JP3054192B2

JP3054192B2 - 副甲状腺ホルモンの製造のための組換えｄｎａ法

Info

Publication number: JP3054192B2
Application number: JP2508493A
Authority: JP
Inventors: クローネンバーグ，ヘンリー・エム; ヌッスバウム，サムエル・アール; 知子土井
Original assignee: ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション
Priority date: 1989-05-12
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 2000-06-19
Anticipated expiration: 2015-06-19
Also published as: DE69024649T2; JPH04505259A; US5171670A; EP0473701A1; WO1990014415A1; EP0473701B1; DE69024649D1; EP0473701A4

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の分野本発明は、組換えDNA法を用いて細菌中で大量のヒト
副甲状腺ホルモン１−84（hPTH 1−84）またはその変異
体を製造するための方法に関する。

従来技術の説明副甲状腺ホルモン（PTH）は84アミノ酸残基のペプチ
ドであり、哺乳動物におけるカルシウム・ホメオスタシ
スの主要な調節物質の１つである。PTHは主に腎臓で作
用してカシウムの再吸収を刺激し、そして骨細胞に作用
してカルシウムの動員を刺激する。また、PTHは骨の整
形過程の増強を導く［Pottsら,Adv.Protein Chem.32:32
3−395（1982）を参照］。PTHは、骨粗鬆症の治療また
は予防に有望な作用を有しているかもしれない。

PTHの変異体または類似体はPTH受容体に結合すること
ができ、PTHまたは最近になって発見されたPTH関連ペプ
チド（腎細胞癌、肺癌および乳癌などの多種の腫瘍によ
って産生され、現在では悪性腫瘍の過カルシウム血症の
原因であると考えられている）の作用を遮断することが
できる［Broadus,A.ら,New.Eng.J.Med.319:556−563（1
988）］。

上記の理由から、大量の精製が容易なヒトPTHの供給
源が多年にわたって求められていた。

大腸菌におけるPThの直接発現がいくつかの報告に記
載されている［Breyelら,3rd Europ.Cong.Biotech.３:3
63−369（1984）;Born,W.ら,Endocrinol.123:1848−185
3（1988）;Morelleら,Biochim.Biophys.Acta 950:459−
462（1988）;Rabbaniら,J.Biol.Chem.263:1307−1313
（1988）］。ヒトPTHを発現させようとするBreyelらお
よびMorelleら（上記）の試みによっては、RNAとタンパ
ク質の不安定性の故に、極めて限られた量のホルモン
（＜500μg/）しか得られなかった。Rabbaniら（上
記）は200μg/のPTH収量を達成したが、これはＮ−末
端で様々に先端切除されたペプチドを不純物として含ん
でいた。純粋かつ無傷のPTH（１−84）を複雑な方法で
精製すると、最終的な収量は1Lの培養物あたり10μｇに
すぎなかった。Bornら（上記）は、ヒトプレプロPTH cD
NAの複数コピープラスミドを用いて、主にPTH（３−8
4）およびPTH（８−84）である先端切除hPTHを発現させ
たが、これらは実質的にPTHの生物活性を欠いていた。

従って、容易に精製することができ、かつPTHの不活
性形態／類似体を含まない、安定なPTHのさらに大量の
製造を導く発現ベクターの必要性が認識されていた。こ
の問題を解決するための１つの方法が、細菌宿主中での
他のペプチドの発現について記載する研究によって示唆
されている［Itakuraら,Science 198:1056−1063（197
7）;Riggs,米国特許No.4,366,246,微生物ポリペプチド
発現のための方法，（1982年12月28日）;Ikeharaら,Pro
c.Natl.Acad.Soi.USA 81:5956−5960（1984）］。

Itakuraら（1977、上記）およびRiggs（1984、上記）
は、外来タンパク質の細菌発現のための方法、特に所望
の異種タンパク質（ヒトソマトスタチン）と大きな細菌
性タンパク質（β−ガラクトシダーゼ）の間の融合タン
パク質の製造のための方法を教示している。この融合タ
ンパク質は、外来タンパク質の細胞内分解を防止する機
能を供する。さらに、過剰発現された融合タンパク質、
特にβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質は細菌細
胞中の細胞封入体として蓄積されることが多く、従って
単離および精製するのが比較的容易である［Marston,Bi
ochem.J.240:1−12（1986）］。ソマトスタチン遺伝子
はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＣ−末端に相内で挿入
され、ソマトスタチン配列のＮ−末端にメチオニンが存
在するようにして臭化シアンによって後に行う融合タン
パク質の切断を可能にしている。誘導可能な細菌性プロ
モーターであるlacプロモーターが、融合タンパク質のm
RNAの転写を刺激するために挿入されている。非細菌性
タンパク質（例えば、MS2ファージ）を産生させるため
に大腸菌中で好ましいことがわかっているアミノ酸コド
ンが使用されている。この融合タンパク質を70％ギ酸、
6MグアニジニウムHCl、8M尿素、または２％SDSで可溶化
し、次いで所望の産物であるソマトスタチンをCNBr切
断、アルコール抽出、およびクロマトグラフィーを用い
て豊富化している。選択的切断部位の考えに基づいて別
の切断法についての示唆が為されている：メチオニンを
所望の連結点に挿入して臭化シアンの標的部位とするこ
とができると同様に、アミノ酸特異性を有するタンパク
質加水分解酵素によって攻撃されうる特異的なアミノ酸
部位を導入することができる。

