JP3007919B2 - ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（▲ｉｉ▼） - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと略
す。）と抗アレルギー性ペプチドであるアスパラギン酸
（Asp）−セリン（Ser）−アスパラギン酸（Asp）−グ
リシン（Gly）−リジン（Lys）の５個のアミノ酸配列よ
りなるペプチド（以下、DSDGKと略す。）を繰り返し単
位とする多量体をロイシン−メチオニンを介在アミノ酸
として含む融合タンパク質（以下融合タンパク質（II）
と略す。）を大量に生産可能とする新規組換えプラスミ
ド、そのプラスミドを含有する大腸菌、DHFR−DSDGK多
量体の融合タンパク質（II）、DHFR−DSDGK多量体の融
合タンパク質（II）の製造法、DSDGK多量体の製造法及
びDSDGKの製造法に関するものである。本発明は、発酵
工学、医薬品工業などの分野に有効に利用されるもので
ある。

〔従来の技術〕

DSDGKは、抗アレルギー性ペプチドの一種であり、ケ
ミカルメディエーターに起因して発症するアレルギー性
鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息及びその他のア
レルギー性疾患の予防薬及び治療薬としての利用が期待
される興味深い生理活性ペプチドである（特開平１−31
6398号）。

アミノ酸数の少ないオリゴペプチドの製造方法として
は、通常、化学合成法が知られているが、近年は遺伝子
組換え技術によっても容易に製造しうる方法が開発され
ている。例えば、巖倉らは大腸菌のDHFRを大量に発現さ
せることが可能なプラスミドpTP70−１を作製し（特開
昭63−267276号）、DHFRのカルボキシル末端アミノ酸付
近をコードする塩基配列を種々改変して異種遺伝子を導
入し、有用なポリペプチドをDHFRとの融合タンパク質の
状態で大腸菌に産生させた。その例としてはソマトスタ
チン（特開平１−144977号、特開平１−144995号）、ブ
ラジキニン（特開平１−252289号）がある。

また、巖倉らはDHFRの生産効率を高める目的で、効率
のよりターミネータ領域として知られるrrnB遺伝子とpT
P70−１を使用して組換えプラスミドpTP104−４を作製
し（特開平１−144979号）、それを利用してDHFR−ロイ
シンエンケファリン融合タンパク質を発現させることの
できる組換えプラスミドpLEK1の作製も行っている。こ
こで得られる融合タンパク質はDHFRの酵素活性も保持さ
れているので、その精製はDHFRの特性と活性を利用して
容易に行われている。また、目的とするペプチドは、融
合タンパク質をブロモシアン処理もしくはトリプシン処
理した後、HPLCで精製して取得されている（特開平１−
252290号）。

これらの例では、目的とするポリペプチドの産生量の
増大を図るため、プロモータ領域やターミネータ領域の
改変が行われているが、目的とするポリペプチドをダン
デムに複数個連結させたポリペプチドを産生させること
も行われている（特開昭61−31090号）。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、DSDGKを遺伝子操作技術により大量
に製造することにあり、このために、DSDGKを繰り返し
単位とする多量体をコード化する遺伝子を組み込んだ有
効なプラスミドを作製しようとするものである。そして
このプラスミドは下記の要件を満たすことが必要であ
る。

（ｉ）DSDGKを繰返し含む融合タンパク質（II）として
産生することができるものであること （ii）融合タンパク質（II）の遺伝子を大量発現させる
ものであること （iii）産生される融合タンパク質（II）の精製が容易
なものであること （iv）融合タンパク質（II）からのDSDGKの分離が容易
なものであること 〔課題を解決するための手段〕 本発明者らは、鋭意研究の結果、大腸菌のジヒドロ葉
酸還元酵素遺伝子を用いることにより、上記課題が解決
できることを見いだし、その知見に従ってDHFRとDSDGK
の多量体からなる融合タンパク質（II）をコード化する
遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドを作製し、本発明
を完成させた。

すなわち、本発明は下記のアミノ酸配列を有する（ジ
ヒドロ葉酸還元酵素）−（アスパラギン酸−セリン−ア
スパラギン酸−グリシン−リジン）ｎの融合タンパク質
（ｎは２から10）をコードする塩基配列を含む組換えプ
ラスミトにある。

上記組換えプラスミドにおけるジヒドロ葉酸還元酵素
−抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク
質（II）において抗アレルギー性ペンタペプチドが二量
体である融合タンパク質（II）は下記のアミノ酸配列を
有するものである。

上記抗アレルギー性ペンタペプチドが二量体である融
合タンパク質（II）をコードする塩基配列としては例え
ば下記の塩基配列が挙げられる。

更に、上記組換えプラスミドにおけるジヒドロ葉酸還
元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タ
ンパク質（II）において抗アレルギー性ペンタペプチド
が三量体である融合タンパク質（II）は下記のアミノ酸
配列を有するものである。

上記抗アレルギー性ペンタペプチド三量体である融合
タンパク質（II）をコードする塩基配列としては例えば
下記の塩基配列が挙げられる。

更に上記の抗アレルギー性ペンタペプチドが二量体で
ある融合タンパク質（II）をコードする塩基配列を含む
組換えプラスミドには、大腸菌において安定に複製さ
れ、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピ
シリン耐性を与え、かつ4658塩基対の大きさを有するも
のが含まれる。

更に上記の抗アレルギー性ペンタペプチドが三量体で
ある融合タンパク質（II）をコードする塩基配列を含む
組換えプラスミドには、大腸菌において安定に複製さ
れ、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピ
シリン耐性を与え、かつ4673塩基対の大きさを有するも
のが含まれる。

上記組換えプラスミドには第１図の塩基配列を有する
組換えプラスミドpBBK8DMが含まれる。

更に上記組換えプラスミドには第２図の塩基配列を有
する組換えプラスミドpBBK9TMが含まれる。

更に本発明は上記組換えプラスミドにより形質転換さ
れた大腸菌にある。

更に本発明は下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉
酸還元酵素−カルボキシ末端にメチオニンを有する介在
アミノ酸−抗アレルギー性ペンタペプチド二量体の融合
タンパク質にある。

