KR950000301B1

KR950000301B1 - 진핵 밸러스트 부분(ballast portion)을 갖는 융합 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR950000301B1
Application number: KR1019860011010A
Authority: KR
Inventors: 하베르만 폴
Original assignee: 훽스트 아크티엔게젤샤프트; 하인리히 벡커, 베른하르트 벡
Priority date: 1985-12-21
Filing date: 1986-12-20
Publication date: 1995-01-13
Also published as: ATE78296T1; DK619186D0; JP2553058B2; JPS62167799A; NO865192D0; AU6676086A; IL81018A; EP0229998B1; ES2033678T3; FI93734C; EP0229998A3; IL81018A0; EP0229998A2; GR3005985T3; DK168823B1; IE863334L; IE58935B1; FI865187A; HUT44614A; JPH08187089A

Abstract

내용 없음.

Description

진핵 밸러스트 부분(ballast portion)을 갖는 융합 단백질의 제조방법

제 1a 도는 본 발명에 따른 절편 A 내지 F 및 절편 A 및 B의 배합의 개관이다. 출발물질은 플라스미드 p159/6로, 그의 제법이 EP-A 0,163,249에 상세히 기술되어 있고 이 문헌의 제5도에 정의되어 있다.

제 1b 도는 발현 플라스미드 pEW 1000로, 이의 제법이 독일연방공화국 특허원 제P3,541,856.7호에 기술되어 있고 제 1 도에 나타나 있다. 이 플라스미드를 적당한 이중 분해에 의해 폴리링커 서열에서 열개하면 선형 플라스미드(Ex1) 내지 (Ex4)가 생성된다.

제 1c 도는 pUC12유도체 pW226 및 발현 플라스미드 pW226-1의 작제를 나타내고 있으며, 둘다 폴리링커 서열에 의해 분리되는 절편 A 및 F를 함유한다.

제 1 도는 pUC12 유도체 pKH40 및 발현 플라스미드 pK40의 작제를 도시하고 있으며, 이들은 절편 A에 상응하는 단백질 서열, 즉 인터루킨-2(IL-2)의 처음 22개 아미노산에 이어 가교 요소 Thr-Arg 및 후속적으로 프로인슐린의 아미노산 서열이 뒤따르는 융합 단백질을 암호화한다.

제 2 도는 절편 A에 이어 폴리링커 서열(2) 및 (20a)에 상응하는 가교 요소 및 후속적으로 프로인슐린의 아미노산 서열이 뒤따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드 pSL11 및 발현 플라스미드 pSL12작제를 나타낸다.

제 3 도는 절편 A 및 B, 즉 IL-2의 처음 38개 아미노산에 이어 바로 프로인슐린의 아미노산 서열이 뒤따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 플라스미드 pK50의 작제를 나타낸다.

제 4 도는 절편 A 및 B에 이어 서열(42) 및 (41)에 상응하는 가교 요소가 뒤따르고, 프로인슐린의 아미노산 서열이 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 플라스미드 pK51의 작제를 나타낸다.

제 5 도는 MluI링커(51)를 삽입하여 pK51과는 다르며, 인자 Xa로 절단할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드 pK52의 작제를 나타낸다. pK52는 또한 pK50(제 3 도)을 MluI으로 절단하고 상기MluI링커를 혼입시켜 수득할 수 있다.

제 6 도는 마찬가지로 MluI링커를 혼입시켜 pK51(제 4 도)로부터 발현 플라스미드 pK53를 작제하는 것을 나타내고 있다.

제 7 도는 단편 C를 폴리링커에 혼입시켜 pSL12(제 2 도)로부터 발현 플라스미드 pSL14를 작제하는 것을 나타낸다. 이는 절편 C가 절편 A에 직접 연결되는 결과를 낳는다. 다음의 폴리링커에서 처음 2개의 아미노산(각각 Glu)는 IL-2의 아미노산 60 및 61에 상응한다. 따라서 IL-2 부분은 아미노산 1 내지 22 및 37 내지 61로 구성된다. 후속 아미노산 서열은 플라스미드 pSL12(제 2 도)가 암호화한 것에 상응한다.

제 8 도는 발현 플라스미드 pPH31의 작제를 나타내는 것으로 절편 A 내지 C에 이어 서열(81)로 표기되는 가교 요소가 뒤따르고 후속으로 프로인슐린의 아미노산 서열이 있는 융합 단백질을 암호화한다.

제 9 도는 절편 A 및 B 다음에 메티오닌 및 이어서 히루딘의 아미노산 서열이 있는 융합 단백질을 암호하하는 플라스미드 pK192의 작제를 나타낸다.

제 10 도는 절편 A 및 B에 이어 인자 Xa로 절단되는 아미노산 서열 및 후속으로 과립구/대식세포 콜로니촉진인자(CSF)의 아미노산 서열이 있는 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 pW214의 작제를 나타낸다.

