JPH05505594A

JPH05505594A - ｈＰＴＨフラグメント（１―３７）とその誘導体

Info

Publication number: JPH05505594A
Application number: JP91500084A
Authority: JP
Inventors: ホルスマン、ヴォルフーゲオルグ; ハルブスト、フランツ; シュルツ―クナーパ、ペーター; アダーマン、クヌート; ガーゲルマン、ミハエル
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-25
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2016-02-13
Also published as: ATE121424T1; DE3935738A1; CA2071538C; DK0497915T3; GR3015909T3; EP0497915B1; EP0497915A1; AU6871291A; AU643725B2; ES2071837T3; JP3135122B2; WO1991006564A1; CA2071538A1; DE59008949D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｈＰＴＨフラクメント（１−３７）とその製造法、およびこれを含有する医薬品とその使用本発明は、ｈＰＴＨフラグメント（１−３７）とその製造法、および、これを含をする医薬品とその使用に関するものである。

ヒト・パラトルモン（ｈＰＴＨ）、すなわち副甲状腺ホルモンは、骨粗髪症や上皮小体機能不全症などの治療に、重要な役割を果すことができるものである。

骨粗髪症（骨の量の減少）　（Ｒｉｇｇｓ　ａｎｄ　Ｍｅｌｔｏｎ、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３１４．１６７６−１６８６、１９８６）は、主として閉経後の女性や高齢者に、よく起こる病気である。患者は病気の程度によって、背骨部、前腕部あるいは大腿部を頻繁に骨折したり、痛みのために動かすことができなくなったり、また、適正な運動や社会生活ができなくなフたり、さらには、生命の危険に脅かされたりする。現在のところ、この病気の治療は、はとんど不可能と考えられている（ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＤｅｖｅｌｏｐＩｌｅｎｔ　Ｃ。

ｎｆｅｒｅｎｃｅ：　Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｌｌｌｅｎｔ　ｏｆ　０ｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ、１９８７）　、動物■■■■ 果（Ｓｅｌｙｅ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１６．５４７−５５８．　＋９３２：にａｌｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ　１３６R−１３６６、　＋９７０；　Ｈｅｆｔ１　ｅｔ　ａｌ、、ｃｌｉｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　６２．３８９−４１９６．１９８２；　Ｔａｎ　ｅｔ　ａｌ−AＥｎｄｏｃｒ６４）や、原発性−Ｆ皮小体機能九進症についてのより最近の組織学的な発見から、ＰＴＨを用いることによって骨の量を増加できることが示唆されている。実際、リーヴ工（Ｒｅｅｖｅ）たちは、毎日、少量のＰＴＨを投与することによって、副作用として僅かに皮質性骨の量が減少したものの、骨粧琴毛恒者の小社骨組織を改善することかできた（Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｊ−１３４０−１：１４４．１９８０）。このリーヴ工（Ｒｅｅｖｅ）らの発−１８０，１９１’１９）あるいはエストロゲ：／　（Ｒｅｅｖｅ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５Ｌｈ　Ｔｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、　Ｎｉｉｇａｊａ、Ｊｕｌｙ　２４−２９．１X８８）なとの骨組織活性物質とともＣ投与すわば、骨の皮質を失うことなく海綿質の量を増加させることかできることを支持するものである。

上皮小体機能不全症（ＰＴＨ欠乏症）　（Ｋｒｕｓｅ、　Ｍｏｎａｔｓｓｃｈｒ、　Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ＋３ｆｉ、　５５２−６ｔｉ６）は、先天的な原因や手術の結果、あるいは頚部への放射線被曝などによって起こり、ｋｍ中のカルシウム濃度か減少するものである。また、この病気の患者は原資性の発作を起しやすい。もし、ＰＴＨか幼児期あるいは１１弓ツ川に既に欠乏していると、知能の発育不全、歯および骨の欠陥といった危険に長い間さらされることになる１、はとんどの働者は、カルシウムおよび／またはビタミンＤ製剤を用いた治療によって順かやのカルシウム濃度を一定にすることか可能であるが、この治療は腎臓障害を起す危険を伴うものであるっこの投薬に伴う危険は、ＰＴＨによるホルモン治療に変えることで避けることできる。

さらに、最近、副甲状腺ホルモンは抗高血圧活性を示すことが明らかにされてきた（Ｎｉｃｋｏｌｓ、　Ｂｌｏｏｄ　Ｖｅｓｓｅｌｓ、　２４．１２０−１２４．１９８７）。

上皮小体機能不全症のホルモン治療だけでなく、骨粗髪症や緊張九進症の治療でも、ＰＴＨは長期間、必要であわば一生、規１す的に投与しなけわばならない。

従って、投与さｉるＰＴＨは不純物かなく、また、抗体を形成しないものでなければならない。このような条件を最も効率的に満たすものは、遺伝子工学もしくは化学的な経路を経て合成された、ヒトＰＴＨのアミノ酸配列を有するペプチドである。分泌されるＰＴＨ分子は、８４個のアミノ酸から成フている［ｈ　ＰＴＨ−（１−８４）］。しかしながら、この規模のペプチドは化学的に合成することは困難であり、遺伝子工学によってより容易に作ることができる。

今までに、ヒトＰＴＨのアミノ末端部分の配列を持つ、異なる２種類のペプチド −すなわち、ｈＰＴＨ−（１−３４）とｈＰＴＨ−（１−３８）−が合成されてきた。ｈ　ＰＴＨ−（ｆ　−３４）　（Ｍａｌ　Ｉｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、！４ｅｔａｂ。

６７、９６４−９７２．１９８８１でも、ｈＰＴＨ−（１−３８）（にｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｋｒａｃｈｔ、　Ｅｕｒ、、Ｊ。

Ｐｅｄｉａｔｒ、セゆ、３７３−３７７、１９８７＞でも、注射による単独投与を行なった臨床実験では、ウシから抽出されたウシＰＴＨ（ｂＰＴ）！＞による実験から経験的に予想されていたような短期的な効果、すなわち、未中のリン酸塩と環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭｐｌの排泄が一時的に促進されること、および血漿中のｃＡＭＰｆｊＪ度か一萌をＪに増加することなどが観察された。

少人数の骨粗粘疵色者を対象とした治療学的試験では、ｈＰＴＨ−（１−３４）　（Ｒｅｅｖｅ　ｅｊ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　（：ｏｎｙｅｓｓ　ｏ氏@Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、Ｎｉｉｇａｔａ、、Ｉｕｌｙ　２４−２９．　１９８８）もｈＰＴＨ−（１−３８）　（Ｈｅｓｃｈ　ｅｔａｌ、、　Ｃａ１ｃｉｆ、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｔｎむ、　４４．１７６−１８０．　’＋９８９）も、ある程度の成果をあげることかできた。

しかしなから、これほと符用なＰＴＨフラグメントでも、患者によっては、たとえ内因性ＰＴＨであっても外部より投与されたフラグメントによる効果を反対にしてしまうような抗体を生成してしまうという欠点がある［例えば、ｈ　ＰＴＨ −（１−３４）ではオードランらの報文（Ａｕｄｒａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、Ｍｅｔａｂ、　８４．９３７−９４３．１９８７１、ｈＰＴＨ−（１−３８）ではステーブマンらの報又（Ｓｔｏｇｍａｎｎ　ｅｊ　ａｌ、、　Ｍｏｎａｔｓｓｃｈｒ、に１ｎｄｅｒｈｅｉｌｋ　１３６．１０７．１９８８）を参照］。

約２０年はど以前に、バーツンとヤーロ−（Ｂｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｙａｌｏｗ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、　２８．１０３７−１０４７．１９６８）は、ヒトの血漿中には、分泌によりて生じたり、あるいは元の分子の辺縁部が急激に分解されることで生した種々のＰＴＨフラグメントが存在することを明らかにした。また、この辺縁部ＰＴＨ代謝の結果生し、血液循環によって体内に供給される量の生成物は、生物活性を持たない巨大なカルボキシル末端のフラグメントであり、このフラグメントは肝臓で形成されることが示された（Ｄ’ＡｍＤｕｒ　ａｎｄ　）ｌｕｃｔ、　Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｖｓｉｏｌ、　２４６．　Ｅ２４９−２５５．１９８４）。また、実験の結果から、完全な腎機能に依ったｈＰＴＨ−（１−８４）は、圧倒的な生物活性を持つタイプのＰＴＨであると考えられた。これに対して、不完全な腎機能では、個々の患者の何漿のクロマトグラフィーで、ｈＰＴＨ−（１−３４）の溶出ピークが明確に観測された（Ｇｒｕｎｂａｕｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２４７、　Ｅ４４２−４４８．１９８４）。