更に本発明は、下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ
葉酸還元酵素−カルボキシ末端にメチオニンを有する介
在アミノ酸−抗アレルギー性ペンタペプチド三量体の融
合タンパク質にある。

更に本発明は、上記の形質転換した大腸菌を培養し、
培養菌体から上記のジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギ
ー性ペンタペプチド二量体の融合タンパク質（II）又は
ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド
三量体の融合タンパク質（II）を採取することを特徴と
するジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプ
チド多量体の融合タンパク質（II）の製造方法にある。
そしてと、前記ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性
ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（II）の採取工
程は、培養菌体の無細胞抽出液から、ストレプトマイシ
ン処理、硫安沈澱、及びメソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィーを順次用いて精製する工程を含
むのものである。

更に本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー
性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（II）を酵素
処理もしくは化学処理もしくはこれらの処理方法を併用
することにより、アスパラギン酸−セリン−アスパラギ
ン酸−グリシン−リジンのアミノ酸配列からなる抗アレ
ルギー性ペンタペプチドを採取することにある。

そして、上記酵素処理に用いる酵素としては、トリプ
シンが挙げられる。

以下に本発明の詳細を（１）新規組換えプラスミドの
作製、（２）形質転換された大腸菌、（３）DHFR−DSDG
K多量体の融合タンパク質（II）の製造工程、（４）得
られたDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（II）、
（５）DSDGK多量体の製造工程、（６）DSDGKの製造工
程、の順に説明する。

（１）新規組換えプラスミドの作製 ｉ）DSDGK多量体をコードするDNAの作製 DSDGK多量体をコードするDNAの作製は、一本鎖DNAを
それぞれ化学合成した後、両鎖をアニールさせて行う。
目的とする二本鎖DNAが長い場合は途中でいくつかに区
切って作製してもよい。

DSDGK多量体をコードするDNAは、両端にベクターと連
結する粘着末端を有し、その間に、DHFRコード領域に近
い方から、DHFRとDSDGK多量体の結合を切断するための
カルボキシ末端にメチオニンを有する介在アミノ酸（ロ
イシン−メチオニン）をコードする塩基配列、DSDGK多
量体をコードする塩基配列及び翻訳終了を指令する塩基
配列を含む構造である。

粘着末端としては制限酵素の作用によって生じる切断
面の塩基配列とし、プラスミドpMEK2（特開平１−25228
9号公報参照）を用いる場合は、DHFRコード領域に近い
方の末端にBamH Iによる切断面を、反対側の末端にはXh
o Iによる切断面を用いるのが都合がよい。

DHFRとDSDGK多量体との間に介在するアミノ酸は、メ
チオニンまたはそれを含む複数のアミノ酸から成り、カ
ルボキシ末端にメチオニンを有するものを用いることが
できるが、ロイシン−メチオニンが好ましい。

DSDGKの多量体の重合度は好ましくは二量体から十量
体である。なお、後述の具体例としては二量体及び三量
体を例示した。

ii）DSDGK多量体をコードするDNAのベクタープラスミド
への挿入 DSDGK多量体をコードするDNAを発現させるためのベク
ターは、DHFRを発現させることができるものを用いる。
その例としては既に巖倉らが作製している組換えプラス
ミドpMEK2（特開平１−252289号公報参照）がある。pME
K2は、大腸菌に安定に保持され、pMEK2を含有する大腸
菌は、微工研にFERM BP−1816として寄託されている。p
MEK2は、pMEK2を含有する大腸菌から通常に行われるプ
ラスミドの分離方法に従って分離精製し利用することが
できる。精製したpMEK2をBamH I及びXho Iで切断して得
たDNA断片に上記ｉ）の二本鎖DNAをT4−DNAリガーゼを
用いて連結し、目的とする融合タンパク質（II）を大腸
菌菌体内で発現可能とする新規組換えプラスミドを得
る。

iii）新規プラスミドの塩基配列 第１図は本発明の一例である新規組換えプラスミドpB
BK8DMの全塩基配列を示している。二本鎖環状DNAのうち
遺伝情報をコードしている片方のDNA鎖塩基配列だけ
を、プラスミド中に唯一存在する制限酵素Cla Iの認識
切断部位、５′−ATCGAT−３′、最初の“A"を１番とし
て数えて、５′末端から３′末端の方向に記述してい
る。pBBK8DMは、4658塩基対の大きさであり、宿主であ
る大腸菌にトリメトプリム及びアンピシリン耐性を付与
することができる。pBBK8DMは、pMEK2（4640塩基対より
なる。）のBamH I及びXho I切断によって得られる大き
い方のDNA断片（4614塩基対よりなる。）とDSDGK二量体
をコードする塩基配列を含む44塩基対の化学合成DNAが
結合した構造をしている。第１図において、533番目か
ら576番目までの配列が化学合成DNA由来の配列である。
ちなみに、pMEK2の全塩基配列は既に本発明者らによっ
て明らかにされており（特開平１−252289号公報参
照）、第１図に示す塩基配列のうち533番目から576番目
までの配列が、以下に示す26塩基対の配列に置き変わっ
た構造である。

化学合成した二本鎖DNAの末端の配列には、制限酵素B
amH Iによる切断の際に生じる粘着末端、５′−GATC−
３′（第１図の533番目から536番目までの配列。）、及
び制限酵素Xho Iによる切断の際に生じる粘着末端、
３′−AGCT−５′（第１図の577番目から580番目までの
配列と相補する配列。）、を含ませてある。pMEK2由来
の部分には:BamH I及びXho I切断によって生じる粘着末
端部位が存在するので方向を定めて異種DNAの導入を行
い、DHFR遺伝子との融合遺伝子を容易に作製することが
できる。

第１図の57番目から572番目までの配列は、DHFRカル
ボキシル末端側にDSDGK二量体がロイシン−メチオニン
のアミノ酸配列を介して結合したDHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（II）をコード化している。

DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）をコード
化する配列の上流にはDHFR−DSDGK二量体の融合タンパ
ク質（II）遺伝子発現を効率良く行わせる配列が存在す
る（特開昭63−267276号明細書）。

即ち、43番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれ
るもので、効率のよい翻訳に、また、4616番目から4644
番目までが、コンセンサス転写プロモーターであり、効
率のよい転写に貢献する。そのためpBBK8DMは、大腸菌
に導入された場合、多量のDHFR−DSDGK二量体の融合タ
ンパク質（II）を作る。作られたDHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（II）は、菌体内に可溶性の状態で、菌
体タンパク質の約20％程度蓄積する。トリメトプリムは
このDHFRに対する阻害剤であるが、pBBK8DMを有する大
腸菌はDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）を菌
体内に大量に蓄積するので、トリメトプリム耐性を示す
ようになる。

第２図は本発明の他の一例である新規組換えプラスミ
ドpBBK9TMの全塩基配列を示している。第１図と同様
に、二本鎖環状DNAのうち遺伝情報をコードしている片
方のDNA鎖の塩基配列だけを、プラスミド中に唯一存在
する制限酵素Cla Iの認識切断部位、５′−ATCGAT−
３′、の最初の“A"を１番として教えて、５′末端から
３′末端の方向に記述している。pBBK9TMは、4673塩基
対の大きさで、pMEK2（4640塩基対よりなる。）のBamH
I及びXho I切断によって得られる大きい方のDNA断片（4
614塩基対よりなる。）とDSDGK三量体をコードする塩基
配列を含む59塩基対の化学合成DNAが結合した構造をし
ている。第２図において、533番目から591番目までの配
列が化学合成DNA由来の配列である。

第２図の57番目から587番目までの配列は、DHFRのカ
ルボキシル末端側にDSDGK三量体がロイシン−メチオニ
ンのアミノ酸配列を介して結合したDHFR−DSDGK三量体
の融合タンパク質（II）をコード化している。

pBBK9TMは、大腸菌に導入された場合、多量のDHFR−D
SDGK三量体の融合タンパク質（II）を産生するほかはpB
BK8DMと同様な特徴をもっている。

pBBK8DM及びpBBK9TMは、それぞれ実施例１及び実施例
２に従って作製することができるが、組換えプラスミド
の作製方法によって本発明が制限されるものではない。

（２）形質転換された大腸菌 上記（１）で作製した組換えプラスミドを常法に従い
大腸菌に取り込ませる。形質転換された大腸菌は、トリ
メトプリム及びアンピシリンに対して耐性を示す。この
プラスミドを含有する大腸菌は、プラスミド上のDHFR−
DSDGK多量体の融合タンパク質（II）遺伝子の効率のよ
い発現の結果、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（I
I）を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。このプ
ラスミドを含有する大腸菌をYT＋Ap培地（培地1L中に、
5gのNaCl、8gのトリプトン、5gのイーストエキス、及び
100mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培地。）を
用いて、37℃で定常期まで培養した場合、蓄積するDHFR
−DSDGK多量体の融合タンパク質（II）は、菌体タンパ
ク質の約20％に達する。培養菌体を、リン酸緩衝液など
の適当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしくは超
音波破砕法で破砕し、これを遠心分離法により上清と沈
澱に分離した場合、ほとんど全てのDHFR−DSDGK多量体
の融合タンパク質（II）は上清中に回収される。この新
規な組換えプラスミドのうちpBBK8DMを含有する大腸菌
は、微工研条寄第2392号（FERM BP−2392）として、ま
たpBBK9TMを含有する大腸菌は、微工研条寄第2393号（F
ERM BP−2393）として、それぞれ寄託されている。

（３）DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（II）の製
造工程 本発明のDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（II）
の製造工程は、ｉ）菌体の培養、ii）菌体の破砕、ii
i）ストレプトマイシン処理、iv）硫安沈澱、及びｖ）
メソトリキセート（MTX）結合アフィニティクロマトグ
ラフィーの各工程により成り立っている。

ｉ）菌体の培養 本発明のプラスミドを含有する大腸菌の培養は、YT＋
Ap培地（培地1L中に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gの
イーストエキス、及び50mgのアンピシリンナトリウムを
含む液体培地。）で培養することができる。培地として
は、この他にST＋Ap培地（培地1L中に、2gのグルコー
ス、1gのリン酸２ナトリウム、5gのポリペプトン、5gの
イーストエキス及び50mgのアンピシリンナトリウムを含
む液体培地。）など、菌体が成長する培地であれば、い
ずれの培地でも用いることができるが、DHFR−DSDGK多
量体の融合タンパク質（II）の生産にはYT−Ap培地が望
ましい。

本発明のプラスミドを含有する大腸菌を、培地に接種
し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養す
る。培養温度により菌体中のDHFR−DSDGK多量体の融合
タンパク質（II）の蓄積量が変動し、調べた限りでは、
培養温度が高いほど蓄積量が大であった。培養した菌体
は、4,700×ｇの遠心分離により集める。培地1Lから湿
重量２〜4gの菌体が得られる。集菌及びこれ以降の操作
は、特にことわらない限り、低温（０から10℃の間、４
℃が望ましい。）で行うのが好ましい。

ii）菌体の破砕 培養して得られた菌体を、培養液1Lにつき、10mの
割合で緩衝液１［0.1mMエチレンジアミン４酢酸２ナト
リウム（EDTA・Na2）及び14mM 2−メルカプトエタノー
ルを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）］に懸濁
し、フレンチプレスまたは超音波破砕機を用いて菌体を
破砕する。菌体破砕液を27,000×ｇで、20分間遠心分離
し、上清（以下無細胞抽出液という。）を得る。

iii）ストレプトマイシン処理 無細胞抽出液に対して1.5％（W/V）のストレプトマイ
シン硫酸をスターラーで攪拌しながらゆっくり加える。
20分間攪拌した後ストレプトマイシン処理した液を27,0
00×ｇで、20分間遠心分離し、上清を得る。

iv）硫安沈澱 上記の操作により得られた上清１容に対して0.8〜0.9
容の飽和硫酸アンモニウム液をスターラーで攪拌しなが
らゆっくり加える。20分間撹はんした後硫安沈澱処理し
た液を27,000×ｇで、20分間遠心分離し、上清を得る。

