JPH08510762A

JPH08510762A - 塩基性線維芽細胞成長因子の精製プロセス

Info

Publication number: JPH08510762A
Application number: JP8504976A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．シェイドル，ポウラ; ビー．シルバーネス，ケイト; エス．キング，ロバート
Original assignee: サイオスノバインコーポレイテッド
Priority date: 1994-07-18
Filing date: 1994-07-18
Publication date: 1996-11-12
Anticipated expiration: 2019-03-22
Also published as: WO1996002562A1; DE69432706T2; US5331095A; EP0720618A4; EP0720618A1; CA2170885A1; ATE240969T1; DE69432706D1; EP0720618B1; CA2170885C; JP3509104B2

Abstract

(57)【要約】本発明は塩基性線維芽細胞成長因子を精製する方法に関する。この方法は、強カチオン交換クロマトグラフィー、続いて疎水的相互作用クロマトグラフィー、次いで、弱カチオン交換クロマトグラフィーの使用を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】塩基性線維芽細胞成長因子の精製プロセス技術分野本発明はタンパク質の単離および精製に関する。特に、本発明は、強および弱の両カチオン交換ならびに疎水的相互作用クロマトグラフィーを用いる塩基性線維芽細胞成長因子の単離および精製の改良された方法に関する。発明の背景塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）は、有効な分裂促進効果を有することを示し、それゆえ、組織の再生または修復にその使用を示唆する。天然bFGFを精製する多数の方法が記載されている。天然のbFGFはヘパリンに対して親和性を有することを示すので、ヘパリンを用いるアフィニティークロマトグラフィーは、bFGFの精製に有効な方法であることが見出された。Burgessら、A nnu. Rev. Biochem. 58:575-606（1989）。しかし、このアプローチの欠点は、最終容量の精製bFGFがヘパリンを含まないことの確認が困難であることである。ヘパリンは、抗凝血活性を有する生物学的に活性な物質なので、微量のヘパリンの混入でさえも非常に好ましくない。 Shingら、J. Bio1. Chem. 263:9059-9062（1988）は、２つのタイプのFGFである塩基性FGFおよび酸性FGFのそれぞれのヘパリンに対する親和性およびそれらの等電点（pI）に基づいた２つのタイプのFGFの分離を記載する。ヘパリンクロマトグラフィーが、粗細胞培養物に由来するライゼートまたは下垂体、副腎髄質、および脳組織のような組織のいずれかに由来する天然FGFを精製するために用いられた。GospodarowiczおよびMescher（1981）Advances in Neurology: Neurofi bromatosis , Riccardi V.MおよびMulvihill J.J.編、Vol.29, p.149 Raven Pres s, New York。組換えbFGFが生産され、再度ヘパリンアフィニティーHPLCを用いて精製された。Masaharuら、Biochem. Biophys. Res Commun. 151:701-708（198 8）。Masaharuらは、タンパク質を安定化し、ヘパリンアフィニティーHPLCからのbFGF溶出の不均一度を減少する試みのために、部位指向性変異誘発を用いて、成熟bFGF タンパク質の４つのシステイン残基をセリン残基に変化させたが、いくつかの改変タンパク質では生物学的活性が残存していた。 Scheuermannら、米国特許第5,136,025号（以下「'025特許」）の開示は、その全てが参考として本明細書中に援用されており、それは組換えヒトbFGF多量体を発現するEscherichia coliを回収し、ヘパリンが存在しない金属キレートアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いてbFGFを精製する方法を開示する。'0 25特許は、公知のbFGF精製法で用いるヘパリンが、インビボでbFGFとの親和性、 bFGFの取り込み速度、および薬学動力学に影響し得ることを特記した。'