SU1604164A3

SU1604164A3 - Способ получени гибридного интерферона типа @ 1/ @ 2

Info

Publication number: SU1604164A3
Application number: SU874202086A
Authority: SU
Inventors: Гауптманн Рудольф; Светли Петер; Мейндль Петер; Адольф Гюнтер; Фалькнер Эдгар; Бодо Герхард; Маурер-Фоги Ингрид
Original assignee: Берингер Ингельгейм Интернациональ Гмбх (Фирма)
Priority date: 1986-03-10
Filing date: 1987-03-09
Publication date: 1990-10-30
Also published as: FI871012A0; IE60573B1; PT84427B; PT84427A; IE940131L; DK120387D0; NZ219549A; EP0236920A3; JPS62282595A; DE3782259D1; FI871012A; HUT44074A; KR950008191B1; FI925631A0; ZA871679B; DD276493A5; ES2052502T3; PH27060A; DK120387A; ATE81671T1

Abstract

Изобретение относитс к генетической инженерии, в частности к способам получени гибридных интерферонов типа ω₁/α₂. Плазмидой P RHW78 трансформируют штамм E. COLI HB 101, отбирают штамм, продуцирующий интерферон, и путем последующей очистки получают интерферон формулы R₁-GLU ILE PHE - R₂, где R₁ - пептидна последовательность α₂-интерферона

R₂ - пептидна последовательность ω₁-интерферона.

Description

Изобретение относитс к генетической инженерии, в частности к способу получени гибридных интерферо- нов формулы

R, -GluIlePhe - R

CAG АТСТТС BilII

(1)

где Bglll означает совместное Bglll рестрикционное место ) -ин- ;

терферонов;

R - пептидна последовательность -интерферона, кодируема ДНК-последовательностью этого интерферона перед Bglll-MecTot . разреза;

R - пептидна последовательность СО -интерферона, кодируема ДНК-последовательностью этого интерферона после BgIll-места разреза или

R. - пептидна последовательность С0 -интерферона, кодируема ДНК-последовательностью этого интерферона перед BglII-местом разреза;

R, - пептидна последовательность й 2 интёрферона, коди-. руема ДНК-последовательг-. ностью этого интерферона после BglII-места разреза;

или их N-концевых мет- или N-формил- мет-производных или их N-гликозилиро- ванных производньк, а также необходим мые дл экг.пресии репликонные и контрольные последовательности плазмиды pERl03, имеющие формулу

а о

4

о

4

СМ

316041644

5 AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 GTGCGACTAGCGATTTTGTAAGAGGTTTTTCTCC CAAGTGAAACGGAAG

Промотор

GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCT CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCGTGCAAATTCGA Промотор/оператор- -- -рНК-старт - рибоз, - линTAAAGATGTGT

ATTTCTACACACTAG-

реп- -ген--

Пример 1е Плазмиду рАТ153 режут рестриктазами BamHI и PstI, Получаемые фрагменты раздел ют в 1%-ном агаровом геле и вьщел ют большой фрагмент, содержащий начало репликации , лигируют его с полз енным из плазмиды рагЕКЗЗ, расщепленной теми же рестриктазами, меньшим фрагментом Т -ДНК-лигазой, Дл осуществлени репликации плазмвд бактерии EiColi штамма НВ101 промывают раствором хло ристого кали , полученные ко1«1петент- ные Е. со11 НВ101 смешивают с лиги- рованной ДНК и инкубируют при 0°С с нагревом до в течение 2 мин. Затем трансформированные бактерии нанос т на содержащие ампициллин LB-агаровые пластинки (ЬВ-среда + + 15 г/л агара). После инкубации при 37 С выбирают 12 из полученных .колоний и выдел ют из них плазмиды. Двойным перевариванием выбранных плазмид рестрикционными энзимами PstI-BamHI,. Pstl-PvuII или EcoRI-BamHI и последующим гелевым электрофорезом получаемых фрагментов подтверждаетс правильность конструкции этих плазмид, Полученную таким образом плазмиду обозначают рагрАТЕКЗЗ Эта плазмида, трансформированна в Е. coli НВ101, про вл ет фенотип Ар (устойчивый к ампициллину) и Тс (устойчивый к тетрациклину ). Плазмиду рагрАТЕКЗЗ расщепл ют рестриктазами Hindlll и BamHI. Фрагменты раздел ют в 1%-ном агаровом геле Выдел ют наибольший, имеющий около 3750 пар оснований (п.о.), фрагмент (фрагмент а), содержащий триптофановый промотор/опера

