JP2774260B2 - 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 - Google Patents
真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質Info
- Publication number
- JP2774260B2 JP2774260B2 JP7263310A JP26331095A JP2774260B2 JP 2774260 B2 JP2774260 B2 JP 2774260B2 JP 7263310 A JP7263310 A JP 7263310A JP 26331095 A JP26331095 A JP 26331095A JP 2774260 B2 JP2774260 B2 JP 2774260B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- sequence
- amino acid
- gene
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
‐２部分を含有する融合タン白質の遺伝子、それを含有
するベクターおよびそのベクターを含有する細胞に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】インターロイキン‐２の最初の１００個
のアミノ酸と実質的に一致するＣ‐又はＮ‐末端部分を
有する融合タンパク質は既に提案されている（西独特許
出願第Ｐ３，５４１，８５６．７号明細書）。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】これらのうちインターロイキン‐２部分は、
哺乳類インターロイキン‐２、例えば公開第０，０９
１，５３９号の欧州特許出願（以下、“ＥＰ‐Ａ”と略
する）明細書に開示されているマウス又はラットのイン
ターロイキン‐２に由来していてもよいが、ヒトインタ
ーロイキン‐２に由来していることが好ましい。これら
の融合タンパク質は驚くべきことに宿主細胞中で安定で
あって、しかもそれらの溶解性が低いため、宿主に固有
の可溶性タンパク質から容易に分離することができる。
この発明概念を更に発展させたものとして、インターロ
イキン‐２分子の著しく小さな部分がこのタイプの融合
タンパク質の“バラスト（ballast ）”部分として適し
ていることは、驚くべきことに今ここに見出されたので
ある。本発明は特許請求の範囲に規定されている。好ま
しい態様は以下詳細に説明されている。 【０００４】ＥＰ‐Ａ第０，１６３，２４９号明細書で
開示されかつ表中に記載されたヒトインターロイキン‐
２（以下、“ＩＬ‐２”と略する）の合成遺伝子から始
めることが特に好都合である。この合成遺伝子は、ＩＬ
‐２をコードするＤＮＡを分解して“扱いやすい（mana
geable）”セグメントにするためのいくつかの独特な制
限切断部位を有している。これらのセグメントを用い、
モジュラー原理（modular principle ）により融合タン
パク質のバラスト部分を調節するとができるが、得られ
る融合タンパク質の溶解性が高いか低いかは、セグメン
トの組合せと所望のタンパク質の性質とにかかってい
る。このように、本発明では、産物の可能な又は望まし
い生産のために最も有利となるように溶解性を調節する
ことができ、即ち産物がクロマトグラフィー、例えば抗
体カラムにより精製されるべき場合には高溶解性に、又
は予備精製として宿主に固有の可溶性タンパク質が例え
ば遠心分離によって除去されるべき場合には低溶解性に
調節することができる。 【０００５】本発明の特に有利な点は、非常に小さい
“バラスト部分”を有する融合タンパク質を生産するこ
とができることであって、それにより所望のタンパク質
の相対的収率が著しく増大するようになる。本発明のも
う一つの利点は、“バラスト部分”が、所望のタンパク
質の空間構造をできる限り阻害せず、その結果例えば折
り重なり（folding up）を阻害することのないような方
法で構成され得る、ということである。融合タンパク質
の切断により、所望のタンパク質ばかりではなく、所謂
ＩＬ‐２誘導体たる“バラスト部分”も得られる。これ
はＩＬ‐２活性（Ｔ‐細胞増殖試験）を有していても又
はＩＬ‐２レセプターに結合していてもよい。本発明の
“モジュラー原理”は、したがって、多かれ少なかれあ
る程度のＩＬ‐２生物活性を有するＩＬ‐２誘導体を
“副産物”として産生するためにも利用することができ
る。本発明の特に有利な点は、ＥＰ‐Ａ第０，１６３，
２４９号明細書に記載された合成遺伝子に関して以下に
説明されている。この遺伝子は、制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩにより５′未満で、ＳａｌＩにより３′未
満で切断される。このような遺伝子を構成するために使
用された酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ及びＳａｃＩ用の三つ
の独特な制限切断部位の他に、ＭｌｕＩ及びＰｖｕＩ用
の独特な切断部位が存在していることも好ましい。これ
ら切断部位間に存在する配列がＡ〜Ｆである場合には、
合成遺伝子は概略的に（ＥｃｏＲＩ）‐Ａ‐ＰｓｔＩ‐
Ｂ‐ＭｌｕＩ‐Ｃ‐ＸｂａＩ‐Ｄ‐ＳａｃＩ‐Ｅ‐Ｐｖ
ｕＩ‐Ｆ‐（ＳａｌＩ）で示される。 【０００６】セグメントＡ〜Ｆは、このように本発明の
モジュラー系にとって特に適切な“単位”である。上記
表示において、西独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．
７号明細書に記載された融合タンパク質についての“バ
ラスト部分”はセグメントＡ〜Ｅと一致し、同上出願に
記載された完全ＩＬ‐２遺伝子を含有する２官能性タン
パク質についての“バラスト部分”はすべてのセグメン
トＡ〜Ｆと一致する。一方、本発明の遺伝子構造は、セ
グメントＡ〜Ｆ、好ましくはこれらセグメントのうちの
４個未満のセグメントからなる別の組合せに関するもの
であるが、ここでセグメントＡは融合タンパク質のＮ‐
末端をコードしている。他のセグメント配列は任意的で
あって、場合により適切なアダプター又はリンカーが使
用される。適切なアダプター又はリンカー配列も“バラ
スト部分”のＣ‐末端に導入することができるが、この
場合において、それらは酵素的又は化学的に所望のタン
パク質からの“バラスト部分”の切除を可能ならしめ又
は促進させるようなアミノ酸又は短鎖アミノ酸配列をコ
ードすることができる。アダプター又はリンカー配列
は、特定の融合タンパク質についての“バラスト部分”
を調節するために、例えば所望の溶解性を達成するため
にも当然利用することができる。これと関連するが、融
合タンパク質の溶解性は分子の大きさとは無関係であ
り、逆に比較的小さな分子であっても低溶解性であるこ
とが驚くべきことに判明したのである。下記諸例中に詳
細に説明されているこれらの関連性から明らかなよう
に、当業者であればさほど実験上の労苦をすることがな
く、小さな“バラスト部分”を有しかつ特定の望ましい
性質を有する本発明の融合タンパク質を得ることができ
る。したがって、所望のタンパク質が真核細胞タンパク
質である場合には、本発明により得られる融合タンパク
質は全面的には又は事実上全面的に真核細胞タンパク質
配列からなる。しかしながら、驚くべきことに、タンパ
ク質は原核宿主細胞において外来タンパク質として認識
されないため、宿主に固有のプロテアーゼにより急速に
分解されることはない。このような分解は、宿主にとっ
て外来でありかつ細菌中で発現すべきｃＤＮＡ配列によ
ってコードされるタンパク質の場合に特に頻発する。ｃ
ＤＮＡ配列が本発明のセグメント中に“埋め込まれ”て
いる場合にこのｃＤＮＡ配列は極めて効果的に発現し得
ることが今ここに判明したのである。ｃＤＮＡ配列に関
していくつかのクローニング部位を有するポリリンカー
配列を本発明の配列中に含有する特定のベクターを上記
目的のために製造することができる。複製されたｃＤＮ
Ａが停止コードンを有していない場合には、ｃＤＮＡ配
列によりコードされるポリペプチド配列はＣ‐末端セグ
メントがコードするポリペプチドによって付加的に保護
される。 【０００７】融合タンパク質は化学的又は酵素的に自体
公知の方法により切断することができる。適切な方法を
いかに選択するかは、特に所望のタンパク質のアミノ酸
配列にかかっている。後者が例えばメチオニンを有して
いない場合には、結合要素はＭｅｔを表わすことがで
き、このときには塩化もしくは臭化シアンによる化学的
切断が行なわれる。結合要素のカルボキシル末端にシス
テインが存在する場合、即ち結合要素がＣｙｓを表わす
場合には、例えば特異的Ｓ‐シアニル化後にシスティン
特異性の酵素的切断又は化学的切断を行なうことができ
る。結合要素のカルボキシル末端にトリプトファンが存
在する場合、即ち結合要素がＴｒｐを表わす場合には、
Ｎ‐ブロモスクシンイミドによる化学的切断が行われ
る。自己のアミノ酸配列中にちＡｓｐ‐Ｐｒｏを有せ
ず、かつ酸に対して十分に安定である所望のタンパク質
は、融合タンパク質が上記結合要素を有する場合に、自
体公知の方法によってタンパク質分解により切断するこ
とができる。その結果、Ｎ‐末端にプロリンを有するか
又はＣ‐末端にアスパラギン酸を有するタンパク質が得
られる。したがって、この方法により改変タンパク質を
合成することもできる。この結合要素（Ａｓｐ）ｎ‐Ｐ
ｒｏ又はＧｌｕ‐（Ａｓｐ）ｎ‐Ｐｒｏであり、ｎが１
〜３を表わす場合には、Ａｓｐ‐Ｐｒｏ結合は酸に対す
る安定が低くなることがある。酵素的切断の例も同様に
公知であり、改善された特異性をもつ改変酵素を使用す
ることもできる〔C.S. Craik et al., Science 228(198
5)291-297 参照〕。所望の真核細胞ペプチドがプロイン
シュリンである場合に選択される配列は、トリプシンに
よる切断が可能なアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）がプロイ
ンシュリンのＮ‐末端アミノ酸（Ｐｈｅ）結合している
ペプチド配列、例えばＡｌａ‐Ｓｅｒ‐Ｍｅｔ‐Ｔｈｒ
‐Ａｒｇであることが有利であるが、その理由はこの場
合においてアルギニン特異的切断がトリプシンプロテア
ーゼによって行ない得るからである。 所望のタンパク質がアミノ酸配列： Ｉｌｅ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ を有していない場合には、適切な結合要素を有する融合
タンパク質はＸａ因子により切断することができる（Ｅ
Ｐ‐Ａ第０，０２５，１９０号及び第０，１６１，９７
３号明細書）。融合タンパク質は、自体公知の方法によ
り適切な発現系で発現させることによって得られる。す
べての公知の宿主‐ベクター系、即ち、例えば哺乳類細
胞及び、酵母、好ましくは細菌、特に大腸菌等の微生物
はかかる目的のために適している。 【０００８】所望のタンパク質についてコードするＤＮ
Ａ配列は、選択された発現系での満足すべき発現を確実
化するベクター中に公知の方法で組込まれる。細菌宿主
においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ファージλのＰ
L もしくはＰR 、ｈｓｐ、ｏｍｐ又は例えば西独特許公
開第３，４３０，６８３号（ＥＰ‐Ａ第０，１７３，１
４９号）明細書で開示されているような合成プロモータ
ーからなる群よりプロモーター及びオペレーターを選択
することが有利である。ｔａｃプロモーター‐オペレー
ター配列が有利であり、現在市販されている〔例えば、
発現ベクターｐＫＫ２２３‐３、ファルマシア（Pharma