Ikeharaら（1984、上記）は、ヒト成長ホルモン（hG
H）の合成遺伝子の発現を促進して191アミノ酸のhGHペ
プチドの合成を高める大腸菌trpプロモーターを含有す
るプラスミドを記載している。この合成遺伝子は、大腸
菌において最も頻繁なアミノ酸コドンを使用している。

Nagaiら［Nature 309:810−812（1984）］は、たとえ
適切なプロモーターおよびリボソーム結合配列を導入し
たときであっても、大腸菌において真核性遺伝子を高レ
ベルで発現させることの限界を指摘し、所望のペプチド
の効率的かつ容易な分離を高めるための有用な方法とし
て、融合タンパク質中での所望の遺伝子産物の産生を開
示している。この目的を達成するために、Nagaiらは血
液凝固因子Xaの切断部位として作用する４アミノ酸の配
列を導入し、ファージラムダcII遺伝子の一部に融合さ
せたヒトβグロビン遺伝子の発現を行った。因子Xaによ
る切断によって、通常の方法で大腸菌において発現され
たほとんどの真核性タンパク質中に存在する、開始コド
ンによってコードされている余分なＮ−末端メチオニン
が削除される。

他の文献は所望の異種タンパク質と第２のタンパク質
の間の融合タンパク質をコードしているプラスミドの設
計および使用を開示しており、これらの一部は、所望の
タンパク質の細菌中での発現を高めるためおよびその精
製をさらに容易にするために、因子Xaまたはトロンビン
によって認識される切断部位を含んでいる［Germinoら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:692−4696（1984）;Scholt
issekら,Gene 62:55−64（1988）;Smithら,Gene 67:31
−40（1988）;Knottら,Eur.J.Biochem.174:405−410（1
988）；およびDykesら,Eur.J.Biochem.174:411−416（1
988）］。

Wingenderら［J.Biol.Chem.264:4367−4373（198
9）］は、大腸菌中でのhPTHの発現を高めるために上記
の方法を適用することを試みた。Nagaiら（1985、上
記）が記載したように発現プラスミドのhPTH部位の上流
に因子Xaの認識部位を導入し、因子Xaによるタンパク質
加水分解切断を用いて融合タンパク質からhPTHを単離し
ようとする試みは、精製度の高い融合タンパク質および
プロテイナーゼを用いたときであっても不成功に終わっ
た。

発明の簡単な要約 hPTHおよびその類似体（選択的なアンタゴニストであ
って、ある種の病的状態においてPTH受容体に作用する
アゴニストによって媒介される不都合な作用を遮断する
ことができる）が入手可能になることは、臨床的に大き
な価値を有するものと考えられる。この目的のために
は、原核性の発現系が極めて有用であろう。このような
系は臨床および研究用に十分な原料を供給するだけでな
く、構造−機能の関係を調べるためおよびホルモン変異
体を設計して特異的な働きをさせるためにタンパク質操
作法を適用することをも可能にするであろう（例えば、
カルシウム動員と骨の再構成、アゴニスト作用とアンタ
ゴニスト作用）。

本発明は、殺菌中で効率的に発現させることができる
ヒト副甲状腺ホルモンをコードしている組換えDNA分子
に関する。このDNA分子は宿主において遺伝子配列を発
現させるためのコントロール領域を含有しており、この
コントロール領域はポリペプチド配列をコードしている
リーダー配列と機能的に結合している。このリーダー配
列は長さが約600ヌクレオチド未満であり、選択的な酵
素切断部位をコードしているヌクレオチド配列に機能的
に結合しており、このヌクレオチド配列は発現させよう
とする遺伝子配列の前に結合している。

さらに、本発明は、リーダーポリペプチド、選択した
酵素切断部位、およびhPTH（１−84）またはその変異体
からなる融合タンパク質に関する。

また、本発明は、上記の組換えDNA分子を用いて細菌
中で、大量のヒト副甲状腺ホルモン１−84（hPTH 1−8
4）またはその変異体を製造するための方法を包含する
ものである。

本発明の主要な利点の１つは、現在達成することがで
きるレベルの50〜100倍に改善された高濃度の精製hPTH
1−84を製造しうることである。

本発明は、付加されたＮ−末端メチオニンを欠く（そ
れが存在しているときには、ホルモン調製物の活性を減
少させ、ヒト宿主に対してさらに免疫原性にする）、細
菌の細胞内での分解に耐性である安定な形態のhPTH 1−
84を製造することを可能にする。

さらに、本発明は、有用な副甲状腺ホルモンのアゴニ
ストまたはアンタゴニストとして作用しうる、変異Ｎ−
末端を有するhPTH類似体を製造するためのプラスミド構
築物を作成することを可能にする。