5

0

5

0

5

0

5

тор, начало репликации и ген Ар, и лигируют с ДНК, кодирующей COj-интерферон . Эту ДНК получают путем разрезани кодирующей to 1 -интерферон плазмиды pRHWl1 (или pRHWl2) рестриктазами BamHI и Hindlll и последующего разделени обоих фрагментов путем гелевого электрофореза, причем желае- мьм ген содержитс в меньшем фрагменте с длиной около 800 п,о. Дл осу- ществлени репликации получаемых плаз-, МИД раствором хлористого кальци промывают E.coliHBIOI, смешивают их с реакционной смесью лигированной ДНК и после инкубации при 0°С плазмидную, ДНК поглощают бактери ми путем нагрева до в течение 2 мин. Трансформированные бактерии нанос т на содержащие ампициллин LB-агаровые пластинки . После инкубации при выбирают 6 из полученных колоний и вьдед.- ют из них плазмиды, Перевариваниё м выбранных плазмид рестрикционными энзимами EcoRI, Hindlll, Ncol и PstI и последующим гелевым электрофорезом подтверждаетс правильность конструкции этих плазмнд. Плазмиду, кодирующую COi -интерферон (Glu), обозначают как pRHWI4, если в качестве исходной плазмиды используют pRHW12, кодирующуюО,-интерферон (GluJ, Эта плазмида, трансформированна в Е. coli НВ101, про вл ет фено- тип Ар и Тс,

использовании в качестве исходной плазмиды pRHWl аналогично получают плазмиду pRHW13, кодирующую (0,-интерферон (Glu) . Получаема таким образом плазмида pRHW14 имеет в два

раза большую степень экспресии дл .dV -интерферона (Glu), чем известна плазмида pRHWlli. Плазмиду рагрАТЕКЗЗ и кодирующую СЙ -интерферон плазмиду pRHW14 режут Bglll и Sphl. Получаемые при этом фрагменты раздел ют в 1%-ном агаровом геле, элюируют и очищают посредством осаждени этанолом. После растворени фрагментов в ТЕ- буфере получаемый из плазмиды , рагрАТЕНЗЗ большой фрагмент лигируют с получаемым из плазмиды pRHW14 меньшим фрагментом в присутствии Т -ДНК- лигазы. Дл осуществлени репликации получаемых плазмид раствором хлористого кальци промывают бактерии штамма Е. coli НВ 101, Компетентные Е. coli НВ 101 смешивают с лиги- рованной ДНК и после инкубации при плаэмидную ДНК поглощают бактери ми путем нагрева до в течение 2 минв Затем трансформированные бактерии нанос т на содержащие ампициллин LB-агаровые пластинки (LB- среда + 15 г/л агара). После инкубации при 37°С отбирают несколько колоний и выдел ют из них плазмиды. Двойным перевариванием выбранных .плазмид рестрикционными энзимами Bglll и Sphl и гелевым электрофорезом получаемых фрагментов подтверждаетс правильность конструкции этих .плазмид, Плазмиду обозначают как pRH72,

Эта плазмида про вл ет фенотип Ар и Тс, кодирует /(л} -кнтерфе- рон (Glu) (Bglll).

Дп получени кодирующей гибридный интерферон формулы (I) плазмиды, содержащей перед совместным местом разреза Bglll кодирующую 6)(-интерферон последовательность ДНК, следует осуществл ть две стадии, если в последовательности ДНК С -интерферона имеютс два места разреза Bglll как и в последовательности ДНК интерферон (Ар), При этом на первой стадии получаемый из плазмиды pRHWlA путем разрезани Bglll и Sphl больщой фрагмент лигируют с получаемым из плазмиды рагрАЕКЗЗ путем переваривани с Bglll и Sphl фрагментом , который кодируетС-конецсх -интер- ферона (АрО в присутствии Т -ДНК-лига зы. Дп осуществлени репликации получаемых плазмид бактерии Е. coli НВ101 трансформируют и культивируют с последующей проверкой конструкции этих

5

0

5 0

плазмид. Выбирают получаемую таким . образом плазмиду и обозначают ее как . pRH77. Плазмиду pRH77 разрезают Bglll и 5 -концевой фосфат удал ют фосфата-. ЗОЙ тел чьего кишечника. Линеаризированную плазмиду pRHW77 раздел ют в 1%-ном агаровом геле, вьщел ют и очищают посредством осаждени этанолом, после растворени в ТЕ-буфере лигируют с фрагментом с длиной 263 n.o.i полученным при переваривании рагр ATER33 рестриктазами Bglll и Sphl в присутствии Т -ДНК-лигазы, Бакте-t рии Е„ coli НВ101 трансформируют и культивируют с последующей проверкой правильности конструкции плазмид путем разделени рестрикционными эндонуклеазами Alul и Haelll. При этом на основании идентичных концов введение фрагмента с длиной 263 п.о, осуществл ют в двух направлени х. Плазмиду, в которую фрагмент Bglll с длиной 263 п.о о введен в правильном дл экспрессии положении, обозначают как pRH78r, а плазмиду с неправильным дл экспрессии направле- нием - как pRH78f.

Обе плазмиды, трансформированные . в Е„ coli НВ101, показывают фенотип f и Тс.

Дл осуществлени репликации или экспрессии новые плазмиды могут быть внесены в бактериальный хоз ин.

