KR101687686B1 - Pth를 정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 향상된 재조합 부갑상선 호르몬 (rhPTH^{1 -34} 또는 테리파라티드)을 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 부갑상선 호르몬을 정제하는 방법은 다음의 필수적인 단계: (a) 효소적 절단; (b) 음이온 교환 크로마토그래피 후, 다른 적합한 정제 단계를 포함하며, 상기 (a) 및 (b) 단계는 임의의 순서로 실행될 수 있다.

Description

PTH를 정제하는 방법 {Purification process for PTH}

본 발명은 향상된 재조합 부갑상선 호르몬(rhPTH^{1 -34} 또는 테리파라티드)을 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 PTH를 정제하는 방법은 임의의 양이온 교환 크로마토그래피의 이용 전에 첫번째 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피의 이용을 포함한다. 이러한 정제 방법은 정제 공정에서 어떠한 HPLC 컬럼 단계를 사용하지 않고, 순도 99% 이상의 고도로 정제된 rhPTH^1-34를 결과적으로 수득한다.

재조합 인간 부갑상선 호르몬(Recombinant human parathyroid hormone:rhPTH^1-34) 또는 테리파라티드(teriparatide)는 내생의 인간 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone:PTH)의 생물학적으로 활성인 N-말단 단편이다. 치료적으로, 테리파라티드는 골절 위험이 높은 골다공증을 가진 남성 및 폐경 후의 여성의 치료를 위해 사용된다. 테리파라티드는 뼈 무기질 밀도를 증가시키고 척추 및 비-척추 골절의 위험을 감소시킨다.

본 발명의 발명자들은 숙주 시스템으로서 유전적으로 조작된 대장균(E.coli) 세포를 이용하는 재조합 DNA 기술로 독자적으로 테리파라티드를 개발하였다. 34개 천연 아미노산을 포함하는 테리파라티드는 이론상 분자량 4117.8Da을 가진다. 테리파라티드는 시스테인-프리(free) 폴리펩티드 사슬이다.

인체에서, PTH는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하는 84개의 아미노산(9.5 kDa)으로, 주로 부갑상선 샘의 주세포(chief cell)에 의해 합성 및 분비된다. 혈류로 방출시에, PTH는 뼈와 신장에 주로 존재하는 특이적인 막 수용체에 결합하여, 혈청의 Ca^{2 +} 수준을 유지한다. 호르몬-수용체 상호 작용은 전형적인 캐스케이드 시스템의 cAMP-의존적인 단백질 키나제 A 및 칼슘-의존적인 단백질 키나제 C 모두의 활성화를 이끈다.

순환에서, 내생의 천연형 PTH는 2 내지 5분의 반감기를 갖으며 그 감소(clearance)의 90% 이상은 간과 신장에 의해 매개된다.

여러 생화학 및 구조 연구들을 통하여, 재조합 또는 합성으로 생성되는 PTH 의 N-말단 1-34 아미노산 단편이 수용체 결합과 활성화에서 완전하게 활성인 것으로 유지되는 것으로 관찰되었다. 최적의 수용체 결합 활성을 위하여, N-말단 부분 즉, PTH^{1 -34} 폴리펩티드 사슬의 1-27 아미노산은 생물학적 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다. PTH^{1 -34}의 상기 N-말단 부분이 수용체에 결합하면 cAMP의 자극을 야기하며, 반면 PTH^{1 -34}의 C-말단 부분은 cAMP 활성화를 유도하지 않고 결합 에너지의 대부분을 제공하는 것을 돕는다.

PTH는 Ca^{2 +} 항상성에 중요한 역할을 한다. 순환하는 혈액 내 Ca^{2 +}의 농도가 낮을 때 (저칼슘혈증), PTH의 방출은 세포막 결합 칼슘 센서를 통해 부갑상선 세포로부터 촉발된다. 저칼슘혈증이 지속되면, 부갑상선 샘의 비대 및 증식이 일어난다. 반면, 혈장 내 증가된 Ca^{2 +} 농도는 음성 피드-백 기전에 의해 PTH의 방출을 억제한다.

본 발명은 재조합 PTH의 정제에 관한 것이다. 종래 기술에 여러 정제 방법이 알려져 있다. 이러한 정제 방법은 고비용이고 작동하는 동안 다량의 유기 용매를 요구하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 이용을 포함한다. 기구의 고비용, 방염 제조 시설 필요 및 이동상으로 사용되는 고비용, 양질의 유기 용매의 다량의 필요는 산업 규모에서 HPLC에 의한 PTH의 정제의 경우에 중요한 제한이 된다.

WO2009019715는 순도 98% 이상의 표적 단백질을 수득하기 위하여 양이온 교환 크로마토그래피 후 선택적으로 HIC 또는 RP-HPLC로부터 선택되는 분취용 크로마토그래피를 포함하는 rhPTH(1-34)의 2단계 직교 정제 방법을 개시한다.

WO2003102132는 HPTFF와 비-친화성 크로마토그래피의 조합을 수반하는 단백질 정제 방법에 관한 것이다.

인도 출원 2991/MUM/2010은 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함하는 PTH 정제 방법을 개시한다.

본 발명은 부갑상선 호르몬(PTH), 바람직하게는 재조합 PTH를 정제하는 방법을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 수상에서 복수 크로마토그래피 단계의 이용을 포함하는 PTH, 바람직하게는 재조합 PTH를 비-HPLC로 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 고도로 정제된 형태의 원하는 폴리펩티드 분자를 수득하기 위하여 불순물의 제거를 위한 첫번째 컬럼으로서 음이온 교환 크로마토그래피 후 추가 정제를 위한 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 PTH를 비-HPLC로 정제하는 방법을 제공한다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 융합-파트너-단백질 복합체로부터 원하는 PTH의 원하는 폴리펩티드 사슬을 분리하기 위하여 부위-특이적인 절단을 실행한 후 융합-파트너-단백질 복합체로부터 PTH를 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 절단시에, PTH 분자가 그 N-말단 자리으로부터 분리되도록, 상기 융합 파트너가 효소적 절단에 특이적인 신호 서열(signature sequence)을 통하여 PTH 분자와 결합된, 융합 파트너 단백질 복합체의 용도를 개시한다. 상기 융합 파트너 단백질은 pI 값(이론상) 7.2 이하를 가지는 것으로 알려져 있고, 상기 특이적인 절단 반응에 요구되는 상기 서열의 신호 서열과 비슷한 폴리펩티드 사슬 내 임의의 신호 서열을 포함하지 않는 것처럼 보이는 단백질 분자의 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, PTH, 바람직하게는 재조합 PTH를 정제하는 방법을 제공한다:

1. 부위-특이적 절단

2. 약한 음이온 교환 크로마토그래피

3. 약한 양이온 교환 크로마토그래피

4. 강한 양이온 교환 크로마토그래피

5. 초미세여과 및 투석여과

6. 약한 음이온 교환 크로마토그래피.

추가의 일 구체예에서, 3 내지 6단계에서 임의의 컬럼 단계는 임의의 순서로 실행될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 상기 효소적 절단 반응은 첫번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 실행될 수 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의된다.

DEAE 세파로오스 : 디에틸아미노에틸 세파로오스(Diethylaminoethyl sepharose)

CM 세파로오스 : 카르복시메틸 세파로오스(Carboxymethyl sepharose)

HPLC : 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography)

RP-HPLC : 역상-고성능 액체 크로마토그래피(Reverse phase - High performance liquid chromatography)

HIC : 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography)

HPTFF : 고성능 접선 유동 여과(High performance tangential flow filtration)

r-Enk : 재조합 엔테로키나제(Recombinant Enterokinase)

MWCO : 분자량 컷-오프(molecular weight cut-off)

WFI : 주사용 증류수(Water for Injection)

PTH 정제를 위하여 본 발명에서 개시된 방법은 상기 폴리펩티드 분자의 정제 공정 동안 유기 용매를 이동상으로 사용하는 어떠한 컬럼 크로마토그래피 또는 HPLC 컬럼 크로마토그래피를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명은 고도로 정제된 rhPTH^1-34를 얻기 위하여 간단하고, 비용이 효율적이며, 고확장성, 산업적으로 실행 가능하고 환경 친화적인 정제 과정을 개시한다. 본 발명에서 개시된 정제 방법은 임의의 방법으로부터 생성되는 rhPTH^{1 -34}를 포함하는 조 혼합물로부터 PTH를 정제하기 위해 사용될 수 있다.

