PT98711B

PT98711B - Metodo para a preparacao de alaglu-igf-1 e para a sua renaturacao e metodo para a preparacao de igf-1 humano

Info

Publication number: PT98711B
Application number: PT98711A
Authority: PT
Inventors: Lars Skriver; Kim Ry Hejnaes; Henrik Dalboge
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-08-20
Filing date: 1991-08-19
Publication date: 1999-01-29
Also published as: US5459052A; EP0545999B1; US5691168A; US5708134A; EP0545999A1; AU8417091A; DE69126434D1; WO1992003477A1; IE912935A1; PT98711A; ATE154073T1; JPH06500084A

Description

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES

CAMPO DAS CEBOLAS, 1100 LISBOA

TEL.: 888 51 51 / 2 / 3 TELEX: 18356 INPI

TELEFAX :8753 08

Modalidade e n.° (h)

T D

Data do pedido (22)

Classificação Internacional (51)

FOLHA DO RESUMO (Continuação)

Resumo (continuação) (5/

NÃO PREENCHER AS ZONAS SOMBREADAS

ADN que codifica para IGF-1 humano comportando uma extensão no terminal amino e uma sequência de sinal que proporciona a secreção do produto expresso;

ii) de se extrair IGF-1 de terminal amino prolongado a pH } 6,0 mediante a utilização de ureia na presença de um agente de redução e, eventualmente, um aqgente guelante;

iii) de se submeter o extracto a uma cromatogra fia sobre gel de permuta aniõnica, escolhido entre DEAE, DE e FF-Q, utilizando o tampão como descrito na fase ii) ajustado para 1,8-2,2mS e pH de 7,8-8,2;

iv) de se renaturar o IGF-1 de terminal amino prolongado isolado por alteração do potencial redox da mistura reaccional linearmente de -40 mV para +20-40 mV, por diálise contra um tampão contendo etanol em uma concentração compreendida entre 20 e 40% V/V, durante um intervalo de tempo de até horas, com uma concentração de proteína compreendida entre 0,1 e 0,6 mg/ml e uma condutividade compreendida entre 0,15 e 0,3 mS, à temperatura ambiente e a um pH compreendido entre 7,5 e 10,0 e, finalmente, de se acidificar a mistura para um pH inferior a 5;

v) de se separar a extensão do terminal amino usando-se DAPI (EC 3,4,14,1);

vi) de se isolar IGF-1 autêntico renaturado do

DSM-5 -,.MOORBS«SÍ»&

INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES “ FOLHA DO RESUMO (Continuação)

NÃO PREENCHER AS ZONAS SOMBREADAS

DSM-5 -.MOORB5«333

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE AlaGlu-IGF-1 E PARA A SUA RENATURAÇÃO E MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE IGF-1 HUMANO

A presente invenção refere-se a um novo factor do crescimento semelhante a insulina (FCI-1) que possui uma extensão amino-terminal,a uma sequência de ADN que codifica o FCI-1 que possui a referida extensão amino-terminal,a um plasmido recombinante constituido pelo ADN que codifica o FCI-1 humano que possui a extensão amino-terminal,a um microrganismo transformante que contém o referido plasmido recombinante,a um método para a renaturação de AlaGlu-FCI-1,a um método para se produzir FCI-1 humano e à utilização de um FCI-1 com umá extensão amino-terminal para a preparação de um FCI-1 maduro. A presente invenção é especialmente adequada na produção em larga escala do FCI-1.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

Os factores do crescimento semelhantes a insulina (FCI) constituem uma família de proteínas que possuem propriedades de estimulação do crescimento e semelhantes às através da sua fixação aos receptores da superfície celular nos tecidos alvo (Salmon, W.D.Jr., e Daughaday, W.H.: J. Lab. Clin. Med., 49, 825-836, 1957). A principal acção biológica local dos FCI consiste na sua acção como um potente agente mitogénico apesar do seu efeito ser inferior ao medido, por exemplo para FCDP e FCF (Froesch e outros.: Ann. Rev. Phyiol. 47, 443-467 (1985). Conjuntamente com o FCDP, o FCI-1 apresenta efeitos biológicos sinérgicos (Kato e outros,: Eur. J. Biochem., 129,685-690 (1983), Stiles e outros.: P.N.A.S.,

Estados Unidos da	América,	76,	1279-1283	,1979). Os
principais efeitos	biológicos	do	FCI-1 foram	por isso
considerados como	uma função	de	propagação	de reacções

mitogénicas e de manutenção do crescimento iniciado por outros factores, sob condições devidamente controladas (0 Keefe e outros.: Mol. Cell. Endocrinol., 31, 167-186 (1983).

A potência do FCI-1 como um factor mitogénico e a sua ampla e potencial utilização por exemplo na cicatrização de feridas e no metabolismo do azoto, encorajou um grande número de empresas biofarmacêuticas a tentar exprimir o FCI-1 em diversos organismos, devido ao facto de no plasma humano apenas se encontrar presente uma pequena quantidade. A produção do FCI-1 em leveduras é favorecida por uma purificação muito simples de um polipéptido correctamente reconstituído. No entanto existem determinadas desvantagens significativas associadas à utilização destes /

>r sistemas de expressão. O rendimento da fermentação é baixo ( alguns mg por litro de caldo de fermentação) e o risco de se obterem formas glicosiladas ligadas ao 0 da molécula é significativo (Gillerfors e outros.: J. Biol. Chem., 264, 2748-53, 1989).

A expressão nas bactérias foi até à data a abordagem melhor sucedida e que proporcionou produções elevadas de FCI-1 e do FCI-2, mas na sua maioria em formas associadas a células. Também se tentou exprimir o FCI-1 fundido com um péptido estabilizante. Um péptido como este possui normalmente as mesmas dimensões do próprio FCI-1, e pode possuir propriedades fisico-químicas que facilitem a purificação da proteína resultante. Clivou-se a proteína de fusão quer por clivagem química quer por clivagem enzimática, deixando a proteína madura pronta a ser isolada.

A extração do péptido recombinante (péptido de fusão) encontra-se normalmente associada a um passo de desnaturação seguido da renaturação in vitro do FCI-1 extraído, o que origina a conformação nativa do FCI-1.

Nos sistemas bacterianos descritos até este momento, foram descritos rendimentos de produção de 1,5 gramas por litro de caldo de fermentação, por expressão biossintética de HCh. No entanto, apesar do elevado rendimento de expressão , apenas se obtiveram pequenas quantidades do FCI-1 nativo devido à formação não controlada de pontes dissulfeto intra e

intermoleculares. Em consequência, à expressão bacteriana de produtos contendo as referidas pontes dissulfeto segue-se a renaturação in vitro durante a última fase de purificação dos polipéptidos o que origina normalmente grandes perdas de produto.

	0 objectivo da presente	invenção	consiste,	em
primeiro	lugar, na ultrapassagem dos	problemas	descritos	na
técnica	anterior no que se refere à	produção	do FCI-1	em

microrganismos, em grandes quantidades.

No contexto da presente invenção utiliza-se a palavra reconstituição para se designar o processo de acordo com o qual se estabelece a estrutura terciária da proteína, incluindo a formação das pontes dissulfeto intramoleculares.

A palavra renaturação utiliza-se para se referir o estabelecimento da estrutura terciária nativa das proteínas.

A palavra desnaturação utiliza-se para se designar a ruptura da estrutura terciária das moléculas, rompendo as pontes dissulfeto e/ou o desenrolar das proteínas.

BREVE DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao FCI-1 humano que possui uma extensão amino-terminal AlaGlu.

A extensão amino-terminal permite a elevada expressão do FCI-1 prolongado, a fácil renaturação ou a

reconstituição do FCI-1 e facilita a sua completa clivagem utilizando o enzima dipeptidil-amino-peptidase (DAP-1, EC 3.4.14.1) para formar o FCI-1 maduro.

Descobriu-se então, com surpresa, que a extensão amino-terminal AlaGlu permite ultrapassar os problemas da técnica anterior. Para além disso, é possível purificar o FCI-1 que possui uma extremidade N-terminal correcta, a partir da mistura de reacção.Pode isolar-se AlaGlu-FCI-1 como um produto intermédio com uma pureza de 80%, de preferência de 90% e que apresenta quando correctamente reconstituído a actividade biológica do FCI-1.

A porção de ADN que codifica o FCI-1 pode consistir em ADNc, ADN cromossómico ou ADN inteira ou parcialmente de síntese em que qualquer porção restante do ADN pode consistir nos correspondentes ADNc ou ADN cromossómico.

As sequências nucleotídicas utilizadas para a extensão amino-terminal e qualquer porção do ADN de síntese que codifique o FCI-1 são preferencialmente seleccionadas de modo a proporcionarem os codãos preferenciais para o microrganismo seleccionado.

A expressão de AlaGlu-FCI-1, do amino- terminal prolongado origina um nível de expressão de 1,5 g/litro (0,2 mM) de AlaGlu-FCI-1 antes da extracção. Isto representa aproximadamente 4 a 5 vezes a expressão específica obtida em sistemas em que se aplicam proteínas de fusão mais longas. No

entanto, nem todas as extensões amino-terminais de cadeia curta proporcionam elevados níveis de expressão. A expressão de , por exemplo, MetGluAlaGlu-FCI-1, (AlaGlu)g-FCI-1, ou do próprio FCI-1 origina níveis de expressão 10 a 25 vezes menores que o nível obtido quando se expressa AlaGlu-FCI-1.

Pode preparar-se o ADN que codifica AlaGlu-FCI-1 a partir de uma sequência de ADN clonado que codifica os 70 aminoácidos do FCI-1 que se encontra acoplado à sequência seguinte de ADN de cordão duplo, produzida por síntese, de tal modo que a extremidade 3' do cordão + esteja acoplado à extremidade + 5' do gene que codifica o FCI-1 e a extremidade 5' do cordão de ADN de síntese se encontre acoplada à extremidade 3' do gene por uma ligação complementar +5' CGATG GCT GAA

-3' TAC CGA CTT em que os dois primeiros nucleótidos do cordão + são uma projecção do sítio de restrição Ciai e a sequência nucleotídica seguinte codifica os aminoácidos MetAlaGlu.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção proporciona-se um gene, apto para produção industrial, que codifica um FCI-1 terminalmente prolongado por um grupo amino que assegura a formação de um produto estável e a sua secreção no espaço periplasmático ou directamente no meio.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector recombinante que engloba ADN

que codifica o FCI-1 humano e que possui uma extensão aminoterminal AlaGlu. 0 vector pode apresentar-se na forma de um plasmido que engloba um promotor a jusante do ADN que codifica AlaGlu-FCI-1 e que engloba preferencialmente o promotor sensível à temperatura , X PR, directamente acoplado ao ADN que codifica AlaGlu-IGF-1 e a sequência sinal OmpA que proporciona a secreção de AlaGlu-FCI-1 no espaço periplasmãtico ou directamente no meio. Demonstrou-se que este vector se encontrava apto para a produção industrial quando inserido na E. coli.

De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção proporciona microrganismos transformantes que englobam os referidos plasmidos recombinantes.

De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção, refere-se a um método para a renaturação de AlaGlu-FCI-1 em que AlaGlu-FCI-1, na sua forma reduzida e desnaturada, é reconstituído na presença de um reagente mercapto, na sua forma reduzida, numa solução aquosa tampão. A renaturação ocorre durante a alteração controlada do potencial redox de -40 mV para + 20 mV subindo até aos +40 mV por diálise em presença de um tampão contendo entre 20 e 40%, v/v, de etanol durante um período superior a 5 horas, para uma concentração proteica compreendida entre 0,1 e 0,6 mg/ml e para uma condutividade compreendida entre 0,15 e 0,3 mS, à temperatura ambiente e a um pH compreendido entre 7,5 e

10,0 e finalmente por acidificação da mistura para um pH inferior a 5.

O reagente mercapto utilizado , de acordo com o método da presente invenção, pode ser constituido por qualquer reagente do grupo mercapto que não forme produtos intermédios indesejáveis, por exemplo, 2-mercapto -etanol, cisteína, cisteamina , dando-se preferência à cisteína.

De acordo com a presente invenção , utiliza-se o reagente mercapto numa concentração compreendida entre 0,0110 mM, de preferência numa concentração compreendida entre 0,1 e 5 mM e preferêncialmente a uma concentração de 1 mM.

A solução aquosa tamponada na qual se efectua a reconstituição ou renaturação , de acordo com a presente invenção, é tamponada a um pH que se situa no intervalo compreendido entre 8,0 e 10,0, preferêncialmente a um pH de 9,0.

Nalguns casos é preferível efectuar a renaturação de acordo com a presente invenção na presença de etanol, numa quantidade superior a 40% e de preferência cerca de 25%. Esta adição aumenta o rendimento do método e o eventual efeito benéfico do etanol torna-se facilmente demonstrável por simples experiências preliminares.

De acordo com um sexto aspecto a presente invenção refere-se a um processo para a produção do FCI-1 caracterizado por:

i) se fazer a expressão de um FCI-1 com uma extensão aminoterminal, num microrganismo transformado com um vector de expressão que engloba um promotor susceptível de ser induzido, directamente acoplado ao ADN que codifica o FCI-1 humano que possua uma extensão amino-terminal e uma sequência sinal que proporcione a secreção do produto expressado, ii) se fazer a extracção do FCI-1 com a extensão aminoterminal, a um pH de 6,0 utilizando uma elevada concentração de ureia na presença de um agente de redução e, eventualmente de um agente quelante, iii) se submeter o produto extraído a cromatografia num gel de permuta de aniões seleccionado entre grupo constituído por DEAE, DE e FF-Q utilizando o mesmo tampão a que se fez referência no passo ii),ajustado para 1,8-2,2 mS e a um pH compreendido entre 7,8 e 8,2, iv) se fazer a renaturação do FCI-1 que possui a extenção amino-terminal, alterando o potencial redox da mistura de reacção, linearmente de -40 mV para +20 até +40 mV por diálise na presença de um tampão que contenha entre 20 e 40% de etanol , durante um período de tempo superior a 5 horas, conservando a concentração de proteínas compreendida entre 0,1 e 0,6 mg/ml e para uma condutividade de 0,15-0,3 mS, à temperatura ambiente encontrando-se o pH compreendido entre

7,5 e 10,0 e finalmente acidificando a mistura para um pH inferior a 5.

v) se fazer a clivagem da extensão amino-terminal utilizando

DAP-1, vi) se fazer o isolamento e a renaturação do autêntico FCI-1 humano renaturado recorrendo à cromatografia em líquido a elevada pressão-fase inversa (CLEP-FI) e à cromatografia de permuta catiónica e vii) se fazer a filtração em gel e a liofilização do FCI-1 humano isolado.

Pode levar-se a efeito o método da presente invenção, por expressão do FCI-1 que possui a extensão aminoterminal, num microrganismo tal como uma bactéria grampositiva ou numa bactéria gram-negativa tal como a Escherichia, de preferência a E. coli, que constitui um hospedeiro muito conveniente devido à sua aplicabilidade industrial.

De acordo com a presente invenção, o promotor pode consistir num promotor sensível à temperatura tal como X pp, XpL ou Xpp» e a sequência sinal pode consistir numa das sequências LamB, OmpA ou OmpF, com a finalidade assegurar uma expressão e secreção adequadas.

Ala-Glu-FCI-1 expressa-se em níveis elevados , utilizando-se o promotor λρρ directamente acoplado ao gene que codifica AlaGlu-FCI-1 e a sequência sinal OmpA proporciona a secreção de proteína numa forma estável.

