NO176922B - Fremgangsmåte for fremstilling av bifunksjonelle proteiner - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av bifunksjonelle proteiner Download PDFInfo
- Publication number
- NO176922B NO176922B NO881658A NO881658A NO176922B NO 176922 B NO176922 B NO 176922B NO 881658 A NO881658 A NO 881658A NO 881658 A NO881658 A NO 881658A NO 176922 B NO176922 B NO 176922B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- csf
- protein
- bridge
- plasmid
- dna sequence
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 28
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 24
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 24
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av "bifunksjonelle proteiner.
Nærmere bestemt angår oppfinnelsen fremstilling av slike proteiner som består av en aktiv interleukin-2- og granulo-cytt-makrofag-koloni-stimulerende-faktor (GM-CSF )-del, idet de to biologisk aktive proteindeler er knyttet sammen over en bro av 1 til ca. 20 genetisk kodbare aminosyrer.
Interleukin-2, i det følgende betegnet IL-2, virker som T-cellevekstfaktor. IL-2 forsterker aktiviteten av "Killer"-celler som NK (Natural Killer)-celler, cytotoksiske T-celler og LAK (Lymphokine Activated Killer )-celler.
Granulocytt-makrofag-"Colony Stimulating"-faktor, i det følg-ende betegnet GM-CSF, derimot stimulerer granulycyt- og .makrofagdannelsen fra hematopoitiske forløperceller. Kombina-sjonen av de to biologiske aktiviteter er interessant for tumorbehandling med og uten cytostatika-inngivning. IL-2 og GM-CSF er imidlertid forskjellig stabile, som som kan føre til problemer ved den direkte administrering av de to komponenter og således til en nedsettelse av det terapeutiske resultat.
Problemet av den forskjellige stabilitet kan ifølge oppfinnelsen løses ved at man knytter sammen disse to proteiner til et bifunksjonelt protein.
Det er allerede foreslått fusjonsproteiner med den generelle formel Ia eller Ib
til genteknisk fremstilling av eventuelt modifisert GM-CSF, hvori X betyr i det vesentlige aminosyrerekken av de første ca. 100 aminosyrer og fortrinnsvis menneskelig IL-2, Y betyr
en direkte binding, hvis den til det ønskede protein nabo-plasserte aminosyre eller aminosyrerekke muliggjør en avspalting av det ønskede protein, eller ellers et broledd av en eller flere genetiske kodbare aminosyrer som muliggjør avspaltingen og Z er en sekvens av genetisk kodbare aminosyrer, som er det ønskede GM-CSF protein. Man kan herved også i større eller mindre grad utnytte den for IL-2 kodende DNA-sekvens til det siste og derved frembringe biologisk aktivt, eventuelt modifisert, IL-2 som "biprodukt" (EP-A 0 228 018 resp. SA-86/9557).
Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å forbedre den kjente teknikk og angår derved en fremgangsmåte av den innlednings-vis nevnte art og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man legerer en DNA-sekvens som koder for IL-2, en DNA-sekvens som koder for GM-CSF og en DNA-sekvens som koder for broen, i en eksprimeringsvektor, transformerer en vertscelle med dette og eksperimerer og isolerer det tilsvarende bifunksjonelle protein.
De ifølge oppfinnelsen fremtilte fusjonsproteiner består altså av to biologisk aktive komponenter, nemlig på den ene side av en IL-2 del som på i og for seg kjent måte kan være modifisert, på den annen side, av en GM-CSF-del som likeledes kan være modifisert og eventuelt et broledd tilsvarende definisjonen Y i de ovenfor angitte formler. Fortrinnsvis tilsvarer anordningen av de to komponenter formel (Ia). Prinsippet ifølge oppfinnelsen kan imidlertid også tjene til fremstilling av andre nye bifunksjonelle proteiner.
Figuren viser konstruksjonen av plasmidet pB30, som koder for et ifølge oppfinnelsen fremstilt bifunksjonelt protein.