現在までのところ、健康人の血漿中にあって体内を循環している、生物活性をもつＰＴＨフラグメントは検圧てきていない。

そのため、体内でのＰＴＨの分解を容器内でシュミレーションしてみて、それによって、ＰＴＨ分子全体での主な開裂位置を明らかにしようとする、種々の試みかなされてきた。このような研究では、鎗のアミン末端から５番目のアミノ酸か６４３番目のアミノ酸までの間の、はとんど全部の位置が考慮されてきたく例えば、Ｂａｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６．８１５−８２１．１９８４）　、、ズルとシャンク（Ｚｕｌｌ　ａｎｄ　Ｃｈｕａｎｇ、　Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、　２６０．１６０８−１６１３．１９８５）は、ｂＰＴＨとカテプシンＤとを用いた研究を行なった。その結果、彼らは、ウシひ臓から分泌される酵素によってウシＰＴＨ（ｂＰＴＨ）か酵素分解されて、Ｃ末端のフラグメント（３５−８４）と（３８−８４）、および、これらど相補的なＮ東端フラグメント（１−３４）と（１−３７）が形成されることを明らかにした。なお、彼らの論文に記載されているｂＰＴＨは、我々か発見したｈＰＴＨ（１−３７）とは。

位置１　（ｂＰＴＨではアラニン［以下、Ａｌａ　Ｊ、ｈＰＴＨてはセリン［以下、５ｅｒＪ）、７　（ｂＰＴＨではフェニルアラニンし以下、Ｐｈｅ　］、ｈＰＴＨではロイシン［以下、Ｌｅｕ　］　）、および１６（ｂＰＴＨではＳｅｒ、ｈＰＴＨではアスパラギン［以下、Ａｓｎ　］　）が異なっている。上記の最後に述へたウシＰＴＨ（１−３７）フラグメントは、ラットとウシから採取した腎臓服を用いた研究によって、容器中で生物活性を示すことが明らかになったが、この（１−３７）フラグメントは、極めて少量しか検出されず、また、〉、速に加水分解されて（１−３４）フラグメントになってしまう。このことから、著者らは、　ウシの体内て、ＰＴＨはカテプシンＤによる酵素分解をうけて、最終的に（１−３４）フラグメントを生成すると結論した。これに対して、他の研究者からは、生体の、どの血漿中からも、いかなるＮ末端フラグメントも検出されないことに疑いが出された（Ｇｏｌ　ｊｚｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、（：Ｉｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　６５．１３０９−１３１７．１９８０）　。今までのところ、分解によって生成した、生物活性のあるＮ末、Ｑｉ４　Ｐ　Ｔ　Ｈフラグメントを、正常なラットか２９−ＩＱ３４．１９８６）は、ウシの生体内の副甲状腺は、いかなる生物活性Ｎ末端ＰＴＨフラクメントをも分泌していないことを発見した。要するに、上Ｊ己のような報告から明らかなことは、本発明の時点においては、いかなる生物活性Ｎ末端ＰＴＨフラグメントも、人間や動物の血漿中にあって体内を循還しているということはないということである。

本発明の目的は、天然パラトルモン（ＰＴＨ）の生物学的および治療学的活性を有している摂取し易い医薬品のｈＰＴＨフラグメントであって、少なくとも公知のＰＴＨフラグメント−（１−３４）および（１−３８）の効果を育し、しかも、これらに固有の欠点を持たない−特に、抗体の形成を引き起こすことのない、新しいｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）を提供することにある。

また、本発明は、前記ｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）の製造法、およびこれを様々な治療用、診断用医薬品として用いる使用を提供することにもある。

上記の目的は、新しいアミノ酸Δ致りからなるｈＰＴＨフラグメントによって達成することができる。

すなわち、本発明は、以下のアミノ酸配列を有するｈＰＴＨフラグメント−（１ −３７）と、その天然および薬学的に同等な誘導体、特に、アミド化、アセチル化、ホスホリル化およびグリコジル化されたｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）誘導体に関する。

アミノ酸丘７す：　Ｓｅｒ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ −Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ −５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−＾ｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａｓｐ　−Ｖａ　ｌ　−Ｈ１ｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ　Ｉ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕさらに、本発明は、原核もしくは真核生物の発現により調製し、クロマトグラフィーによフて精製することを特徴とするト記ｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）またはその誘導体の製造法に関する。またさらに、本発明は、ヒトの血液からクロマトグラフィーを用いた公知の方法によって、上記フラグメントを単離するｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）または、その誘導体の製造法に関する。

また１本発明は、保護された上記のＩＥＪｌＪを含むアミノ酸群から、従来の方法によってｈＰＴＨフラグメントを固相もしくは液相で形成し、保護基をはずし、クロマトグラフィーを用いた、確立された精製法でＮ製する上記ｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）またはその誘導体の製造法にも関する。

警〈へきことには、完全な生物活性を有する最小のｈＰＴＨフラグメントはｈＰＴＨ−（１−３７）であり、こわはｈＰＴＨ−（１−８４）が人体中て開裂して最初に形成されることが、本発明によって明らかになった（実施例１参照）。

さらにまた驚くべきことには、ｈＰＴＨ−（１−３７）の空間的な構造は、従来知られているフラグメントの構造と明らかに譬なっており（実施例５参照）、構造と効果および抗体の性質との間に特定の関連があることか分った。

ｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）は、化学的に合成（実施例２参照）し、医薬品として製剤した。また、従来のベクターを用いた遺伝子工学的な方法によっても製造した。すなわち、ｈＰＴＨ−（１−３７）ペプチドを、　（１）原核生物および（２）真核生物を用いて、遺伝子工学的な経路を経て製造した。原核生物を用いる場合、大腸菌を利用することか好ましい。この目的のために利用でさるものとしては、分泌発現用の発現ベクター（例えば、ｐＳＰ６、ｐＲｉｔ誘導体、ファーマシア社製）、直接細ｌｆｔ発現用ヘクター（例えば、ｐＫに誘導体、ファーマシア社製）、あるいは融合タンパク質としての発現用ベクター（例えば、２ＭＣ１８７１、ファーマシア社製）などを挙げることかできる（マーストンらの文献を一参照［Ｍａｒｓｊｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２４０．　ｌ−１２，＋９８６］　）　。真核生物を用いる場合、種々の有機体やベクターを利用することができる。例えば、昆虫細Ｑ　（Ｓ＋ｍｅｒｓ　ａｎｄ　５ｗ１ｔｈ、　Ｔｅｘ、Ａｇｒｉ、Ｅｘｐ−５ｔ、ｎ、（ｂｕｌ１３１５５５．１９８７）、酵母（）ｌｉ狽■ ｅａａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔ、ｕｒｅ　２９：１．７１７−７２２．１９８１）、糸状菌％　（Ｙｅｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ窒盾メB Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８１．１４７０−１４７４．１９８４）および哺乳類の細Ｑ　（Ｚｅｔｔｌｆｆｉｅｉｓｓｌｐｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”４．７２０−７２５．１９８７）などである。これらのなかで、昆虫細胞が好ましい。得られたペプチドはクロマトグラフィー、好ましくは、実施例１に示したクロマトクラフィーによって精製する。