도 1은 rhPTH^{1 -34}를 정제하는 방법에 사용되는 첫번째 약한 음이온 교환 컬럼 단계의 크로마토그래피 프로파일을 도시한다. rhPTH^{1 -34} 산물은 음이온 교환 마트릭스에 결합하지 않고 컬럼 플로우-스루-및-세척 분획(flow-through-and-wash fraction)에 나온다. 강하게 결합된 오염된 단백질은 더 높은 염 농도(500 mM NaCl)로 컬럼에서 제거된다.
도 2는 rhPTH^{1 -34}를 정제하는 방법에 사용되는 약한 양이온 교환 컬럼의 크로마토그래피 프로파일을 도시한다. 마트릭스에 결합하면, rhPTH^{1 -34}는 200mM NaCl 구배에 의하여 원하는 분획에(나타낸 바와 같이), 분별적으로, 컬럼 밖으로 용출된다. 용출 전, 컬럼을 150 mM NaCl 버퍼로 세척한다.
도 3은 rhPTH^{1 -34}를 정제하는 방법에 사용되는 강한 양이온 교환 컬럼의 크로마토그래피 프로파일은 도시한다. 단백질 용액을 로딩한 후, 먼저, 컬럼 마트릭스를 평형화 버퍼로 세척하고, 두번째 세척은 상기 평형화 버퍼보다 전도도가 높도록 수행한다. 용출은 상기 두번째 세척 버퍼보다 pH 및 전도도가 높은 버퍼로 실행한다. 용출하는 동안, 추가 공정을 위하여, 도면에 나타낸 바와 같이, 원하는 rhPTH^{1 -34} 분획을 수집한다.
도 4는 rhPTH^{1 -34}를 정제하는 방법에 사용되는 두번째 약한 음이온 교환 컬럼 단계의 크로마토그래피 프로파일을 도시한다. rhPTH^{1 -34} 산물은 음이온 교환 마트릭스에 결합하지 않고 플로우-스루-및-세척 분획에 나온다. 나타낸 바와 같이, 강하게 결합된 잔여 오염된 단백질은 더 높은 염 농도(500 mM NaCl)로 컬럼에서 제거된다.
도 5는 비-환원 SDS-PAGE에 의해 상기 두번째 약한 음이온 교환 컬럼으로부터 회수되는 rhPTH^{1 -34}의 폴리펩티드 프로파일을 도시한다. 겔(gel)에 분리(resolving) 후, 단백질 밴드를 Ag-염색하여 현상하였다. rhPTH^{1 -34}의 단일 밴드 정제는 SDS-PAGE 분석으로부터 명확하다. 오염된 단백질 잔여량의 제거는 레인(lane) 3에 나타내었다.
도 6은 RP-HPLC에 의한 rhPTH^{1 -34}의 정제된 약물의 순도를 도시한다. rhPTH^{1 -34}의 정제된 약물 재료에서 rhPTH^{1 -34}의 주요 피크(principal peak)의 99% 이상의 순도가 관찰되었다.

본 발명은 PTH, 바람직하게는 재조합 PTH(rhPTH^1-34)를 비-HPLC로 정제하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 조 혼합물로부터 PTH를 정제하기 위하여, 먼저, 음이온 교환 크로마토그래피의 이용 후, 후속하는 다른 컬럼의 이용을 포함하는 PTH를 정제하는 방법을 제공한다. 조 혼합물은 원하는 단백질뿐만 아니라 오염된 단백질, 내생의 단백질, 물질과 관련된 산물 및 다른 불순물을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 복수 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 단계를 포함하는 PTH를 비-HPLC로 정제하는 방법을 제공한다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명은, 가용성 융합-파트너-단백질-PTH 복합체로부터 PTH를 정제하는 방법에 있어서, 상기 PTH는 특이적인 절단 부위를 통하여 융합 파트너와 결합하는 방법을 제공한다. 단, 본 발명은 당해 기술 분야에서 알려진 임의의 통상적인 발효 방법에 의해 합성된 융합-파트너 단백질-절단 부위-PTH 복합체에 특이적인 유전자를 포함하는 벡터로 유전적으로 형질 전환된 세포로부터 PTH의 정제를 나타낸 것이다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 융합-파트너-단백질-PTH 복합체로부터 PTH의 정제는 하기 단계로 실행된다:

1. 조 혼합물에 존재하는 가용성 융합 파트너-PTH 복합체로부터 PTH를 절단하기 위한 효소적 반응

2. 음이온 교환 크로마토그래피

3. 양이온 교환 크로마토그래피

4. 양이온 교환 크로마토그래피

5. 초미세여과 및 투석여과

6. 음이온 교환 크로마토그래피

일 구체예에서, 상기 효소적 절단은 첫번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후에 실행될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 3 내지 6 단계는 임의의 순서로 실행될 수 있다.