При этом пригодны прокариоты, как, например, Е. coli К12, щтамм 294 (АТСС N 3.446), Е. coli Х1776 (АТСС № 31,537), Е, coli W3110 (F, h, прототроф, АТСС S 27.325), Е„ coli

НВ101 ((F , hsdS20 (-, m), recA13, ara-14, proA2, lacVI, galK2, TpSL20 (smr), xyl-5, mtl-1, sup E44, J), бациллы, как например. Bacillus suhtilis и другие энтеробактерии,

как Salmonella typhimurium или Ser- ratia marcenses, и различные псев- домонадыо Дл экспрессии новых гибридных интерферонов формулы (I) в Е. coli трансформируют и культивируют,

например, плазмиду рЕЬ72, pRH78f и рЕН78Го После разрушени стенок клеток и удалени центрифугированием обломков бактерии антивирусную активность экспримированных полипептидов определ ют в клеточной надоса- дочной жидкости. Клеточные надоса- . дочные жидкости, полученные из штамма Е. coli, трансформированного рКН72, и щтамма Е. coli, трансформированного pRH78f, не имеют антиви-, русных свойств. Получаема из плаз МИДЫ pRH78r клеточна надосадочна жидкость, содержаща СО,/о -интерферон (Bglll), имеет в четыре раза большую специфическую антивирусную активность на А549-клетках, чем интерферон (Ар) .

Пример2. 10 мкг рагрЕЮЗ в 200 мкл реакционного раствора разрезают 20 ед. BatnHI и 20 ед„ Pstl Затем два образовавшихс фрагмента раздел ют в 1%-ном агаровом геле (1% агара в 1хтВЕ-буфере, состо щем из 10,8 г/л трис(оксиметил)аминоме- тана (далее - трис), 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л динатриевой соли этиландинитрилотетрауксусной кисло- ты ЭДТУК) и 0,5 мг/л бромида эти- ди , в качестве рабочего буфера используют lifTBE, электрофорез при 5 В/см ДНК-фрагменты делают видимыми путем облучени УФ-светом (254 нм) агарового гел . Содержащий ОС -интер- ферон (Ар ) меньший фрагмент изолируют электрофорезом ДНК-полос на бума- ге DE-81, бумагу промывают в 200 мМ хлористом натрий,; 25 мМ трис рН 7,5,

1мМ ЭДТУК, элюа.цию ДНК осуществл ют с помощью 1 М хлористого натри ,

25 мМ трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТУК и, добавл 2,5 объема этанола, осаждают ДНКо После отделени центрифугированием ДНК высушивают и раствор ют в пригодном объеме ТЕ-буфера, состо щего из 10 мМ трис рН 8,0 и 1 мМ ЭДТУК„

10 мкг рАТ153 в 200 мкл реакционного раствора также разрезают 20 ед BamHI м 20 ед. PstI, фрагменты раздел ют. При этом больший, содержащий начало репликации, фрагмент вьщел ют о

По 0,5 мкг очищенных ДНК-фрагмен- тов в 20 мкл реакционного раствора (66 Ш трис рН 7,5, 100 мМ хлористый натрий, 10 мМ хлористый магний, 5 мМ дитиотрейтол, 1 мМ ЭДТУК, 1 мМ три- фосфат аденозина лигируют 5 ед. ДНК-лигазыо Затем к 150 мкл компетентных бактерий Е. coli НВ101 добавл ют 1 мкл продукта реакции лигирова- ни в течение 30 мин при 0°С, инкубируют и путем инкубации в течение

2мин при 42° С трансформирзпот ДНК (компетентные бактерии Но coli вьфа- щивают в LB-среде (10 г/л триптона,

5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л

О

Q

с

5

хлористого натри , рН 7,5) до достижени оптической плотности 0,3 и центрифугируют. Бактерии повторно суспендируют в 0,5 объема лед ного раствора 50 мМ хлористого кальци и инкубируют в течение 30 мин. После повторного центрифугировани бак- терии суспендируют в 50 мМ хлористом кальции 1/15 исходного объема о Суспензию бактерий нанос т на LB-агаровые пластинки (LB-среда + 15 г/л агара) с 50 мкг/мл ампициллина. Через 16 ч инкубации при выбирают 12 из образовавшихс колоний, из которых в микромасштабе изолируют плазмиды. Правильность конструкции подтвержДа- етс двойным перевариванием рестрикци- онными энзимами Pstl-BamHI, Pstl- PvuII и Ec,oRI-BamHI с последующим электрофорезом в геле. Вьйирают одну плазмиду, которую обозначают как рагрАТЕКЗЗ. Е. coli, трансформированный parpATER33, дает фенотип: ре- зистентность к ампициллину и тетрациклину .

10 мкг рагрАТЕКЗЗ в 150 мкл реакционного раствора подвергают двойному перевариванию Hindlll,и BamHI Полученные три ДНК-фрагмента раздел - ют в 1%-ном агаровом геле и наибольший фрагмент, длина которого составл ет приблизительно 3750 п.о., вьщел ют фрагмент. Этот фрагмент имеет триптофановый промотор/оператор (Ser- ratia marcescens), начало репликации и .

10 мкг pRHW12 в 150 мкл реакционного раствора также подвергают двойному перевариванию BamHI и Hindlll. Образовавшиес два фрагмента раздел ют электрофорезом в геле, и меньший фрагмент (фрагмент б), длина которого составл ет приблизительно 800 п.о. изолируют (он содержит 00 -интерферон (С1и)-ген. . .40 нг фрагмента и приблизительно 50 нг фрагмента б в 10 мкл реакционного раствора лигируют 5 ед. Тд-ДНК- лигазы. 200 мкл суспензии компетентных бактерий Е. coli смешивают с раствором реакции лигировани , бакте- - рии трансформируют внезапным нагревом до и нанос т на LB-агаровые пластинки, содержащие 50 мкл/мл ампициллина . Через 16 ч инкубации при 37 С выбирают 6 колоний, из которых в микромасштабе изолируют плазмидную ДНК.После переваривани ДНК рестрик91

ио нными эндонуклеазами ECoRI, indlll, Ncol или PstI и последуюего электрофореза в геле фрагментов вы снилось, что одна из плазмид имеет желаемую структуру. Ее обозначают как pRHWIA. Е. coli трансформируют pRHWU и получают фенотип Ар и Тс.

Дл этого бактерии Е. coli CSR 603 (F, thr-1, leuB6,., proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacVI, galK2, xyl-5, mtl-I, gyr A98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, A, sup E44), трансформированные плазми- дами pRHW12 и pRHW14, выращивают при в экспрессионной среде (10 г/л фосфата аммони , 3,5 г/л гидрогенфосфата кали с рН 7,3, 0,5 г/л хлористого натри , 21 г/л- гидролизата казеина (гидролизованного кислотой, свободного от витаминов ), tl г/л глюкозы, 1 мМ сульфата магни , 0,1 мМ хлористого кальци , 1 мг/л тиамина в виде гидрохлорида, 20 мг/л L-цистеина, 100 мг/л ампициллина ) до достижени OngQOuM О 6. 10 мл этой культуры подают в открытую чашку Петри и УФ-лампой (15 Вт) установленной на рассто нии 50 см, облучают в течение 5 с и далее в течение 1 ч инкубируют. К культурам добавл ют 100 мкг D-циклосерина дл уничтожени способных к размножв нию бактерий. По истечении 16 ч инку бации при 37 с бактерии отдел ют центрифугированием, дважды промывают по 5 мл солевого раствора Гершей (5,4 г/л хлористого натри , 3,0 г/л хлористого кали , 1,1 г/л хлористого аммони , 15 мг/л хлористого кальци , 0,2 г/л хлористого магни в виде гексагидрата, 0,2 мг/л треххлористого железа в ви,че гексагидрата , 87 мг/л дигидрогенфосфата кали , 12,1 г/л трис, рН 7,4) и инкубируют в 5 мл среды Гершей на 100 мл солевого раствора Тершей используют 2,0 мл 20%-ной глюкозы, 0,5 мл 2%-кого треонина, 1,0 мл 1%- ного лейцина, 1,0 мл- 2%-ного проли- на, 2%-ного аргинина, 0,1 мл О,1%-но- го тиамина в виде гидрохлорида,

20 мкг/мл КАК-индоакрнловой кислоты. Добавлением 5 мг/мл S-метионина и дальнейшей инкубацией при 37 С в течение 1 ч новосинтезируемые протеины радиоактивно маркируют. Бактерии отдел ют центрифугированием и в

10

20

25

04164 0

200 мкл буфера (ДСН) - додецилсуль- , фата натри (6,16 мл фосфата натри с рН 6,8, 2 мМ ЭДТУК, 2% ДСН, 3% глицерина , 0,02% бромфенолового синег го, 0,66% 2-меркаптоэтанола) в течение 5 мин лигируют при 100 С, Пробы затем раздел ют в 15%-ном полиакрил- амидном геле (разделительный гель: 15% акриламида, 0,4% бисакриламида, 375 мМ трис, рН 8,8, 2 мМ ЭДТУК, 0,1% ДСН| собирательный гель: 6% акриламида , 0,16% бисакриламида, 375 мМ трис, рН 6,8, 2 мМ ЭДТУК, 0,1% ДСН; элект- 55 родный буфер: З.,0 г/л трис, 14,24 г/л глицерина, 0,335 г/л ЭДТУК, 0,5 г/л , ДСН; продолжительность электрофореза 16 ч при посто нном значении тока 20 мА). Гель в течение 1 ч фиксируют в 20%-ном метаноле и 7,5%-ной уксусной кислоте, в течение 30 мин инкубируют в 5%-ном метаноле и 1%-ном глицерине с последующей сушкой. С помощью усилительной фольги гель экспонируют при -80°С на рентгеновской пленке. Геновый продукт с резистентностью к ампициллину (| -лактамаза) в обоих случа х одинаково маркируетс . G),-интерферон в случае pRHW14 более чем в два раза сильнее маркированный , чем в случае pRHW12.

П р и м е р 3. Экстракци Qj-интерферон (Glu) из бактерий.

Штамм Е. coli НВ101, трансформированный pRHW12/pRHW14, вьфащивают в экспрессионной среде + 20 мкг/мл ИАК до ОПбООнм 20. Бактерии уничтожают добавлением серной кислоты до значени рМ и инкубацией в течение 60 мин при . Бактерии отдел ют центрифугированием и биомассу замораживают при до переработки . Бактерии повторно суспендируют в 10 объемах 1%-ной уксусной кислоты. Добавл 2 н. гидроокиси натри , значение рН раствора довод т до 10 и суспензию перемешивают в течение 2 ч при . Затем значение рН добавлением 2 н. сол ной кислоты довод т до 7,5 и остатки разрушенных клеток отдел ют центрифугированием (4°С, 10 0000 об/мин, 30 мин). Интер- феронов что активность з надосадоч- ной жидкости (сыром экстракте) измер ют при помощи известного теста 55, на человеческих клетках А549 (клеточна лини рака легких человека), ин- фицированньк вирусом энцефаломиокар- дита (ЭЬЖ), с использованием в ка30

35

40

45

50

n

честве стандарта o j -интерферона (Ар При этом биомасса Е. Coli, трансформированна pRHW12, дает 100000 ед/г (среднее значение из трех независимых культур), а клон pRHW14 - 200000 ед./г биомассы (15 культур).

Примера. 10 мкг рагрАТЕКЗ и pRHW14, соответственно, в 130 мк раствора подвергают двойному перевариванию Bgl II и Sphl. Образовавшиес фрагменты раздел ют на 0,8%-ном ага ровом геле, дезоксирибонуклеиновые кислоты элюирзпот и осаждают. ФраГгме ты раствор ют в 20 мкл буфера ТЕ. Экспрессионную плазмиду дл .,- интерферона (Bglll) получают путем лигировани 1 мкл большого фрагмента из рагрАТЕЕЗЗ с 5 мкл малого фрамента из pRHW14 в 20 мкл среды в присутствии 5 ед. Т -ДНК-лигазы. После трансформации Е. со11 НВ101 в микромасштабе вьщел ют плазмиды нескольких полученных резистентных к ампициллину клонов и правильность конструкции провер ют двойным перевриванием рестрикционными энзимами Bglll/Sphl. Выбирают одну из плазмид и обозначают как pRH72. Е. coli, трансформированный этой плазмидой, имеет фенотип , Тс®.

-1 мкл большого фрагмента из pRHW14 и 5 мкл Bgl11(2)-Sphl-фраг- мента из parpATER33, кодирующего С-конец о -интерферона (Аг), в 20 мкл реакционного раствора лигиру- ют 5 ед. Т -ДНК-лигазы. Образовавшейс плаэмидой трансформируют Е. coli НВ101 и выбирают плазмиду желаемой конструкции. Эта промежуточна плазмида обозначаетс как pRH77 С целыб комплектовани гена дл и,/о/2 интерферона (Bglll), удаленны при разрезе parpATER33c Bglll фрагмент следует внести в pRH77. Дл этго 10 мкг pRH77 разрезают с Bglll в 50 мкл раствора, объем раствора удваивают с помощью 2vбуфера CIP ( - IP Фосфатаза тел чьего кишечника ) . 2х С1Р-буфер содержит 100 трис, рН 5,0, 2 мМ хлориртый магний 0,2 мМ хлористый цинк. 5 -концевой фосфат добавлением 1 ед. CIP удал етс (60 мин при 37°С). Линеаризированную форму pRH77 очищают электрофорезом в агаровом геле и элюацией ДНК с последующим осаждением. ДНК раствор ют в 20 мкл ТЕ-буфера и 1 мкл полученного раствора вместе с 5 мкл фрагмента с длиной 263 п.о. (Bglll

12

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

(I) BglII(2)-фрагмент), получаемого перевариванием.рагрАТЕЕЗЗ и Bglll/ /Sphl, в 10 мкл реакционного раствора лигируют в присутствии 5 ед. ДНК-лигазы. Ё. coli НВ101 трансформируют и ДНК шести образовавшихс колоний анализируют. Так как концы идентичны введение фрагмента с длиной 263 п.о. может происходить в двух направлени х, плазмиды провер ют относительно правильности конструкции при помощи рестрикционных эндо- нуклеаз Alul и Haelll.

Плазмида, в которую вставлен BglII-фрагмент в правильном дл экспрессии положении, обозначаетс как pRHW78r, а друга с неправильным дл экспрессии положением т как pRH78f. Е. coli, трансформированный pRH78r или pRH78f, показывает фенотип Ар, Тс. Т рансформированный различными плазмвдами штамм Е. coli в 35 мл эксп- рессионной среды + 20 мкг/мкл ИАК при 37°С вырашзивают до ОП 50цдд 0,6. Бактерии отдел ют центрифугированием. Осадок бактерий суспендируют в 3,5 мл раствора 50 мМ трис, рН 7,6, и 30 мМ хлористого магни ,, охлаждают льдом, обрабатывают ультразвуковым дизен- тегратором типа Сонипрен-150 при максимальной мощности. Суспензию в течение 10 мин центрифугируют (10000 об/мин ) и надосадочную жидкость стериль- : но фильтруют. Антивирусную активность раствора определ ют с использованием / клеток А549, инфицированных вирусом ЭМК.