025特許で開示された方法は、98％純度で混入物汚染のないタンパク質を生じる。簡単に説明すれば、この方法は、以下のとおりである：組換えbFGFを含む粗抽出物を、 bFGFがその塩基性pIのために結合するカチオン交換体を含む最初のクロマトグラフィー工程に供する。この最初のカラムから回収したタンパク質は、約80％bFGF である。部分的に精製したbFGFを、多量体形態のbFGFおよびレベルが減少した混入物を含む調製物を生じる金属キレートアフィニティーマトリックスに適用する。低分子量（MW）の混入物が存在する場合、さらなるクロマトグラフィー工程、例えば、ゲル濾過を用いる。ゲル濾過サイズ排除樹脂により、bFGF凝集体を含むより高MWの種を、より低MWの混入物から分離する。bFGFを含む画分は、bFGF多量体を解離するために化学的に還元される。次いで、十分に解離および還元された bFGFモノマーは、いかなる高MWの混入物からも単離され得る。このような単離は、より高いMWの混入物からモノマー性bFGFを分離するゲル濾過カラムによって行われ得る。金属キレートアフィニティーカラムクロマトグラフィープロセスの欠点は、金属が、生成物の酸化、凝集、およびペプチド結合加水分解を与え、結果としてモノマー性生成物の収率が低下することである。従って、さらなるプロセッシング工程が、凝集体を除去するために必要である。発明の開示本発明の方法を用いると、bFGFは、ヘパリンまたは金属キレートアフィニティークロマトグラフィーのいずれも用いなくても、逆相高性能液体クロマトグラフィー（「RP-HPLC」）分析による評価されるように本質的に均質になるまで精製され得ることが分かった。このように、高収率のbFGFがさらに迅速なプロセスで得られる。さらに、bFGFは、以前の方法よりかなり緩和されたプロセッシング条件に供される。本発明は、天然または組換えbFGF（そのフラグメントまたはアナログを含む）を含むサンプルから精製bFGFを回収する改良した方法を提供する。方法は以下の工程を包含する：（ａ）bFGF含有溶液を強カチオン交換マトリックスと接触させる工程；（ｂ）この強カチオン交換マトリックスから、多数の画分を、bFGFを含む少なくとも１つの画分で溶出する工程；（ｃ）bFGFを含有する強カチオン交換マトリックス画分を疎水的相互作用マトリックスと接触させる工程；（ｄ）この疎水的相互作用マトリックスから、多数の画分を、bFGFを含む少なくとも１つの画分で溶出する工程；（ｅ）bFGFを含有する疎水的相互作用マトリックス画分を弱カチオン交換マトリックスと接触させる工程；（ｆ）この弱カチオン交換マトリックスから、多数の画分を、bFGFを含む少なくとも１つの画分で溶出する工程；および（ｇ）bFGFを含有する弱カチオン交換マトリックス画分から精製bFGFを回収する工程。図面の簡単な説明図１は、実例となる精製のスキームを示すフローチャートである。図２Ａおよび図２Ｂは、生成物bFGFの逆相（図２Ａ）パターンおよびイオン交換溶出（図２Ｂ）パターンの分析グラフを示す。発明の実施様式Ａ．定義「bFGF」は、天然に存在するかまたは組換え的に生産されるかのいすれかである塩基性線維芽細胞成長因子を意味する。bFGFは、'025特許の図１に示す配列に相同または実質的に相同である。あるいは、bFGFは本明細書中のアッセイまたは当業者に公知の他のアッセイに示す生物学的活性を有する。「bFGF」はまた、同様の生物学的活性を有するがアミノ酸残基の欠失、付加、伸長、または交換のような偶発的または意図的に誘導した変化を含み得るbFGFのアナログタンパク質およびフラグメントを含み得る。このようなアナログの例は、例えば、１またはそれ以上のシステイン残基を他のアミノ酸残基と置換し、分子内架橋結合または間違った分子内ジスルフィド結合を形成する部位を除去したタンパク質を含む。システインの中性アミノ酸、例えば、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、チロシン、またはメチオニンへの変換は、好ましいアプローチである。セリンおよびアラニンは、システインに化学的に相同なので、より好ましい置換である。生物学的活性を有する１つの変異体形態では、78位および 96位のシステイン残基がセリンに変化している。Ｎ末端欠失アナログを含む他の bFGFアナログは、1989年１月12日に公開されたPCT出願WO89/00198に記載されており、この出願の関連部分は参考として本明細書中に援用される。さらに、bFGF は、当該分野で公知の任意の方法により化学的に改変され得る。