Modifikasjoner av IL-2-molekylet er kjent, men det skal her bare henvises til EP-A 0 091 539, 0109 748, 0 118 617, 0 136 489 og 0 163 249.
Videre ble det i den ikke tidligere publiserte EP-A 0 219 839 foreslått et IL-2 derivat hvor N-terminal de første syv aminosyrer er deletert.
Modifikasjoner av GM-CSF-molekylet ble foreslått i EP-A 0 228 018.
Ytterligere modifikasjoner av de to aktive molekyldeler kan foretas på i og for seg kjent måte, idet det her som eksempel bare skal nevnes den spesifike mutagenese.
Broleddet Y har fordelaktig formel II,
hvori x betyr et helt tall inntil 20, og AS betyr en ønskelig genetisk kodbar aminosyre med unntak av cystein.
Fortrinnsvis er i formel (II) IL-2-delen anordnet ved den venstre ende og følgelig GM-CSF-delen ved den høyre ende.
Spesielt foretrukne utformninger av Y har aminosyrerekken -Asp-Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Pro- eller -Asp-Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Leu-Glu-Glu-Leu-Thr-Ile-Asp-Asp-Pro-
idet likeledes fortrinnsvis IL-2 delen er anordnet ved den venstre ende, og GM-CSF-delen ved den høyre ende.
Eksprimeringen av de bifunksjonelle proteiner som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan foregå på i og for seg kjent måte. I bakterielle eksprimeringssystemer kan man gå via direkte eksprimering. Hertil egner seg alle kjente verts-vektor-systemer med bakterier av typen Streptomyces, B.subtilis, Salmonella tuphymurium eller Serratia marcenscens, spesielt E.coli som verter.
DNA-sekvensen som koder for det ønskede protein innbygges på i og for seg kjent måte i en vektor som i det valgte eksprimeringssystem sikrer en god eksprimering.
Herved velger man hensiktsmessig promoteren og operatoren fra gruppen trp. lac, tac, Pl eller Pg av fagen \, hsp, omp eller en syntetisk promoter, slik de for eksempel er omtalt i DE-OS 34 30 683 resp. EP-A 0 173 149. Fordelaktig er tac-promoter-operator-sekvensen som i mellomtiden er handelsvanlig (f.eks. eksprimeringsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologi-cals, Chemicals and Equipment for molecular Biology", 1984, s. 63).
Ved eksprimeringen av proteinet ifølge oppfinnelsen kan det vise seg hensiktsmessig å endre enkelte tripletts av de første aminosyrer etter ATG-start-kodonet for å hindre en eventuell baseparing på nivå med av mRNA. Slike endringer som delesjoner eller addisjoner av enkelte aminosyrer er vanlige for fagfolk, og omfattes likeledes av oppfinnelsen.
For eksprimering i gjær - fortrinnsvis S.cerevisiae-anvender man hensiktsmessig et sekresjonssystem - eksempelvis den heterologe eksprimering via a-faktorsystemet som er beskrevet flere ganger.
For eksprimeringen av det bifunksjonelle molekylet i gjær er det fordelaktig når i det bifunksjonelle protein de basiske peptidsekvenser samt glykosyleringssteder ødelegges ved tilsvarende utveksling av enkelte aminosyrer. Herved fremkommer mange kombinasjonsmuligheter som også kan påvirke den biologiske virkning.
Eksprimeringen av IL-2 i gjær er kjent fra EP-A 0 142 568, av GM-CSF fra EP-A 0 188 350.
Administreringen av de bifunksjonelle proteiner som fremstilles ifølge oppfinnelsen tilsvarer denne av de to komponenter. På grunn av den større stabilitet, er det imidlertid i mange tilfeller mulig med en mindre dosering som holder seg i det nedre området av de hittil foreslåtte doseringer.
Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eks-empler. Prosentangivelser og forhold er beregnetpå vekt hvis intet annet er anført.
Eksempel 1.