Efectua-se a extracção de Ala-Glu-FCI-1 sob condições de redução e de renaturação utilizando ureia, agentes redutores tais como cisteína, 2-mercapto-etanol ou ditiotreitol e eventualmente um agente ou agentes quelantes tais como EDTA, no sentido de se destruir a estrutura terciária imposta em AlaGlu-FCI-1 pelo sistema de expressão.

A extracção de Ala-Glu-FCI-1 numa forma totalmente desnaturada efectua-se preferencialmente utilizando um tampão que contenha 7M de ureia, 50 mM de Cys no ponto isoeléctrico (8,4) ou pH 8,0.

A maioria das proteínas contaminantes provenientes de E.coli são removidas do AlaGlu-CIF-1 reduzido e desnaturado por cromatografia de permuta aniónica no ponto isoeléctrico. Efectua-se preferencialmente esta cromatografia para valores de condutividade de 2,0 mS,a pH 8,0 e preferencialmente por cromatografia por lotes sobre DE-52 (Whatman) repetida em Sefarose de tipo Q de Fluxo Rápido (FF-Q^R) .

Renatura-se o AlaGlu-FCI-1 desnaturado e reduzido, obtendo-se AlaGlu-FCI-1 estável e correctamente reconstituído.

Efectua-se o processo de renaturação utilizando uma diálise sob condições controladas de potencial redox, pH, concentração de proteínas e temperatura na presença de reagentes quelantes, de desnaturação e mercapto e na presença

de solventes orgânicos.

tampão de diálise caracteriza-se pela presença de pequenas quantidades de agente redutor ( como por exemplo DDT, Cys ou 2-mercapto-etanol), de um agente quelante, de um composto orgânico que interactue com a ligação hidrofóbica ( tal como o terc-butanol, 2-propanol, etanol, metanol) e finalmente uma substância tampão para conservar um intervalo de pH bem definido, habitualmente compreendido entre 8,8 e 9,0. De acordo com um dos aspectos da presente invenção, utiliza-se a seguinte composição tampão: 50 mM de Tris-HCl, 1 mM de Cys, 2 mM de EDTA e etanol a 25% a um pH de 9,5.

Preferencialmente leva-se a efeito a renaturação alterando linearmente o potencial redox de aproximadamente 30 mV para aproximadamente +25 e +30 mV durante um período de 3 horas. Calibraram-se os eléctrodos redox utilizando uma solução de hidroquinona que possui um potencial redox bem definido de 463 mV.

É preferível efectuar a renaturação para valores de condutividade de 0,2 mS uma concentração de proteínas compreendida entre 0,1 e 0,4 mg/ml e um valor de pH que varie entre 8,5 e 9,5, de preferência a um valor de pH compreendido entre 8,5 e 9,0 de acordo com a medição efectuada em tampão antes da adição de etanol numa concentração compreendida entre 20% e 40% (v/v), a uma temperatura compreendida entre 20 e 22°C.

De acordo com um aspecto mais preferencial efectua-se a renaturação de AlaGlu-FCI-1 fazendo passar o polipéptido através de um dispositivo de fibras ocas (Nephross Presto,H.P., Organon Teknika) a um débito que varie entre 25 e 250 ml/minuto, de preferência entre cerca de 100 ml/minuto, enquanto se altera o potencial redox, até se pôr cobro ao processo mediante a adição de ácido acético 5M até se obter um pH inferior a 5, de preferência um pH de 4,0.

Concentrou-se então a solução resultante por cromatografia de permuta catiónica na presença de solventes orgânicos antes de se clivar a extensão amino-terminal. Efectuou-se a permuta catiónica utilizando de preferência um material forte de permuta iónica, tal como FF-S ou FF-SPr, na presença de um álcool a 10-40%, tal como o metanol, etanol, propanol ou butanol, de preferência etanol a 25% e utilizando um gradiente de pH compreendido entre 3,5 e 7,5.

Efectua-se, a clivagem do AlaGlu-FCI-1 renaturado utilizando de preferência a exopeptidase (DAP-1) para se proporcionar uma clivagem rápida e eficiente do precursor do FCI-1. Utiliza-se a exopeptidase preferêncialmente numa concentração de 0,08 unidades de DAP-1 por mg de proteína , na presença de NaCl, ajustando-se a concentração da proteína para , aproximadamente 1 mg/ml em tampão acetato 40 mM a pH 4,0 e a 37°C.

A purificação do FCI-1 por CLEP de fase inversa

após a clivagem utilizando DAP-1 pode ser efectuada alternativamente em coluna PR18 de tipo comercial (Lichosorb) ou em coluna de tipo RP 18 de silanoilo C18 feita por encomenda. De preferência utiliza-se uma coluna RP18 de silanoilo A/S de 15 μιη da Novo Nordisk cuja eluição é efectuada a pH 3,0 em tampão fosfato de sódio 0,1 M com gradiente linear de etanol variando entre 30 e 50%

Todos os FCI-1 que não se encontrem correctamente reconstituídos serão removidos por cromatografia de fase inversa numa coluna RP18 de tipo comercial por exemplo Lichrosorb,ou numa coluna RP18 de silanoilo C18, feita por encomenda utilizando etanol como fase móvel e removendo o

AlaGlu-FCI-1 por cromatografia de permuta catiónica , partindo de condições ácidas e aplicando um gradiente de pH compreendido entre 4,0 e 7,0, utilizando o mesmo sistema tampão que se usou no anterior procedimento de permuta catiónica.

Submete-se depois o CIF-1 purificado a liofilização e filtração através de gel .0 FCI-1 liofilizado é capturado em ureia 7 M e aplicado a uma coluna Sephadex GPC G50F equilibrada com ácido acético 0,1 M, a 4°C. Armazena-se o material purificado a 4°C.

Finalmente submete-se o FCI-1 altamente purificado a diálise, filtração através de gel e a liofilização dando origem a um pó quimicamente estável.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, purifica-se parcialmente o FCI-1 que possui a extensão amino-terminal, para se obter uma forma totalmente desnaturada e reduzida.

Obtém-se uma separação selectiva do FCI-1 com a extensão amino-terminal e a sequência aminoácida correctas, utilizando uma cromatografia de permuta catiónica, após clivagem da extensão amino-terminal utilizando DAP-1 de acordo com o princípio descrito por Dalboege, H. e outros FEBS Lett. 246 (1,2) 89-93, 1989.

Obtem-se a remoção das formas do FCI-1 incorrectamente renaturadas (reconstituídas ) por CLEP de fase inversa, utilizando uma matriz de sílica octadecildimetil-silil-substituida constituída por partículas esféricas de 15μ,sendo o diâmetro dos poros de 300 Â .

Efectuou-se a caracterização do FCI-1 renaturado, no que se refere ao correcto posicionamento das pontes dissulfeto, utilizando duas clivagens enzimáticas seguidas de análise da carta peptídica e análise sequencial.

O processo, de acordo com a presente invenção possui ainda a vantagem de poder ser utilizado directamente.

Um dos aspectos importantes da presente invenção reside no facto do procedimento de extracção proporcionar um elevado rendimento ( próximo dos 100%) de AlaGlu-FCI-1. Purifica-se então o FCI-1 que possui a extensão amino17

-terminal utilizando um passo que consiste especificamente na cromatografia por permuta aniónica de tipo FF-Q sob condições de pl tais que o AlaGlu-FCI-1 não se fixa à resina, considerando que sob estas condições específicas se removem as proteínas originadas na E.Coli e um polipéptido que exibe características fisico-químicas semelhantes às do

AlaGlu-FCI-1 .

Um outro aspecto importante da presente invenção reside no passo de renaturação específica. Este passo caracteriza-se pelo controlo contínuo do potencial redox, rigor iónico e temperatura durante a renaturação do Ala-GluFCI-1.

Descobriu-se que as modificações da pré-sequência alteram dràsticamente as condições de renaturação.

A presente invenção proporciona, também um novo conceito para a clivagem de uma extensão N-terminal do FCI-1, em que se utiliza DAP-1 (EC 3.4.14.1) e, se efectua uma desnaturação moderada do FCI-1 correctamente reconstituído antes do passo final de cromatografia por permeação em gel.

Deste modo, na presente invenção, aplica-se uma série de condições únicas que tomadas em conjunto melhoram a qualidade do produto e o rendimento de todo o processo que decorre a seguir à fermentação.

Pode levar-se a efeito o referido processo em quantidades que podem ascender a gramas por ensaio, obtendo-se um elevado grau de purificação, tal como é demonstrado

pelo baixo teor de proteínas originadas pela E. coli ( < 1 ppm) .

Verificou-se que o produto possuia uma composição aminoácida, uma sequência aminoácida, pontes dissulfeto e uma cartografia peptídica idêntica às observadas para o FCI-1 purificado a partir do plasma humano.

Caracterizou-se posteriormente o produto,pelo facto de existir uma banda única sobre gel de SDS-poliacrilamida e sobre os geles nativos. Finalmente verificou-se por CLEP e por CGP analíticas de fase inversa, que o produto possuia uma pureza superior a 95%

A presente invenção refere-se também à utilização do FCI-1 possuindo a extensão amino-terminal AlaGlu, na preparação do FCI-1 maduro.

A actividade biológica do produto obtido , de acordo com o método descrito na presente invenção, é igual à do FCI-1 nativo, purificado, a partir do plasma. Pode-se utilizar o produto, por exemplo, para o tratamento de feridas durante o período de cicatrização das referidas feridas, cicatrização de fracturas ósseas, distúrbios de carácter metabólico e de diabetes do tipo II (NIDDM). Pode-se formular o FCI-1 , de acordo com métodos conhecidos na formulação de preparações farmacêuticas ou de formas de administração, que incorporem o FCI-1.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A descrição das Figuras , que a seguir se efectua, contribuirá para melhor ilustrar a presente invenção:

A Fig 1 apresenta a estratégia de clonagem de um vector que codifica Ala-Glu-FCI-1;

A Fig. 2 apresenta um diagrama de uma CLEP de Ala-Glu-FCl-1 parcialmente purificado, nas suas formas desnaturada e reduzida;

A Fig. 3 apresenta um diagrama de uma CLEP de AlaGlu-FCI-1 parcialmente purificado, na sua forma renaturada;

A Fig. 4 apresenta um diagrama de uma CLEP do FCI-1 com um grau de pureza superior a 95%;

A Fig. 5 apresenta uma sequência de ADN do pHD 147 que codifica o FCI-1;

A Fig.6 apresenta um diagrama de Ala-Glu-FCI-1 por CLEP-FI após renaturação por diálise num dispositivo de fibras ocas;

A Fig. 7 apresenta um diagrama de Ala-Glu-FCI-1 por CLEP-FI após renaturação por diluição;

A Fig.8 apresenta um diagrama de Ala-Glu-FCI-1 por CLEP-FI após renaturação por dessalinização;

A Fig. 9 apresenta um diagrama de Ala-Glu-FCI-1 por CLEP-FI após renaturação por diálise.

A partir deste momento proceder-se-à à exemplificação da presente invenção tendo como finalidade uma

melhor compreensão da mesma.

PARTE EXPERIMENTAL

EXEMPLOS

Exemplo 1

Construção do gene do FCI-1

Construiu-se um gene de síntese para o MetGlu-FCI-1 com base numa sequência aminoácida publicada (Jansen e outros, 1983). Utilizando codãos óptimos de E. coli construiu-se o gene a partir de fragmentos de síntese os quais depois de recozidos e purificados sobre gel foram clonados, gradualmente entre os sítios de restrição únicos nos vectores de clonagem adequados (Fig.l ).

Construção do plasmido pHD!45 (plasmido que codifica aa 1-30 de MetGlu-FCI-1):

Preparação do ligante: trataram-se separadamente com quinase 0,4 μg de ligantes na placa superior a, na placa inferior a e na placa superior b , adicionando-lhes 1 μΐ de tampão quinase (10 X), 1 μΐ de ATP 10 mM, 1 μΐ de PNK T4 (10 unidades) e 6 μΐ de H2O. Incubou-se a 37°C, durante 30 minutos. Aqueceu-se depois a mistura até aos 65°C durante 10 minutos.

Efectuou-se 0 recozimento de 10 μΐ do ligante na posição superior a tratado com quinase e 10 μΐ do ligante na posição inferior a tratado com quinase, por aquecimento até se atingirem os 100 °C durante 3 minutos e arrefecimento

em gelo.

Efectuou-se o recozimento de 10 μΐ do ligante na placa superior b tratado com quinase e de 0,4 μg do ligante na placa inferior b ( não tratado com quinase) por aquecimento até aos 100°C durante 3 minutos e por arrefecimento em gelo.

União dos ligantes: misturou-se 20 μΐ de a, 11 μΐ de b, 4 μΐ da mistura ligase (10 X), 1 μΐ de ligase (0,5 unidades) e 4 μΐ de H₂0 e, incubou-se a 15°C durante 2 horas. Fez-se passar a mistura, através de um gel de agarose a 1,8%, de baixo ponto de fusão. Isolou-se um fragmento de 100 pb que se purificou utilizando um agente de eluição. Após precipitação, dissolveu-se o fragmento em 50 μΐ de H₂O. Tomaram-se 2 μΐ da solução que se examinaram sobre gel de agarose a 2%.

Preparação do plasmido

Clonou-se o ligante anteriormente purificado, no plasmido pBR322, digerido com Clal/Ball. Para facilitar a digestão de pBR322 com Bali é necessário efectuar a cultura deste plasmido numa estirpe não metilante de E. coli. Por consequência, o pBR322 foi transformado utilizando a estirpe bacteriana E. coli GC117 que é DCM menos e DAM menos. Digeriu-se 10 μΐ de pBR322 ( de GC117) utilizando 5 U de Clal/3 u de Bali num tampão de um sal inferior , num volume final de 100 μΐ. A incubação realizou-se a 37°C, durante 2 dias e 2 noites.

Purificou-se um fragmento de ADN que possuia aproximadamente 1900 pb ( fragmento do plsmido), sobre gel de agarose a 0,7%, de baixo ponto de fusão. Após a eluição com um agente de eluição, dissolveu-se o ADN em 40 μΐ de H₂O. Examinou-se sobre gel uma aliquota de 1 μΐ da referida solução.

Ligação do pHD145:

Efectuaram-se as seguintes ligações:

	A	Β	C
ADN 100 pb	3 μΐ	3 μΐ	3 μΐ
Ligante a+b
pBR322 Clal/Ball	1 μΐ	0,05 μΐ	0,05 μΐ
ADN ligase T4	0,05 unid.	0,05 unid.	1 unid.
	(1 Hl)	(1 μΐ)	(1 μΐ)
mist.lig. (10X)	1 μΐ	1 μΐ	1 μΐ
h₂o	4 μΐ	4 μΐ	4 μΐ
	Controlo Α	Controlo Β	Controlo C
ADN 100 pb	0	0	0
ligante
pBR322 Clal/Bal	1 μΐ	0,05 μΐ	0,05 μΐ
ADN ligase T4	0,05 unid.	0,05 unid.	1 unid.
mist.lig. (10X)	1 μΐ	1 μΐ	1 μΐ
h₂o	7 μΐ	7 μΐ	7 μΐ

Todos os produtos ligados foram incubados a 15°C durante 3 horas, transformados utilizando MC1061, colocados em placas de agar contendo LB + ampicilina (LBA) sobre filtro de nitrocelulose e incubados a 37°C durante a noite.A leitura das placas efectuada no dia seguinte demonstrou que o

número de colónias nas placas de controlo era superior ao das placas às quais se tinha adicionado o fragmento de 100 pt». Por este motivo se decidiu fazer o rastreio dos transformantes positivos por hibridação do ADN.

Hibridação das colónias:

Replicou-se uma cópia de cada um dos filtros sobre nitrocelulose recém-preparada transferiram-se ambos os filtros para placas contendo LBA e incubaram-se a 37°C durante a noite. Efectuou-se a lise das bactérias existentes sobre um dos filtros durante 2 minutos em NaOH 0,5 M, NaCl

1,5 M, seguindo-se a lavagem com Tris 0,5M, a pH 8, NaCl

1,5 M, durante 2 minutos e 2 X SSC durante 2 minutos.

Secaram-se os filtros recozeram-se durante 1 hora a 80°C e hibridaram-se com uma sonda.

Preparação da sonda:

Misturou-se 1 μΐ (0,4 |ig) de FCI-1 na placa superior a, 1 μΐ (0,4 μg) do FCI-1 na placa superior b, 100 μθϊ de ATP (10 μΐ) 2 μΐ de tampão quinase (10 X), 1 μΐ { 5 unidades) de PNK,misturou-se H2O até 20 μΐ e incubou-se a 37°C durante 30 minutos. Adicionaram-se os filtros recozidos após hibridação prévia a 65“C, adicionou-se à sonda anterior os filtros cozidos num volume de hibridação de 50 ml. Efectuou-se a hibridação a 60°C durante a noite . Lavou-se os filtros com 2 X SSC efectuando-se em seguida a sua lavagem em 0,1 X SSC a 50°C ,secagem e colocação sobre uma película.

«I

Efectuou-se a cultura de 15 colónias positivas em LBA, a 37°C durante a noite. A análise do ADN de uma minipreparação, utilizando os enzimas Clal/PvuII demonstrou, após passagem por gel de agarose a 1,5%, que todas os clones com excepção do clone 11 incorporavam o fragmento de ADN esperado de 745 pb. No sentido de se analisarem alguns dos clones, inclusivamente quanto à presença do fragmento Blal/Clal de aproximadamente 100 pb, transformaram-se os clones 1,2, 3 e 4 na E. coli GC117 e colocaram-se em placas de agar que continham LBA. Seleccionou-se apenas uma colónia de cada uma das quatro placas e utilizou-se para se efectuar a propagação do ADN de uma maxipreparação. A digestão das preparações dos quatro plasmidos demonstrou que as construções 1,2 e 3 possuíam os sítios de restrição esperados, mas no clone 4 não existia o sítio Bali.

Construção de pHD146 ( plasmido que possui uma sequência que codifica aa 1-56 de MetGlu-FCI-1):

Digeriu-se 100 μ,Ι de ADN de uma maxipreparação respectivamente de pHD146-l, -2 e -3 com 20 unidades de Bali durante a noite a 37°C, num sal inferior. Depois de se ter examinado a digestão em gel de agarose, digeriu-se o ADN com 20 unidades de Pvul durante a noite a 37°C num sal superior. Após a digestão, fraccionou-se o ADN numa preparação de gel de agarose a 0,7%. Isolou-se um fragmento de ADN de 750 pb, a partir de cada colónia, que se eluiu, precipitou e dissolveu em 20 μΐ de H2O à temperatura de ebulição durante 5 minutos e arrefeceu-se com gelo. 0 ligante recozido foi depois purificado sobre uma preparação de agarose a 2,5%, isolou-se uma banda de 70 pb, eluiu-se a partir do gel utilizando um agente de eluição, precipitou-se e dissolveu-se em 20 μΐ de H₂O.

Adicionou-se ao ligante purificado 1 μΐ de tampão quinase diluido 10 vezes, 1 μΐ de ATP 10 mM, 5 unidades de PNK e um volume de H2O até perfazer 10 μΐ, ao que se seguiu a sua incubação a 37°C, durante 1 hora.

Digeriu-se 20 μΐ de ADN do pBR322 com 50 unidades de PvuI/50 unidades de NruI num sal superior até perfazer um volume final de 100 μΙ.Αρόβ a digestão, fraccionou-se o ADN sobre um gel e isolou-se um fragmento de aproximadamente 2800 pb, purificou-se com um agente de eluição, precipitou-se e dissolveu-se em 20 μΐ de H2O.

As ligações que a seguir se indicam, A,B, controlo C e controlo D foram efectuadas com fragmentos isolados de pHD145-l, -2 e -3 respectivamente

	A	Β	Controlo C	Controlo D
mist. lig.lOX	2 μΐ	2 μΐ	2 μΐ	2 μΐ
frag. 2800 pb	0,5 μΐ	0,5 μΐ	0,5 μΐ	0,5 μΐ
frag. 750 pb lig.c+d tratado	0,5 μΐ	0,5 μΐ	0,5 μΐ	0
c/ cinase,70 pb	10 μΐ	1 μΐ	0	0
H₂O	6 μΐ	15 μΐ	16 μΐ	16,5 μΐ
ADN T4 ligase 0,1 υ/μΐ	0,1 υ	0,1 υ	0,1 υ	0,1 υ

Incubaram-se as ligações anteriores a 15°C durante a noite, transformaram-se com MC1061 e colocaram-se em placas contendo LBA sobre um filtro de nitrocelulose. Utilizaram-se cinco placas por ligação.

Após incubação durante a noite a 37°C, replicaramse e trataram-se todas as placas tal como anteriormente se descreveu para a construção do pHD145. Utilizou-se como sonda 1 μΐ (0,4 μg) de ligante na placa superior c e 1 μΐ (0,4 μΐ) de ligante na placa superior d,marcados tal como se descreveu para o pHD145. As condições de hibridação e de lavagem foram idênticas às anteriormente descritas. Após desenvolvimento da película, seleccionaram-se 24 colónias positivas que se propagaram numa minipreparação de ADN em meio LBA. Analisouse o ADN por digestão com NruI/EcoRI e verteu-se sobre gel de agarose a 1,5%. Os clones 3,4,5,8,13,16,18,19,20 e 21 pareciam correctos. Seleccionou-se os clones 3 e 13 para uma análise mais rigorosa e propagação numa minipreparação de ADN.

Os 24 clones isolados foram obtidos a partir das seguintes ligações:

	Reacção de Ligação	pHD145-de 750 pb	Placa NS
1	A	1	b
2,3,4,5,6	B	1	a
7,8	B	1	c
9	A	2	b
10	A	2	c
11,12,13,14	B	2	c
15,16	B	2	e
17	A	3	c
18	A	3	d
19,20,21	B	3	c
22,23,24	B	3	d

Clonagem de pHD147 ( plasmido que possui a sequência que codifica aa 1-70 de MetGlu-FCI-1 (Fig. 1):

Digeriu-se 50 μΐ da maxipreoparação de ADN de pHD146-3 e pHD146-13 respectivamente com 20 unidades de NruI e 15 unidadesde Pvul num volume final de 55 μΐ ( meio salino). Digeriu-se 10 unidades de ADN do plasmido pBR322 com 15 unidades de Pvul e 36 unidades de HindIII , num volume final de 55 μΐ (meio salino). Fraccionaram-se as duas digestões sobre gel de agarose a 0,8% de baixo ponto de fusão. A partir dos clones pHD146-3 e -13 isolou-se um fragmento de 800 pb que se eluiu, precipitou e dissolveu em 50 μΐ de H2O. A partir de pBR322 isolou-se um fragmento de 3500 pb que se eluiu, precipitou e dissolveu em 50 μΐ de H2O.

Examinou-se o ligante FCI-1 que se recozeu e purificou sobre uma preparação de gel de agarose a 2,5%, tal como se descreveu para os ligantes anteriores.

Isolou-se um fragmento de 20 pb que se dissolveu em

μΐ de Η2Ο. Todos os fragmentos anteriormente referidos foram examinados sobre gel de agarose .

Ligação de pHD147:

	A	Β
pBR322-frag. 3 500 pb	1,5 μΐ	1,5 μΐ
PHD146-3- frag 3800 pb	10 μΐ	10 μΐ
ligante e de 50 pb	2 μΐ	0 μΐ
mist. lig. (10 X 10)	1,5 μΐ	1,5 μΐ
ADN T4 ligase 1 υ/μΐ	1 unid.	1 unid.

Efectuou-se a reacção de ligação utilizando o fragmento de 800 pb do pHD146-3 assim como do pHD146-13.Incubou-se a reacção de ligação durante 3 horas a 15°C, transformou-se por introdução na E. coli MC1061 e colocou-se em placas LBA. Replicaram-se os filtros, lavaram-se e hibridaram-se, tal como anteriormente descrito. Utilizaram-se 2 μΐ do FCI-1 e de ADN inferior como uma sonda. Seleccionaram-se 6 clones positivos dos filtros em que se tinha utilizado respectivamente o ADN dos clones pHD146-3 e pHD146-13. Designaram-se estes clones por pHD-l-> 6 (pHD146-3 +ligante e) e pHD147-7-> 12 (pHD146-13 + ligante e). A análise duma minipreparação de ADN de 12 clones utilizando a mistura de enzimas de restrição EcoRl/Hindlll demonstrou que todos os clones possuiam o fragmento esperado. Seleccionaram-se os clones 1, 2, 7 e 8 para uma análise mais rigorosa em que se utilizou a digestão com os enzimas de restrição HindIII/Clal,

PVuII/BamHI, PstI/BamHI. Segundo parecia todos os clones possuiam o padrão de restrição esperado. Propagaram-se os clones pHD147-l e pHD147-7 numa maxipreparação de ADN. Isolou-se simultâneamenteo ADN de uma minipreparação a partir dos clones 1,2,7 e 8 digeridos com as enzimas EcoRI, Hindiii e isolou-se um fragmento de 220 pb que se clonou em M13, MP18 e MP19 e se submeteu a análise sequencial. A análise sequencial do ADN demonstrou que os clones englobavam a sequência de ADN esperada.

Exemplo 2

Produção Citoplasmática de MetGlu-FCI-1

Digeriu-se o plasmido pHD-147-1 com Hindiii na presença de ADN-polimerase de Klenow e dNTP, extraiu-se com fenol, precipitou-se e digeriu-se com Ciai. Introduziu-se o gene excisado no plasmido de expressão pHD86SP13 (Dalboge e outros, 1987). Biotechnol. 5, fs 161) e introduziu-se na

E.coli MC1061.

Analisaram-se extractos de bactéria contendo o plasmido de expressão num ensaio radioimunológico (ERI) específico para FCI-1 e pelas bandas Western. Em nenhuma das análises se detectaram clones que expressassem quantidades detectáveis do FCI-l.Na E. coli, existe uma tendência para a desintegração de pequenos polipéptidos citoplasmáticos estranhos ( com um número de aminoácidos inferior a 90-100), uma vez que são reconhecidos como proteínas incorrectamente *

sintetisadas. 0 transporte destas proteínas para o periplasma, onde a actividade proteplítica é qualitativamente diferente da actividade do citoplasma, pode estabilizar estes polipéptidos.

Exemplo 3

Produção periplasmática de AlaGlu-FCI-1 péptido sinal utilizado provinha do precursor

OmpA da E. coli. No precursor OmpA natural, o péptido sinal é processado entre dois resíduos de alanina. Para se conservar este sítio de processamento, alterou-se o gene de MetGlu-

-FCI-1 por	mutagenese	in vitro	para	AlaGlu-FCI-1.
Introduziu-se	este gene	no vector	de expressão	> pHD313
(Dalboge e	outros 1989,	Gene, 79, 325-332)	que	contém o
promotor PR	lambda, um	sítio de	fixação	do	ribossoma

optimizado e o gene CI ts, de tal modo que o péptido sinal se fundiu directamente com o gene de AlaGlu-FCI-1 no sítio de processamento. Introduziu-se o plasmido obtido pHD365 na E. coli MC1061 cuja cultura se efectuou a 28°C durante 18 horas. Induziu-se a produção do FCI-1 fazendo subir a temperatura para 40°C.

Exemplo 4

Extracção de AlaGlu-FCI-1 da E. coli

A quatro litros de caldo de fermentação de E. coli adicionou-se cisteína até se perfazer uma concentração final de 50 mM e ureia até se perfazer uma concentração final de

M. Extraiu-se a cultura celular a pH 8,0 durante 30 minutos entre 6 e 10 °C. Centrifugou-se o extracto durante 30 minutos (4 000 rpm) e o sobrenadante foi congelado ou então imediatamente processado.

Exemplo 5

Diálise

Diluiu-se um litro de extracto de cultura celular do Exemplo 1 até ao volume de 1,5 litros utilizando 0,5 litros de ureia 7M e de cisteína 50 mM. Dialisou-se o extracto diluido fazendo-o passar através de um filtro de fibras ocas (Nephros Presto, H.P. Organon). 0 fluxo foi de 100 ml por minuto. Efectuou-se a mudança de tampão invertendo a passagem da ureia 7 M e da cisteína 50 mM, a pH 8,0, a um débito de 133 ml por minuto. Reciclou-se o extracto e o tampão até se atingir o equilíbrio. Pôs-se cobro à diálise ao atingir-se uma intensidade iónica correspondente a 2,0 mS. Exemplo 6

Permuta Aniónica de AlaGlu-FCI-1 Impura

Equilibrou-se material de permuta aniónica DE-52 (Whatman) utilizando 50 mM de Tris-HCl 50 ,7 M de ureia e 50 mM de cisteína a uma condutividade de 2,0 mS. Misturou-se o material de permutra aniónica equilibrado com o extracto bruto dialisado obtido no Exemplo 2 ( proteína/gel numa proporção de 1 g para 30 ml). 0 extracto bruto foi absorvido durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a

·»

4°C. A seguir à absorção, recolheram-se as proteínas não absorvidas , por filtração num filtro Millipore A25. 0 filtrado foi reabsorvido durante 3 horas à temperatura ambiente, em Sefarose de tipo FF-Q , que se havia préviamente equilibrado utilizando o mesmo tampão ( proteína /gel, numa proporção de lg/200 ml). Determinou-se a qualidade e a quantidade de AlaGlu-FCI-1 desnaturado, por cromatografia de fase inversa. A coluna aplicada foi uma coluna de Nucleosil C4, de 5μιη e de 4,6 X 250 mm, em TFA, e acetonitrilo. Condições iniciais para TFA: 0,085% em H2O, (tampão A), tampão B em TFA a 0,1%, 80% de acetonitrilo. Eluiu-se a coluna utilizando uma mistura de tampões A e B num gradiente isocrático durante 0-5 minutos para o tampão B a 30% e um gradiente linear durante 5-25 minutos para para o tampão B variando entre 30-75%, débito: 1,0 ml/minuto; detecção: absorção a 215 nm; temperatura ambiente. Na Figura 2 apresenta-se o AlaGlu-FCI-1 desnaturado e reduzido.

Exemplo 7

Renaturação de AlaGlu-FCI-1 desnaturado por diálise em fibras ocas

Ajustaram-se os lotes reduzidos e desnaturados de AlaGlu-FCI-1 obtidos tal como se descreveu no Exemplo 3, para uma concentração de proteínas de 0,2 mg/ml utilizando 7M de ureia e 50 mM de cisteína. Ajustou-se o pH npara 9,5 utilizando NaOH. Dialisou-se a solução em presença de um ζ

'Vtampão constituído por 50 mM de Tris-HCl, 2 mM de cisteína, 2 mM de EDTA, a pH 9,5 e etanol a 25%. Efectuou-se a diálise utilizando um dispositivo de diálise em fibras ocas (Nephros Prosto H.F. Organon) com um débito de 100 ml/minuto. Mudou-se o tampão de diálise quando se obteve o equilíbrio entre a solução e o tampão. Prosseguiu-se com o processo até se atingir uma condutividade de 150 μΞ e um potencial redox de 25 mV. Após a fase inicial durante a qual se duplicou a maior parte da quantidade de AlaGlu-FCI-1, deixou-se estabilizar a solução a 4°C durante a noite. Decorridas 16 horas pôs-se termo à reacção ajustando o pH para 4,0 utilizando ácido acético 5M. Após a diálise, a intensidade iónica correspondia a 0,2 mS e a concentração de ureia calculada foi menor do que 0,05M.

Na Figura 3 fornece-se um exemplo da renaturação de uma aliquota de AlaGlu-FCI-1 desnaturada e reduzida.O pico correspondente ao tempo de retenção (TR) de 14,86 minutos representa uma forma desordenada de AlaGlu-FCI-1 (TR de 15,68) com um valor de M^r de 7 845 u.m.a.. Os picos que apareceram posteriormente a AlaGlu-FCI-1 representam, provàvelmente, formas desorganizadas da molécula.

Ajustou-se o eléctrodo redox que se utilizou neste passo, utilizando uma solução de hidroquinona 5 mM que possuia um potencial redox definido de 463 mV a um pH de 4,0.

Faz-se referência à Figura 6, que diz respeito à

CLEP-FI em fibras ocas.

No diagrama da Fig.6, o pico correspondente ao TR de 15,99 refere-se ao AlaGlu-FCI-1. O pico correspondente ao TR de 15,21 representa uma forma desorganizada da molécula de AlaGlu-FCI-1 que possui um valor de M de 7845 u.m.a..

A renaturação de AlaGlu-FCI-1 desnaturada foi também efectuada de acordo com os três procedimentos que se seguem:

1) diluição da amostra desnaturada, 2mg/ml em 50 mM de Tris, 2 mM de EDTA, pH 9,0 e etanol a 25% até se atingir uma concentração final de 0,2 mg/ml (ensaio BioRad) e deixando prosseguir a reacção durante 18 horas a 4°C.

2) dessalinização da amostra desnaturada numa coluna NAP 5 (Pharmacia -LKB) em 50 mM de Tris, 1 mM de cisteina, 2 mM de EDTA, pH 9,0, etanol a 25%. O volume da solução era de 1,00 ml. A concentração de proteínas era de 0,3 mg/ ml ( ensaio BioRad) e deixou-se prosseguir a reacção durante 18 horas a

4°C.

3) diálise da amostra desnaturada (Spectapor, valor de transição: 3,5 KD) em presença de 50 mM de Tris , 1 mM de cisteina, 2 mM de EDTA, pH 9,0, etanol a 25%, a 4°C, durante 18 horas. A concentração inicial de proteínas era de 0,3 mg/ml.

Em cada um dos ensaios, acidificou-se 200 μΐ da solução resultante com 30 μΐ de ácido acético 5M e filtraram35

-se 200 μΐ da referida solução num filtro Millex de 0,22 μπι e, submeteu-se a análise por CLEP-FI numa coluna Nucleosil C4, de 5 μ e 4,6 X 260 mm, Machery-Nagel 720059, tampão A: ácido trífluoroacético (TFA), tampão B: TFA a 0,1% e acetonitrilo a 80% utilizando um gradiente isocrático durante 0-5 minutos para o tampão B a 30% e um gradiente linear enter 5 e 25 minutos para o tampão B variando entre 30-75% e um débito de 1,0 ml/minuto; detecção a 215 nm à temperatura ambiente.

Referência às Figuras 7-9

No diagrama da Figura 7, o pico correspondente ao TR de 16,07 minutos representa AlaGlu-FCI-1 . 0 pico correspondente ao TR de 15,1 minutos representa uma forma desorganizada de AlaGlu-FCI-1 que possui um valor de M de 7845 u.m.a. Os picos que surgem imediatamente após AlaGluFCI-1 representam provavelmente formas desorganizadas da molécula.

No diagrama da Figura 8, o pico correspondente ao

TR de 16,07 minutos representa AlaGlu-FCI-1,

O pico correspondente ao TR de 15,10 minutos representa uma forma desorganizada com um valor de M de 7845 u.m.a.. Os picos que surgem imediatamente após AlaGlu-FCI-1 representam provavelmente formas desorganizadas da molécula. Os picos que surgem depois dos 20,00 minutos representam, provavelmente formas irreversivelmente desorganizadas ou poliméricas de AlaGlu-FCI-1.

No diagrama da Figura 9, o picocorrespondente ao TR de 16,21 minutos representa AlaGlu-FCI-1. 0 pico correspondente ao TR de 15,43 minutos representa uma forma desorganizada com uma M^r de 7845 u.rn.a. . Os picos que surgem imediatamente após AlaGlu-FCI-1 representam, provàvelmente, formas desorganizadas da molécula.

Exemplo 8

Permuta catiónica de Ala-Glu-FCI 1 renaturada

Equilibrou-se 70 ml de Sefarose (Pharraacia-LKB) em 25 mM de fosfato de sódio, 25 mM de citrato de sódio que se ajustou para pH 4,0 com NaOH ,dissolvidos em etanol a 25%.

Aplicou-se 2 litros da mistura de renaturação obtida, de acordo com a descrição efectuada no Exemplo 7, na coluna de Sefarose de tipo FF-S. Mexeu-se suavmente a suspensão, durante 10 minutos à temperatura ambiente e depois 2 colocou-se o gel numa coluna (3,5 X20 cm ). Os tampões utilizados consistiam em:

Tampão A: 25 mM de fosfato de sódio, 25 mM de citrato de sódio, a pH 4,0, dissolvido em etanol a 25%.

Tampão B: 25 mM de fosfato de sódio, 25 mM de citrato de sódio, a pH 7,0 em etanol a 25% .

Os dois tampões foram ajustados mediante a utilização de NaOH 5M.

O débito foi de 0,15 ml/minuto, a detecção foi ζ

z” .¼ efectuada a 280 nm e a temperatura foi de 4°C. Aplicou-se um gradiente de tampão B variando entre 0-100% durante 60 minutos.

Recolheram-se as fracções que continham AlaGlu-FCI1 tendo sido efectuada a determinação das referidas fracções por absorção a 280 nm.

Exemplo 9

Conversão de AlaGlu-FCI-1 utilizando DAP-1

Dialisou-se a AlaGlu-FCI-1 obtida no Exemplo 8, em presença de 40 mM de citrato de sódio, 200 mM de NaCl , pH 4,0 ( que se ajustou com NaOH 5 M) a 4°C durante 18 horas.

Fez-se subir a temperatura para 37°C e adicionaramse 0,08 unidades de Catepsina C ( 3.4.14.1. Boehringer

Mannheim) por miligrama de proteína.

Decorridos 10 minutos aplicou-se a mistura de reacção numa coluna para análise por CLEP-FI.

Para pôr termo à reacção e para purificação do material obtido, aplicou-se a mistura numa coluna para CLEP-FI (Novo Nordisk A/S RP18, 15μ, 10 X 250 mm) em 100 mM de tampão fosfato de sódio a pH 3,0 e eluiu-se com um gradiente de de etanol variando entre 30 e 50% durante um período de tempo compreendido entre 30 e 60 minutos. 0 débito foi de 0,75 ml/minuto a 280 nm à temperatura ambiente.

Recolheram-se as fracções que incorporavam FCI, fraccões essas que se determinaram por absorção a 280 nm.

·*

Exemplo 10

Permuta Catiónica do FCI-1

Aplicou-se numa coluna de Sefarose de tipo PF-Q HR/10/10 de Pharmacia -LKB, as fracções recolhidas que incorporavam FCI-1 e que se obtiveram da purificação por CLEP-FI tal como descrito no Exemplo 9.

Os tampões utilizados consistiam em:

Tampão A:25 mM de fosfato de sódio, 25 mM de citrato de sódio, a pH 4,0, em etanol a 25%.

Tampão B: 25 mM de fosfato de sódio, 25 mM de citrato de sódio, a pH 7,0, em etanol a 25%.

Ajustaram-se os dois tampões com NaOH 5M.

O débito foi de 0,15 ml/minuto, a detecção efectuou-se a 280 nm, a temperatura foi de 4°C.

Utilizou-se um gradiente linear de tampão B variando entre 0-100% durante 100 minutos.

Recolheram-se as fracções que continham o FCI-1, determinação esta que foi efectuada por absorção a 280 nm. Exemplo 11

Diálise e filtração em gel do FCI-1

Dialisaram-se as fracções do FCI-1 obtidas no Exemplo 10 (Spectrapor,valor de transição de 3,5 KD) em presença de ácido acético 0,1 M a 4°C durante 18 horas e depois liofilizaram-se.

Dissolveu-se o pó liofilizado em ureia 7 M para se .fi obter uma concentração de 5 mg/ml e aplicou-se numa coluna Sefadex G50F (0,9 X 60 cm, Pharmacia-LKB) em ácido acético 0,4 M. 0 débito foi de 0,2 ml/minuto, a detecção efectuou-se a 280 nm e a temperatura foi de 4°C.

Recolheram-se as fracções que continham o FCI-1, determinação esta que foi efectuada por absorção a 280 nm.

Pode liofilizar-se a solução obtida utilizando agentes de liofilização convencionais de modo a fromar um pó liofilizado e estável. Pode utilizar-se o referido pó na preparação de composições farmacêuticas de acordo com os procedimentos conhecidos para a formulação de preparações farmacêuticas que incorporem o FCI-1.

Claims

mano (IGF·

AlaGlu no codificar no.

de conter

1,- Factor de crescimento semelhante a insulina hu1), caracterizado pelo facto de conter a extensão terminal amino.
2. - Sequência de ADN, caracterizada pelo facto de para IGF-1 contendo a extensão AlaGlu no terminal ami
3. - Vector recombinante, caracterizado pelo facto ADN que codifica para IGF-1 humano contendo a extensão

AlaGlu no terminal amino.

fc ·*
4. - Vector de acordo com a reivindicação 3, caracte rizado pelo facto de conter o promotor Λ PR sensível à tempera tura directamente ligado ao ADN que codifica para a sequência AlaGlu-IGF-1 e para a. sequência sinal OmpA.
5. - Microrganismo transformado, caracterizado pelo facto de comportar um vector que contém ADN que codifica para IGF-1 humano contendo a extensão AlaGlu no terminal amino.
6.- Microrganismo transformado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de ser E. coli.
7.- Método para a renaturação de AlaGlu-IGF-1, carac ter izado pelo facto de se dobrar uma forma desnaturada e re- duzida de AlaGlu-IGF-1 durante a modificação do potencial redox de :40 mV para um valor compreendido entre +20 e. +40 mV, por diálise contra um tampão contendo entre 20-40% V/V de etanol, du rante um intervalo de tempo de até 5 horas, com uma concentração de proteína compreendida entre 0,1 e 0,6 mg/ml e uma condutividade compreendida entre 0,15 e 0,3 mS à temperatura ambiente, a um pH compreendido entre 7,5 e 10 e, finalmente, de se aci dificar a mistura para um valor de pH inferior a 5.
8.- Método para a produção de IGF-1 humano, caracte rizado pelo facto:

ν 3 .¼

i) de se exprimir um terminal amino de IGF-1 com extensão em um microrganismo transformado com um vector de expres são contendo um promotor induzível ligado directamente ao ADN que codifica para IGF-1 humano comportando uma extensão no terminal amino e uma sequência de sinal que proporciona a secreção do produto expresso;

ii) de se extrair IGF-1 de terminal amino prolongado a pH >6,0 mediante a utilização de ureia na presença de um agen te de redução e, eventualmente, um agente quelante;

iii) de se submeter o extracto a uma cromatografia so bre gel de permuta aniõnica, escolhido entre DEAE, DE e FF-Q, utilizando o tampão como descrito na fase ii) ajustado para 1,8-2,2 mS e pH de 7,8-8,2,iv) de se renaturar o IGF-1 de terminal amino prolon gado isolado por alteração do potencial redox da mistura reaccional linearmente de -40 mV para +20-40 mV, por diálise contra um tampão contendo etanol em uma concentração compreendida entre 20 e 40% V/V, durante um intervalo de tempo de atê 5 horas, com uma concentração de proteína compreendida entre 0,1 e 0,6mg/ /ml e uma condutividade compreendida entre 0,15 e 0,3 mS ã tempe ratura ambiente e a um pH compreendido entre 7,5 e 10,0 e, finalmente, de se acidificar a mistura para um pH inferior a 5;

v) de se separar a extensão do terminal amino usando-se DAPI (EC 3,4,14,1);

vi) de se isolar IGF-1 autêntico renaturado do

IGF-1 de terminal amino prolongado por meio de HPLC de fase inversa e cromatografia de permuta catiónica; e vii) de se filtrar sobre gel e liofilizar o IGF-1 hu mano, isolado.
9. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de o microrganismo ser E. coli.
10. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se utilizar um promotor sensível â tempe ratura, tal como A PR, A PL ou λ PR e de a sequência de sinal ser LamB, OmpA ou OmpF.
11. - Método de acordo com a.reivindicação 10, carac terizado pelo facto de o promotor ser A PR e de a sequência de sinal ser a sequência OmpA.
12. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se realizar a extracção de AlaGlu-IGF-1 na fase II utilizando-se um tampão com uma concentração em ureia maior do que 4M.
13.- Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se realizar a extracção de AlaGlu-IGF-1 na fase ii) usando um tampão de ureia 7M, 50mM Cys e pH8,0.
14,- Método de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de se realizar a cromatografia do extracto pro veniente da fase iii) para valores da condutividade de 2,0 mS a pH 8,0.
15. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de se realizar a cromatografia do extracto pro veniente da fase iii) como cromatografia descontínua (uma só quantidade) em DE. e de se repetir em FF-Q.
16. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se realizar a renaturação de AlaGlu-IGF-1 na fase iv) com uma condutividade de 0,2 mS.
17. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se realizar a renaturação na fase iv) alterando-se o potencial redox linearmente de cerca.de -40 mV até um valor compreendido entre +25 e + 30 mV, durante 3 horas.
18. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de se.realizar a renaturação da fase iv) com uma condutividade de 0,2 mS,uma concentração de proteínas de

0,2 mg/ml e um pH compreendido entre 8,5 e 9,5, especialmente en tre 8,5 e 9,0.
19.- Método de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de se realizar a renaturação da fase iv) a uma temperatura compreendida entre 20 e 22°C.
20. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se realizar a renaturação da fase iv) fa zendo passar AlaGlu-IGF-1 através de um dispositivo de fibra oca com um débito.compreendido entre 25 e 250 ml/minuto, de pre ferência igual a cerca de 100 ml/minuto.
21. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de se realizar a acidificação na fase iv) mediante adição de ácido acético 5M.
22. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se realizar a separação na fase v) utilizando DAP-I, em uma concentração de 0,08 unidades de DAP-I por mg de proteína, na presença de cloreto de sódio e ajustando a concentração de proteína para aproximadamente 1 mg/ml, em um tampao de acetato 40mM a pH 4,0 e a temperatura de 37 C.
23, - Processo para a preparação de IGF-1 maduro, caracterizado pelo facto de se utilizar IGF-1 com a extensão

AlaGlu no terminal amino.

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