本明細書で使用するように、「bFGF」は、上記の形態および全ての天然に存在するまたは組換え形態、完全なタンパク質およびその生物学的活性なアナログおよびフラグメントを含む。本明細書で使用するように、用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物種を意味するが、好ましくはヒトである。「精製」または「純粋な」は、組換え体または天然の状態に見られるように通常付随する物質を含まない物質を意味する。従って、例えば、「純粋な」bFGFは、そのインサイチュ環境で通常結合しているDNA、宿主細胞タンパク質、または脂質を含まないbFGFを意味する。もちろん、「純粋な」bFGFは、共有結合で結合した物質を含み得る。「純粋な」bFGFは、少なくとも約75％、さらに好ましくは少なくとも約90％、および最も好ましくは少なくとも約98％である純度を意味する。「カチオン交換クロマトグラフィー」または「カチオン交換体」は、荷電基を有するクロマトグラフィー樹脂を、精製されるべき混合物中の荷電成分を選択的に結合し、放出するために使用する精製方法を意味する。カチオン交換体は、カチオン（正に荷電した種）を結合し、それゆえに、活性または結合相として負に荷電したリガンドを有する。「強カチオン交換クロマトグラフィー」は、広いpH 範囲（約５と7.5との間）にわたり完全にイオン化される樹脂を意味する；すなわち、媒体の特徴はpHで大きく変化しない。強カチオン交換体の例は、硫酸塩、スルホプロピル（SP）、トリスアクリル（Trisacryl）などを含む。「弱カチオン交換クロマトグラフィー」は、解離程度およびそのため交換能がpHで大きく変化する樹脂を意味する。代表的には、弱カチオン交換体は、その解離定数を越えるpHでイオン化されるだけである。従って、弱カチオン交換体は、狭いpH範囲（約６と７との間）で作動する。弱カチオン交換体の例は、カルボキシメチル（CM ）、ホスホノ、およびポリアスパラギン酸などを含む。「疎水的相互作用クロマトグラフィー」（HIC）は、水性緩衝液で行われるクロマトグラフィーの様式を意味する。タンパク質のような成分は、疎水的相互作用を介してHICカラムに結合する。HICは逆相（RP）クロマトグラフィーに使用されるのと同じクロマトグラフィー樹脂を使用し得る。HICは、低または高圧で行い得る。しかし、RPクロマトグラフィーとは異なり、カラムは、高塩濃度を用いる水性緩衝液の存在下で平衡化され、そして低塩濃度を用いる水性緩衝液の存在下で溶出される。低圧での適用のための代表的なHIC樹脂は、Pharmaciaのフェニル-セファロース、およびTosohaasのブチル、フェニル、およびエーテルToyopea rl650系列樹脂を含む。Ｂ．一般的な方法記載した全ての方法は、当業者に慣例的に公知および使用される方法であり、そしてYostら、Practical Liquid Chromatography, Perkin-Elmer Corporation （1980）中に見られ得る。１．bFGFの出発供給源：組換え生産タンパク質組換えDNA技術の利用を通じて、bFGFの十分な供給は、今や創傷、手術、火傷、骨折、または神経学的変性の結果として外傷した組織を修復するために製造され得る。 bFGFは、参考として本明細書に援用される1987年３月26日に公開されたPCT公開WO87/01728に開示されるとおり、組換え方法により生産され得る。Abrahamら、Science, 233:545（1986）およびAbrahamら、The EMBO Journal ５:2523（198 6）もまた参照のこと。組換え生産タンパク質は、E. coliを含むが、これに限定されない細菌宿主系で発現され得る。細胞ライゼートの調製は、約２℃から10℃の温度で、約0.01M EDTA（エチレンジアミン四酢酸）の細胞溶解緩衝液、約0.1〜約0.2M NaCl；約0.02〜約0.05Mリン酸緩衝液；および約0.005MDTT（ジチオトレイトール）中、約7.5のpHで宿主細胞を溶解することにより行われ得る。次いで、細胞ライゼートは、30CDシステム（Manton-Gaulin, Inc.，Everett, Mass.）を含むが、これに限定されない任意の便利な手法によりホモジナイズされる。30CDシステムは、約12,000〜約15,000 psig、約１〜3L/分の流速で用いられ、80〜90％の溶解を生じる。あるいは、タンパク質は宿主細胞により周囲の培地に分泌され、それにより細胞溶解手順が不必要となる。２．bFGFの出発供給源：組織供給源からの単離本発明で使用するためのbFGFはまた、種々の動物の下垂体からの抽出および続く濃縮技術により得られ得る。