DK170741B1 - Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel - Google Patents

Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel Download PDF

Info

Publication number
DK170741B1
DK170741B1 DK209188A DK209188A DK170741B1 DK 170741 B1 DK170741 B1 DK 170741B1 DK 209188 A DK209188 A DK 209188A DK 209188 A DK209188 A DK 209188A DK 170741 B1 DK170741 B1 DK 170741B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
asp
thr
protein
drug
protein according
Prior art date
Application number
DK209188A
Other languages
English (en)
Other versions
DK209188A (da
DK209188D0 (da
Inventor
Paul Habermann
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of DK209188D0 publication Critical patent/DK209188D0/da
Publication of DK209188A publication Critical patent/DK209188A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK170741B1 publication Critical patent/DK170741B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

DK 170741 B1
Den foreliggende opfindelse angår bifunktionelle proteiner, en fremgangsmåde til deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelsen deraf til fremstilling af et lægemiddel.
5 Interleukin-2, i det følgende benævnt som IL-2, virker som T-cellevækstfaktor. IL-2 forstærker aktiviteten af "dræ-ber"-celler, såsom NK (Natural Killer)-celler, cytotoksiske T-celler og LAK ("Lymphokine Activated Killer")-celler.
Granulocyt-makrofag-"Colony Stimulating"-faktor, i 10 det følgende benævnt som GM-CSF, stimulerer derimod granu-locyt- og makrofagdannelsen ud fra hæmatopoietiske forløberceller. Kombinationen af de to biologiske aktiviter er interessant for tumorbehandling med og uden indgift af cytos-tatika. IL-2 og GM-CSF har imidlertid forskellig stabilitet, 15 hvilket kan føre til problemer med den direkte indgift af de to komponenter og følgelig til et mindre godt terapeutisk resultat.
Problemet med den forskellige stabilitet kan ifølge opfindelsen løses ved, at man forbinder disse to proteiner 20 til dannelsen af et bifunktionelt protein.
Man har allerede foreslået fusionsproteiner med de almene formler
Met-X-Y-Z eller Met-Z-Y-X
25 (la) (Ib) til genteknisk fremstilling af eventuelt modificeret GM-CSF, idet X i det væsentlige er aminosyrerækkefølgen af de første ca. 100 aminosyrer af fortrinsvis menneskeligt IL-2, Y er 30 en direkte binding, såfremt den til det ønskede protein nabostillede aminosyre eller aminosyrerækkefølge muliggør en fraspaltning af det ønskede protein. Ellers muliggør et broelement af en eller flere aminosyrer, der kan kodes genetisk, fraspaltningen, og Z er en sekvens af aminosyrer, som 35 kan kodes genetisk, hvilken sekvens udgør det ønskede CM--CSF-protein. Det er ligeledes blevet foreslået at anvende 2 DK 170741 B1 den for IL-2 kodende DNA-sekvens - mere eller mindre - til ende og således danne - eventuelt modificeret - biologisk aktivt IL-2 som M biprodukt ·', men forslaget er ikke gennemført i praksis (ikke offentliggjort europæisk patentansøgning 5 med offentliggørelsesnummeret EP-A-228.018 og sydafrikansk patentskrift nr. 86/9557).
Den foreliggende opfindelse angår bifunktionelle proteiner, bestående af en biologisk aktiv interleukin-2 (IL-2) - og en granulocyt-makrofag-"Colony Stimulating"-faktor 10 (GM-CSF)-del.
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af de bifunktionelle proteiner ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man konstruerer et gen, der koder for disse proteiner, og eksprimerer det i 15 en værtscelle.
Opfindelsen angår endvidere et lægemiddel bestående af et protein ifølge opfindelsen, eventuelt i kombination med en farmakologisk egnet bærer.
Opfindelsen angår endelig også anvendelsen af et 20 protein ifølge opfindelsen til fremstilling af et lægemiddel til behandling af maligne nydannelser.
Det ifølge opfindelsen anvendte fusionsprotein består altså af to biologisk aktive komponenter, nemlig på den ene side af en IL-2-del, som kan være modificeret på i og 25 for sig kendt måde, og på den anden side en GM-CSF-del, som eventuelt kan være modificeret, og eventuelt et broelement, svarende til definitionen af Y i de ovenfor angivne formler. Fortrinsvis er de komponenter arrangeret som i formlen la. Det her omhandlede princip kan ligelede tjene til fremstil-30 ling af hidtil ukendte bifunktionelle proteiner.
På tegningen i figuren er vist konstruktionen af plasmidet pB30, som koder for et bifunktionelt protein ifølge opfindelsen.
Modifikationer af IL-2-molekylet er kendt, idet der 35 her som eksempler kun skal henvises til europapatentansøgning nr. EP-A-091.593, -109.748, -118.617, -136.489 og -163.249.
DK 170741 B1 3
Endvidere er der i den ikke offentliggjorte europapatent-ansøgning EP-A219.839 foreslået et IL-2-derivat, i hvilken N-terminal de første syv aminosyrer er fjernet.
Modifikationer af GM-CSF-molekylet er foreslået i 5 europapatentansøgning nr. EP-A-228.018.
Yderligere ændringer af de to aktive molekyldele kan foretages på i og for sig kendt måde, idet man her som eksempel kun skal nævne den specifikke mutagenese.
Broelementet Y har fordelagtigt formlen 10 -ASp-(AS)x-Pro- (II) hvori x er et helt tal op til ca. 20, og As er en vilkårlig aminosyre, der kan kodes, med undtagelse af cystein.
Fordelagtigt er IL-2-delen anbragt i den venstre 15 ende, og følgelig er GM-CSF-delen anbragt i den højre ende i formlen II.
Især foretruknes udførelsesformer af Y viser amino-syrerækken -Asp-Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Pro- eller 20 -Asp-Pr o-Met-1 le-Thr-Thr-Tyr-Leu-G lu-Glu-Leu-Thr- -Ile-Asp-Asp-Pro- hvori tillige fortrinsvis IL-2-delen er anbragt i venstre ende og GM-CSF-delen er anbragt i højre ende.
Ekspressionen af de bifunktionelle proteiner ifølge 25 opfindelsen kan ske på i og for sig kendt måde. I bakterielle ekspressionssystemer kan den direkte ekspressions-vej lykkes. Hertil egner sig alle kendte værts-vektor sy stemer med værter, såsom bakterier af arterne Streptomyces, B-subtilis, Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens, især E.
30 coli.
Den DNA-sekvens, som koder for det ønskede protein, indbygges på kendt måde i en vektor, som i det udvalgte ekspresionssystem sikrer en god ekspression.
Herved vælger man hensigtsmæssigt promotoren og ope-35 ratoren fra gruppen trp, lac, tac, PL og PR fra fagen λ, hsp, omp eller en syntetisk promotor, såsom de eksempelvis 4 DK 170741 B1 er beskrevet i tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.430.683 eller i europapatentansøgning nr. EP-A-173.149. Fordelagtig er tac-promotor-operator-sekvensen, som i mellemtiden er tilgængelig i handelen (eksempelvis ekspressionsvektor 5 pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and
Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).
Ved ekspressionen af det her omhandlede protein kan det vise sig at være hensigtsmæssigt at ændre enkelte tripletter af de første aminosyrer efter ATG-start-kodon for 10 at hindre en eventuelt basepardannelse på mRNA-planet. Sådanne ændringer som fjernelser eller additioner af enkelte aminosyrer er velkendte for fagfolk og ligeledes omfattet af opfindelsen.
Til ekspressionen i gær - fortrinsvis S. cerevisiae-15 anvender man hensigtsmæssigt et sekretionssystem, eksempelvis den heterologe ekspression via α-faktor-systemet, som er beskrevet flere gange.
Til ekspressionen af det bifunktionelle molekyle i gær er det fordelagtigt, når dibasiske peptidsekvenser samt 20 glycosyleringssteder i det bifunktionelle protein ødelægges ved tilsvarende ombytning af enkelte aminosyrer. Herved fås mange kombinationsmuligheder, som ligeledes kan påvirke den biologiske virkning.
Ekspressionen af IL-2 i gær er kendt fra europapa-25 tentansøgning nr. EP-A-142.268, af GM-CSF fra europapatent-ansøgning nr. EP-A-188-350.
Indgiften af de her omhandlede bifunktionelle proteiner svarer til indgiften af de to komponenter. På grund af den større stabilitet er det dog i mange tilfælde muligt 3 0 med en mindre dosering, som holder sig i det nedre område af de hidtil foreslåede doseringer.
I de følgende eksempler belyses opfindelsen nærmere. Procentangivelser og forhold er beregnet på vægten, såfrem intet andet er angivet.
35 DK 170741 B1 5
Eksempel 1
Plasmidet pl59/6 (europapatentansøgning nr. EP-A-163.249, fig. 5, (1) på tegningen, i den foreliggende figur) indeholder mellem et EcoRI- og et Sall-spaltested et syn-5 tetisk, for 11-2 kodende gen. DNA-sekvensen for dette gen er gengivet i det nævnte EP-A2 som "DNA-sekvens I". I triplet 127- og 128-området befinder der sig et Taql-spaltested. Fra dette plasmid udskæres ved spaltning med EcoRI og Taql IL-2-delsekvensen (2), og den isoleres.
10 Plasmidet pHG23 (3) , som koden for GM-CSF, er kendt fra europatentansøgning nr. EP-A2-183.350. GM-CSF-cDNA er gengivet i fig. 2 i denne EP-A2. Plasmidet pHG23 fås ved, at man indbygger cDNA-sekvensen i PstI-spaltestedet i pBR322, idet der på den ene side bliver gjort brug af Pstl-spalte-15 stedet ved 5'-enden og på den anden side af et ved hjælp af GC-"tailing" indført Pstl-sted ved 3'-enden. Fra dette plasmid isoleres ved spaltning med SfaNI og PstI DNA-sekvensen (4), som indeholder den største del af GM-CSF-genet.
Ved phosphitroetoden syntetiseres det følgende oligo-20 nukleotid (5): 128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile
CG AT C ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATG
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG
25 (Taql) (5) 1 2
Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
ACC ACC TAT GCG GAC GAT CCG GC
TGG TGG ATA CGC CTG CTA GGC CGT GGG
30 (SfaNI)
Oligonukleotidet (5) fuldstændiggør ved 5'-enden DNA-sekvensen af IL-2, idet der dog i 133-stillingen i stedet for Thr står Asp. Ved 3'-enden af dette oligonukleotid be-35 finder de nukleotider sig, som ved spaltning med SfaNI er faldet bort fra cDNA.
6 DK 170741 B1
Fremstilling af ekspressionsplasmidet pEWlOOO (6) er foreslået i den (ikke offentliggjorte) europapatentansøgning nr. EP-A-227.938 (fig. l). Dette plasmid er et derivat af plasmidet ptac 11 (Amann et al., Gene 25 (1983) 167-178), i 5 hvilket der i genkendelsesstedet fra EcoRI er indbygget en syntetiske sekvens, som indeholder et Sall-spaltested. Man får således ekspressionsplasmidet pKK 177.3. Ved indsættelse af lac-repressoren (Farabaugh, Nature 274 (1978) 765-769) får man plasmidet pJF118. Dette åbnes ved det singulære 10 restriktionsspaltested for Aval, og på kendt måde forkortes det ved exonuklease-behandling med ca. 1000 bp og ligeres. Man får plasmidet pEWlOO (6). Ved åbning af dette plasmid i polylinkeren med enzymerne EcoRI og PstI får man det linea-riserede ekspressionspladmid (7).
15 Dette lineariserede plasmid-SNA (7) ligeres derpå med DNA-fragmentet (2), som koder for IL-2-sekvensen, med det syntetiske oligonukleotid (5) og med cDNA-fragmentet (4). Der dannes plasmidet pB30 (8), som transformeres i E. coli-stammen Mcl061. Plasmid-DNA fra enkelte kloner isoleres 20 og karakteriseres ved hjælp af restriktionsanalyse.
Eksempel 2
Anvender man i eksempel 2 i stedet for oligonukleo-tidet (5) det følgende syntetiske oligonukleotid 25 128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr
CG ATC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATC ACC ACC TAT
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG TGG TGG ATA
30 (Taql) 1 2
Leu Glu Glu Leu Thr Ile Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
CTA GAA GAG CTC ACG ATC GAC GAT CCG GC
GAT CTT CTC GAG TGC TAG CTG CTA GGC GCT GGG 35 (SfaNI), DK 170741 B1 7 får man således plasmidet pB31.
Kfcggmpel 3
Kompetente celler fra E. coli-stammen W3110 trans-5 formeres med plasmidet pB30 eller pB31. En kultur af stammen, der har stået natten over, fortyndes med LB-medium (J.H. Miller, Experiments in Molec. Gen., Cold Spring Harbor Lab. , 1972), som indeholder 50 μg ampicillin pr. ml, i et forhold på ca. 1:100, og væksten følges via OD-måling. Ved OD = 0,5 10 indstilles kulturen til en koncentration på 2mM isopropyl--/3-D-thiogalactopyranosid (IPTG) , og bakterierne centrifugeres fra efter 150-180 minutters forløb. Bakterierne behandles i ca. 5 minutter i en pufferblanding (7M urinstof, 0,1% SDS, 0,1M natriumphosphat, pH-værdi =7,0), og prøver 15 påføres på en SDS-gelelektroforeseplade. Ekspressionen af det bifunktionelle protein bekræftes således.
De angivne betingelser gælder for rystekulturer. Ved større fermentationer er tilsvarende ændrede OD-værdier, næringssubstrater og varierede IPTG-koncentrationer hen-20 sigtsmæssige.
Eksempel 4
Efter induktion centrifugeres E. coli W3ll0-celler, som indeholder plasmidet pB30 eller pB31, fra, suspenderes 25 igen i natriumphosphatpuffer (pH-værdi = 7) og centrifugeres atter fra. Bakterierne tages op i den samme puffer og åbnes derpå (French Press, ^Dyno-Mvihle) . Celleåbningsmaterialet centrifugeres fra. Den ovenstående væske og det sedimenterede materiale analyseres ved hjælp af SDS-polyacrylamidelektro-30 forese som beskrevet i eksempel 3. Efter farvning af proteinbåndene viser det sig, at man finder det bifunktionelle protein i sedimentet fra det åbnede materiale. Sedimentet vaskes flere gange med chaotrope puffer-opløsninger og til sidst med vand, hvorved det ønskede protein koncentreres 35 yderligere. I den vandige proteinsuspension bestemmes proteinkoncentrationen derpå. Suspensionen indstilles derefter 8 DK 170741 B1 til en koncentration på 5M guanidiniumhydrochlorid og 2 mM dithiothreitol (DTT). Blandingen omrøres i ca. 30 minutter under nitrogen og fortyndes derpå med 50 nM tris-puffer (pH-værdi = 8,5) således, at man får en proteinkoncentration 5 på 100 jug/ml. Derefter dialyseres der mod denne tris-puffer og efter to ganges pufferudskiftning mod vand. Det således behandlede protein filtreres sterilt og efterprøves med hensyn til sin biologiske aktivitet. Det viser både i den interleukin-2-afhængige CTLL 2-celleproliferationstest og i 10 den humane knoglemarvstest fuld biologisk virkning. Man iagttager derved blandede kolonier af granulocyter og makrofager .
Det bifunktionelle protein kan yderligere renses via interleukin-2-specifik affinitetschromatografi. Proteinet 15 er også derefter aktivt ved begge prøver. Et E. coli-ekstrakt af den utransformerede stamme W3110, der behandles som beskrevet, viser derimod ikke nogen aktivitet.
Til den tekniske fremstilling af produktet er andre betingelser hensigtsmæssige, eksempelvis til foldning af 20 proteinet og rensningen deraf. Som - i og for sig kendte-fremgangsmåder til rensning kommer ionbytning, adsorption, gelfiltrering og præparativ HPLC-chromatografi i betragtning.
25

Claims (9)

1. Bifunktionelle proteiner, bestående af en biologisk aktiv interleukin-2 (IL-2)- og en granulocyt-makrofag-"Colony
5 Stimulating"-faktor (GM-CSF)-del.
2. Bifunktionelle proteiner med en biologisk aktiv IL-2- og GM-CSF-del, kendetegnet ved, at de to biologisk aktive proteindele er forbundet via en bro af fra 10 ca. 1 til ca. 20 aminosyrer, der kan kodes genetisk.
3. Protein ifølge krav 2, kendetegnet ved, at broen har formlen
15 -Asp-(As)x-Pro- (II) idet x er et helt tal fra 1 til 18, og As er en aminosyre, der kan kodes genetisk, med undtagelse af Cys.
4. Protein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at broelementet (As)x er aminosyrefølgen -Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp- eller
25 -Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Leu-Glu-Glu-Leu-Thr-Ile-Asp-Asp- . 1 2 Protein ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at IL-2-delen er anbragt N-terminalt og GM-CSF-delen er anbragt C-terminalt. 30 2 Fremgangsmåde til fremstilling af bifunktionelle proteiner ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man konstruerer et gen, der koder for disse proteiner, og eksprimerer det i en værtscelle. 35 DK 170741 B1
7. Lægemiddel, bestående af et protein ifølge krav 1-5, eventuelt i kombination med en farmakologisk egnet bærer.
8. Anvendelse af et protein ifølge krav 1-5 til frem stilling af et lægemiddel til behandling af maligne nydannelser .
DK209188A 1987-04-16 1988-04-15 Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel DK170741B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873712985 DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1987-04-16 Bifunktionelle proteine
DE3712985 1987-04-16

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK209188D0 DK209188D0 (da) 1988-04-15
DK209188A DK209188A (da) 1988-10-17
DK170741B1 true DK170741B1 (da) 1996-01-08

Family

ID=6325799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK209188A DK170741B1 (da) 1987-04-16 1988-04-15 Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0288809B1 (da)
JP (1) JP2667193B2 (da)
KR (1) KR970000187B1 (da)
AR (1) AR242991A1 (da)
AT (1) ATE79135T1 (da)
AU (1) AU613022B2 (da)
CA (1) CA1322157C (da)
DE (2) DE3712985A1 (da)
DK (1) DK170741B1 (da)
ES (1) ES2033981T3 (da)
FI (1) FI98830C (da)
GR (1) GR3006141T3 (da)
HU (1) HU204303B (da)
IE (1) IE61574B1 (da)
IL (1) IL86086A (da)
NO (1) NO176922C (da)
NZ (1) NZ224247A (da)
PH (1) PH25327A (da)
PT (1) PT87237B (da)
ZA (1) ZA882659B (da)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5662896A (en) * 1988-03-21 1997-09-02 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US5108910A (en) * 1989-08-22 1992-04-28 Immunex Corporation DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5073627A (en) * 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
ATE103932T1 (de) * 1989-08-22 1994-04-15 Immunex Corp Fusionsprotein bestehend aus gm-csf und il-3.
US5376367A (en) * 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
WO1999029732A2 (en) 1997-12-08 1999-06-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
AU1551801A (en) * 1999-11-30 2001-06-12 Shionogi & Co., Ltd. Chemokine slc-il2 fused protein and gene thereof
EP1252192B1 (en) 2000-02-11 2006-08-16 MERCK PATENT GmbH Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
EP2292271A3 (en) 2001-10-10 2011-09-14 BioGeneriX AG Remodelling and glycoconjugation of an antibody
PT1454138E (pt) 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
CA2510180C (en) 2002-12-17 2012-09-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
ES2359473T3 (es) * 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
DE602004031341D1 (de) 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
WO2010001414A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Lupin Limited Expression of heterologous proteins in bacterial system using a gm-csf fusion tag

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
GB8327880D0 (en) * 1983-10-18 1983-11-16 Ajinomoto Kk Saccharomyces cerevisiae
EP0158198A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
WO1985004673A1 (en) * 1984-04-10 1985-10-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel dna and its use
DE3419995A1 (de) * 1984-05-29 1985-12-05 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
AU588819B2 (en) * 1984-10-29 1989-09-28 Immunex Corporation Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene
JPS61128889A (ja) * 1984-11-27 1986-06-16 Green Cross Corp:The 組換えｄｎａ及び該ｄｎａによる形質転換体
JPH0646957B2 (ja) * 1985-03-11 1994-06-22 武田薬品工業株式会社 インタ−ロイキン−２の製造方法
JPS63502795A (ja) * 1985-10-03 1988-10-20 バイオジェン インコーポレイテッド 顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子‐様ポリペプチド、ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子−様ポリペプチドを高収量で生産する方法
DE3541856A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
DE3545568A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-16 Hoechst Ag Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
FI98830B (fi) 1997-05-15
EP0288809A1 (de) 1988-11-02
ZA882659B (en) 1988-10-14
PT87237B (pt) 1992-07-31
KR970000187B1 (ko) 1997-01-06
EP0288809B1 (de) 1992-08-05
DE3873397D1 (de) 1992-09-10
DE3712985A1 (de) 1988-11-03
NO176922B (no) 1995-03-13
FI881743A (fi) 1988-10-17
FI881743A0 (fi) 1988-04-14
GR3006141T3 (da) 1993-06-21
HUT47319A (en) 1989-02-28
JP2667193B2 (ja) 1997-10-27
NO881658D0 (no) 1988-04-15
CA1322157C (en) 1993-09-14
AU1466188A (en) 1988-10-20
IE61574B1 (en) 1994-11-16
AR242991A1 (es) 1993-06-30
DK209188A (da) 1988-10-17
NO881658L (no) 1988-10-17
PT87237A (pt) 1988-05-01
NZ224247A (en) 1990-04-26
DK209188D0 (da) 1988-04-15
NO176922C (no) 1995-06-21
HU204303B (en) 1991-12-30
ES2033981T3 (es) 1993-04-01
KR880012760A (ko) 1988-11-29
IL86086A (en) 1995-01-24
FI98830C (fi) 1997-08-25
IE881146L (en) 1988-10-16
PH25327A (en) 1991-04-30
AU613022B2 (en) 1991-07-25
IL86086A0 (en) 1988-09-30
JPS63301898A (ja) 1988-12-08
ATE79135T1 (de) 1992-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK170741B1 (da) Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel
US5359035A (en) Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
SU1604164A3 (ru) Способ получени гибридного интерферона типа @ 1/ @ 2
ES2067486T5 (es) Proteina inhibidora de factor de necrosis tumoral (tnf) y su purificacion.
HUT64582A (en) Method for producing recombinant human interleukin-1 inhibitor
JPS63251095A (ja) 新規融合蛋白質およびその精製方法
US5180811A (en) Proteins having a tnf action comprising tnf-fibromectin fusion protein
Goth et al. Aspartic acid 50 and tyrosine 108 are essential for receptor binding and cytotoxic activity of tumour necrosis factor beta (lymphotoxin)
KR100356140B1 (ko) 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법
AU622125B2 (en) Neutrophil-activating factor
WO1993003152A1 (en) Igf-ii analogues
AU617999B2 (en) A genetic engineering process for the preparation of angiogenins
EP0437544A1 (en) Recombinant pdgf and methods for production
GB2188933A (en) Expression vectors for production of polypeptides, method for enhanced expression of polypeptides, hosts containing the expression vectors, products manufactured thereby
Nishizawa et al. Biologically active human and mouse nerve growth factors secreted by the yeast Saccharomyces cerevisiae
JP2602628B2 (ja) Ｓｍｃ様ポリペプチド及びその産生方法
RU2708556C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида
EP0431042A4 (en) A method of preparing an active human neutrophil chemotactic factor polypeptide
JPS63226297A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPH0330693A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
Mertvetsov Chemo-enzymatic synthesis of the human angiogenin gene. Construction of bacterial strains, producers of human angiogenin. Elaboration of a technology for the purification and preparation of angiogenin
JPH0361495A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPS63188396A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPS63160598A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPS63164898A (ja) 新規生理活性ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PBP Patent lapsed

Country of ref document: DK