ｖ）MTX結合アフィニティクロマトグラフィー 上記の操作により得られた上清に、あらかじめ緩衝液
１で平衡化した25mのMTX結合アガロースゲル（ジグマ
社製）を加える。10分間放置しゲルに吸着させた後、ゲ
ルをカラムに詰める。カラムを緩衝液１、1M KClを含む
緩衝液１、1M KClを含む緩衝液２［0.1mMエチレンジア
ミン４酢酸２ナトリウム（EDTA・Na₂）、14mM 2−メル
カプトエタノールを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH
8.5）。］の順で洗う。DHFR−DSDGK多量体の融合タンパ
ク質（II）の溶出は、1MのKClと3mMの葉酸を含む緩衝液
１を2NのNaOHでpHを9.3に調整した溶液を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。分画した溶出液についてDHFR活性を測定し、酵
素活性が含まれる画分を集める。得られた溶液を、緩衝
液１に対して透析する。この段階で、純度90％以上のDH
FR−DSDGK多量体の融合タンパク質（II）が得られる。

以上の操作により、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパ
ク質（II）の精製を再現性良く行うことができる。

本発明に従うと、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク
質（II）の精製は、培養を含めて３日以内に行うことが
でき、回収率約80％で、均一なタンパク質標品を得るこ
とができる。

DHFR酵素活性の測定は、反応液［0.05mMのジヒドロ葉
酸、0.06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノール
を含む50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）。］1m
をキュベットにとり、これに試料を加え、25℃で340nm
の吸光度の時間変化を測定することにより行う。酵素活
性はユニットで表し、上記反応条件において、１分間に
１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵
素量を１ユニットとして定義する。この測定は、分光光
度計を用いて容易に行うことができる。

（４）得られたDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（I
I） 第３図は、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（I
I）の一例として、pBBK8DMに含まれるDHFR−DSDGK二量
体の融合タンパク質（II）をコード化する部分のDNA配
列とそれから作られるタンパク質のアミノ酸配列を示し
ている。DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）
は、172アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。ア
ミノ末端側から数えて、１から159番目までの配列が、
大腸菌の野生型DHFRに１箇所のアミノ酸置換が起こった
［Cys−152（wild）→Glu−152］配列であり、163番目
から172番目までがDSDGK二量体の融合タンパク質（II）
の配列である。160番目のイソロイシン（Ile）及び161
番目のロイシン（Leu）は、pMEK2のBamH I部位にDSDGK
二量体をコード化する遺伝子を導入する際に、遺伝子情
報の読み取り枠を合わせるために生じた配列である。16
2番目のアミノ酸、つまりDSDGK二量体の配列の直前のア
ミノ酸はメチオニン（Met）である。そのため、DHFR−D
SDGK二量体の融合タンパク質（II）をブロムシアン処理
することにより、DSDGK二量体を切り出すことができ
る。DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）の分子
量は、19,387である。

また、第４図はDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質
（II）の他の一例としてpBBK9TMに含まれるDHFR−DSDGK
三量体の融合タンパク質（II）をコード化する部分のDN
A配列とそれから作られるタンパク質のアミノ酸配列を
示している。DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（I
I）は177アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。ア
ミノ末端側から数えて１から172番目までの配列は、上
記のDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）と同一
であるが、DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）
はDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）のカルボ
キシル末端側にもう一つDSDGKが結合した構造となって
いる。DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）の分
子量は19,889である。

なお、DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）及
びDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）は、DHFR
のカルボキシ末端側に、介在アミノ酸を介してそれぞれ
DSDGK二量体及びDSDGK三量体が結合した構造をしている
にもかかわらず、DHFR酵素活性を有する。このため、大
腸菌がDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）やDHF
R−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）を多量につくる
と、DHFRの阻害剤であるトリメトプリムに対して耐性を
示すようになる。

（５）DSDGK多量体の製造工程 上記（４）のDHFR−DSDGK多量体の融合タンパク質（I
I）においてDSDGK多量体の直前のアミノ酸はメチオニン
（Met）である。そこでこのDHFR−DSDGK多量体の融合タ
ンパク質（II）をブロムシアンで化学処理すると、DHFR
−DSDGK多量体の融合タンパク質（II）からDSDGK多量体
が切り出される。その化学処理分解物をHPLCで精製する
ことで、DSDGK多量体を得る。

（６）DSDGKの製造工程 上記（５）で得たDSDGK多量体をトリプシンで処理す
るか、またはリジルエンドペプチダーゼで処理してDSDG
Kを得る。また、（４）で得たDHFR−DSDGK多量体の融合
タンパク質（II）にトリプシンを作用させ、その分解物
をHPLCで精製することにより、DSDGK多量体を経ること
なく直接DSDGKを得ることもできる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により詳細に説明する。

（実施例１） pBBK8DMの作製 DSDGK二量体をコード化するDNAとしては、 の２本の44ヌクレオチドからなるDNAをホスホアミダイ
ド法に従って化学合成機（ミリジェン社製、7500型）で
化学合成し、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（ア
プライド・バイオシステムズ社製）で精製後、DNAを約
0.02m（約0.1μｇのDNAを含んでいる。）ずつ取り、
これにカイネーション用反応液（50mM Tris−HCl pH7.
8、10mM MgCl₂、5mMジチオトレイトール、0.5mM ATP）
を180μｌとT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製1
0ユニット／μｌ）を１μｌ加え、37℃で30分間インキ
ュベートすることによって、５′末端をリン酸化した。
これを一旦80℃でインキュベートした後、徐々に冷却さ
せることにより、両DNAをアニールさせ、下記の二本鎖D
NAを得た（これを以下、DNA1と呼ぶ。）。