Трансформированные pRH72 / COt - интерфероном (Bglll)бактерии Е. coli не про вл ют антивирусной активности, также как и трансформированный pRH78 штамм Е. coli, коди-- рзтощий первые 64 аминокислоты зрелого COj -интерферона и последующий се - рин.

По сравнению с этим результатом СО /с г-иитерферон (Bglll) про вл ет в четыре раза большую специфичную антивирусную активность относительно клеток А549, чем -интерфер он (Ар), причем на 1 л культуры при Пбоонм 1 кпон pRH78r продуцирует приблизительно 30x10 ед.. интерферона .

П р и м е р 5. Очистка CJj /о( терферона (Bglll).

145 г обработанных кислотой и замороженных при -20 С бактерий Е. со1-316041

li-клона HB101/pRH78r в 1450 мл 1%-ной уксусной кислоты, размешивают,. гомогенизируют в течение 2 мин при 10000 об/мин, добавл ют полиамин Р до концентрации 0,25% и добавлением 5 н. гидроокиси натри рН среды довод т до 10,0. При охлаждении льдом перемешивают в течение 2 ч и добавлением 5 н. сол ной кислоты .« рН довод т до 7,3. Сырой продукт очищают центрифугированием О000 об/мин, 60 мин, приблизительно ). К сырому экстракту добавл ют 430 г/л сульфата аммони и до полно- , го осаждени оставл ют сто ть в течение 16 ч при . Осадок отдел ют центрифугированием (10000 об/мин, 60 мин, 4-8°С), раствор ют в 145 мл 0,01 М хлорида натри . Значение рН 20 суспензии довод т до 7,5 добавлени- нием 5 н. гидроокиси натри . При охлаждении льдом перемешивают в течение 3 ч и затем, раствор центрифугируют до прозрачности (10000 об/мин, 25 , 60 ми н) .Диализуют в 0,01 М хлорида натри до того, пока раствор интерферона не покажет осмол рность 370 осмоль/л.

Двойна хроматографи : дл очистки хроматографией колонку из целлюлозы DE-52 уравновешивают О.,025 М трис- сол ной кислотой + 0,2 М хлористым натрием, рП 7,5, и подключают к колонне емкостью 60 мл, котора содержит моноклональное антитело EBI-1 35 св занное с сефарозой 4В. Колонка содержит 480 мг моноклонального антитела EBI-1 и уравновешена буфером при помощи триссол ной кислоты + + хлористый натрий, рН 7,5. Раствор 40 интерферона пропускают через обе колонки , колонки промывают 0,025 М триссол ной кислотой + 0,2 моль хлористым натрием до того, пока в злюа- те измер ют только экстинкцию опти- 45 ческой плотности при 280 нм ниже О,1. Затем отсоедин ют содержащую DE-52- целлюлозу колонку, а колонку, содержащую антитело, промывают до ОП при 280 нм в элюате ниже 0,01. 50 дсорбированный интерферон злюируют 0,1 М лимонной кислотой в 25%-ном зтиленгликоле, собирают пик протеина. Кислый элюат колонки с антителом дово т до рН 4-5 добавлением 2 н. аммиа- 55 ка и получаемый осадок удал ют центриугированием . Последней стадией очисти вл етс хроматографи на ионите оно-С. Колонку, содержащую 1 мл

30

« 0 5

5 0 5

0

6414

ионита, уравновешивают при О,t М цитратом натри , рН 4,2, нанос т г .нтерфе- рон и элюируют его градиентом рН (буфер А: О,1 М цитрат натри со значением рН 4,2; буфер Б: 0,1 М фосфат натри со значением рН 8,0) . Интерферон Qtвыходит при значении рН 7,0, пик интерферона собирают.

П р и М е р 6. Очистка СО, -интерферона .

а) Экстракци и хроматографи с использованием стекл нных частиц, имеющих поры величиной 120-240 меш. I

794 г осажденных кислотой и замороженных при -20 С бактерий Е. coli клона pRHW14 при охлаждении льдом перемешивают в 7700 мл 1%-ной уксусной кислоте до полного распределени материала (около 30 мин) и при помощи 2 н. гидроокиси натри довод т до рН 10. После перемешивани в течение 2 ч при охлаждении льдом суспензию довод т до рН 7,5 (2 н. сол ной кислоты и центрифугируют в течение 1 ч при 10000 об/мин и 4°С. Прозрачную налр- садочную жидкость в количестве 50 мл/ч пропускают через колонну, содержащую 500 мл стекл нных частиц, затем колонну тщательно промывают 0,025 М триссол ной кислотой + 1 М .хлоридом натри (рН 7,5). Адсорбированный интерферон элюируют 50 мл/ч раствора 0,025 М триссол ной кислоты + О,1 М KSCN в 50%-ном этиленгликоле (рН 7,5), Затем пул интерферона подвергают диализу 0,025 М триссол ной кислотой + + 0,1 М хлористым натрием, причем добавлением 10%-ного полиэтиленгликол с мол.массой 40000 одновременно достигаетс концентраци пула интерферона . Подвергнутый диализу концентрат осветл ют центрифугированием (1 ч, 4°С, 15000 об/мин).