図面の説明図１は、因子Xa認識配列（FXRS）を含有するオリゴヌ
クレオチドフラグメントおよびトロンビン認識配列を含
有する類似フラグメントを示すものであり、さらに制限
部位の存在をも示すものである。特に重要な部位はArg
コドンの３′側のStu I部位であり、この部位がhPTHの
暗号配列の５′末端との結合を可能にする。

図２は、組換えhPTHの製造方法を図式的に示すもので
ある。出発プラスミドであるpGH−L9は、大腸菌のトリ
プトファンプロモーターおよびヒトGHをコードしている
ヌクレオチド配列を含み、Bgl IIおよびSal I制限部位
を含有している。FXRSを含む35ヌクレオチドのオリゴマ
ー（図１を参照）を、pCG−L9中のBgl II−Sal I部位に
クローニングする。即ち、得られた中間体プラスミド
（pTG1、示していない）は、FXRS配列に結合したヒトGH
のアミノ酸１〜138をコードしているヌクレオチドを含
有している。この中間体プラスミドをStu Iで処理し
て、Argをコードしているゴドンの３′側に平滑末端を
創製する。hPTHをコードしている遺伝子配列をプラスミ
ドpPTHm124からXbaIで切り出し、平滑末端にし、Xba I
部位をクレノウ試薬を用いて充填し、得られた配列を中
間体プラスミドpTG1中にクローニングする。この方法に
より、hPTHのＮ−末端コドンをFXRSラグメントのArgコ
ドンに隣接させることが可能である。この新規に構築し
たプラスミドをpGFP−１と命名した。次いで、このプラ
スミドを大腸菌中で発現させると、hGH（１−138）、FX
RS、およびhPTH（１−84）配列を含有する融合タンパク
質が産生された。因子Xaで切断すると、Ｎ−末端のセリ
ン残基が修飾されていない無傷のhPTH（１−84）ホルモ
ンが放出された。次いで、このhPTHをHPLCで精製した。

図３は、フクロネズミ腎細胞への組換えhPTH（１−8
4）および合成PTH（１−34）の結合を示すものである。

図４は、UMR腫瘍細胞への組換えhPTH（１−84）およ
び合成PTH（１−34）の結合を示すものである。

図５は、組換えhPTH（１−84）および合成PTH（１−3
4）による刺激に対する、フクロネズミ腎細胞の環状AMP
応答を示すものである。

図６は、組換えhPTH（１−84）および合成PTH（１−3
4）による刺激に対する、UMR腫瘍細胞の環状AMP応答を
示すものである。

好ましい態様の説明ヒト副甲状腺ホルモン（hPTH）は84アミノ酸残基のポ
リペプチドである［hPTH（１−84）］。そのアミノ酸配
列［Keutmann,H.T.ら,Biochemistry 17:5723−5729（19
78）］およびそれをコードしている遺伝子のクヌレオチ
ド配列［Hendyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:7365−73
69（1981）］は既知である。

hPTH（１−84）のヌクレオチド配列は多数の既知供給
源から得ることができる。例えば、プラスミドpPTHm124
［Bornら,Molec.Endocrinol.１:5−14（1987）］がこの
配列を含んでおり、本発明のプラスミドpGFP−１を構築
するために用いるDNAの供給源となる（図２を参照）。

hPTHの生物学的活性およびこれら活性を測定するため
の方法は当分野で周知である［例えば、Pottsら,Adv.Pr
otein Chem.32:323−395（1982）を参照］。これらの活
性には、腎細胞および種々の腫瘍セルライン上の受容体
への結合、ならびに環状AMP産生の刺激が含まれる。

本明細書で用いるhPTHの「変異体」なる用語は、hPTH
の生物学的活性に実質的に類似した生物学的活性を有す
るポリペプチドを指す。このような生物学的活性には、
hPTHの受容体への結合、ならびにその後のこの受容体へ
のhPTHの結合または作用の阻害が含まれる。２つの分子
が実質的に類似した構造を有しているとき、または２つ
の分子が類似した生物学的活性を保持しているときに、
一方の分子は他方の分子に「実質的に類似」していると
言われる。組換えhPTHの「変異体」には、組換えhPTHの
「フラグメント」および「変異体」の両方が含まれる。

「hPTHのフラグメント」なる用語は、該分子の任意の
ポリペプチド小集団を指すことを意味する。「hPTHの変
異体」なる用語は、この「変異体」がhPTHの生物学的活
性に類似する生物学的活性の少なくとも１つを有してい
るという条件のもとで、完全分子またはそのフラグメン
トのいずれかに構造が実質的に類似している分子を指す
ことを意味する。即ち、ある分子がhPTHの活性に類似す
る生物学的活性（hPTH受容体への結合およびその後のhP
THの結合の阻害を含む）の少なくとも１つを保持してい
るときには、一方の分子が他方に見い出されない１また
はそれ以上のアミノ酸を含有しているときであっても、
また、２つの分子中のアミノ酸残基の配列が同一ではな
いときであっても、本明細書においてこの用語を用いる
ときにはhPTHの「変異体」であるとみなされる。

本発明で意図されているように、hPTHの変異体がhPTH
の生物活性（hPTHの受容体に結合する能力およびhPTHの
アンタゴニストとして機能する能力を含む）を保持して
いる限り、任意のhPTH変異体を発現させ、製造すること
ができる。

hPTHの変異体は組換え法によって製造する。一方また
は他方の末端からアミノ酸残基を失っている末端切除の
変異体を、ポリペプチドとして発現されうるポリヌクレ
オチドを合成することによって製造する。

ウシPTHの合成類似体であるPTH（３−34）は、インビ
トロで強力なPTHアンタゴニストであると認識されてい
る。Ｎ−末端アミノ酸１−２および１−７を欠くhPTHの
変異体はアゴニスト活性を欠き、アンタゴニスト活性の
能力があることが示されている［Born.W.ら,Endocrino
l.123:1848−1853（1988）］。本発明の好ましいhPTH変
異体は、Ｎ−末端で末端切除された変異体である。変異
体がＮ−末端から１個のアミノ酸を切除したものである
ときには、この変異体は残基No.1を欠いているが残基N
o.2〜84を含んでおり、hPTH（２−84）と呼ばれる。同
様に、Ｎ−末端が切除された変異体は、hPTH（３−8
4）、hPTH（４−84）などと呼ばれる。本発明の好まし
い変異体は、hPTh（３−84）、（４−84）、（５−8
4）、（６−84）、（７−84）、および（８−84）であ
る。

「融合タンパク質」なる用語は、ヒトPTHまたはその
変異体がそのＮ−末端のところで「選択的切断部位」に
結合し、次いでこれがそのＮ−末端のところで別のアミ
ノ酸リーダーポリペプチド配列に結合している融合タン
パク質を意味する。融合タンパク質中の結合は、本発明
の一部を構成する遺伝子配列から転写されるmRNAに由来
する、タンパク質生合成中に宿主細胞において生成され
る通常のペプチド結合によっている。

「選択的切断部位」なる用語は、化学物質または酵素
のいずれかによって選択的に切断することができ、かつ
予測可能な状態で切断することができるアミノ酸残基ま
たは残基群を指す。選択的な酵素切断部位は、タンパク
質加水分解酵素によって認識され、そして加水分解され
るアミノ酸またはペプチド配列である。このような部位
の例には、トリプシンまたはキモトリプシイン切断部位
が含まれる。本発明の好ましい態様においては、この選
択的切断部位は、血液凝固因子Xaによって認識され、そ
して切断される配列Ile−Glu−Gly−Argからなる。他の
態様では、この選択的切断部位は、トロンビンによって
認識され、そして切断される配列Leu−Val−Pro−Argを
有している。

この酵素認識部位をコードしている配列の５′側のオ
リゴヌクレオチド配列の大きさは変化してよい。好まし
い態様においては、13個のヌクレオチドを、Ileのコド
ン（認識部位の最初）とリーダー配列の３′末端の間に
設置する。他の態様においては、さらに長い配列を用い
ることもできる。これら上流配列は、これらをリーダー
配列に隣接したDNA中にクローニングすることを可能に
する適当な制限部位を含んでいなければならない［因子
Ｘ認識部位（FXRS）を含有するオリゴヌクレオチドのBg
l II部位のように；図１および図２を参照］。

「リーダー配列」なる用語は、hPTHに結合されるポリ
ヌクレオチド配列であって、選択的切断部位およびhPTH
に融合した融合タンパク質として宿主細胞中で発現され
る配列を意味する。「リーダーポリペプチド」なる用語
は、融合タンパク質中に得られる「リーダー配列」の発
現形態を指す。

ある態様では、約600ヌクレオチド未満のリーダー配
列を利用する。別の態様では、ヒト成長ホルモン（191
アミノ酸残基）をコードしているヌクレオチド配列を用
い、その結果、リーダーポリペプチドがヒト成長ホルモ
ンである融合タンパク質が得られる［Ikeharaら,Proc.N
atl.Acad.Soi.USA 81:5956−5960（1984）］。他の態様
では、このリーダーポリペプチドは約50アミノ酸からな
る。さらに別の態様では、このリーダーポリペプチドは
約100アミノ酸からなる。

本発明で用いるリーダー配列は、完全なヒト成長ホル
モンポリペプチドをコードするのに必要なヌクレオチド
数よりも少ない、即ち、ヒト成長ホルモンの短縮された
変異体をコードしているものであってもよい（これが融
合タンパク質に発現される）。好ましい態様において
は、このリーダー配列は、ヒト成長ホルモンの残基１〜
138をコードしているヌクレオチド配列からなる。

過剰発現されたときに細胞封入体中に見い出され、不
溶性であることが多い融合タンパク質を、当分野で周知
の方法によって他の細菌性タンパク質から精製する。好
ましい態様では、この不溶性の融合タンパク質を、細胞
溶解の後に遠心して洗浄し、グアニジン−HClで再溶解
する。これは、透析による変性物質の除去の後に可溶性
のままであることができる「屈折力のあるタンパク質の
精製については、Jonesの米国特許No.4,512,922;Olson
の米国特許No.4,518,526;Builderらの米国特許No.4,51
1,502およびNo.4,620,948を参照］。

組換えhPTHは、種々の方法のいずれかを用いることに
より、可溶化した融合タンパク質から天然不純物を実質
的に含まないように精製することができる。本明細書に
おいては、ある化合物が細菌または真核宿主細胞におい
て発現された後にその化合物に伴われる物質から実質的
に精製されたときに、その化合物は「天然不純物を実質
的に含まない」と言う。通常のクロマトグラフィー分離
法を用いてhPTHを精製することができる。

別法では、このペプチドを免疫アフィニティークロマ
トグラフィーを用いて精製してもよい［Rotman,A.ら,Bi
ochim.Biophys.Acta 641:114−121（1981）;Sairam,M.
R.,J.Chromatog.215:143−152（1981）;Nielsen,L.S.
ら,Biochemistry 21:6410−6415（1982）;Vockley,J.
ら,Biochem.J.217:535−542（1984）;Paucha,E.ら,J.Vi
rol.51:670−681（1984）;Chong,P.ら,J.Virol.Meth.1
0:261−268（1985）］。

部分的または実質的な精製の後に、融合タンパク質を
選択的切断部位に対応する酵素で処理する。別法では、
さらに不純な状態にある融合タンパク質を、屈折力のあ
る形態であっても酵素で処理することができる。必要な
ら、得られた成熟hPTHまたはその変異体をさらに精製す
ることができる。

酵素処理のための条件は当業者に既知である。

DNA配列の発現は、このDNA配列が転写および翻訳調節
情報を含むDNA配列に「機能的に結合」していることを
必要とする。機能的な結合とは、コントロールまたは調
節DNA配列および発現させようとするDNA配列が、遺伝子
を発現させるような仕方で結合している結合を指す。遺
伝子発現に必要な「コントロール領域」の正確な性質は
生物の種類によって変わるであろうが、通常は、プロモ
ーター領域を含むであろう。原核生物では、このプロモ
ーター領域は、プロモーター（RNA転写の開始を指令す
る）ならびにRNAに転写されたときにタンパク質合成の
開始を合図するであろうDNA配列の両方を含んでいる。
通常、真核細胞における調節領域はRNA合成の開始を指
令するに十分なプロモーター領域を含有している。

２つのDNA配列の間の結合の性質が次のようであると
きに、この２つのDNA配列は機能的に結合していると言
われる：（１）フレームシフト突然変異を導入する結果
にならない；（２）融合タンパク質をコードしている配
列の転写を指令するプロモーター領域配列の能力に悪影
響を及ぼさない；または（３）プロモーター領域配列に
よって転写させようとする融合タンパク質コード化配列
の能力に悪影響を及ぼさない。即ち、プロモーターがDN
A配列を転写させることができるなら、該プロモーター
領域は該DNA配列に機能的に結合している。

原核細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス
属、ストレプトマイセス属など）中でhPTH分子またはそ
の変異体もしくは機能的誘導体を発現させるためには、
hPTHをコードしている配列を機能的な原核性プロモータ
ーに機能的に結合させることが必要である。このような
プロモーターは構成性またはより好ましくは調節可能
（即ち、誘導可能または抑制解除可能）のいずれであっ
てもよい。構成性プロモーターの例には、バクテリオフ
ァージλのintプロモーター、pBR322のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子のblaプロモーター、およびpPR325のクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCAT
プロモーターなどが含まれる。誘導可能な原核性プロモ
ーターの例には、バクテリオファージλの主右側および
左側プロモーター（P_LおよびP_R）、大腸菌のtrp、rec
A、lacZ、lacIおよびgalプロモーター、枯草菌のα−ア
ミラーゼプロモーター［Ulmanen,I.ら,J.Bacteriol.16
2:176−182（1985）］およびσ−28特異的なプロモータ
ー［Gilman,M.Z.ら,Gene 32:11−20（1984）］、バシラ
ス属のバクテリオファージのプロモーター［Gryczan,T.
J.,The Molecular Biology of the Bacilli中,Academic
Press,Inc.,NY（1982）］、ならびにストレプトマイセ
ス属のプロモーター［Ward,J.M.ら,Mol.Gen.Genet.203:
468−478（1986）］が含まれる。原核性のプロモーター
は概説されている［Glick,B.R.,J.Ind.Microbiol.１:27
7−282（1987）;Cenatiempo,Y.,Biochimie 68:505−516
（1986）；およびGottesman,S.,Ann.Rev.Genet.18:415
−442（1984）］。

本発明の発現ベクターを得るための種々のDNAフラグ
メントの結合は、平滑末端または付着末端にした連結用
末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、適切な付
着末端の充填、所望ではない結合を避けるためのアルカ
リおよびホスファターゼ処理、ならびに適当なリガーゼ
による連結を用い、常法に従って行う。この遺伝子構築
物は、融合タンパク質の５′遺伝子配列に機能的に結合
した誘導可能なプロモーターをコードしており、融合タ
ンパク質の効率的な発現を可能にする。

本発明に好ましい原核性プロモーターは、インドール
アクリル酸で誘導することができる大腸菌trpプロモー
ターである。

原核細胞における適切な発現には、遺伝子コード化配
列の上流のリボソーム結合部位の存在が必要である。こ
のようなリボソーム結合部位は開示されている［例え
ば、Gold,L.ら,Ann.Rev.Microbiol.35:365−404（198
1）］。