精製した約１μｇのpMEK2を20ユニットのBamH I（宝
酒造社製）及び20ユニットのXho I（宝酒造社製）で切
断した後、0.85％アガロースゲル電気泳動法により分離
した。約4.6キロ塩基対のDNA断片を含むゲルを切出し、
ゲルからDNAを回収した（これを以下、DNA2と呼
ぶ。）。BamH I及びXho IによるDNAの切断の操作は、
“Molecular Cloning:A Laboratory Manual"［T.Maniat
is,E.F.Fritsch,J.Sambrook,eds.Cold Spring Harbor L
aboratory（1982）。］に記載されている方法に従って
行った。全20μｌのDNA2に20μｌのリガーゼ用反応液
（10mM Tris−HCl pH7.4、5mM MgCl₂、10mMジチオトレ
イトール、5mM ATP）、10μｌのDNA1を加え、これに１
μｌのT4−DNAリガーゼ（宝酒造社製300ユニット／μ
ｌ）を加えて、室温で19時間DNAの連結反応を行わせ
た。この反応物を、形質転換法（trans formation meth
od、上記Maniatisらの文献に記載。）に従って、大腸菌
（宝酒造社製E.coli HB101コンピテントセル）に取り込
ませた。この処理をした菌体を、100mg/lのアンピシリ
ンナトリウム及び5mg/lのトリメトプリムを含む栄養寒
天培地（培地1L中に、2gのグルコース、1gのリン酸２カ
リウム、5gのイーストエキス、5gのポリペプトン、及び
15gの寒天を含む。）上に塗布し、37℃で24時間培養す
ることにより、数十個のコロニーを得ることができた。
これらのコロニーのうち６個を、2mのYT＋Ap培地（培
地1L中に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gのイーストエ
キス、及び100mgのアンピシリンナトリウムを含む。）
で37℃で、一晩菌体を培養した。培養液をそれぞれエッ
ペンドルフ遠心管（1.5m容）に取り、エッペンドルフ
社製遠心分離機（5414S型）を使用して12,000回転／分
で10分間遠心分離し、菌体を沈澱として集めた。これ
に、0.1mの電気泳動用サンプル調製液［0.0709MのTri
s−HCl pH6.8、２％（W/V）のラウリル硫酸ナトリウム
（SDS）、11％（V/V）のグリセリン、５％（V/V）の２
−メルカプトエタノール、及び0.045％（W/V）にブロム
フェノールブルーを含む。］を加え、菌体を懸濁し、こ
れを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶かした。この処理
をしたサンプルをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法［U.K.Laemmli;Nature,vol.227,p680（1970）。］
に従って分離した。分子量マーカーとしてラクトアルブ
ミン（分子量14,200）、トリプシンインヒビター（分子
量20,100）、トリプシノーゲン（分子量24,000）、カー
ボニックアンヒドラーゼ（分子量29,000）、グリセロア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子量36,00
0）、卵アルブミン（分子量45,000）、及び牛血清アル
ブミン（分子量66,000）の混合物（シグマ社製DALTON M
ARK VII−Ｌ）を使用し、アクリルアミド濃度から10か
ら20％である濃度勾配ゲル（第一化学社製）で泳動し
た。その結果、６個のコロニーのうち３個について、推
定される大きさのタンパク質が作られていることが明ら
かになった。このコロニーをYT＋Ap培地で培養し、Tana
kaとWaisblumの方法［T,Tanaka,B.Weisblum;J.Bacterio
logy vol.121,p.354（1975）。］に従って、プラスミド
を調製した。得られたプラスミドをpBBK8DMと名付け
た。pBBK8DMは、pMEK2のBamH IとXho I部位の間の配列
が合成DNAと置き換わった構造をしているはずである。
合成DNAには、制限酵素Xho Iで認識切断される配列、
５′−CTCGAG−３′、が含まれているので、Xho IでpBB
K8DMの切断を試みたところ、確かに切断された。また、
pBBK8DMのEcoR I（第１図の471−476番目の配列。）とS
al I（第１図の875−880番目の配列。）による切断によ
って得られる約400ヌクレオチド長のDNAについて、M13
ファージを用いたジデオキシ法［J.Messing;Methods in
Enzymology,vol.101,p20（1983）。］に従って、EcoR
IからSal Iの方向に塩基配列を決定した。その結果、第
１図に示すpBBK8DMの全塩基配列の471番目から875番目
までの配列が確かめられた。

また、pBBK8DMのBamH I−Xho I切断によって得られる
約4.6キロ塩基対のDNAは、EcoR I,Pst I,Hind III,Hpa
I,Pvu II,Bgl II,Cla I（以上は宝酒造社製）及びAat I
I（東洋紡社製）を用いた制限酵素による切断実験の結
果、pMEK2のBamH I−Xho I切断によって得られる約4.6
キロ塩基対のと全く同一であることが示された。

以上の結果から、pBBK8DMの全塩基配列を第１図に示
したとおり決定した。

（実施例２） pBBK8DMを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK二量体の融
合タンパク質（II） pBBK8DMを含有する大腸菌か作るDHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（II）のアミノ酸配列は、DHFR−DSDGK
二量体の融合タンパク質（II）遺伝子の塩基配列から予
想することができる。第１図の57番目から572番目まで
の配列がDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）を
コード化していることから、トリプレットコード表を用
いてアミノ酸配列を推定した。その結果、第３図に示す
アミノ酸配列が得られた。そして、pBBK8DMを含有する
大腸菌を用い、以下のようにして、DHFR−DSDGK二量体
の融合タンパク質（II）の分離精製及びその固定を行っ
た。

DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）の精製 A.用いた菌体量：湿重量13.3g/3L培養液 B.酵素精製工程：下記表１に示す（表におけるは無細
胞抽出液、はストレプトマイシン処理、は硫安沈
澱、及びはメソトリキセート結合アフィニティクロマ
トグラフィーを示す。

DHFR酵素活性の測定は、反応液［0.05mMのジヒドロ葉
酸、0.06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノー
ル、50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）］１をキ
ュベットにとり、これに試料を加え、25℃で340nmの吸
光度の時間変化を測定することにより行った。酵素活性
はユニットで表し、上記反応条件において、１分間に１
マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素
量を１ユニットとして定義した。

得られたDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）
をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（実施例１
に記載の方法。）により分析したところ、約22,000の単
一なタンパク質バンドが示され、得られたDHFR−DSDGK
二量体の融合タンパク質（II）標品が均一であることが
示された。

（実施例３） 精製分離したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（I
I）からのDSDGK二量体の分離 実施例２で得られた61mの精製均一化したDHFR−DSD
GK二量体の融合タンパク質（II）の溶液を限外濾過膜
（アミコン社製YM5径25mm）で濃縮し、緩衝液１で透析
し、5.5mのDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（I
I）濃縮液を得た。これは、26.8mg/mの濃度でDHFR−D
SDGK二量体の融合タンパク質（II）を含んでいた。この
DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）濃縮液100μ
ｌに0.1N塩酸に溶解したブロムシアン（50mg/m）180
μｌ、0.1N塩酸720μｌを加え、室温で一晩撹拌した。
反応後、少量の水を加え、その後凍結乾燥した。得られ
た標品を500μｌの0.1％トリフルオロ酢酸に溶かした。
そのうちの300μｌをとり、高速液体クロマトグラフィ
ー装置（日立655形）を用いYMC−ODS−５カラム（山村
化学社製 径4.6×250mm）で分離した。溶出は、0.1％
トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾配（０％
から10％）をかけることによって行った。０から５分ま
では、０％のアセトニトリルを用い、５分から35分まで
は、０％から10％のアセトニトリルの直線濃度勾配をか
けた。その結果、第５図に示すような溶出曲線が得られ
た。試料注入後約19分後のピーク画分を分離し、分離し
た溶出液に少量の水を加え凍結乾燥して溶媒を除き、ペ
プチドを得た。得られたペプチドを酸加水分解後、その
25分の１をアミノ酸分析に用いた。その結果、アスパラ
ギン酸が8.8n mole、セリン、グリシン、及びリジンが
それぞれ、4.4n moleずつ検出された。アミノ酸組成
は、DSDGK二量体のそれと一致した。この結果から、精
製均一化したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（I
I）をブロムシアン処理し、次いで高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて分離することにより収率約66％でDSDG
K二量体を回収できることが明らかになった。DHFR−DSD
GK二量体の融合タンパク質（II）の精製の収率が約57％
であり、DHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）か
らのDSDGK二量体の分離の収率が約66％であることか
ら、無細胞抽出液からのDSDGKの単離収率は約37％であ
ると計算された。

（実施例４） 分離精製したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（I
I）からの分離 実施例３で使用したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパ
ク質（II）濃縮液20μｌをエッペンドルフ遠心管（1.5m
容）に入れ、これにアセトン80μｌを加えた。そして
−20℃の冷凍庫中に30分間置き、DHFR−DSDGK二量体の
融合タンパク質（II）を沈澱させた。これをエッペンド
ルフ社製遠心分離機（5414S型）を使用して12,000回転
／分で２分間遠心分離して上清液を除き、10μｌの1Mト
リス−塩酸緩衝液（pH8.0）、90μｌの精製水、10μｌ
のTPCK−トリプシン（シグマ社製）を加え、37℃で一晩
インキュベートした。反応後、このうちの10μｌをと
り、高速液体クロマトグラフィー装置（日立655形）を
用い、YMC−ODS−５カラム（山村化学社製 径4.6×250
mm）で分離した。溶出は実施例３と同一の条件で行っ
た。その結果、試料注入後約９分後のところにDSDGKの
ピークが確認された。

（実施例５） pBBK9TMの作成 DSDGK三量体をコード化するDNAとしては、 の２本のDNAをホスホアミダイド法に従って化学合成機
（ミリジェン社製7500型）で化学合成し、オリゴヌクレ
オチド精製カートリッジ（アプライド・バイオシステム
ズ社製）で精製後、DNAを約0.1m（約0.1μｇのDNAを
含んでいる。）ずつ取り、これにカイネーション用反応
液（50mM Tris−HCl pH7.8、10mM MgCl₂、5mMジチオト
レイトール、0.5mM ATP）を180μｌとT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（宝酒造社製 10ユニット／μｌ）を１μｌ
加え、37℃で30分間インキュベートすることによって、
５′末端をリン酸化した。これを一旦80℃でインキュベ
ートした後、徐々に冷却させることにより、両DNAをア
ニールさせ、下記の二本鎖DNAを得た（これを以下、DNA
3と呼ぶ。）。

10μｌのDNA3に、20μｌのDNA1、20μｌのリガーゼ用
反応液、１μｌのT4−DNAリガーゼ（いずれも実施例１
に記載）を加えて室温で19時間DNAの連結反応を行っ
た。そして、実施例１記載の方法に従って大腸菌の形質
転換，形質転換体の培養、培養菌体を用いたSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行った。

その結果、２個のコロニーについて推定される大きさ
のタンパク質の産生が認められた。そこで、このうちの
１個のコロニーをYT＋Ap培地で培養し、前記TanakaとWe
isblumの方法に従ってプラスミドを調製した。得られた
プラスミドをpBBK9TMと名付けた。pBBK9TMは、pMEK2のB
amH IとXho I部位の間の配列が合成DNAと置き換わった
構造をしているはずである。合成DNAには、制限酵素Xho
Iで認識切断される配列、５′−CTCGAG−３′、が含ま
れているので、Xho IでpBBK9TMの切断を試みたところ、
確かに切断された。また、pBBK9TMのEcoR I（第２図の4
71−476番目の配列）とSal I（第２図の890−895番目の
配列）による切断によって得られる約400ヌクレオチド
長のDNAについて、M13ファージを用いたジデオキシ法に
従って、EcoR IからSal Iの方向に塩基配列を決定し
た。その結果、第２図に示すpBBK9TMの全塩基配列の471
番目から890番目までの配列が確められた。

また、pBBK9TMのBamH I−Xho I切断によって得られる
約4.6キロ塩基対のDNAは、EcoR I,Pst I,Hind III,Hpa
I,Pvu II,Bgl II,Cla I（以上は宝酒造社製）及びAat I
I（東洋紡社製）を用いた制限酵素による切断実験の結
果、pMEK2のBamH I−Xho I切断によって得られる約4.6
キロ塩基対のと全く同一であることが示された。

以上の結果から、pBBK9TMの全塩基配列を第２図に示
したとおり決定できた。

（実施例６） pBBK9TMを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK三量体の融
合タンパク質（II） pBBK9TMを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK三量体の
融合タンパク質（II）のアミノ酸配列は、DHFR−DSDGK
三量体の融合タンパク質（II）遺伝子の塩基配列から予
想することができる。第２図の57番目から587番目まで
の配列がDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）を
コード化していることから、トリプレット暗号表を用い
てアミノ酸配列を推定した。その結果、第４図に示すア
ミノ酸配列が得られた。そして、pBBK9TMを含有する大
腸菌を用い、以下のようにしてDHFR−DSDGK三量体の融
合タンパク質（II）の分離精製及びその固定を行った。

DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）の精製 A.用いた菌体量：湿重量13.1g/3L培養液 B.酵素精製工程：下記表２に示す（表におけるは無細
胞抽出液、はストレプトマイシン処理、は硫安沈
澱、及びはメソトリキセート結合アフィニティクロマ
トグラフィーを表し、酵素精製はの無細胞抽出液を順
次、、の精製工程に付すことにより行った。） DHFR酵素活性の測定方法及び活性の定義は実施例２に
従った。

得られたDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）
をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（実施例１
に記載の方法。）により分析したところ、約22,000の単
一なタンパク質バンドが示され、得られたDHFR−DSDGK
三量体の融合タンパク質（II）標品が均一であることが
示された。

（実施例７） 分離精製したDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（I
I）からのDSDGK二量体の分離 実施例６で得られた95mの精製したDHFR−DSDGK三量
体の融合タンパク質（II）の溶液を限外濾過膜（アミコ
ン社製YM5径25mm）を用いてで濃縮し、6.5mのDHFR−D
SDGK三量体の融合タンパク質（II）濃縮液を得た。これ
は、22.8mg/mの濃度でDHFR−DSDGK三量体の融合タン
パク質（II）を含んでいた。

このDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）濃縮
液100μｌに0.1N蟻酸に溶解したブロムシアン（50mg/m
）180μｌ、0.1N蟻酸720μｌを加え、室温で一晩撹拌
した。反応後、少量の水を加え、その後凍結乾燥した。
得られた標品を500μｌの0.1％トリフルオロ酢酸に溶か
した。そのうちの40μｌをとり、高速液体クロマトグラ
フィー装置（日立655形）を用い、YMC−ODS−５カラム
（山村化学社製 径4.6×250mm）で分離した。溶出は実
施例３と同一の条件で行った。その結果、第６図に示す
ような溶出曲線が得られた。試料注入後約31分後のピー
ク画分を分離し、分離した溶出液に少量の水を加え凍結
乾燥して溶媒を除きペプチドを得た。得られたペプチド
を酸加水分解後、その４分の１をアミノ酸分析に用い
た。その結果、アスパラギン酸が7.8n mole、セリン、
グリシン、及びリジンがそれぞれ3.9n moleずつ検出さ
れた。アミノ酸組成は、DSDGK三量体のそれと一致し
た。この結果から、精製したDHFR−DSDGK三量体のタン
パク質をブロムシアン処理し、次いで高速液体クロマト
グラフィーを用いて分離することにより収率約56％でDS
DGK三量体を回収できることがわかった。DHFR−DSDGK三
量体の融合タンパク質（II）の精製の収率が約40％であ
り、DHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）からのD
SDGK三量体の分離の収率が約56％であることから、無細
胞抽出液からのDSDGK三量体の収率は22％であると計算
される。

（実施例８） 分離精製したDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（I
I）からのDSDGKの分離 実施例７で使用したDHFR−DSDGK三量体の融合タンパ
ク質（II）濃縮液10μｌをエッペンドルフ遠心管（1.5m
容）に取り、これにアセトン40μｌを加えた。そして
−20℃の冷凍庫中に30分間置き、DHFR−DSDGK三量体の
融合タンパク質（II）を沈澱させた。

これをエッペンドルフ社製遠心分離機（5414S型）を
使用して12,000回転／分で２分間遠心分離して上清を除
き、沈澱に8M尿素を20μｌ加えて溶解させた。さらに80
μｌの0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）、10μｌの0.5
％トリプシン（Difco社製）を加え、37℃で一晩インキ
ュベートした。反応後、そのうちの20μｌをとり、高速
液体クロマトグラフィー装置（日立655形）を用いYMC−
ODS−５カラム（山村化学社製 径4.6×250mm）で分離
した。溶出は実施例３と同一の条件で行った。その結
果、試料注入後約９分後のところにDSDGKのピークが確
認された。