cia ）、“Molecular Biologicals,Chemicals and Equi
pment for Molecular Biology ”１９８４年、第６３
頁〕。本発明による融合タンパク質の発現に際し、ｍＲ
ＮＡレベルでの塩基の対合を阻止するために、ＡＴＧ開
始コードン下流の最初の数個のアミノ酸に関して個々の
トリプレットを改変することが有利のようである。この
タイプの改変は、ＩＬ‐２タンパク質部分における個々
のアミノ酸の改変、削除又は付加と同様に、当業者にと
って周知であり、本発明は同様にそれらにも関する。望
ましくないジスルフィド結合の形成を防止するためのシ
スティンの削除又は他のアミノ酸によるシスティンの置
換は、例えばＥＰ‐Ａ第１０９，７４８号明細書に開示
されているように、例示として述べられている。図１〜
１６は、同一番号の例中に記載された合成方法を工程図
により説明するものである。理解を容易化させるため
に、出発物質及び中間体の製造法は図１４〜１６（Ａ〜
Ｃ）に示されている。明確化のため、第１〜１３図の参
照番号はそれぞれ別の新しい１０位から始まり、第１図
では(11)から始まる。本発明では言及していない出発物
質の参照番号は０で終わり、したがって例えば第２図で
は(20)となる。図は縮尺通りでは描かれておらず、特に
尺度はポリリンカー配列領域において適度に拡大されて
いる。ＩＬ‐２配列は太線で示されており、所望のタン
パク質についての構造遺伝子は他の方法で強調されてい
る。 【０００９】 【実施例】本発明は下記諸例中で詳細に説明されてお
り、その例の番号は図の番号と一致する。他に記載のな
い限り、％は重量に関する。 例Ａ（図１４（Ａ）参照） 出発プラスミドｐ１５９／６はＥＰ‐Ａ第０，１６３，
２４９号明細書（第５図）に記載されている。そこで
“ＩＬ‐２”として又は本明細書中“ＤＮＡ配列Ｉ”と
して記載されている配列は、酵素ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＸｂａＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩ及びＳａ
ｌＩの切断部位を介して結合したセグメントＡ〜Ｆとし
て第１４Ａ図では分けられている。適切な酵素で二重切
断すると、セグメント(A) 〜(F) 又は隣接セグメントが
得られ、例えばＥｃｏＲＩ及びＭｌｕＩによるとセグメ
ント(A,B) が得られる。 【００１０】例Ｂ（図１５（Ｂ）参照） 発現プラスミドｐＥＷ１０００の製造法は（公開前の）
西独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．５号明細書（第
１図）に開示されている。このプラスミドはプラスミド
ｐｔａｃ１１〔Amann et al., Gene 25(1983)167-178〕
の誘導体であり、そのＥｃｏＲＩ認識部位にＳａｌＩ切
断部位含有合成配列が組込まれたものである。このよう
にして発現プラスミドｐＫＫ１７７．３が得られる。ｌ
ａｃリプレッサー〔Farabaugh, Nature 274(1978)765-7
69〕の挿入によりプラスミドｐＪＦ１１８が得られる。
これをＡｖａＩの唯一の制限切断部位で開環し、公知の
方法でエキソヌクレアーゼ処理して約１０００ｂｐ短縮
して、結合させる。それによってプラスミドｐＥＷ１０
００を得る。酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ III、Ｓａｌ
Ｉ、ＰｓｔＩもしくはＳｍａＩによりポリリンカー中で
このプラスミドを開環し、直鎖発現プラスミド(Ex1) 、
(Ex2) 、(Ex3）及び(Ex4）を得る。 【００１１】例Ｃ（図１６（Ｃ）参照） 市販プラスミドｐＵＣ１２をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで
開環し、直鎖プラスミド(1) を分離する。(1) をセグメ
ント(A) 、合成リンカー配列(2) 及びセグメント(F) と
結合して、プラスミドｐＷ２２６(3) を得る。大腸菌７
９／０２株を公知の方法により結合混合体由来プラスミ
ドＤＮＡで形質転換する。細胞をイソプロピル‐β‐Ｄ
‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、５‐ブロモ‐
４‐クロロ‐３‐インドリル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノ
シド（Ｘ‐ｇａｌ）及びアンピシリン（Ａｐ）２０μｇ
／ml含有寒天プレート上で培養する。プラスミドＤＮＡ
を白色クローンから得、プラスミド(3) の形成を制限分
析及びＤＮＡ配列分析により確認する。小さなＥｃｏＲ
Ｉ‐Ｈｉｎｄ IIIフラグメント(4）をプラスミド(3) か
ら切断し、分離する。このフラグメントをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ反応により直鎖発現プラスミド(Ex1) と結合す
る。得たプラスミドｐＷ２２６‐１(5) を制限分析によ
り確認する。大腸菌Ｍｃ１０６１株のコンピテント細胞
をプラスミドｐＷ２２６‐１由来ＤＮＡで形質転換す
る。アンピシリン耐性クローンをＡｐ含有寒天プレート
上で分離する。プラスミドＤＮＡをＭｃ１０６１細胞か
ら再分離し、しかる後制限分析により再度確認する。大
腸菌Ｗ３１１０株コンピテント細胞を大腸菌Ｍｃ１０６
１細胞から分離したプラスミドＤＮＡで形質転換する。
大腸菌Ｗ３１１０細胞を以後常に発現用として使用す
る。以後の諸例中でのすべての発現実験は下記条件で行
なわれる。プラスミド(5) 含有大腸菌細胞の一夜培養物
をアンピシリン５０μｇ／ml含有ＬＢ培地〔J.H.Mille
r, Experments in Molecular Genetics, Cold Spring H
arbor Laboratory, 1972 〕で約１：１００の比に希釈
し、増殖を吸光度測定により追跡する。吸光度が０．５
のときに培養物をＩＰＴＧ中１ｍＭに調整し、１５０〜
１８０分間後細菌を沈降させる。細菌を５分間混合緩衝
液（７Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．０）中で沸騰させ、試料をＳＤＳゲル電
気泳動プレートに塗布する。電気泳動後、プラスミド
(5) 含有細菌は予期されたタンパク質の大きさ（６Ｋ
Ｄ）に相当するタンパク質バンドを生じる。以上の誘導
条件は、培養物を振盪する場合に妥当する。大規模発酵
の場合では、吸光度を適度に変更しかつ適切であればＩ
ＰＴＧ濃度をわずかに変更することが有利である。得ら
れたタンパク質はＩＬ‐２依存細胞系（ＣＴＬＬ２）で
の細胞増殖試験において生物活性を示されない。 【００１２】例 １ プラスミド(3) をＭｌｕＩ及びＳａｌＩで開環し、得ら
れた二つのフラグメントをゲル電気泳動により分離す
る。大きなフラグメント(11)を分離する。合成オリゴヌ
クレオチド(12)をプロインシュリンをコードするブラン
ト末端ＤＮＡ(13)〔Wetekam et al., Gene 19(1982) 17
9-183 〕と結合して、ＤＮＡ配列(14)を得る。後者をＭ
ｌｕＩ及びＳａｌＩで切断し、これによりＤＮＡ配列(1
5)を得る。後者をフラグメント(11)と結合して、プラス
ミドｐＫＨ４０(16)を形成する。後者を制限分析により
確認する。プラスミド(16)をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ I
IIで消化し、小さなフラグメント(17)をゲル電気泳動に
より分離する。直鎖状とした発現プラスミド(Ex1) と結
合して、発現プラスミドｐＫ４０(18)を得る。例Ｃで示
す発現により、細胞破壊後の細胞性タンパク質の可溶性
画分に存在するタンパク質を得る。プロインシュリン配
列が完全であることを証明するために、ウェスターンブ
ロット法を利用する。 【００１３】例 ２ 出発物質はプラスミドｐＰＨ３０であるが、これは（未
公開の）西独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．７号明
細書中の第３ｃ図に示されている。本発明での意味の範
囲内において、第２図のＩＬ‐２部分配列は“Ａ‐Ｅ”
(20)として示されている。この配列の末端から結合要素
及びプロインシュリン配列までは第２図中(20a）として
示されている。プラスミド(20)をＰｖｕＩ及びＨｉｎｄ
IIIで消化し、小さなフラグメント(22)を分離する。更
に、プラスミド(3) をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで開環
し、小さなフラグメント(23)を分離する。しかもベクタ
ーｐＵＣ１２をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断し、
大きなフラグメント(21)を分離する。フラグメント(2
1)、(23)及び(22)を結合して、プラスミドｐＳＬ１１(2
4)を得る。プラスミド(24)をＨｉｎｄ IIIで及び部分的
に ＥｃｏＲＩで切断し、セグメントＡ及びプロインシ
ュリン遺伝子含有フラグメント(25)を分離する。(25)を
直鎖状とした発現プラスミド(Ex1) に結合して、発現プ
ラスミドｐＳＬ１２(26)を得る。例Ｃで示される発現及
びその後の操作により、可溶性融合タンパク質を得る。
インシュリン抗体でのウェスターンブロット分析によ
り、このタンパク質が完全なインシュリン配列を有して
いることを確認する。 【００１４】例 ３ プラスミドｐｔｒｐＥＤ５‐１(30)〔Hallewell et a
l., Gene 9(1980)27-47〕をプロインシュリン遺伝子の
増幅用に使用する。プラスミドをＨｉｎｄ III及びＳａ
ｌＩで開環して、大きなフラグメント(31)を分離する。
フラグメント(31)をＤＮＡ配列(14)と結合して、プラス
ミド ｐＨ１０６／４(32)を得る。プラスミド(32)をＳ
ａｌＩ及びＭｌｕＩで消化して、小さなフラグメント(1
5)を分離する。直鎖状とした発現プラスミド(Ex2) 、セ
グメント(A,B）及びフラグメント(15)を結合して、発現
プラスミドｐＫ５０(33)を得る。コードされた融合タン
パク質の発現を例Ｃで示したように行なう。細胞を培養
ブイヨン中から沈降させ、フレンチプレス（French pre
ss）で破壊する。タンパク質懸濁物を遠心分離し、その
可溶性及び不溶性の両タンパク質成分に分離する。二つ
の画分を公知の方法で１７．５％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルのゲル電気泳動に付し、しかる後タンパク質を
クマシー（Coomassie ）ブルー染料で染色することによ
り分析する。驚くべきことに、融合タンパク質は不溶性
沈降物中に存在していることが判明した。インシュリン
抗体でのウェスターンブロット法分析により、完全プロ
インシュリンが融合タンパク質中に存在していることを
確認する。フレンチプレス破壊による沈降物は更にプロ
インシュリン分離用として直ちに使用することができ
る。 【００１５】例 ４ 出発物質はプラスミドｐＰＨ２０(40)であり、これは西
独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．７号明細書の第３
ｃ図に記載されている。このプラスミドをＥｃｏＲＩで
切断し、突出端を埋填し、Ｈｉｎｄ IIIで切断してフラ
グメント(41)を得るが、そこには本発明において重要な
(40)の一部のＤＮＡ配列が存在している。直鎖状とした
発現プラスミド(Ex4）をセグメント(A,B) 、合成オリゴ
ヌクレオチド(42)及びフラグメント(41)と結合して、プ
