JP2016528173A - Ｐｔｈの精製方法 - Google Patents
Ｐｔｈの精製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016528173A JP2016528173A JP2016516093A JP2016516093A JP2016528173A JP 2016528173 A JP2016528173 A JP 2016528173A JP 2016516093 A JP2016516093 A JP 2016516093A JP 2016516093 A JP2016516093 A JP 2016516093A JP 2016528173 A JP2016528173 A JP 2016528173A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- exchange chromatography
- anion exchange
- sepharose
- pth
- column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims abstract description 57
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims abstract description 56
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 25
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 16
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 238000004271 weak anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000012437 strong cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000003989 weak cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 6
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 4
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 claims description 2
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 abstract description 9
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 abstract description 7
- 229960005460 teriparatide Drugs 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 7
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 6
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 6
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 6
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 3
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 description 2
- 208000013038 Hypocalcemia Diseases 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000011035 continuous diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 2
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 description 2
- 230000000705 hypocalcaemia Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710184538 Calcium-dependent protein kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 239000012512 bulk drug substance Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004094 calcium homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010041569 spinal fracture Diseases 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
Abstract
本発明は、組換え副甲状腺ホルモン（rhPTH1〜34またはテリパラチド）の精製のための改良された方法に関し、副甲状腺ホルモンの該精製方法は、以下の必須の工程：（a）酵素的切断と、（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、それに次ぐ他の好適な精製工程とを含み、工程（a）と（b）は任意の順序で行うことができる。
Description
発明の分野
本発明では、組換え副甲状腺ホルモン（rhPTH1〜34またはテリパラチド）の精製の改良された方法が提供される。本発明に従ったPTHの精製プロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に先立ち、第一の工程において陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することを含む。そのような精製プロセスによって、精製のプロセスでHPLCカラム工程を使用せずに、99％より高い純度の高度精製されたrhPTH1〜34が得られる。
本発明では、組換え副甲状腺ホルモン（rhPTH1〜34またはテリパラチド）の精製の改良された方法が提供される。本発明に従ったPTHの精製プロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に先立ち、第一の工程において陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することを含む。そのような精製プロセスによって、精製のプロセスでHPLCカラム工程を使用せずに、99％より高い純度の高度精製されたrhPTH1〜34が得られる。
発明の背景
組換えヒト副甲状腺ホルモン（rhPTH1〜34）またはテリパラチドは、内因性ヒト副甲状腺ホルモン（PTH）の生物学的に活性なN-末端断片である。治療的には、テリパラチドは骨折のリスクの高い骨粗鬆症を有する男性および閉経後女性の治療に使用される。その使用によって骨密度が増加し、椎体骨折および非椎体骨折のリスクが低減される。
組換えヒト副甲状腺ホルモン（rhPTH1〜34）またはテリパラチドは、内因性ヒト副甲状腺ホルモン（PTH）の生物学的に活性なN-末端断片である。治療的には、テリパラチドは骨折のリスクの高い骨粗鬆症を有する男性および閉経後女性の治療に使用される。その使用によって骨密度が増加し、椎体骨折および非椎体骨折のリスクが低減される。
本発明の発明者らは、遺伝子操作した大腸菌細胞を宿主系として用い、組換えDNA技術によって独自の方法でテリパラチドを開発した。34個の天然アミノ酸からなるテリパラチドは、理論上4117.8 Daの分子量を有する。テリパラチドはシステインを含まないポリペプチド鎖である。
ヒトの体内では、PTHは主に副甲状腺主細胞によって、84個のアミノ酸からなる一本鎖ポリペプチド（9.5 kDa）として合成され分泌される。血流中に放出された際に、PTHは骨や腎臓に主に存在する特異的な膜受容体に結合し、血清のCa2+レベルを維持する。ホルモンと受容体の相互作用から、典型的なカスケード系によってcAMP依存性プロテインキナーゼAシグナル伝達経路とカルシウム依存性プロテインキナーゼCシグナル伝達経路の双方の活性化が導かれる。
循環においては、内因性の天然型PTHの半減期は2〜5分であり、そのクリアランスの90％より多くは肝臓および腎臓によって仲介される。
複数の生化学的研究および構造的研究により、遺伝子組換え技術または合成によって作製されたPTHのN-末端の1〜34アミノ酸断片は、受容体との結合およびその活性化について十分に活性を保持していることが認められた。最適な受容体結合活性のためには、N-末端部分、即ちPTH1〜34ポリペプチド鎖の1〜27アミノ酸が生物学的活性に不可欠であることが見出されている。PTH1〜34のN-末端部分は、その受容体への結合の際にcAMPの刺激を誘発する一方、PTH1〜34のC-末端部分はcAMPの活性化を導かず、結合エネルギーの多くを供給することに役立っている。
PTHはCa2+の恒常性において重要な役割を担う。循環血液中のCa2+濃度が低いときには（低カルシウム血症）、膜結合血漿カルシウムセンサーを介して副甲状腺細胞からPTHの放出が誘発される。低カルシウム血症が持続すると、その後副甲状腺の肥大および過形成が起きる。一方、血漿中のCa2+濃度の上昇によっては、負のフィードバック機構によりPTHの放出が抑制される。
本発明は、組換えPTHの精製に関連する。先行技術においてはいくつかの精製プロセスが知られている。そのような精製プロセスは、高価であり操作中に大量の有機溶媒を必要とする高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の使用を含む。工業的規模でHPLCによってPTHを精製する場合、当装置のコストが高いこと、耐火性の製造プラントが必要となること、および移動相として使用される高価で高品質の有機溶媒が大量に必要となることが大きな制限要因である。
国際公開公報第2009019715号（特許文献1）により、98％より高い純度の標的タンパク質を得る、陽イオン交換クロマトグラフィーと、任意でそれに次ぐHICまたはRP-HPLCから選択される分取クロマトグラフィーとを含む、rhPTH（1〜34）の2工程の直行（orthogonal）精製プロセスが開示されている。
国際公開公報第2003102132号（特許文献2）は、アフィニティークロマトグラフィーではないクロマトグラフィーとHPTFFとの組み合わせに関わる、タンパク質の精製方法に関連する。
インド特許出願第2991/MUM/2010号（特許文献3）では、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを含むPTHの精製プロセスが開示されている。
本発明において説明されるPTHの精製のためのプロセスは、該ポリペプチド分子の精製プロセスにおいて、移動相として有機溶媒が使用されるカラムクロマトグラフィーやHPLCカラムクロマトグラフィーを全く含まない。したがって、本発明は、高度精製されたrhPTH1〜34を得るための、簡単な、費用効果の高い、高度にスケーラブルな、工業的に実行可能であり環境的に好ましい精製プロセスを開示する。本発明において開示する精製プロセスは、任意のプロセスによって作製されたrhPTH1〜34を含有する粗製混合物からPTHを精製するために使用できる。
本発明では、副甲状腺ホルモン（PTH）、好ましくは組換えPTHを精製する方法が提供される。
ある局面において本発明は、水相において複数のクロマトグラフィー工程を使用することを含む、PTH、好ましくは組換えPTHを精製するための、HPLCではないプロセスを提供する。
別の局面において本発明では、高度精製された形態の所望のポリペプチド分子を得る、不純物を除去するための第一カラム精製としての陰イオン交換クロマトグラフィーと、それに次ぐ、さらなる精製のための陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、PTHを精製するための、HPLCではないプロセスが提供される。
ある好ましい局面において本発明では、部位特異的切断を行って所望のPTHのポリペプチド鎖を融合パートナータンパク質複合体から単離した後に、該複合体からPTHを精製するプロセスが提供される。
別の好ましい態様において本発明では、酵素的切断に特異的なシグネチャー配列を介して融合パートナーがPTH分子と結合されているため切断の際にはPTH分子がそのN-末端位置から単離されるような、融合パートナータンパク質複合体の使用を開示する。融合パートナータンパク質は、（理論上）7.2またはそれ未満のpI値を有することが公知の、特異的な切断反応に必要とされる配列のものと同様のシグネチャー配列をポリペプチド鎖には含まないと考えられるタンパク質分子群より選択することが可能である。
好ましい態様において本発明では、以下の工程を含む、PTH、好ましくは組換えPTHの精製プロセスが提供される：
1．部位特異的な切断
2．弱陰イオン交換クロマトグラフィー
3．弱陽イオン交換クロマトグラフィー
4．強陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．弱陰イオン交換クロマトグラフィー。
1．部位特異的な切断
2．弱陰イオン交換クロマトグラフィー
3．弱陽イオン交換クロマトグラフィー
4．強陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．弱陰イオン交換クロマトグラフィー。
さらなる態様においては、工程3〜6のうち任意のカラム精製工程を任意の順序で行うことができる。
別の態様においては、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで酵素的切断反応を行うことができる。
本説明において使用される略語は以下のように定義される：
DEAEセファロース：ジエチルアミノエチルセファロース
CMセファロース： カルボキシメチルセファロース
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
RP-HPLC：逆相-高速液体クロマトグラフィー
HIC：疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPTFF：高性能タンジェンシャルフローろ過
r-Enk：組換えエンテロキナーゼ
MWCO：分画分子量
WFI：注射用水。
DEAEセファロース：ジエチルアミノエチルセファロース
CMセファロース： カルボキシメチルセファロース
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
RP-HPLC：逆相-高速液体クロマトグラフィー
HIC：疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPTFF：高性能タンジェンシャルフローろ過
r-Enk：組換えエンテロキナーゼ
MWCO：分画分子量
WFI：注射用水。
発明の詳細な説明
本発明によって、PTH、好ましくは組換えPTH（rhPTH1〜34）の、HPLCではない精製プロセスが提供される。
本発明によって、PTH、好ましくは組換えPTH（rhPTH1〜34）の、HPLCではない精製プロセスが提供される。
ある態様において本発明では、粗製混合物からPTHを精製するために、最初に陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することと、次いで他のカラム精製を使用することを含む、PTHの精製プロセスが提供される。粗製混合物は、所望のタンパク質に加えて混入タンパク質、内因性タンパク質、産物関連物質、および他の不純物を含み得る。
ある態様においては本発明によって、複数のイオン交換カラムクロマトグラフィー工程を含む、HPLCではないPTHの精製プロセスが提供される。
ある好ましい態様においては本発明によって、PTHが特異的切断部位を介して融合パートナーと結合されている、可溶性の融合パートナータンパク質-PTH複合体からPTHを精製するプロセスが提供される。しかし本発明は、当技術分野において公知の任意の従来的な発酵プロセスによって合成される融合パートナータンパク質-切断部位-PTH複合体に特異的な遺伝子を含有するベクターによって形質転換された細胞からの、PTHの精製を想定している。
好ましい態様においては、融合パートナータンパク質-PTH複合体からのPTHの精製は以下の工程によって実施される：
1．粗製混合物中に存在する可溶性の融合パートナー-PTH複合体からPTHを切断するための酵素反応
2．陰イオン交換クロマトグラフィー
3．陽イオン交換クロマトグラフィー
4．陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．陰イオン交換クロマトグラフィー。
1．粗製混合物中に存在する可溶性の融合パートナー-PTH複合体からPTHを切断するための酵素反応
2．陰イオン交換クロマトグラフィー
3．陽イオン交換クロマトグラフィー
4．陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．陰イオン交換クロマトグラフィー。
ある態様においては、酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができる。
別の態様においては、工程3〜6は任意の順序で行うことができる。
好ましい態様においては、融合パートナータンパク質-PTH複合体を含む粗製混合物からのPTHの精製は、以下の工程によって実施される：
1．酵素的切断
2．弱陰イオン交換クロマトグラフィー
3．弱陽イオン交換クロマトグラフィー
4．強陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．弱陰イオン交換クロマトグラフィー。
1．酵素的切断
2．弱陰イオン交換クロマトグラフィー
3．弱陽イオン交換クロマトグラフィー
4．強陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．弱陰イオン交換クロマトグラフィー。
PTH（rhPTH1〜34）産物の精製の下流プロセスは、以下の工程を含む：
−細胞の破砕
−細胞ライセートからの封入体塊の単離
−封入体の可溶化
−酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からのrhPTH1〜34の分離
−リコンディショニング
−弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる融合パートナータンパク質の除去
−弱陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−強陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）
−弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換
−0.22μmでの最終ろ過
−-20℃以下における原薬の保存。
−細胞の破砕
−細胞ライセートからの封入体塊の単離
−封入体の可溶化
−酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からのrhPTH1〜34の分離
−リコンディショニング
−弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる融合パートナータンパク質の除去
−弱陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−強陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）
−弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換
−0.22μmでの最終ろ過
−-20℃以下における原薬の保存。
好ましい態様においては、上流プロセスは以下のように実施される。
発酵バッチを採取した後に、遠心分離法によって大腸菌細胞を収集し、溶解用バッファーに再懸濁する。高圧細胞ホモジナイザーを使用して細胞を破砕し、ペレットの形態でライセートから不溶性封入体塊を単離する。単離された封入体塊を可溶化し、酵素反応に供する。融合パートナータンパク質-PTH複合体からの所望のPTHポリペプチド鎖の酵素的切断を好適な条件下において5〜6時間行う。反応終了時に反応混合物をリコンディショニング工程に供し、次いでカラム精製を行う。
本発明において使用されるクロマトグラフィー法：
陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、固定相は正に帯電しており、負に帯電したタンパク質がカラムのマトリックスを通過する間に結合する。本発明に従って陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するために同様に使用できる他の陰イオン交換体は、DEAEセファロース、Mono Q、Qセファロース、QセファロースXL、Capto Q等から選択される。本発明においては陰イオン交換体にDEAEセファロースを使用した。
陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、固定相は正に帯電しており、負に帯電したタンパク質がカラムのマトリックスを通過する間に結合する。本発明に従って陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するために同様に使用できる他の陰イオン交換体は、DEAEセファロース、Mono Q、Qセファロース、QセファロースXL、Capto Q等から選択される。本発明においては陰イオン交換体にDEAEセファロースを使用した。
陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーにおいては、固定相は負に帯電しており、正に帯電したポリペプチド分子がカラムのマトリックスを通過する間に結合する。陽イオン交換クロマトグラフィーにおいては、陽イオン交換体はSP-5PW、SPセファロース、MonoS、Bio-rex70、CMセファロース等から選択することができる。本発明においては、特定の工程において、弱陽イオン交換体としてCMセファロースを使用し、強陽イオン交換体としてSP-5PWを使用した。
陽イオン交換クロマトグラフィーにおいては、固定相は負に帯電しており、正に帯電したポリペプチド分子がカラムのマトリックスを通過する間に結合する。陽イオン交換クロマトグラフィーにおいては、陽イオン交換体はSP-5PW、SPセファロース、MonoS、Bio-rex70、CMセファロース等から選択することができる。本発明においては、特定の工程において、弱陽イオン交換体としてCMセファロースを使用し、強陽イオン交換体としてSP-5PWを使用した。
RP-HPLC
0.1％TFAを加えた移動相Aで満たした逆相C18カラムを使用して、RP-HPLC分析を行う。TFAアセトニトリル溶液（移動相B）を用いて、流速1 mL/分、40℃でrhPTH1〜34原薬の分離を行う。
0.1％TFAを加えた移動相Aで満たした逆相C18カラムを使用して、RP-HPLC分析を行う。TFAアセトニトリル溶液（移動相B）を用いて、流速1 mL/分、40℃でrhPTH1〜34原薬の分離を行う。
本発明においては、PTH産物の精製にHPLCカラム精製工程は使用されなかった。
本発明に従ったrhPTH1〜34の精製の好ましい方法は下記に説明されるが、いかなるものも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
工程1：細胞の破砕
遠心分離によって13±2 Lの発酵ブロス（ワーキングボリューム）から細胞塊を採取した後、pH 8.0のTrisバッファー中に細胞ペレットを懸濁した。冷却条件下（2℃〜15℃）において単一パッセージで圧力900〜1100 barで高圧細胞ホモジナイザーを使用することによって細胞を破砕した。
遠心分離によって13±2 Lの発酵ブロス（ワーキングボリューム）から細胞塊を採取した後、pH 8.0のTrisバッファー中に細胞ペレットを懸濁した。冷却条件下（2℃〜15℃）において単一パッセージで圧力900〜1100 barで高圧細胞ホモジナイザーを使用することによって細胞を破砕した。
工程2：細胞ライセートからの封入体塊の単離
冷却条件下における10,500 g×1時間の遠心分離によって細胞ライセートから封入体塊を単離した。pH 8.0のTrisバッファーを用いて、ペレット化した封入体塊を再懸濁し、還元条件下で低濃度の尿素、好ましくは0.5〜1 Mの尿素の存在下における遠心分離法によって洗浄した。
冷却条件下における10,500 g×1時間の遠心分離によって細胞ライセートから封入体塊を単離した。pH 8.0のTrisバッファーを用いて、ペレット化した封入体塊を再懸濁し、還元条件下で低濃度の尿素、好ましくは0.5〜1 Mの尿素の存在下における遠心分離法によって洗浄した。
工程3：封入体塊の可溶化
洗浄後に封入体塊を、還元条件下で、8 Mの尿素を含むpH 8.0のTrisバッファーによって1時間、周囲温度で可溶化した。可溶化した封入体塊を、2℃〜8℃で10,500 g×1時間、遠心分離した。可溶性の融合パートナータンパク質-rhPTH1〜34複合体を他の混入物と共に含む透明な上清画分を、融合パートナー複合体からのPTHの酵素的切断に供した。
洗浄後に封入体塊を、還元条件下で、8 Mの尿素を含むpH 8.0のTrisバッファーによって1時間、周囲温度で可溶化した。可溶化した封入体塊を、2℃〜8℃で10,500 g×1時間、遠心分離した。可溶性の融合パートナータンパク質-rhPTH1〜34複合体を他の混入物と共に含む透明な上清画分を、融合パートナー複合体からのPTHの酵素的切断に供した。
工程4：酵素的切断による、融合パートナータンパク質複合体からのrhPTH1〜34の分離
融合パートナータンパク質-rhPTH1〜34複合体および他の混入物を含む上清画分1〜2 mg/mL（総タンパク質）を、酵素的切断のために還元条件下でr-エンテロキナーゼによって5〜6時間周囲温度で処理した。エンテロキナーゼは、融合パートナー-rhPTH1〜34複合体を特異的な部位で切断し、タンパク質複合体からrhPTH1〜34を切り離した。エンテロキナーゼは、融合パートナータンパク質とrhPTH1〜34分子の間に存在していたシグネチャー配列のC末端のLys残基（Asp）4Lysにて切断を行った。酵素反応は、酢酸の添加による酸性化によって特定の時点で終わらせた。混合物をデプスフィルターに通し、不溶性物質または酸性化中に生じた沈殿物から可溶性画分を分離させた。酸性化に続き、混合物をデプスフィルターに通し、透過液中にrhPTH1〜34を主に含む可溶性タンパク質画分を回収した。
融合パートナータンパク質-rhPTH1〜34複合体および他の混入物を含む上清画分1〜2 mg/mL（総タンパク質）を、酵素的切断のために還元条件下でr-エンテロキナーゼによって5〜6時間周囲温度で処理した。エンテロキナーゼは、融合パートナー-rhPTH1〜34複合体を特異的な部位で切断し、タンパク質複合体からrhPTH1〜34を切り離した。エンテロキナーゼは、融合パートナータンパク質とrhPTH1〜34分子の間に存在していたシグネチャー配列のC末端のLys残基（Asp）4Lysにて切断を行った。酵素反応は、酢酸の添加による酸性化によって特定の時点で終わらせた。混合物をデプスフィルターに通し、不溶性物質または酸性化中に生じた沈殿物から可溶性画分を分離させた。酸性化に続き、混合物をデプスフィルターに通し、透過液中にrhPTH1〜34を主に含む可溶性タンパク質画分を回収した。
工程5：切断後の可溶性PTH1〜34のリコンディショニング
デプスフィルターに通した後に、rhPTH1〜34および他の少量の混入物を含む可溶性タンパク質画分を、次のカラム精製工程の平衡化条件に適合させるために、pH調整についてのリコンディショニング工程に供した。溶液のpHはTrisまたはNaOH溶液を用いて8.2に調整した。
デプスフィルターに通した後に、rhPTH1〜34および他の少量の混入物を含む可溶性タンパク質画分を、次のカラム精製工程の平衡化条件に適合させるために、pH調整についてのリコンディショニング工程に供した。溶液のpHはTrisまたはNaOH溶液を用いて8.2に調整した。
工程6：弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
リコンディショニング後に、タンパク質溶液を弱陰イオン交換カラムに通し、カラムフロースルーおよび洗浄画分中の混合物からrhPTH1〜34産物の大部分を回収した。切断されていない融合パートナータンパク質および他のタンパク質混入物は陰イオン交換カラムのマトリックスに結合したまま残り、より高い電気伝導度にてカラムから除去された。RP-HPLC分析によって評価すると、本工程では、フロースルーおよび洗浄画分において回収されたrhPTH1〜34産物が90％より高い純度を示すことが認められた。
リコンディショニング後に、タンパク質溶液を弱陰イオン交換カラムに通し、カラムフロースルーおよび洗浄画分中の混合物からrhPTH1〜34産物の大部分を回収した。切断されていない融合パートナータンパク質および他のタンパク質混入物は陰イオン交換カラムのマトリックスに結合したまま残り、より高い電気伝導度にてカラムから除去された。RP-HPLC分析によって評価すると、本工程では、フロースルーおよび洗浄画分において回収されたrhPTH1〜34産物が90％より高い純度を示すことが認められた。
陰イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：13 cm（高さ）×20 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：4 L
平衡化バッファー：Tris-Cl、pH 8.2
流速：28〜47 cm/時間
カラムの洗浄：Tris-Cl、pH 8.2、500 mM NaClを含む
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは、図1に示す。
カラムの寸法：13 cm（高さ）×20 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：4 L
平衡化バッファー：Tris-Cl、pH 8.2
流速：28〜47 cm/時間
カラムの洗浄：Tris-Cl、pH 8.2、500 mM NaClを含む
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは、図1に示す。
工程7：弱陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程に次いで、弱陽イオン交換カラムをpH 5.0、結合-溶出モードで使用することによってrhPTH1〜34産物をさらに精製した。本カラム精製工程は主に宿主細胞に由来する混入産物、または産物に関連しない不純物を除去するために行われた。カラムへのローディングに先立ち、希釈酢酸を添加することによってrhPTH1〜34溶液をpH 5.0に調整した。カラムのマトリックスに結合させ、同じpHにおけるステップワイズ法で175〜200 mM NaClを用いてrhPTH1〜34産物をカラムから溶出した。rhPTH1〜34の溶出に先立ち、150 mM NaClを用いた中間バッファー洗浄にカラムを供した。弱陽イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは図2に示す。RP-HPLC分析によって評価すると、弱陽イオン交換カラム精製工程の後溶出されたrhPTH1〜34は95％より高い純度を示す。
弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程に次いで、弱陽イオン交換カラムをpH 5.0、結合-溶出モードで使用することによってrhPTH1〜34産物をさらに精製した。本カラム精製工程は主に宿主細胞に由来する混入産物、または産物に関連しない不純物を除去するために行われた。カラムへのローディングに先立ち、希釈酢酸を添加することによってrhPTH1〜34溶液をpH 5.0に調整した。カラムのマトリックスに結合させ、同じpHにおけるステップワイズ法で175〜200 mM NaClを用いてrhPTH1〜34産物をカラムから溶出した。rhPTH1〜34の溶出に先立ち、150 mM NaClを用いた中間バッファー洗浄にカラムを供した。弱陽イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは図2に示す。RP-HPLC分析によって評価すると、弱陽イオン交換カラム精製工程の後溶出されたrhPTH1〜34は95％より高い純度を示す。
弱陽イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：13 cm（高さ）×20 cm（内径）
平衡化バッファー：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
カラムのベッドボリューム：4 L
流速：47 cm/時間
溶出：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0、175〜200 mM NaClを含む
カラムの洗浄：酢酸ナトリウム、pH 5.0、250 mM NaClを含む
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
カラムの寸法：13 cm（高さ）×20 cm（内径）
平衡化バッファー：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
カラムのベッドボリューム：4 L
流速：47 cm/時間
溶出：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0、175〜200 mM NaClを含む
カラムの洗浄：酢酸ナトリウム、pH 5.0、250 mM NaClを含む
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
工程8：強陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
pH 5.0における強陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって主に産物関連物質を除去するために、rhPTH1〜34を含む弱陽イオン交換カラム-溶出画分をさらに、第三のカラム精製工程に供した。pH 5.0、結合-溶出モードでカラム精製を行った。ローディングに次いで、pH 6.2の110 mM酢酸ナトリウムバッファーでカラムを洗浄した。pH 7.2の150 mM酢酸ナトリウムバッファーでrhPTH1〜34の溶出を行った。ショルダーピークを伴ってrhPTH1〜34産物がカラムから溶出され、画分ごとに収集された。所望の画分のプールまたは選択を行う以前に、異なるピークの画分をRP-HPLC分析によって分析した。97％より高い純度（RP-HPLCによる）を有する主要ピークのrhPTH1〜34含有画分を、さらなる処理のためにプールした。
pH 5.0における強陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって主に産物関連物質を除去するために、rhPTH1〜34を含む弱陽イオン交換カラム-溶出画分をさらに、第三のカラム精製工程に供した。pH 5.0、結合-溶出モードでカラム精製を行った。ローディングに次いで、pH 6.2の110 mM酢酸ナトリウムバッファーでカラムを洗浄した。pH 7.2の150 mM酢酸ナトリウムバッファーでrhPTH1〜34の溶出を行った。ショルダーピークを伴ってrhPTH1〜34産物がカラムから溶出され、画分ごとに収集された。所望の画分のプールまたは選択を行う以前に、異なるピークの画分をRP-HPLC分析によって分析した。97％より高い純度（RP-HPLCによる）を有する主要ピークのrhPTH1〜34含有画分を、さらなる処理のためにプールした。
強陽イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：23〜26 cm（高さ）×10 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：2 L
平衡化バッファー：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
流速：92 cm/時間
溶出：150 mM酢酸ナトリウム、pH 7.2
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
強陽イオン交換カラムからのrhPTH1〜34溶出の、クロマトグラフィーのプロファイルは、図3に示す。
カラムの寸法：23〜26 cm（高さ）×10 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：2 L
平衡化バッファー：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
流速：92 cm/時間
溶出：150 mM酢酸ナトリウム、pH 7.2
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
強陽イオン交換カラムからのrhPTH1〜34溶出の、クロマトグラフィーのプロファイルは、図3に示す。
工程9：限外ろ過−ダイアフィルトレーション
電気伝導度およびpHを各々およそ1.5（±1）mS.cm-1および5.0に調整して、次のカラム精製工程の平衡化バッファー条件に合わせるために、強陽イオン交換カラム-溶出rhPTH1〜34溶液を限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程に供した。残分の電気伝導度およびpHが最初のダイアフィルトレーションバッファーのものと同じになるまで、1 kDaまたは2 kDaの膜をpH 5.0の低イオン強度の酢酸バッファーと共に用いてrhPTH1〜34溶液の定容ダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション後、次のカラム精製工程の平衡化バッファーのpHに合わせるために、1 M Tris-base（溶液）を用いてrhPTH1〜34溶液のpHをpH 8.2に調整した。