〔発明の効果〕

上記のように、本発明の新規組換えプラスミドは、DH
FR−DSDGK多量体の融合タンパク質（II）をコード化し
ているため、このプラスミドを有する大腸菌はDHFR−DS
DGK多量体の融合タンパク質（II）を可溶性の状態で大
量に生産蓄積する。さらに、産生されるDHFR−DSDGK多
量体の融合タンパク質（II）は、DHFR酵素活性を保持し
ており、精製を容易に行うことができる。本発明の精製
法に従うことにより、DHFR−DSDGK多量体の融合タンパ
ク質（II）の精製を迅速に効率よく行うことができる。
また、このようにして得られたDHFR−DSDGK多量体の融
合タンパク質（II）に直接トリプシンその他適当な酵素
を作用させるか、又はブロムシアン等の化学的切断によ
ってDSDGK多量体を切り出した後にトリプシンを作用さ
せ、高速液体クロマトグラフィーによってDTDGKを単離
精製することができる。精製されたDSDGKはアレルギー
性疾患の治療薬として有用である。従って、本発明によ
り、アレルギー性疾患の治療薬として有用なDSDGKを遺
伝子操作技術によって製造するための有利な手段が提供
できた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれpBBK8DM及びpBBK9TMの全
塩基配列を示した図であり、二本鎖DNAのうち遺伝情報
をコードしている片方のDNA鎖の塩基配列だけを、５′
末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は、
核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇ
はグアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、
pBBK8DM及びpBBK9TMにそれぞれ１箇所存在する制限酵素
Cla Iの認識切断部位、５′−ATCGATP−３′、の最初の
“A"を１番として教えた番号を示している。 第３図及び第４図は、それぞれpBBK8DM及びpBBK9TM中に
存在するDHFR−DSDGK二量体の融合タンパク質（II）及
びDHFR−DSDGK三量体の融合タンパク質（II）をコード
化する部分の塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列を
示す図である。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表
し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニン
を、Ｔはチミンを、Glyはグリシンを、Alaはアラニン
を、Valはバリンを、Leuはロイシンを、Ileはイソロイ
シンを、Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Cysはシ
ステインを、Metはメチオニンを、Aspはアスパラギン酸
を、Asnはアスパラギンを、Gluはグルタミン酸を、Gln
はグルタミンを、Argはアルギニンを、Lysはリジンを、
Hisはヒスチジンを、Pheはフェニルアラニンを、Tyrは
チロシンを、Trpはトリプトファンを、Proはプロリンを
示している。図中番号は、融合タンパク質（II）のアミ
ノ末端のアミノ酸であるメチオニンを１番として数えた
番号を示している。 第５図及び第６図は、それぞれDHFR−DSDGK二量体の融
合タンパク質（II）及びDHFR−DSDGK三量体の融合タン
パク質（II）をブロムシアンで処理し、逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィー装置で分離したときの
クロマトグラムを示している。横軸は時間を分単位で、
縦軸は220nmの吸光度を任意単位で表している。図中の
矢印はそれぞれDSDGK二量体及びDSDGK三量体が溶出され
る位置を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 19/00 7/06 Ｃ１２Ｎ 1/21 19/00 9/02 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 9/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/50 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (72)発明者 小原 和彦 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (72)発明者 高須賀 晶子 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (56)参考文献 特開 平１−316389（ＪＰ，Ａ)

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する（ジヒドロ葉
   酸還元酵素）−（アスパラギン酸−セリン−アスパラギ
   ン酸−グリシン−リジン）ｎの融合タンパク質（ｎは２
   から10）をコードする塩基配列を含む組換えプラスミ
   ド。
2. 【請求項２】前記融合タンパク質が（アスパラギン酸−
   セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジン）の二量体
   を含み、下記のアミノ酸配列を有するものである請求項
   １記載の組換えプラスミド。
3. 【請求項３】前記融合タンパク質をコードする塩基配列
   が下記の塩基配列である請求項２記載の組換えプラスミ
   ド。
4. 【請求項４】前記融合タンパク質が（アスパラギン酸−
   セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジン）の三量体
   を含み、下記のアミノ酸配列を有するものである請求項
   １記載の組換えプラスミド。
5. 【請求項５】前記融合タンパク質をコードする塩基配列
   が下記の塩基配列である請求項４記載の組換えプラスミ
   ド。
6. 【請求項６】組換えプラスミドが、大腸菌において安定
   に複製され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及
   びアンピシリン耐性を与え、かつ4658塩基対の大きさを
   有するものである請求項２記載の組換えプラスミド。
7. 【請求項７】組換えプラスミドが、大腸菌において安定
   に複製され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及
   びアンピシリン耐性を与え、かつ4673塩基対の大きさを
   有するものである請求項４記載の組換えプラスミド。
8. 【請求項８】組換えプラスミドが第１図の塩基配列を有
   する組換えプラスミドpBBK8DMである請求項２記載の組
   換えプラスミド。
9. 【請求項９】組換えプラスミドが第２図の塩基配列を有
   する組換えプラスミドpBBK9TMである請求項４記載の組
   換えプラスミド。
10. 【請求項１０】請求項１乃至９記載の組換えプラスミド
    により形質転換された大腸菌。
11. 【請求項１１】下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉
    酸還元酵素−カルボキシ末端にメチオニンを有する介在
    アミノ酸−抗アレルギー性ペンタペプチド二量体の融合
    タンパク質。
12. 【請求項１２】下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉
    酸還元酵素−カルボキシ末端にメチオニンを有する介在
    アミノ酸−抗アレルギー性ペンタペプチド三量体の融合
    タンパク質。
13. 【請求項１３】請求項10記載の大腸菌を培養し、培養菌
    体から請求項１記載の融合タンパク質を採取することを
    特徴とする該融合タンパク質の製造方法。
14. 【請求項１４】前記融合タンパク質の採取工程が、培養
    菌体の無細胞抽出液から、ストレプトマイシン処理、硫
    安沈澱、及びメソトリキセート結合アフィニティクロマ
    トグラフィーを順次用いて精製する工程を含むものであ
    る請求項13記載の製造方法。
15. 【請求項１５】請求項11又は請求項12記載のジヒドロ葉
    酸還元酵素−カルボキシ末端にメチオニンを有する介在
    アミノ酸−抗アレルギー性ペンタペプチド二量体の融合
    タンパク質又はジヒドロ葉酸還元酵素−カルボキシ末端
    にメチオニンを有する介在アミノ酸−抗アレルギー性ペ
    ンタペプチド三量体の融合タンパク質を酵素処理もしく
    は化学処理もしくはこれらの処理方法を併用することに
    より、アスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリ
    シン−リジンのアミノ酸配列からなる抗アレルギー性ペ
    ンタペプチドを採取することを特徴とするアスパラギン
    酸−セリン−アスパラギン酸−グリシン−リジンのアミ
    ノ酸配列からなる抗アレルギー性ペンタペプチドの製造
    方法。
16. 【請求項１６】酵素が、トリプシンである請求項15記載
    の製造方法。