б) Сродственна хроматографи на антителе ОМГ-2 на сефарозном носит еле.

Очищенное моноклональное антитело ОМГ-2 нанос т на сефароз 4В при помощи активированного бромистым цианом сефароза 4В. При этом используют 16 мг моноклонального антитела на 1 г активированного сефарбза 4В. Дл разделени используют колонну с объемом 8 мл. Полученный согласно примеру 6а концентрат колонны со стекл нными частицами 4 мл/мин пропускают через колонну с антителом и затем колонну промывают 0,025 М триссол ной кислотой + О,1 М хлористым натрием.

15

рН 7,5. до тех пор, пока в элюате больше не содержитс протеина (ОП при 280 нм элюата идентична с плот-с ностью промывного буфера). Затем св занный интерферон элюируют О,1 М лимонной кислотой в 25%-ном этиленгли-i коле (2 мл/мин) и собирают пик протеина (ОП230йм

в)Хроматографи на ионите моно-С, Ионообменную колонну уравновешивают раствором 0,1 М фосфата кали

в 25%-ном пропиленгликоле, рН 6,0 . Полученный согласно примеру 66 элюат содержащей антитело колонны подают в Количестве 0,5 мл/мин. Адсорбиро-. ванный интерферон элюируют при помощи в качеств© градиента хлористого натри (буфер Б 0,1 М фосфата ка- ЛИЯ + 1 М к рристый натрий, рН 6,0, в 25%-ном пропнленгликоле). Фракции (по 1 мл) исследуют в отношении, ин- терфероновой активности. Первый пик () при применении 46% буфера Б содержит 00 -интерферон.

г)Жидкостна хроматографи под давлением с использованием обращенной фазы.

В качестве неподвижной фазы слу-

10

1604164

Эта последовательность подтверждает последовательность аминокислот по кДНК (цистеин в положении 1 не может быть доказан без восстановлени и алкилировани протеина, а гис- тидин в положении 7 не может быть однозначно доказан.

е) Очистка гибридного СО,/(Х -интер- ферона (табл. 1-3).

Ф о рмула изобретени

Способ получени гибридного интерферона типа (, заключающийс в том, что плазмиду рагрАТЕКЗЗ обра- 5 батывают рестриктазами Hindlll и feamHI, выдел ют фрагмент размером 3750 п.о., лигируют данный фрагмент с помощью Tij-ДНК-лигазы и BamHI- HindIII-фрагмент размером 800 пор оснований плазмиды pRHW11 илирМН12, полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в щтамм Е. coli НЕ 101, вьщел ют плазмиду pRHW13 или pRHW14, лигируют BglII-SphI-фрагменты плазмиды pRHW13 или pRHW14 размером 3,77 кВ с помощью 14-ДНК лигазы и фрагмент размером 1,18 кВ, кодирующий С-конец интерферона плазмиды

20

25

„„,.о . „.-п рагрАТЕКЗЗ, полученную рекомбинант- жит колонна типа ВП-РП 18, 4x250 мм, -ал nnv з. 30 ную ДНК трансформируют в щтамм Е. со . 11 НВ101, вьщел ют плазмиду pRH77, обрабатывают плазмиду pRH77 Bglll очищают линеаризованную форму плазмиды pRH77 и легируют ее с помощью

J, Т -ДНК-лигазы с BglII-SphI-фрагмен- том длиной 0,26 кВ плазмиды parpATER 33, полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в штамм бактерий Е. coli 101, выдел ют плазмиду pRHW7or

4Q трансформируют штамм. Е. coli НБ101 плазмидой pRHW78r, выращивают трансформированный штамм, очистку белка провод т путем осаждена с помощью 10 мл 1%-ной уксусной кислоты, гомосодержаща пористые частицы диамет- рон 5 мкм и величиной пор 300 А, В качестве подвижной фазы служит градиент ацетонитрила в О,1%-ной трифтор- уксусной кислоте. Буфер А: О,1%-на трифторуксусна кислота в воде; буфер Б: 0,1%-на трифторуксусна кислота в ацетонитриле.

Градиент 20-68% буфера В в течение 28 мин. Скорость подачи 1мп/мин.

Детекци ОП2(4(М Через колон-, ну пропускают 630 мкг полученного согласно примеру 6в протеина (пул интерферона после хроматографии на

моно-С). Элюат в области 48-58% буфе- енизации полиэтиленимином до концент о f ..:-.T.f Р-Дии 0,25%, доведением рН среды до

10 с помощью 5 н. гидроокиси натри с последующим снижением рН до 7,5 с помощью 5 н. сол ной кислоты и вне- 50- сением в получаемый сырой экстракт . 43% сульфата аммони , центрифугирр.- ваниём диализом до осмол рности 370 смоль/л, хроматографией на целлюлозе DE-52, затем на св занной с моноклональным антителом EBI-1 сефарозе 4В, доведением рН элюата до 4,5, центрифугированием, хроматографией на моно-С и элюацией при рН 7.