真核細胞（例えば、酵母、菌類、哺乳動物細胞または
植物細胞など）での発現が所望であるときには、そのよ
うな真核宿主において転写を指令することができるプロ
モーターを用いることが必要である。好ましい真核性プ
ロモーターには、マウスメロチオネインＩ遺伝子のプロ
モーター［Hamer,D.ら,J.Mol.Appl.Gen.１:273−288（1
982）］；ヘルペスウイルスのTKプロモーター［McKnigh
t,S.,Cell 31:355−365（1982）］;SV40の初期プロモー
ター［Benoist,C.ら,Neture（London）290:304−310（1
981）］；および酵母gal4遺伝子のプロモーター［Johns
ton,S.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6971−6975（1
982）;Silver,P.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5951
−5955（1984）］が含まれる。

導入された遺伝子配列を、受容宿主において自律的な
複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターに導入
するのが好ましい。この目的に多種多様のベクターの任
意のものを用いることができる。特定のプラスミドまた
はウイルスベクターを選択する際の重要な因子には次の
ものが含まれる：即ち、ベクターを含んでいる受容細胞
を、ベクターを含んでいない受容細胞から認識および選
択する際の容易さ；特定の宿主において望ましいベクタ
ーのコピー数；ならびに、異なる種の宿主細胞の間でベ
クターを「往復」させうることが所望であるか否かなど
である。好ましい原核性ベクターには、大腸菌中で複製
することができるプラスミド、例えば、pBR322、ColE
1、pSC101、pACYC184、πVXなどが含まれる。このよう
なプラスミドは、例えば、Maniatis,T.ら［Molecular C
loning,A Laboratory Manual中,Cold Spring Harbor Pr
ess,Cold Spring Harbor,NY（1982）］が開示してい
る。バシラス属プラスミドにはpC194、pC221、pT127な
どが含まれる。このようなプラスミドは、例えば、Gryc
zan,T.［The Molecular Biology of the Bacilli中,Aca
demic Press,NY（1982）,pp.307−329］が開示してい
る。適当なストレプトマイセス属プラスミドには、pIJ1
01［Kendall,K.J.ら,J.Bacteriol.169:4177−4183（198
7）］、およびφC31などのストレプトマイセスバクテリ
オファージ［Chater,K.F.ら,Sixth international Symp
osium on Actinomycetales Biology中,Akademiai Kaid
o,Budapest,Hungary（1986）,pp.45−54］が含まれる。
シュードモナス属プラスミドは、John,J.F.ら［Rev.inf
ect.Dis.８:693−704（1986）］、およびIzaki,K.［Jp
n.J.Bacteriol.33:729−742（1978）］が概説してい
る。

好ましい真核性プラスミドにはBPV、ワクシニア、SV4
0、２−ミクロンサークルなどが含まれる。このような
プラスミドは当分野で周知である［Botstein,D.ら,Miam
i Wntr.Symp.19:265−274（1982）;Broach,J.R.,The Mo
lecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cy
cle and Inheritance中,Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Horbor,NY,p.445−470（1981）;Broach,
J.R.,Cell 28:203−204（1982）;Bollon,D.P.ら,J.Cli
n.Hematol.Oncol.10:39−48（1980）;Maniatis,T.,Cell
Biology:A Comprehensive Treatise,Vol.3,Gene Expre
ssion中,Academic Press,NY,pp.563−608（1980）］。

本発明に好ましい細菌宿主は大腸菌である。別の態様
では、別の細菌種を用いることができる。さらに別の態
様では、例えば酵母、糸状菌などの真核細胞を用いるこ
とができる。これらの細胞種の使用は当分野で周知であ
る。発現プラスミド中のレプリコンおよびコントロール
配列に適合する任意の宿主を用いてタンパク質を発現さ
せることができる。通常は、宿主細胞に適合する種から
導いたレプリコンおよびコントロール配列を含有するベ
クターを、この宿主と組合せて使用する。このベクター
は、レプリコン部位、ならびに感染細胞または形質転換
細胞において表現型選択を与えることができる特別の遺
伝子を担持しているのが普通である。また、融合タンパ
ク質の発現を他の調節配列の制御下に置くこともでき、
この配列は形質転換されていない状態の生物にホモロー
ガスであってもよい。

次いで、hPTHをその周知の用途のすべてに対して使用
することができる。

実施例１ヒトPTH（１−84）の製造 pGFP−１（図２を参照）で形質転換した大腸菌（10m
l）をLBアンピシリン培地（1L）に接種した。培養物の
光学密度が600nmに達したときに、３β−インドールア
クリル酸（40mg）を加え、この培養物を37℃で16時間誘
導した。5000xgで10分間遠心することによって細胞をペ
レット化し、TE−スクロース（100ml）に再懸濁し、こ
れにリソチーム（100mg）を加えた。０℃で1.5時間イン
キュベートした後、MgCl₂を20mMの濃度となるように、
そしてDNアーゼＩを50μg/mlの濃度となるように加え、
さらに1.5時間インキュベートした。0.2M NaCl、１％デ
オキシコール酸、1.6％ Nonidet P40、20mMトリス−HCl
（pH7.5）、2mM EDTA、および0.5mMジチオトレイトール
（DTT）を含む溶液（200ml）を加え、０℃で1.5時間イ
ンキュベートすることによって細胞を溶解した。この溶
菌液を5000xgで10分間の遠心によってペレット化した。
このペレットを0.5％Triton X−100、1mM EDTA、および
0.5mM DTTで４回洗浄し、遠心することによって融合タ
ンパク質に富むペレットを得た。