電気伝導度およびpHを各々およそ1.5（±1）mS.cm-1および5.0に調整して、次のカラム精製工程の平衡化バッファー条件に合わせるために、強陽イオン交換カラム-溶出rhPTH1〜34溶液を限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程に供した。残分の電気伝導度およびpHが最初のダイアフィルトレーションバッファーのものと同じになるまで、1 kDaまたは2 kDaの膜をpH 5.0の低イオン強度の酢酸バッファーと共に用いてrhPTH1〜34溶液の定容ダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション後、次のカラム精製工程の平衡化バッファーのpHに合わせるために、1 M Tris-base（溶液）を用いてrhPTH1〜34溶液のpHをpH 8.2に調整した。
工程10：弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
ダイアフィルトレーション後、残存の融合パートナータンパク質混入物（産物関連不純物）を除去するため、rhPTH1〜34産物溶液はさらに、弱陰イオン交換カラムを通過させた。所望のrhPTH1〜34産物はカラムフロースルーおよび洗浄画分において回収された一方、混入産物関連物質はマトリックスに結合したままとなる。
ダイアフィルトレーション後、残存の融合パートナータンパク質混入物（産物関連不純物）を除去するため、rhPTH1〜34産物溶液はさらに、弱陰イオン交換カラムを通過させた。所望のrhPTH1〜34産物はカラムフロースルーおよび洗浄画分において回収された一方、混入産物関連物質はマトリックスに結合したままとなる。
弱陰イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：25 cm（高さ）×10 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：2.5 L
平衡化バッファー：Tris-Cl、pH 8.2
流速：28 cm/時間
カラムの洗浄：500 mM NaClを含むTrisバッファー、pH 8.2
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは図4に示す。
カラムの寸法：25 cm（高さ）×10 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：2.5 L
平衡化バッファー：Tris-Cl、pH 8.2
流速：28 cm/時間
カラムの洗浄：500 mM NaClを含むTrisバッファー、pH 8.2
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは図4に示す。
本工程において、カラムフロースルーおよび洗浄画分において回収された精製rhPTH1〜34産物は、図5に示すように、SDS-PAGE分析後銀染色するとゲル上にブロードなシングルバンドとして現れる。
工程11：限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換
第二の陰イオン交換カラム精製工程から回収された所望のrhPTH1〜34産物溶液を初めに酢酸溶液と混合してpH 5.0とし、その後限外ろ過-ダイアフィルトレーションに供した。残分のpHおよび電気伝導度がダイアフィルトレーションバッファーのものと同じになるまで、冷却条件下（2℃〜15℃）で1 kDaまたは2 kDaのMWCOの膜を使用し、pH 4.0の酢酸ナトリウムバッファーを用いて定容ダイアフィルトレーションを行う。本工程を行い、精製rhPTH1〜34産物の原薬保存用バッファー溶液が得られた。精製rhPTH1〜34産物の最終濃度はおよそ1 mg/mLに維持された。
第二の陰イオン交換カラム精製工程から回収された所望のrhPTH1〜34産物溶液を初めに酢酸溶液と混合してpH 5.0とし、その後限外ろ過-ダイアフィルトレーションに供した。残分のpHおよび電気伝導度がダイアフィルトレーションバッファーのものと同じになるまで、冷却条件下（2℃〜15℃）で1 kDaまたは2 kDaのMWCOの膜を使用し、pH 4.0の酢酸ナトリウムバッファーを用いて定容ダイアフィルトレーションを行う。本工程を行い、精製rhPTH1〜34産物の原薬保存用バッファー溶液が得られた。精製rhPTH1〜34産物の最終濃度はおよそ1 mg/mLに維持された。
工程12：0.22μmでの最終ろ過
限外ろ過-ダイアフィルトレーションによるバッファー交換後、精製rhPTH1〜34産物溶液を0.22μmフィルターに無菌的に通し、好適な保存容器において、rhPTH1〜34の冷凍バルク『原薬』として-20℃以下で保存した。
限外ろ過-ダイアフィルトレーションによるバッファー交換後、精製rhPTH1〜34産物溶液を0.22μmフィルターに無菌的に通し、好適な保存容器において、rhPTH1〜34の冷凍バルク『原薬』として-20℃以下で保存した。
rhPTH1〜34の最終精製原薬は、図6に示すように、RP-HPLC分析により99％より高い純度を示している。
結果および考察
したがって、本発明のプロセスにより、HPLCではない、粗製混合物からのrhPTH1〜34の効率よい精製プロセスが提供される。該プロセスからは、RP-HPLC分析で評価すると99％より高い純度を有する、高度精製されたrhPTH1〜34調製物が得られる。そのように高度精製されたrhPTH1〜34調製物は、当業者に公知の従来技術による製剤化後の、ヒトにおける治療的な使用に好適であると考えられる。
したがって、本発明のプロセスにより、HPLCではない、粗製混合物からのrhPTH1〜34の効率よい精製プロセスが提供される。該プロセスからは、RP-HPLC分析で評価すると99％より高い純度を有する、高度精製されたrhPTH1〜34調製物が得られる。そのように高度精製されたrhPTH1〜34調製物は、当業者に公知の従来技術による製剤化後の、ヒトにおける治療的な使用に好適であると考えられる。
本説明において使用される略語は以下のように定義される：
DEAEセファロース：ジエチルアミノエチルセファロース
CMセファロース： カルボキシメチルセファロース
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
RP-HPLC：逆相-高速液体クロマトグラフィー
HIC：疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPTFF：高性能タンジェンシャルフローろ過
r-Enk：組換えエンテロキナーゼ
MWCO：分画分子量
WFI：注射用水。
[本発明1001]
以下の必須の工程：
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、それに次ぐ他の好適な精製工程
を含み、工程（a）と（b）を任意の順序で実施することができる、副甲状腺ホルモンを精製するための方法。
[本発明1002]
酵素的切断が組換えエンテロキナーゼ酵素によって行われる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
陰イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
陰イオン交換体がDEAEセファロース、Mono QおよびQセファロースXL、好ましくはQセファロースから選択される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（c）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（d）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（e）陰イオン交換クロマトグラフィー
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（c）から（e）は任意の順序で実施することができる、
前記本発明のいずれかの副甲状腺ホルモンを精製するための方法。
[本発明1006]
陽イオン交換体がSP-5PW、SPセファロース、MonoS、Bio-rex70、CMセファロースから選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
強陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がSP-5PWである、本発明1005の方法。
[本発明1008]
弱陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がCMセファロースである、本発明1005の方法。
[本発明1009]
第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで、限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1010]
ダイアフィルトレーション媒体が、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、およびそれらの組み合わせから選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
（a）細胞の破砕、
（b）細胞ライセートからの封入体塊の単離、
（c）封入体の可溶化、
（d）酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からの副甲状腺ホルモンの分離、
（e）リコンディショニング、
（f）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（g）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（h）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（i）限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）、
（j）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（k）限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換、
（l）0.22μmでの最終ろ過
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（g）から（l）は任意の順序で実施することができる、
粗製混合物から副甲状腺ホルモンを精製するための、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
副甲状腺ホルモンが組換え副甲状腺ホルモンである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
副甲状腺ホルモンが切断部位を介して融合パートナーと融合されている、前記本発明のいずれかの方法。
DEAEセファロース：ジエチルアミノエチルセファロース
CMセファロース： カルボキシメチルセファロース
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
RP-HPLC：逆相-高速液体クロマトグラフィー
HIC：疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPTFF：高性能タンジェンシャルフローろ過
r-Enk：組換えエンテロキナーゼ
MWCO：分画分子量
WFI：注射用水。
[本発明1001]
以下の必須の工程：
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、それに次ぐ他の好適な精製工程
を含み、工程（a）と（b）を任意の順序で実施することができる、副甲状腺ホルモンを精製するための方法。
[本発明1002]
酵素的切断が組換えエンテロキナーゼ酵素によって行われる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
陰イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
陰イオン交換体がDEAEセファロース、Mono QおよびQセファロースXL、好ましくはQセファロースから選択される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（c）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（d）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（e）陰イオン交換クロマトグラフィー
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（c）から（e）は任意の順序で実施することができる、
前記本発明のいずれかの副甲状腺ホルモンを精製するための方法。
[本発明1006]
陽イオン交換体がSP-5PW、SPセファロース、MonoS、Bio-rex70、CMセファロースから選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
強陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がSP-5PWである、本発明1005の方法。
[本発明1008]
弱陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がCMセファロースである、本発明1005の方法。
[本発明1009]
第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで、限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1010]
ダイアフィルトレーション媒体が、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、およびそれらの組み合わせから選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
（a）細胞の破砕、
（b）細胞ライセートからの封入体塊の単離、
（c）封入体の可溶化、
（d）酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からの副甲状腺ホルモンの分離、
（e）リコンディショニング、
（f）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（g）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（h）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（i）限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）、
（j）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（k）限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換、
（l）0.22μmでの最終ろ過
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（g）から（l）は任意の順序で実施することができる、
粗製混合物から副甲状腺ホルモンを精製するための、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
副甲状腺ホルモンが組換え副甲状腺ホルモンである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
副甲状腺ホルモンが切断部位を介して融合パートナーと融合されている、前記本発明のいずれかの方法。
Claims (13)
- 以下の必須の工程：
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、それに次ぐ他の好適な精製工程
を含み、工程（a）と（b）を任意の順序で実施することができる、副甲状腺ホルモンを精製するための方法。 - 酵素的切断が組換えエンテロキナーゼ酵素によって行われる、請求項1記載の方法。
- 陰イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項1記載の方法。
- 陰イオン交換体がDEAEセファロース、Mono QおよびQセファロースXL、好ましくはQセファロースから選択される、請求項1記載の方法。
- （a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（c）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（d）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（e）陰イオン交換クロマトグラフィー
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（c）から（e）は任意の順序で実施することができる、
前記請求項のいずれか一項記載の副甲状腺ホルモンを精製するための方法。 - 陽イオン交換体がSP-5PW、SPセファロース、MonoS、Bio-rex70、CMセファロースから選択される、請求項5記載の方法。
- 強陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がSP-5PWである、請求項5記載の方法。
- 弱陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がCMセファロースである、請求項5記載の方法。
- 第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで、限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
- ダイアフィルトレーション媒体が、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項9記載の方法。
- （a）細胞の破砕、
（b）細胞ライセートからの封入体塊の単離、
（c）封入体の可溶化、
（d）酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からの副甲状腺ホルモンの分離、
（e）リコンディショニング、
（f）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（g）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（h）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（i）限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）、