제 11 도는 절편 A 및 C(IL-2의 아미노산 1 내지 22 및 37 내지 61에 해당)에 이어 가교 요소 Leu-Thr-Ile-Asp-Asp-PrO 및 후속으로 CSF의 아미노산 서열이 있는 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pW233의 작제를 나타낸다.

제 12 도는 하기 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pW234의 작제를 나타낸다 ; 절편 A(아미노산 1 내지 22)에 이어 가교 요소 Thr-Arg, 절편 D(IL-2의 아미노산 59 내지 96), 또 다른 가교 요소로서 Thr-Asp-Asp-Pro 및 최종적으로 CSF.

제 13 도는 플라스미드 pH200 및 pH201 및 발현 플라스미드 pH202의 작제를 나타낸다. 이들 플라스미드는 폴리링커가 절편 A 및 F 또는 A, B 및 F 사이에 있어 이들 다수의 절단부위에 외래 DNA를 클론시킬 수 있다. 이 플라스미드들은 특히 cDNA 서열의 클로닝에 적합하다.

기본적으로 인터루킨-2(IL-2)의 처음 100개 아미노산에 상응하는 C- 또는 N-종결 부분을 갖는 융합단백질이 이미 제안되었다(참조 : 독일연방공화국 특허원 제p3,541,856.7호). 여기에서의 인터루킨-2 부분은 포유류 인터루킨-2, 예를들면 유럽 공개특허공보(이후 "EP-A") 제0,091,539호에 기술된 마우스 또는 레트 인터루킨-2로부터 유래할 수도 있으나, 바람직하게는 사람 인터루킨-2로부터 유래한다. 이들 융합 단백질은 놀랍게도 숙주 세포에서 안정하며, 그들의 낮은 용해도로 인해 숙주에 고유한 가용성 단백질로부터 용이하게 분리할 수 있다.

이 발명 개념의 진보로, 놀랍게도 인터루킨-2 분자의 상당히 작은 부분이 이런 유형의 융합 단백질용 "밸러스트(ballast)" 부분으로서 적합하다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 본 발명은 특허청구의 범위에 정의되어 있다. 바람직한 태양이 다음에 상세히 설명되고 있다.

본원에서 참고로 인용된 EP-A0,163,249에 기술된 사람 인터루킨-2(이후 "IL-2")의 합성 유전자로부터 출발하는 것이 특히 유리하다. 이 합성 유전자는 IL-2를 암호화하는 DNA를 "조작 가능한" 절편으로 절단할 수 있는 다수의 독특한 제한 절단부위를 함유한다. 이들 절편을 사용하여 기본 원리에 의해 융합 단백질용 밸러스트 부분을 작제할 수 있으며, 수득한 융합 단백질의 용해도는 절편의 배합 및 목적 단백질의 특성에 따라 높거나 낮다.

따라서, 본 발명은 용해도가 가능한한 목적 생성물의 후처리에 유리하도록 해주는데, 예를들면 항체 컬럼을 사용한 크로마토그래피로 생성물을 정제할 경우에는 고용해도로, 또는 예비-정제시 숙주에 고용한 가용성 단백질을 예를들면 원심분리로 제거할 경우 저용해도로 유도할 수 있게 한다.

본 발명의 특별한 장점은 매우 작은 "밸러스트 부분"을 갖는 융합 단백질을 제조할 수 있다는 것이며, 이 결과 목적 단백질의 상대적 수율이 상당히 증가된다는 것이다.

본 발명의 또 다른 장점은 "벨러스트 부분"을 상기와 같이 구성하여 목적 단백질의 공간 구조를 가능한한 작게 하고 이로써, 예를들어 접힘을 방해하지 않는다는 것이다.

융합 단백질의 절단은 목적 단백질 뿐만 아니라 "밸러스트 부분", 즉 IL-2유도체를 생성시킨다. 이것은 IL-2활성이 있거나(T-세포증식시험)IL-2수용체와 결합한다. 본 발명에 따른 "기본원리"를 사용하여 IL-2의 생물학적 활성을 크게 또는 작게 갖는 IL-2유도체를 "부산물"로서 생성시킬 수 있다.