この融合タンパク質のペレットを50mlの6Mグアニジン
−HCl、20mMトリス−HCl（pH7.5）、0.5mM DTT、および
1mM EDTAに溶解し、融合タンパク質が1mg/mlになるよう
にした。この溶液を、50mMトリス−HCl（pH7.8）、0.1M
NaClに対して透析した。

活性化した因子Ｘを100mgの融合タンパク質あたり1mg
の比で加え、この混合物を37℃で２時間インキュベート
した。次いで、この溶液をHPLC RPC−18システムにか
け、直線の30〜70％アセトニトリル/H₂O勾配液で溶離し
た。PHT分画は38％アセトニトリルで溶出することがわ
かった。この分画を凍結乾燥し、後に行う分析用に水に
再懸濁した。

GH−PTH融合タンパク質は疎水性であり、68％アセト
ニトリルで溶出することがわかった。因子Xaで処理した
後には、このハイブリッドタンパク質のピークは顕著に
減少し、同時に38％アセトニトリルのところにPTHのピ
ークが現れた。

通常、ハイブリットGH−PTHの収量は1Lの培養物あた
り約50mgであった。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動分析によると、上記の因子Ｘ処理条件により、融合
タンパク質のhPTH（１−84）およびGHフラグメントへの
50％の変換が得られた。

実施例２組換えhPTH（１−84）のアミノ酸組成および
Ｎ−末端配列の分析アミノ酸組成の分析は、hPTH（１−84）に対する予想
アミノ酸組成と一致していた。hPTH（１−84）のガス相
マイクロ配列決定によって、最初の18アミノ酸の配列を
確認した。重要なことは、Ｎ−末端の１位がセリンであ
ることがわかったことである。他の研究者が記載してい
るように［Rabbaniら,1988;上記］、得られたhPTHの重
要な部分の中にブロックされたアミノ末端が存在すると
いう事実は認められなかった。

実施例３組換えhPTH（１−84）の生物学的活性上記の実施例１の記載のように製造された組換えペプ
チドについて、２種類の細胞型に対する結合を調べた。
図３に示した結果からわかるように、組換えhPTH（１−
84）は、約3nMの半−最大結合でもってフクロネズミ腎
細胞に特異的に結合した。この結果は、約1nMの半−最
大結合を示す合成PTH（１−34）の結合に類似してい
た。図４はUMRラット骨肉腫セルラインを用いた同様の
研究を示すものであり、ここでは、合成PTH（１−34）
の約2nMに対し、組換えhPTH（１−84）は約10nMの半−
最大値で結合した。

環状AMP生成を誘導する生物学的活性が図５および図
６に示されている。組換えhPTH（１−84）は約10nMのEC
₅₀でフクロネズミ腎細胞中の環状AMPを刺激し、合成PTH
（１−34）は約4nMのEC₅₀を有していた（図５）。UMR細
胞では、組換えhPTH（１−84）は約3nMのEC₅₀で環状AMP
を刺激し、一方、合成PTH（１−34）は約0.1nMのEC₅₀を
有していた（図６）。即ち、この組換えペプチドは、既
知の活性フラグメントの活性とほとんど区別できないPT
H生物学的活性を有していた。

寄託プラスミドpGFP−１を含有する大腸菌株DH1は1989年
５月12日にAmerican Type Culture Collection（Rockvi
lle,MD）に寄託されており、受託番号ATCC 67977が付与
されている。