（j）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（k）限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換、
（l）0.22μmでの最終ろ過
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（g）から（l）は任意の順序で実施することができる、
粗製混合物から副甲状腺ホルモンを精製するための、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 副甲状腺ホルモンが組換え副甲状腺ホルモンである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 副甲状腺ホルモンが切断部位を介して融合パートナーと融合されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN2726/MUM/2013 | 2013-08-21 | ||
| PCT/IN2014/000539 WO2015025335A1 (en) | 2013-08-21 | 2014-08-21 | Purification process for pth |
| IN2726MU2013 IN2013MU02726A (ja) | 2013-08-21 | 2014-08-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016528173A true JP2016528173A (ja) | 2016-09-15 |
| JP6046862B2 JP6046862B2 (ja) | 2016-12-21 |
Family
ID=51862491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016516093A Expired - Fee Related JP6046862B2 (ja) | 2013-08-21 | 2014-08-21 | Ｐｔｈの精製方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160200792A1 (ja) |
| EP (1) | EP3036252A1 (ja) |
| JP (1) | JP6046862B2 (ja) |
| KR (1) | KR101687686B1 (ja) |
| CN (1) | CN105473610A (ja) |
| AU (1) | AU2014310255B2 (ja) |
| CA (1) | CA2919604A1 (ja) |
| EA (1) | EA201690264A1 (ja) |
| HK (1) | HK1223378A1 (ja) |
| IL (1) | IL243642A (ja) |
| IN (1) | IN2013MU02726A (ja) |
| MX (1) | MX2016002274A (ja) |
| NZ (1) | NZ716205A (ja) |
| SG (1) | SG11201600511QA (ja) |
| WO (1) | WO2015025335A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA201600424B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019194702A (ja) * | 2013-11-08 | 2019-11-07 | エシロール アンテルナショナルＥｓｓｉｌｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ | 累進眼科用レンズの少なくとも１つの光学的設計パラメータを判断する方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019077432A1 (en) * | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Intas Pharmaceuticals Ltd. | IMPROVED PURIFICATION METHOD OF RECOMBINANT PTH (1-34) |
| CN107941983B (zh) * | 2018-01-05 | 2020-05-15 | 北京博康健基因科技有限公司 | 一种rhPTH蛋白或rhPTH蛋白制剂的检测方法和纯度的分析方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01501148A (ja) * | 1986-07-18 | 1989-04-20 | ザ ユニバーシティー オブ メルボルン | 悪性‐ＰＴＨｒＰの液性過カルシウム血症において活性なタンパク |
| JPH04505259A (ja) * | 1989-05-12 | 1992-09-17 | ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション | 副甲状腺ホルモンの製造のための組換えｄｎａ法 |
| JPH05505594A (ja) * | 1989-10-27 | 1993-08-19 | ホルスマン、ヴォルフーゲオルグ | ｈＰＴＨフラグメント（１―３７）とその誘導体 |
| JP2005524092A (ja) * | 2002-04-26 | 2005-08-11 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | タンパク質の非アフィニティ精製 |
| WO2011151714A1 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Lupin Limited | Modified sak gene for the production of recombinant proteins |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE185146T1 (de) * | 1996-06-14 | 1999-10-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Verfahren zur entfernung von n-terminalem methionin |
| AU7701398A (en) * | 1997-05-30 | 1998-12-30 | Bion, Inc. | Large-scale isolation and purification of hif |
| EP1598075A1 (en) * | 2004-05-21 | 2005-11-23 | LEK Pharmaceuticals d.d. | Process for the isolation and / or purification of proteins |
| CN1706947A (zh) * | 2004-06-04 | 2005-12-14 | 南京大学生物制药工程研究中心 | 重组人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的构建、表达与纯化方法 |
| US7585943B2 (en) * | 2005-04-20 | 2009-09-08 | Viromed Co., Ltd. | Compositions and methods for fusion protein separation |
| CN1861790A (zh) * | 2006-04-25 | 2006-11-15 | 华东理工大学 | 重组人甲状旁腺激素1－84的制备方法 |
| EP2173768B1 (en) * | 2007-08-09 | 2014-03-05 | USV Limited | Novel orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhpth) (1-34) |
| US20120264920A1 (en) * | 2010-10-11 | 2012-10-18 | Abbott Laboratories | Processes for purification of proteins |
-
2014
- 2014-08-21 CN CN201480046603.3A patent/CN105473610A/zh active Pending
- 2014-08-21 IN IN2726MU2013 patent/IN2013MU02726A/en unknown
- 2014-08-21 NZ NZ716205A patent/NZ716205A/en not_active IP Right Cessation
- 2014-08-21 CA CA2919604A patent/CA2919604A1/en not_active Abandoned
- 2014-08-21 JP JP2016516093A patent/JP6046862B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-08-21 EA EA201690264A patent/EA201690264A1/ru unknown
- 2014-08-21 US US14/912,984 patent/US20160200792A1/en not_active Abandoned
- 2014-08-21 MX MX2016002274A patent/MX2016002274A/es unknown