바람직한 일 구체예에서, 융합-파트너-단백질-PTH 복합체를 포함하는 조 혼합물로부터 PTH의 정제는 하기 단계로 실행된다:

1. 효소적 절단

2. 약한 음이온 교환 크로마토그래피

3. 약한 양이온 교환 크로마토그래피

4. 강한 양이온 교환 크로마토그래피

5. 초미세여과 및 투석여과

6. 약한 음이온 교환 크로마토그래피.

후속(downstream)하는 PTH(rhPTH^{1 -34}) 산물를 정제하는 방법은 하기 단계를 포함한다 -

- 세포 파쇄

- 세포 용해물로부터 봉입체 덩어리 분리

- 봉입체 가용화

- 효소적 절단에 의한 융합-파트너-단백질-PTH 복합체로부터 rhPTH^{1 -34}의 분리;

- 재조정(Reconditioning)

- 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 융합-파트너-단백질의 제거

- 약한 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

- 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

- 미세여과 / 투석여과 (UF / DF)

- 약한 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

- 초미세여과 / 투석여과에 의한 버퍼 교환

- 0.22 μm 말단 여과

- -20 ℃ 또는 그 이하에서 약물 저장.

바람직한 일 구체예에서 상류(upstream) 방법은 하기와 같이 실행된다:

발효 배치를 수거한 후, 대장균(E. coli) 세포를 원심분리하여 수집하고 용해 버퍼로 현탁한다. 세포를 고압 세포 호모게나이저를 이용하여 파쇄하여, 펠렛 형태의 용해물로부터 불용성 봉입체를 분리한다. 분리된 봉입체 덩어리를 용해하고 효소 반응에 제공한다. 융합-파트너-단백질-PTH 복합체로부터 원하는 PTH 폴리펩티드 사슬의 효소적 절단은 적합한 조건하에서 5-6 시간 소요된다. 반응 종결 후, 반응 혼합물을 재조정(reconditioning) 단계를 거친 후 컬럼에 정제한다.

본 발명에서 사용된 크로마토그래피 방법:

음이온 교환 크로마토그래피 - 음이온 교환 크로마토그래피에서, 고정상은 컬럼 마트릭스를 통과하면서, 음으로 하전된 단백질이 결합한 것에 양전하를 전달한다. 본 발명에 따른 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하기 위하여, 또한 이용될 수 있는 다른 음이온 교환체는 DEAE 세파로오스, 모노 Q(Mono Q), Q 세파로오스, Q 세파로오스 XL, Capto Q 등으로부터 선택된다. 본 발명에서 음이온 교환체 DEAE 세파로오스가 사용되었다.

양이온 교환 크로마토그래피 - 양이온 교환 크로마토그래피에서, 고정상은 컬럼 마트릭스를 통과하면서, 양으로 하전된 폴리펩티드 분자가 결합한 것에 음전하를 전달한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, 양이온 교환체는 SP-5PW, SP 세파로오스, 모노 S(Mono S), 바이오-렉스70(Bio-rex70), CM 세파로오스 등으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서, 구체적인 단계에서 CM 세파로오스는 약한 양이온 교환체로 사용되었고, SP-5PW는 강한 양이온 교환체로 사용되었다.

RP-HPLC - 분석용 RP-HPLC은 0.1% TFA 이동상 A로 포화된 역상 C18 컬럼을 사용하여 수행된다. rhPTH^{1 -34} 약물의 분리는 40℃에서 1mL/min의 유속으로 아세토니트릴(acetonitrile)이 든 TFA (이동상B)로 실시하였다.

본 발명에서, PTH 산물의 정제를 위하여 어떠한 HPLC 컬럼 단계도 사용하지 않았다.

본 발명에 따른 바람직한 rhPTH^{1 -34}의 정제 방법은 하기에 설명되며, 이는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

단계 1: 세포 파쇄

13±2L의 발효액(fermentation broth) (작업 부피)으로부터 원심분리하여 세포 덩어리(cell mass)를 수거한 후, 세포 펠렛을 pH 8.0의 Tris 버퍼로 현탁하였다. 세포를 차가운 조건(2℃-15℃)하에서 900-1100bar 압력으로 고압 세포 호모게나이저를 사용하여 파쇄하였다.

단계 2: 세포 용해물로부터 봉입체 분리

세포 용해물을 차가운 조건하에서 10,500g로, 1시간 동안 원심분리하여 봉입체 덩어리를 분리하였다. 펠렛된 봉입체 덩어리를 현탁하고, 환원 조건하, 저농도의 우레아, 바람직하게는 0.5 1M 우레아의 존재하에서, pH 8.0의 Tris 버퍼로 원심분리하여 세척하였다.

단계 3: 봉입체의 가용화

세척 후, 봉입체를 주위 온도에서 1시간 동안, 환원 조건하, pH 8.0의 8M 우레아 Tris 버퍼로 용해하였다. 용해된 봉입체 덩어리를 2℃-8℃, 10,500g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 다른 오염 물질과 가용성 융합-파트너-단백질-rhPTH^{1 -34} 복합체를 포함하는 맑은 상층액 분획을 상기 융합-파트너 복합체로부터 PTH의 효소적 절단에 적용하였다.

단계 4: 효소적 절단에 의한 융합-파트너-단백질 복합체로부터 rhPTH ^{1 -34} 분리

1-2mg/mL(총 단백질)의 상기 융합-파트너-단백질-rhPTH^{1 -34} 복합체 및 다른 오염 물질을 포함하는 상층액 분획을 효소적 절단을 위해 환원 조건하에서, 주위 온도에서 5-6시간 동안 재조합-엔테로키나제로 처리하였다. 엔테로키나제는 특이적인 부위에서 상기 융합-파트너-rhPTH^{1 -34} 복합체를 절단하여 상기 단백질 복합체로부터 rhPTH^1-34를 방출시켰다. 엔테로키나제는 융합-파트너-단백질 및 rhPTH^{1 -34} 분자 사이에 위치하는 신호 서열의 C-말단의 Lys 잔기, (Asp)₄Lys에서 절단하였다. 효소적 반응은 아세트산을 첨가하여 산성화시킴으로써 특정된 시간에 종결시켰다. 상기 혼합물을 심층 필터에 통과시켜 산성화하는 동안 생성된 불용성 물질 및 침전물로부터 가용성 분획을 분리하였다. 산성화 후에, 상기 혼합물을 심층 필터에 통과시켜 투과물에 주로 rhPTH^1-34를 포함하는 가용성 단백질 분획을 회수하였다.

단계 5: 절단 후 가용성 PTH ^{1 -34} 의 재조정(Reconditioning)

심층 여과 후, 다음 컬럼 단계 평형 조건에 맞추기 위해, 상기 rhPTH^{1 -34} 및 다른 부수의 오염 물질을 포함하는 가용성 단백질 분획에 pH를 조정하여 재조정하는 단계를 실시하였다. 상기 용액의 pH는 Tris 또는 NaOH 용액으로 8.2로 조정하였다.

단계 6: 약한 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피

재조정 후, 상기 단백질 용액을 약한 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 플로우-스루-및-세척 분획의 혼합물로부터 rhPTH^{1 -34} 산물의 대부분을 회수하였다. 절단되지 않은 융합-파트너 단백질 및 다른 단백질 오염물은 음이온 교환 컬럼 마트릭스에 결합된 상태로 남아있고, 더 높은 전도도에서 컬럼에서 제거된다. 이 단계에서, 상기 플로우-스루-및-세척 분획에서 회수된 rhPTH^{1 -34} 산물은, 분석용 RP-HPLC로 측정한 바에 따르면 순도 90% 이상을 나타내는 것을 관찰하였다.

음이온 교환 컬럼 조건의 세부 사항:

컬럼 규격(dimension) - 13 cm(h) x 20 cm(i.d.)

컬럼 베드 볼륨(bed volume) - 4 L

평형화 버퍼 : Tris-Cl, pH 8.2

유속 - 28 내지 47 cm / h

컬럼 세척 - 500 mM NaCl 를 함유하는 pH 8.2, Tris-Cl

컬럼 크리닝 - 0.5 N NaOH

약한 음이온 교환 컬럼 단계의 크로마토그래피 프로파일을 도 1에 도시한다.

단계 7: 약한 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

상기 약한 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 단계 후, rhPTH^{1 -34} 산물을 pH 5.0의 결합-용출 모드에서 약한 양이온 교환 컬럼을 이용하여 추가로 정제하였다. 이 컬럼 단계를 수행하여 주로 불순물과 관련된 오염된 산물 또는 비-산물 유래 숙주 세포를 제거하였다. 상기 컬럼에 로딩하기 전에, 희석된 아세트산을 첨가하여 rhPTH^1-34 용액을 pH 5.0으로 조정하였다. 컬럼 마트릭스에 결합 후, rhPTH^{1 -34} 산물을 동일한 pH에서 단계적인 방식으로 175-200mM의 컬럼에서 용출하였다. rhPTH^{1 -34}의 용출에 앞서, 상기 컬럼을 150mM NaCl로 중간 버퍼 세척을 실시하였다. 약한 양이온 교환 컬럼 단계의 크로마토그래피 프로파일을 도 2에 도시한다. 상기 약한 양이온 교환 컬럼 단계 후, 용출된 rhPTH^{1 -34}는 분석용 RP-HPLC로 측정한 바에 따르면 순도 95% 이상을 보인다.

약한 양이온 교환 컬럼 조건의 세부 사항:

컬럼 규격 - 13 cm (h) x 20 cm (i.d.)

평형화 버퍼: 20 mM 소듐 아세테이트, pH 5.0

컬럼 베드 볼륨 - 4 L

유속 - 47 cm / h

용출 - 175-200 mM NaCl을 함유하는 pH 5.0, 20 mM 소듐 아세테이트

컬럼 세척 - 250 mM NaCl을 함유하는 pH 5.0, 소듐 아세테이트

컬럼 크리닝 - 0.5 N NaOH

단계 8: 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

pH 5.0의 강한 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에서 주로 산물-관련 물질의 제거를 위하여, 추가적으로, rhPTH^{1 -34}를 포함하는 약한 양이온 교환 컬럼-용출 분획에 세번째 컬럼 단계 정제를 실시하였다. 컬럼 정제를 pH 5.0의 결합-용출 모드에서 수행하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 pH 6.2의 110mM 소듐 아세테이트 버퍼로 세척하였다. rhPTH^{1 -34}의 용출은 pH 7.2의 150mM 소듐 아세테이트로 실행하였다. 숄더 피크(shoulder peak)를 가지는 rhPTH^{1 -34} 산물을 컬럼에서 용출하고 분획에 수집하였다. 원하는 분획을 풀링(pooling) 또는 선별하기 전, 상이한 피크의 분획을 분석용 RP-HPLC로 분석하였다. 추가 공정을 위해 주요 피크(principal peak)가 순도 97% 이상(분석용 RP-HPLC에 의하여)을 가지는 분획을 함께 풀링하였다.

강한 양이온 교환 컬럼 조건의 세부사항:

컬럼 규격 - 23 내지 26 cm (h) x 10 cm (i.d.)

컬럼 베드 볼륨 - 2 L

평형화 버퍼: pH 5.0의 20 mM 소듐 아세테이트

유속 - 92 cm / h

용출 - 150 mM 소듐 아세테이트, pH 7.2

컬럼 크리닝 - 0.5 N NaOH

강한 양이온 교환 컬럼으로부터 rhPTH^{1 -34} 용출의 크로마토그래피 프로파일을 도 3에 도시한다.

단계 9: 초미세여과- 투석여과 (Ultrafiltration- diafiltration )

다음 컬럼 단계 평형화 버퍼 조건으로 튠-업(tune-up)하기 위하여, 강한 양이온 교환 컬럼-용출된 rhPTH^{1 -34} 용액을 전도도 및 pH를 각각 1.5 (± 1) mS.cm^-1 및 5.0으로 조정하여 초미세여과-투석여과 단계를 실시하였다. rhPTH^{1 -34} 용액의 정적(Constant volume) 투석여과를 보유물(retentate)의 전도도 및 pH가 초기 투석여과 버퍼와 같아질 때까지 pH 5.0의 낮은 이온 강도의 아세테이트 버퍼로 1kDa 또는 2kDa 막을 사용하여 실행하였다. 투석여과 후, 다음 컬럼 단계 평형화 버퍼 pH에 맞추기 위해, 상기 rhPTH^{1 -34} 용액의 pH를 1M Tris-base(용액)로 pH 8.2로 조정하였다.

단계 10: 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

투석여과 후, 융합-파트너 단백질 오염 물질 (산물-관련 불순물)의 잔량을 제거하기 위하여 rhPTH^{1 -34} 산물 용액을 추가로 약한 음이온 교환 컬럼에 통과시켰다. 오염된 산물-관련 물질(들)은 마트릭스에 결합되어 남은 반면, 상기 원하는 rhPTH^1-34 산물은 컬럼 플로우-스루-및-세척 분획에서 회수하였다.

약한 음이온 교환 컬럼 조건의 세부사항:

컬럼 규격 - 25 cm (h) x 10 cm (i.d.)

컬럼 베드 볼륨 - 2.5 L

평형화 버퍼 - Tris-Cl, pH 8.2

유속 - 28 cm / h

컬럼 세척 - 500 mM NaCl Tris 버퍼, pH 8.2

컬럼 크리닝 - 0.5 N NaOH

상기 약한 음이온 교환 컬럼 단계의 크로마토그래피 프로파일을 도 4에 도시한다.

이 단계에서, 상기 컬럼-플로우-스루-세척 분획에서 회수된 정제된 rhPTH^{1 -34} 산물을 Ag-염색된 SDS-PAGE로 분석하면, 도 5에 나타낸 바와 같이, 겔에 하나의 넓은 밴드로 보인다.

단계 11: 초미세여과 / 투석여과에 의한 버퍼 교환

두번째 음이온 교환 컬럼 단계로부터 회수된 원하는 rhPTH^{1 -34} 산물 용액을 먼저 아세트산 용액과 혼합하여 pH 5.0으로 조정한 다음, 초미세여과-투석여과에 적용하였다. 정적(Constant volume) 투석여과를 보유물(retentate)의 pH 및 전도도가 상기 투석여과 버퍼의 pH 및 전도도와 같아질 때까지, 차가운 조건하에서 (2℃-15℃), pH 4.0의 소듐 아세테이트 버퍼로 1kDa 또는 2kDa MWCO 막을 사용하여 수행하였다. 이 단계를 실행하여 약물 저장 버퍼에 상기 정제된 rhPTH^{1 -34} 산물을 넣었다. 상기 정제된 rhPTH^{1 -34} 산물의 최종 농도는 1mg/mL 정도로 유지하였다.

단계 12: 0.22μm 말단 여과

초미세여과-투석여과에 의한 버퍼 교환 후, 정제된 rhPTH^{1 -34} 산물 용액을 무균에서 0.22 μm 필터로 여과하고, 냉동의 벌크(bulk)한 rhPTH^{1 -34}의 약물로, -20℃ 또는 그 이하에서, 적합한 저장 용기에 저장하였다.

최종적으로 정제된 rhPTH^{1 -34}의 약물은 분석용 RP-HPLC에 의하면 도 6에 나타낸 바와 같이 순도 99% 이상을 보인다.

따라서 본 발명의 방법은 조 혼합물로부터 rhPTH^{1 -34}를 비-HPLC로 정제하는 효율적인 방법을 제공한다. 상기 방법은, 분석용 RP-HPL로 측정한 바에 따르면, 결과적으로 순도 99% 이상을 가지는 고도로 정제된 rhPTH^{1 -34}를 제조한다. 이와 같이 고도로 정제된 rhPTH^{1 -34}의 제조는 당업자에게 공지된 통상의 기술에 따라 제형 후 인간의 치료 용도에 적합한 것으로 판단된다.