本発明をその具体的な態様との関係において説明した
が、さらに修飾を加えることができることは理解されよ
う。本出願は、広く本発明の原理に従うあらゆる変異
形、使用または適合を包含することを意図するものであ
り、本発明が属している分野の既知または通常の実施の
範疇に含まれ、添付した請求の範囲に記載したような上
記説明の本質的特徴に当てはめることができる本開示か
らの逸脱を包含するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/06 21/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者土井知子大阪府吹田市古江台６丁目２番３号株式会社蛋白工学研究所 (56)参考文献Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 264 Ｎｏ．８（1989 Ｍａｒ）ｐ. 4367−4373 東ソー研究報告（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴＯＳＯＨＲｅｓｅａｒｃｈ）Ｖｏｌ．32 Ｎｏ．２（1988）ｐ．161− 198 ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．Ｖｏｌ．１（1987）ｐ．487−492 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 263 Ｎｏ．３（1988）ｐ．1307−1313 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C07K 14/635 C12P 21/02 C12P 21/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）発現コントロール領域；（ｂ）該領域と機能的に結合し、ヒト成長ホルモンのア
ミノ酸１−138をコードしているリーダー配列；（ｃ）該リーダー配列と機能的に結合し、ヒト副甲状腺
ホルモン（hPTH）またはhPTH受容体に結合する能力を有
するそのポリペプチド変異体をコードしている遺伝子配
列に先行して結合している、選択的酵素切断部位をコー
ドしているヌクレオチド配列；を含有する組換えDNA分子。
【請求項２】コントロール領域が、細菌、ウイルス、菌
類、または哺乳動物プロモーターを含む請求項１に記載
の分子。
【請求項３】プロモーターが、バクテリオファージλの
右側プロモーター（P_L）、バクテリオファージλの左側
プロモーター（P_R）、大腸菌のtrpプロモーター、大腸
菌のrecAプロモーター、大腸菌のlacZプロモーター、大
腸菌のlacIプロモーター、大腸菌のgalプロモーター、
枯草菌のα−アミラーゼプロモーター、枯草菌のσ−28
特異的プロモーター、バシラス属バクテリオファージの
プロモーター、およびストレプトマイセス属プロモータ
ーからなる群から選ばれる請求項２に記載の分子。
【請求項４】プロモーターが大腸菌trpプロモーターで
ある請求項３に記載の分子。
【請求項５】選択的酵素切断部位が因子Xaによって切断
される請求項１に記載の分子。
【請求項６】選択的酵素切断部位がIle−Glu−Gly−Arg
である請求項１に記載の分子。
【請求項７】選択的酵素切断部位がトロンビンによって
切断される請求項１に記載の分子。
【請求項８】選択的酵素切断部位がLeu−Val−Pro−Arg
である請求項１に記載の分子。
【請求項９】ヒト副甲状腺ホルモンがhPTH（１−84）で
ある請求項１に記載の分子。
【請求項１０】ポリペプチドの変異体がＮ−末端のとこ
ろで先端切除されたものである請求項１に記載の分子。
【請求項１１】ポリペプチド変異体が、hPTH（２−8
4）、hPTH（３−84）、hPTH（４−84）、hPTH（５−8
4）、hPTH（６−84）、hPTH（７−84）、およびhPTH
（８−84）からなる群から選ばれる請求項10に記載の分
子。
【請求項１２】プラスミドである請求項１に記載の分
子。
【請求項１３】プラスミドがpGFP−１である請求項12に
記載の分子。
【請求項１４】請求項１に記載の分子を含有する宿主細
胞。
【請求項１５】原核性である請求項14に記載の細胞。
【請求項１６】細菌である請求項15に記載の細胞。
【請求項１７】大腸菌種である請求項16に記載の細胞。
【請求項１８】真核性である請求項14に記載の細胞。
【請求項１９】酵母細胞または哺乳動物細胞である請求
項18に記載の細胞。
【請求項２０】（ａ）ヒト成長ホルモンアミノ酸１−13
8; （ｂ）該アミノ酸に融合した選択的酵素切断部位；（ｃ）該切断部位に融合したhPTH（１−84）またはhTPH
受容体に結合する能力を有するそのポリペプチド変異
体；を含有する融合タンパク質。
【請求項２１】選択的酵素切断部位が因子Xaによって切
断される請求項20に記載のタンパク質。
【請求項２２】選択的酵素切断部位がIle−Glu−Gly−A
rgである請求項20に記載のタンパク質。
【請求項２３】選択的酵素切断部位がトロンビンによっ
て切断される請求項20に記載のタンパク質。
【請求項２４】選択的酵素切断部位がLeu−Val−Pro−A
rgである請求項20に記載のタンパク質。
【請求項２５】hTPH受容体に結合する能力を有するポリ
ペプチド変異体がＮ−末端のところで先端切除されたも
のである請求項20に記載のタンパク質。
【請求項２６】ポリペプチド変異体が、hPTH（２−8
4）、hPTH（３−84）、hPTH（４−84）、hPTH（５−8
4）、hPTH（６−84）、hPTH（７−84）、およびhPTH
（８−84）からなる群から選ばれる請求項20に記載のタ
ンパク質。
【請求項２７】ポリペプチド変異体がhPTH（３−84）で
ある請求項26に記載のタンパク質。
【請求項２８】天然の不純物を実質的に含まないヒト副
甲状腺ホルモン（hPTH）またはhPTH受容体に結合する能
力を有するそのポリペプチド変異体の製造方法であっ
て、（ａ）請求項１に記載の分子を宿主中に供し；（ｂ）ヒト副甲状腺ホルモンまたはhPTH受容体に結合す
る能力を有するそのポリペプチド変異体を発現させ；そ
して（ｃ）ヒト成長ホルモン、これに融合した選択的酵素切
断部位、これに融合したhPTH（１−84）またはhPTH受容
体に結合する能力を有するそのポリペプチド変異体を含
有する融合タンパク質を得；そして（ｄ）工程（ｃ）の融合タンパク質を選択的酵素切断部
位を認識する酵素で切断する；ことを含む方法。
【請求項２９】（ｅ）hPTH（１−84）またはhPTH受容体
に結合する能力を有するそのポリペプチド変異体を精製
する；工程をさらに含む請求項28に記載の方法。
【請求項３０】hPTH（１−84）をHPLC RPC−18システム
を用いて精製し、リニアな30〜70％アセトニトリル/H₂O
グラジエントで溶出する、請求項29に記載の方法。