Plasmidet pl59/6 (EP-A2 0 163 249, fig. 5; (1) i foreliggende figur inneholder, mellom et EcoRI- og et Sall-snittsete, et syntetisk, for IL-2 kodende gen. DNA-sekvensen for dette gen er i nevnte EP-A2 gjengitt som "DNA-sekvens I". I området av triplettene 127 og 128, befinner det seg et Taql-snittsete. Fra dette plasmid skjærer man ut IL-2 delsekvensen (2) ved hjelp av EcoRI og Taql og isolerer den.
Fra EP-A2 0 183 350 kjenner man plasmidet pEG23 (3), som koderer for GM-CSF. GM-CSF-cDNA er gjengitt på fig. 2 i dette EP-A2. Plasmidet pHG23 fåes når man bygger inn cDNA-sekvensen i Pstl-snittsetet av pBR322, idet man på den ene side gjør bruk av Pstl-snittsetet ved 5'-enden, og på den annen side et ved GC-"tailing" innført Pstl-sete ved 3'-enden. Fra dette plasmid isolerer man ved kutting med SfaNI og Pstl DNA-sekvensen (4) som inneholder den største del av CM-CSF-genet.
Etter fosfitt-metoden syntetiseres følgende oligonukleotid (5):
Oligonukleotidet (5) supplerer DNA-sekvensen av IL-2 ved 5'-enden, hvorved dog Asp. står istedet for Thr i posisjon 133. Ved 3'-enden av dette oligonukleotid finnes nukleotidene som er falt bort ved kutting med SfaNI fra cDNA.
Fremstillingen av eksprimeringsplasmidet pEWlOOO (6) er foreslått i (det ikke tidligere publiserte) EP-A 0 227 938 (fig. 1). Dette plasmid er et derivat av plasmidet ptac 11 (Amann et al., "Gene" 25 (1983) 167-178), hvor det i gjen-kjennelsesetet for EcoRI ble bygget inn en syntetisk sekvens som inneholder et SalI-snittsted. Man får således eksprimeringsplasmidet pKK 177.3. Ved inskyting av lac-repressoren (Farabaugh, "Nature" 274 (1978) 765 - 769) får man plasmidet pJF 118. Dette åpnes ved det singulære restriksjonssnittsete for Aval og forkortes på kjent måte med eksonukleasebehandl-ing rundt ca. 100o bp og ligeres. Man får plasmidet pEWlOOO (6) . Ved åpning av dette plasmid i polylinker med enzymene EcoRI og Pstl får man det lineariserte eksprimeringsplasmid (7) .
Dette lineariserte plasmid-DNA (7) ligeres nu med DNA-fragmentet (2) som koder for IL-2 sekvensen, med syntetiske oligonukleotid (5) og med cDNA-fragmentet (4). Man oppnår plasmidet pB30 (8), som transformeres i E.coli-stammen Mcl061. Plasmid-DNA av enkelte kloner isoleres og karakteriseres ved restriksjonsanalyse.
Eksempel 2.
Anvender man i eksempel 1 istedet for oligonukleotidet (5) følgende syntetiske oligonukleotid
så får man plasmidet pB31.
Eksempel 3.
Kompetente celler av E.coli-stammen W3110 transformeres med plasmidet pB30 eller pB31. En overnattskultur av stammen fortynnes med LB-medium (J.H.Miller, "Esperiments in Molec-Gen.", Cold Spring Harbor Lab., 1972), som inneholder 50 pg/ml ampicillin i forhold på ca. 1:100, og veksten følges ved OD-måling. Ved OD = 0,5 innstilles kulturen på en konsentrasjon av 2mM isopropyl-p<->D-tiogalaktopyranosid (IPTG) og bakteriene sentrifugeres av etter 150-180 minutter. Bakteriene behandles ca. 5 minutter i en bufferblanding (7M, urinstoff, 0, 1% SDS, 0, IM natriumfosfat, pH 7 , 0 ), og prøver bringes på en SDS-gelelektroforeseplate. Eksprimeringen av det bifunksjonelle protein bekreftes dermed.
De angitte betingelser gjelder for ristekulturer ved større fermenteringer, der det hensiktsmessig tilsvarende endrede OD-verdiern, næringsmedium og varierte IPTG-konsentrasjoner.