ヘパリンに対する強い親和性および塩基性pIを有する13,000〜18,000MWの多くの内皮細胞分裂促進因子が、哺乳動物供給源から単離されている（これらの分裂促進因子のまとめについては、Foxら、J. Biol. Ch emistry 263:18452-18458（1988）参照）。これらの全ての因子は、Ｎ末端プロセッシングの程度だけが異なる形態のbFGFであることが公知である。下垂体組織から単離されるように、bFGFは16,500MWの一本鎖非グリコシル化タンパク質である。３．bFGFの精製一旦、bFGFの粗単離物が上記の方法または他の任意の適切な手段により得られると、本発明の精製手順が使用され得る。図１は、本発明の実例となる実施態様のフローチャートである。好ましい方法は、３つのクロマトグラフィー工程を使用する。第一の工程は、bFGFがその塩基性pIのために結合する強カチオン交換体を包含する。bFGF分子またはbFGFと宿主細胞タンパク質との間の分子間ジスルフィド結合形成を破壊しまたは妨げるため、そしてbFGFの樹脂への結合効率を高めるために、還元剤を細胞抽出緩衝液に含み得る。適切な還元剤の例は、DTT、β-メルカプトエタノール、およびシステインを含むがこれらに限定されない。強カチオン交換クロマトグラフィーは、約２℃〜約25℃、好ましくは約４℃の温度で、約６〜８のpH、好ましくは約7.5の緩衝液中で実施される。このような緩衝液の例は、リン酸ナトリウムおよびイミダゾール-HCl緩衝液を含むがこれらに限定されない。溶出は、段階または勾配、好ましくは段階であり得る。カラムマトリックスは、スルホプロピル−アガロース、デキストラン、およびアクリルアミドマトリックスを含むがこれらに限定されないカチオン交換樹脂を含む。例えば、スルホプロピル−セファロースファーストフロー（sulphopropyl-Sepharose Fast Flow ）、スルホプロピル−セファデックス、トリスアクリルなどが挙げられ、好ましくはスルホプロピル−セファロースファーストフローである。bFGFは、低塩濃度（0.1MNaCl, 0.05Mリン酸ナトリウムpH7.5，好ましくは10mM EDTAおよび5mM DTT をともなう）で結合され、高塩濃度（0.5M NaCl，0.05Mリン酸ナトリウムpH7.5 ，好ましくは1.0mMEDTAをともなう）で溶出される。KCl、Na₂SO₄などを含むがこれらに限定されない他の適切な塩は、結合および溶出のためにNaClの代わりに用いられ得る。この工程はbFGFを７〜８倍精製し、そしてまた、bFGFが約70％と85 ％との間の純度になるように、エンドトキシンおよび核酸レベルを実質的に減少させる。この工程は、バッチ様式およびカラムで行われ得る。第二の工程はbFGFをさらに精製するために疎水的相互作用クロマトグラフィーの使用を包含する。上記の強カチオン交換クロマトグラフィープロセスのイオン交換溶出物はその伝導性を調節するために緩衝液で処理され、そしてクロマトグラフィーはブチル-HIC樹脂上で、好ましくは周囲の温度で行われるが、４℃で行われ得る。緩衝液は０〜５mMEDTAを含む;好ましくは1.4〜1.5M硫酸アンモニウムおよび0.01〜0.1Mリン酸カリウムをともなう硫酸アンモニウム／リン酸カリウム緩衝液であるが、硫酸ナトリウム、KCl、高NaCl、または他の強塩もまた含み得る。別の緩衝液もまた用いられ得、リン酸ナトリウム、イミダゾール-HCl、クエン酸ナトリウム、および酢酸ナトリウムを含むがこれらに限定されない。HIC は５と7.2との間のpH、好ましくは６と７との間のpHで行われ得る。bFGFの他の混入物からの単離は、塩勾配の減少を用いて達成される。段階溶出または勾配溶出のいずれかが利用され得る。カラムマトリックスは、アガロース、シリカ、またはポリマー性樹脂を含むがこれらに限定されない。カラムマトリックスは、ブチル、オクチル、フェニル、アセチル、または他の低級（１〜８Ｃ）アルキルを含むがこれらに限定されない官能基が結合している。上記の勾配HIC工程は、RP-HPLCにより約85％と95％との間の均質性までbFGFを精製し、90％より高い純度のbFGFを生じる。純度はRP-HPLCにより分析され、RP- HPLCはアクトニチル（actonitile）/0.1％ TFA勾配30〜45％を用いるVydac C4カラムで30分間にわたり行われる。ピークの検出は215nmでモニターされる。 HICからの勾配溶出の代替物はイソクラティックHICであり、そこではbFGFかHI C樹脂に結合せずに、不純物が結合する。この方法により、RP-HPLCにより約80％と90％との間の均質性にあり、約90％と95％との間の純度のbFGFであるbFGFが生じる。