、 r−e6.1eader、 p
arathonncr+e、 M!!+parsthyrin、 ’kaker
bin、 384゜
Claims (32)
- 1.(a)宿主中でヒト副甲状腺ホルモンまたはその変異体を発現させるための コントロール領域; (b)該領域と機能的に結合し、長さが約600ヌクレオチド未満の、ポリペプ チド配列をコードしているリーダー配列;(c)該リーダー配列と機能的に結合 し、ヒト副甲状腺ホルモンまたはその変異体をコードしている遺伝子配列に先行 して結合している、選択的酵素切断部位をコードしているヌクレオチド配列;を 含有する組換えDNA分子。
- 2.コントロール領域が、細菌、ウイルス、菌類、または哺乳動物プロモーター を含む請求項1に記載の分子。
- 3.プロモーターが、バクテリオファージλの右側プロモーター(PL)、バク テリオファージλの左側プロモーター(PR)、大腸菌のtrpプロモーター、 大腸菌のrecAプロモーター、大腸菌のlacZプロモーター、大腸菌のla cIプロモーター、大腸菌のgalプロモータ、枯草菌のα−アミラーゼプロモ ーター、枯草菌のσ−28特異的プロモーター、バシラス属バクテリオファージ のプロモーター、およびストレプトマイセス属プロモーターからなる群から選ば れる請求項2に記載の分子。
- 4.プロモーターが大腸菌trpプロモーターである請求項3に記載の分子。
- 5.リーダー配列が成長ホルモンをコードしている請求項1に記載の分子。
- 6.選択的酵素切断部位が因子Xaによって切断される請求項1に記載の分子。
- 7.選択的酵素切断部位がIle−Glu−Gly−Argである請求項5に記 載の分子。
- 8.選択的酵素切断部位がトロンビンによって切断される請求項1に記載の分子 。
- 9.選択的酵素切断部位がLeu−Val−Pro−Argである請求項7に記 載の分子。
- 10.ヒト副甲状腺ホルモンがhPTH(1−84)である請求項9に記載の分 子。
- 11.ヒト副甲状腺ホルモンの変異体がN−末端のところで先端切除されたもの である請求項9に記載の分子。
- 12.変異体が、hPTH(2−84)、hPTH(3−84)、hPTH(4 −84)、hPTH(5−84)、hPTH(6−84)、hPTH(7−84 )、およびhPTH(8−84)からなる群から選ばれる請求項11に記載の分 子。
- 13.プラスミドである請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 14.pGFP−1である請求項13に記載のプラスミド。
- 15.請求項1に記載の分子を含有する宿主細胞。
- 16.原核性である請求項15に記載の細胞。
- 17.細菌である請求項16に記載の細胞。
- 18.大腸菌種である請求項17に記載の細胞。
- 19.真核性である請求項15に記載の細胞。
- 20.酵母細胞または哺乳動物細胞である請求項19に記載の細胞。
- 21.(a)約200アミノ酸未満のリーダーポリペプチド;(b)核ポリペプ チドに融合した選択的酵素切断部位;(c)該切断部位に融合したhPTH(1 −84)またはその変異体;を含有する融合タンパク質。
- 22.リーダーポリペプチドが成長ホルモンである請求項21に記載のタンパク 質。
- 23.選択的酵素切断部位が因子Xaによって切断される請求項21に記載のタ ンパク質。
- 24.選択的酵素切断部位がIle−Glu−Gly−Argである請求項21 に記載のタンパク質。
- 25.選択的酵素切断部位がトロンビンによって切断される請求項21に記載の タンパク質。
- 26.選択的酵素切断部位がLeu−Val−Pro−Argである請求項21 に記載のタンパク質。
- 27.変異体がN−末端のところで先端切除されたものである請求項21に記載 のタンパク質。
- 28.変異体が、hPTH(2−84)、hPTH(3−84)、hPTH(4 −84)、hPTH(5−84)、hPTH(6−84)、hPTH(7−84 )、およびhPTH(8−84)からなる群から選ばれる請求項21に記載のタ ンパク質。
- 29.変異体がhPTH(3−84)である請求項28に記載のタンパク質。
- 30.天然の不純物を実質的に含まないヒト副甲状腺ホルモンまたはその変異体 の製造方法であって、 (a)請求項1に記載の分子を宿主中に供し;(b)ヒト副甲状腺ホルモンまた はその変異体を発現きせ;そして(c)約200アミノ酸未満のリーダーポリペ プチド、これに融合した選択的酵素切断部位、これに融合したhPTH(1−8 4)またはその変異体を含有する融合タンパク質を得る;ことからなる方法。
- 31.(d)工程(c)の融合タンパク質を選択的酵素切断部位を認識する酵素 で切断する; 工程をさらに含む請求項30に記載の方法。
- 32.(f)hPTH(1−84)またはその変異体を精製する;工程をさらに 含む請求項30または31に記載の方法。
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