특히, 본 발명의 유리한 태양은 EP-A 0,163,249에 기술된 합성 유전자와 관련하여 이후에서 설명되고 있다. 이 유전자를 제한효소 EcoRI으로 5'말단 및 Sall으로 3'말단을 절단한다. 이 유전자의 작제시 사용한 효소 PstI, XbaI 및 SacI에 대한 세가지 독특한 제한 절단부위와는 별도로, MluI 및 PvuI에 대한 독특한 절단부위의 위치가 유리하게 이용된다. 이들 절단부위 사이에 위치한 서열을 A 내지 F로 표기하면, 합성 유전자는 하기와 같이 도식적으로 나타낼 수 있다 ;

(EcoRI)-A-PstI-B-MluI-C-XbaI-D-SacI-E-PvuI-F-(SalI)

따라서 절편 A 내지 F는 본 발명에 따른 기본 시스템을 위한 "단위로 특히 적합하다. 따라서, 이 표기에서 독일연방공화국 특허원 제P3,541,856,7호에 기술된 융합 단백질용 "벨러스트 부분"은 절편 A 내지 E에 해당되고 동일 출원에서 언급된 IL-2 유전자를 함유하는 이 작용성 단백질용 "밸러스트 부분"은 모든 절편 A 내지 F에 해당된다. 반면, 본 발명에 따른 유전자 작제물은 바람직하게는 이들 절편 4개 미만을 갖는 절편 A 내지 F의 배합에 관한 것으로, 절편 A는 융합 단백질의 N-종결 말단을 암호화한다. 다른 절편의 배열은 임의적이며 임의로 적당한 어댑터 또는 링커로 제조하여 사용한다. 적당한 어댑터 또는 링커 서열은 또한 "밸러스트 부분"의 C-종결 말단에 도입시킬 수 있으며, 이 경우 그들은 "밸러스트 부분"을 목적 단백질로부터 효소적 또는 화학적 분해를 허용하거나 촉진시키는 아미노산 또는 짧은 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 물론, 어댑터 또는 링커 서열을 사용하여 예를 들면 목적하는 용해도를 달성하기 위해 특정 융합 단백질용 "밸러스트 부분"을 작제할 수 있다. 이러한 맥락에서, 놀랍게도 융합 단백질의 용해도가 문자의 크기에 의존하지 않고, 오히려 상당히 작은 분자가 낮은 용해도를 가질수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서 실시예에 상세히 설명된 이런 관계에 대한 지식을 바탕으로 당분야 전문가는 커다란 실험적 노력없이 본 발명에 따라 소형 "랠러스트 부분"을 지니고 목적 특성을 갖는 융합 단백질을 수득할 수 있다.

따라서 목적 단백질이 진핵 단백질인 경우 본 발명에 따라 수득한 융합 단백질은 전부 또는 사실상 전부 진핵 단백질 서열로 이루어지게 된다. 그러나 놀랍게도 이들 융합 단백질이 원핵 숙주 세포에 의해 외래 단백질로 인식되지 않아 숙주에게 고유한 단백질 분해효소에 의해 신속히 분해되지 않는다. 이 분해는 단백질이 숙주와 다르고 박테리아에서 발현될 cDNA 서열에 의해서 암호화된 단백질인 경우에 특히 자주 발생한다. cDNA 서열은 이들이 본 발명에 따라 절편들중에 "삽입"된 경우 아주 효율적으로 발현될 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 이 목적을 위해 본 발명에 따른 서열 사이에 cDNA 서열용으로 수 개의 클로닝 부위를 갖는 폴리링커 서열을 함유하는 특정 벡터의 작제가 가능하다. 클론된 cDNA가 정지코돈을 함유하지 않도록 클로닝된 경우, cDNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열은 부가적으로 C-말단 절편을 암호화하는 폴리펩타이드에 의해 보호된다.

융합 단백질은 그 자체가 공지된 방법에 의해 화학적 또는 효소적으로 분해될 수 있다. 적당한 방법을 선택하는 것은 특히 목적 단백질의 아미노산 서열에 따라 달라진다. 예를 들면 후자가 메티오닌을 전혀 함유하지 않을 경우 연결요소를 Met으로 표시하는 것이 가능하고 시아노겐 클로라이드 또는 브로마이드를 사용한 화학적 분해를 수행할 수 있다. 연결요소의 카복실 종결 말단에 시스테인이 있거나, 또는 연결요소를 Cys으로 한 경우, 예를들면 특이적 S-시아닐화후 시스테인-특이적 효소 절단 또는 화학적 절단을 수행할 수 있다. 가교 요소의 카복실 종결 말단에 트립토판이 있거나, 또는 연결요소가 Trp인 경우, N-브로모석신이미드로 화학적 수행할 수 있다.

아미노산 서열에 Asp-Pro를 함유하지 않고 산에 충분히 밸러스트한 목적 단백질은 이 가교 요소를 지닌융합 단백질과 같이 자체 공지된 방법으로 단백질 분해적으로 절단한다. 이 결과 N-말단 프롤린 또는 C-말단 아스파르트산을 함유하는 단백질이 생성된다. 그러므로 또한 이런 방식으로 변형된 단백질을 합성하는 것이 가능하다.

Asp-Pro결합은 이 가교 요소가 (Asp)n-Pro 또는 Glu-(Asp)n-Pro (n은 1 내지 3임)일 경우 산에 더욱 유약할 수 있다.