- 2014-08-21 KR KR1020167003963A patent/KR101687686B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-21 AU AU2014310255A patent/AU2014310255B2/en not_active Ceased
- 2014-08-21 EP EP14793628.0A patent/EP3036252A1/en not_active Withdrawn
- 2014-08-21 SG SG11201600511QA patent/SG11201600511QA/en unknown
- 2014-08-21 WO PCT/IN2014/000539 patent/WO2015025335A1/en active Application Filing
-
2016
- 2016-01-17 IL IL243642A patent/IL243642A/en not_active IP Right Cessation
- 2016-01-19 ZA ZA2016/00424A patent/ZA201600424B/en unknown
- 2016-10-04 HK HK16111539.7A patent/HK1223378A1/zh unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01501148A (ja) * | 1986-07-18 | 1989-04-20 | ザ ユニバーシティー オブ メルボルン | 悪性‐ＰＴＨｒＰの液性過カルシウム血症において活性なタンパク |
| JPH04505259A (ja) * | 1989-05-12 | 1992-09-17 | ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション | 副甲状腺ホルモンの製造のための組換えｄｎａ法 |
| JPH05505594A (ja) * | 1989-10-27 | 1993-08-19 | ホルスマン、ヴォルフーゲオルグ | ｈＰＴＨフラグメント（１―３７）とその誘導体 |
| JP2005524092A (ja) * | 2002-04-26 | 2005-08-11 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | タンパク質の非アフィニティ精製 |
| WO2011151714A1 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Lupin Limited | Modified sak gene for the production of recombinant proteins |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019194702A (ja) * | 2013-11-08 | 2019-11-07 | エシロール アンテルナショナルＥｓｓｉｌｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ | 累進眼科用レンズの少なくとも１つの光学的設計パラメータを判断する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160027204A (ko) | 2016-03-09 |
| IL243642A (en) | 2017-05-29 |
| JP6046862B2 (ja) | 2016-12-21 |
| KR101687686B1 (ko) | 2016-12-19 |
| AU2014310255B2 (en) | 2017-02-16 |
| EP3036252A1 (en) | 2016-06-29 |
| CA2919604A1 (en) | 2015-02-26 |
| AU2014310255A1 (en) | 2016-02-25 |
| MX2016002274A (es) | 2016-05-31 |
| ZA201600424B (en) | 2017-03-29 |
| WO2015025335A1 (en) | 2015-02-26 |
| WO2015025335A8 (en) | 2016-02-04 |
| US20160200792A1 (en) | 2016-07-14 |
| HK1223378A1 (zh) | 2017-07-28 |
| SG11201600511QA (en) | 2016-02-26 |
| IN2013MU02726A (ja) | 2015-06-26 |
| EA201690264A1 (ru) | 2016-06-30 |
| NZ716205A (en) | 2017-05-26 |
| CN105473610A (zh) | 2016-04-06 |
| IL243642A0 (en) | 2016-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU765206B2 (en) | Process for producing peptide with the use of accessory peptide | |
| CN103080128B (zh) | Glp-1类似物的反相hplc纯化 | |
| JP4975895B2 (ja) | 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 | |
| EP2173768B1 (en) | Novel orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhpth) (1-34) | |
| JP2592623B2 (ja) | アポエクオリンの製造法 | |
| JP6046862B2 (ja) | Ｐｔｈの精製方法 | |
| US20220372074A1 (en) | Production and Purification Method for Polypeptide | |
| CN113549144A (zh) | 一种特立帕肽hPTH(1-34)的生产和纯化方法 | |
| US20170029482A1 (en) | Novel purification process of gonadotropin | |
| JPH03228682A (ja) | Ｅ．コリでの非融合タンパク質の調製方法 | |
| Kim et al. | Effects of operating parameters in in vitro renaturation of a fusion protein of human growth hormone and glutathione S transferase from inclusion body | |
| JP4088584B2 (ja) | 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。 | |
| JPH08510762A (ja) | 塩基性線維芽細胞成長因子の精製プロセス | |
| WO2014046484A1 (ko) | 가용성 재조합 단백질의 발현, 추출 및 정제 방법 | |
| JP2021511785A (ja) | 組換えポリペプチド生産用ｎ末端融合パートナーおよびこれを用いた組換えポリペプチドの生産方法 | |
| JP2016538261A (ja) | ダルベポエチンアルファの精製方法 | |
| WO2019077432A1 (en) | IMPROVED PURIFICATION METHOD OF RECOMBINANT PTH (1-34) | |
| JP2022023814A (ja) | 組換え生産された三量体型のｒｓｖタンパク質の精製方法 | |
| KR101744297B1 (ko) | Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법 | |
| KR101634380B1 (ko) | Tlr5 아고니스트 단백질의 생산방법 | |
| CN110582510A (zh) | 用于纯化重组抗体片段的方法 | |
| CN117801123B (zh) | 沃索利肽可溶性中间体、中间体制备方法及沃索利肽的制备方法 | |
| Romanov et al. | Isolation of human interferon β1b (Ser17) expressed in E. coli with the use of ion-exchange chromatography | |
| KR20030010536A (ko) | 융합단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법 | |
| KR100473443B1 (ko) | 단백질의 생산방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20160705 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160713 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161004 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161027 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161117 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6046862 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |