JPH06500084A

JPH06500084A - 生物学的に活性な化合物、その製造方法及びその利用

Info

Publication number: JPH06500084A
Application number: JP3513656A
Authority: JP
Inventors: スクリベル，ラルス; ヘイネス，キム　リイ; ダルベーイェ，ヘンリク
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1990-08-20
Filing date: 1991-08-16
Publication date: 1994-01-06
Also published as: ATE154073T1; IE912935A1; US5708134A; PT98711A; WO1992003477A1; US5459052A; AU8417091A; PT98711B; EP0545999B1; US5691168A; DE69126434D1; EP0545999A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的に活性な化合物、その製造方法及びその利用本発明は、アミノ末端伸長部を有する新規なヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）　、このようなアミノ末端伸長部を存するＩＧＦ−１をコードするＤＮＡ配列、アミノ末端伸長部を有するヒト　ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡを含んで成る組換プラスミド、このような組換プラスミドを含む形質転換微生物、Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＴＧＦ　−１の再生、ヒトＩＧＦ−１の製造方法、及び成熟ＩＧＦ−１の製造のためのアミノ末端伸長化［ＧＦ−１の利用に関する。本発明はＩＧＦ−１の大量生産に利用するのに特に適する。

発明の背景インスリン様成長因子（ＩＧＦ）はインスリン様及び成長刺激特性を有するタンパク質の種類を構成する。このペプチドは血漿から精製されており、そしてその構造及び化学特性は決定されている。ＩＧＦはプロインスリンと近接な構造相同性を示し、そして似たような生物学的作用を示す（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ、　Ｅ、とＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、著：　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５３．　２７６９−２７７３　（１９７８）、Ｚａｐｆ、Ｊ、ら著：　Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐｉｃｓ　１ｎＣｅｌｌ　Ｒｅｇ、、　１９．２５７−３０９　（１９８１）、Ｈｕｍｂｅｌ、Ｒ，Ｅ、著：　Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏ −ｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　１２．　ＡＰ　５６−６９　（１９８４）、ｖａｎ　Ｗｙｋ、Ｊｊ、著：Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｔ）ｔｉｄｅｓ、　１２．　ＡＰ　８１−１２５　（１９８４））　Ｏ二種の主要なるＩＧＦの型は同じ種類のタンパク質の一員でありながら、その化学的特徴に関してやや相違する。ＩＧＦ−１は塩基性ペプチドであり（ｐｌ　８．４）　、そしてプロインスリンと４３％の相同を示す（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ、　Ｅ、とＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、著：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５３．２７６９−７６　（１９７８））。　ＩＧＦ−２はほぼ中性のペプチドであり（ｐ［６，４）、ＩＧＦ−１と６０％の相同を示す。

ＩＧＦ−１は７０個のアミノ酸より構成され、その配列はＲ１ｎｄｅｒｋｎｅ− ｃｈｔ、　Ｅ、とＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、著：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５３．２７６９−７３　（１９７８）により決定されている。ＩＧＦ−１に関する物理化学的パラメーターはいくつかのグループによりかなり研究されている。これらの研究に利用されている材料は主として種々の常用のクロマトグラフィー法によりヒト血漿から単離されている。これらには第一に血漿分画化、そして更には結合性タンパク質とその他の血漿タンパク質を除去するための酸エタノール抽出を利用する他のタンパク質の沈殿を含む。酸性化されたＩＧＦ−１−濃縮画分を次に陽イオン交換クロマトグラフィー、並びに複数の段階の逆相及び等電点電気泳動にかけて、数μｇの精製ＩＧＦ−１の回収を行っている。

ＩＧＦ−１及びそれより少ない量のｒＧＦ−２は血漿の中に見い出せるが、はんの微量にしか遊離形態においては存在していない。両ＩＧＦに対して非常に高い結合容量を有する高分子量の特異的結合性タンパク質は、担体タンパク質として又はｒＧＦ機能のモジュレータ−として働＜　（Ｈｏｌｌｙ、Ｊ、Ｍ、Ｐ、とＷａｓｓ、　Ｊ、　Ａ、　Ｈ，著：　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１２２゜６１１−６１８　（１９８９）、　Ｏｏｉ、Ｇ、Ｔ、とＨｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ａ、　Ｃ，著：　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　。

１１８、７−１８　（１９８９））。ＩＧＦは大量で存在しているときはインスリン様作用を示すが、それはインスリンの１％程度にすぎない。ＩＧＦ−１の体細胞機能は通称「ソマトメジン説」において明瞭に述べられ、この説が示唆するには、脳下垂体から放出される成長ホルモンは肝臓からのＩＧＦ−１の放出を刺激することによりその作用を及ぼし、ここで［ＧＦ−１は次に標的組織における細胞表層レセプターに結合することを介して体細胞原性作用を仲介することである（Ｓａｌｍｏｎ、　Ｗ。

Ｄ、　Ｊｒ、　、とＤａｕｇｈａｄａｙ、　ｗ、　Ｈ，著：　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、、　４９．８２５−８３６゜（１９５７））。ＩＧＦの主要な局所的生物学的機能は強い分裂促進剤のようであるが、しかしながらその効果は例えばＰＤＧＦ及びＦＧＦに関して測定されたものよりは弱い（Ｆｒｏｅｓｃｈら著：Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｉｏｌ、　４７．４４３−４６７　（１９８５））。ＰＤＧＦと一緒となって、　ＩＧＦ−１は相乗生物学的作用を示す（Ｋａｔｏら著：　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１２９．６８５−６９０　（１９８３）。

５ｔｉｌｅｓら著：　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、　ＵＳＡ、　７６、１２７９−１２８３　（１９７９））。従ってＩＧＦ−１の主たる生物学的作用は有糸分裂を増大させる機能、及び適切にコントロールされている条件のもとて他の因子により誘発される成長を維持させる機能であると考えられる（ＯＫｅｅｆｅら著：　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　３１．１６７−１８６　（１９８３））。

分裂促進因子としてのＩＧＦ−１の効力、並びに例えば創傷の治癒及び窒素代謝におけるその莫大な数の潜在的利用性は、それがヒト血漿の中に微量に存在しているため、多数の生物薬学者に種々の生。

物においてＩＧＦ−１を発現させようとする試みを奮い立たせた。酵母におけるＩＧＦ−１の生産は適切に折りたたまれたポリペプチドの非常に容易なる精製を理由に好まれている。しかしながら、このような発現系の利用に係る一定の顕著な欠点が存在する。発酵の収率は低く（発酵培地のリットル当り数ｍｇ）　、そして〇−結合グリコシル化形態の分子の獲得の危険性が高い（Ｇｉｌｌｅｒｆｏｒｓら著：　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２６４．２７４８−５３　（１９８９））。

細菌における発現が高い収量のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２を得るのに現在までの最も有用な手法であるが、これはほとんどが細胞一体化状態にある。安定化用ペプチドと融合させたＩＧＦ−１を発現させることも試まれでいる。このようなペプチドは通常ＩＧＦ−１自体と同じサイズであり、そして生ずるタンパク質の精製を促進せしめる物理化学的性質を有することがある。融合タンパク質は、単離を目的とする成熟タンパク質を残すような化学的又は酵素的切断によって切断する。

組換ペプチド（融合ペプチド）の抽出は通常、抽出したＩＧＦ−１の変性段階、それに続（インビトロ再生を伴い、これにより　ＩＧＦ−１の天然コンホメーションが得られる。

今迄に開示されてきた細菌系において、発酵培地１リットル当り１−１．５グラムの収率がｈＧＨの生合成発現に関して開示されている。

しかしながら、高収率の発現にもかかわらず、はんの微量の天然ＩＧＦ−Ｉ　Ｌか得られず、その理由は分子内及び分子間ジスルフィド架橋の形成がコントロールできないことによる。従って、このようなジスルフィド架橋を含む生成物の細菌発現には、ポリペプチドの精製の後半の際でのインビトロ再生が続くべきであるが、これは生成物の大量のロスを通常もたらす。

本発明の目的は主として、高収量において微生物でＩＧＦ−１を生。

産することに関する従来技術に述べられている問題を解決することにある。

本明細書に用いられている「折りたたみ」なる表現は、分子内ジスルフィド結合の形成を含む、タンパク質の三次構造を樹立するプロセスを表わすために用いている。

「再生」なる表現は、タンパク質の天然三次構造を樹立することを表わすために用いている。

「変性」なる表現は、ジスルフィド結合を崩壊させる及び／又はタンパク質をほどくような、分子の三次構造の破壊を表わすために用いている。

発明の詳細な説明本発明はアミノ末端伸長部Ａｌａ　Ｇｌｕを有するヒトｒＧＦ−１に関する。

このアミノ末端伸長部は、伸長化ＩＧＦ−１の高い発現率、ＩＧＦ−１の容易なる再生又は折りたたみ、及び成熟ＩＧＦ−１を生成するための酵素ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ−１、ＥＣ，３，４，１４，１）を用いるＩＧＦ− １の容易且つ完全な切断を可能とする。

従って、驚くべきことにこのアミノ末端伸長部Ａｌａ　Ｇｌｕは従来の技術の問題を解決することが見い出された。更に、反応混合物から適切なＮ−末端を有するＩＧＦ−１を精製することが可能である。

Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１は８０％以上、好ましくは９０％以上の精製率における中間体として単離されることができ、そして適切に折りたたまれている場合、　ｒＧｐ−ｉの生物学的活性を示す。

本発明はアミノ末端伸長部Ａｌａ　Ｇｌｕを有するＩＧＦ−１をコードするＤＮＡ配列にも関連する。この短い伸長部はルーｌβ及びｈＧＨの発現においては適用されているが、ＩＧＦ−１の発現に関しては試まれ。

ていない。

１ＧＦ−１をコードするＤＮＡの部分はｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ又は全体的もしくは部分的合成りＮＡであってよく、ここでＤＮＡの残りの任意の部分は対応のｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡであってよい。

アミノ末端伸長部分に用いられるヌクレオチド配列及びＩＧＦ−１をコードするＤＮＡの任意の合成部分は、選択した微生物にとって好ましいコドンを示すように選ばれることが好ましい。

アミノ末端の伸長されたＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の発現は、抽出する前に１．５ｇ／リットル（０，２ｍＭ）のＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の発現レベルをもたらす。これはより長い融合タンパク質を利用する系において得られる比発現率の約４〜５倍である。しかしながら、全ての短鎖アミノ末端伸長部が高いレベルの発現をもたらすわけではない。例えばＭｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１，（Ａｌａ　Ｇｌｕ）６−　ｒＧＦ　−１又はＩＧＦ−１自体の発現は全てＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１を発現させるのに得られるレベルより１０〜２５分の１の発現レベルをもたらす。

Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１をコードするＤＮＡは、７０個のアミノ酸のＩＧＦ−１をコードするクローン化ＤＮＡ配列あって、以下の合成的に製造した二本鎖ＤＮＡ配列と、十鎖の３′末端がＩＧＦ−１をコードする遺伝子の＋５′末端に連結され、そして合成りＮＡ鎖の５′末端が遺伝子の３′末端に連結しているような状態で、プラント末端連結により連結されているものより作られうる：＋　５　’　ＣＧＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ−３’　ＴＡＣＣＧＡ　ＣＴＴ（ここで十鎖の最初の２個のヌクレオチドはＣ１ａＩ制限部位突き出しであり、そしてそれに続くヌクレオチド配列はアミノ酸Ｍｅｔ　ＡｌａＧｌｕをコードする）。

本発明の更なる観点に従い、安定な生成物の生成を保証し、且つ。

ペリプラズマ空間又は直接的に培地へのその分泌を更に保証するような、アミノ末端が伸長されたＩＧＦ−１をコードする、工業的生産に適する遺伝子が提供される。

第三の観点に従い、本発明はアミノ末端伸長部Ａｌａ　Ｇｌｕを有するヒトＩＧＦ−１をコードするＤＮＡを含んで成る組換ベクターに関連する。このベクターは、Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１をコードするＤＮＡの上流にプロモーターを含んで成り、そして好ましくはＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＴＧＦ　−１をコードするＤＮＡに直接連結している温度感受性プロモーターλＰＲ及びペリプラズマ空間又は直接的に培地へとＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の分泌をもたらすＯｍｐＡシグナル配列を含んで成る。このベクターはＥ、　コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）に挿入したときに工業的生産に適するようになることが実証された。

第四の観点に従い、本発明は前記組換プラスミドを含んで成る形質転換微生物を提供する。

第五の観点に従い、本発明はＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の再生のための方法に関連し、ここでは実質的に変性及び還元状態のＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ− １を緩衝化水性溶液の中でメルカプト試薬の存在下において、その還元状態で折りたたむ。再生は、２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含む緩衝液に対する５時間までの時間にわたる、０．１〜０．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、０．１５〜０．３ｍＳの伝導率、及び７．５〜１０．０のｐＨでの透析による、−４０ｍＭから＋２０〜＋４０ｍＭに到るコントロールせしめたレドックス電位の変化の際に起こり、そして最終的にこの混合物のｐＨを５以下に酸性化する。

本発明の方法に用いるメルカプト試薬は不要な副産物を生成しない任意のメルカプト試薬、例えば２−メルカプトエタノール、システィン、システアミン、好ましくはシスティンである。

本発明に関して、メルカプト試薬は０．０１〜１０ｍＭの濃度、好ましく。

は０．１〜５ｍＭの濃度、そして最も好ましくは１ｍＭの濃度で用いられる。

本発明の折りたたみ又は再生を行う緩衝化水性溶液は８．０〜１０．０のｐＨ１好ましくは９．０のｐＨに緩衝化されている。

ある場合においては、本発明に関する変性を、４０％まで、好ましくは約２５％の量におけるエタノールの存在下において行うことが好ましい。かかる添加は本法の収率を高め、そしてエタノールの最も有利な効果は簡単な予備実験により容易に示される。

第六の観点に従い、本発明はＩＧＦ−１を製造するプロセスであって、ｉ）発現生成物の分泌を提供する、アミノ末端伸長部を有するヒトＩＧＦ−１及びシグナル配列をコードするＤＮＡに直接連結されている誘発性プロモーターを含んで成る発現ベクターにより形質転換された微生物における、アミノ末端伸長化ＩＧＦ−１の発現、ｉｉ）　ｐＨ＞６．０での、高濃度の尿素を用いる、還元剤及び任意的にキレート剤の存在下における、アミノ末端伸長化ｒＧＦ−１の抽出、ｉｎ　）　１．８〜２．２ｍＳ及びｐｆ（７，８〜８．２に調整した、段階ｉｉ）と同種の緩衝液を用いる、ＤＥＡＥ、　ＤＢ及びＦＦ−Ｑより成る群から選ばれる陰イオン交換ゲル上でのクロマトグラフィーに、この抽出物をかけること、ｉｖ）　２０−４０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含む緩衝液に対して、５時間までの時間にわたり、タンパク質濃度を０．１〜０．６　ｍｇ／＋ｎｌ及び伝導率を０．１５〜０．３ｍＳに維持しながら、周囲温度及び乙５〜１０．０のｐＨで透析することにより一４０ｍＶから＋２０〜＋４０ｍＭまで線状に反応混合物のレドックス電位を変化させて、この単離したアミノ末端伸長化ｒＧＦ−１を再生し、次いで最終的にこの混合物をｐＨ５以下に酸性化すること、ｖ）ＤＡＰ−１を用いるアミノ末端伸長部の切断、ｖｉ）ＲＰ−ＨＰＬＣ及び陽イオンクロマトグラフィーを用いる、アミノ末端伸長化ＩＧＦ−１に由来する再生された真性ヒトＩＧＦ−１の単離、並びにｖｉ）単離したヒトＩＧＦ−１のゲル濾過及び凍結乾燥、を含んで成るプロセスに関する。

本発明の方法は、ダラム陽性菌又はグラム陰性菌、例えばエッシュリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）　、好ましくは工業的有用性に基づき非常に好都合な宿主であるＥ、コリのような微生物において、アミノ末端伸長化ＩＧＦ−１を発現させることによって行なわれつる。

本発明に関して、適切な発現及び分泌のために、このプロモーターは温度感受性プロモーター、例えばλ７３．λ１．又はλ口・でよく、そしてシグナル配列はＬａｍＢ、ＯｍｐＡ又はＯｍｐ　Ｆ配列でよい。

Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１は、Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１をコードする遺伝子に直接連結されているλ□プロモーターを用いることにより高レベルで発現され、モしてＯｍｐＡシグナル配列は安定状態にあるタンパク質の分泌を提供する。

Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ｒＧＦ　−１の抽出は、発現系によりＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１に付与される三次構造を破壊するために、尿素、還元剤例えばシスティン、２−メルカプト−エタノール又はジチオスレイトール及び任意的にキレート剤例えばＥＤＴＡを用いる還元及び変性条件のもとで行われる。

全体的に変性された状態におけるＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の抽出は、７Ｍの尿素、５０ｍＭのＣｙｓを含む、等電点（８，４）又はｐＨ８，０の緩衝液を用いて行うことが好ましい。

Ｅ、コリに由来するほとんどの夾雑タンパク質は、等電点での陽イオン交換クロマトグラフィーによって還元及び変性Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ−１から除去される。このクロマトグラフィーは２．０ｍＳの伝導率及びｐＨ８，０にて行われるのが好ましく、そしてＤＢ　−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）でバッチ式クロマトグラフィーを行い、ファストフローＱセファロース（商標０ＦＦ−Ｑ）で繰り返すことが好ましい。

還元及び変性Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１は、正しく折りたたまれている安定なＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１ヘと再生される。

この再生プロセスは、レドックス電位、ｐＨ、タンパク質濃度及び温度のコントロール下で、キレート剤、変性剤及びメルカプト試薬の存在下における、且つ育種溶媒の存在下における透析を利用して行われる。

透析緩衝液は、微量の還元剤（例えばＤＤＴ、　Ｃｙｓ又は２−メルカプトエタノール）、キレート剤、疎水結合により相互作用する育種化合物（例えば第三ブタノール、２−プロパツール、エタノール、メタノール）の存在、そして最後によく規定されたｐＨの間隔、典型的には８．８〜９．０のｐＨを維持する緩衝剤の存在を特徴とする。ある態様において、以下の緩衝組成、即ち、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１　ｍＭのＣｙｓ、２　ｍＭのＥＤＴＡ及び２５％のエタノールｐＨ２，５が利用される。

再生は好ましくは、レドックス電位を線状的に、３時間かけて約−３０ｍＭから＋２５＋ｎＶと＋３０ｍＭとの間まで変化させることによって行われる。レドックス電極はよく規定された４６３ｍＶのレドックス電位を有するヒドロキノン溶液を用いて較正する。

再生は好ましくは、０．２ｍＳの伝導率、０．１−０．４　ｍｇ／　ｍｌ（７）　９　ンハク質濃度、２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）の濃度においてエタノールを加える前の緩衝液における測定されるｐｆ（が８．５〜９．５、特に好ましくは８．５〜９．０のｐＨ１及び２０〜２２℃の温度で行われる。

最も好ましい観点に従うと、Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の再生は、このポリペプチドを中空ファイバー装置（Ｎｅｐｈｒｏｓｓ　Ｐｒｅｓｔｏ、　Ｈ，Ｆ、　、オル。

ガノンテクニ力社）に、ｐＨ５以下、好ましくはｐＨ４，０まで５Ｍの酢酸を加えることによってこのプロセスを終了させるまで、レドックス電位を変えながら、２５〜２５０　ｍ１７分、好ましくは約１００ｍ１／分の流速で通すことによって行われる。

生ずる溶液を次に、アミノ末端伸長部を切断する前に育種溶剤の存在下において陽イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮する。

この陽イオン交換クロマトグラフィーは好ましくは強力なイオン交換材料、例工ｊｆＦＦ−Ｓ　（ｉｌ［）　又１ｔＦＦ−５Ｐ　（［標）ヲ用イ、１０〜４０％のアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパツール又はブタノール、好ましくは２５％のエタノールの存在下において、３．５〜７．５の９Ｈ勾配を利用して行う。

再生させたＡｌａ　Ｇｌｕ−ＩＧＦ　−１の切断は好ましくは、迅速且つ効率的なｒＧＦ−１前駆体の切断をもたらすエキソペプチダーゼ（ＤＡＰ　−１）を用いて行われる。このエキソペプチダーゼは好ましくは０．Ｇ８単位のＤＡＰ−１／タンパク質ｍｇの濃度において、ＮａＣ１の存在下において、タンパク質濃度を４０ｍＭの酢酸緩衝液の中で約１　ｍｇ／ｍｌに調整して、ｐＨ４，０及び３７℃で用いられる。

ＤＡＰ−１を用いる切断の後のＩＧＦ−１の逆相ＨＰＬＣ精製は、市販タイプ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ）であるか又は受注Ｃ１８シラノイルＲＰ１８カラムのいづれかのＲＰ１８−カラム上で行うことができる。好ましくは、３０〜５０％のエタノール線状勾配を用いる、０．１ＭのＮａ−リン酸塩緩衝液においてｐＨ３，０にて溶離させる１５μｍのノボ　ノルディスクＡ／ＳシラノイルーＲＰ１８カラムか利用される。

適切に折りたたまれていない全てのｒＧＦ−１は、市販のタイプ、例えばＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂのか、又は受注ＣＩＩシラノイルＲＰ１８カラムのいづれかのＲＰ１８−カラムでの、移動相としてエタノールを用いる逆相クロマトグラフィーにより除去されることができ、そして残留Ａｌａ　Ｇｌｕ−ＩＧＦ−１は酸性条件から出発して、前記の陽イオン交換手順と同種の緩衝液系を用いるｐＨ４，０からｐｉ（７，０に到るｐＨ勾配を適用する陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して取り出すことができるであろう。

精製したｔｃｐ−ｉを次に凍結乾燥及びゲル濾過にかける。凍結乾燥させたｒＧＦ−１を７Ｍの尿素の中に取り込ませ、そして０．１Ｍの酢酸に４℃で平衡にしたＧ５０Ｆ　ＧＰＣセファデックス（商標）カラムに適用する。精製した材料は４°Ｃで保存する。

最後に、高純度ＩＧＦ−１を透析、次いでゲル濾過にかけ、そして凍結乾燥して、凍結乾燥された化学的に安定な粉末を形成させる。

本発明の更に他の観点は、完全に変性且つ還元された状態にあるアミノ末端伸長化ＩＧＦ−１の部分精製にある。

適切なアミノ末端及びアミノ酸配列を有するＩＧＦ−１からのアミノ末端伸長化ｒＧＦ−１の選択的分離は、Ｄａｌｂｏｅｇｅ、　Ｈ，ら著、ＦＢＢＳＬｅｔｔ、　２４６（１，２）　８９−９３．１９８９に記載の原理に従い、ＤＡＰ−１を用いるアミノ末端伸長部の切断の後に陽イオン交換クロマトグラフィーを利用することによって得られる。

逆相ＨＰＬＣによる不適切に再生した（折りたたまれた）状態のｒＧＦ−１の除去は、３００人の孔径を存する１５μの球状粒子を含んで成るオクタデシル−ジメチル−シリル置換化珪素を用いて得られる。

ジスルフィド架橋の適切な位置に関連する再生ＩＧＦ−１の特徴付けは、二通りの酵素切断、それに続くペプチド地図化及びシーケンス分析を利用して行われる。

本発明のプロセスは、それが直接スケールアップできることに更なる利点を有する。

本発明の価値のある観点は、非常に高収率（１００％近く）のＡｌａ　Ｇｌｕ− ＩＧＦ−１を提供する抽出手順にある。アミノ末端伸長化ｒＧＦ−１。

に従って、Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ｒＧＦ　−１が樹脂に結合しないようなｐ１条件のもとて特異的なＦＦ−Ｑ（商標）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用することにより精製され、ここでＥ、コリに由来するタンパク質及びＡｌａ　Ｇｌｕ　−ｒＧＦ　−１の物理化学的性質と似たようなそれを示すポリペプチドはこのような特異的な条件のもとで除去される。本発明の他の価値ある観点は再生段階にある。この段階は、Ａｌａ　Ｇｌｕ−ＩＧＦ−１の再生中でのレドックス電位、イオン強度及び温度の常時のコントロールを特徴とする。

プレ配列の改質は再生にとっての条件を劇的に変えることが見い出された。

零発”Ａｌａ　ＤＡＰ−１（ＥＣ３，４，１４，１＞を用いるＴＧＦ−１（７）Ｎ−末端伸長部の切断、及び最終ゲル濾過クロマトグラフィ一段階の前での適切に折りたたまれたｒＧＦ−１の緩かな変性の適用に関する新しい概念を更に提供する。

従って本発明は、生成物の品質及び発酵に続く下流プロセスの収率を共に向上させる一連の固有の条件を利用する。

本プロセスは一工程当りグラムの桁の量までスケールアップでき、且つＥ、コリに由来するタンパク質の低含有量により示される（　＜　１　ｐｐｍ）ように、高純度が得られる。

この生成物は、ヒト血漿より精製したＩＧＦ−１に関して見うけられるアミノ酸組成、アミノ酸配列、ジスルフィド架橋及びペプチド地図と同一性を育することが示されている。この生成物は５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル及び自然ゲルの電気泳動の後に単一バンドを示すことを特徴とする。最後に、分析用逆相）ＩＰＬＣ及びＧＰＣにより、この生成物は純度が９５％以上であることが特徴付けられる。

更に、本発明は成熟ＩＧＦ−１の製造のための、アミノ末端伸長部Ａｌａ　Ｇｌｕを有するＩＧＦ−１の利用に関する。

本発明の方法の生成物の生物学的活性は、血漿から精製した天然ＩＧＦ−１のそれと等しい。この生成物は創傷治癒の際の創傷の処置、骨折、代謝疾患及び■型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治癒に利用されつる。ＩＧＦ−１は、このＩＧＦ−１を含んで成る薬品製剤又は投与形態の製剤化のための、本質的に知られる任意の方法において製剤化されつる。

図面の簡単な説明本発明を図面を参照しながらより詳しく説明するが、ここで、図１はＡｌａ　− Ｇｌｕ　−ＴＧＦ　−１をコードするベクターのクローニング手法を示し、図２は、変性且つ還元状態にある部分精製したＡｌａ　−Ｇｌｕ　−ｒＧＦ−１のＩＰＬＣ図を示し、図３は、再生状態にある部分精製したＡｌａ　−Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１のＩＰＬＣ図を示し、図４は、純度９５％以上のＩＧＦ−１の分析ＨＰＬＣ図を示し、図５は、　ＩＧＦ−１をコードするｐＨＤ１４７のＤＮＡ配列を示し、図６は、中空ファイバー分析による再生の後のＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１のＲＰ　−ＨＰＬＣ図を示し、図７は、希釈による再生の後のＡｌａ　Ｇｌｕ　−ｒＧＦ　−１のＲＰ　−ＨＰＬＣ図を示し、図８は、脱塩による再生の後のＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１のＲＰ　−ＨＰＬＣ図を示し、そして図９は、透析による再生の後のＡｌａ　Ｇｌｕ　−［ＧＦ　−１のＲＰ−ＨＰＬＣ図実験の章実施例Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　−［ＧＦ　−１に関する合成遺伝子を公開されたアミノ酸配列（Ｊａｎｓｅｎら著、１９８３）を基礎として作製した。最適Ｅ、コリ　コドンを利用し、合成フラグメントから遺伝子を作製し、次いでアニーリング、そしてゲル上での精製を行い、これを適切なりローニングベクターにおける固有制限部位の間に逐次クローンした（図１）。

３０をコードするプラスミド）リンカ−の調製ニアツバ−（ｕｐｐｅｒ）　ａ１０アー（ｌｏｗｅｒ）　ａ及びロアーｂのリンカ−それぞれ０．４μｇを別々に、１μｌのｌＯ×のキナーゼ緩衝液、１μＩの１０ｍＭのＡＴＰ、１μｍのＴ４　ＰＮＫ　（１０単位）、６μ ｍのＨ２Ｏを加えることによりリン酸化（ｋｉｎａｔｅｄ）させた。インキュベーションは３７°Ｃで３０分とした。次にこの混合物を６５°Ｃで１０分間熱した。

１０μｍのリン酸化アッパーａ及び１０μｍのリン酸化ロアーａを１００°Ｃで３分間熱し、次いで氷上で冷やすことによってアニール化した。

１０μｍのアッパーｂを０．４μｇのロアーｂ（リン酸化していない）に、１００°Ｃで３分間熱し、次いで氷上で冷却することによってアニール化させた。

リンカ−のリゲーション：２０μｌのａ、　１１μｌのす、４μｌの１０×のりガーゼ混合物、１μｍのリガーゼ（０，５単位）、４μｌのＨｚＯを混ぜ合わせ、そして１５°Ｃで２時間インキュベートさせた。この混合物を１．８％の低融点アガロースゲルに流した。１００ｂｐのフラグメントをエル−チップ（ｅｌｕｔｉｐ）を利用して単離及び精製した。沈殿外。

理後、このフラグメントを５０μｌのＨ，０に溶かした。２μｌを取り出し、そして２％のアガロースゲル上でチェックした。

プラスミドの調製：上記の精製したリンカ−を次にＣ１ａ　Ｉ　／　Ｂａｌ　Ｉにより消化したｐＢＲ３２２にクローンした。Ｂａ１ＩによるｐＢＲ３２２の消化を促進するために、Ｅ、コリのメチル化機能のない株においてこのプラスミドを培養することが必要である。従って、ｐＢＲ３２２を細菌株Ｅ、コリＧＣ１１７であってＤＣＭマイナス及びＤＡＭマイナスである株に形質転換させる。

１０μｍのｐＢＲ３２２（ＧＣＩ　１７由来）を低塩緩衝液の中で５ＵのＣ１ａＩ／３ＵのＢａ１Ｉを用いて最終容量１００μｌにおいて消化させる。このインキュベーションを３７℃で２昼夜インキユベートした。

約１９００ｂｐのＤＮＡフラグメント（プラスミドフラグメント）を０．７％の低融点アガロースゲル上で精製した。エル−チップを利用して溶出後、ＤＮＡを４０μｌの８．０に溶かした。１μｍのアリコートをゲルでチェックした。

以下のリゲーション物を準備した：全てのリゲーション物を１５°Ｃで３時間インキュベートし、ＭＣ１０６１に形質転換させ、ニトロセルロースフィルター上のＬＢ＋アンピシリン（ＬＢＡ）アガープレート上で平板培養し、次いで３７°Ｃで一夜インキユベートした。翌日でのプレートの測定は、１００ｂｐのフラグメントを加えたプレート上に比べて大量のコロニーがコントロールプレート上にあることを示した。従って、　ＤＮＡハイブリダイゼーションにより全ての陽性形質転換体についてスクリーンすることが決断された。

コロニーハイブリダイゼーション：各フィルターのコピーを新たなニトロセルロースフィルター上にレプリケートし、両フィルターをＬＢＡプレート上に転写し、そして３７℃で一夜インキユベートした。一方のフィルタ上の細菌を、０．５ＭのＮａＯＨ，１，５ＭのＮａＣ１中で２分間溶菌させ、次いで０．５Ｍのトリス、ｐＨ８，１，５ＭのＮａＣ１で２分間、次いで２×のＳＳＣで２分間洗った。このフィルターを乾かし、８０° Ｃで１時間焼き、そしてプローブにハイブリダイズさせた。

プローブの調製：１　μＩ　Ｃ０，４ｕ　ｇ）のＩＧＦ−１アッパーａ、１　ａ　１　（０，４ａ　ｇ）のＩＧＦ　１７ツパーｂ、１０（ｌμｃｉ）γＡＴＰ（１０μｌ）、２μ ｌノ１０ｘノキナーゼ緩衝液、１μｍ（５単位）のＰＮＫ、　２０μｌのＨｚＯを混ぜ合わせ、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。この焼いたフィル。

ターを６５°Ｃでプレハイブリダイゼーションさせた後、５０μｌのハイブリダイゼーション容量において上記のプローブに加えた。ハイブリダイゼーションは６０°Ｃで一夜行った。このフィルターを２ＸのＳＳＣで洗い、次いで０．１× のＳＳＣ，５０℃で洗い、乾かし、そしてフィルム上に載せた。

１５個の陽性コロニーをＬＢＡの中で３７°Ｃにて一夜培養させた。酵素Ｃ１ａｎ／　ＰｖｕＩ［を用いるミニブレブＤＮＡの分析は、　１．５％のアガロースゲル上に流した後、クローン１１以外の全てのクローンが予測の７４５ｂｐのＤＮＡフラグメントを含んで成ることを示した。いくつかのクローンを更に分析するため、即ち、約１００ｂｐのＢａｌ　Ｉ　／　Ｃ１ａ　Ｉフラグメントの存在を分析するため、クローン１．　２．　３及び４をＥ。

コリＧＣ１１７に形質転換させ、次いで［、ＢＡアガープレート上で平板培養させた。４枚のプレートそれぞれから単一コロニーを選び、そしてマクシブレブＤＮＡを増幅させるために用いた。４種のプラスミド調製物の消化は、構造体１，２及び３が予測の制限部位を有するが、しかしクローン４はＢａｌＩ部位を欠くことを示した。

ｐｌ（Ｄ１４６の作製（ａａ　１〜５６のＭｅｔ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１をコードする配列を有するプラスミド）：ｐｌ（ＤＩ４５−１．−２及び−３のそれぞれに由来するマキシブレブＤＮＡ１００μｌを低塩の中で３７°Ｃにて２０単位のＢａ１Ｉにより一夜消化させた。

アガロースゲル上で消化をチェックした後、このＤＮＡを高塩の中で３７°Ｃにて２０単位のＰｖｕ　Ｉにより一夜消化させた。消化の後、ＤＮＡを０．７％の予備アガロースゲルで分画した。７５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを各クローンから単離し、エル−チップにかけ、沈殿させ、そして２０μｌの８２０に溶かした。０．４μｇのリンカ−Ｃ＋Ｄアッパー十ロアーを２０μｍのＨ，０の中で５分間煮沸し、次いで氷上で冷やしてアニール化させた。アニールしたリンカ−を次に２．５％の予備ゲ。

ルで精製し、７０ｂｐのバンドを単離し、エル−チップを利用してゲルから溶離させ、沈殿させ、そして２０μｌのＨ，０に溶かした。

精製したリンカ−を、１μｍのＩＯＸのキナーゼ緩衝液、１μｍの１０ｍＭのＡＴＰ、５単位のＰＮＫ、及びＨ２Ｏを１０μｍまで加え、次いで３７°Ｃで１時間インキュベートすることによりリン酸化させた。

２０μｍのｐＢＲ３２２ＤＮＡを５０単位のＰｖｕＩ１５０単位のＮｒｕ　Ｉにより、高塩の中で、最終容量１００μｍにおいて消化させた。消化後、ＤＮＡをゲル上で分画し、そして約２８００ｂｐのフラグメントを単離し、エル−チップにより精製し、沈殿させ、そして２０μｍのＨ，０に溶かした。

以下のリゲーション物Ａ、　Ｂ、コントロールＣ及びコントロールＤを、ｐＨＤ１４５−１　、−２及び−３のそれぞれから単離したフラグメントより準備した。

上記のリゲーション物を１５℃で一夜インキユベートし、ＭＣ１０６１に。

形質転換し、そしてニトロセルロースフィルター上のＬＢＡプレート上でプレートアウトした。リゲーション物当り５枚のプレートを用いた。３７°Ｃで一夜インキユベートさせた後、全てのプレートをレプリケートし、そしてｐＨＤ１４５の作製で前述した処理をした。ｐＨ０１４５について前述したように標識した１ μｍ（０，４μｇ）のアッパーＣ及び１μｍ（０，４μｇ）のアッパーｄをプローブして用いた。フィルムの現像後、２４の陽性コロニーを選び、モしてＬＢＡ培地の中でミニブレブＤＮＡへと増幅させた。このＤＮＡをＮｒｕ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩによる消化及び１．５％のアガロースゲル上での泳動により分析した。

クローン３゜４、　５．　８．１３．１６．１８．１９．２０及び２１が目的のものと見えた。クローン３及び１３を接近（ｃｌｏｓｅｒ）分析のために選び、そしてマキシブレブＤＮＡのために増幅させた。

以下のリゲーションから２４の単離クローンを単離した。

配列を有するプラスミド（図１））：ｐＨ０１４６−３及びＩ）ＨＤ１４６−１３それぞれに由来するマキシブレブＤＮＡ５０μｍを５５μｍの最終容量（中塩）の中で２０単位のＮｒｕ　Ｉ及び１５単位のＰｖｕ　Ｉにより消化した。１０μｍのｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを５５μｍの最終容量（中塩）の中で１５単位のＰｖｕ　Ｉ及び３６単位のＨｉｎｄＩＩ［により消化した。両者の消化物を０．８％の低融点アガロースゲル上で分画した。クローンｐＨＤ１４６−３及び−１３から５ｏｏｂｐのフラグメントを単離し、エル−チップにかけ、沈殿させ、そして５０μｍのＨ２Ｏに溶かした。ｐＢＲ３２２からは３５００ｂｐのフラグメントを単離し、エル−チップにかけ、沈殿させ、そして５０μＩのＨ，０に溶かした。

リンカ−ＩＧＦ−１ｅをアニールさせ、そして先のリンカ−に関して記載した２、５％の予備アガロースゲルで精製した。

５０ｂｐのフラグメントを単離し、そして５０μｍの８．０に溶かした。

上記のフラグメント全てをアガロースゲルでチェックした。

ｐＨＤ１４６−３及びＩ）ＨＤ１４６−１３に由来する８００ｂｐのフラグメントを用いてリゲーションを行った。リゲーション物を１５°Ｃで３時間インキュベートし、ＭＣ１０６１に形質転換し、そしてＬＢＡプレート上で平板培。

養した。フィルターをリプリケートし、洗い、そして前記の通りにハイブリダイズさせた。２μｌのＩＧＦ−１ｅロアーＤＮＡをプローブとして用いた。６個の陽性クローンをフィルターから選び、ここではｐＨＤ１４６−３及びＩ）ＨＤ１４６−１３のそれぞれのクローンに由来するＤＮＡを用いた。これらのクローンはｐＨＤ　−１−＞　６　（ｐＨＤ１４６−３＋リンカ−ｅ）とｐＨ０１４７− ７−＞　１２　（１１ＨＤ１４６−１３＋リンカ−ｅ）と呼ぶ。制限酵素ＥｃｏＲＩ　／ＨｉｎｄＩＩ［を用いた１２のクローン由来のミニブレブＤＮＡの分析は、全てのクローンが予測のＤＮＡ配列を含んで成ることを示した。クローンｌ並びに２．７及び８を、制限酵素ＨｉｎｄＩ［［／Ｃ１ａ　Ｉ　。

Ｐｖｕ　ＩＩＩ／ＢａｍＨ１，Ｐｓｔ　Ｉ／ＢａｍＨＩによる消化による近接分析のために選んだ。全てのクローンが予測の制限パターンを有することが見い出された。クローンｐＨＤ１４７−１及びｐＨ０１４５−７をマキシブレブＤＮＡへと増幅させた。同時にミニプレブＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲ１，ＨｉｎｄＩ［により消化したクローン１．　２．　７及び８より単離し、そして２２０ｂｐのフラグメントを単離し、Ｍ１３．　ＭＰ１８及びＭＰ１９の中にクローンし、そしてシーケンス分析にかけた。ＤＮＡ配列分析は、このクローンが予測のＤＮＡ配列を含んで成ることを示した。

プラスミドｐＨＤ１４７−１をフレノウＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下においてＨｉｎｄＩＩ［により消化し、フェノール抽出にかけ、沈殿させ、モしてＣ１ａＩにより消化させた。切り出した遺伝子を発現プラスミドｐＨＤ８６３Ｐ１３　（Ｄａｌｂｏｇｅら著、１９８７．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５．　１６１　ｆｆ）の中に導入し、次いでＥ、コリＭＣ１０６１に導入した。

発現プラスミドを含む細菌からの抽出物をＩＧＦ−１特異的ＲＩＡ及びウェスタンプロットにより分析する。どの分析したクローンも検出可能な量の［ＧＦ−１を発現しないことが見い出せた。Ｅ、コリに−おいて、小さな細胞質外来ポリペプチド（９０〜１００個以下のアミノ酸）は、不適切に合成されたタンパク質として認識されるためにそれらは分解されがちである。タンパク質分解活性が細胞質とは性質的に異なるベリプラズマへのこのようなタンパク質の輸送は−これらのポリペプチドを安定化しつる。

利用したシグナルペプチドはＥ、コリのＯｍｐＡとした。天然ＯｍｐＡ前駆体において、シグナルペプチドは二個のアラニン残基の間でプロセスを受ける。このプロセス部位を維持するため、Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　−［ＧＦ−１遺伝子をインビトロ突然変異誘発によりＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＴＧＦ　−１へと変える。この遺伝子を、ラムダＰＲプロモーター及び最適リポソーム結合性部位及びＣＩ　ｔｓ遺伝子を含む発現ベクターｐＨ０３１３（Ｄａｌｂｏｇｅら著、　１９８９．　Ｇｅｎｅ、　７９．３２５−３３２）の中に、シグナルペプチドがＡｌａ　Ｇｌｕ　 −ＩＧＦ　−１遺伝子にそのプロセス部位において直接融合されるような状態で導入した。得られるプラスミドｐＨＤ３６５をＥ、コリＭＣ１０６１に導入し、そして２８℃で１８時間培養した。　［ＧＦ−１の生産は温度を４０°Ｃに上げることによって誘発させた。

Ｅ、コリ発酵培地４リツトルにシスティンを最終濃度５０ｍＭとなるように、そして尿素を最終濃度７Ｍとなるように加えた。この培養物をｐＨ８，０で６〜ｌＯ°Ｃにて３０分間抽出した。この抽出物を３０分間遠心しく４０００ｒｐｍ）　、そしてその上溝液を凍結するか、又は直ちに更に処理した。

実施例１由来の細胞培養物１リツトルを、７Ｍの尿素及び５０ｍＭのシスティン０．５リツトルを用いて１．５リツトルに希釈した。この抽出物を中空ファイバー装置（Ｎｅｐｈｒｏｓ　Ｐｒｅｓｔｏ、Ｈ，Ｆ、オルガノン社）に通すことにより、透析した。７Ｍの尿素及び５０ｍＭのシスティン、ｐＨ８，０を１３３ｍ１／分の流速で逆流させることにより緩衝液の交換を行った。この抽出物及び緩衝液を平衡が達せられるまで循環させた。

透析は２．０ｍＳのイオン強度で停止させた。

ＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎｎ）陰イオン交換材料を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ。

７Ｍの尿素、５０ｍＭのシスティンを用い、２．０ｍＭの伝導率に平衡化さた。

平衡にしたこの陰イオン交換材料を実施例２で得られた粗透析抽出物（タンパク質／ゲル）と混ぜ合わせた（Ｉｇ対３０ｍ１の比で）。

この粗抽出物を室温で２ｈｒ、又は４°Ｃで一夜吸着させた。吸着に次いで、未吸着タンパク質をミリポアＡ２５フイルターでの濾過により集めた。この濾液を、同種の緩衝液を用いて予備平衡にしたＦＦ−Ｑセファロース上に周囲温度で３時間再吸着させた（タンパク質／ゲルの比は１ｇ７２００ｍ１とした）。変性Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の定性及び定量は逆相クロマトグラフィーにより決定した。利用したカラムは、ＴＦＡ、アセトニトリル中のネクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　Ｃ４，５μｍ、４．６ｘ２５Ｏｍｍカラムとした。初期条件、ＴＦＡ：　Ｈ２Ｏ中で０．０８５％（緩衝Ａ）：緩衝液Ｂは０．１％のＴＦＡ、　８０％のアセトニトリル。

緩衝液ＡとＢの混合物を用い、０から５分までは３０％Ｂでイソクラチックに、５から２５分目までは３０−７５％のＢの勾配で溶離させた。

流速１．Ｏｍｌ　／分；検出：　２１５ｎｍでの吸収：周囲温度とした。変性且つ還元させたＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１を図２に示す。

実施例３に記載の通りに得られた、プールした変性且つ還元したＡｌａ　Ｇｌｕ　−ｒＧＦ　−１のバッチを７Ｍの尿素及び５０ｍＭのシスティンを用いて０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整した。このｐＨを５ＭのＮａＯＨを用いて９．５に合わせた。この溶液を、５０ｍＭのトリス−Ｃ１，２ｍＭのシスティン、ｐＨ９，５及び２５％のエタノールより成る緩衝液に対して透析した。透析は中空ファイバー透析装置（Ｎｅｐｈｒｏｓ　Ｐｒｏｓｔｏ　Ｈ。

Ｆ、オルガノン社）を用い、１００１１１１／分の流速で行った。溶液と緩衝液との間で平衡が達せられたら透析緩衝液を交換した。１５０μｓの伝導率及び２５ｍＭのレドックス電位が達せられるまでこのプロセスを続けた。はとんどのＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１が折りたたまれる第−期の後、この溶液を４°Ｃて一夜安定化させた。１６時間後、５Ｍの酢酸を用いてｐＨを４．０に調整することによって反応を停止した。透析後、そのイオン強度は０．２ｍＳであり、そして尿素の濃度は＜　０．０５Ｍであると見積られた。

変性且つ還元したＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１のアリコートの再生の例を図３に示す。ＲＴ　１４．８６分のピークはＭｒ　７８４５　ａ、ｍ、ｕ、のＡｌａ　Ｇｌｕ−ＩＧＦ−１（ＲＴ　１５．６８）のスクランブル状態である。Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１より後に現れているピークはおそらく該分子のスクランブル状態であろう。

この段階で利用するレドックス電位は、ｐＨ４，０で４６３ｍＶの一定のレドックス電位を有する５ｍＭのヒドロキノン溶液を用いて調整した。

中空ファイバーＲＰ−ＨＰＬＣに関しては図６を参照のこと。

図６において、ＲＴ　１５．９９のピークはＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１である。

ＲＴ　１５．２１のピークは、Ｍｒ　７８４５　ａ、ｍ、ｕ、を有するＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１のスクランブル状態である。

変性Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１の再生は以下の方法でも行った：１）２ｍｇ／ｍｌの変性サンプルを、５０ｍＭのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ９，０，２５％のエタノールにおいて、０．２ｍｇ／ｍｌ　（バイオラッドアッセイ）の最終濃度に希釈し、次いで４℃で１８時間反応を進行させること。

２）ＮＡＰ５カラム上で変性サンプルを、５０ｍＭのトリス、１ｍＭのシスティン、２ｍＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ９，０，２５％のエタノールにおいて脱塩すること。溶出容量は１．００ｍ１であった。タンパク質濃度は０．３ｍｇ／ｍｌ（バイオラッドアッセイ）であり、そして反応は４°Ｃで１８時間進行させた。

３）５０ｍＭのトリス、１ｍＭのシスティン、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９，０，２５％のエタノールに対して、４°Ｃで１８時間の変性サンプルの透析（Ｓｐｅｃ−ｔａｐＯｒ　３．５ｋＤカツトオ））。タンパク質の初期濃度は０．３ｍｇ／ｍｌとした。

各実験において得られる溶液２００μｍを５Ｍの酢酸３０μｍにより繊細化し、そしてこの２００μｍをミレックス０．２２μｍフィルター上で濾過し、次いでヌクレオシルＣ４，５μ、４．６　Ｘ　２５０ｍｍカラム（Ｍａｃｈｅｒｙ−ＮａＨｅｌ　７２００５９）上でＲＰ　−ＨＰＬＣ分析にかけた（Ａ緩衝液：０、０８５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　、Ｂ緩衝液＝０．１％のＴＦＡ、　８０％のアセトニトリル：０から５分まで３０％Ｂのイソクラチック、５から２５分まで３０〜７５％のＢの線状勾配を利用；流速：　１．０ｆｆｌｌ／分；検出：２１５ｎｍ　；周囲温度）。

図７〜９について。

図７において、ＲＴ　１６．０７分のピークはＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１である。

ＲＴ１５．１のピークはＭｒ　７８４５　ａ、ｍ、ｕ、を有するＡｌａ　Ｇｌｕ　−（ＧＦ　−１のスクランブル状態である。Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ｒＧＦ　−１よりすぐ後に現れるピークも同様にスクランブル状態である。

図８において、ＲＴ　１６．０７のピークはＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１である。

ＲＴ１５．１０分のピークはＭｒ　７８４５　ａｏｍ、ｕ、のスクランブル状態である。

Ａｌａ　Ｇｌｕ　−［ＧＦ　−１よりすぐ後に現れるピークはおそらく同様にスクランブル状態である。２０分以後に現れるピークはおそら＜　Ａｌａ　Ｇｌｕ −ＩＧＦ−１の不可逆性スクランブル状態又は重合状態であろう。

図９において、ＲＴ　１６．２１分のピークはＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１である。

ＲＴ　１５．４３分でのピークはＭｒ　７８４５　ａ、ｍ、ｕ、のスクランブル状態である。

Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１のすぐ後に現れるピークはおそらく同様にスクランブル状態である。

実施例８再生Ａｌａ　Ｇｌｕ　−ｒＧＦ　−１の陽イオン交換ＦＦ−５セフアロース（ファルマシアーＬＫＢ）７０１０１を、５ＭのＮａＯＨでｐＨ４，０に調整した２５［１１ＭのＮａ−リン酸塩、２５ｍＭのＮａ−クエン酸塩、２５％エタノールで平衡にした。

実施例７に記載の通りに得られた再生混合物２１ＪットルをＦＦ−５セフアロースに適用した。この懸濁物を周囲温度で３０分間ゆっくり混合し、次いでこのゲルをカラム（３，５Ｘ　２０ｃｍ”　）　Ｇこ充填した。中１用した緩衝液はＡ　：　２５ｍＭのＮａ−リン酸塩、２５ｍＭのＮａ−クエン酸塩ｐＨ４，０，２５％のエタノールＢ：２５−のＮａ−リン酸塩、２５ｍＭのＮａ−クエン酸塩ｐＨ７，０，２５％のエタノール、であり両方トも５ＭのＮａＯＨを用いて調整シタ。

流速は０．１５ｍ１／　ａｍ”　／分とし、検出は２８ｃｍｍで行し）、そして温度は４°Ｃとした。６０分かけての０〜１００％のＢの勾配を適用した。２８ｃｍｍでの吸収により決定されるＡｌａ　Ｇｌｕ−ＩＧＦ　−１を含んで成る画分実施例８で得られるＡｌａ　Ｇｌｕ　−ＩＧＦ　−１のプールを４０ｍＭのＮａ−クエン酸塩、２００−のＮａＣ１ｐＨ４，０（５ＭのＮａ０Ｈｌ二より調整）（こ対し４℃で１８時間透析した。

温度を３７°Ｃにまで上げ、そしてタンノ（り質のｍｇ当り０．０８単位のカブテシンＣ（３，４，１４，１ベ一リンガーマンノ１イム社）を加えた。

３０分後、この反応混合物をＲＰ　−）ＩＰＬＣカラムに適用した。

反応の停止及び精製のため、反応混合物を１００ｍＭのＮａ−！Ｊン酸塩緩衝液ｐＨ３，０のＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ　ＲＰ１８゜１５μｍ、　１０Ｘ１０Ｘ２５０に適用し、そして３０〜６０分か番すての３０− ５０％のエタノールの逐次勾配を用いて溶出させた。流速ｉｔ０．７５ｍ１／分、検出は２ｓｏｎｍにて、周囲温度で行った。

２８ｃｍｍでの吸収により決定されるＩＧＦを含んで成る画分をプールした。

実施例９に記載のＲＰ　−ＨＰＬＣ精製により得られるＩＧＦ−１のプールした画分をファルマシアーＬＫＢのＦＦ−５（商標）セファロースＨＲＩＯ／１０カラムに適用した。

用いた緩衝液はＡ　：　２５ｍＭのＮａ−リン酸塩、２５ｍＭのＮａ−クエン酸塩ｐＨ４，０，２５％のエタノール、Ｂ　：　２５ｍＭのＮａ−リン酸塩、２５ｍＭのＮａ−クエン酸塩ｐＨ７，０，２５％のエタノールであり、両方とも５ＭのＮａＯＨを用いて調整した。

流速は０．１５＋ｎｌ／ｃｍ”　／分とし、検出は２８ｃｍｍにて行い、温度は４゜°Ｃとした。

１００分かけての０−１００９６のＢの線状勾配を利用した。２８ｃｍｍでの吸収により決定されるＩＧＦ−１を含んで成る画分をプールした。

実施例１Ｏで得られるｒＧＦ−１のプールした画分を０．１Ｍの酢酸に対して４ °Ｃて１８時間透析しく５ｐｅｃｔｒａｐｔｏｒ　３．５ｋＤカツトオフ値）、次いで凍結乾燥した。

凍結乾燥粉末を７Ｍの尿素に溶かして５［ｌ１ｇ／ｍｌの濃度にし、次いで０．４Ｍの酢酸のセファデックスＧ５０Ｆカラム（０，９ｘ　６０ｃｍ、ファルマシアーＬＫＢ）に適用した。流速は２ｍｌ／分、検出は２８ｃｍｍ、温度は４℃とした。

２８ｃｍｍての吸収により決定されるＩＧＦ−１を含んで成る画分をプールした。

得られる溶液は、安定な凍結乾燥粉末を形成する常用の凍結乾燥試薬を用いて凍結乾燥してよい。この粉末は、　ＩＧＦ−１を含んで成る薬品製剤を製剤化するため、本質的に知られてしする方法の薬品製剤の製剤化に利用できる。

ＦＩＧ、１ＦＩＧ、１　ｃｏｎｔ。

ＦＩＧ、１　ｃｏｎｔ。

特表千６−５０００８４　（１２）量　「輝国際調査報告ＰＣＴ／ＤＫ　９１１００２３１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ｈ８２１４−４Ｂ／／ＣＣ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、　ＡＵ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＳＵＩ（７２）発明者　ダルベーイエ、ヘンリクデンマーク国、デーコー−２８３０ビルム。

リグステルベンゲト　６３

Claims

【特許請求の範囲】１．アミノ末端伸長部ＡｌａＧｌｕを有するヒトＩＧＦ−１。２．アミノ末端伸長部ＡｌａＧｌｕを有するＩＧＦ−１をコードするＤＮＡ配列。３．アミノ末端伸長部ＡｌａＧｌｕを有するヒトＩＧＦ−１をコードするＤＮＡを含んで成る組換ベクター。４．ＡｌａＧｌｕ−ＩＧＦ−１及び０ｍｐＡシグナル配列をコードするＤＮＡに直接連結している温度感受性プロモーターλＰＲを含んで成る、請求項３に記載のベクター。５．アミノ末端伸長部ＡｌａＧｌｕを有するヒトＩＧＦ−１をコードするＤＮＡを含むベクターを含んで成る、形質転換微生物。６．微生物がＥ．コリである、請求項５に記載の形質転換微生物。７．ＡｌａＧｌｕ−ＩＧＦ−１の再生のための方法であって、変性且つ還元状態にあるＡｌａＧｌｕ−ＩＧＦ−１を、２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含む緩衝液に対して、５時間まで時間をかけて、０．１〜０．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、及び０．１５〜０．３ｍＳの伝導率で、周囲温度、及び７．５〜１０．０のｐＨにて透析することによってレドックス電位を−４０ｍＶから＋２０〜＋４０ｍＶまでに変えて折りたたみ、そして最終的にこの混合物のｐＨを５以下に酸性化する方法。８．ヒトＩＧＦ−１を製造するための方法であって、ｉ）アミノ末端伸長部及び発現生成物の分泌を提供するシグナル配列を有するヒトＩＧＦ−１をコードするＤＮＡに直接連結している誘発性プロモーターを含んで成る発現ベクターにより形質転換されている微生物において、アミノ末端伸長化ＩＧＦ−１を発現させ、ｉｉ）還元剤及び任意的にキレート剤の存在下において、尿素を用いてｐＨ＞６．０でアミノ末端伸長化１ＧＦ−１を抽出し、ｉｉｉ）１．８〜２．２のｍＳ及びｐＨ７．８〜８．２に調整した段階ｉｉ）と同種の衝液を用いて、ＤＥＡＥ，ＤＥ及びＦＦ−Ｑより成る群から選ばれる陰イオン交換ゲル上でのクロマトグラフィーにこの抽出物をかけ、ｉｖ）２０〜４０％（Ｖ／Ｖ）の濃度のエタノールを含む緩衝液に対して、５時間までの時間にわたり、０．１〜０．６ｍｇ／ｍｌのタンパク費濃度、及び０．１５〜０．３ｍＳの伝導率にて、周囲温度にて、そして７．５〜１０．０のｐＨにて透析することによりこの反応混合物のレドックス電位を−４０ｍＶから＋２０〜４０ｍＶに線状に変化させて単離したアミノ末端伸長化ＩＧＦ−１を再生し、そして最終的にこの混合物をｐＨ５以下に酸性化させ、ｖ）ＤＡＰＩ（ＥＣ３．４．１４．１）を用いてこのアミノ末端伸長部を切断し、ｖｉ）ＲＰ−ＨＰＬＣ及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてアミノ末端伸長化１ＧＦ−１から再生真性ヒトＩＧＦ−１を単離し、そしてｖｉｉ）単離したヒトＩＧＦ−１をゲル濾過し、次いで凍結乾燥すること、を含んで成る方法。９．微生物がＥ．コリである、請求項８に記載の方法。１０．プロモーターがλＰＲ，λＰＬ又はλＰＲ′のような温度感受性プロモーターであり、そしてシグナル配列がＬａｍＢ，０ｍｐＡ又は０ｍｐＦである、請求項８に記載の方法。１１．プロモーターがλＰＲであり、そしてシグナル配列がｍｐＡ−配列である、請求項１０に記載の方法。１２．段階ＩＩにおけるＡｌａＧｌｕ−ＩＧＦ−１の抽出を、＞４Ｍの尿素の濃度を有する緩衝液を用いて行う、請求項８に記載の方法。１３．段階ｉｉ）におけるＡｌａＧｌｕ−ＩＧＦ−１の抽出を、７Ｍの尿素、５０ｍＭのＣｙｓ，ｐＨ８．０の緩衝液を用いて行う、請求項８に記載の方法。１４．段階ｉｉｉ）に由来する抽出物のクロマトグラフィーを、ｐＨ８．０にて２．０ｍＳの伝導率で行う、請求項８に記載の方法。１５．段階ｉｉｉ）に由来する抽出物のクロマトグラフィーを、ＤＥでのバッチ式クロマトグラフィー、ＦＦ−Ｑ（商標）での操り返しで行う、請求項８に記載の方法。１６．段階ｉｖにおけるＡｌａＧｌｕ−ＩＧＦ−１の再生を、０．２ｍＳの伝導率で行う、請求項８に記載の方法。１７．段階ｉｖ）の再生を、レドックス電位を３時間にわたり約−４０ｍＶから＋２５〜＋３０ｍＶに線状に変えて行う、請求項８に記載の方法。１８．段階ｉｖ）の再生を、０．２ｍＳの伝導率、０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度及び８．５〜９．５のｐＨ、特に８．５〜９．０のｐＨで行う、請求項８に記載の方法。１９．段階ｉｖ）の再生を、２０〜２２℃の温度で行う請求項８に記載の方法。２０．段階ｉｖの再生を、ＡｌａＧｌｕ−ＩＧＦ−１を中空ファイバー装置に、２５〜２５０ｍｌ／分の流速、好ましくは約１００ｍ１／分の流速で通過させることにより行う、請求項８に記載の方法。２１．段階ｉｖ）の酸性化を、５Ｍの酢酸を加えることにより行う、請求項８に記載の方法。２２．段階ｖ）の切断を、タンパク質のｍｇ当り０．０８単位のＤＡＰ−Ｉの濃度におけるＤＡＰ−Ｉを用いて、ＮａＣｌの存在下において、タンパク質濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調整して、４０ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ４．０の中で３７℃にて行う、請求項８に記載の方法。２３．成熟ＩＧＦ−１の製造のための、アミノ末端伸長部ＡｌａＧｌｕを有するＩＧＦ−１の利用。