마찬가지로, 효소적 절단의 예가 공지되어 있으며, 증진된 특이성의 변형된 효소를 사용하는 것도 가능하다[참조 : C.S.Craik et al., Science 228(1985) 291-297]. 목적하는 진핵 펩타이드가 프로인슐린인 경우 선택된 서열은 바람직하게는 트립신으로 분해할 수 있는 아미노산(Arg, Lys)이 프로인슐인의 N-말단 아미노산(Phe)에 결합된 펩타이드 서열, 예를들면 Ala-Ser-Met-Thr-Arg인데, 이는 단백질 분해효소트립신으로 아르기닌-특이적 절단을 수행할 수 있기 때문이다.

목적 단백질이 아미노산 서열 Ile-Glu-Gly-Arg을 함유하지 않으면 적당한 가교 요소가 있는 융합 단백질은 인자 Xa(EP-A 0,025,190 및 0,161,973) 로 절단할 수 있다.

융합 단백질은 그 자체가 공지된 방법에 의해 적합한 발현 시스템에서 발현시켜 수득한다. 모든 공지된 숙주-벡터 시스템 예를들어 포유류 세포 및 미생물, 그 중에서 효모 및 바람직하게는 박테리아, 특히 이콜라이가 이 목적에 적합하다.

목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 공지된 방향으로 선택된 발현 시스템내에서 만족스러운 발현을 나타내는 벡터로 혼입시킨다.

박테리아 숙주에서는 lac, tax, t게, 파아지 람다 (1)의 P₁또는 P_K, hsp, omp 또는 예를들면 독일연방공화국 공개특허공보 제3,430,683호(EP-A 0,173,148)에서 제안한 합성 프로모터로 이루어진 그룹중에서 프로모터 및 오퍼레이터를 선택하는 것이 유리하다. tac프로모터-오퍼레이터-서열이 바람직하며 현재 시판된다(예: 발현 벡터 pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology" 1984, p63).

본 발명에 따른 융합 단백질의 발현시, mRNA 수준에서의 어떠한 특정 염기-쌍형성을 방지하기 위해 ATG출발 코돈의 하류에서 처음 몇 개의 아미노산 각각의 삼연부(triplet)를 변형시키는 것이 유리하다. 이런 유형의 변형뿐만 아니라 IL-2단백질 부분에서의 각 아미노산의 변형, 결실 또는 첨가가 당분야 전문가에게 일상적인 것이며, 본 발명은 또한 이에 관한 것이다. 바람직하지 않은 이황화 결합 형성을 방지하기 위한 시스테인의 제거 또는 다른 아미노산으로 시스테인을 대체시키는 것이, 예를들면, 예로써 언급한 EP-A 109,748에 기술되어 있다.

도면 제 1 내지 13 도는 동일한 번호의 실시예에 기술한 합성방법을 흐름도(flow diagram)방식으로 설명하고 있다. 이해를 돕기 위해 출발물질 및 중간물질의 제법은 제 a 내지 c 도에서 서술하고 있다. 명확히할 목적으로 제 1 내지 13 도의 참조번호는 새로 십단위부터 시작하며 따라서 제 1 도에서는 (11)부터 시작한다. 본 출원과 무관한 출발물질의 참조번호는 0으로 끝냈으며, 따라서 예를들면 제 2 도에서는 (20)이 된다. 도면은 실제 척도에 따라 작도한 것이 아니며, 척도는 폴리링커 서열의 영역에서 적절하게 확대된다. IL-2서열은 굵은 선으로 나타냈고 목적 단백질의 구조 유전자는 다른 방법으로 강조하였다.

본 발명은 하기 실시예에서 상세히 설명되고 있으며 번호는 도면의 번호와 같다. 달리 설명이 없는 한 백분율은 중량 기준이다.

[실시예 A]

출발 플라스미드 p159/6이 EP-A 0,163,249(제 5 도)에 기술되어 있다. 거기에 "IL-2"로서 또는 본문중에 "DNA 서열 I"으로서 정의된 서열이 절편 A 내지 F로 나뉘어 제 1a 도에 있으며, 효소 EcoRI, PstI, MluI, XbaI, SacI, PvuI 및 SalI 의 절단부위로 둘러싸여 있다. 적절한 효소로 이중 분해하면 절편(A) 내지 (F) 또는 연결된 절편, 예를 들면 EcoRI 및 MluI의 경우 절편(A,B)가 산출된다.

[실시예 B]

발현 플라스미드, pEW1000의 제법이 독일연방공화국 특허원 제P3,541,856.7호(제 1 도)(미공개)에 제안되어 있다. 이 플라스미드는 EcoRI의 인식부위를 SalI 절단부위 함유의 합성서열에 삽입시킨 플라스미드 ptac 11[Amann et al., Gene 25(1983) 167-178]의 유도체이다. 이런 방법으로 발현 플라스미드 pKK177.3을 수득한다. lac억제인자[Farabaugh, Nature 274(1978) 765-769]의 삽입은 플라스미드 pJF118을 산출한다. 이것을 독특한 AvaI의 제한 절단부위에서 열개시키고 공지의 방법으로 엑소뉴클레아제 처리하여 1000bp정도 단축시켜서 연결한다. 효소 EcoRI 및 HindIII, SalI, PstI 또는 SmaI을 사용하여 이 플라스미드를 폴리링커에서 열개시키면 선형화된 발현 플라스미드 (Ex1), (Ex2), (Ex3) 및 (Ex4)가 수득된다.

[실시예 C]

시판용 플라스미드 pUC12를 EcoRI 및 SalI으로 열 개시키고, 선형화된 플라스미드(1)을 분리한다. (1)을 절편(A), 합성 링커 서열(2) 및 절편(F)와 연결하여 플라스미드 pW226(3)을 산출한다.

균주 이. 콜라이 79/02를 연결 혼합물중의 플라스미드 DNA로 공지의 방법으로 형질전환시킨다. 세포를 아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 5-브로모-4-클로로-3-인돌린-β-D-갈락토피라노시드(X-gal) 및 20㎍/㎖ 암피실린(Ap)을 함유하는 한천 평판상에 플레이팅한다. 백색 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 수득하고, 플라스미드(3)의 형성을 제한 분석 및 DNA 서열분석으로 확인한다.

작은 EcoRI-HindIII 단편(4)을 플라스미드(3)에서 절단하여 분리한다. 이 단편을 (스캔) DNA리가제 반응에 의해 선형 발현 플라스미드(Exl)과 연결한다. 생성된 플라스미드 pW226-1(5)의 특성을 제한 분석으로 확인한다.

균주 이.콜라이 Mc1061의 캄피턴트 세포를 플라스미드 pW226-1 DNA로 형질전환시킨다. 암피실린 내성인 클론을 Ap-함유 아가 평판상에서 분리한다. 플라스미드 DNA를 Mc1061 세포로부터 재분리하고 제한 분석으로 새로이 특성화한다. 이 .콜라이 균주 W3110의 캄피턴트 세포를 이.콜라이 Mc1061 세포로부터 분리한 플라스미드 DNA로 형질전환시킨다. 이.콜라이 W3110세포는 이후 항상 발현용으로 사용한다. 기술하는 실시예에서 모든 발현 실험은 하기 조건에 따라 수행한다.

플라스미드(5)를 함유하는 이.콜라이 세포의 밤새 배양물을 50㎍/㎖ 암피실린 함유 LB배지(J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)로 약 1:100비로 희석하고, 생장 상태를 OD로 측정한다. OD가 0.5일 때 배양물을 IPTG 1mM로 조정하고, 150 내지 180분 박테리아를 회전시켜 침전시킨다. 박테리아를 완충 혼합물(7M우레아, 0.1% SDS, 0.1M 인산나트륨, pH 7.0)중에서 5분동안 비등시키고, 샘플을 SDS겔 전기영동 플레이트에 적용한다. 전기영동후 플라스미드(5)를 함유하는 박테리아는 예상하는 단백질 크기(6KD)에 상응하는 단백질 밴드를 생성한다.

언급한 유도 조건은 진탕 배양에 적용시키는데, 대규모 발효시 OD값에 적당한 변경 및 경우에 따라 IPTG농도에 약간의 변경이 유리하다. 생성된 단백질은 IL-2-의존성 세포주(CTLL2)의 세포 증식 시험에서 생물학적 활성을 나타내지 않았다.

[실시예 1]

플라스미드(3)을 MluI 및 SalI으로 열개하고, 생성된 2개의 단편을 겔 전기영동으로 분리한다. 큰 단편(11)을 분리한다.

합성 올리고뉴클레오타이드(12)를 프로인슐린을 암호화하는 평활말단 DNA( 13)과 연결[참조 : Wetekam et al., Gene 19(1982) 179-183]하여 DNA 서열(14)를 생성한다. 후자를 MluI 및 SalI으로 절단하여 DNA 서열(15)를 수득한다. 후자를 단편(11)과 연결하여 플라스미드 pKH40(16)을 형성한다. 후자의 특성을 제한 분석으로 확인한다.

플라스미드(16)을 EcoRI 및 HindIII로 분해하고, 작은 단편(17)을 겔 전기영동으로 분리한다. 선형 발현 플라스미드(Exl)과 연결하여 발현 플라스미드 pK40(18)을 산출한다. 실시예 C에서 나타낸 바와 같이 발현시켜 세포파괴후 세포 단백질의 가용성 분획에서 볼 수 있는 단백질을 생성한다. 웨스턴 블럿(Westersn blot) 기술을 사용하여 프로인슐린 서열이 온전한지 확인한다.

[실시예 2]

출발물질은 독일연방공화국 특허원 제P3,541,856.7호(미공개), 제 3c 도에 설명된 플라스미드 pPH30이다. 본 발명의 의미내에서 제 2 도중 IL-2부분 서열은 "A-E"(20)으로 나타낸다. 이 서열의 말단 및 프로인슐린 서열 이하의 가교 요소가 제 2 도에 (20a)로서 나타나 있다.

플라스미드(20)을 PvuI 및 HindIII로 분해하고, 작은 단편(22)을 분리한다. 또한, 플라스미드(3)을 EcoRI 및 PvuI으로 열개하고, 작은 단편(22)을 분리한다. 또한 벡터 pUC12를 EcoRI 및 HindIII로 분해하고, 큰 단편(21)을 분리한다. 단편(21), (23) 및 (22)를 연결시켜 플라스미드 pSL11(24)를 수득한다.

플라스미드(24)를 HindIII로 및 EcoRI로 부분 분해하고, 절편 A 및 프로인슐린 유전자를 함유하는 단편(25)를 분리한다. 단편(25)를 선형 발현 플라스미드(Exl)에 연결하여 발현 플라스미드 pSL12(16)를 수득한다.

실시예 C에 기술한 바와 같이 발현시키고 후속적으로 후처리하여 가용성 융합 단백질을 수득한다. 인슐린 항체로 웨스턴 블랏 분석하여 이 단백질이 완전한 인슐린 서열을 함유하는지 확인한다.

[실시예 3]

플라스미드 ptrp ED 5-1(30)[참조 : Hallewll et al., Gene 9(180) 27-47]을 사용하여 프로인슐린 유전자를 증폭시킨다. 플라스미드를 HindIII 및 SalI으로 열 개시키고, 큰 단편(31)을 분리한다. 단편(31)을 DNA 서열(14)와 연결하여 플라스미드 pH106/4(32)를 수득한다.

플라스미드(32)를 SalI 및 MluI으로 분해하고 작은 단편(15)를 분리한다. 선형 발현 플라스미드(Ex2), 절편(A,B) 및 단편(15)를 연결하여 발현 플라스미드 pK50(33)을 수득한다.

암호화 융합 단백질 발현은 실시예 C에서 나타낸대로 수행한다. 세포를 배양 브로스로부터 회전 침전시키고 프렌치 프레스로 파괴한다. 단백질 현탄액을 원심분리하여 가용성 및 불용성 단백질 성분으로 분리한다. 두 분획을 공지의 방법으로 17.5% SDS폴리아크릴아마이드 겔상에서 겔 전기영동하고 후속적으로 단백질을 염료 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하여 분석한다. 놀랍게도 융합 단백질이 불용성 침전물에 위치함을 발견하였다. 인슐린 항체로 웨스턴 블랏 분석하여 온전한 프로인슐린이 융합 단백질에 존재하는지 확인한다.

프렌치 프레스 파괴로부터 침전물을 프로인슐린을 분리하는데 바로 사용할 수 있다.

출발물질은 독일연방공화국 특허일 제P3,541,856.7호 제 3c 도에 기술된 플라스미드 pPH20(40)이다. 이 플라스미드를 EcoRI으로 절단하고, 돌출 발단에 충전시키고 HindIII로 절단하여 단편(41)을 산출하는데, 여기에 관련된 (40)부분의 DNA 서열을 관찰할 수 있다.

선형 발현 플라스미드(Ex4)와 절편(A, B), 합성 올리고뉴클레오타이드(42) 및 단편(41)을 연결하여 플라스미드 pK51(43)을 수득한다.

[실시예 5]

선형 발현 플라스미드(Ex2)를 절편(A, B), 합성 올리고뉴클레오타이드(51) 및 DNA 서열(15)와 연결하여 플라스미드 pK52(52)를 수득한다. 올리고뉴클레오타이드(51)의 정확한 배향을 서열 분석으로 확인한다. 이 플라스미드는 올리고뉴클레오타이드(51)에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 융합 단백질을 암호화하여 활성화된 인자 Xa로 절단할 수 있다.

플라스미드(52) 또한 하기 방법으로 수득할 수 있다 : 플라스미드(33)을 MluI으로 부분 절단하고 생성된 열개시킨 플라스미드(53)을 DNA 서열(51)과 연결하여 플라스미드 pK52를 수득한다.

[실시예 6]

플라스미드(43)을 MluI으로 부분 절단하고 생성된 선형 플라스미드(61)을 합성 DNA 서열(51)과 연결하여 플라스미드 pK 53(62)을 수득한다. 후자는 활성화된 인자 Xa로 절단되는 융합 단백질을 암호화한다. 서열(51)의 정확한 배향을 실시예 5와 같이 DNA서열 분석으로 확인한다.