ют 24,5 мин с 63% буфера. Выход составл ет 5-10 мкг, а удельна активность 10 ед/мг протеина.

д) .Определение последовательности Ы-концевы5 : аминокислот.

Полученный согласно примеру 66 Пик О)-интерферона сушат в центрифуге с последующим анализом. Получают следующую последовательность аминокислот:

Хкх-Asp-Leu-Pro-Glu-Asn-Xxx-Clu-Leu-. Leu-Ser1510

55

.17 160416418

Таблица

Экстракци и хроматографи с использованием стекл нных

частиц (ХСЧ) с порами величиной 120-240 меш J I

Таблица2

Сродственна хроматографи на антителе ОМГ-2 на сефарозном носителе

Claims

Формула изобретения

Способ получения гибридного интерферона типа СО,/о(_г, заключающийся в том, что плазмиду рагрАТЕКЗЗ обрабатывают рестриктазами ΗίηάΙΙΙ и ЙЗатН1, выделяют фрагмент размером 3750 п.о., лигируют данный фрагмент с помощью Т₄-ДНК-лигазы и ВашН1ΗίηάΙΙΙ-фрагмент размером 800 пор оснований плазмиды рМШ11 илирВНЫ12, полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в штамм Ε. со11 НВ 101, выделяют плазмиду рЕЭДЛЗ или рКНН14, лигируют В§111-БрЫ-фрагменты плазмиды рКЖ13 или рВНИ14 размером 3,77 кВ с помощью Т₄-ДНК лигазы и фрагмент размером 1,18 кВ, кодирующий С~конец интерферона плазмиды рагрАТЕКЗЗ, полученную рекомбинант-/ ную ДНК трансформируют в штамм Е. соΐί НВ101, выделяют плазмиду рКН77, обрабатывают плазмиду рВН77 Ββ1ΙΙ_?очищают линеаризованную форму плазмиды рКН77 и легируют ее с помощью Т.^-ДНК-лигазы с В§111-8рМ-фрагментом длиной 0,26 кВ плазмиды рагрАТЕК 33, полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в штамм бактерий Е. со11 101, выделяют плазмиду рКНИ78г трансформируют штамм. Ε. οοΐί НВ101 плазмидой рКНМ78г, вымащивают трансформированный штамм, очистку белка проводят путем осаждения с помощью

10 мл 1%-ной уксусной кислоты, гомогенизации полиэтиленимином до концентрации 0,25%, доведением рН среды до 10 с помощью 5 н. гидроокиси натрия с последующим снижением рН до 7,5 с помощью 5' н. соляной кислоты и вне. сением в получаемый сырой экстракт 43% сульфата аммония, центрифугиро- ванием диализом до осмолярности 370 смоль/л, хроматографией на целлюлозе ΏΕ-52, затем на связанной с моноклональным антителом ΕΒΙ-1 |сефарозе 4В, доведением рН элюата до 4,5, центрифугированием, хроматографией на моно—С и элюацией при рН 7.

.17 . '1604164 18

Таблица 1

Экстракция и хроматография с использованием стеклянных частиц (ХСЧ) с порами величиной 120-240 меш

’ - ' . · з ι

Продукт Объем, мл Интерферон* ед „ ** Протеин мг Единиц Выход % Сырой экстракт 7700 190-10⁶ 19100 9950 100 Пул после ХСЧ 425 53 -10⁶ 4600 11500 28 После диализа 410 45-10* 1650 27300 24

Таблица2

Сродственная хроматография на антителе ОМГ-2 на сефарозном носителе

Материал Объем мл Интерферон * ед Протеин _?мг Единиц Выход, % Подано 350 40,6-10⁶ 1520 26700 100 Не адсорби- ровано 440 4,5-10 — 11

Элюат, содер-

жащий О-интерферон 7 25,6- Ю⁶ 2,84 9,0’ 10⁶ 63 — а----------

ТаблицаЗ

Хроматография на ионите моно-С

Материал Объем, мл Интерферон*; ед ** Протеин, мг Единиц Выход, %

Подано 7 7,1440⁶ 2,84 2,5-10⁶ 100

Пул, содержащий ϋ -интерферон 2 3,04 4 0⁶ 0,72 4,2 ·10⁶ 43

————————————————————————__——— С._________________—_______

£

Определение содержания интерферона осуществляют, измеряя антивирусную активность при помощи клеток А549, инфицированных вирусом ЭМК, с использованием в качестве стандарта о^-интерферона (Ар^г). Указанное значение представляет собой среднее значение трех независимых опытов.

** Определение протеина осуществляют с использованием в качестве стандарта альбумина сыворотки.