Eksempel 4.
Etter induksjon frafiltreres E.coli W3110-celler som inneholder plasmidet pB30 eller pB31, disse resuspenderes i natrium-fosfatpuffer pH (7), og sentrifugeres fra igjen. Bakteriene opptas i den samme buffer, og oppsluttes deretter (French Press, "Dyno-Miihle"). Celleoppslutningen sentrifugeres fra og supernatant og sediment analyseres ved hjelp av SDS-poly-akrylamid-elektroforese som beskrevet i eksempel 3. Etter farging av proteinbåndet viser det seg at det bifunksjonelle protein finnes i sedimentet av oppslutningen. Sedimentet vaskes flere ganger med chaotrope buffere og til slutt med vann, idet det ønskede protein anrikes videre. I den vandige proteinsuspensjon bestemmes deretter proteinkonsentrasjonen. Suspensjonen innstilles nu på en konsentrasjon på 5M guanidi-niumhydroklorid og 2 mM ditiotreitol (DTT). Blandingen omrøres ca. 30 minutter under nitrogen, og fortynnes deretter med 50 mM tris-buffer (pH 8,5) slik at proteinkonsentrasjonen gir 100 jjg/ml. Man dialyserer så mot denne tris-buffer, og etter to gangers bufferveksel dialyserer man mot vann. Det således behandlede protein sterilfiltreres og undersøkes for sin biologiske aktivitet. Det viser full biologisk virkning såvel i den interleukin-2-avhengige CTLL-2-celleproliferas-jonsprøve som også i human benmargsprøve. Blandede kolonier av granulocytter og makrofater iakttas derved.
Det bifunksjonelle protein kan renses videre over interleukin-2-spesifikk affinitetskromatografi. Proteinet er også da aktivt i begge prøver. Et E.coli-ekstrakt av den ikke-transformerte stamme W3110 som ble behandlet som omtalt, viser derimot ingen aktivitet.
For den tekniske fremstilling av produktet er det hensiktsmessig med andre betingelser, for eksempel for holding av protein og dets rensing. Som i og for seg kjente rensemetoder kan man benytte ionebytting og adsorbsjon, gelfiltrering og preparativ HPLC-kromatografi.
Claims (4)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av bifunksjonelle proteiner bestående av en aktiv interleukin-2- og granulocytt-makrofag-koloni-stimulerende-faktor (GM-CSF)-del, idet de to biologisk aktive proteindeler er knyttet sammen over en bro av 1 til ca. 20 genetisk kodbare aminosyrer, karakterisert ved at man legerer en DNA-sekvens som koder for IL-2, en DNA-sekvens som koder for GM-CSF og en DNA-sekvens som koder for broen, i en eksprimeringsvektor, transformerer en vertscelle med dette og eksperimerer og isolerer det tilsvarende bifunksjonelle protein.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at broen har formelen
der x betyr et helt tall fra 1-18, og As betyr en genetisk kodbar aminosyre med unntak av Cys.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at broleddet (As)x står for aminosyrerekken
eller
4 .
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 4, karakterisert ved at IL-2-delen er anordnet N-terminalt og GM-CSF-delen er anordnet C-terminalt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873712985 DE3712985A1 (de) | 1987-04-16 | 1987-04-16 | Bifunktionelle proteine |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO881658D0 NO881658D0 (no) | 1988-04-15 |
| NO881658L NO881658L (no) | 1988-10-17 |
| NO176922B true NO176922B (no) | 1995-03-13 |
| NO176922C NO176922C (no) | 1995-06-21 |
Family
ID=6325799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO881658A NO176922C (no) | 1987-04-16 | 1988-04-15 | Fremgangsmåte for fremstilling av bifunksjonelle proteiner |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0288809B1 (no) |
| JP (1) | JP2667193B2 (no) |
| KR (1) | KR970000187B1 (no) |
| AR (1) | AR242991A1 (no) |
| AT (1) | ATE79135T1 (no) |
| AU (1) | AU613022B2 (no) |
| CA (1) | CA1322157C (no) |
| DE (2) | DE3712985A1 (no) |
| DK (1) | DK170741B1 (no) |
| ES (1) | ES2033981T3 (no) |
| FI (1) | FI98830C (no) |
| GR (1) | GR3006141T3 (no) |
| HU (1) | HU204303B (no) |
| IE (1) | IE61574B1 (no) |
| IL (1) | IL86086A (no) |
| NO (1) | NO176922C (no) |
| NZ (1) | NZ224247A (no) |
| PH (1) | PH25327A (no) |
| PT (1) | PT87237B (no) |
| ZA (1) | ZA882659B (no) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5662896A (en) * | 1988-03-21 | 1997-09-02 | Chiron Viagene, Inc. | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US6406697B1 (en) | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5073627A (en) * | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| ATE103932T1 (de) * | 1989-08-22 | 1994-04-15 | Immunex Corp | Fusionsprotein bestehend aus gm-csf und il-3. |
| US5108910A (en) * | 1989-08-22 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| US5376367A (en) * | 1991-11-22 | 1994-12-27 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising MGF and IL-3 |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| EP1037927B1 (en) | 1997-12-08 | 2004-05-19 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| DK1200479T3 (da) | 1999-08-09 | 2006-05-15 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Multiple cytokin-antistof-komplekser |
| WO2001040311A1 (fr) * | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Proteine fusionnee de chimiokine slc-il2 |
| CA2399832C (en) | 2000-02-11 | 2011-09-20 | Stephen D. Gillies | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| AU2002248571B2 (en) | 2001-03-07 | 2007-01-18 | Merck Patent Gmbh | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| BR0209177A (pt) | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
| EP2279755B1 (en) | 2001-10-10 | 2014-02-26 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of Fibroblast Growth Factor (FGF) |
| EP2354791A1 (en) | 2001-12-04 | 2011-08-10 | Merck Patent GmbH | Immunocytokines with modulated selectivity |
| BRPI0317376B8 (pt) | 2002-12-17 | 2021-05-25 | Merck Patent Gmbh | proteína de fusão de anticorpo-il2 designada como hu14.18-il2, usos da mesma, vetor e composição farmacêutica |
| AU2004263274B2 (en) * | 2003-07-21 | 2009-11-05 | Transgene S.A. | Novel multifunctional cytokines |
| DE602004031341D1 (de) | 2003-07-21 | 2011-03-24 | Transgene Sa | Multifunktionelle cytokine |
| WO2010001414A1 (en) * | 2008-07-03 | 2010-01-07 | Lupin Limited | Expression of heterologous proteins in bacterial system using a gm-csf fusion tag |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| WO1985004673A1 (en) * | 1984-04-10 | 1985-10-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and its use |
| DE3419995A1 (de) * | 1984-05-29 | 1985-12-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| AU588819B2 (en) * | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| JPS61128889A (ja) * | 1984-11-27 | 1986-06-16 | Green Cross Corp:The | 組換えｄｎａ及び該ｄｎａによる形質転換体 |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| JPS63502795A (ja) * | 1985-10-03 | 1988-10-20 | バイオジェン インコーポレイテッド | 顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子‐様ポリペプチド、ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子−様ポリペプチドを高収量で生産する方法 |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
-
1987