本発明の医薬品は、ｈＰＴＨ−（１−３７）もしくは、こわと生理学的に同等なｈＰＴＨ−（１−３７）の塩を含存する。ｈＰＴＨ−（１−３７）を含有する医薬品の形態および組成は、投与の方法に依っている。ヒトｈＰＴＨ−（１−３７）の投与は、非経口的に、あるいは鼻からや口から、または、吸入によって行なってもよい。好ましくは、使用直前に溶液もしくは凍結乾燥されたｈＰＴＨ−（１−３７）から注射液を調製する。さらに、この医薬品には、調剤のため、もしくは、溶解性、安定性または消毒のため、あるいは体内への吸収効率を高めるためなどに必要な補助成分が含まれていてもよい。毎日の投与量は症状に依っている。骨粗欠錠の治療では、毎日の投与量は、静脈／筋肉注射の場合で１日当り１００から１２００１Ｊ１位（ｍｇ）であり、皮下注射の場合で１日当り３００か６２４００単位（ｍｇ）が好ましい。生物活性の決定は、国際基準試薬と私たちの実験室でヒトｈＰＴＨフラグメントのために調製した基準試薬とを用いて、ｈｐＴＨフラグメントに共通なバイオ・アッセイの測定を基礎にして行なった。

本発明のｈＰＴＨフラグメンｌ−−（１−３７）は、上皮小体機能不全症および骨Ｍ症の長期にわたる治療に、特に適している。なぜならば、このｈＰＴＨフラグメント−（１−３７）は優れた生物活性を示す一方で、たとえ長期間使用しても、いかなる免疫反応も引き起こさないからである。

また、本発明の医薬品は、本態性緊張先進症に対して長期間もしくは一性涯用いる血圧安定剤として優わたものである。

さらに、本発明の医薬品は、腎臓病および肺疾患の集中治療用の試薬として応用できる（実施例６参照）。

またさらに本発明の医薬品は、男性のインポテンツの治療薬としても利用できる（実施例６参照）。

以下に、実施例および実施例で参照する図を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。

第１図：セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５−分子量によって粗分離するとともに、粗製ペプチド抽出物の脱塩を行なう、アルギン酸溶出液の調製用大規模クロマトグラフィー。ＲＩＡ　（放射能免疫分析）によって、斜線部分からｈ　ＰＴＨフラグメントが検出される。

カラム゛　ファーマンア（Ｐｈａｎｍａｃｉａ）　Ｋ　１００　／　１００　：ＩＤ　１０ｃｍｘｌＯｃｍ材質：　セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５　媒体溶離ｆｉ：　ＩＭ　酢酸展開速度：５ｍｌ／分力吸収：　２８０ｎｍ第２図：第１図のペプチド物質を、さらに分離するための調製用ＨＰＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィー。各々１６ｍ１ずつ採取されたＮ０１２−５のフラクションは、それぞれ６４０ｐｍｏ１以上のｈＰＴＨフラグメント−（４４−６８）−１Ｒ物質を含有している（斜線部）。

カラム：　ＨＰＬＣＩＩ製カラム　２ｃｍＸ１０ｃｍ材質”　パーコシル・ベブケート（Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｅｐｋａｔ）溶離ｆｉ：　Ａ：５ｍＭ　に２　ＨＰ　０４　ｐ　Ｈ３、０Ｂ：ＩＭ　ＨＣｌ中でＡと同様展開速度：８ｍｌ／分塊成：　２８０ｎｍ溶離傾斜：０−６０％Ｂ１６０分間第３図、第２図のフラクションＮｏ、２−５を、さらに分離するための半調製用ＲＰクロマトグラフィー。フラクションＮｏ、１７および２ｏには、３ｍｌ中に、ｈＰＴＨフラグメント−（４４−６８）が１８０ｐｍｏ１以上存在していることがＲ４Ａによって検出できる７カラム：　ＨＰＣ鋼製カラム　１ｃｍｘｌＯｃｍ材質：　オーベケン（Ｏｒｐｅｇｅｎ）　ＲＰ　ＨＤ−ゲル７／３００溶離液：　Ａ：０．ＯＩＭ　ＨＣＩＢ：８０％アセトニトリル中でＡと同様展開速度：３ｍｌ／分光吸収：　２８０ｎｍ溶離傾斜：　０−６０％Ｂ、６０分間温度：　４５℃ 第４図：第３図のフラクションＮｏ、２０を、さらに分離するための半調製用陽イオン交換クロマトグラフィー。フラクションＮｏ、３２および３３には、１０ｍ１中に、ｈＰＴＨフラグメント−（４４−６８）か、それぞれ７５０ｐｍ。

ｌおよび６００ρｍｏｌ存在していることかＲＩＡによって検出できる。

カラム：　ＨＰＬＣ湛製カラム　１ｃｍＸ５ｃｍ材質：　パーコシル・ベブケート（Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｅｐｋａｔ）溶離ｆｉ：　Ａ：５ｍＭ　Ｋ２　ＨＰＯ４ｐＨ３，０Ｂ：ＩＭ　ＮａＣ１中でＡと同様展開速度：３ｍｌ／分光吸収：　２３０ｎｍ溶離傾斜：　０−ＳＯ％Ｂ、５０分間第５図：中間段階１：第４図のフラクションＮｏ、３２および３３の分析用ＲＰクロマトグラフィー。２種類の形態のｈＰＴＨフラクメントー（４４−６８）− ＩＲが検出された。すなわち、フラクションＮｏ、３には、３ｍｌ中に１５０ｐｍｏ１以上、フラウンＥＩ：／Ｎｏ、１５および１６には、３ｍｌ中に、各々３゜Ｏρｍｏ１以上存在し・ている。

カラム：　ＨＰＣ鋼製カラム　１ｃｍｘｌＯｃｍ材買：　オーベゲン（Ｏｒｐｅｇｅｎ）　ＲＰ　ＨＤ−ゲル７／３００溶離液：Ａ：０．１％　ＴＦＡＢ：８０％アセトニトリル中でＡと同様展開速度：３ｍｌ／分光吸収：　２８０ｎｍ溶離傾斜：０−４０％Ｂ、６０分間温度：　４５℃ 第６図：中間段階２：第５図のフラクションＮｏ、１５および１６の分析用陽イオン交換クロマトクラフィー。２ｍｌのフラクションＮｏ、９にｈＰＴＨフラグメント−（４４−６８）−ＩＲ物質が、特に、濃縮されていた（２００ｐｍ。

１以上）。

カラム：　ＨＰＬＣ鋼製カラム　０．５ｃｍｘ５ｃｍ材質：　パーコシル・ベブケート（Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｅｐｋａｔ）溶離液：　Ａ：５ｍＭ　にｚ　ＨＰＯ４ｐＨ３，０Ｂ：ＩＭ　ＮａＣ１中でＡと同様展開速度：０．７ｍｌ／分光吸収：　２３０ｎｍ溶離傾斜：　０−ＳＯ％Ｂ、５０分間第７図、第６図のフラクション８および９の疎水性クロマトグラフィー、０゜８７ｍ１のフラクションＮｏ、５−１０の各々には、１７０ｐｍｏ１以上のｈｐＴＨフラグメント−（４４−６８）−ＩＲ物賃が含まれていた。

カラム：　ＨＰＬＣ鋼製カラム　０．５ｃｍｘ５ｃｍ材質：　パーコシル・プロ（Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｒｏｌ　ＨＩ　Ｃ溶離液：　Ａ：１００ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４ｐＨ６，５Ｂ：３Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ，中でＡと同様展開速度：０．７ｍｌ／分光吸収・　２３０ｎｍ溶離傾斜：１００−０％Ｂ、４５分間第８図：第７図のフラクションＮＯ３５から１０の分析用ＲＰクロマトグラフィー。ｈＰＴＨフラグメント−（４４−６８）−ＩＲのピークか観測された。

カラムニ　ＨＰＬＣＭカラム　０．５ｃｍＸ５ｃｍ材質：　オーベケン（Ｏｒｐｅｇｅｎ）ＲＰ　ＨＤ−ケル７／３００溶離液　Ａ：０．１％　ＴＦＡＢ：８０％アセトニトリル中でＡと同様展開速度：０．７ｍｌ／分光吸収：　２３０ｎｍ溶離傾斜：０−４０％Ｂ、６０分間温度＝　４５℃ 第９図：ｈＰＴＨフラグメントの最終特製に用いた分析用ＲＰクロマトグラフィー。第８図のフラクション２５を再度クロマトグラフにかけて、ピーク位置に極めて純粋なｈＰＴＨフラグメントを集めた。配列を澗へたところ、これがｈｐＴＨ−（３８−８４）であることが分った６カラム：　ＨＰＬＣ１ｌｌ製カラム　０．５ｃｍｘ５ｃｍ材質・　オーベケン（Ｏｒｐｅｇｅｎ）ＲＰ　ＨＤ−ケル７／３００溶離液・　Ａ：０．１％　ＴＦＡＢ：８０％アセトニトリル中でＡと同様展開速度：０．７ｍｌ／分Ｍ収：　２３０ｎｍ溶離傾斜：　０−４０％Ｂ、６０分間温度・　４５℃ 第１０図：Ｎ末端ｈＰＴＨフラグメントを合成するための反転相ＨＰＬＣクロマトクラフィー。すなわち、ｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１−３４）、ｈＰＴＨ−（１−３７）、ｈＰＴＨ−（１−３８）を合成した。もしこゎらのフラグメントが、ｆｆｉ液によって人体内を循環している天然のＮ末端ｈＰＴＨフラグメントの参照として用いられるならば、ｈＰＴＨ−（１−３７）がヒトの血液中にある正確な分子形態であることを示すことができる。

カラム：　パーコシル・プロ（Ｐａｒｃｎｓｉ　ｌ　Ｐｒｏ）　３００−７Ｃ４、１２５ｘ４ｍｍ温度：　５５℃ 溶離液：Ａ：０．１％　トリフロロ酢酸Ｂ：８０％アセトニトリル中＋Ａと同様溶離傾斜：最初＝　２５％　Ｂ５５分＝　５０％　Ｂ６０分＝１００％　Ｂ光吸収：　２３０ｎｍ展開速度：０．７ｍｌ／分第１１図：ｈＰＴＨフラグメントによる刺激を受けてからの、ＰＣ−１２細胞内のｃＡＭＰ濃度の時間変化である。１．５Ｘ１０５の細胞を、１０〜４ＭのＩＢＭＸ（７）存在下でＩＯ−７Ｍ（７）ｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１ −３７）あるいはｈＰＴＨ−（１−３８）とともに、０．２．５．１０および２０分間培養した。上１咬のために、Ｔ　ＢＭＸだけで２０分間培養した細胞も測定した。値は、３回の実験の平均値上標準偏差である。

第１２図：ｈＰＴＨフラグメントによる刺激を受けてから５分後の、ＰＣ−１２細胞内のｃＡＭＰ濃度と、ｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１−３７）およびｈＰＴＨ−（１−３８）［どの関係を示した。２．２Ｘ１０５の細胞を、１０−’Ｍｆ７）ＩＢＭＸの存在下で、ｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１ −３７）およびｈＰＴＨ−（１−３８）の、それぞれＩＱ−１１（二つ実験した）Ｍ、１０−”Ｍ、１０−’Ｍ、１０−８Ｍおよび１０−’Ｍ浴溶液ともに５分間培養し、細胞内のｃＡＭＰ濃度を叡する実験を３回行なった。ＰＴＨを含まない１８ＭＸ参照試料の値は、１８，０．２６．１．２０．９であった。示した数値は、平均値上標準偏差である。

第１３図：ｈＰＴＨフラグメントｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１−３７）およびｈＰＴＨ−（１−３８）の紫外光円二色性スペクトルである、他のｈＰＴＨフラグメントに比へると、ｈＰＴＨ−（１−３７）は、目立った特徴を有している。

第１４図：化学的に合成したｈＰＴＨ−（１−３７）の第１段階の精礼ここでは、粗製物に対して陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた。参照試料によると、担持時間２９分の高いピークは、合成したｈＰＴＨ−（１−３７３である（矢印の位置）。

カラム：　バーコシル・プロ（Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｒｏ）　３００−７１２５Ｘ４ｍｍ温度：　２５℃ 溶離液：　Ａ：　５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ０４Ｂ　：　５　ｍＭ　Ｎ　ａ２　ＨＰ　０４、ＩＭ　ＮａＣ１゜ｐＨ＝３．０溶離傾斜：最初：　５％　Ｂ５７分＝１００％　Ｂ光吸収：　２３０％ｍ展開速度：　ｆｍｌ／分第１５図二合成のときに準したスケールでの、また精製していない第１４図の物質の反転相ＨＰＬＣクロマトグラフィー。溶出液の２２５分のピークは、ｈＰＴＨ−（１−３７）参照試料のものと一致した。

カラム・　パーコシル・プロ（Ｐａｒｃｏｓｉ　ｌ　Ｐｒｏ）　ＲＰ　３００− ７Ｃ４、１０１００ｘ２０温度＝　２５℃ 光吸収：　２３０％ｍ溶離’ｆｉ＋Ａ：０．１％　トリフロロ酢酸８．８０％アセトニトリル中＋Ａと同様溶離傾斜：０−１００％　Ｂ、６０分間展展開度ニアｍｌ／分第１６図°第１５図の物質の最終精製に用いる反転相ＨＰＬＣクロマトグラフィー。ピークは、ｈＰＴＨ−（１−３７）参照試料のものと一致した。

カラム：　パーコシル・プロ（Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｒｏ）　ＲＰ３００−１８Ｃ４、１２５％４ｍｍ温度：　２５℃ 光吸収＋　２３０％ｍ溶離液：Ａ：０．１％　トリフロロ酢酸Ｂ　８０％アセトニトリル中＋Ａと同様溶離傾斜：０−１００％　Ｂ、６０分間展展開度：０．７ｍｌ、／分第１７図：第１６図で得られた合成ｈＰＴＨ−（１−３７）の質量スペクトル。

分子量４３９８．１のところのピークは、計算によってめた分子−１１４４０１，０と、０．１％の誤差の範囲内で一致している。側鎖の配列は観測されていない。分子Ｊ］２２０Ｌ５のピークも、二重イオン化されたものに誤差のｉ内で一致している。この質量の測定は、相補配列によって確認した。

実施例１体内を循環している生物活性ＰＴＨフラクメントの６汐りの間接的決定用いた出発物質は、腎臓機能不全症の患者から採取した大量の血液口液で、約２００００ダルトンまての分子サイズの、すへての血漿構成成分を含有している。

■、粗製ペプチド物質の回収１Ｍ口液は、排除サイズ２００００ダルトンのトリアセテート・フィルターを用いたサートリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ１社製血’ａｏＡ装置（ＳＭ　４００４２型、サートリウス社、ゲッチンゲン、ドイツ［Ｔｙｐｅ　ＳＭ　４００４２．５ａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、　Ｇｅｒｍａｎｙ］　）によって回収した。０液は、長期間にわたる口過によって安定な（を謝を維持している腎臓機能不全症の患者から採取した。１０００リツトルの面液口液を採取して、すぐに、フロー加熱、酸性化および阻害酵素の添加を行ない、タンパク分解か起こらないようにした。その後、ホースマン（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ）がＤＥ３６３３７９７Ａ１で開示している方法によって、粗製ペプチド−フラクション（約１００ｇ＞をアルギン酸で抽出し、単離した。

■パラトルモン（ＰＴＨ）の中間領域およびＣ末端で特異的な放射能免疫分析に対して免疫反応性を示すフラクション（コード５１．５）の単離１、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５による粗製ペプチド物質の脱塩アルギン酸抽出によって得られた粗製ペプチド・フラクションを、セファデックスＧ２５（ファーマシア社製、ウプサラ、スエーデン［Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｌｌｐｐｓａｌａ。

５ｗｅｄｅｎ］　）を充填したカラムにかけて、１Ｍ酢酸を展開液にして８℃でゲル・クロマトグラフィーによる分層を行なった（第１図）。ブール■からＩＶの免疫反応性を、中間筆域で特異的なヒトＰＴＨ（ｈＰＴＨ−（４４−６８）− ＲＩＡ、イムノンディアグノスティク社製、ダルムシュタット、ドイツ［Ｉｎｗ＋＋ｕｎｄｉ■ｎｏｓｔｉｋ。

Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｇｅｎａａｎｙｌ　）を用いた放射能免疫分析によフて測定した。前記製造者のデータによりば、検出限界は、使用した基準（ｈＰＴＨ −（４４−６８））の６ｆｍｏｌ／試験（１試験当り６フエムト・モル）である。イントラ・アッセイおよびインター・アッセイの変動係数は、それぞわ１０か６１３％および１２から２１％である。ペプチドｈＰＴＨ−（５３−８４）およびｈＰＴＨ−（１−８４）がｈＰＴＨ−（４４−６８）−ＲＩＡと１００％交叉反応するのに対して、合成ｈＰＴＨペプチドｈＰＴＨ−（１−３４）、ｈＰＴＨ −（２８−４８）およびｈＰＴＨ−（６４−８４）は、いかなる交叉、反応も起こさない。

他のフラクションか免疫反応性を全く示さなかったのに対して、ブール■では、完全な免疫反応性がｈＰＴＨ−（４４−６８）−ＲＩＡて測定された。

また、ブールＩでは、極めて高いＣ末端免疫反応性がｈＰＴＨ−（５３−８４） −ＲＩＡ　（イムノンディアグノスティク社製、ダルムシュタット、ドイツ［Ｉｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔ、ｉｋ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｇｅｎａａｎｙｌ　）で測定された。製造者のデータによれば、ｈＰＴＨ−（５３−８４）−ＲＩＡによる検出限界は、使用した基準（ｈｐＴＨ−（５３−８４））の４ｆｍｏｌ／試験である。イントラ・アッセイおよびインター・アッセイの変動係数は、それぞれ８．３から９．８％および１１から１４％である。ペプチドｈＰＴＨ−（６４−８４）およびｈＰＴＨ−（１−８４）かｈＰＴＨ−（５３−８４）−ＲＩＡと１００％交叉反応するのに対して、合成ｈＰＴＨペプチドｈＰＴＨ−（１−３４）、ｈＰＴＨ−（２８−４８）’およびｈＰＴＨ−（４４−６８）は、いかなる交叉反応も起こさない。

ここでは、２種類のＰＴＨ−ＲＩＡによる測定を行なったために、高濃度のＣ末端ＰＴＨフラグメントが生じたので、ブール■（斜線部）をさらに精製した。

２、ブール■の謂製用陽イオン交換クロマトグラフィー陽イオン交換カラム・クロマトグラフを用いて、室温で、さらに分離・調製を行なった（第２図）。１２本のクロマトグラフを用いて、鑑＋約６ｇのブール■成分を分離し、ｈＰＴＨ− （４４−６８）−ＲＩＡによって免疫反応性を測定した（第２図）。表には示されていないフラクションＮｏ、２−５（斜線部）は、ｈＰＴＨ−（４４−６８） −ＲＩＡで、極めて高い免疫反応性を示した。これらのフラクションを一緒に集めてブールにして、ざらに分離を続けた。なお、これらのワラクシ３ンは、ｈＰＴＨ−（５３−８４）−ＲＩＡでも、極めて高い免疫反応性を示した。

３．調製用陽イオン交換クロマトクラフィーによって得られた免疫反応性プールの半調装用反転相クロマトグラフィー（第２工程）得られた免疫反応性プール（約２００ｇ）を、半翼製用反転相（ＲＰ）クロマトグラフを用いて、４５℃で、ざらにｌｉＩ製した（第３図）。ｈＰＴＨ−（５３−８４）−ＲＩＡで免疫反応性を示すピーク（第３図）と、ｈＰＴＨ−（４４−６８）−ＲＩＡで免疫反応性を示すピーク（第３図）とが、互いに充分には分離しないで表われた。

ＲＩＡに対して極めて高い反応性を示す、後ろのプールについての操作を以下により詳しく記載する（第４図から第６図）。この第４工程から第６王程までを行なって得られたフラクションＮｏ、５１．５のｅｌを分析した。

なお、ここて特に言及しなかったフラクションからは、いかなる免疫反応性も測定されなかった。

４゜ａ）半調製用ＲＰクロマトグラフィーによって得られた免疫反応性プールの半調製用陽イオン交換クロマトグラフィー（箪３工程）上記のＲＰクロマトグラフィーによって得られた免疫反応性プールを、半調製用陽イオン交換カラム・クロマトグラフィーを用いて、室温で、さらに精製したく第４図）。フラクションＮｏ、３２−３３は、中間領域およびＣ末端ＰＴＨ（図示せず）に免疫反応性を示した。、これらのフラクションを棗めてプールにして（斜線部）、さらに操作を進めた。なお、ここで特に言及しなかったフラクションからは、いかなる免疫反応性も測定されな力じた。

ｂ）４ａ）で得られた免疫反応性プールの分析用ＲＰクロマトグラフィー上記の半諸用陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られた免疫反応性プールを、分析用ＲＰクロマトグラフィーを用いて、４５℃で、さらに精製した（第５図）。極めて高い免疫反応性を示す免疫反応性プール（斜線部）を、さらに精製した。なお、ここで特に言及しなかったフラクションからは、いかなる免疫反応性も測定されなかった。

ｃ）４ｂ）で得られた免疫反２性ブールの分析用陽イオ〉交換クロマトクラフィー −Ｆ記で得られた免疫反応性プールを、分析用陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、室温で、ざらに精製した（第６図）。第６図に示したように、ｈＰＴＨ−（４４−６８）−ＲＩＡで免疫反応性か観測された（斜線部）。ｈＰＴＨ− （５３−８４）−ＲＩＡでの測定結果も同様に示した。ここで特に言及しなかったフラクションからは、いかなる免疫反応性も測定されなかフた。また、極めて高い免疫反応性を示したフラクションを棗めてプールにしく斜線部）、さらに操作を進めた。

５．４ｃ）で得られた免疫反応性プールの疎水性クロマトグラフィー４ｃ）で得られた免疫反応性プールを、疎水性クロマトグラフィーを用いて、室温で、さらに精製しく第７図）、ｈＰＴＨ−（４４−６８）−ＲＩＡで免疫反応性を測定したく第７図）。ここで特に言及しなかったフラクションからは、いかなる免疫反応性も測定されなかった。また、極めて高い免疫反応性を示したフラクションを集めてプールにしく斜線部）、＃Ｌ後の精製を行なフた。

６゜ａ）第−分析用ＲＰクロマトグラフィー５）で得られた免疫反応性プールを、ＲＰカラム・クロマトグラフィーを用いて、２５℃で分離し、ｈＰＴＨ−（４４− ６８）−ＲＩＡで免疫反応性を測定した（第８図）。斜線部７ラクシヨンについては、再度、クロマトグラフィーで分離した。

ｂ）第二分析用ＲＰクロマトグラフィー６ａ）で得られた免疫反応性プールを、再びＲＰカラム・クロマトグラフに通した（第９図）。温度を４５℃にした以外は、６ａ）と同様にして行なった。高いピーク部分をコートＮｏ、５１．５とし、紛すを調へた。

Ｉ比バラトルモン（ＰＴＨ）の中間領域およびＣ末端で特異的な放射能免疫分析に対して免疫反応性を示す第二フラクション（コード５４．５）の単離フラクション５１．５の単離を行なう過程で、半調製用ＲＰクロマトグラフィーによって、二つの免疫反応性を示すプールか得られた（’＄３工程）。この第３工程のプールの面の方を、ＩＩの４から６で述へた？麦ろのプールの場合と同様にして精製した。４ｂ）ては、再び、免疫反応性を示すピークが二つ現ゎゎた。この場合、前のピークか支配的であったので、こわをさらに精製した。４ｃ）から６０）を行なったのち、得られたフラクションをコードＮｏ、５４．５として、配列を調へた。

ＩＶ　血液口液より単離し、パラトルモン（ＰＴＨ）の中間領域およびＣ末端で特異的な放射能免疫分析に対して免疫反応性を示すＰＴＨペプチドの配列血液より採取し、上記Ｈおよび［１によって得られたフラクション５１．５と５４．５のアミノｌ！ｉ［ｌを、気相アミノ酸丘ζ」分析装置４７０Ａ型（アプライド・バイオシステム社製［Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｌ）によって決定した。Ｒ１！ブロクラムＰＴＨＲＵＮを用いてエドマン分解（Ｅｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｇｇ、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ　８０−９１．１９６７）を行なった。遊離したアミノ酸の分析は、標準プロトコールＡＢＩを使用したＡＢＩ　１２０Ａクロマトグラフを用いて、オンラインで行なった。

この結果、フラクション５１．５の３９のアミノ酸配列を決定することかできた。また、条件によっては、さらに５つのアミノ酸配列を決定できた。決定された配列は、ヒトＰＴＨの（３８−７６）部分に対応している（Ｋｅｕｔ５ａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｒｉｏｃｈｅｍ、　１７．５７２３−５７２９．１９７８）。

フラクション５４．５では、１６のアミノｌ！！ｉ＃ｌＩを決定することかできた。この酊すは、ヒトＰＴＨの（３８−５３）部分に対応している。

すなわち、二つのフラクションをヒトの血液口液より単離することかでき、その両者ともに、Ｃ末端たけでなく中間領域のＰＴＨ−ＲＩＡでも検出された。このどちらのペプチドもアミノ末端からＧｌｎ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−＾１ａ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｅｔｃ、と始まっている。すなわち、どちらのペプチドもｈＰＴＨ分子の３８番目のアミノ酸から始まっている。一方、得られたペプチドのどちらでも、Ｃ−末端のアミノ酸を明確に決定することはできなかった。フラクション５１．５の場合、配列は、たいたい位置８４まで続いている。もう一方のペプチドは、少量しか得られなかったので、位置１６までしか配列を決定できなかった。このペプチドは、Ｃ末１ＲＩＡで検出できたので、少なくとも３０のアミノ酸配列を有している。また、異なるＮ末端配列から始まっているＣ末端ＰＴＨペプチドを単離することはできなかった。これらの結果から、ｈＰＴＨ−（１− ８４）は３７番目と３８番目のアミノ酸の間で開裂し、生物活性なフラグメントｈＰＴＨ−（１−３７）を形成すると考えられる。

実施例２ヒトーバラトルモン・ペプチドｈＰＴＨ−（１−３７）の合成１、ケイソウ土で補強したｈ■−Ｌｅｕ−樹脂の合成ｆ％、水Ｆｒｒｒ＞ｃ−アミノａ１（５当量）を最小限のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、丸底フラスコ中のヒドロキシメチルフェノキシアセチルノルロイシン樹脂に加えた。さらに、４−ジメチルアミノピリジン（１当Ｎ）も最小限のＤＭＦに溶かして、この丸底フラスコ中に加えた。１堝克過剰の反応液を口過によって除き、樹脂をよく洗浄した。

２、ヒト・パラトルモン・ペプチドｈＰＴ）Ｉ−（１−３７）の合成以下のアミノ酸ｆＱ１を有するペプチドを合成するために、フロー法（Ａｔｈｅｒｔｏｎａｎｄ　５ｈｅｐｐａｒｄ、５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ　１９８X）　を用いた。

アミノ酸配列：　Ｓｅｒ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−ｆｌｅ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ− Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ− ５ｅｒ−Ｍｅｔ−ＧＩｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ− Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ　−Ｈ１ｓ−Ａｓｎ− Ｐｈｅ−Ｖ　ａｌ　−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ上記したペプチド配列を、Ｆｍｏｃ−ペンタフロロフェニル・エステル（ＯＰｆｐ）を用いた自動ペプチド合成装置（ミリガン［Ｍｉ　ｌ　ｌｉｇｅｎｌ　９０５０　）によって合成した。

以下に示した０Ｐｆｐ−アミノ酸（４当量）を用いた。（いずれの場合も、Ｌ− アミノ酸誘導体を用いた。）Ｆａｃｃ−Ａｌａ−ＯＰｆｐ　Ｆｆｆｉｏｃ−＾１ａＦｍｃ−Ａｓｐ　（０８ｕｔ）　−０Ｐｆｐ　Ｆ［）Ｃ−ＡＳｐ（ＯＢｕ’）Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＰｆｐ　Ｆｍｃ−ＭｅｔＦ［）Ｃ−ＧＩＵ　（ＯＢｕｔ）　−０Ｐｆｐ　Ｆｍｏｃ−Ｇｌ　ｕ　（ＯＢｕｔ）Ｆａｔｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−０Ｐｆｐ　Ｆｌ！Ｉｏｃ− Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐ　Ｆｍｏｃ−ＬｅｕＦ＋ｏｏｃ− Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）　−０Ｐｆｐ　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｍｔｒ）Ｆｍｏｃ−Ｔｒｉ−ＯＰｆｐ　Ｆｍｏｃ−ＴｒｉＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−０ＰｆｐＦｍｃ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）Ｆｍｏｃ−１１ｅ−ＯＰｆｐ　Ｆｍｏｃ−１１ｅＦｍｏｃ −Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ　ＦＩＴｈＯｃ−ＰｈｅＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ　Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＦａａｃ−Ａｓｎ−ＯＰｆｐ　Ｆｍｃ−Ａｓｎ　（Ｔｒｔ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＰｆｐ　Ｆ＋ｏｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ、）Ｆｆｆｌｏｃ−Ｖａｌ −ＯＰｆｐ　Ｆｍｏｃ−ＶａｌＦｍｏｃ−５ｅｒ（Ｂｕｔ）　−０Ｄｈｂｔ　Ｆｍｏｃ−５ｅｒ（Ｂｕ’）この合成は、ＴＢＴＰ　［テトラフロロホウ酸ｏ−（ＩＨ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウム］を加え、この添加て生したヒトロキシヘンゾニトリル・エステルによって行なうこともできる。

酢酸−アニソール−エタンジチオール−フェノールの９４：２：２：２（ｖ／ｖ　／　ｖ　／　ｗ　Ｉ混合溶媒によって、担体ｍＪｌからペプチドを溶出させ、エーテルで沈殿させた。ＨＰＬＣによって精製したのち、アミノ酸分析、分析用ＨＰＬＣおよびアミノ酸配列分析によって確認した。

３、ヒトーバラトルモン・ベブチＦｈＰＴＨ−（１−３７）の実用的合成アミノ酸配列：　５ｅｒ−Ｖａ　ｌ　−５ｅｒ−Ｇ　Ｉ　ｕ−１１ｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅ　ｔ−Ｈｉ　５−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　凵|１，ｙｓ −Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−＾ｓｎ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−＾ｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ −Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ −Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−＾１ａ−Ｌｅｕ　（１）を、ミリケン／バイオサーチ［ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ］社製自動合成装置９０５０（９０５０ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）　（プログラム・バージョン１．３）を用いた連続フロー法によって合成した。５体のＦｅｏｃ−アミノ酸ペンタフロロフェニル・エステルを、それぞれ０．８ｍｍｏ１つつ用いた。合成に必要な試薬は、すべてミリケン／バイオサーチ［ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ１社より入手した。この合成に必要な試薬は、すなわち、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ピペリジンの２０％Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液、および１−ヒドロキシベンツトリアゾールである。Ｌ−アミノ酸誘導体は４倍過ＩＩＪに用い、また、末端のアミノ基はＦ３ＤＣで保護した。

アスパラギン酸とグルタミン酸は、Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル・エステルの形で：チロシンとセリンは、ｔｅｒｔ−ブチル・エステルの形で：ヒスチジンとリジンは、Ｎ”−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル化合物の形で；また、アルキニンは、ＮＧ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）誘導体の形で、それぞれ用いた。合成は、ケイソウ土樹脂ＦＩＩＯｃ−Ｌｅｕ− Ｐｅｐｓｙｎ　Ｋ　Ａ　（ミリケン／バイオサーチ［Ｍｉｌｌ　１Ｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ］社製）を出発物質として行なった。この樹脂では、担体とＣ末端のアミノ酸（Ｉｇ当り０．０９１ミリ当量のロイシン、１．ｓｏｇ）とが結合する。Ｆ＋ｕｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨは、［テトラフロロホウ酸ｏ−（ＩＨ −ベンゾトリアゾール−１−イル）　−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウム］　（ＴＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびジイソプロピルエチルアミンの存在化でアシル化した。以下のような操作を繰り返した。すなわち、ピペリデンの２０％ＤＭＦ溶液でＦ［）Ｃを除き（７分間）、ＤＭＦで洗い（１２分間）、アシル化（３０分間；　Ｆ＋ｏｏｃ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐでは４５分間）し、ＤＭＦで洗った（８分間）。合成反応の進行具合は、紫外光によって連続的に監視した。合成は、Ｎ末端のＦ＋ａｏｃ基を除去して完でした。樹脂に結合したペプチドを、それぞれ５０ｒｎｌのインプロパツール、氷酢酸、イソプロパツールとジエチルエーテルで、３回洗浄し、乾燥した。

担体樹脂からの溶出は、トリフロロ酢酸／フェノール／エタンジチオール／チオアニソール１０：０．７５：０．２５：０．５：０．５　（ｖ／ｗ／ｖ／ｖ／ｖ；５ｍ１）混合溶媒で行った。溶液を容器内で濃縮し、ジエチルエーテルを加えて沈殿させた。得られた粗製ペプチドをジエチルエーテルで数回洗い、乾燥させた。以上のようにして、２４０ｍｇのペプチド樹脂から６５ｍｇの粗製ペプチドを得た。

別に合成し、正確なアミノ酸配列を質量スペクトルや配列分析によって明らかにしであるｈＰＴＨ−（１−３７）を用いて、精製を行なった。第１段階として、保護基をはずした粗製ペプチドを陽イオン交換ＨＰＬＣで精製したくバーコシル・ベブケート［Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｅｐｋａｔ］、２ｃｍｘ１０ｃｍ、３３０ λ、７μ、展間速度：９ｍｌ／分、２３０ｎｍ、溶離液：Ａ＝５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４：Ｂ＝５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４＋１Ｍ　ＮａＣ１、溶離傾斜：５％からｉｏｏ％６０分）。２８．１７分のピーク（第１４図）は、基準物質のものと一致した。第２段階の精製として、脱塩のときと同様のＲＰ−）ＩＰＬｃを行なった（バーコシル・プロ　［Ｐａｒｃｏｓｉｌ　Ｐｒｏｌ　、２ｃｍＸ　１０ｃｍ、３００＾、７μ、層邊屯幻斐：　７　ｍ１７分、２３０ｎｍ、溶離液：Ａ＝０．１％トリフロロ酢酸水溶液、Ｂ＝ｌ−リフロロ酢酸の０，１％アセトニトリル／水４：１溶液、溶離傾斜二〇％から１００％Ｂで６０分）。収量は６．６ｍｇ　（１，５ｍｍｏｌ　：　１４％）だフた６３０゜８０分にピークが表われたく第１５図’）−Ｃ１８物質を用いた分析用ＲＰ−ＨＰＬＣでは、鋭い単一のピークが表われた（第１６図）。

合成物が、ｈＰＴＨ−（１−３７）の−次構造を有していることは、質量スペクトル（プラズマ脱着法、バイオ−イオン、アプライド・バイオシステム［Ｂｌｏ −１ｏｎ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ、ｅｍ］　）および気相アミノ酸丘汐１］分析装ｆｉ４７０Ａ型（アプライド・バイオシステム社製［Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍＪ）による相補配列分析で確認した。合成したｈＰＴＨ−（１−３７）の生物活性は、腎臓動脈と肺動脈とでの筋収縮の差を潤定する機能テストで確認した。このテストの結果、合成物は確かに生物活性を有していることが分った。

実施例３体内を循環している生物活性ヒトＰＴＨがｈＰＴＨ−（１−３７）であることの証明実施例１に記載したように、血液０液をクロマトグラフィーによって処理し、実施例２で合成したｈＰＴＨ−（１−３７）を参照物質として利用した（第１０図）。こうして、ｈＰＴＨの放射能免疫分析に対してアミノ領域で特異的な免疫反応性を示す、血液０液から得たフラクションを決定することができた。このフラクションを実施例１と同様にして精製し、ｈＰＴＨ−（１−３７）であることを確認した。パーコシルＲＰカラム・クロマトグラフを用いることで、ｈ　ＰＴＨ−（１−３７）を、他のｈＰＴＨフラグメント（第４０図）、すなわちｈ　ＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１−３４）およびｈＰＴＨ−（１−３８）から明確に分離することかできることで証明できた。

実施例４ｈＰＴＨ−（１−３７）の生物活性を証明するためのフラクション分析ラットに、ヒト・パラトルモンのペプチドｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈ　ＰＴＨ −（１−３７）およびｈＰＴＨ−（１−３８）を投与して、その後のファエオクロモシトマ（ｐｈａｅｏｃｈｒｏＩＩＯｃｙｔｏｍａ）細胞（ＰＣ−１２）内での環状３°、５′　−アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）レベルの変化を斜へた。

予備実験では、ＰＴＨを加えるとラットのファエオクロモシトマ細胞内のｃＡＭＰレヘルは増加した。このことに基づいて、合成したｈＰＴＨ−（１−３７）の活性と他のＮ末端ＰＴＨフラグメント［ｈＰＴＨ−（１−３３）とｈＰＴＨ−（１−３８）］の活性とを、この細胞系で比較した。

実験には、ＰＣ−１２細胞を用いた。細胞は、１０ｍ１のし一グルタミン酸２００Ｍ（ギブコ［Ｇｉｂｃｏ１社製）、１０％のウマ血清、５％ＦＣ３場よび１％のペニシリン／ストレプトマイシンによってＲＰＭＩ培地（ギブコ［Ｇｉｂｃｏ］社製）で培養した。ホスホシエステラーゼ墾害剤として、シグマ［ＳｉｇＩａａ］社製４−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を用いた。培養容器は、ポリーＬ−ロイシンで表面処理をした２４個のへこみ（直径１６ｍｍ）が設けられているものを用いた。表面処理は、殺菌口過したポリーＬ−ロイシン溶液（１００ｍｇ／ｌ）を３７℃で１時間かけて塗布することで行なった。

以下のｈＰＴＨペプチドについて実験をした。

ｈＰＴＨ−（１−３３）（分子量：３９７１．２．ペプチド含量＝７６９％）ｈＰＴＨ−（１−３７）（分子量：４４０１．ｏ；ペプチド含量ニア４．５％）ｈＰＴＨ−（１−３８）（分子量：　４４５８．０　；ペプチド含量：８１．８％）濃い細胞シートを形成した細胞（約４−８日後）を実験に使用した。実験培養は室温で１ｍｌの細胞培地で行なった。実験の直前にＰＴＨペプチドを細胞培地で希釈してから、１．５Ｘ１０５の細胞を、１０−’ＭのＩＢＭＸの存在下で１０−’ＭのｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１−３７）およびｈＰＴＨ− （１−３８）とともに、０．２．５．５．１０および２０分間培養した。１蛋のため、Ｉ　ＢＭＸだけで２０分間培養する実験も行なった。数値は、３回行なった結果から得た平均値±Ｒ準偏差である（ｉｌ１図参照）。

もう一つ別の実験として、２．２ｘｌＯ’のＰＣ−１２細胞を１０−’ＭのＩＢＭｘの存在下で、そｈぞれ、１０−”　（２回行ｒｔッだ）、１Ｑ−１０，１０ −９，１０−８および１０−’ＭのｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１− ３７）およびｈＰＴＨ−（１−３８）とともに５分間培養した試料を、各々３試料づつ調製し、細胞内のｃＡＭＰ濃度を測定した。ＰＴＨを含まないＩ　ＢＭＸだけの参照試料の値は、１８，０．２６．１．２０．９であった。示した数値は、平均値上標準偏差である（第１２図参照）。

ＰＴＨとＩ　ＢＭＸとは、同時に添加した。培地を吸引除去したのち、１ｍｌの９９％エタノールを加えて反応を終らせた。細胞を削り取り、エタノールでプラスチック製チューブ（グライナー［Ｇｒｅ　１ｎｅｒ１社製）に移した。培養容器を６６％エタノールで洗い、上記のチューブ内のエタノール溶液と合わせて、遠心分離した。得られた上澄みを、窒素ガスをパージした状態で、水浴上で蒸発させた（５０℃）、ｃＡＭＰの濃度は、放射能免疫分析キット（ＮＥＮ社製）を用いて測定した。この測定は製造者の指示通りに行なった。測定に使用したｃＡＭＰ標慮物質、ｃＡＭＰ抗血清錯体、ｃＡＭＰ　”Ｉ−トレサー、ｃＡＭＰ担体血清およびｃＡＭＰ沈殿剤の使用量は、製造者が指示した量の５０％であった。

結果から、実験を行なった細朧内渠で、ｈＰＴＨ−（１−３７）の活性は、他の非内因的なＰＴＨペプチドの活性と大きく異なっていることが分った。このことから、上記に示したような、これらのペプチドの構造の違いが、ＰＴＨ受容体− アデニレートシクラーセ系の活性化に影響を及ぼすたけでなく、抗原性にも影響すると考えられる。

実施例５円二色性によるパラトルモン・フラグメントｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ −（１−３７）およびｈＰＴＨ−（１−３８）の二次構造に関する研究ジャスコＤＰ−５００テータ・プロセッサーと組合せたジャスコＪ−５００自記偏光分光計を用いて、円二色性を測定した。二次構造を決定するために、測定は、光路長１ｍｍの厳選された石英製セルを使用して、室温で１９０ｎｍから２４０ｎｍの範囲で行なった。パラトルモンの濃度は、ｈＰＴＨ−（１−３３）は５０μｇ／ｍｌ、ｈＰＴＨ−（１−３７）が５０μｇ／ｍｌ、そしてｈＰＴＨ−（１−３８）も５０μｇ／ｍｌであった。溶媒は、１０ｍＭのトリス）ＩＣ！緩衝液ｐＨ７，５を用いた。（他の泗足条件：悪度２ミリ度／　ｃ　ｍ、時定数２秒、記録計速度４ｎｍ／分、波長記録エクスパンション５ｎｍ／ｃｍ）。第１３図に示した曲線は、ｈＰＴＨ−（１−３３）、ｈＰＴＨ−（１−３７）およびｈ　ＰＴＨ− （１−３８）の各々についての４回の測定結果からベースラインを差し引いて得られた信号の平均である。

二次構造の決定は、リードとキンセルによって述べられている方法（Ｒｅｅｄ　ａｎｄに１ｎｚｅｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３．１３５７−１３６２．１９８４）によって行った。得られたデータからの計算で、ｈＰＴＨ−（１− ３８）の二次構造は、α−ヘリックスの比率が約２７％であることが分った。これに対して、アミノ酸一つ分だけ短いｈ　ＰＴＨ−（１−３７）フラグメントでは、はるかに多く、約４０−４５％であった。また、ｈＰＴＨ−（１−３３）の α−へリックスは、ｈＰＴＨ−（１−３８）と同様に少なかった。

二次構造か大きく異っているのために、ＰＴＨフラグメントｈＰＴＨ−（１−３７）のペプチド−受容体相互作用や免疫エピトープの性質は、他のフラグメントの場合と明らかに違うことが、この研究から分った。

実施例６肺直管と海綿体（男性生殖器）の無線条筋に対するｈＰＴＨ−（１−３７）の生物活性に関する研究肺血管と海綿体の無線条筋をヒトとウサギから外科的に採取し、筋力の向上を測定するために、適当な器官浴システムに固定した、これらの筋肉に、種々の収縮活性物質を作用させて予め収縮させておき、その後、１０− ９モルのｈＰＴＨ−（１−３７）を作用させると、ヒトの器官の他の平滑筋に比へて顕著な弛緩か起こった。このことは、ｈＰＴＨ−（１−３７）は、肺血管を弛緩させたり、雄性器官のｌｌ＊循埋を活性化させるのに、特に適したペプチドであることを示している。

Ｆｉｇｕｒｅ　１Ｆｉｇｕｒｅ　２Ｆｉｇｕｒｅ　３Ｆｉｇｕｒｅ　４Ｆｉｇｕｒｅ　５Ｆｉｇｕｒｅ　６ム關 ↑ＯＤ２３０ｎｍ　ｌ　ｌ　、、−，１りＦｉｇｕｒｅ　７フラクションＦｉｇｕｒｅ　９フラクションＦｉｇｕｒｅ　１０分Ｆｉｇｕｒｅ　１１時間（分）Ｆｉｇｕｒｅ　１２濃度　（−１ｏｇＭ）Ｆｉｇｕｒｅ　１３波長（ｎｍ）Ｆｉｇｕｒｅ　１４分Ｆｉｇｕｒｅ　１５分Ｆｉｇｕｒｅ　１６分Ｆｉ路「ｃ１７Ｍ／Ｚ補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成４年　４月２７日

Claims

【特許請求の範囲】１。下記のアミノ酸配列を有するｈＰＴＨフラグメントー（１−３７）、および、その天然および薬学的に同等な誘導体、特に、アミド化、アセチル化、ホスホリル化およびグリコシル化されたｈＰＴＨフラグメントー（１−３７）誘導体。アミノ酸配列：【配列があります】２。請求項１のｈＰＴＨフラグメントー（１−３７）、または、その誘導体の製造法であって、前記フラグメントを原核もしくは真核生物の発現により調製し、クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする製造法。３。請求項１のｈＰＴＨフラグメントー（１−３７）、または、その誘導体の製造法であって、前記フラグメントをヒトの血液から、従来のクロマトグラフィーを用いた公知の方法によって単離することを特徴とする製造法。４。請求項１のｈＰＴＨフラグメントー（１−３７）、または、その誘導体の製造法であって、ｈＰＴＨフラグメントー（１−３７）を、特定の配列を含む保護されたアミノ酸群から従来の方法によって固相もしくは液相で形成し、保護基をはずし、その後、クロマトグラフィーを用いた、確立された精製法で精製することを特徴とする製造法。５。請求項１の、もしくは請求項２から４のいずれかによって製造された、人体内を循環している副甲状腺ホルモン、すなわち、ｈＰＴＨフラグメントー（１− ３７）を、活性成分として他の補助的な成分や添加物とともに含んでいることを特徴とする医薬品。６。請求項５の医薬品を、副甲状腺の病気、特に、その機能不全（副甲状腺機能不全症）の治療に用いることを特徴とする使用。７。請求項５の医薬品を、骨が変性する病気、特に、骨粗鬆症の治療に用いることを特徴とする使用。８。請求項５の医薬品を、回復期の骨折治療に用いることを特徴とする使用。９。請求項５の医薬品を、血圧の上昇を伴なう心臓血管の病気、特に、本態性緊張亢進症の治療に用いることを特徴とする使用。１０。請求項５の医薬品を、肺循環系の血圧の上昇を伴なう肺の病気、特に、原発性肺緊張亢進症の治療に用いることを特徴とする使用。１１。請求項５の医薬品を、電解質の排出不調を伴なう腎臓の病気、特に、リン酸塩とカルシウムの排出不調を伴なう重症の腎不全の治療に用いることを特徴とする使用。１２。請求項５の医薬品を、請求項６から１１に記載した病気の治療に用いる使用であって、この医薬品を適当な形態にして、これらの病気の集中治療に用いることを特徴とする使用。１３。請求項５の医薬品を、男性インポテンツの治療に用いる使用であって、製薬的に適当な薬剤、とくに注射液の形態にして、単独もしくはカルジオジラチン／ウロジラチンおよび／またはカルシトニン／遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）など他のペプチドと組合せて、受精治療やインポテンツの治療のために、１回当り１から１０μｇのｈＰＴＨ−（１−３７）を、好ましくは男性器官に投与することを特徴とする使用。１４。請求項５の医薬品を、病気、とくに請求項６から１３のいずれかの病気の診断に用いる使用であって、合成ペプチドに対する特定の抗体を形成し、血液中のｈＰＴＨ−（１−３７）の濃度を免疫分析によって測定することを特徴とする使用。１５。請求項５の医薬品を、種々の薬剤の形態、とくにマンニトールを用いた凍結乾燥剤にし、消毒したガラス容器中で生理的食塩水および／または注射液に溶解して、１回の治療当り３００μｇから３０ｍ８のｈＰＴＨ−（１−３７）が投与されるような、反復的な注射および／または恒久的注入に用いることを特徴とする使用。