第三の工程は、FGF凝集体および分解生成物ならびに宿主細胞タンパク質からb FGFをさらに精製するために、弱カチオン交換クロマトグラフィーの使用を含む。精製bFGFを含むHIC溶出液は、任意の便利な手段、例えば限外濾過を用いて濃縮され、次いで、緩衝液を低塩緩衝液に交換し、そしてイオン交換カラムにかけられる。低塩緩衝液は、１mM EDTAをともなう0.1M硫酸アンモニウム、0.02Mリン酸カリウム、pH6.0であり得る。NaClおよびNa₂SO₄を含むがこれらに限定されない他の塩は用いられ得る。酢酸塩、クエン酸塩、およびイミダゾールを含むがこれらに限定されない他の緩衝液もまた用いられ得る。弱カチオン交換クロマトグラフィーは、約２℃〜約25℃、好ましくは約15〜20 ℃の温度、約５〜7.5のpH、好ましくは約６のpHを有する緩衝液中で実施される。カルボキシル（COO^-）交換基およびシリカへのポリアスパラギン酸結合に基づく弱カチオン交換体（例えば、PolyCAT A、PolyLC Inc.，Columbia，MDから入手、およびBakerbond弱カチオン交換体、J.T. Baker，Phillipsburg，N.J.から入手）は、この適用において有用であることが示されている。カラムマトリックスの粒子サイズ（５〜25μm）および孔サイズ（300または1000Å）の範囲は、受容可能な分解特徴を全て示した。bFGFは、イソクラティックまたは緩やかな勾配溶出様式（すなわち、0.5mM/分）のカチオン交換塩（例えば、ナトリウムまたはアンモニウム）を用いて、一定pH（6.0〜7.5の範囲）および約４cm/分〜約10cm/分までの線形速度で溶出される。生成物bFGFは、ＡおよびＢと称する小さなピークおよび主要なピークに溶出される。ピークＡは酸化されたFGF混入物を含むが、一方ピークＢは、上記のようにRP-HPLCで分析する場合、約95％より大きい、好ましくは約97〜98％の単一ピークのbFGFである（図２参照）。FGF凝集体は、存在するならば、ピークＢより後に溶出する。４．混入についての試験精製後のbFGFの活性は、種々のアッセイ、例えば、副腎皮質内皮細胞アッセイ（ACEアッセイ）またはベビーハムスター腎臓-21（（BHK）-21）マイクロタイター細胞増殖アッセイにより測定され得る。さらに、最終生成物の混入についての試験は、純度をモニターすることを意図しており、例えば、リムルス変形細胞ライゼート（LAL）アッセイ、残存核酸混入範囲、E. coli宿主細胞タンパク質アッセイ、および発熱物質についてのウサギアッセイが挙げられる。Ｃ．実施例以下の実施例は、発明を説明するが限定しないことが意図される。実施例１組換えヒトbFGFを、本明細書で参考として援用される共同所有の米国特許第5, 136.025号に記載のとおり、E. coli Bで発現した。細胞を収集し、そしてProsta kデバイス（Millipore，Bedford，MA）の正接流濾過（tangential flow filtrat ion）により洗浄した。凍結した細胞塊、約２kgを解凍し、３倍容量の0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5および0.1M NaClに４℃で再懸濁した。EDTA（0.5M）および DTT（1M）をそれぞれ最終濃度10mMおよび5mMまで添加した。細胞のスラリーをMa nton Gaulin CD30ホモジナイザーを用いてホモジナイズすることにより溶解した。工程１−強カチオン交換クロマトグラフィー細胞ライゼートを、0.05Mリン酸ナトリウム、0.1M NaCl、pH7.5、１mM EDTAを用いて４℃で撹拌バッチ様式で平衡化したSP-セファロースファーストフロー樹脂（Pharmacia）と直接接触させた。インキュベーションは４℃で60分間（撹拌）行い、bFGFを樹脂に結合させた。次いで、樹脂を沈澱させ、非結合化合物、細胞デブリ、および緩衝液を除去するためにデカントした。緩衝液での２回の洗浄を同様に行った。次いで、樹脂をカラム（18×90cm、IBF/Sepracor Inc.）に充填し、そしてさらに0.05Mリン酸ナトリウムpH7.5、１mM EDTA中0.22M NaClでさらに洗浄した。この工程は特定の宿主細胞タンパク質混入物を溶出した。次いで、bFGFを出発緩衝液中0.5M NaClを用いて溶出させた。最初の1.9kgの細胞塊（これは210グラムの全タンパク質を含む（Bradford ass ay））から、14.7gまたは約７％のタンパク質およびほぼ全てのbFGFが結合および溶出画分中に得られた。この物質は、Molecular Devices Threshold Machine を用いる免疫学的アッセイに基づき、約80％bFGFであった。従って、細胞デブリの効率的な除去が、分離濾過工程を用いずに達成された。工程２−疎水的相互作用クロマトグラフィー次の工程は疎水的相互作用クロマトグラフィー（HIC）を利用した。上記の0.5 M溶出液を「緩衝液Ａ」（緩衝液Ａは0.1Mリン酸カリウム、および1mM EDTA、pH6 .5である）中３M硫酸アンモニウムで１：１に希釈した。粒子除去フィルターを通して濾過した後、100mlのスルホプロピル0.5M溶出プール中のタンパク質15mg を、緩衝液Ａ中1.5M硫酸アンモニウムで平衡化した10ml（1.6cm×５cm）ブチル6 50M To SoHaas（Philadelphia，PA）カラムにかけた。タンパク質を流した後、カラムを緩衝液Ａ中1.5M硫酸アンモニウムで洗浄した。カラムおよび全ての緩衝液は室温であった。結合タンパク質の溶出を、緩衝液Ａ中の1.4Mおよび1.3M硫酸アンモニウム、水、および水酸化ナトリウムを用いて段階様式で行った。画分を RP-HPLCによりbFGF均質性についてアッセイし、そして純度のためにプールした。85％より大きい主要ピークbFGFで50〜70％の収率が達成された。工程３−弱カチオン交換クロマトグラフィー次の工程は弱イオン交換クロマトグラフィーを利用した。HIC工程からの溶出液を脱塩化し、限外濾過系−Minitan（Millipore，Bedford，MA）により濃縮した。HICカラムの溶出液由来のbFGFの精製に用いるカラムは、polyCAT Aと称される4.6×200mmの弱カチオン交換体であり、それはポリアスパラギン酸でコートされた５μmの1000Åシリカ充填からなる（PolyLC、Columbia，MD）。結合タンパク質の溶出を、20mMリン酸カリウムおよび１mM EDTA中の線形勾配の硫酸アンモニウム、pH６を用いて行った。２重の勾配は、1.6mM硫酸アンモニウム／分の最初の緩やかな勾配、および次いで120mM硫酸アンモニウム／分から最終濃度400mM 硫酸アンモニウムからなった。生成物の溶出パターンを図２に示す。95％より高い主要ピークbFGFで、約60％の収率が達成された。実施例２実施例１の２kgの細胞ライゼートを、0.05Mリン酸ナトリウム、0.1M NaCl、pH 7.5、１mM EDTAを用いて４℃で撹拌バッチ様式で平衡化したSP-セファロースファーストフロー樹脂（Pharmacia）と直接接触させた。インキュベーションは４ ℃で60分間（撹拌）行った。次いで、その上に緩衝液のスペースを有する安定な充填ベッドが得られるまで、樹脂を含むライゼートをカラム（18×90cm、IBF/Se pracorInc.）にゆっくりな流速で充填した。次いで、ほとんどの細胞デブリをカラムから目視的に除去し、流出液が透明になるまで、樹脂ベッドを、上流および下流を交互に用いて0.05Mリン酸ナトリウム、0.1M NaCl、pH7.5、および１mM ED TAで洗浄した。これは流れの方向の４つの変化を必要とした。次いで、カラムを 0.05Mリン酸ナトリウム、pH7.5、１mM EDTA中0.22M NaClで洗浄した。次いで、b FGFを出発緩衝液中0.5M NaClを用いて溶出した。最初の2.0kgの細胞塊から、約6.5％のタンパク質およびほぼ全てのbFGFが結合および溶出画分に得られた。この物質は、Molecular Devices Threshold Machin eを用いる免疫学的アッセイに基づき、約80％bFGFであった。従って、細胞デブリの効率的な除去が、分離濾過工程を用いずに達成された。実施例３ HIC精製−段階勾配方法 bFGFの精製を実施例１のように実施したが、工程２のプロセッシング条件を以下のように変更した。強カチオン交換体由来の溶出液を、緩衝液Ａ中3M硫酸アンモニウムで１：１に希釈した。この物質を粒子除去フィルターに通した。緩衝液Ａ中1.5M硫酸アンモニウムで平衡化した後、実施例２に記載のカラムに200ml中30mgのタンパク質を流した。次いで、カラムを平衡緩衝液で洗浄し、続いて、緩衝液Ａ中1.25M、0.9 M、および0.5M硫酸アンモニウム、水、および水酸化ナトリウムを用いて段階様式で、結合タンパク質の溶出を行った。RP-HPLCにより決定されたところ、85％の主要ピークbFGFで、53％の収率が達成された。実施例４ bFGFの精製を実施例１のように実施したが、工程２のプロセッシング条件を以下のように変更した。強カチオン交換体由来の溶出液を、緩衝液Ａ中3M硫酸アンモニウムで１：１に希釈した。粒子除去フィルターを通して濾過した後、100mlのスルホプロピル0.5 M NaCl緩衝液溶出プール（下降側）中の960mgのタンパク質を、緩衝液Ａ中1.5M 硫酸アンモニウムで平衡化した159ml（4.5cm×10cm）ブチル650S ToSoHaas（Phl ladelphia，PA）カラムにかけた。タンパク質を流した後、カラムを緩衝液Ａ中の1.5M硫酸アンモニウムで洗浄した。カラムおよび全ての緩衝液は室温であった。結合タンパク質の溶出を以下のような段階様式で行った：全て緩衝液Ａ、0.5M 水酸化ナトリウム、20％エタノール、および30％プロピレングリコール中の1.5M ；1.3M；1.25M；1.1M；0.9M；0.7M；0.45M；および0.0M硫酸アンモニウム。収率は、RP-HPLCにより測定されたところ85％の主要ピークbFGFで、プールされた画分に依存して62％と81％との間にあった。実施例５ bFGFの精製を実施例１のように実施したが、工程２のプロセッシング条件を以下のように変更した。強カチオン交換体由来の溶出液を、緩衝液Ａ中3M硫酸アンモニウムで１：１に希釈した。粒子除去フィルターを通して濾過した後、85mlのスルホプロピル0.5M NaCl緩衝液溶出プール（上昇側）中の85mgのタンパク質を、緩衝液Ａ中1.5M硫酸アンモニウムで平衡化した159ml（4.5cm×10cm）ブチル650S ToSoHaas（Phlla delphia，PA）カラムにかけた。タンパク質を流した後、カラムを緩衝液Ａ中1.5 M硫酸アンモニウムで洗浄した。カラムおよび全ての緩衝液は室温であった。結合タンパク質の溶出を以下のような段階様式で行った：全て緩衝液Ａ；0.5M水酸化ナトリウム；および30％プロピレングリコール中の1.5M；1.3M；1.25M；0.9M ；0.7M；0.45M；および0.0M硫酸アンモニウム。収率は、RP-HPLCにより測定されたところ、85％の主要ピークbFGFで15％であった。負荷物質中に低いパーセントの生成物が存在するので、収率は低かった。実施例６ bFGFの精製を実施例１のように実施したが、工程２のプロセッシング条件を以下のように変更した。強カチオン交換体由来の溶出液を、緩衝液Ａ中3M硫酸アンモニウムで１：１に希釈した。粒子除去フィルターを通して濾過した後、1000mlのスルホプロピル0. 5M NaCl緩衝液溶出プール中の1026mgのタンパク質を、緩衝液Ａ中1.5M硫酸アンモニウムで平衡化した159ml（4.5cm×10cm）ブチル650S ToSoHaas（Philadelphi a，PA）カラムにかけた。タンパク質を流した後、カラムを緩衝液Ａ中1.5M硫酸アンモニウムで洗浄した。カラムおよび全ての緩衝液は室温であった。結合タンパク質の溶出を以下のような段階様式で行った：全て緩衝液Ａ中の1.5M；1.3M； 1.25M；1.1M；0.9M；0.45M；および0.0M硫酸アンモニウム。RP-HPLCにより測定されたところ85％より高い主要ピークbFGFで92％の収率が達成された。実施例７ HIC精製−イソクラティック方法 bFGFの精製を実施例１のように実施したが、工程２のプロセッシング条件を以下のように変更した。強カチオン交換体由来の溶出液を、100mM KPi、1.5M硫酸アンモニウム、１mM EDTA、pH6.5で３：５に希釈し、硫酸アンモニウム濃度を0.9Mにした。ブチル-65 0M ToSoHaas樹脂（Philadelphia，PA）を用いて、５ml（1.0cm×6.5cm）カラムに100mM KPi、0.9M硫酸アンモニウム、1mM EDTA、pH6.5を注ぎ、平衡化した。次いで、このカラムをPharmacia FPLC系に取り付けた。平衡化のさらに10分後、20 ml（37mgのタンパク質）の上記の負荷物質をカラムにかけた。次いで、この系をイソクラティック条件（100mM KPi、0.9M硫酸アンモニウム、１mM EDTA、pH6.5 ）でさらに30分間洗浄し、UVでモニターしたクロマトグラフィートレースを基線まで戻した。さらに10分間にわたり、硫酸アンモニウム濃度を連続勾配を用いてゼロまで減少させ、従ってHIC樹脂に結合した混入しているタンパク質の放出を促進する。２ml画分をクロマトグラフィートレースの全コースにわたり回収し、３番目毎の画分を、標準としてBSAを用いてBradford法（Biorad，Richmond，CA）によりタンパク質濃度についてアッセイした。次いで、これらの画分をSDS-PAGEにより分析した。ゲルの可視分析から、画分を純度のためにプールし、そしてBradford により物質収支目的のために再度アッセイした。これはカラムの96％からのタンパク質回収、および80％の主要ピークbFGFでの92％の収率を示した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、bF GFを含む画分において、上記の段階溶出手順で既に認められたより宿主細胞混入レベルがわずかに高いこと（目視観察）を示した。このことは、本明細書に記載したイソクラティック方法が、段階方法で使用する硫酸アンモニウム洗浄工程を欠くという事実に起因するようである。この方法は、有意なレベルの混入物を除去することを示した。実施例８弱カチオン交換クロマトグラフィー bFGFの精製を実施例１のように実施したが、工程２および３のプロセッシング条件を以下のように変更した。疎水的相互作用マトリックス由来の溶出液（実施例３参照）を、ポリ（アスパラギン酸）でコートされた５μMの1000Åシリカ充填からなる分析スケール（4.6 ×200mm）IE-HPLCカラム（PolyCAT A、PolyLC，Inc.、Columbia，MDから入手）にかけた。試料を、20mMリン酸カリウムおよび１mM EDTA中の２重勾配の硫酸アンモニウムを用いてpH6.0で溶出した。２重勾配は、1.6mM（NH₄）₂SO₄／分の最初の緩やかな勾配から120mM（NH₄）₂SO₄／分から最終濃度400mM（NH₄）₂SO₄までからなった。ピーク画分を、上昇側で収集を開始することおよび降下側で収集を停止することにより最大ピークについて用手収集した。収率は、95％より大きい主要ピークbFGFで約60％であった。実施例９弱カチオン交換クロマトグラフィーのスケール増大研究スケール増大研究で分離を最大にするために、他の不純物から主要ピークのbF GFを分離するのに最適な溶出条件について試験するため、21mm内径（I.D.）の調製スケールの弱カチオン交換カラムで上記のようにイソクラティック溶出を用いて研究を行った。これらの研究に基づいて、300Å、12μm粒子と1000Å、15〜25 μm粒子との間の分離（最も近い不純物に対する主要ピークbFGF）における違いは、５mg/ml以下のカラム容量のローディングでごくわずかであった。イソクラティック溶出で見られるテーリング効果を減少させるさらに最適な溶出条件は、 110mM〜125mM（NH₄）₂SO₄から開始する0.5mM以下の（NH₄）₂SO₄／分の緩やかな勾配であることが分かった。当業者に明らかな本発明の実施のための上記の様式の改変は、以下の請求の範囲内であることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キング，ロバートエス. アメリカ合衆国カリフォルニア 94555, フレモント，オネイルテラス 34196

Claims

【特許請求の範囲】１．bFGFを含むサンプルから精製bFGFを回収する方法であって、該方法は本質的に以下の工程からなる：（ａ）bFGF含有溶液を強カチオン交換マトリックスと接触させる工程；（ｂ）該強カチオン交換マトリックスから、多数の画分を、bFGFを含む少なくとも１つの画分で溶出する工程；（ｃ）bFGFを含有する強カチオン交換マトリックス画分を疎水的相互作用マトリックスと接触させる工程；（ｄ）該疎水的相互作用マトリックスから、多数の画分を、bFGFを含む少なくとも１つの画分で溶出する工程；（ｅ）bFGFを含有する疎水的相互作用マトリックス画分を弱カチオン交換マトリックスと接触させる工程；（ｆ）該弱カチオン交換マトリックスから、多数の画分を、bFGFを含む少なくとも１つの画分で溶出する工程；および（ｇ）bFGFを含有する弱カチオン交換マトリックス画分から精製bFGFを回収する工程。２．前記強カチオン交換マトリックスがスルホプロピル−アガロース、デキストラン、およびアクリルアミドマトリックスらなる群から選択される、請求項１に記載の方法。３．前記疎水的相互作用マトリックスが、フェニル、アセチル、および（１〜８Ｃ）アルキルからなる群から選択される官能基に結合しているアガロース、シリカ、およびポリマー性樹脂からなる群から選択される支持体を含む、請求項１に記載の方法。４．前記弱カチオン交換マトリックスがカルボキシル官能基に結合したシリカ支持体を含む、請求項１に記載の方法。５．各溶出工程が約２℃と25℃との間の温度で行われる、請求項１に記載の方法。６．前記接触工程、工程ａ、ｃ、およびｅ、ならびに前記溶出工程、工程ｂ、ｄ、およびｆが約６と８との間のpHで行われる、請求項１に記載の方法。７．前記精製bFGFがタンパク質アナログを含み、ここで１またはそれ以上のシステイン残基が中性アミノ酸残基により置換され、該タンパク質アナログが天然bF GFの生物学的活性を示す、請求項１に記載の方法。８．前記精製bFGFが天然bFGFのアミノ末端欠失アナログを含む、請求項１に記載の方法。９．前記官能基がポリアスパラギン酸である、請求項４に記載の方法。