- 1987-04-16 DE DE19873712985 patent/DE3712985A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-09 ES ES198888105693T patent/ES2033981T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-09 DE DE8888105693T patent/DE3873397D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-09 EP EP88105693A patent/EP0288809B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-09 AT AT88105693T patent/ATE79135T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-14 FI FI881743A patent/FI98830C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-04-14 NZ NZ224247A patent/NZ224247A/en unknown
- 1988-04-14 PT PT87237A patent/PT87237B/pt active IP Right Grant
- 1988-04-15 CA CA000564322A patent/CA1322157C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-15 DK DK209188A patent/DK170741B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 AU AU14661/88A patent/AU613022B2/en not_active Ceased
- 1988-04-15 ZA ZA882659A patent/ZA882659B/xx unknown
- 1988-04-15 AR AR88310585A patent/AR242991A1/es active
- 1988-04-15 NO NO881658A patent/NO176922C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 HU HU881966A patent/HU204303B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 IL IL8608688A patent/IL86086A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 JP JP63093321A patent/JP2667193B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-15 IE IE114688A patent/IE61574B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-16 KR KR1019880004345A patent/KR970000187B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-04-14 PH PH36799A patent/PH25327A/en unknown
-
1992
- 1992-11-04 GR GR920402185T patent/GR3006141T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE881146L (en) | 1988-10-16 |
| KR880012760A (ko) | 1988-11-29 |
| FI98830B (fi) | 1997-05-15 |
| FI98830C (fi) | 1997-08-25 |
| AR242991A1 (es) | 1993-06-30 |
| ZA882659B (en) | 1988-10-14 |
| DK209188A (da) | 1988-10-17 |
| DK170741B1 (da) | 1996-01-08 |
| DE3873397D1 (de) | 1992-09-10 |
| FI881743A (fi) | 1988-10-17 |
| IL86086A (en) | 1995-01-24 |
| JPS63301898A (ja) | 1988-12-08 |
| JP2667193B2 (ja) | 1997-10-27 |
| EP0288809B1 (de) | 1992-08-05 |
| FI881743A0 (fi) | 1988-04-14 |
| CA1322157C (en) | 1993-09-14 |
| AU613022B2 (en) | 1991-07-25 |
| NZ224247A (en) | 1990-04-26 |
| HUT47319A (en) | 1989-02-28 |
| NO881658D0 (no) | 1988-04-15 |
| EP0288809A1 (de) | 1988-11-02 |
| GR3006141T3 (no) | 1993-06-21 |
| AU1466188A (en) | 1988-10-20 |
| IE61574B1 (en) | 1994-11-16 |
| DK209188D0 (da) | 1988-04-15 |
| HU204303B (en) | 1991-12-30 |
| NO881658L (no) | 1988-10-17 |
| PT87237A (pt) | 1988-05-01 |
| PT87237B (pt) | 1992-07-31 |
| IL86086A0 (en) | 1988-09-30 |
| ES2033981T3 (es) | 1993-04-01 |
| KR970000187B1 (ko) | 1997-01-06 |
| PH25327A (en) | 1991-04-30 |
| ATE79135T1 (de) | 1992-08-15 |
| NO176922C (no) | 1995-06-21 |
| DE3712985A1 (de) | 1988-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO176922B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av bifunksjonelle proteiner | |
| US5359035A (en) | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) | |
| JP3115318B2 (ja) | Ｇｍ―ｃｓｆ及びｉｌ―３を含む融合タンパク質 | |
| FI104733B (fi) | Menetelmä ja plasmidi interleukiini 1:n inhibiittorin tuottamiseksi | |
| SU1604164A3 (ru) | Способ получени гибридного интерферона типа @ 1/ @ 2 | |
| IE64202B1 (en) | Fusion proteins comprising gm-csf and il-3 | |
| KR100356140B1 (ko) | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 | |
| WO1990010070A1 (en) | Il-2 analogs containing n-linked glycosylation sites | |
| AU621051B2 (en) | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor | |
| JP2637392B2 (ja) | 遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法 | |
| US5047504A (en) | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor | |
| RU2708556C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида | |
| KR960016705B1 (ko) | 신규폴리펩티드 및 그것을 코우드하는 dna | |
| US4851512A (en) | Novel human interleukin-2 polypeptide derivative | |
| JPS62502305A (ja) | ポリペプチドの産生を向上する方法 | |
| RU2326169C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pA3GF, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2048521C1 (ru) | Способ получения полипептида со свойствами лимфотоксина человека | |
| RU2091488C1 (ru) | Рекомбинатная плазмидная днк р 280 gm, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. штамм escherichia coli sg20050/р 280 gm - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN OCTOBER 2003 |