Claims (13)

1. 부갑상선 호르몬을 정제하는 방법으로서,
   (a) 효소적 절단에 의해 융합-파트너-단백질-PTH 복합체로부터 부갑상선 호르몬을 분리하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 부갑상선 호르몬을 약한 음이온 교환 크로마토그래피에 통과시켜 플로우-스루(flow-through) 및 세척 분획을 얻는 단계;
   (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 플로우-스루 및 세척 분획을 약한 양이온 교환 크로마토그래피에서 NaCl을 함유하는 소듐 아세테이트로 용출시켜 분획을 얻는 단계;
   (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 분획을 강한 양이온 교환 크로마토그래피에서 소듐 아세테이트로 용출시켜 분획을 얻는 단계;
   (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 분획을 약한 음이온 교환 크로마토그래피에 통과시켜 플로우-스루 및 세척 분획을 얻는 단계; 및
   (f) 상기 (e) 단계에서 얻은 플로우-스루 및 세척 분획으로부터 고도로 정제된 부갑상선 호르몬을 회수하는 단계를 포함하고,
   상기 약한 음이온 교환 크로마토그래피에서 음이온 교환체는 DEAE 세파로오스이며,
   상기 약한 양이온 교환 크로마토그래피에서 양이온 교환체는 바이오-렉스70(Bio-rex70) 또는 CM 세파로오스이고,
   상기 강한 양이온 교환 크로마토그래피에서 양이온 교환체는 SP-5PW, SP 세파로오스 및 모노S(Mono S)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 효소적 절단은 재조합 엔테로키나제 효소에 의해 수행되는 방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계의 강한 양이온 교환 크로마토그래피 수행 후 상기 (e) 단계의 약한 음이온 교환 크로마토그래피 수행 전에, 초미세여과-투석여과(Ultrafiltration-diafiltration) 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 투석여과 매체는 포스페이트 버퍼, 아세테이트 버퍼, 시트레이트 버퍼, 숙시네이트 버퍼 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
10. 하기 단계를 포함하는 조 혼합물로부터 부갑상선 호르몬을 정제하는 방법으로서,
    (a) 세포를 파쇄하는 단계;
    (b) 세포 용해물로부터 봉입체 덩어리를 분리하는 단계;
    (c) 봉입체 덩어리를 가용화하는 단계;
    (d) 효소적 절단에 의해 융합-파트너-단백질-PTH 복합체로부터 부갑상선 호르몬을 분리하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 분리된 부갑상선 호르몬을 포함하는 분획의 pH를 재조정(Reconditioning)하는 단계;
    (f) 상기 (e) 단계에서 재조정된 분획을 약한 음이온 교환 크로마토그래피에 통과시켜 플로우-스루 및 세척 분획을 얻는 단계;
    (g) 상기 (f) 단계에서 얻은 플로우-스루 및 세척 분획을 약한 양이온 교환 크로마토그래피에서 NaCl을 함유하는 소듐 아세테이트로 용출시켜 분획을 얻는 단계;
    (h) 상기 (g) 단계에서 얻은 분획을 강한 양이온 교환 크로마토그래피에서 소듐 아세테이트로 용출시켜 분획을 얻는 단계;
    (i) 상기 (h) 단계에서 얻은 분획을 초미세여과/투석여과(UF/DF)를 수행하여 분획을 얻는 단계;
    (j) 상기 (i) 단계에서 얻은 분획을 약한 음이온 교환 크로마토그래피에 통과시켜 플로우-스루 및 세척 분획을 얻는 단계;
    (k) 상기 (j) 단계에서 얻은 플로우-스루 및 세척 분획에 대하여, 초미세여과/투석여과로 버퍼 교환을 수행하는 단계; 및
    (l) 상기 (k) 단계의 버퍼 교환된 분획을 0.22μm의 필터로 여과하여, 고도로 정제된 부갑상선 호르몬을 얻는 단계를 포함하고,
    상기 약한 음이온 교환 크로마토그래피에서 음이온 교환체는 DEAE 세파로오스이며,
    상기 약한 양이온 교환 크로마토그래피에서 양이온 교환체는 바이오-렉스70(Bio-rex70) 또는 CM 세파로오스이고,
    상기 강한 양이온 교환 크로마토그래피에서 양이온 교환체는 SP-5PW, SP 세파로오스 및 모노S(Mono S)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
11. 청구항 1, 2 및 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부갑상선 호르몬은 재조합 부갑상선 호르몬인 방법.
12. 청구항 1, 2 및 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부갑상선 호르몬은 절단 부위를 통하여 융합 파트너와 융합된 것인 방법.
13. 삭제

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