JPH06500084A - 生物学的に活性な化合物、その製造方法及びその利用 - Google Patents
生物学的に活性な化合物、その製造方法及びその利用Info
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- JPH06500084A JPH06500084A JP3513656A JP51365691A JPH06500084A JP H06500084 A JPH06500084 A JP H06500084A JP 3513656 A JP3513656 A JP 3513656A JP 51365691 A JP51365691 A JP 51365691A JP H06500084 A JPH06500084 A JP H06500084A
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Classifications
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
生物学的に活性な化合物、その製造方法及びその利用本発明は、アミノ末端伸長
部を有する新規なヒトインスリン様成長因子(IGF−1) 、このようなアミ
ノ末端伸長部を存するIGF−1をコードするDNA配列、アミノ末端伸長部を
有するヒト IGF−1をコードするDNAを含んで成る組換プラスミド、この
ような組換プラスミドを含む形質転換微生物、Ala Glu −TGF −1
の再生、ヒトIGF−1の製造方法、及び成熟IGF−1の製造のためのアミノ
末端伸長化[GF−1の利用に関する。本発明はIGF−1の大量生産に利用す
るのに特に適する。
発明の背景
インスリン様成長因子(IGF)はインスリン様及び成長刺激特性を有するタン
パク質の種類を構成する。このペプチドは血漿から精製されており、そしてその
構造及び化学特性は決定されている。IGFはプロインスリンと近接な構造相同
性を示し、そして似たような生物学的作用を示す(Rinderknecht、
E、とHumbel、 R,E、著: J、Biol。
Chem、、253. 2769−2773 (1978)、Zapf、J、ら
著: Curr、Topics 1nCell Reg、、 19.257−3
09 (1981)、Humbel、R,E、著: Hormonal Pro
−teins and Peptides、 12. AP 56−69 (1
984)、van Wyk、Jj、著:Hormonal Proteins
and Pet)tides、 12. AP 81−125 (1984))
O二種の主要なるIGFの型は同じ種類のタンパク質の一員でありながら、そ
の化学的特徴に関してやや相違する。IGF−1は塩基性ペプチドであり(pl
8.4) 、そしてプロインスリンと43%の相同を示す(Rinderkn
echt、 E、とHumbel、 R,E、著: J、Biol、Chem、
、 253.2769−76 (1978))。 IGF−2はほぼ中性のペプ
チドであり(p[6,4)、IGF−1と60%の相同を示す。
IGF−1は70個のアミノ酸より構成され、その配列はR1nderkne−
cht、 E、とHumbel、 R,E、著: J、Biol、Chem、、
253.2769−73 (1978)により決定されている。IGF−1に
関する物理化学的パラメーターはいくつかのグループによりかなり研究されてい
る。これらの研究に利用されている材料は主として種々の常用のクロマトグラフ
ィー法によりヒト血漿から単離されている。これらには第一に血漿分画化、そし
て更には結合性タンパク質とその他の血漿タンパク質を除去するための酸エタノ
ール抽出を利用する他のタンパク質の沈殿を含む。酸性化されたIGF−1−濃
縮画分を次に陽イオン交換クロマトグラフィー、並びに複数の段階の逆相及び等
電点電気泳動にかけて、数μgの精製IGF−1の回収を行っている。
IGF−1及びそれより少ない量のrGF−2は血漿の中に見い出せるが、はん
の微量にしか遊離形態においては存在していない。両IGFに対して非常に高い
結合容量を有する高分子量の特異的結合性タンパク質は、担体タンパク質として
又はrGF機能のモジュレータ−として働< (Holly、J、M、P、とW
ass、 J、 A、 H,著: J、 Endocrinol、 122゜6
11−618 (1989)、 Ooi、G、T、とHerrington、
A、 C,著: J、 Endocrinol、 。
118、7−18 (1989))。IGFは大量で存在しているときはインス
リン様作用を示すが、それはインスリンの1%程度にすぎない。IGF−1の体
細胞機能は通称「ソマトメジン説」において明瞭に述べられ、この説が示唆する
には、脳下垂体から放出される成長ホルモンは肝臓からのIGF−1の放出を刺
激することによりその作用を及ぼし、ここで[GF−1は次に標的組織における
細胞表層レセプターに結合することを介して体細胞原性作用を仲介することであ
る(Salmon、 W。
D、 Jr、 、とDaughaday、 w、 H,著: J、Lab、Cl
1n、Med、、 49.825−836゜(1957))。IGFの主要な局
所的生物学的機能は強い分裂促進剤のようであるが、しかしながらその効果は例
えばPDGF及びFGFに関して測定されたものよりは弱い(Froeschら
著:Ann、Rev、Phyiol、 47.443−467 (1985))
。PDGFと一緒となって、 IGF−1は相乗生物学的作用を示す(Kato
ら著: Eur、J、Biochem、、 129.685−690 (198
3)。
5tilesら著: P、N、A、S、、 USA、 76、1279−128
3 (1979))。従ってIGF−1の主たる生物学的作用は有糸分裂を増大
させる機能、及び適切にコントロールされている条件のもとて他の因子により誘
発される成長を維持させる機能であると考えられる(OKeefeら著: Mo
l。
Ce11. Endocrinol、、 31.167−186 (1983)
)。
分裂促進因子としてのIGF−1の効力、並びに例えば創傷の治癒及び窒素代謝
におけるその莫大な数の潜在的利用性は、それがヒト血漿の中に微量に存在して
いるため、多数の生物薬学者に種々の生。
物においてIGF−1を発現させようとする試みを奮い立たせた。酵母における
IGF−1の生産は適切に折りたたまれたポリペプチドの非常に容易なる精製を
理由に好まれている。しかしながら、このような発現系の利用に係る一定の顕著
な欠点が存在する。発酵の収率は低く(発酵培地のリットル当り数mg) 、そ
して〇−結合グリコシル化形態の分子の獲得の危険性が高い(Gillerfo
rsら著: J、Biol。
Chem、、 264.2748−53 (1989))。
細菌における発現が高い収量のIGF−1及びIGF−2を得るのに現在までの
最も有用な手法であるが、これはほとんどが細胞一体化状態にある。安定化用ペ
プチドと融合させたIGF−1を発現させることも試まれでいる。このようなペ
プチドは通常IGF−1自体と同じサイズであり、そして生ずるタンパク質の精
製を促進せしめる物理化学的性質を有することがある。融合タンパク質は、単離
を目的とする成熟タンパク質を残すような化学的又は酵素的切断によって切断す
る。
組換ペプチド(融合ペプチド)の抽出は通常、抽出したIGF−1の変性段階、
それに続(インビトロ再生を伴い、これにより IGF−1の天然コンホメーシ
ョンが得られる。
今迄に開示されてきた細菌系において、発酵培地1リットル当り1−1.5グラ
ムの収率がhGHの生合成発現に関して開示されている。
しかしながら、高収率の発現にもかかわらず、はんの微量の天然IGF−I L
か得られず、その理由は分子内及び分子間ジスルフィド架橋の形成がコントロー
ルできないことによる。従って、このようなジスルフィド架橋を含む生成物の細
菌発現には、ポリペプチドの精製の後半の際でのインビトロ再生が続くべきであ
るが、これは生成物の大量のロスを通常もたらす。
本発明の目的は主として、高収量において微生物でIGF−1を生。
産することに関する従来技術に述べられている問題を解決することにある。
本明細書に用いられている「折りたたみ」なる表現は、分子内ジスルフィド結合
の形成を含む、タンパク質の三次構造を樹立するプロセスを表わすために用いて
いる。
「再生」なる表現は、タンパク質の天然三次構造を樹立することを表わすために
用いている。
「変性」なる表現は、ジスルフィド結合を崩壊させる及び/又はタンパク質をほ
どくような、分子の三次構造の破壊を表わすために用いている。
発明の詳細な説明
本発明はアミノ末端伸長部Ala Gluを有するヒトrGF−1に関する。
このアミノ末端伸長部は、伸長化IGF−1の高い発現率、IGF−1の容易な
る再生又は折りたたみ、及び成熟IGF−1を生成するための酵素ジペプチジル
アミノペプチダーゼ(DAP−1、EC,3,4,14,1)を用いるIGF−
1の容易且つ完全な切断を可能とする。
従って、驚くべきことにこのアミノ末端伸長部Ala Gluは従来の技術の問
題を解決することが見い出された。更に、反応混合物から適切なN−末端を有す
るIGF−1を精製することが可能である。
Ala Glu −IGF −1は80%以上、好ましくは90%以上の精製率
における中間体として単離されることができ、そして適切に折りたたまれている
場合、 rGp−iの生物学的活性を示す。
本発明はアミノ末端伸長部Ala Gluを有するIGF−1をコードするDN
A配列にも関連する。この短い伸長部はルーlβ及びhGHの発現においては適
用されているが、IGF−1の発現に関しては試まれ。
ていない。
1GF−1をコードするDNAの部分はcDNA、染色体DNA又は全体的もし
くは部分的合成りNAであってよく、ここでDNAの残りの任意の部分は対応の
cDNA又は染色体DNAであってよい。
アミノ末端伸長部分に用いられるヌクレオチド配列及びIGF−1をコードする
DNAの任意の合成部分は、選択した微生物にとって好ましいコドンを示すよう
に選ばれることが好ましい。
アミノ末端の伸長されたAla Glu −IGF −1の発現は、抽出する前
に1.5g/リットル(0,2mM)のAla Glu −IGF −1の発現
レベルをもたらす。これはより長い融合タンパク質を利用する系において得られ
る比発現率の約4〜5倍である。しかしながら、全ての短鎖アミノ末端伸長部が
高いレベルの発現をもたらすわけではない。例えばMet Glu Ala G
lu −IGF −1,(Ala Glu)6− rGF −1又はIGF−1
自体の発現は全てAla Glu −IGF −1を発現させるのに得られるレ
ベルより10〜25分の1の発現レベルをもたらす。
Ala Glu −IGF −1をコードするDNAは、70個のアミノ酸のI
GF−1をコードするクローン化DNA配列あって、以下の合成的に製造した二
本鎖DNA配列と、十鎖の3′末端がIGF−1をコードする遺伝子の+5′末
端に連結され、そして合成りNA鎖の5′末端が遺伝子の3′末端に連結してい
るような状態で、プラント末端連結により連結されているものより作られうる:
+ 5 ’ CGATG GCT GAA−3’ TACCGA CTT
(ここで十鎖の最初の2個のヌクレオチドはC1aI制限部位突き出しであり、
そしてそれに続くヌクレオチド配列はアミノ酸Met AlaGluをコードす
る)。
本発明の更なる観点に従い、安定な生成物の生成を保証し、且つ。
ペリプラズマ空間又は直接的に培地へのその分泌を更に保証するような、アミノ
末端が伸長されたIGF−1をコードする、工業的生産に適する遺伝子が提供さ
れる。
第三の観点に従い、本発明はアミノ末端伸長部Ala Gluを有するヒトIG
F−1をコードするDNAを含んで成る組換ベクターに関連する。このベクター
は、Ala Glu −IGF −1をコードするDNAの上流にプロモーター
を含んで成り、そして好ましくはAla Glu −TGF −1をコードする
DNAに直接連結している温度感受性プロモーターλPR及びペリプラズマ空間
又は直接的に培地へとAla Glu −IGF −1の分泌をもたらすOmp
Aシグナル配列を含んで成る。このベクターはE、 コリ (E、 coli)
に挿入したときに工業的生産に適するようになることが実証された。
第四の観点に従い、本発明は前記組換プラスミドを含んで成る形質転換微生物を
提供する。
第五の観点に従い、本発明はAla Glu −IGF −1の再生のための方
法に関連し、ここでは実質的に変性及び還元状態のAla Glu −IGF−
1を緩衝化水性溶液の中でメルカプト試薬の存在下において、その還元状態で折
りたたむ。再生は、20〜40%(V/V)のエタノールを含む緩衝液に対する
5時間までの時間にわたる、0.1〜0.6mg/mlのタンパク質濃度、0.
15〜0.3mSの伝導率、及び7.5〜10.0のpHでの透析による、−4
0mMから+20〜+40mMに到るコントロールせしめたレドックス電位の変
化の際に起こり、そして最終的にこの混合物のpHを5以下に酸性化する。
本発明の方法に用いるメルカプト試薬は不要な副産物を生成しない任意のメルカ
プト試薬、例えば2−メルカプトエタノール、システィン、システアミン、好ま
しくはシスティンである。
本発明に関して、メルカプト試薬は0.01〜10mMの濃度、好ましく。
は0.1〜5mMの濃度、そして最も好ましくは1mMの濃度で用いられる。
本発明の折りたたみ又は再生を行う緩衝化水性溶液は8.0〜10.0のpH1
好ましくは9.0のpHに緩衝化されている。
ある場合においては、本発明に関する変性を、40%まで、好ましくは約25%
の量におけるエタノールの存在下において行うことが好ましい。かかる添加は本
法の収率を高め、そしてエタノールの最も有利な効果は簡単な予備実験により容
易に示される。
第六の観点に従い、本発明はIGF−1を製造するプロセスであって、
i)発現生成物の分泌を提供する、アミノ末端伸長部を有するヒトIGF−1及
びシグナル配列をコードするDNAに直接連結されている誘発性プロモーターを
含んで成る発現ベクターにより形質転換された微生物における、アミノ末端伸長
化IGF−1の発現、ii) pH>6.0での、高濃度の尿素を用いる、還元
剤及び任意的にキレート剤の存在下における、アミノ末端伸長化rGF−1の抽
出、in ) 1.8〜2.2mS及びpf(7,8〜8.2に調整した、段階
ii)と同種の緩衝液を用いる、DEAE、 DB及びFF−Qより成る群から
選ばれる陰イオン交換ゲル上でのクロマトグラフィーに、この抽出物をかけるこ
と、
iv) 20−40%(V/V)のエタノールを含む緩衝液に対して、5時間ま
での時間にわたり、タンパク質濃度を0.1〜0.6 mg/+nl及び伝導率
を0.15〜0.3mSに維持しながら、周囲温度及び乙5〜10.0のpHで
透析することにより一40mVから+20〜+40mMまで線状に反応混合物の
レドックス電位を変化させて、この単離したアミノ末端伸長化rGF−1を再生
し、次いで最終的にこの混合物をpH5以下に酸性化すること、
v)DAP−1を用いるアミノ末端伸長部の切断、vi)RP−HPLC及び陽
イオンクロマトグラフィーを用いる、アミノ末端伸長化IGF−1に由来する再
生された真性ヒトIGF−1の単離、並びに
vi)単離したヒトIGF−1のゲル濾過及び凍結乾燥、を含んで成るプロセス
に関する。
本発明の方法は、ダラム陽性菌又はグラム陰性菌、例えばエッシュリヒア属(E
schericia) 、好ましくは工業的有用性に基づき非常に好都合な宿主
であるE、コリのような微生物において、アミノ末端伸長化IGF−1を発現さ
せることによって行なわれつる。
本発明に関して、適切な発現及び分泌のために、このプロモーターは温度感受性
プロモーター、例えばλ73.λ1.又はλ口・でよく、そしてシグナル配列は
LamB、OmpA又はOmp F配列でよい。
Ala Glu −IGF −1は、Ala Glu −IGF −1をコード
する遺伝子に直接連結されているλ□プロモーターを用いることにより高レベル
で発現され、モしてOmpAシグナル配列は安定状態にあるタンパク質の分泌を
提供する。
Ala Glu −rGF −1の抽出は、発現系によりAla Glu −I
GF −1に付与される三次構造を破壊するために、尿素、還元剤例えばシステ
ィン、2−メルカプト−エタノール又はジチオスレイトール及び任意的にキレー
ト剤例えばEDTAを用いる還元及び変性条件のもとで行われる。
全体的に変性された状態におけるAla Glu −IGF −1の抽出は、7
Mの尿素、50mMのCysを含む、等電点(8,4)又はpH8,0の緩衝液
を用いて行うことが好ましい。
E、コリに由来するほとんどの夾雑タンパク質は、等電点での陽イオン交換クロ
マトグラフィーによって還元及び変性Ala Glu −IGF−1から除去さ
れる。このクロマトグラフィーは2.0mSの伝導率及びpH8,0にて行われ
るのが好ましく、そしてDB −52(Whatman)でバッチ式クロマトグ
ラフィーを行い、ファストフローQセファロース(商標0FF−Q)で繰り返す
ことが好ましい。
還元及び変性Ala Glu −IGF −1は、正しく折りたたまれている安
定なAla Glu −IGF −1ヘと再生される。
この再生プロセスは、レドックス電位、pH、タンパク質濃度及び温度のコント
ロール下で、キレート剤、変性剤及びメルカプト試薬の存在下における、且つ育
種溶媒の存在下における透析を利用して行われる。
透析緩衝液は、微量の還元剤(例えばDDT、 Cys又は2−メルカプトエタ
ノール)、キレート剤、疎水結合により相互作用する育種化合物(例えば第三ブ
タノール、2−プロパツール、エタノール、メタノール)の存在、そして最後に
よく規定されたpHの間隔、典型的には8.8〜9.0のpHを維持する緩衝剤
の存在を特徴とする。ある態様において、以下の緩衝組成、即ち、50mMのト
リス−HCl、1 mMのCys、2 mMのEDTA及び25%のエタノール
pH2,5が利用される。
再生は好ましくは、レドックス電位を線状的に、3時間かけて約−30mMから
+25+nVと+30mMとの間まで変化させることによって行われる。レドッ
クス電極はよく規定された463mVのレドックス電位を有するヒドロキノン溶
液を用いて較正する。
再生は好ましくは、0.2mSの伝導率、0.1−0.4 mg/ ml(7)
9 ンハク質濃度、20〜40%(V/V)の濃度においてエタノールを加え
る前の緩衝液における測定されるpf(が8.5〜9.5、特に好ましくは8.
5〜9.0のpH1及び20〜22℃の温度で行われる。
最も好ましい観点に従うと、Ala Glu −IGF −1の再生は、このポ
リペプチドを中空ファイバー装置(Nephross Presto、 H,F
、 、オル。
ガノンテクニ力社)に、pH5以下、好ましくはpH4,0まで5Mの酢酸を加
えることによってこのプロセスを終了させるまで、レドックス電位を変えながら
、25〜250 m17分、好ましくは約100m1/分の流速で通すことによ
って行われる。
生ずる溶液を次に、アミノ末端伸長部を切断する前に育種溶剤の存在下において
陽イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮する。
この陽イオン交換クロマトグラフィーは好ましくは強力なイオン交換材料、例工
jfFF−S (il[) 又1tFF−5P ([標)ヲ用イ、10〜40%
のアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパツール又はブタノール、
好ましくは25%のエタノールの存在下において、3.5〜7.5の9H勾配を
利用して行う。
再生させたAla Glu−IGF −1の切断は好ましくは、迅速且つ効率的
なrGF−1前駆体の切断をもたらすエキソペプチダーゼ(DAP −1)を用
いて行われる。このエキソペプチダーゼは好ましくは0.G8単位のDAP−1
/タンパク質mgの濃度において、NaC1の存在下において、タンパク質濃度
を40mMの酢酸緩衝液の中で約1 mg/mlに調整して、pH4,0及び3
7℃で用いられる。
DAP−1を用いる切断の後のIGF−1の逆相HPLC精製は、市販タイプ(
Lichrosorb)であるか又は受注C18シラノイルRP18カラムのい
づれかのRP18−カラム上で行うことができる。好ましくは、30〜50%の
エタノール線状勾配を用いる、0.1MのNa−リン酸塩緩衝液においてpH3
,0にて溶離させる15μmのノボ ノルディスクA/SシラノイルーRP18
カラムか利用される。
適切に折りたたまれていない全てのrGF−1は、市販のタイプ、例えばLic
hrosorbのか、又は受注CIIシラノイルRP18カラムのいづれかのR
P18−カラムでの、移動相としてエタノールを用いる逆相クロマトグラフィー
により除去されることができ、そして残留Ala Glu−IGF−1は酸性条
件から出発して、前記の陽イオン交換手順と同種の緩衝液系を用いるpH4,0
からpi(7,0に到るpH勾配を適用する陽イオン交換クロマトグラフィーを
利用して取り出すことができるであろう。
精製したtcp−iを次に凍結乾燥及びゲル濾過にかける。凍結乾燥させたrG
F−1を7Mの尿素の中に取り込ませ、そして0.1Mの酢酸に4℃で平衡にし
たG50F GPCセファデックス(商標)カラムに適用する。精製した材料は
4°Cで保存する。
最後に、高純度IGF−1を透析、次いでゲル濾過にかけ、そして凍結乾燥して
、凍結乾燥された化学的に安定な粉末を形成させる。
本発明の更に他の観点は、完全に変性且つ還元された状態にあるアミノ末端伸長
化IGF−1の部分精製にある。
適切なアミノ末端及びアミノ酸配列を有するIGF−1からのアミノ末端伸長化
rGF−1の選択的分離は、Dalboege、 H,ら著、FBBSLett
、 246(1,2) 89−93.1989に記載の原理に従い、DAP−1
を用いるアミノ末端伸長部の切断の後に陽イオン交換クロマトグラフィーを利用
することによって得られる。
逆相HPLCによる不適切に再生した(折りたたまれた)状態のrGF−1の除
去は、300人の孔径を存する15μの球状粒子を含んで成るオクタデシル−ジ
メチル−シリル置換化珪素を用いて得られる。
ジスルフィド架橋の適切な位置に関連する再生IGF−1の特徴付けは、二通り
の酵素切断、それに続くペプチド地図化及びシーケンス分析を利用して行われる
。
本発明のプロセスは、それが直接スケールアップできることに更なる利点を有す
る。
本発明の価値のある観点は、非常に高収率(100%近く)のAla Glu−
IGF−1を提供する抽出手順にある。アミノ末端伸長化rGF−1。
に従って、Ala Glu −rGF −1が樹脂に結合しないようなp1条件
のもとて特異的なFF−Q(商標)陰イオン交換クロマトグラフィーを利用する
ことにより精製され、ここでE、コリに由来するタンパク質及びAla Glu
−rGF −1の物理化学的性質と似たようなそれを示すポリペプチドはこの
ような特異的な条件のもとで除去される。本発明の他の価値ある観点は再生段階
にある。この段階は、Ala Glu−IGF−1の再生中でのレドックス電位
、イオン強度及び温度の常時のコントロールを特徴とする。
プレ配列の改質は再生にとっての条件を劇的に変えることが見い出された。
零発”Ala DAP−1(EC3,4,14,1>を用いるTGF−1(7)
N−末端伸長部の切断、及び最終ゲル濾過クロマトグラフィ一段階の前での適切
に折りたたまれたrGF−1の緩かな変性の適用に関する新しい概念を更に提供
する。
従って本発明は、生成物の品質及び発酵に続く下流プロセスの収率を共に向上さ
せる一連の固有の条件を利用する。
本プロセスは一工程当りグラムの桁の量までスケールアップでき、且つE、コリ
に由来するタンパク質の低含有量により示される( < 1 ppm)ように、
高純度が得られる。
この生成物は、ヒト血漿より精製したIGF−1に関して見うけられるアミノ酸
組成、アミノ酸配列、ジスルフィド架橋及びペプチド地図と同一性を育すること
が示されている。この生成物は5OS−ポリアクリルアミドゲル及び自然ゲルの
電気泳動の後に単一バンドを示すことを特徴とする。最後に、分析用逆相)IP
LC及びGPCにより、この生成物は純度が95%以上であることが特徴付けら
れる。
更に、本発明は成熟IGF−1の製造のための、アミノ末端伸長部Ala Gl
uを有するIGF−1の利用に関する。
本発明の方法の生成物の生物学的活性は、血漿から精製した天然IGF−1のそ
れと等しい。この生成物は創傷治癒の際の創傷の処置、骨折、代謝疾患及び■型
糖尿病(NIDDM)の治癒に利用されつる。IGF−1は、このIGF−1を
含んで成る薬品製剤又は投与形態の製剤化のための、本質的に知られる任意の方
法において製剤化されつる。
図面の簡単な説明
本発明を図面を参照しながらより詳しく説明するが、ここで、図1はAla −
Glu −TGF −1をコードするベクターのクローニング手法を示し、
図2は、変性且つ還元状態にある部分精製したAla −Glu −rGF−1
のIPLC図を示し、
図3は、再生状態にある部分精製したAla −Glu −IGF −1のIP
LC図を示し、
図4は、純度95%以上のIGF−1の分析HPLC図を示し、図5は、 IG
F−1をコードするpHD147のDNA配列を示し、図6は、中空ファイバー
分析による再生の後のAla Glu −IGF −1のRP −HPLC図を
示し、
図7は、希釈による再生の後のAla Glu −rGF −1のRP −HP
LC図を示し、
図8は、脱塩による再生の後のAla Glu −IGF −1のRP −HP
LC図を示し、そして
図9は、透析による再生の後のAla Glu −[GF −1のRP−HPL
C図実験の章
実施例
Met Glu −[GF −1に関する合成遺伝子を公開されたアミノ酸配列
(Jansenら著、1983)を基礎として作製した。最適E、コリ コドン
を利用し、合成フラグメントから遺伝子を作製し、次いでアニーリング、そして
ゲル上での精製を行い、これを適切なりローニングベクターにおける固有制限部
位の間に逐次クローンした(図1)。
30をコードするプラスミド)
リンカ−の調製ニアツバ−(upper) a10アー(lower) a及び
ロアーbのリンカ−それぞれ0.4μgを別々に、1μlのlO×のキナーゼ緩
衝液、1μIの10mMのATP、1μmのT4 PNK (10単位)、6μ
mのH2Oを加えることによりリン酸化(kinated)させた。インキュベ
ーションは37°Cで30分とした。次にこの混合物を65°Cで10分間熱し
た。
10μmのリン酸化アッパーa及び10μmのリン酸化ロアーaを100°Cで
3分間熱し、次いで氷上で冷やすことによってアニール化した。
10μmのアッパーbを0.4μgのロアーb(リン酸化していない)に、10
0°Cで3分間熱し、次いで氷上で冷却することによってアニール化させた。
リンカ−のリゲーション:20μlのa、 11μlのす、4μlの10×のり
ガーゼ混合物、1μmのリガーゼ(0,5単位)、4μlのHzOを混ぜ合わせ
、そして15°Cで2時間インキュベートさせた。この混合物を1.8%の低融
点アガロースゲルに流した。100bpのフラグメントをエル−チップ(elu
tip)を利用して単離及び精製した。沈殿外。
理後、このフラグメントを50μlのH,0に溶かした。2μlを取り出し、そ
して2%のアガロースゲル上でチェックした。
プラスミドの調製:
上記の精製したリンカ−を次にC1a I / Bal Iにより消化したpB
R322にクローンした。Ba1IによるpBR322の消化を促進するために
、E、コリのメチル化機能のない株においてこのプラスミドを培養することが必
要である。従って、pBR322を細菌株E、コリGC117であってDCMマ
イナス及びDAMマイナスである株に形質転換させる。
10μmのpBR322(GCI 17由来)を低塩緩衝液の中で5UのC1a
I/3UのBa1Iを用いて最終容量100μlにおいて消化させる。このイン
キュベーションを37℃で2昼夜インキユベートした。
約1900bpのDNAフラグメント(プラスミドフラグメント)を0.7%の
低融点アガロースゲル上で精製した。エル−チップを利用して溶出後、DNAを
40μlの8.0に溶かした。1μmのアリコートをゲルでチェックした。
以下のリゲーション物を準備した:
全てのリゲーション物を15°Cで3時間インキュベートし、MC1061に形
質転換させ、ニトロセルロースフィルター上のLB+アンピシリン(LBA)ア
ガープレート上で平板培養し、次いで37°Cで一夜インキユベートした。翌日
でのプレートの測定は、100bpのフラグメントを加えたプレート上に比べて
大量のコロニーがコントロールプレート上にあることを示した。従って、 DN
Aハイブリダイゼーションにより全ての陽性形質転換体についてスクリーンする
ことが決断された。
コロニーハイブリダイゼーション:
各フィルターのコピーを新たなニトロセルロースフィルター上にレプリケートし
、両フィルターをLBAプレート上に転写し、そして37℃で一夜インキユベー
トした。一方のフィルタ上の細菌を、0.5MのNaOH,1,5MのNaC1
中で2分間溶菌させ、次いで0.5Mのトリス、pH8,1,5MのNaC1で
2分間、次いで2×のSSCで2分間洗った。このフィルターを乾かし、80°
Cで1時間焼き、そしてプローブにハイブリダイズさせた。
プローブの調製:
1 μI C0,4u g)のIGF−1アッパーa、1 a 1 (0,4a
g)のIGF 17ツパーb、10(lμci)γATP(10μl)、2μ
lノ10xノキナーゼ緩衝液、1μm(5単位)のPNK、 20μlのHzO
を混ぜ合わせ、次いで37℃で30分間インキュベートした。この焼いたフィル
。
ターを65°Cでプレハイブリダイゼーションさせた後、50μlのハイブリダ
イゼーション容量において上記のプローブに加えた。ハイブリダイゼーションは
60°Cで一夜行った。このフィルターを2XのSSCで洗い、次いで0.1×
のSSC,50℃で洗い、乾かし、そしてフィルム上に載せた。
15個の陽性コロニーをLBAの中で37°Cにて一夜培養させた。酵素C1a
n/ PvuI[を用いるミニブレブDNAの分析は、 1.5%のアガロース
ゲル上に流した後、クローン11以外の全てのクローンが予測の745bpのD
NAフラグメントを含んで成ることを示した。いくつかのクローンを更に分析す
るため、即ち、約100bpのBal I / C1a Iフラグメントの存在
を分析するため、クローン1. 2. 3及び4をE。
コリGC117に形質転換させ、次いで[、BAアガープレート上で平板培養さ
せた。4枚のプレートそれぞれから単一コロニーを選び、そしてマクシブレブD
NAを増幅させるために用いた。4種のプラスミド調製物の消化は、構造体1,
2及び3が予測の制限部位を有するが、しかしクローン4はBalI部位を欠く
ことを示した。
pl(D146の作製(aa 1〜56のMet Glu −IGF −1をコ
ードする配列を有するプラスミド):
pl(DI45−1.−2及び−3のそれぞれに由来するマキシブレブDNA1
00μlを低塩の中で37°Cにて20単位のBa1Iにより一夜消化させた。
アガロースゲル上で消化をチェックした後、このDNAを高塩の中で37°Cに
て20単位のPvu Iにより一夜消化させた。消化の後、DNAを0.7%の
予備アガロースゲルで分画した。750bpのDNAフラグメントを各クローン
から単離し、エル−チップにかけ、沈殿させ、そして20μlの820に溶かし
た。0.4μgのリンカ−C+Dアッパー十ロアーを20μmのH,0の中で5
分間煮沸し、次いで氷上で冷やしてアニール化させた。アニールしたリンカ−を
次に2.5%の予備ゲ。
ルで精製し、70bpのバンドを単離し、エル−チップを利用してゲルから溶離
させ、沈殿させ、そして20μlのH,0に溶かした。
精製したリンカ−を、1μmのIOXのキナーゼ緩衝液、1μmの10mMのA
TP、5単位のPNK、及びH2Oを10μmまで加え、次いで37°Cで1時
間インキュベートすることによりリン酸化させた。
20μmのpBR322DNAを50単位のPvuI150単位のNru Iに
より、高塩の中で、最終容量100μmにおいて消化させた。消化後、DNAを
ゲル上で分画し、そして約2800bpのフラグメントを単離し、エル−チップ
により精製し、沈殿させ、そして20μmのH,0に溶かした。
以下のリゲーション物A、 B、コントロールC及びコントロールDを、pHD
145−1 、−2及び−3のそれぞれから単離したフラグメントより準備した
。
上記のリゲーション物を15℃で一夜インキユベートし、MC1061に。
形質転換し、そしてニトロセルロースフィルター上のLBAプレート上でプレー
トアウトした。リゲーション物当り5枚のプレートを用いた。37°Cで一夜イ
ンキユベートさせた後、全てのプレートをレプリケートし、そしてpHD145
の作製で前述した処理をした。pH0145について前述したように標識した1
μm(0,4μg)のアッパーC及び1μm(0,4μg)のアッパーdをプロ
ーブして用いた。フィルムの現像後、24の陽性コロニーを選び、モしてLBA
培地の中でミニブレブDNAへと増幅させた。このDNAをNru I / E
coRIによる消化及び1.5%のアガロースゲル上での泳動により分析した。
クローン3゜4、 5. 8.13.16.18.19.20及び21が目的の
ものと見えた。クローン3及び13を接近(closer)分析のために選び、
そしてマキシブレブDNAのために増幅させた。
以下のリゲーションから24の単離クローンを単離した。
配列を有するプラスミド(図1)):
pH0146−3及びI)HD146−13それぞれに由来するマキシブレブD
NA50μmを55μmの最終容量(中塩)の中で20単位のNru I及び1
5単位のPvu Iにより消化した。10μmのpBR322プラスミドDNA
を55μmの最終容量(中塩)の中で15単位のPvu I及び36単位のHi
ndII[により消化した。両者の消化物を0.8%の低融点アガロースゲル上
で分画した。クローンpHD146−3及び−13から5oobpのフラグメン
トを単離し、エル−チップにかけ、沈殿させ、そして50μmのH2Oに溶かし
た。pBR322からは3500bpのフラグメントを単離し、エル−チップに
かけ、沈殿させ、そして50μIのH,0に溶かした。
リンカ−IGF−1eをアニールさせ、そして先のリンカ−に関して記載した2
、5%の予備アガロースゲルで精製した。
50bpのフラグメントを単離し、そして50μmの8.0に溶かした。
上記のフラグメント全てをアガロースゲルでチェックした。
pHD146−3及びI)HD146−13に由来する800bpのフラグメン
トを用いてリゲーションを行った。リゲーション物を15°Cで3時間インキュ
ベートし、MC1061に形質転換し、そしてLBAプレート上で平板培。
養した。フィルターをリプリケートし、洗い、そして前記の通りにハイブリダイ
ズさせた。2μlのIGF−1eロアーDNAをプローブとして用いた。6個の
陽性クローンをフィルターから選び、ここではpHD146−3及びI)HD1
46−13のそれぞれのクローンに由来するDNAを用いた。これらのクローン
はpHD −1−> 6 (pHD146−3+リンカ−e)とpH0147−
7−> 12 (11HD146−13+リンカ−e)と呼ぶ。制限酵素Eco
RI /HindII[を用いた12のクローン由来のミニブレブDNAの分析
は、全てのクローンが予測のDNA配列を含んで成ることを示した。クローンl
並びに2.7及び8を、制限酵素HindI[[/C1a I 。
Pvu III/BamH1,Pst I/BamHIによる消化による近接分
析のために選んだ。全てのクローンが予測の制限パターンを有することが見い出
された。クローンpHD147−1及びpH0145−7をマキシブレブDNA
へと増幅させた。同時にミニプレブDNAを、制限酵素EcoR1,HindI
[により消化したクローン1. 2. 7及び8より単離し、そして220bp
のフラグメントを単離し、M13. MP18及びMP19の中にクローンし、
そしてシーケンス分析にかけた。DNA配列分析は、このクローンが予測のDN
A配列を含んで成ることを示した。
プラスミドpHD147−1をフレノウDNAポリメラーゼ及びdNTPの存在
下においてHindII[により消化し、フェノール抽出にかけ、沈殿させ、モ
してC1aIにより消化させた。切り出した遺伝子を発現プラスミドpHD86
3P13 (Dalbogeら著、1987. Biotechnol、5.
161 ff)の中に導入し、次いでE、コリMC1061に導入した。
発現プラスミドを含む細菌からの抽出物をIGF−1特異的RIA及びウェスタ
ンプロットにより分析する。どの分析したクローンも検出可能な量の[GF−1
を発現しないことが見い出せた。E、コリに−おいて、小さな細胞質外来ポリペ
プチド(90〜100個以下のアミノ酸)は、不適切に合成されたタンパク質と
して認識されるためにそれらは分解されがちである。タンパク質分解活性が細胞
質とは性質的に異なるベリプラズマへのこのようなタンパク質の輸送は−これら
のポリペプチドを安定化しつる。
利用したシグナルペプチドはE、コリのOmpAとした。天然OmpA前駆体に
おいて、シグナルペプチドは二個のアラニン残基の間でプロセスを受ける。この
プロセス部位を維持するため、Met Glu −[GF−1遺伝子をインビト
ロ突然変異誘発によりAla Glu −TGF −1へと変える。この遺伝子
を、ラムダPRプロモーター及び最適リポソーム結合性部位及びCI ts遺伝
子を含む発現ベクターpH0313(Dalbogeら著、 1989. Ge
ne、 79.325−332)の中に、シグナルペプチドがAla Glu
−IGF −1遺伝子にそのプロセス部位において直接融合されるような状態で
導入した。得られるプラスミドpHD365をE、コリMC1061に導入し、
そして28℃で18時間培養した。 [GF−1の生産は温度を40°Cに上げ
ることによって誘発させた。
E、コリ発酵培地4リツトルにシスティンを最終濃度50mMとなるように、そ
して尿素を最終濃度7Mとなるように加えた。この培養物をpH8,0で6〜l
O°Cにて30分間抽出した。この抽出物を30分間遠心しく4000rpm)
、そしてその上溝液を凍結するか、又は直ちに更に処理した。
実施例1由来の細胞培養物1リツトルを、7Mの尿素及び50mMのシスティン
0.5リツトルを用いて1.5リツトルに希釈した。この抽出物を中空ファイバ
ー装置(Nephros Presto、H,F、オルガノン社)に通すことに
より、透析した。7Mの尿素及び50mMのシスティン、pH8,0を133m
1/分の流速で逆流させることにより緩衝液の交換を行った。この抽出物及び緩
衝液を平衡が達せられるまで循環させた。
透析は2.0mSのイオン強度で停止させた。
DE−52(Whatmann)陰イオン交換材料を、50mMのトリス−HC
l。
7Mの尿素、50mMのシスティンを用い、2.0mMの伝導率に平衡化さた。
平衡にしたこの陰イオン交換材料を実施例2で得られた粗透析抽出物(タンパク
質/ゲル)と混ぜ合わせた(Ig対30m1の比で)。
この粗抽出物を室温で2hr、又は4°Cで一夜吸着させた。吸着に次いで、未
吸着タンパク質をミリポアA25フイルターでの濾過により集めた。この濾液を
、同種の緩衝液を用いて予備平衡にしたFF−Qセファロース上に周囲温度で3
時間再吸着させた(タンパク質/ゲルの比は1g7200m1とした)。変性A
la Glu −IGF −1の定性及び定量は逆相クロマトグラフィーにより
決定した。利用したカラムは、TFA、アセトニトリル中のネクレオシル(Nu
cleosil) C4,5μm、4.6x25Ommカラムとした。初期条件
、TFA: H2O中で0.085%(緩衝A):緩衝液Bは0.1%のTFA
、 80%のアセトニトリル。
緩衝液AとBの混合物を用い、0から5分までは30%Bでイソクラチックに、
5から25分目までは30−75%のBの勾配で溶離させた。
流速1.Oml /分;検出: 215nmでの吸収:周囲温度とした。変性且
つ還元させたAla Glu −IGF −1を図2に示す。
実施例3に記載の通りに得られた、プールした変性且つ還元したAla Glu
−rGF −1のバッチを7Mの尿素及び50mMのシスティンを用いて0.
2mg/mlのタンパク質濃度に調整した。このpHを5MのNaOHを用いて
9.5に合わせた。この溶液を、50mMのトリス−C1,2mMのシスティン
、pH9,5及び25%のエタノールより成る緩衝液に対して透析した。透析は
中空ファイバー透析装置(Nephros Prosto H。
F、オルガノン社)を用い、1001111/分の流速で行った。溶液と緩衝液
との間で平衡が達せられたら透析緩衝液を交換した。150μsの伝導率及び2
5mMのレドックス電位が達せられるまでこのプロセスを続けた。はとんどのA
la Glu −IGF −1が折りたたまれる第−期の後、この溶液を4°C
て一夜安定化させた。16時間後、5Mの酢酸を用いてpHを4.0に調整する
ことによって反応を停止した。透析後、そのイオン強度は0.2mSであり、そ
して尿素の濃度は< 0.05Mであると見積られた。
変性且つ還元したAla Glu −IGF −1のアリコートの再生の例を図
3に示す。RT 14.86分のピークはMr 7845 a、m、u、のAl
a Glu−IGF−1(RT 15.68)のスクランブル状態である。Al
a Glu −IGF −1より後に現れているピークはおそらく該分子のスク
ランブル状態であろう。
この段階で利用するレドックス電位は、pH4,0で463mVの一定のレドッ
クス電位を有する5mMのヒドロキノン溶液を用いて調整した。
中空ファイバーRP−HPLCに関しては図6を参照のこと。
図6において、RT 15.99のピークはAla Glu −IGF −1で
ある。
RT 15.21のピークは、Mr 7845 a、m、u、を有するAla
Glu −IGF −1のスクランブル状態である。
変性Ala Glu −IGF −1の再生は以下の方法でも行った:1)2m
g/mlの変性サンプルを、50mMのトリス、2mMのEDTA、 pH9,
0,25%のエタノールにおいて、0.2mg/ml (バイオラッドアッセイ
)の最終濃度に希釈し、次いで4℃で18時間反応を進行させること。
2)NAP5カラム上で変性サンプルを、50mMのトリス、1mMのシスティ
ン、2mMのEDTA、 pH9,0,25%のエタノールにおいて脱塩するこ
と。溶出容量は1.00m1であった。タンパク質濃度は0.3mg/ml(バ
イオラッドアッセイ)であり、そして反応は4°Cで18時間進行させた。
3)50mMのトリス、1mMのシスティン、2mMのEDTA、pH9,0,
25%のエタノールに対して、4°Cで18時間の変性サンプルの透析(Spe
c−tapOr 3.5kDカツトオ))。タンパク質の初期濃度は0.3mg
/mlとした。
各実験において得られる溶液200μmを5Mの酢酸30μmにより繊細化し、
そしてこの200μmをミレックス0.22μmフィルター上で濾過し、次いで
ヌクレオシルC4,5μ、4.6 X 250mmカラム(Machery−N
aHel 720059)上でRP −HPLC分析にかけた(A緩衝液:0、
085%のトリフルオロ酢酸(TFA) 、B緩衝液=0.1%のTFA、 8
0%のアセトニトリル:0から5分まで30%Bのイソクラチック、5から25
分まで30〜75%のBの線状勾配を利用;流速: 1.0ffll/分;検出
:215nm ;周囲温度)。
図7〜9について。
図7において、RT 16.07分のピークはAla Glu −IGF −1
である。
RT15.1のピークはMr 7845 a、m、u、を有するAla Glu
−(GF −1のスクランブル状態である。Ala Glu −rGF −1
よりすぐ後に現れるピークも同様にスクランブル状態である。
図8において、RT 16.07のピークはAla Glu −IGF −1で
ある。
RT15.10分のピークはMr 7845 aom、u、のスクランブル状態
である。
Ala Glu −[GF −1よりすぐ後に現れるピークはおそらく同様にス
クランブル状態である。20分以後に現れるピークはおそら< Ala Glu
−IGF−1の不可逆性スクランブル状態又は重合状態であろう。
図9において、RT 16.21分のピークはAla Glu −IGF −1
である。
RT 15.43分でのピークはMr 7845 a、m、u、のスクランブル
状態である。
Ala Glu −IGF −1のすぐ後に現れるピークはおそらく同様にスク
ランブル状態である。
実施例8
再生Ala Glu −rGF −1の陽イオン交換FF−5セフアロース(フ
ァルマシアーLKB)70101を、5MのNaOHでpH4,0に調整した2
5[11MのNa−リン酸塩、25mMのNa−クエン酸塩、25%エタノール
で平衡にした。
実施例7に記載の通りに得られた再生混合物21JットルをFF−5セフアロー
スに適用した。この懸濁物を周囲温度で30分間ゆっくり混合し、次いでこのゲ
ルをカラム(3,5X 20cm” ) Gこ充填した。中1用した緩衝液は
A : 25mMのNa−リン酸塩、25mMのNa−クエン酸塩pH4,0,
25%のエタノール
B:25−のNa−リン酸塩、25mMのNa−クエン酸塩pH7,0,25%
のエタノール、であり
両方トも5MのNaOHを用いて調整シタ。
流速は0.15m1/ am” /分とし、検出は28cmmで行し)、そして
温度は4°Cとした。60分かけての0〜100%のBの勾配を適用した。28
cmmでの吸収により決定されるAla Glu−IGF −1を含んで成る画
分実施例8で得られるAla Glu −IGF −1のプールを40mMのN
a−クエン酸塩、200−のNaC1pH4,0(5MのNa0Hl二より調整
)(こ対し4℃で18時間透析した。
温度を37°Cにまで上げ、そしてタンノ(り質のmg当り0.08単位のカブ
テシンC(3,4,14,1ベ一リンガーマンノ1イム社)を加えた。
30分後、この反応混合物をRP −)IPLCカラムに適用した。
反応の停止及び精製のため、反応混合物を100mMのNa−!Jン酸塩緩衝液
pH3,0のRP−HPLCカラム(ノボ ノルディスクA/S RP18゜1
5μm、 10X10X250に適用し、そして30〜60分か番すての30−
50%のエタノールの逐次勾配を用いて溶出させた。流速it0.75m1/分
、検出は2sonmにて、周囲温度で行った。
28cmmでの吸収により決定されるIGFを含んで成る画分をプールした。
実施例9に記載のRP −HPLC精製により得られるIGF−1のプールした
画分をファルマシアーLKBのFF−5(商標)セファロースHRIO/10カ
ラムに適用した。
用いた緩衝液は
A : 25mMのNa−リン酸塩、25mMのNa−クエン酸塩pH4,0,
25%のエタノール、
B : 25mMのNa−リン酸塩、25mMのNa−クエン酸塩pH7,0,
25%のエタノールであり、
両方とも5MのNaOHを用いて調整した。
流速は0.15+nl/cm” /分とし、検出は28cmmにて行い、温度は
4゜°Cとした。
100分かけての0−10096のBの線状勾配を利用した。28cmmでの吸
収により決定されるIGF−1を含んで成る画分をプールした。
実施例1Oで得られるrGF−1のプールした画分を0.1Mの酢酸に対して4
°Cて18時間透析しく5pectraptor 3.5kDカツトオフ値)、
次いで凍結乾燥した。
凍結乾燥粉末を7Mの尿素に溶かして5[l1g/mlの濃度にし、次いで0.
4Mの酢酸のセファデックスG50Fカラム(0,9x 60cm、ファルマシ
アーLKB)に適用した。流速は2ml/分、検出は28cmm、温度は4℃と
した。
28cmmての吸収により決定されるIGF−1を含んで成る画分をプールした
。
得られる溶液は、安定な凍結乾燥粉末を形成する常用の凍結乾燥試薬を用いて凍
結乾燥してよい。この粉末は、 IGF−1を含んで成る薬品製剤を製剤化する
ため、本質的に知られてしする方法の薬品製剤の製剤化に利用できる。
FIG、1
FIG、1 cont。
FIG、1 cont。
特表千6−500084 (12)
量 「輝
国際調査報告
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(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号Cl2P 21102
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DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、NL、SE)、 AU、 BG、
BR,CA、 C5,FI、 HU、JP、KP、KR,No、PL、RO,
SUI
(72)発明者 ダルベーイエ、ヘンリクデンマーク国、デーコー−2830ビ
ルム。
リグステルベンゲト 63
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.アミノ末端伸長部AlaGluを有するヒトIGF−1。 2.アミノ末端伸長部AlaGluを有するIGF−1をコードするDNA配列 。 3.アミノ末端伸長部AlaGluを有するヒトIGF−1をコードするDNA を含んで成る組換ベクター。 4.AlaGlu−IGF−1及び0mpAシグナル配列をコードするDNAに 直接連結している温度感受性プロモーターλPRを含んで成る、請求項3に記載 のベクター。 5.アミノ末端伸長部AlaGluを有するヒトIGF−1をコードするDNA を含むベクターを含んで成る、形質転換微生物。 6.微生物がE.コリである、請求項5に記載の形質転換微生物。 7.AlaGlu−IGF−1の再生のための方法であって、変性且つ還元状態 にあるAlaGlu−IGF−1を、20〜40%(V/V)のエタノールを含 む緩衝液に対して、5時間まで時間をかけて、0.1〜0.6mg/mlのタン パク質濃度、及び0.15〜0.3mSの伝導率で、周囲温度、及び7.5〜1 0.0のpHにて透析することによってレドックス電位を−40mVから+20 〜+40mVまでに変えて折りたたみ、そして最終的にこの混合物のpHを5以 下に酸性化する方法。 8.ヒトIGF−1を製造するための方法であって、i)アミノ末端伸長部及び 発現生成物の分泌を提供するシグナル配列を有するヒトIGF−1をコードする DNAに直接連結している誘発性プロモーターを含んで成る発現ベクターにより 形質転換されている微生物において、アミノ末端伸長化IGF−1を発現させ、 ii)還元剤及び任意的にキレート剤の存在下において、尿素を用いてpH>6 .0でアミノ末端伸長化1GF−1を抽出し、iii)1.8〜2.2のmS及 びpH7.8〜8.2に調整した段階ii)と同種の衝液を用いて、DEAE, DE及びFF−Qより成る群から選ばれる陰イオン交換ゲル上でのクロマトグラ フィーにこの抽出物をかけ、iv)20〜40%(V/V)の濃度のエタノール を含む緩衝液に対して、5時間までの時間にわたり、0.1〜0.6mg/ml のタンパク費濃度、及び0.15〜0.3mSの伝導率にて、周囲温度にて、そ して7.5〜10.0のpHにて透析することによりこの反応混合物のレドック ス電位を−40mVから+20〜40mVに線状に変化させて単離したアミノ末 端伸長化IGF−1を再生し、そして最終的にこの混合物をpH5以下に酸性化 させ、 v)DAPI(EC3.4.14.1)を用いてこのアミノ末端伸長部を切断し 、 vi)RP−HPLC及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてアミノ末端 伸長化1GF−1から再生真性ヒトIGF−1を単離し、そしてvii)単離し たヒトIGF−1をゲル濾過し、次いで凍結乾燥すること、を含んで成る方法。 9.微生物がE.コリである、請求項8に記載の方法。 10.プロモーターがλPR,λPL又はλPR′のような温度感受性プロモー ターであり、そしてシグナル配列がLamB,0mpA又は0mpFである、請 求項8に記載の方法。 11.プロモーターがλPRであり、そしてシグナル配列がmpA−配列である 、請求項10に記載の方法。 12.段階IIにおけるAlaGlu−IGF−1の抽出を、>4Mの尿素の濃 度を有する緩衝液を用いて行う、請求項8に記載の方法。 13.段階ii)におけるAlaGlu−IGF−1の抽出を、7Mの尿素、5 0mMのCys,pH8.0の緩衝液を用いて行う、請求項8に記載の方法。 14.段階iii)に由来する抽出物のクロマトグラフィーを、pH8.0にて 2.0mSの伝導率で行う、請求項8に記載の方法。 15.段階iii)に由来する抽出物のクロマトグラフィーを、DEでのバッチ 式クロマトグラフィー、FF−Q(商標)での操り返しで行う、請求項8に記載 の方法。 16.段階ivにおけるAlaGlu−IGF−1の再生を、0.2mSの伝導 率で行う、請求項8に記載の方法。 17.段階iv)の再生を、レドックス電位を3時間にわたり約−40mVから +25〜+30mVに線状に変えて行う、請求項8に記載の方法。 18.段階iv)の再生を、0.2mSの伝導率、0.2mg/mlのタンパク 質濃度及び8.5〜9.5のpH、特に8.5〜9.0のpHで行う、請求項8 に記載の方法。 19.段階iv)の再生を、20〜22℃の温度で行う請求項8に記載の方法。 20.段階ivの再生を、AlaGlu−IGF−1を中空ファイバー装置に、 25〜250ml/分の流速、好ましくは約100m1/分の流速で通過させる ことにより行う、請求項8に記載の方法。 21.段階iv)の酸性化を、5Mの酢酸を加えることにより行う、請求項8に 記載の方法。 22.段階v)の切断を、タンパク質のmg当り0.08単位のDAP−Iの濃 度におけるDAP−Iを用いて、NaClの存在下において、タンパク質濃度を 約1mg/mlに調整して、40mMの酢酸緩衝液pH4.0の中で37℃にて 行う、請求項8に記載の方法。 23.成熟IGF−1の製造のための、アミノ末端伸長部AlaGluを有する IGF−1の利用。
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