ラスミドｐＫ５１(43)を得る。 【００１６】例 ５ 直鎖状にした発現プラスミド(Ex2) をセグメント(A,B)
、合成オリゴヌクレオチド(51)及びＤＮＡ配列(15)と
結合して、プラスミドｐＫ５２(52)を得る。オリゴヌク
レオチド(51)の正確な配向性を配列分析により確認す
る。このプラスミドは、オリゴヌクレオチド(51)に対向
するアミノ酸配列を含有する融合タンパク質をコードし
ており、このため活性因子Ｘａで切断することができ
る。プラスミド(52)は、下記方法によっても得ることが
できる。プラスミド(33)をＭｌｕＩで部分的に切断し、
得られた開環プラスミド(53)をＤＮＡ配列(51)と結合し
て、同様にプラスミドｐＫ５２を得る。 【００１７】例 ６ プラスミド(43)をＭｌｕＩで部分的に切断し、得られた
直鎖状プラスミド(61)を合成ＤＮＡ配列(51)と結合し
て、プラスミドｐＫ５３(62)を得る。後者は、活性因子
Ｘａで切断することができる融合タンパク質を同様にコ
ードしている。配列(51)の正確な配向性を例５のように
ＤＮＡ配列分析により確認する。 【００１８】例 ７ プラスミド(26)をＸｂａＩで及び部分的にＭｌｕＩで切
断して、大きなフラグメント(71)を分離する。セグメン
ト(C) と結合させてプラスミドｐＳＬ１４(72)を得る。
発現及び細胞破壊後、融合タンパク質は細胞性タンパク
質の可溶性画分中に存在する。 【００１９】例 ８ プラスミド(20)をＸｂａＩで部分的に及びＥｃｏＲＩで
切断し、突出端を埋填して、ＤＮＡ配列(81)を得る。ブ
ラント末端条件下で結合させてプラスミドｐＰＨ３１(8
2)を得る。融合タンパク質は、細胞性タンパク質の不溶
性画分中に存在する。 【００２０】例 ９ 使用する出発物質はＥＰ‐Ａ第０，１７１，０２４号明
細書（第３図）に記載されたプラスミド(90)である。こ
のプラスミドをＳａｌＩしかる後ＡｃｃＩと反応させ
て、小さなフラグメント(91)を分離する。後者を合成オ
リゴヌクレオチド(92)と結合して、ＤＮＡ配列(93)を得
る。後者をＭｌｕＩで切断して、ＤＮＡフラグメント(9
4)を得る。プラスミド(33)をＭｌｕＩで部分的に及びＳ
ａｌＩで消化して、大きなフラグメント(95)を分離す
る。後者をＤＮＡ配列(94)と結合して、発現プラスミド
ｐＫ１９２(96)を得る。後者は、ＩＬ‐２の最初の３８
個のアミノ酸の後にメチオニン次いでヒルジンアミノ酸
配列が続く融合タンパク質をコードするものである。融
合タンパク質は、細胞性タンパク質の可溶性画分中に存
在する。 【００２１】例１０ 使用する出発物質はプラスミドｐＨＧ２３(100）であ
り、これはＥＰ‐Ａ第０，１８３，３５０号明細書に記
載されており、アメリカン・タイプ・カルチァー・コレ
クション（American Type Culture Collection）の寄託
番号ＡＴＣＣ３９０００号として一般的に入手できる。
このプラスミドをＳｆａＮＩで切断し、突出端を埋填
し、しかる後ＰｓｔＩとの反応を行ない、小さなフラグ
メント(101)を分離する。直鎖状発現プラスミド(Ex3)
をセグメント(A,B) 、合成オリゴヌクレオチド(102) 及
びフラグメント(101) と結合して、発現プラスミドｐＷ
２１４(103) を得る。このプラスミドは、ＩＬ‐２の最
初の３８個のアミノ酸の後に、オリゴヌクレオチド(10
2) 由来であってかつＸａ因子で分子を切断させ得る配
列、次いでＣＳＦアミノ酸配列が続く融合タンパク質を
コードするものである。細胞破壊後、融合タンパク質は
細胞性タンパク質の不溶性画分中に存在する。 【００２２】例１１ 出発物質ｐＷ２１６(110) は、西独特許出願第Ｐ３，５
４５，５６８．３号明細書（第２ｂ図）に開示されてい
る。このプラスミドでは、セグメントＡ〜Ｅ（ＰｖｕＩ
切断部位）に相当するＩＬ‐２配列の後に、アミノ酸Ａ
ｓｐ‐Ａｓｐ‐Ｐｒｏをコードするリンカー、すぐその
後にＣＳＦアミノ酸配列、が続いている。ＩＬ‐２及び
ＣＳＦ間の結合配列により、融合タンパク質をタンパク
質分解によって切断することができる。配列(111) を、
ＰｖｕＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断することにより、プラ
スミド(110) から分離する。プラスミド(3) をＭｌｕＩ
及びＸｂａＩで切断して、大きなフラグメント(112) を
分離する。後者をセグメント(C) と結合して、プラスミ
ドｐＷ２２７(113)を得る。このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄ IIIと反応させ、短鎖フラグメント(11
4) を分離する。このフラグメントが直鎖状発現プラス
ミド(Ex1) と結合している場合には、プラスミドｐＷ２
２７‐１(115) が得られる。プラスミドは、ＩＬ‐２由
来ではあるもののＩＬ‐２活性を有していていないタン
パク質をコードするものである。プラスミド(113) を更
にＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで切断し、短鎖フラグメント
(116) を分離する。直鎖状発現フラグメント(Ex1）をフ
ラグメント(116）及び(111) と結合して、発現プラスミ
ドｐＷ２３３(117) を得る。後者は不溶性融合タンパク
質をコードしているが、この融合タンパク質は上記リン
カーの存在によりタンパク質分解によって切断すること
ができる。 【００２３】例１２ プラスミド(3) をＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断し、大き
なフラグメント(121)を単離する。セグメント(D) と結
合させてプラスミドｐＷ２２８(122) を得る。後者をＥ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断して、小さなフラグメ
ント(123) を分離する。直鎖状発現プラスミド(Ex1) を
フラグメント(123) と結合させて発現プラスミドｐＷ２
２８‐１(124) を得る。このプラスミドは生物学的に不
活性のＩＬ‐２誘導体をコードしている。プラスミドを
ＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで消化して、短鎖フラグメント
(125) を分離する。直鎖状発現プラスミド(Ex1) をフラ
グメント(125) および(111) と結合させて、発現プラス
ミドｐＷ２３４(126) を得る。後者は難溶性融合タンパ
ク質をコードしており、この融合タンパク質も同様にタ
ンパク質分解によって切断することができる。 【００２４】例１３ 適切なプラスミドの製造のために、特にｃＤＮＡ配列の
発現のために、まずポリリンカー配列(131) を合成す
る。直鎖状プラスミド(1) をセグメント(A) 、ポリリン
カー配列(131) 及びセグメント(F) と結合させて、プラ
スミドｐＨ２００(132) を得る。プラスミド(132) をＥ
ｃｏＲＩ及びＭｌｕＩと反応させて、大きなフラグメン
ト(133) を分離する。後者をセグメント(A,B) と結合し
て、プラスミドｐＨ２０１(134) を得る。プラスミド(1
34) をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIと反応させ、短鎖フ
ラグメント(135) を分離する。このフラグメントを直鎖
発現プラスミド(Ex1) と結合し、発現プラスミドｐＨ２
０２(136) を得る。プラスミド(136) をＢａｍＨＩで閉
環し、発現すべきｃＤＮＡを直鎖プラスミド中に市販Ｂ
ａｍＨＩアダプターを介して組込む。ｃＤＮＡの配向性
に従い、すべての第三の配列が読取り枠中で(A,B) と結
合している。ｃＤＮＡ配列が停止コードンを有していな
い場合には、それがコードするポリペプチド配列はセグ
メント(F) に対応するアミノ酸配列によって付加的に保
護されている。ｃＤＮＡが正しい読取り枠中に結合して
いない場合には、読取り枠の移動は、例えばｃＤＮＡ含
有（最初の又は複製された）プラスミドをＭｌｕＩ又は
ＸｂａＩで切断し（ｃＤＮＡがこれら酵素の切断部位を
有していないときに限る）、クレノウポリメラーゼ反応
により突出端を埋填することによって行なわれる。 【００２５】 【表１】 【表２】【表３】
‐２部分を含有する融合タン白質の遺伝子、それを含有
するベクターおよびそのベクターを含有する細胞に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】インターロイキン‐２の最初の１００個
のアミノ酸と実質的に一致するＣ‐又はＮ‐末端部分を
有する融合タンパク質は既に提案されている（西独特許
出願第Ｐ３，５４１，８５６．７号明細書）。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】これらのうちインターロイキン‐２部分は、
哺乳類インターロイキン‐２、例えば公開第０，０９
１，５３９号の欧州特許出願（以下、“ＥＰ‐Ａ”と略
する）明細書に開示されているマウス又はラットのイン
ターロイキン‐２に由来していてもよいが、ヒトインタ
ーロイキン‐２に由来していることが好ましい。これら
の融合タンパク質は驚くべきことに宿主細胞中で安定で
あって、しかもそれらの溶解性が低いため、宿主に固有
の可溶性タンパク質から容易に分離することができる。
この発明概念を更に発展させたものとして、インターロ
イキン‐２分子の著しく小さな部分がこのタイプの融合
タンパク質の“バラスト（ballast ）”部分として適し
ていることは、驚くべきことに今ここに見出されたので
ある。本発明は特許請求の範囲に規定されている。好ま
しい態様は以下詳細に説明されている。 【０００４】ＥＰ‐Ａ第０，１６３，２４９号明細書で
開示されかつ表中に記載されたヒトインターロイキン‐
２（以下、“ＩＬ‐２”と略する）の合成遺伝子から始
めることが特に好都合である。この合成遺伝子は、ＩＬ
‐２をコードするＤＮＡを分解して“扱いやすい（mana
geable）”セグメントにするためのいくつかの独特な制
限切断部位を有している。これらのセグメントを用い、
モジュラー原理（modular principle ）により融合タン
パク質のバラスト部分を調節するとができるが、得られ
る融合タンパク質の溶解性が高いか低いかは、セグメン
トの組合せと所望のタンパク質の性質とにかかってい
る。このように、本発明では、産物の可能な又は望まし
い生産のために最も有利となるように溶解性を調節する
ことができ、即ち産物がクロマトグラフィー、例えば抗
体カラムにより精製されるべき場合には高溶解性に、又
は予備精製として宿主に固有の可溶性タンパク質が例え
ば遠心分離によって除去されるべき場合には低溶解性に
調節することができる。 【０００５】本発明の特に有利な点は、非常に小さい
“バラスト部分”を有する融合タンパク質を生産するこ
とができることであって、それにより所望のタンパク質
の相対的収率が著しく増大するようになる。本発明のも
う一つの利点は、“バラスト部分”が、所望のタンパク
質の空間構造をできる限り阻害せず、その結果例えば折
り重なり（folding up）を阻害することのないような方
法で構成され得る、ということである。融合タンパク質
の切断により、所望のタンパク質ばかりではなく、所謂
ＩＬ‐２誘導体たる“バラスト部分”も得られる。これ
はＩＬ‐２活性（Ｔ‐細胞増殖試験）を有していても又
はＩＬ‐２レセプターに結合していてもよい。本発明の
“モジュラー原理”は、したがって、多かれ少なかれあ
る程度のＩＬ‐２生物活性を有するＩＬ‐２誘導体を
“副産物”として産生するためにも利用することができ
る。本発明の特に有利な点は、ＥＰ‐Ａ第０，１６３，
