JP2016538261A - ダルベポエチンアルファの精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ダルベポエチンアルファを含むベクターで形質転換されたCHO細胞からダルベポエチンアルファを発現させて得た培養液約1Lを10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)により限外濾過システム(分子量カットオフ10,000)を用いてダイアフィルトレーション(diafiltration)した。これを陰イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーを用いて、2つのカラムに順次的にローディングした。
約20mlのQセファローズFF(GE Healthcare社)樹脂をXK−26カラム(GE Healthcare社)に充填し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を十分に流してカラムを平衡化した。
前記実施例2におけるアルギニンを用いる洗浄方法は、シアル酸含量が高いダルベポエチンアルファを精製する上で重要な要素となることが下記実施例により確認された。
約1.7LのセファクリルS−100〜200(GE Healthcare社)樹脂をXK−50/90カラム(GE Healthcare社)に充填し、140mM NaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.2)を十分に流してカラムを平衡化した。
Claims (18)
- (a)様々なシアル酸含量を有するダルベポエチンアルファを含む混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させるステップと、
(b)アルギニン(Arginine)を含む洗浄緩衝液で前記クロマトグラフィーカラムを洗浄するステップと、
(c)前記クロマトグラフィーカラムとの結合が維持されたダルベポエチンアルファをカラムから溶出するステップを含む、ダルベポエチンアルファの精製方法。 - 前記(c)ステップで溶出されたダルベポエチンアルファは、等電点がpH2.0以上4.0以下である、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記アルギニンを含む洗浄緩衝液は、pH3.0以上5.0以下である、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記アルギニンを含む洗浄緩衝液は、アルギニンを含み、NaCl及びウレア(Urea)からなる群から選択されるいずれか1つ以上をさらに含む、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記洗浄緩衝液は、5mM以上90mM以下のNaClを含む、請求項4に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記洗浄緩衝液は、3M以上8M以下のウレアを含む、請求項4に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記(b)ステップは、目的とする等電点を有するアイソフォーム(isoform)であるダルベポエチンアルファを得るために、目的とする等電点より高い等電点を有するダルベポエチンアイソフォームを洗浄することを特徴とする、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記(b)ステップの前又は後に、アルギニンを含む又は含まない洗浄緩衝液で洗浄するステップをさらに含む、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記(b)ステップの前に、pH6以上pH8以下の洗浄緩衝液で前記カラムを1次洗浄するステップをさらに含み、
前記(b)ステップは、pH3以上pH5以下のアルギニンを含む洗浄緩衝液でカラムを2次洗浄するステップである、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。 - 前記1次洗浄するステップの洗浄緩衝液はリン酸ナトリウム溶液であり、
前記2次洗浄するステップの洗浄緩衝液はグリシン−HCl溶液である、請求項9に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。 - 前記生物学的流液は、酵母、植物細胞又は動物細胞の培養液である、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを構成する樹脂の官能基が、Q(Quaternary amine)、DEAE(DiEthylAminoEthyl)及びQAE(Quaternary Amino Ethyl)からなる群から選択されるいずれかである、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- (d)前記(c)ステップで得られた陰イオン交換クロマトグラフィー溶出液をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて分画するステップをさらに含む、請求項1に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- (a)ダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、
(b)ステップ(a)で生成された溶出液を吸着クロマトグラフィーにかけてダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップと、
(c)ステップ(b)で生成された溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングしてダルベポエチンアルファをカラムに結合させるステップと、
(d)アルギニンを含む洗浄緩衝液でステップ(c)における前記カラムを洗浄するステップと、
(e)ステップ(d)における前記カラムとの結合が維持されたダルベポエチンアルファをカラムから溶出するステップを含む、ダルベポエチンアルファの精製方法。 - 前記吸着クロマトグラフィーの固定相はヒドロキシアパタイト樹脂である、請求項14に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- (f)前記(e)ステップで得られた陰イオン交換クロマトグラフィー溶出液をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて分画するステップをさらに含む、請求項14に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記(a)ステップは、平衡化した陰イオン交換樹脂にダルベポエチンアルファを含む生物学的流液を加えて吸着させた後、0〜100mM NaClを含むpH6〜8の洗浄緩衝液で洗浄し、次いで100〜300mM NaClを含むpH6〜8の溶出緩衝液でダルベポエチンアルファを含む分画を溶出するステップである、請求項14に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
- 前記(b)ステップは、平衡化したヒドロキシアパタイト樹脂に(a)ステップで回収された溶出液をローディングし、その後0〜100mMリン酸ナトリウムを含むpH6〜8の洗浄緩衝液で洗浄し、次いでローディングと洗浄により樹脂に付着せずに流出した液からダルベポエチンアルファを含む分画を得るステップである、請求項14に記載のダルベポエチンアルファの精製方法。
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