[실시예 7]

플라스미드(26) XbaI으로 절단하고 MluI으로 부분 절단하며 큰 단편(71)을 분리한다. 절편(C)와 연결하여 플라스미드 pSL14(72)를 수득한다. 발현 및 세포 파괴 이후 세포 단백질의 가용성 분획에서 융합 단백질이 발견된다.

[실시예 8]

플라스미드(20)을 XbaI 및 부분적으로는 EcoRI으로 절단하고, 돌출 말단에 채워 DNA 서열(81)을 수득한다. 평활말단 조건하에 연결시켜 플라스미드 pPH31(82)을 수득한다. 융합 단백질이 세포 단백질의 불용성 분획에서 발견된다.

[실시예 9]

사용한 출발물질은 EP-A 0,171,024(제 3 도)에 기술된 플라스미드(90)이다. 이 플라스미드를 SalI, 및 이어서 AccI과 반응시키고, 작은 단편(91)을 분리한다. 후자를 합성 올리고뉴클레오타이드(92)와 연결시켜 DNA 서열(93)을 수득한다. 후자를 MluI으로 절단하면 DNA 단편(94)가 된다.

플라스미드(33)을 MluI으로 부분 분해 및 SalI으로 분해하고 큰 단편(95)를 분리한다. 후자를 DNA 서열(94)와 연결하여 발현 플라스미드 pK192(96)으로 한다. 후자는 IL-2의 처음 38개 아미노산에 이어 메티오닌 및 히루딘의 아미노산 서열이 있는 융합 단백질을 암호화한다. 이 융합 단백질은 세포 단백질의 가용성 분획에서 발견된다.

[실시예 10]

사용한 출발물질은 EP-A 0,183,350에 기술된 플라스미드 pHG23(100)으로 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 ATCC 39000 하에 입수 가능하다. 이 플라스미드를 SfaNI으로 절단하고 돌출말단을 충전시키고, 이어서 PstI과 반응시키고 작은 단편(101)을 분리한다. 선형 발현 플라스미드(Ex3)을 절편(A, B), 합성 올리고뉴클레오타이드(102) 및 단편(101)고 연결하여 발현 플라스미드 pW214(103 )를 수득한다. 이 플라스미드는 IL-2의 처음 38개 아미노산에 이어 올리고뉴클레오타이드(102)로부터 유래된, 인자 Xa로 절단할 수 있는 서열 및 후속적으로 CSF의 아미노산 서열이 있는 융합 단백질을 암호화한다. 세포 파괴후 세포 단백질의 불용성 융합 단백질이 발견된다.

[실시예 11]

출발 플라스미드 pW216(110)은 독일연방공화국 특허원 제P3,545,568.3호(제 2b 도)에 기술되어 있다. 이 플라스미드에서 절편 A 내지 E에 상응하는 IL-2 서열(PvuI 절단부위)에 이어 아미노산 Asp-Asp-Pro를 암호화하는 링커 및 바로 뒤에 CSF의 아미노산 서열이 위치하고 있다. IL-2 및 CSF사이의 연결 서열은 융합 단백질을 단백질 분해적으로 절단할 수 있도록 한다.

서열(111)을 PvuI 및 HindIII로 절단하여 플라스미드(110)으로부터 분리한다.

플라스미드(3)을 MluI 및 XbaI으로 절단하고 큰 단편(112)를 분리한다. 후자를 절편(C)와 연결하여 플라스미드 pW227(113)를 수득한다. 이 플라스미드를 EcoRI 및 HindIII와 반응시키고 짧은 단편(114)를 분리한다. 이 단편을 선형 발현 플라스미드(Exl)과 연결할 경우 플라스미드 pW227-1(115)가 IL-2 활성은 없다.

플라스미드(113)을 EcoRI 및 PvuI으로 더 절단하고, 짧은 단편(116)을 분리한다. 선형 발현 플라스미드(Exl)을 단편(116) 및 (111)과 연결하여 발현 플라스미드 pW233(117)을 수득한다. 후자는 불용성 융합 단백질을 암호화하여 상술한 링커와 같은 이유로 단백질 분해적으로 절단할 수 있다.

[실시예 12]

플라스미드(3)을 XbaI 및 SacI으로 절단하고 큰 단편(112)를 분리한다. 절편(D)와 연결하여 플라스미드 pW228(122)을 수득한다. 후자를 EcoRI 및 HindIII로 절단하고 작은 단편(123)을 분리한다. 선형 발현 플라스미드(Exl)을 단편(123)과 발현 플라스미드 pW228-1(124)을 수득한다. 이 플라스미드는 생물학적으로 불활성인 IL-2유도체를 암호화한다. 이 플라스미드를 EcoRI 및 PvuI으로 분해하고 짧은 단편(125)을 분리한다. 선형 발현 플라스미드(Exl)을 단편(125) 및 (111)과 연결하여 발현 플라스미드 pW234(126)를 수득한다. 후자는 단백질 분해적으로 절단할 수 있으나 난용성인 융합 단백질을 암호화한다.

[실시예 13]

특히 cDNA 서열의 발현에 적합한 플라스미드를 작제하기 위해 우선 폴리링커 서열(131)을 합성한다. 선형 플라스미드(1)을 절편(A), 폴리링커 서열(131) 및 절편(F)와 연결하여 플라스미드 pH200(132)를 수득한다.

이 플라스미드(132)를 EcoRI 및 MluI과 반응시키고 큰 단편(133)을 분리한다. 후자를 절편(A, B)와 연결하여 플라스미드 pH201(134)를 수득한다. 플라스미드(134)를 EcoRI 및 HindIII과 반응시키고 짧은 단편(135)를 분리한다. 이 단편을 선형화한 발현 플라스미드(Exl)과 연결하여 발현 플라스미드 pH202(136)을 수득한다.

플라스미드 (136)을 BamHI으로 열개시키고 발현시킬 cDNA를 시판되는 BamHI 어뎁터를 통해 선형 플라스미드로 삽입한다. cDNA의 배향에 따라 매 세번째 서열이 판독 프레임에서(A,B)에 부착된다. cDNA 서열이 정지 코돈을 함유하지 않을 경우 이것이 암호화한 폴리펩타이드 서열은 절편(F)에 상응하는 아미노산 서열에 의해 부가적으로 보호된다.

cDNA가 정확한 판독 프레임중에 연결되지 않은 경우, 예를 들면 cDNA-함유(본래의 또는 복제된) 플라스미드를 MluI 또는 XbaI(cDNA가 이들 효소의 절단부위를 함유하지 않는한)으로 절단하고 클레나우 폴리머라제 반응으로 돌출 말단을 충전시켜 판독 프레임 시프트를 유발시킨다.

[별첨 a]

[별첨 b]

[별첨 c]

Claims

인터루킨-2(IL-2)의 22 내지 60개 아미노산에 상응하는 부분과 이러한 부분의 C- 또는 N-종결부에 위치하는 목적 단백질로서의 히루딘, 프로인슐린 또는 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자( CSF)로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 숙주 세포내에서 발현시킴을 특징으로 하여, 상기 융합 단백질을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 사람 IL-2의 아미노산 서열에 상응하는 방법.
제 2 항에 있어서, IL-2를 암호화하는 유전자가 DNA 서열 Ⅰ(별첨)의 일부를 함유하는 방법.
제 3 항에 있어서, IL-2부분을 암호화하는 유전자가 필수적으로 IL-2유전자

(EcoRI)-A-PstI-B-MluI-C-XbaI-D-SacI-E-PvuI-F-(SalI)의 절편 A내지 F중의 1, 2 또는 3개의 임의 서열로 이루어지고, 경우에 따라 어뎁터(adaptor) 또는 링커서열을 통해 연결되어 있는 방법.
제 1 항에 내지 제 4 항중에 어느 한 항에 있어서, IL-2 서열과 목적 단백질의 아미노산 서열 사이에, 목적 단백질을 IL-2부분으로부터 화학적으로 또는 효소적으로 절단해낼 수 있는 아미노산 또는 아미노산들이 위치하는 방법.
제 5 항에 있어서, 아미노산이 Met, Cys, Trp, Lys 또는 Arg이거나, 아미노산 서열이 C-종결 말단에 이들 아미노산을 함유하는 방법.
제 6 항에 있어서, 아미노산 서열이 Asp-Pro이거나 또는 C-종결 말단에 이 아미노산 서열을 함유하는 방법.
제 6 항에 있어서, 아미노산 서열이 Ile-Glu-Gly-Arg이거나 또는 C-종결 말단에 이 아미노산 서열을 함유하는 방법.
제 1 항에 있어서, 유전자를 발현 벡터에 삽입하고 박테리아 세포에서 발현시키는 방법.
제 9 항에 있어서, 사용된 박테리아 세포가 이.콜라이(E.coli)인 방법.
제 1 항에, 제조된 융합 단배질을 암호화 하는 유전자 구조물을, 선택된 발현 시스템내에서 만족할만한 발현을 보장해주는 벡터내로 삽입시킴을 특징으로 하여, 상기 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 재조합 플라스미드를 제조하는 방법.
제 11 항에 있어서, 재조합 플라스미드가 pW226, pW226-1, pK40, pSC12, pK50, pK51, pK52, pK53, pS214, pPH31, pK192, pW214, pW227, pW227-1, pW233, pW228, pW228-1, pW234, pH200, pH201 또는 pH202를 포함하는 방법.
제 11 항의 재조합 작제물로 숙주세포를 형질전환시킴을 특징으로 하여, 제 1항에 따른 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 형질전환 세포를 제조하는 방법.