２４９号明細書に記載された合成遺伝子に関して以下に
説明されている。この遺伝子は、制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩにより５′未満で、ＳａｌＩにより３′未
満で切断される。このような遺伝子を構成するために使
用された酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ及びＳａｃＩ用の三つ
の独特な制限切断部位の他に、ＭｌｕＩ及びＰｖｕＩ用
の独特な切断部位が存在していることも好ましい。これ
ら切断部位間に存在する配列がＡ〜Ｆである場合には、
合成遺伝子は概略的に（ＥｃｏＲＩ）‐Ａ‐ＰｓｔＩ‐
Ｂ‐ＭｌｕＩ‐Ｃ‐ＸｂａＩ‐Ｄ‐ＳａｃＩ‐Ｅ‐Ｐｖ
ｕＩ‐Ｆ‐（ＳａｌＩ）で示される。 【０００６】セグメントＡ〜Ｆは、このように本発明の
モジュラー系にとって特に適切な“単位”である。上記
表示において、西独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．
７号明細書に記載された融合タンパク質についての“バ
ラスト部分”はセグメントＡ〜Ｅと一致し、同上出願に
記載された完全ＩＬ‐２遺伝子を含有する２官能性タン
パク質についての“バラスト部分”はすべてのセグメン
トＡ〜Ｆと一致する。一方、本発明の遺伝子構造は、セ
グメントＡ〜Ｆ、好ましくはこれらセグメントのうちの
４個未満のセグメントからなる別の組合せに関するもの
であるが、ここでセグメントＡは融合タンパク質のＮ‐
末端をコードしている。他のセグメント配列は任意的で
あって、場合により適切なアダプター又はリンカーが使
用される。適切なアダプター又はリンカー配列も“バラ
スト部分”のＣ‐末端に導入することができるが、この
場合において、それらは酵素的又は化学的に所望のタン
パク質からの“バラスト部分”の切除を可能ならしめ又
は促進させるようなアミノ酸又は短鎖アミノ酸配列をコ
ードすることができる。アダプター又はリンカー配列
は、特定の融合タンパク質についての“バラスト部分”
を調節するために、例えば所望の溶解性を達成するため
にも当然利用することができる。これと関連するが、融
合タンパク質の溶解性は分子の大きさとは無関係であ
り、逆に比較的小さな分子であっても低溶解性であるこ
とが驚くべきことに判明したのである。下記諸例中に詳
細に説明されているこれらの関連性から明らかなよう
に、当業者であればさほど実験上の労苦をすることがな
く、小さな“バラスト部分”を有しかつ特定の望ましい
性質を有する本発明の融合タンパク質を得ることができ
る。したがって、所望のタンパク質が真核細胞タンパク
質である場合には、本発明により得られる融合タンパク
質は全面的には又は事実上全面的に真核細胞タンパク質
配列からなる。しかしながら、驚くべきことに、タンパ
ク質は原核宿主細胞において外来タンパク質として認識
されないため、宿主に固有のプロテアーゼにより急速に
分解されることはない。このような分解は、宿主にとっ
て外来でありかつ細菌中で発現すべきｃＤＮＡ配列によ
ってコードされるタンパク質の場合に特に頻発する。ｃ
ＤＮＡ配列が本発明のセグメント中に“埋め込まれ”て
いる場合にこのｃＤＮＡ配列は極めて効果的に発現し得
ることが今ここに判明したのである。ｃＤＮＡ配列に関
していくつかのクローニング部位を有するポリリンカー
配列を本発明の配列中に含有する特定のベクターを上記
目的のために製造することができる。複製されたｃＤＮ
Ａが停止コードンを有していない場合には、ｃＤＮＡ配
列によりコードされるポリペプチド配列はＣ‐末端セグ
メントがコードするポリペプチドによって付加的に保護
される。 【０００７】融合タンパク質は化学的又は酵素的に自体
公知の方法により切断することができる。適切な方法を
いかに選択するかは、特に所望のタンパク質のアミノ酸
配列にかかっている。後者が例えばメチオニンを有して
いない場合には、結合要素はＭｅｔを表わすことがで
き、このときには塩化もしくは臭化シアンによる化学的
切断が行なわれる。結合要素のカルボキシル末端にシス
テインが存在する場合、即ち結合要素がＣｙｓを表わす
場合には、例えば特異的Ｓ‐シアニル化後にシスティン
特異性の酵素的切断又は化学的切断を行なうことができ
る。結合要素のカルボキシル末端にトリプトファンが存
在する場合、即ち結合要素がＴｒｐを表わす場合には、
Ｎ‐ブロモスクシンイミドによる化学的切断が行われ
る。自己のアミノ酸配列中にちＡｓｐ‐Ｐｒｏを有せ
ず、かつ酸に対して十分に安定である所望のタンパク質
は、融合タンパク質が上記結合要素を有する場合に、自
体公知の方法によってタンパク質分解により切断するこ
とができる。その結果、Ｎ‐末端にプロリンを有するか
又はＣ‐末端にアスパラギン酸を有するタンパク質が得
られる。したがって、この方法により改変タンパク質を
合成することもできる。この結合要素（Ａｓｐ）ｎ‐Ｐ
ｒｏ又はＧｌｕ‐（Ａｓｐ）ｎ‐Ｐｒｏであり、ｎが１
〜３を表わす場合には、Ａｓｐ‐Ｐｒｏ結合は酸に対す
る安定が低くなることがある。酵素的切断の例も同様に
公知であり、改善された特異性をもつ改変酵素を使用す
ることもできる〔C.S. Craik et al., Science 228(198
5)291-297 参照〕。所望の真核細胞ペプチドがプロイン
シュリンである場合に選択される配列は、トリプシンに
よる切断が可能なアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）がプロイ
ンシュリンのＮ‐末端アミノ酸（Ｐｈｅ）結合している
ペプチド配列、例えばＡｌａ‐Ｓｅｒ‐Ｍｅｔ‐Ｔｈｒ
‐Ａｒｇであることが有利であるが、その理由はこの場
合においてアルギニン特異的切断がトリプシンプロテア
ーゼによって行ない得るからである。 所望のタンパク質がアミノ酸配列： Ｉｌｅ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ を有していない場合には、適切な結合要素を有する融合
タンパク質はＸａ因子により切断することができる（Ｅ
Ｐ‐Ａ第０，０２５，１９０号及び第０，１６１，９７
３号明細書）。融合タンパク質は、自体公知の方法によ
り適切な発現系で発現させることによって得られる。す
べての公知の宿主‐ベクター系、即ち、例えば哺乳類細
胞及び、酵母、好ましくは細菌、特に大腸菌等の微生物
はかかる目的のために適している。 【０００８】所望のタンパク質についてコードするＤＮ
Ａ配列は、選択された発現系での満足すべき発現を確実
化するベクター中に公知の方法で組込まれる。細菌宿主
においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ファージλのＰ
L もしくはＰR 、ｈｓｐ、ｏｍｐ又は例えば西独特許公
開第３，４３０，６８３号（ＥＰ‐Ａ第０，１７３，１
４９号）明細書で開示されているような合成プロモータ
ーからなる群よりプロモーター及びオペレーターを選択
することが有利である。ｔａｃプロモーター‐オペレー
ター配列が有利であり、現在市販されている〔例えば、
発現ベクターｐＫＫ２２３‐３、ファルマシア（Pharma
cia ）、“Molecular Biologicals,Chemicals and Equi
pment for Molecular Biology ”１９８４年、第６３
頁〕。本発明による融合タンパク質の発現に際し、ｍＲ
ＮＡレベルでの塩基の対合を阻止するために、ＡＴＧ開
始コードン下流の最初の数個のアミノ酸に関して個々の
トリプレットを改変することが有利のようである。この
タイプの改変は、ＩＬ‐２タンパク質部分における個々
のアミノ酸の改変、削除又は付加と同様に、当業者にと
って周知であり、本発明は同様にそれらにも関する。望
ましくないジスルフィド結合の形成を防止するためのシ
スティンの削除又は他のアミノ酸によるシスティンの置
換は、例えばＥＰ‐Ａ第１０９，７４８号明細書に開示
されているように、例示として述べられている。図１〜
１６は、同一番号の例中に記載された合成方法を工程図
により説明するものである。理解を容易化させるため
に、出発物質及び中間体の製造法は図１４〜１６（Ａ〜
Ｃ）に示されている。明確化のため、第１〜１３図の参
照番号はそれぞれ別の新しい１０位から始まり、第１図
では(11)から始まる。本発明では言及していない出発物
質の参照番号は０で終わり、したがって例えば第２図で
は(20)となる。図は縮尺通りでは描かれておらず、特に
尺度はポリリンカー配列領域において適度に拡大されて
いる。ＩＬ‐２配列は太線で示されており、所望のタン
パク質についての構造遺伝子は他の方法で強調されてい
る。 【０００９】 【実施例】本発明は下記諸例中で詳細に説明されてお
り、その例の番号は図の番号と一致する。他に記載のな
い限り、％は重量に関する。 例Ａ（図１４（Ａ）参照） 出発プラスミドｐ１５９／６はＥＰ‐Ａ第０，１６３，
２４９号明細書（第５図）に記載されている。そこで
“ＩＬ‐２”として又は本明細書中“ＤＮＡ配列Ｉ”と
して記載されている配列は、酵素ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＸｂａＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩ及びＳａ
ｌＩの切断部位を介して結合したセグメントＡ〜Ｆとし
て第１４Ａ図では分けられている。適切な酵素で二重切
断すると、セグメント(A) 〜(F) 又は隣接セグメントが
得られ、例えばＥｃｏＲＩ及びＭｌｕＩによるとセグメ
ント(A,B) が得られる。 【００１０】例Ｂ（図１５（Ｂ）参照） 発現プラスミドｐＥＷ１０００の製造法は（公開前の）
西独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．５号明細書（第
１図）に開示されている。このプラスミドはプラスミド
ｐｔａｃ１１〔Amann et al., Gene 25(1983)167-178〕
の誘導体であり、そのＥｃｏＲＩ認識部位にＳａｌＩ切
断部位含有合成配列が組込まれたものである。このよう
にして発現プラスミドｐＫＫ１７７．３が得られる。ｌ
ａｃリプレッサー〔Farabaugh, Nature 274(1978)765-7
69〕の挿入によりプラスミドｐＪＦ１１８が得られる。
これをＡｖａＩの唯一の制限切断部位で開環し、公知の
方法でエキソヌクレアーゼ処理して約１０００ｂｐ短縮
して、結合させる。それによってプラスミドｐＥＷ１０
００を得る。酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ III、Ｓａｌ
Ｉ、ＰｓｔＩもしくはＳｍａＩによりポリリンカー中で
このプラスミドを開環し、直鎖発現プラスミド(Ex1) 、
(Ex2) 、(Ex3）及び(Ex4）を得る。 【００１１】例Ｃ（図１６（Ｃ）参照） 市販プラスミドｐＵＣ１２をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで
開環し、直鎖プラスミド(1) を分離する。(1) をセグメ
ント(A) 、合成リンカー配列(2) 及びセグメント(F) と
結合して、プラスミドｐＷ２２６(3) を得る。大腸菌７
９／０２株を公知の方法により結合混合体由来プラスミ
ドＤＮＡで形質転換する。細胞をイソプロピル‐β‐Ｄ
‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、５‐ブロモ‐
４‐クロロ‐３‐インドリル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノ
シド（Ｘ‐ｇａｌ）及びアンピシリン（Ａｐ）２０μｇ
／ml含有寒天プレート上で培養する。プラスミドＤＮＡ
を白色クローンから得、プラスミド(3) の形成を制限分
析及びＤＮＡ配列分析により確認する。小さなＥｃｏＲ
Ｉ‐Ｈｉｎｄ IIIフラグメント(4）をプラスミド(3) か
ら切断し、分離する。このフラグメントをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ反応により直鎖発現プラスミド(Ex1) と結合す
る。得たプラスミドｐＷ２２６‐１(5) を制限分析によ
り確認する。大腸菌Ｍｃ１０６１株のコンピテント細胞
をプラスミドｐＷ２２６‐１由来ＤＮＡで形質転換す
る。アンピシリン耐性クローンをＡｐ含有寒天プレート
上で分離する。プラスミドＤＮＡをＭｃ１０６１細胞か
ら再分離し、しかる後制限分析により再度確認する。大
腸菌Ｗ３１１０株コンピテント細胞を大腸菌Ｍｃ１０６
１細胞から分離したプラスミドＤＮＡで形質転換する。
大腸菌Ｗ３１１０細胞を以後常に発現用として使用す
る。以後の諸例中でのすべての発現実験は下記条件で行
なわれる。プラスミド(5) 含有大腸菌細胞の一夜培養物
をアンピシリン５０μｇ／ml含有ＬＢ培地〔J.H.Mille
r, Experments in Molecular Genetics, Cold Spring H
arbor Laboratory, 1972 〕で約１：１００の比に希釈
し、増殖を吸光度測定により追跡する。吸光度が０．５
のときに培養物をＩＰＴＧ中１ｍＭに調整し、１５０〜
１８０分間後細菌を沈降させる。細菌を５分間混合緩衝
液（７Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．０）中で沸騰させ、試料をＳＤＳゲル電
気泳動プレートに塗布する。電気泳動後、プラスミド
(5) 含有細菌は予期されたタンパク質の大きさ（６Ｋ
Ｄ）に相当するタンパク質バンドを生じる。以上の誘導
条件は、培養物を振盪する場合に妥当する。大規模発酵
の場合では、吸光度を適度に変更しかつ適切であればＩ
ＰＴＧ濃度をわずかに変更することが有利である。得ら
れたタンパク質はＩＬ‐２依存細胞系（ＣＴＬＬ２）で
の細胞増殖試験において生物活性を示されない。 【００１２】例 １ プラスミド(3) をＭｌｕＩ及びＳａｌＩで開環し、得ら
れた二つのフラグメントをゲル電気泳動により分離す
る。大きなフラグメント(11)を分離する。合成オリゴヌ
クレオチド(12)をプロインシュリンをコードするブラン
ト末端ＤＮＡ(13)〔Wetekam et al., Gene 19(1982) 17
9-183 〕と結合して、ＤＮＡ配列(14)を得る。後者をＭ
ｌｕＩ及びＳａｌＩで切断し、これによりＤＮＡ配列(1
5)を得る。後者をフラグメント(11)と結合して、プラス
ミドｐＫＨ４０(16)を形成する。後者を制限分析により
確認する。プラスミド(16)をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ I
IIで消化し、小さなフラグメント(17)をゲル電気泳動に
より分離する。直鎖状とした発現プラスミド(Ex1) と結
合して、発現プラスミドｐＫ４０(18)を得る。例Ｃで示
す発現により、細胞破壊後の細胞性タンパク質の可溶性
画分に存在するタンパク質を得る。プロインシュリン配
列が完全であることを証明するために、ウェスターンブ
ロット法を利用する。 【００１３】例 ２ 出発物質はプラスミドｐＰＨ３０であるが、これは（未
公開の）西独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．７号明
細書中の第３ｃ図に示されている。本発明での意味の範
囲内において、第２図のＩＬ‐２部分配列は“Ａ‐Ｅ”
(20)として示されている。この配列の末端から結合要素
及びプロインシュリン配列までは第２図中(20a）として
示されている。プラスミド(20)をＰｖｕＩ及びＨｉｎｄ
IIIで消化し、小さなフラグメント(22)を分離する。更
に、プラスミド(3) をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで開環
し、小さなフラグメント(23)を分離する。しかもベクタ
ーｐＵＣ１２をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断し、
大きなフラグメント(21)を分離する。フラグメント(2
1)、(23)及び(22)を結合して、プラスミドｐＳＬ１１(2
4)を得る。プラスミド(24)をＨｉｎｄ IIIで及び部分的
に ＥｃｏＲＩで切断し、セグメントＡ及びプロインシ
ュリン遺伝子含有フラグメント(25)を分離する。(25)を
直鎖状とした発現プラスミド(Ex1) に結合して、発現プ
ラスミドｐＳＬ１２(26)を得る。例Ｃで示される発現及
びその後の操作により、可溶性融合タンパク質を得る。
インシュリン抗体でのウェスターンブロット分析によ
り、このタンパク質が完全なインシュリン配列を有して
いることを確認する。 【００１４】例 ３ プラスミドｐｔｒｐＥＤ５‐１(30)〔Hallewell et a
l., Gene 9(1980)27-47〕をプロインシュリン遺伝子の
増幅用に使用する。プラスミドをＨｉｎｄ III及びＳａ
ｌＩで開環して、大きなフラグメント(31)を分離する。
フラグメント(31)をＤＮＡ配列(14)と結合して、プラス
ミド ｐＨ１０６／４(32)を得る。プラスミド(32)をＳ
ａｌＩ及びＭｌｕＩで消化して、小さなフラグメント(1
5)を分離する。直鎖状とした発現プラスミド(Ex2) 、セ
グメント(A,B）及びフラグメント(15)を結合して、発現
プラスミドｐＫ５０(33)を得る。コードされた融合タン
パク質の発現を例Ｃで示したように行なう。細胞を培養
ブイヨン中から沈降させ、フレンチプレス（French pre
ss）で破壊する。タンパク質懸濁物を遠心分離し、その
可溶性及び不溶性の両タンパク質成分に分離する。二つ
の画分を公知の方法で１７．５％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルのゲル電気泳動に付し、しかる後タンパク質を
クマシー（Coomassie ）ブルー染料で染色することによ
り分析する。驚くべきことに、融合タンパク質は不溶性
沈降物中に存在していることが判明した。インシュリン
抗体でのウェスターンブロット法分析により、完全プロ
インシュリンが融合タンパク質中に存在していることを
確認する。フレンチプレス破壊による沈降物は更にプロ
インシュリン分離用として直ちに使用することができ
る。 【００１５】例 ４ 出発物質はプラスミドｐＰＨ２０(40)であり、これは西
独特許出願第Ｐ３，５４１，８５６．７号明細書の第３
ｃ図に記載されている。このプラスミドをＥｃｏＲＩで
切断し、突出端を埋填し、Ｈｉｎｄ IIIで切断してフラ
グメント(41)を得るが、そこには本発明において重要な
(40)の一部のＤＮＡ配列が存在している。直鎖状とした
発現プラスミド(Ex4）をセグメント(A,B) 、合成オリゴ
ヌクレオチド(42)及びフラグメント(41)と結合して、プ
ラスミドｐＫ５１(43)を得る。 【００１６】例 ５ 直鎖状にした発現プラスミド(Ex2) をセグメント(A,B)
、合成オリゴヌクレオチド(51)及びＤＮＡ配列(15)と
結合して、プラスミドｐＫ５２(52)を得る。オリゴヌク
レオチド(51)の正確な配向性を配列分析により確認す
る。このプラスミドは、オリゴヌクレオチド(51)に対向
するアミノ酸配列を含有する融合タンパク質をコードし
ており、このため活性因子Ｘａで切断することができ
る。プラスミド(52)は、下記方法によっても得ることが
できる。プラスミド(33)をＭｌｕＩで部分的に切断し、
得られた開環プラスミド(53)をＤＮＡ配列(51)と結合し
て、同様にプラスミドｐＫ５２を得る。 【００１７】例 ６ プラスミド(43)をＭｌｕＩで部分的に切断し、得られた
直鎖状プラスミド(61)を合成ＤＮＡ配列(51)と結合し
て、プラスミドｐＫ５３(62)を得る。後者は、活性因子
Ｘａで切断することができる融合タンパク質を同様にコ
ードしている。配列(51)の正確な配向性を例５のように
ＤＮＡ配列分析により確認する。 【００１８】例 ７ プラスミド(26)をＸｂａＩで及び部分的にＭｌｕＩで切
断して、大きなフラグメント(71)を分離する。セグメン
ト(C) と結合させてプラスミドｐＳＬ１４(72)を得る。
発現及び細胞破壊後、融合タンパク質は細胞性タンパク
質の可溶性画分中に存在する。 【００１９】例 ８ プラスミド(20)をＸｂａＩで部分的に及びＥｃｏＲＩで
切断し、突出端を埋填して、ＤＮＡ配列(81)を得る。ブ
ラント末端条件下で結合させてプラスミドｐＰＨ３１(8
2)を得る。融合タンパク質は、細胞性タンパク質の不溶
性画分中に存在する。 【００２０】例 ９ 使用する出発物質はＥＰ‐Ａ第０，１７１，０２４号明
細書（第３図）に記載されたプラスミド(90)である。こ
のプラスミドをＳａｌＩしかる後ＡｃｃＩと反応させ
て、小さなフラグメント(91)を分離する。後者を合成オ
リゴヌクレオチド(92)と結合して、ＤＮＡ配列(93)を得
る。後者をＭｌｕＩで切断して、ＤＮＡフラグメント(9
4)を得る。プラスミド(33)をＭｌｕＩで部分的に及びＳ
ａｌＩで消化して、大きなフラグメント(95)を分離す
る。後者をＤＮＡ配列(94)と結合して、発現プラスミド
ｐＫ１９２(96)を得る。後者は、ＩＬ‐２の最初の３８
個のアミノ酸の後にメチオニン次いでヒルジンアミノ酸
配列が続く融合タンパク質をコードするものである。融
合タンパク質は、細胞性タンパク質の可溶性画分中に存
在する。 【００２１】例１０ 使用する出発物質はプラスミドｐＨＧ２３(100）であ
り、これはＥＰ‐Ａ第０，１８３，３５０号明細書に記
載されており、アメリカン・タイプ・カルチァー・コレ
クション（American Type Culture Collection）の寄託
番号ＡＴＣＣ３９０００号として一般的に入手できる。
このプラスミドをＳｆａＮＩで切断し、突出端を埋填
し、しかる後ＰｓｔＩとの反応を行ない、小さなフラグ
メント(101)を分離する。直鎖状発現プラスミド(Ex3)
をセグメント(A,B) 、合成オリゴヌクレオチド(102) 及
びフラグメント(101) と結合して、発現プラスミドｐＷ
２１４(103) を得る。このプラスミドは、ＩＬ‐２の最
初の３８個のアミノ酸の後に、オリゴヌクレオチド(10
2) 由来であってかつＸａ因子で分子を切断させ得る配
列、次いでＣＳＦアミノ酸配列が続く融合タンパク質を
コードするものである。細胞破壊後、融合タンパク質は
細胞性タンパク質の不溶性画分中に存在する。 【００２２】例１１ 出発物質ｐＷ２１６(110) は、西独特許出願第Ｐ３，５
４５，５６８．３号明細書（第２ｂ図）に開示されてい
る。このプラスミドでは、セグメントＡ〜Ｅ（ＰｖｕＩ
切断部位）に相当するＩＬ‐２配列の後に、アミノ酸Ａ
ｓｐ‐Ａｓｐ‐Ｐｒｏをコードするリンカー、すぐその
後にＣＳＦアミノ酸配列、が続いている。ＩＬ‐２及び
ＣＳＦ間の結合配列により、融合タンパク質をタンパク
質分解によって切断することができる。配列(111) を、
ＰｖｕＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断することにより、プラ
スミド(110) から分離する。プラスミド(3) をＭｌｕＩ
及びＸｂａＩで切断して、大きなフラグメント(112) を
分離する。後者をセグメント(C) と結合して、プラスミ
ドｐＷ２２７(113)を得る。このプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄ IIIと反応させ、短鎖フラグメント(11
4) を分離する。このフラグメントが直鎖状発現プラス
ミド(Ex1) と結合している場合には、プラスミドｐＷ２
２７‐１(115) が得られる。プラスミドは、ＩＬ‐２由
来ではあるもののＩＬ‐２活性を有していていないタン
パク質をコードするものである。プラスミド(113) を更
にＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで切断し、短鎖フラグメント
(116) を分離する。直鎖状発現フラグメント(Ex1）をフ
ラグメント(116）及び(111) と結合して、発現プラスミ
ドｐＷ２３３(117) を得る。後者は不溶性融合タンパク
質をコードしているが、この融合タンパク質は上記リン
カーの存在によりタンパク質分解によって切断すること
ができる。 【００２３】例１２ プラスミド(3) をＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断し、大き
なフラグメント(121)を単離する。セグメント(D) と結
合させてプラスミドｐＷ２２８(122) を得る。後者をＥ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断して、小さなフラグメ
ント(123) を分離する。直鎖状発現プラスミド(Ex1) を
フラグメント(123) と結合させて発現プラスミドｐＷ２
２８‐１(124) を得る。このプラスミドは生物学的に不
活性のＩＬ‐２誘導体をコードしている。プラスミドを
ＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで消化して、短鎖フラグメント
(125) を分離する。直鎖状発現プラスミド(Ex1) をフラ
グメント(125) および(111) と結合させて、発現プラス
ミドｐＷ２３４(126) を得る。後者は難溶性融合タンパ
ク質をコードしており、この融合タンパク質も同様にタ
ンパク質分解によって切断することができる。 【００２４】例１３ 適切なプラスミドの製造のために、特にｃＤＮＡ配列の
発現のために、まずポリリンカー配列(131) を合成す
る。直鎖状プラスミド(1) をセグメント(A) 、ポリリン
カー配列(131) 及びセグメント(F) と結合させて、プラ
スミドｐＨ２００(132) を得る。プラスミド(132) をＥ
ｃｏＲＩ及びＭｌｕＩと反応させて、大きなフラグメン
ト(133) を分離する。後者をセグメント(A,B) と結合し
て、プラスミドｐＨ２０１(134) を得る。プラスミド(1
34) をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIと反応させ、短鎖フ
ラグメント(135) を分離する。このフラグメントを直鎖
発現プラスミド(Ex1) と結合し、発現プラスミドｐＨ２
０２(136) を得る。プラスミド(136) をＢａｍＨＩで閉
環し、発現すべきｃＤＮＡを直鎖プラスミド中に市販Ｂ
ａｍＨＩアダプターを介して組込む。ｃＤＮＡの配向性
に従い、すべての第三の配列が読取り枠中で(A,B) と結
合している。ｃＤＮＡ配列が停止コードンを有していな
い場合には、それがコードするポリペプチド配列はセグ
メント(F) に対応するアミノ酸配列によって付加的に保
護されている。ｃＤＮＡが正しい読取り枠中に結合して
いない場合には、読取り枠の移動は、例えばｃＤＮＡ含
有（最初の又は複製された）プラスミドをＭｌｕＩ又は
ＸｂａＩで切断し（ｃＤＮＡがこれら酵素の切断部位を
有していないときに限る）、クレノウポリメラーゼ反応
により突出端を埋填することによって行なわれる。 【００２５】 【表１】 【表２】【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＣ１２誘導体たるｐＫＨ４０及び発現プラ
スミドｐＫ４０の製造法を示すフローシート。これらの
プラスミドは、セグメントＡに対応するタンパク質配
列、即ちＩＬ‐２の最初の２２個のアミノ酸の後に、結
合要素Ｔｈｒ‐Ａｒｇ、次いでプロインシュリンアミノ
酸配列が続く融合タンパク質をコードしている。 【図２】プラスミドｐＳＬ１１及び発現プラスミドｐＳ
Ｌ１２の構造を示す説明図。これらのプラスミドは、セ
グメントＡの後にポリリンカー配列(2) 及び(20a)に相
当する結合要素次いでプロインシュリンアミノ酸配列が
続くポリペプチドをコードしている。 【図３】発現プラスミドｐＫ５０の構造を示す説明図。
このプラスミドは、セグメントＡ及びＢ、即ちＩＬ‐２
の最初の３８個のアミノ酸、に直接プロインシュリンア
ミノ酸配列が続くポリペプチドをコードしている。 【図４】発現プラスミドｐＫ５１の構造を示す説明図。
このプラスミドは、セグメントＡおよびＢの後に配列(4
2)及び(41)に相当する結合要素、次いでプロインシュリ
ンアミノ酸配列、が結合したポリペプチドをコードして
いる。 【図５】ＭｌｕＩリンカー(51)が挿入されている点でｐ
Ｋ５１と異なる発現プラスミドｐＫ５２の構造を示す説
明図。このプラスミドは、Ｘａ因子で切断されるアミノ
酸配列をコードしている。ｐＫ５２は、ＭｌｕＩで切断
しかつ上記ＭｌｕＩリンカーを組込むことによって、ｐ
Ｋ５０（第３図）からも得ることができるものである。 【図６】ＭｌｕＩリンカーの同様の組込みによってｐＫ
５１（第４図）から得られる発現プラスミドｐＫ５３の
構造を示す説明図。 【図７】フラグメントＣのポリリンカーへの組込みによ
ってｐＳＬ１２（第２図）から得られる発現プラスミド
ｐＳＬ１４の構造を示す説明図。それにより、セグメン
トＣがセグメントＡに直接結合することになる。下記ポ
リリンカーにおいて、最初の２個のアミノ酸（いずれも
Ｇｌｕ）はＩＬ‐２の６０位及び６１位のアミノ酸と一
致する。したがって、ＩＬ‐２部分は１〜２２位及び３
７〜６１位のアミノ酸からなる。その後のアミノ酸配列
は、プラスミドｐＳＬ１２（第２図）によりコードされ
たアミノ酸配列と一致する。 【図８】発現プラスミドｐＰＨ３１の構造を示す説明
図。このプラスミドは、セグメントＡ〜Ｃの後に配列(8
1)で示される結合要素、次いでプロインシュリンアミノ
酸配列、が続く融合タンパク質をコードしている。 【図９】プラスミドｐＫ１９２の構造を示す説明図。こ
のプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後にメチオニ
ン、次いでヒルジンアミノ酸配列、が続く融合タンパク
質をコードしている。 【図１０】プラスミドｐＷ２１４の構造を示す説明図。
このプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後にＸａ因子
で切断されるアミノ酸配列、次いで顆粒球／マクロファ
ージコロニー刺激因子(CSF) アミノ酸配列、が続く融合
タンパク質をコードしている。 【図１１】発現プラスミドｐＷ２３３の構造に示す説明
図。このプラスミドは、セグメントＡ及びＣ（ＩＬ‐２
の１〜２２位及び３７〜６１位のアミノ酸と一致する）
の後に結合要素Ｌｅｕ‐Ｔｈｒ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｐ‐Ａｓ
ｐ‐Ｐｒｏ、次いでＣＳＦのアミノ酸配列、が続く融合
タンパク質をコードしている。 【図１２】発現プラスミドｐＷ２３４の構造を示す説明
図。このプラスミドは、次のアミノ酸配列：即ち、セグ
メントＡ（１〜２２位のアミノ酸）の後に結合要素Ｔｈ
ｒ‐Ａｒｇ、次いでセグメントＤ（ＩＬ‐２の５９〜９
６位のアミノ酸）、もう一つの結合要素Ｔｈｒ‐Ａｓｐ
‐Ａｓｐ‐Ｐｒｏ、及び最後にＣＳＦ、が続く融合タン
パク質をコードしている。 【図１３】プラスミドｐＨ２００及びｐＨ２０１、並び
に発現プラスミドｐＨ２０２の構造を示す説明図。これ
らのプラスミドは、セグメントＡ‐Ｆ間又はＡ，Ｂ‐Ｆ
間にポリリンカーを有しており、その多数の切断部位に
外来ＤＮＡを組込んでこれを複製することができる。こ
れらのプラスミドは、ｃＤＮＡ配列を複製するために特
に適している。 【図１４】本発明のセグメントＡ〜Ｆ並びにセグメント
Ａ及びＢの組合せについての概略図。出発物質はプラス
ミドｐ１５９／６であって、その製造法はＥＰ‐Ａ第
０，１６３，２４９号明細書で詳細に記載されており、
しかもそのプラスミドは該公報の第５図で規定されてい
る。 【図１５】発現プラスミドｐＥＷ１０００を示す説明
図。このプラスミドの製造法は西独特許出願第Ｐ３，５
４１，８５６．７号明細書に記載されかつその第１図に
示されている。このプラスミドは適切な二重切断によっ
てポリリンカー配列中で開環され、それにより直鎖プラ
スミド(Ex1) 〜(Ex4) が得られる。 【図１６】ｐＵＣ１２誘導体たるｐＷ２２６及び発現プ
ラスミドｐＷ２２６‐１の製造法を示す説明図。いずれ
のプラスミドもポリリンカー配列から分離されたセグメ
ントＡ及びＦを有している。
スミドｐＫ４０の製造法を示すフローシート。これらの
プラスミドは、セグメントＡに対応するタンパク質配
列、即ちＩＬ‐２の最初の２２個のアミノ酸の後に、結
合要素Ｔｈｒ‐Ａｒｇ、次いでプロインシュリンアミノ
酸配列が続く融合タンパク質をコードしている。 【図２】プラスミドｐＳＬ１１及び発現プラスミドｐＳ
Ｌ１２の構造を示す説明図。これらのプラスミドは、セ
グメントＡの後にポリリンカー配列(2) 及び(20a)に相
当する結合要素次いでプロインシュリンアミノ酸配列が
続くポリペプチドをコードしている。 【図３】発現プラスミドｐＫ５０の構造を示す説明図。
このプラスミドは、セグメントＡ及びＢ、即ちＩＬ‐２
の最初の３８個のアミノ酸、に直接プロインシュリンア
ミノ酸配列が続くポリペプチドをコードしている。 【図４】発現プラスミドｐＫ５１の構造を示す説明図。
このプラスミドは、セグメントＡおよびＢの後に配列(4
2)及び(41)に相当する結合要素、次いでプロインシュリ
ンアミノ酸配列、が結合したポリペプチドをコードして
いる。 【図５】ＭｌｕＩリンカー(51)が挿入されている点でｐ
Ｋ５１と異なる発現プラスミドｐＫ５２の構造を示す説
明図。このプラスミドは、Ｘａ因子で切断されるアミノ
酸配列をコードしている。ｐＫ５２は、ＭｌｕＩで切断
しかつ上記ＭｌｕＩリンカーを組込むことによって、ｐ
Ｋ５０（第３図）からも得ることができるものである。 【図６】ＭｌｕＩリンカーの同様の組込みによってｐＫ
５１（第４図）から得られる発現プラスミドｐＫ５３の
構造を示す説明図。 【図７】フラグメントＣのポリリンカーへの組込みによ
ってｐＳＬ１２（第２図）から得られる発現プラスミド
ｐＳＬ１４の構造を示す説明図。それにより、セグメン
トＣがセグメントＡに直接結合することになる。下記ポ
リリンカーにおいて、最初の２個のアミノ酸（いずれも
Ｇｌｕ）はＩＬ‐２の６０位及び６１位のアミノ酸と一
致する。したがって、ＩＬ‐２部分は１〜２２位及び３
７〜６１位のアミノ酸からなる。その後のアミノ酸配列
は、プラスミドｐＳＬ１２（第２図）によりコードされ
たアミノ酸配列と一致する。 【図８】発現プラスミドｐＰＨ３１の構造を示す説明
図。このプラスミドは、セグメントＡ〜Ｃの後に配列(8
1)で示される結合要素、次いでプロインシュリンアミノ
酸配列、が続く融合タンパク質をコードしている。 【図９】プラスミドｐＫ１９２の構造を示す説明図。こ
のプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後にメチオニ
ン、次いでヒルジンアミノ酸配列、が続く融合タンパク
質をコードしている。 【図１０】プラスミドｐＷ２１４の構造を示す説明図。
このプラスミドは、セグメントＡ及びＢの後にＸａ因子
で切断されるアミノ酸配列、次いで顆粒球／マクロファ
ージコロニー刺激因子(CSF) アミノ酸配列、が続く融合
タンパク質をコードしている。 【図１１】発現プラスミドｐＷ２３３の構造に示す説明
図。このプラスミドは、セグメントＡ及びＣ（ＩＬ‐２
の１〜２２位及び３７〜６１位のアミノ酸と一致する）
の後に結合要素Ｌｅｕ‐Ｔｈｒ‐Ｉｌｅ‐Ａｓｐ‐Ａｓ
ｐ‐Ｐｒｏ、次いでＣＳＦのアミノ酸配列、が続く融合
タンパク質をコードしている。 【図１２】発現プラスミドｐＷ２３４の構造を示す説明
図。このプラスミドは、次のアミノ酸配列：即ち、セグ
メントＡ（１〜２２位のアミノ酸）の後に結合要素Ｔｈ
ｒ‐Ａｒｇ、次いでセグメントＤ（ＩＬ‐２の５９〜９
６位のアミノ酸）、もう一つの結合要素Ｔｈｒ‐Ａｓｐ
‐Ａｓｐ‐Ｐｒｏ、及び最後にＣＳＦ、が続く融合タン
パク質をコードしている。 【図１３】プラスミドｐＨ２００及びｐＨ２０１、並び
に発現プラスミドｐＨ２０２の構造を示す説明図。これ
らのプラスミドは、セグメントＡ‐Ｆ間又はＡ，Ｂ‐Ｆ
間にポリリンカーを有しており、その多数の切断部位に
外来ＤＮＡを組込んでこれを複製することができる。こ
れらのプラスミドは、ｃＤＮＡ配列を複製するために特
に適している。 【図１４】本発明のセグメントＡ〜Ｆ並びにセグメント
Ａ及びＢの組合せについての概略図。出発物質はプラス
ミドｐ１５９／６であって、その製造法はＥＰ‐Ａ第
０，１６３，２４９号明細書で詳細に記載されており、
しかもそのプラスミドは該公報の第５図で規定されてい
る。 【図１５】発現プラスミドｐＥＷ１０００を示す説明
図。このプラスミドの製造法は西独特許出願第Ｐ３，５
４１，８５６．７号明細書に記載されかつその第１図に
示されている。このプラスミドは適切な二重切断によっ
てポリリンカー配列中で開環され、それにより直鎖プラ
スミド(Ex1) 〜(Ex4) が得られる。 【図１６】ｐＵＣ１２誘導体たるｐＷ２２６及び発現プ
ラスミドｐＷ２２６‐１の製造法を示す説明図。いずれ
のプラスミドもポリリンカー配列から分離されたセグメ
ントＡ及びＦを有している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
// Ｃ０７Ｈ 21/04 Ａ６１Ｋ 37/02
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/09 ZNA
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．第１表のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺
伝子のセグメントであって、任意の配列で場合によりア
ダプター又はリンカー配列を介して結合した、ＩＬ−２
遺伝子： （ＥｃｏＲＩ）−Ａ−ＰｓｔＩ−Ｂ−ＭｌｕＩ−Ｃ−Ｘ
ｂａＩ−Ｄ−ＳａｃＩ−Ｅ−ＰｖｕＩ−Ｆ−（Ｓａｌ
Ｉ） のセグメントＡおよび更に所望によりセグメントＢ〜Ｆ
のうちの１又は２個の更なるセグメントに対応するＣ−
又はＮ−末端部分を含有する融合タンパク質をコードす
る遺伝子構造。 ２．ＩＬ−２配列と所望のタンパク質アミノ酸配列との
間に、化学的又は酵素的にＩＬ−２部分から所望のタン
パク質を切除し得るアミノ酸又はアミノ酸配列が存在し
ている、特許請求の範囲第１項に記載の遺伝子構造。 ３．アミノ酸がＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓもしく
はＡｒｇであるか、又はアミノ酸配列がＣ−末端にこれ
らアミノ酸を有している、特許請求の範囲第２項記載の
遺伝子構造。 ４．アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｐｒｏであるか、又はＣ末
端にこのアミノ酸配列を有する、特許請求の範囲第３項
記載の遺伝子構造。 ５．アミノ酸配列がＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇで
あるか、又はＣ−末端にこのアミノ酸配列を有する、特
許請求の範囲第３項記載の遺伝子構造。 ６．下記の融合タンパク質をコードする遺伝子構造を含
有するベクター。第１表のヒトインターロイキン−２
（ＩＬ−２）遺伝子のセグメントであって、任意の配列
で場合によりアダプター又はリンカー配列を介して結合
した、ＩＬ−２遺伝子： （ＥｃｏＲＩ）−Ａ−ＰｓｔＩ−Ｂ−ＭｌｕＩ−Ｃ−Ｘ
ｂａＩ−Ｄ−ＳａｃＩ−Ｅ−ＰｖｕＩ−Ｆ−（Ｓａｌ
Ｉ） のセグメントＡおよび更に所望によりセグメントＢ〜Ｆ
のうちの１又は２個の更なるセグメントに対応するＣ−
又はＮ−末端部分を含有する融合タンパク質。 ７．プラスミドｐＷ２２６、ｐＷ２２６−１、ｐＫ４
０、ｐＳＬ１２、ｐＫ５０、ｐＫ５１、ｐＫ５２、ｐＫ
５３、ｐＳＬ１４、ｐＰＨ３１、ｐＫ１９２、ｐＷ２１
４、ｐＷ２２７、ｐＷ２２７−１、ｐＷ２３３、ｐＷ２
２８、ｐＷ２２８−１、ｐＷ２３４、ｐＨ２００、ｐＨ
２０１またはｐＨ２０２である、特許請求の範囲第６項
記載のベクター。 ８．下記の融合タンパク質をコードする遺伝子構造を含
有するベクターを有する細菌。第１表のヒトインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）遺伝子のセグメントであって、
任意の配列で場合によりアダプター又はリンカー配列を
介して結合した、ＩＬ−２遺伝子： （ＥｃｏＲＩ）−Ａ−ＰｓｔＩ−Ｂ−ＭｌｕＩ−Ｃ−Ｘ
ｂａＩ−Ｄ−ＳａｃＩ−Ｅ−ＰｖｕＩ−Ｆ−（Ｓａｌ
Ｉ） のセグメントＡおよび更に所望によりセグメントＢ〜Ｆ
のうちの１又は２個の更なるセグメントに対応するＣ−
又はＮ−末端部分を含有する融合タンパク質。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3545565.9 | 1985-12-21 | ||
| DE3545565 | 1985-12-21 | ||
| DE19863636903 DE3636903A1 (de) | 1985-12-21 | 1986-10-30 | Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil |
| DE3636903.9 | 1986-10-30 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61306185A Division JP2553058B2 (ja) | 1985-12-21 | 1986-12-22 | 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08187089A JPH08187089A (ja) | 1996-07-23 |
| JP2774260B2 true JP2774260B2 (ja) | 1998-07-09 |
Family
ID=25839208
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61306185A Expired - Lifetime JP2553058B2 (ja) | 1985-12-21 | 1986-12-22 | 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 |
| JP7263310A Expired - Lifetime JP2774260B2 (ja) | 1985-12-21 | 1995-10-11 | 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61306185A Expired - Lifetime JP2553058B2 (ja) | 1985-12-21 | 1986-12-22 | 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0229998B1 (ja) |
| JP (2) | JP2553058B2 (ja) |
| KR (1) | KR950000301B1 (ja) |
| AT (1) | ATE78296T1 (ja) |
| AU (1) | AU599943B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339894C (ja) |
| DE (1) | DE3636903A1 (ja) |
| DK (1) | DK168823B1 (ja) |
| ES (1) | ES2033678T3 (ja) |
| FI (1) | FI93734C (ja) |
| GR (1) | GR3005985T3 (ja) |
| HU (1) | HU209747B (ja) |
| IE (1) | IE58935B1 (ja) |
| IL (1) | IL81018A (ja) |
| NO (1) | NO175003C (ja) |
| PT (1) | PT83973B (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| FR2643646B1 (fr) * | 1989-02-27 | 1993-09-17 | Pasteur Institut | Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz |
| CU22222A1 (es) * | 1989-08-03 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes |
| DE3942580A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von hirudin |
| DE4105480A1 (de) * | 1991-02-21 | 1992-08-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen |
| ATE264871T1 (de) | 1996-07-26 | 2004-05-15 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivate mit erhöhter zinkbindung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE102006031962A1 (de) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Amidiertes Insulin Glargin |
| DE102006031955A1 (de) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende |
| HUE037449T2 (hu) | 2008-10-17 | 2018-08-28 | Sanofi Aventis Deutschland | Egy inzulin és egy GLP-1 agonista kombinációja |
| EP3831402A1 (de) | 2009-11-13 | 2021-06-09 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten, ein insulin und methionin |
| ES2965209T3 (es) | 2009-11-13 | 2024-04-11 | Sanofi Aventis Deutschland | Composición farmacéutica que comprende desPro36exendina-4(1-39)-Lys6-NH2 y metionina |
| PT2611458T (pt) | 2010-08-30 | 2016-12-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Utilização de ave0010 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| AR087693A1 (es) | 2011-08-29 | 2014-04-09 | Sanofi Aventis Deutschland | Combinacion farmaceutica para uso en el control glucemico en pacientes con diabetes de tipo 2 |
| AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
| DK3229828T5 (da) | 2014-12-12 | 2024-10-14 | Sanofi Aventis Deutschland | Formulering med fast forhold mellem insulin glargin og lixisenatid |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| KR20200080748A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법 |
| KR20200080747A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| GB8412517D0 (en) * | 1984-05-16 | 1984-06-20 | Nagai K | Recombinant fusion proteins |
-
1986
- 1986-10-30 DE DE19863636903 patent/DE3636903A1/de not_active Withdrawn
- 1986-12-16 ES ES198686117481T patent/ES2033678T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-16 EP EP86117481A patent/EP0229998B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-16 AT AT86117481T patent/ATE78296T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-18 FI FI865187A patent/FI93734C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-12-18 IL IL81018A patent/IL81018A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 NO NO865192A patent/NO175003C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 PT PT83973A patent/PT83973B/pt unknown
- 1986-12-19 HU HU865354A patent/HU209747B/hu unknown
- 1986-12-19 AU AU66760/86A patent/AU599943B2/en not_active Expired
- 1986-12-19 IE IE333486A patent/IE58935B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 CA CA000525858A patent/CA1339894C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 DK DK619186A patent/DK168823B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-12-20 KR KR1019860011010A patent/KR950000301B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-12-22 JP JP61306185A patent/JP2553058B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-15 GR GR920402187T patent/GR3005985T3/el unknown
-
1995
- 1995-10-11 JP JP7263310A patent/JP2774260B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0229998A3 (en) | 1988-08-03 |
| PT83973B (pt) | 1989-07-31 |
| ES2033678T3 (es) | 1993-04-01 |
| PT83973A (de) | 1987-01-01 |
| KR950000301B1 (ko) | 1995-01-13 |
| JPS62167799A (ja) | 1987-07-24 |
| DK619186D0 (da) | 1986-12-19 |
| NO175003C (no) | 1994-08-17 |
| IE863334L (en) | 1987-06-21 |
| CA1339894C (en) | 1998-06-02 |
| KR870006187A (ko) | 1987-07-09 |
| EP0229998A2 (de) | 1987-07-29 |
| FI865187A0 (fi) | 1986-12-18 |
| DK168823B1 (da) | 1994-06-20 |
| FI865187A (fi) | 1987-06-22 |
| DE3636903A1 (de) | 1987-07-02 |
| JPH08187089A (ja) | 1996-07-23 |
| ATE78296T1 (de) | 1992-08-15 |
| JP2553058B2 (ja) | 1996-11-13 |
| NO865192D0 (no) | 1986-12-19 |
| AU6676086A (en) | 1987-06-25 |
| AU599943B2 (en) | 1990-08-02 |
| FI93734C (fi) | 1995-05-26 |
| HUT44614A (en) | 1988-03-28 |
| HU209747B (en) | 1994-10-28 |
| NO865192L (no) | 1987-06-22 |
| NO175003B (no) | 1994-05-09 |
| IL81018A0 (en) | 1987-03-31 |
| GR3005985T3 (ja) | 1993-06-07 |
| IL81018A (en) | 1992-03-29 |
| FI93734B (fi) | 1995-02-15 |
| IE58935B1 (en) | 1993-12-01 |
| EP0229998B1 (de) | 1992-07-15 |
| DK619186A (da) | 1987-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2774260B2 (ja) | 真核性のバラスト部分を有する融合タンパク質 | |
| US5496924A (en) | Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion | |
| JP2566933B2 (ja) | 真核細胞融合タンパク質、その生産及び用途、並びに方法 | |
| KR100227167B1 (ko) | 인체혈청알부민의 n-말단 단편을 함유하는 융합단백질 | |
| JP3369168B2 (ja) | 精製が向上される組換えポリペプチドの発現 | |
| US5989868A (en) | Fusion protein systems designed to increase soluble cytoplasmic expression of heterologous proteins in esherichia coli | |
| JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| Latta et al. | Synthesis and purification of mature human serum albumin from E. coli | |
| JP2667193B2 (ja) | 二機能性タンパク質 | |
| JPH09504166A (ja) | リーダー配列なしに細胞質外に輸送される融合ポリペプチドの発現 | |
| RU2118365C1 (ru) | Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения | |
| PT98711B (pt) | Metodo para a preparacao de alaglu-igf-1 e para a sua renaturacao e metodo para a preparacao de igf-1 humano | |
| EP1066328B1 (en) | Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence and its application to insulin production | |
| JP3188264B2 (ja) | 組換えポリペプチド類の精製法 | |
| AU2016100212A4 (en) | Method of producing a recombinant peptide | |
| JPH0272892A (ja) | 蛋白質の製造方法 | |
| JPH0698004B2 (ja) | Ｔｎｆ発現用新規プラスミド | |
| JPS61274686A (ja) | 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチドをコ−ドする遺伝子 | |
| JP2637392B2 (ja) | 遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法 | |
| Zurawski et al. | Expression in Escherichia coli of synthetic human interleukin-1α genes encoding the processed active protein, mutant proteins, and β-galactosidase fusion proteins | |
| JP2671260B2 (ja) | ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法 | |
| US20020164712A1 (en) | Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence | |
| EP0333691A2 (en) | A recombinant fusion protein, its use and a recombinant vector | |
| JPS63202387A (ja) | Ｄｎａ配列、これを含むベクタ−、該ベクタ−を保有する宿主細胞及びポリペプチドの製造法 | |
| JPS63105681A (ja) | Ｄｎａ塩基配列 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |