ES2378977T3

ES2378977T3 - Isoforma del canal de calcio del tipo N humano y usos de la misma

Info

Publication number: ES2378977T3
Application number: ES99911339T
Authority: ES
Inventors: Diane Lipscombe; Stephanie Schorge
Original assignee: Brown University Research Foundation Inc
Current assignee: Brown University Research Foundation Inc
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2012-04-19
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: AU2004202022B2; EP1062337A1; US7018832B2; AU770018B2; US20020147309A1; WO1999046383A1; US6353091B1; AU2004202022A1; US8038995B2; AU3000299A; EP1062337B1; US20060135751A1

Abstract

Un polipéptido de la subunidad hα1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2.

Description

Isoforma del canal de calcio del tipo n humano y usos de la misma

Campo de la invención

[0001] La invención pertenece a las isoformas de la subunidad a1B del canal de calcio tipo N humano.

Antecedentes de la invención

[0002] Los canales de calcio regulados por voltaje, también conocidos como canales de calcio dependientes del voltaje (VDCCs) son proteínas que abarcan la membrana de la multisubunidad que permiten la afluencia de calcio controlada de un ambiente extracelular al interior de una célula. Se han descrito varios tipos de canales de calcio regulados por voltaje en diferentes tejido, incluyendo los canales tipo N, tipo P/Q, tipo L y tipo T. Un canal de calcio regulado por voltaje permite la entrada en la célula del calcio en el momento de la despolarización de la membrana de la célula, que es una disminución de la diferencia en el potencial eléctrico entre el exterior y el interior de la célula.

[0003] Un canal de calcio regulado por voltaje contiene varias proteínas incluyendo subunidades de a1, a2, � y y. También son conocidos los subtipos de las subunidades del canal de calcio. Por ejemplo, los subtipos incluyen a1A, a1B, a1C, a1D, a1E, y a1S. Cada subunidad puede tener una o más isoformas que resultan de empalmes alternativos del ARN en la formación de un ARN mensajero completado que codifica la subunidad. Por ejemplo, se conocen al menos cuatro isoformas de la subunidad a1B del tipo N de rata (ver, por ejemplo, Lin y otros, Neuron 18: 153-166, 1997, que está relacionado con la expresión de variantes de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N en los ganglios simpáticos).

[0004] Las isoformas de la subunidad a1A del canal de calcio se pueden expresar de forma diferente en diferentes tejidos (ver, por ejemplo, Lin y otros, 1997). La expresión diferencial de las isoformas de las subunidades aumenta la posibilidad de desarrollar terapéuticos que son específicos para las distintas isoformas de las subunidades a1A, disminuyendo de este modo los efectos secundarios resultantes del uso de los terapéuticos que son efectivos para más de una isoforma del canal de calcio. Dos isoformas de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N, la a1B-1 y la a1B-2 fueron publicadas por Williams y otros en 1992 (Science 257: 389-395), en un papel que está relacionado con la estructura y la expresión funcional de los canales de calcio del tipo N dependientes del voltaje sensibles a la w-conotoxina (w-Cg Tx).

[0005] Dada la existencia de varias isoformas de rata adicionales en una familia de genes altamente conservada, es sorprendente que no se hayan descubierto isoformas humanas adicionales de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N. Dichas isoformas serían útiles para desarrollar terapéuticos específicos de la isoforma.

Resumen de la invención

[0006] La invención proporciona moléculas de acido nucleico aisladas, fragmentos únicos de esas moléculas, vectores de expresión que contienen lo anterior, y células huésped transfectadas con esas moléculas. La invención también proporciona polipéptidos aislados de los anteriores ácidos nucleicos. Lo anterior puede ser usado en el diagnostico o tratamiento de condiciones caracterizadas por actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano aumentada o reducida y se puede usar en métodos en los que es terapéuticamente útil aumentar

o disminuir la actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano como en tratamientos para la apoplejía, dolor (por ejemplo, dolor neuropático) lesión cerebral traumática y condiciones caracterizadas por la afluencia de calcio regulada por voltaje aumentada o disminuida. Aquí, nosotros presentamos la identificación de una nueva subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano, la ha1B+SFVG, que juega un papel en la afluencia de calcio regulada por voltaje.

[0007] Se descubrió que una isoforma de la subunidad del canal de calcio a1B del cerebro (variante de empalme) contiene un inserto de cuatro aminoácidos en relación con las isoformas del canal de calcio a1B humano publicadas (SEQ ID NO:5 [número de entrada en el Banco de Genes M94172], SEQ ID NO:7 [número de entrada en el Banco de Genes M94173]). Sorprendentemente, este inserto, SFVG (SEQ ID NO:2, codificado por la SEQ ID NO:1),es similar pero no idéntico al inserto encontrado en un canal a1B de rata (número de entrada en el Banco de Genes M92905). SE descubrió que una proporción significativa del ARNm de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano en el cerebro es el subtipo ha1B+SFVG; dada la abundancia de esta expresión el aislamiento de este subtipo no se espera tanto tiempo después la identificación de otras isoformas del a1B. La subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que contiene la SFVG también carece de una secuencia de aminoácido, ET, que está presente en las isoformas de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano publicadas (aminoácidos 1557-1558 de SEQ ID NO:5 y 7).

[0008] La invención implica en un aspecto un polipéptido de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano aislado que incluye la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2 (un polipéptido ha1B+SFVG). En una realización, el polipéptido comprende la secuencia de amino acido de SEQ ID NO:4, y preferiblemente consiste de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:4.

[0009] En otra realización el polipéptido del canal de calcio ha1B+SFVG consiste de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2.

[0010] De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica cualquiera de los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano anteriores. En ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico incluye la SEQ ID NO:1. En una realización preferida, los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:3 (Williams y otros secuencia +SFVG, -ET), y que consiste preferiblemente de la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:3. En otra realización el ácido nucleico es un alelo de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3.

[0011] En otro aspecto la invención es un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano enlazada operativamente a un promotor. También está incluida dentro de la invención una célula huésped transformada o transfectada con el vector de expresión.

[0012] La invención también proporciona composiciones que incluyen cualquiera de los polipéptidos anteriores, o ácidos nucleicos en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

[0013] Los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos son útiles para aumentar la cantidad de los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula. Aumentar la cantidad de polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula resulta en una afluencia de calcio regulada por voltaje aumentada. Esto es útil donde se desea aumentar la cantidad de la afluencia de calcio regulada por voltaje que es mediada por un canal de calcio del tipo N humano.

[0014] En consecuencia de acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para aumentar la expresión de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula. El método implica el paso de poner en contacto la célula con una molécula seleccionada del grupo consistente de un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una cantidad efectiva para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula. En ciertas realizaciones, la célula se pone en contacto con una o más subunidades ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, como una subunidad �, o ácidos nucleicos que codifican tales subunidades no ha1B+SFVG.

[0015] De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona una composición para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje del canal de calcio. La composición es para ser administrada a un sujeto con la necesidad de tal tratamiento de una molécula seleccionada del grupo consistente un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una cantidad efectiva para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje en el sujeto.

[0016] De acuerdo a un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar los compuestos principales para un agente farmacológico útil en el tratamiento de enfermedades asociadas con la afluencia de calcio regulada por voltaje aumentada o disminuida mediada por un canal de calcio del tipo N humano. Se proporciona una célula u otro espacio encapsulado por membrana que comprende polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. La célula u otro espacio encapsulado por membrana se carga con in compuesto sensible al calcio que es detectable en la presencia de calcio. La célula u otro espacio encapsulado por membrana se pone en contacto con un agente farmacológico candidato bajo condiciones que, en ausencia del agente farmacológico candidato, causan una primera cantidad de afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula u otro espacio encapsulado por membrana. Se determina entonces una cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje. Por ejemplo, en una realización preferida, la fluorescencia de un compuesto sensible al calcio es detectada como una medida de la afluencia de calcio regulada por voltaje. Si la cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje es menos que la primera cantidad, entonces el agente farmacológico candidato es un compuesto principal para un agente farmacológico que reduce la afluencia de calcio regulada por voltaje. Si la cantidad de prueba de la afluencia de calcio regulada por voltaje es mayor que la primera cantidad, entonces el agente farmacológico candidato es un compuesto principal para un agente farmacológico que aumenta la afluencia de calcio regulada por voltaje.

[0017] En otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para identificar compuestos que selectivamente

o preferencialmente enlazan con una isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. En una realización, el método incluye proporcionar una primera célula o espacio encapsulado por membrana que expresa una isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, y proporcionar una segunda célula o espacio encapsulado por membrana que expresa una isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, en donde la segunda célula o espacio encapsulado por membrana es idéntico a la primera célula excepto por la isoforma a1B expresada. La primera célula o espacio encapsulado por membrana y la segunda célula o espacio encapsulado por membrana son puestos en contacto con un compuesto, y se determina el enlace del compuesto a la primera célula o espacio encapsulado por membrana y a la segunda célula o espacio encapsulado por membrana. Un compuesto que enlaza con la primera célula o espacio encapsulado por membrana pero no enlaza con la segunda célula o espacio encapsulado por membrana es un compuesto que enlaza selectivamente con la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Un compuesto que enlaza con la primera célula o espacio encapsulado por membrana en una cantidad más grande que el enlace del compuesto con la segunda célula o espacio encapsulado por membrana es un compuesto que preferencialmente enlaza con la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. En otra realización del método, se proporcionan un polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y un polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y se ponen en contacto con un compuesto. Se determina después el enlace del compuesto con el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y con el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Un compuesto que enlaza con el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano pero no enlaza con el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es un compuesto que enlaza selectivamente con el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Un compuesto que enlaza con el polipéptido o el ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una cantidad mayor que con el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es un compuesto que enlaza preferencialmente con el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. También están incluidos en la invención los compuestos identificados los métodos anteriores.

[0018] También se presenta en la presente una identificación de las características de ciertas isoformas de la subunidad del canal de calcio con respecto a la activación dependiente del voltaje. Se ha descubierto, sorprendentemente, que la presencia o la ausencia de un exón que comprende lo aminoácidos ET es importante para las cinéticas de la activación del canal. Así, en todavía otros aspectos de la invención se proporcionan una variedad de ensayos, pruebas, productos recombinantes, sistemas de modelos (como modelos animales) y métodos nuevos que utilizan las funciones de activación diferentes inesperadas entre las isoformas de la subunidad del canal de calcio para la identificación de agentes, tratamientos, etc. nuevos útiles en la modulación de condiciones que surgirán de o manifiestan diferencias en la liberación de neurotransmisores de potencial de acción , la activación del canal de calcio dependiente del voltaje, y demás. Por ejemplo, se proporcionan métodos para la identificación de agentes que alteran la liberación de neurotransmisores dependientes del potencial de activación. Los métodos incluyen seleccionar un agente que enlaza con una isoforma del canal de calcio que tiene o carece de un exón ET IVS3-S4 como se describe en la presente, y determinar la activación del canal de calcio o la liberación de neurotransmisores dependientes del potencial de activación en la presencia o la ausencia del agente. En algunas realizaciones, los compuestos candidatos pueden ser cribados por tales métodos. Los métodos también pueden incluir la medición de estos parámetros en otras subunidades del canal de calcio que manifiestan dichas diferencias en las cinéticas de activación, incluyendo subunidades en las que un exón NP es añadido o es sustituido por el exón ET.

[0019] Se proporciona el uso de las anteriores composiciones en la preparación de un medicamento, y particularmente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la apoplejía, dolor (por ejemplo, dolor neuropático) lesión cerebral traumática, o una condición que resulte de una afluencia de calcio regulada por voltaje excesiva o insuficiente.

[0020] Estos y otros aspectos de la invención se describen en mayor detalle a continuación.

Breve Descripción de las Figuras

[0021]

La Figura 1 muestra que la presencia de ET en el dominio IVS2-S4 del a1B ralentiza la tasa de activación del canal de Ca del tipo N. La Figura 2 muestra el impacto del empalme alternativo en los conectores S3-S4 de la subunidad a1B en la afluencia de Ca dependiente del potencial de activación en una neurona modelo. La Figura 3 muestra los resultados de un análisis funcional de la mutagénesis de sitio dirigido del sitio de empalme ET en el dominio IVS3-S4 de la subunidad a1B.

Breve Descripción de las Secuencias

[0022]

La SEQ ID NO:1 es la secuencia del nucleótido del sitio “SFVG” IIIS3-S4 del ADNc de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano.

La SEQ ID NO:2 es la secuencia del aminoácido del sitio “SFVG” IIIS3-S4 del polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. La SEQ ID NO:3 es la secuencia del nucleótido del ADNc de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. La SEQ ID NO:4 es la secuencia del aminoácido del polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. La SEQ ID NO:5 es la secuencia del nucleótido del región codificante de un canal de calcio a1B humano que carece del sitio “SFVG” IIIS3-S4 (Estado de la Técnica, número de entrada en el Banco de Genes M94172). La SEQ ID NO:6 es la secuencia del aminoácido de un canal de calcio a1B humano que carece del sitio “SFVG” IIIS3-S4 (Estado de la Técnica, número de entrada en el Banco de Genes M94172). La SEQ ID NO:7 es la secuencia del nucleótido de la región codificante de una canal de calcio a1B humano que carece del sitio “SFVG” IIIS3-S4 (Estado de la técnica, número de entrada en el Banco de Genes M94173). La SEQ ID NO:8 es la secuencia del aminoácido de un canal de calcio a1B humano que carece del sitio “SFVG” IIIS3-S4 (Estado de la técnica, número de entrada en el Banco de Genes M92905). La SEQ ID NO:9 es la secuencia del nucleótido de la región codificante de un canal de calcio a1B de rata que contiene un sitio SFMG (Estado de la técnica, número de entrada en el Banco de Genes M92905). La SEQ ID NO:10 es la secuencia del aminoácido de un canal de calcio a1B de rata que contiene un sitio SFMG (Estado de la técnica, número de entrada en el Banco de Genes M92905). La SEQ ID NO:11 es la secuencia del aminoácido de un péptido de w-conotoxina de C. geographus. La SEQ ID NO:12 es la secuencia del aminoácido de un péptido de w-conotoxina de C. magus. Las SEQ ID NOS:13-28 son cebadores para la PCR y/o la secuenciación.

Descripción Detallada de la Invención

[0023] La presente invención en un aspecto implica la identificación de un ADNc que codifica una nueva isoforma humana del canal de calcio del tipo N, referido en al presente como la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Como se usa en la presente, ha1B+SFVG se refiere a cualquier clon de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano que contiene la secuencia SFVG establecida en la SEQ ID NO:2. La secuencia del nucleótido del inserto de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, el sitio “SFVG” IIIS3-S4, se presenta como la SEQ ID NO:1, y la secuencia del aminoácido del inserto de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, el sitio ”SFMG” IIIS-3-S4, se presenta como la SEQ ID NO:2. Los 12 nucleótidos de la SEQ ID NO:1 son insertados inmediatamente siguiendo la nt 3855 en la secuencia de codificación de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano en el codón que codifica el aminoácido 1237, se tal forma que los cuatro aminoácidos de la SEQ ID NO:2 son insertados en el polipéptido tras el aminoácido 1237 (ver SEQ ID NO:3). La subunidad a1B-b del canal de calcio del tipo N humano estrechamente relacionada, fue depositada en el Banco de Genes bajo los números de entrada M94172 y M94173 (SEQ ID Nos:5 – 8. Una subunidad a1B del canal de calcio del tipo N dde rata relacionada fue depositada en el Banco de Genes bajo el número de entrada M92905 (SEQ ID Nos: 9 y 10). Sorprendentemente, la secuencia del aminoácido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano difiere de la secuencia del aminoácido de rata en el sitio SFVG, cuya secuencia está localizada en un área de la molécula en la que las secuencias del aminoácido humano y de rata son por lo demás idénticas. Esta diferencia de especies en el dominio de la proteína altamente conservado de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es completamente inesperada, y permite el cribado de compuestos que enlazan selectivamente y/o modulan la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Como la presente subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es una variante del empalme de subunidades de todos los canales de calcio del tipo N humano, es aparente que la invención quiere abarcar las variantes de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano que varían por empalme alternativo de secuencias que no sean el inserto SFVG (SEQ ID NO:2). Por ejemplo, la invención abarca polipéptidos que contienen o no contienen un residuo Ala siguiendo inmediatamente al posición 414 del aminoácido de SEQ ID NO:3, o un inserto Glu-Thr (ET in código de una letra en las posiciones de aminoácidos 1557-1558 (ver, por ejemplo, SEQ ID NO:6), así como moléculas de acido nucleico que codifican dichos polipéptidos con variantes de empalme. Como se muestra en los Ejemplos, la subunidad ha1B+SFVG es una parte significativa del canal de calcio a1B expresado en el cerebro humano, y está distribuido diferencialmente en diferentes partes del cerebro. Esto abre la posibilidad del tratamiento selectivo de desordenes que implican a esas partes del cerebro.

[0024] La invención implica en un aspecto los ácidos nucleicos y polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, así como los terapéuticos relacionados con los mismos. La invención también abarca fragmentos de los ácidos nucleicos anteriores, y moléculas que enlazan selectivamente con los ácidos nucleicos y polipéptidos anteriores.

[0025] Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano están aislados. El término “aislado”, como se usa en la presente en referencia a una molécula de ácido nucleico, significa una secuencia de acido nucleico; (i) amplificada in vitro, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa (PCR); (ii) sintetizada por, por ejemplo, síntesis química; (iii) producida recombinantemente por clonación; o (iv) purificada por escisión y separación electroforética o cromatográfica. El término “aislado”, como se usa en la presente en referencia a un polipéptido, significa un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico aislada, así como a polipéptidos sintetizados por, por ejemplo, métodos sintéticos químicos, y a polipéptidos separados de materiales biológicos, y después purificados, usando procedimientos preparatorios o analíticos de proteínas convencionales, en una medida que les permite ser usados de acuerdo a los métodos descritos en la presente.

[0026] Como se usa en la presente un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano son aquellas moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que incluyen la secuencia de SEQ ID NO:2. Las moléculas de ácido nucleico incluyen la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO:1 y las secuencias de nucleótido que difieren de la secuencia de la SEQ ID NO:1 en la secuencia del codón debido a la degeneración del código genético. Los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la invención también incluyen alelos de los ácidos nucleicos anteriores, así como fragmentos de los ácidos nucleicos anteriores, siempre que el alelo o fragmento codifique la secuencia del aminoácido de la SEQ ID NO:2. Tales fragmentos pueden ser usados, por ejemplo, como sondas en ensayos de hibridación y como cebadores en una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano preferidos incluyen la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1.

[0027] Como se usa en la presente la “actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano” se refiere a la capacidad de una molécula de modular la afluencia de calcio regulada por voltaje. Una molécula que inhibe la actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano (una antagonista) es una que inhibe la afluencia de calcio regulada por voltaje por este canal de calcio y una molécula que aumenta la actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano (una agonista) es una que aumenta la afluencia de calcio regulada por voltaje por este canal de calcio. Los cambios en la actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano pueden ser medidos por cambios en la afluencia de calcio regulada por voltaje en ensayos in vitro como los revelados en la presente, incluyendo ensayos de pinzamiento zonal y ensayos que emplean compuestos fluorescentes sensibles al calcio como el fura-2.

[0028] Los alelos de los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la invención pueden ser identificados por técnicas convencionales. Por ejemplo, los alelos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano pueden ser aislados hibridizando una sonda que incluye la SEQ ID NO:1 bajo condiciones rigurosas con una biblioteca de ADNc y seleccionando clones positivos. Así un aspecto de la invención es aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y que hibridizan a una molécula de ácido nucleico consistente de la SEQ ID NO:1 bajo condiciones rigurosas. El término “condiciones rigurosas” como se usa en la presente se refiere a parámetros con los que la técnica es familiar. Los parámetros de hibridación del ácido nucleico se pueden encontrar en referencias que recompilan tales métodos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, y otros, eds., Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y otros, eds., John Wuley & Sons, Inc., Nueva York. Más específicamente, condiciones rigurosas, como se usa en la presente, se refiere, por ejemplo, a la hibridación a 65º C en regulador de hibridación (3,5 x SSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinil pirrolidona, 0,02% de Albúmina de Suero Bovino, 2,5 mM de NaH2PO4 (pH7), 0,5% de SDS, 2mM de EDTA). El SSC es 0,15M de cloruro de sodio/0,15M de citrato de sodio, pH7; el SDS es dodecilsulfato sódico; y el EDTA es ácido etilenediaminetetracético. Tras la hibridación, la membrana sobre la que es transferido el ADN se lava a 2 x SS a temperatura ambiente y después a 0,1 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 65º C.

[0029] Hay otras condiciones, reactivos, y demás que pueden ser usados, que resultan en un grado similar de rigurosidad. El experto en la materia será familiar con tales condiciones, y por lo tanto no se proporcionan aquí. Se debe entender, sin embargo, que el experto en la técnica será capaz de manipular las condiciones de una manera que permita la clara identificación de los alelos de los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la invención. El experto en la técnica también está familiarizado con la metodología para el cribado de células y bibliotecas para la expresión de dichas moléculas que entonces son aisladas rutinariamente, seguido por el aislamiento de la molécula de ácido nucleico pertinente y la secuenciación.

[0030] En el cribado de los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, se puede realizar un Southern blot usando las condiciones rigurosas anteriores, junto con una sonda radioactiva. Tras lavar la membrana a la que el ADN es finalmente transferido, la membrana puede ser colocada contra una película de rayos X para detectar la señal radioactiva.

[0031] Los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano también incluyen ácidos nucleicos degenerados que incluyen codones alternativos a los presentes en los materiales nativos. Por ejemplo, los residuos de serina están codificados por los codones TCA, AGT, TCC, TCG, TCT y AGC Cada uno de los seis codones es equivalente para los propósitos de codificar un residuo de serina. Así, será aparente para alguien de experiencia ordinaria en la técnica que cualquiera de los tripletes de nucleótido que codifican la serina pueden ser empleados para dirigir el aparato de síntesis de la proteína, in vitro o in vivo, para incorporar un residuo de serina en un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano expandido. De manera similar, los tripletes de la secuencia de nucleótido que codifican otros residuos de aminoácido incluyen, pero no están limitados a: CCA, CCC, CCG y CCT (codones de prolina); CGA, CGC, CGT, AGA y AGG (codones de arginina); ACA, ACC, ACG y ACT (codones de treonina); AAC y AAT (codones de asparagina); y ATA, ATC y ATT (codones de isoleucina). Otros residuos de aminoácido pueden ser codificados de manera similar por secuencias de nucleótido múltiples. Así, la invención abarca los ácidos nucleicos degenerados que difieren de los ácidos nucleicos aislados biológicamente en la secuencia del codón debido a la degeneración del código genético.

[0032] La invención también proporciona fragmentos aislados de la SEQ ID NO:3 que incluyen la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO:1. Los fragmentos pueden ser usados como sondas en ensayos Southern blot para identificar tales ácidos nucleicos, o pueden ser usados en ensayos de amplificación como los que emplea la PCR. Los fragmentos menores son aquellos que comprenden 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, ó 75 nucleótidos, y cualquier entero entre ellos y son útiles por ejemplo, como cebadores para los procedimientos de amplificación del ácido nucleico. Como es conocido por aquellos expertos en la técnica, se prefieren sondas más grandes tales como 200, 250, 300, 400 o más nucleótidos para ciertos usos como los Southern blots, mientras que los fragmentos menores serán preferidos para usos como la PCR. Los fragmentos también pueden ser usados para producir proteínas de fusión para generar anticuerpos o determinar el enlace de los fragmentos de polipéptido. De manera similar, los fragmentos pueden ser empleados para producir fragmentos no fusionados de los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, útiles, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos, en inmunoensayos, y similares. Los fragmentos de ácidos nucleicos anteriores además pueden ser usados como moléculas antisentido para inhibir la expresión de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, particularmente para propósitos terapéuticos como se describe en mayor detalle más adelante.

[0033] Un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, en una realización, está operativamente enlazado con una secuencia de expresión de genes que dirige la expresión del ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano dentro de una célula eucariota o procariota. La “secuencia de expresión de genes” es una secuencia de nucleótido regulatoria, como una secuencia de promotor o combinación de potenciador-promotor, que facilita la transcripción y la traducción eficiente del ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano a la que está operativamente enlazada. La secuencia de expresión de genes puede, por ejemplo, ser un promotor viral o mamífero, como un promotor inducible o constitutivo. Los promotores mamíferos constitutivos incluyen, pero no están limitados a, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPTR), adenosina deaminasa, piruvato quinasa, promotor �-actina y otros promotores constitutivos. Promotores virales ejemplares que funcionan constitutivamente en las células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores de virus de simio, virus de papiloma, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarcoma de Rous, citomegalovirus, repetición terminal larga (LTR) o virus de la leucemia murina de Moloney y otros retrovirus, y el promotor de la quinasa de la timidina del virus del herpes simples. Otros promotores constitutivos son conocidos por aquellos con un conocimiento ordinario de la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión de genes de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles son expresados en la presencia de un agente inductor. Por ejemplo, el promotor de la metalotioneína es inducido para promover la transcripción y la traducción en la presencia de ciertos iones de metal. Otros promotores inducibles son conocidos por aquellos con un conocimiento ordinario de la técnica.

[0034] En general, la secuencia de la expresión de genes incluirá, según sea necesario, secuencias 5’ de no transcripción y 5’ de no traducción implicadas con la iniciación de la transcripción y la traducción, respectivamente, como una caja TATA, secuencia de capping, secuencia de CAAT, y similares. Especialmente, dichas secuencias 5’ de no transcripción incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano operativamente unido. Las secuencias de expresión de genes opcionalmente incluyen secuencias potenciadoras o secuencias del activador hacia arriba como se desee.

[0035] Se dice que la secuencia del ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y la secuencia de expresión de genes están “operativamente enlazadas” cuando están enlazadas covalentemente de tal forma que se coloque la transcripción y/o la traducción de la secuencia de codificación de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano bajo la influencia o control de la secuencia de expresión de genes. Se desea que la secuencia de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano sea traducida en una proteína funcional, dos secuencias de ADN se dice que están operativamente enlazadas si la inducción de un promotor en la secuencia de la expresión de genes 5’ resulta en la transcripción de la secuencia de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y si la naturaleza del ligamiento entre las dos secuencias de ADN no

(1) resulta en la introducción de una mutación por cambio de marco de lectura, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, o (3) interfiere con la capacidad de la transcripción de ARN correspondiente para ser traducida en una proteína. Así, una secuencia de expresión de genes. Estará operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano si la secuencia de expresión de genes fuese capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia del ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de tal forma que la transcripción resultante pueda ser traducida en la proteína o el polipéptido deseado.

[0036] El ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y el polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano (incluyendo los inhibidores de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano descritos más adelante) de la invención pueden ser administrados a la célula eucariota o procariota solos o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un “vector” es cualquier vehículo capaza de facilitar: (1) la administración de un ácido nucleico o polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano a una célula objetivo o (2) la captación de un ácido nucleico o polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano por una célula objetivo. Preferiblemente, los vectores transportan el ácido nucleico o polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano dentro de la célula objetivo con degradación reducida en relación a la extensión de la degradación que resultaría en la ausencia de ese vector. Opcionalmente, un “ligando dirigido” puede ser agregado al vector para administrar selectivamente el vector a la célula que expresa en su superficie el receptor cognado (por ejemplo un receptor, un antígeno reconocido por un anticuerpo), para el ligando dirigido. De esta manera, el vector (conteniendo un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano o un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano) puede ser administrado selectivamente a una célula específica. En general, los vectores útiles en la invención están divididos en dos clases: vectores biológicos y vectores físico/químicos. Los vectores biológicos son más útiles para la administración/captación de ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano a/por una célula objetivo. Los vectores físico/químicos son más útiles para la administración/captación de ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano o proteínas de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano a/por una célula objetivo.

[0037] Los vectores biológicos incluyen, pero no están limitados a, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes bacterianas o virales que han sido manipuladas por la inserción o incorporación de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención, y fragmentos de ácido nucleico libres que pueden ser agregados a las secuencias de ácido nucleico de la invención. Los vectores virales son un tipo preferido de vector biológico e incluyen, pero no están limitados a, secuencias de ácidos nucleicos de los siguientes virus: retrovirus como el virus de la leucemia murina de Moloney; virus del sarcoma murino de Harvey; virus de tumor mamario murino, virus del Sarcoma de Rous; adenovirus; virus adenoasociadi; virus del tipo SV40; virus polioma; virus de Epstein-Barr, virus de papiloma; virus de herpes, virus vaccinia, virus de la polio. Uno puede emplear fácilmente otros vectores no conocidos en la técnica.

[0038] Los vectores virales preferidos se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que los genes no esenciales han sido reemplazados con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, el ciclo vital de los cuales implica la transcripción inversa del ARN viral genómico en el ADN con la posterior integración proviral en el ADN celular huésped. En general, los retrovirus son deficientes en la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retroviral genéticamente alterada tienen por lo general utilidad para la transducción de alta eficiencia de genes in vivo. Los protocolos estándar para producir retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo los pasos de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, la transfección de una línea de célula envasada con el plásmido, la producción de retrovirus recombinantes por la línea de célula envasada, la recogida de partículas virales de medios de cultivo de tejido, y la infección de las células objetivo con partículas virales) se proporcionan en Kriegler, M., “Gene Trasnfer and Expression, A Laboratory Manual, “ E.H. Freeman Co. O. Nueva York (1990) y Murry, E.J. Ed. “Methods in Molecular Biology,” vol. 7, Humana Press, Inc., Clifton Nueva Jersey (1991).

[0039] Otro virus preferido para ciertas aplicaciones es el virus adenoasociado, un virus de ADN de doble cadena. El virus adenoasociado puede ser diseñado para ser deficiente en la replicación y es capaz de infectar un amplio rango de tipos de células y especies. Tiene además ventajas, como la estabilidad de disolvente a lípidos y al calor; altas frecuencias de transducción en células de diversas estirpes, incluyendo las células hemopoyéticas; y la carencia de la inhibición de la superinfección permitiendo así series múltiples de transducciones. Según se informa, el virus adenoasociado puede integrarse en un ADN celular humano de una manera específica del sitio, minimizando de este modo la posibilidad de la mutagénesis de inserción y la variabilidad de la expresión de los genes insertados. Además, las infecciones de virus adenoasociados del tipo salvaje han sido seguidas en cultivos de tejido durante más de 100 pasajes en ausencia de presión selectiva, implicando que la integración genómica del virus adenoasociado es un evento relativamente estable. EL virus adenoasociado puede funcionar también de una forma extracromosómica.

[0040] Los vectores de expresión que contienen todos los elementos necesarios para la expresión están comercialemtne disponibles y son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Press, 1989. Las células son genéticamente diseñadas por la introducción en las células de ADN (ARN) heterólogos codificando un polipéptido o fragmento o variante de los mismos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Ese ADN (ARN) heterólogo está localizado bajo el control operativo de elementos transcripcionales para permitir la expresión del ADN heterólogo en la célula huésped.

[0041] Los sistemas preferidos para la expresión del ARNm en las células mamíferas son aquellos como el pRc/CMV (disponible de Invitrogen, Carlsbad, CA) que contienen un marcador seleccionable como un gen que confiere resistencia G418 (lo que facilita la selección de las líneas celulares transfectadas de forma estable) y las secuencias mejoradas por promotor del citomegalovirus humano (CMV). Adicionalmente, el vector pCEP4 (invitrogen) es adecuado para la expresión en líneas celulares caninas o de primate, que contiene un origen de virus Epstein Barr (EBV) de replicación, facilitando el mantenimiento del plásmido como un elemento extracromosómico multicopia. Otro vector de expresión es el plásmido pEF-BOS conteniendo el promotor 1a del Factor de Elongación del polipéptido, lo que estimula eficientemente la transcripción in vitro. El plásmido es descrito por Mishizuma y Nagata (Nuc. Acids Res 18:5322, 1992) y su uso en los experimentos de transfección es revelado por, por ejemplo, Demoulin (Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716, 1996). Todavía otro vector de expresión preferido es un adenovirus, descrito por Stratford-Perricaudet, que es defectuoso para las proteínas E1 y E3 (J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992).

[0042] Además de los vectores biológicos, los vectores químico/físicos pueden ser usados para administrar un ácido nucleico o polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano a una célula objetivo y facilitar de este modo la captación. Como se usa en la presente, un vector “físico/químico” se refiere a una molécula natural o sintética, distintas a las derivadas de fuentes bacteriológicas o virales, capaz de administrar el ácido nucleico o polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano a una célula.

[0043] Un vector químico/físico preferido de la invención es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas, y liposomas. Un sistema coloidal preferido de la invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como un vector de administración in vivo o in vitro. Se ha demostrado que las vesículas unilaminares grandes (LUV), que varían en tamaño de 0,2 – 4,0 1l pueden encapsular macromoléculas grandes. El ARN, el ADN y los viriones intactos pueden ser encapsulados dentro del interior acuoso y ser administrados a células en una forma biológicamente activa (Fraley, y otros, Trends Biochem. Sci., v. 6, p. 77 (1981). Para que un liposoma sea un vector de transferencia de ácidos nucleicos eficiente, deben estar presentes una o más de las siguientes características: (1) la encapsulación del ácido nucleico de interés con gran eficiencia con retención de la actividad biológica; 82) enlace preferencial y sustancial con una célula objetivo en comparación con las células no objetivo; (3) administración de los contenidos acuosos de la vesícula al citoplasma celular objetivo con alta eficiencia; y (4) expresión precisa y efectiva de la información genética.

[0044] Los liposomas pueden ser dirigidos a un tejido particular acoplando el liposoma a un ligando específico como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido, o proteína. Los ligandos que pueden ser útiles para dirigir un liposoma a una célula particular dependerán del tipo de célula o tejido particular. Adicionalmente cuando el vector encapsula un ácido nucleico, el vector puede ser acoplado a un péptido dirigido nuclear, que dirigirá el ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano al núcleo del célula huésped.

[0045] Los liposomas están comercialmente disponibles de Gibo BRL, por ejemplo, como LIPOFECTIMTM y LIPOFECTACETM, que están formados de lípidos catiónicos como el cloruro de N-[1-(2,3 dioleiloxi)-propil]-N,N,Ntrimetilamonio (DOTMA) y el bromuro de dioctadecilamonio dimetil (DDAB). Los métodos también han sido revisados por Gregoriadis, G. en Trends in Biotechnology V. 3, p. 235-241 (1985).

[0046] Otras composiciones ejemplares que pueden ser usadas para facilitar la captación por una célula objetivo de los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano incluyen el fosfato de calcio y otros mediadores químicos de transporte intracelular, composiciones de microinyección, composiciones de recombinación de electroporación y homólogas (por ejemplo, para la integrar un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una localización preseleccionada dentro de un cromosoma celular objetivo).

[0047] La invención también abarca los llamados kits de expresión, que permiten al especialista preparar un vector o vectores de expresión deseados. Dichos kits de expresión incluyen al menos porciones separadas de las secuencias de codificación anteriormente planteadas. Otros componentes pueden ser añadidos, como se desee, mientras que las secuencias anteriormente mencionadas, que son requeridas, sean incluidas.

[0048] También se reconocerá que la invención abarca el uso de secuencias de ADNc de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en vectores de expresión, así como para transfectar células huésped y líneas celulares, siendo estas procariotas (por ejemplo, E. coli), o eucariotas (por ejemplo células COS, sistemas de expresión de levadura y expresión de baculovirus recombinante en células de insecto). Especialmente útiles son las células de mamífero como las humanas, de cerdo, de cabra, primate, etc. Pueden ser de una variedad de tipos de tejido, e incluyen células primarias y líneas celulares. Ejemplos específicos incluyen las células neuronales incluyendo las células PC 12, ovocitos de Xenopus, células madre de medula ósea y células madres embrionarias no humanas. Los vectores de expresión requieren que la secuencia pertinente, es decir, aquellos ácidos nucleicos descritos como supra, estén operativamente enlazados a un promotor.

[0049] La invención también proporciona polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano aislados que incluyen la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2, codificada por los ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano descrito anteriormente. El polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano preferido tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4.

[0050] Se pueden utilizar una variedad de metodologías bien conocidas para los facultativos expertos para obtener moléculas de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano aisladas. El polipéptido puede ser purificado de células que producen naturalmente el polipéptido por medios cromatográficos o por reconocimiento inmunológico. Alternativamente, un vector de expresión puede ser introducido en las células para causar la producción del polipéptido. En otro método, las transcripciones de ARNm pueden ser microinyectadas o introducidas de otra forma en las células para causar la producción del polipéptido codificado. LA traducción del ARNm en extractos libres de células como el sistema lisado de reticulocitos también puede ser usado para producir el polipéptido. Aquellos expertos en la técnica también pueden seguir métodos conocidos para el aislamiento de polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Estos incluyen, pero no están limitados a, inmunocromatografía, HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de afinidad inmune.

[0051] La invención como se describe en la presente tiene un número de usos, algunos de los cuales están descritos en otra parte en la presente. Por ejemplo, la invención permite el aislamiento de moléculas de polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano conteniendo la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:” por ejemplo, la expresión de un acido nucleico recombinante para producir grandes cantidades de polipéptido que pueden ser aisladas usando protocolos estándar. Como otro ejemplo, el aislamiento del gen de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano hace posible para el facultativo diagnosticar un desorden caracterizado por la pérdida de expresión de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Estos métodos implican determinar la expresión del ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, y/o los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano derivados de los mismos. En la situación anterior, dichas determinaciones pueden ser llevadas a cabo por cualquier ensayo de determinación del ácido nucleico estándar, incluyendo la reacción en cadena de polimerasa, o ensayando con sondas de hibridación etiquetadas.

[0052] El ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la invención puede ser usado para preparar un animal transgénico no humano. Un “animal transgénico” es un animal que tiene células que contienen ADN que ha sido insertado artificialmente en una célula, este ADN se vuelve parte del genoma del animal que se desarrolla de esa célula. Los animales transgénicos preferidos son los primates no humanos, ratones, ratas, vacas, cerdos, caballos, cabras, ovejas, perros y gatos. Los animales no humanos adecuados para experimentos transgénicos pueden ser obtenidos de fuentes comerciales estándar como Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY), Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN), etc. Los animales transgénicos que tienen una propiedad particular asociada con una enfermedad particular pueden ser usados para estudiar los efectos de una variedad de fármacos y métodos de tratamiento en la enfermedad, y así sirven como modelos genéticos para el estudio de un número de enfermedades humanas. La invención, por lo tanto, contempla el uso del knockout de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y los animales transgénicos como modelos para el estudio de desordenes que implican la afluencia de calcio regulado por voltaje.

[0053] Una variedad e métodos están disponibles para la producción de animales transgénicos no humanos asociados con esta invención. El ADN puede ser inyectado en el pronúcleo de un óvulo no humano fertilizado antes de la fusión de los pronúcleos masculino y femenino, p inyectado en el núcleo de una célula embrionaria no humana (por ejemplo, el núcleo de un embrión de dos células) tras la iniciación de la división celular. Ver, por ejemplo, Brinster y otrois, Proc Nat. Acad. Sci. USA, 82:4438 (1985), Brinster y otros, Cell 27: 223(1981); Constantini y otros, Nature 294: 982 (1981), Harpers y otros, Nature 293: 540 (1981); Wagner y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 5016 (1981); Gordon y otros, Proc. Nat-Acad. Sci. USA 73:1260 (1976). El óvulo fertilizado es después implantado en el útero del recipiente femenino y se permite que se desarrolle en un animal.

[0054] Un método alternativo para producir animales transgénicos no humanos implica la incorporación de la secuencia del gen deseado en un virus que es capaz de afectar a las células de un animal huésped no humano. Ver, por ejemplo Elbrecht y otros, Molec. Cell. Bio/.7:1276 (1987); Lacey y otros, Nature 322:609 (1986); Leopol y otros, Cell 51: 885 (1987). Los embriones no humanos pueden ser infectados con virus, especialmente retrovirus, modificados para llevar las secuencias del nucleótido de la invención que codifica las proteínas o secuencias de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que desestabilizan el gen de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano nativo para producir un animal knockout.

[0055] Otro método para producir animales transgénicos no humanos implica la inyección de células madres embrionarias no humanas pluripotentes en un blastocito de un embrión en desarrollo. Las células madre pluripotentes derivadas de la masa celular interior de un embrión no humano y estabilizadas en un cultivo pueden ser manipuladas en el cultivo para incorporar secuencias de nucleótido de la invención. Un animal transgénico no humano puede ser producido de tales células a través de la implantación en un blastocito que está implantado en una madre adoptiva y se permite que llegue a término. Ver, por ejemplo, Robertson y otros, Cold Spring Harbor Conference Cell Proliferation 10:647 (1983); Bradley y otros, Nature 309: 255 (1984); Wagner y otros, Cold Spring Harbor Symposium Quantitative Biology 50: 691 (1985).

[0056] Los procedimientos para la manipulación de embriones de roedores y para la microinyección de ADN en los pronúcleos del zigoto son bien conocidos para aquellos con conocimientos ordinarios de la técnica (Hogan y otros, supra).Los procedimientos de microinyección para pescado, huevos de anfibio y pájaros están detallados en Houdebine y Chourrout, Experientia, 47: 897-905 (1991). Otros procedimientos para la introducción de ADN en tejidos de animales de describen en la Patente U.S. Nº 4.945.050 (Sandford y otros, 30 de Julio de 1990).

[0057] A modo de ejemplo solamente, para preparar un ratón transgénico, ratones hembra son inducidos a superovular. Las hembras son colocadas con machos, y las hembras copuladas son sacrificadas por asfixia por CO2

o dislocación cervical y los embriones son recuperados de oviductos extirpados. Las células cumulo circundantes son retiradas. Los embriones pronucleares son entonces lavados y almacenados hasta el momento de la inyección. Aleatoriamente los ratones hembra adultos en ciclo son emparejados con machos vasectomizados. Las hembras recipiente son copuladas al mismo tiempo que las hembras donantes. Los embriones son después transferidos quirúrgicamente, El procedimiento para generar ratas transgénicas es similar al de los ratones. Ver Hammer y otros, Cell 63: 1099-112 (1990).

[0058] Los métodos para el cultivo de células madre (ES) embrionarias no humanas y la posterior producción de animales transgénicos no humanos por la introducción de ADN en células ES no humanas usando métodos como la electroporación, la precipitación de ADN/fosfato de calcio y la inyección directa también son bien conocidas para aquellos con conocimientos ordinarios de la técnica. Ver, por ejemplo, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., IRL Press (1987).

[0059] En casos que implican la integración de genes aleatoria, un clon que contiene la(s) secuencia(s) de la invención es contransfectado con una resistencia codificando al gen. Alternativamente, de neomicina que codifica al gen está físicamente enlazada a la(s) secuencia(s) de la invención. La transfección y el aislamiento de los clones deseados son llevadas a cabo por cualquiera de los varios métodos bien conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios de la técnica (E.J. Robertson, supra).

[0060] Las moléculas de ADN introducidas en células ES no humanas pueden también ser integradas en el cromosoma a través del proceso de recombinación homóloga. Capecchi, Science, Science, 244; 1288-1292 (1989). Los métodos para la selección positiva del evento de recombinación (por ejemplo neo resistencia) y selección positiva-negativa dual (por ejemplo, neo resistencia y resistencia ganciclovir) y la posterior identificación de los clones deseados por PCR han sido descritos por Capecchi, supra y Joyner y otros, Nature, 338: 153-156 (1989). La fase final del procedimiento es inyectar células ES no humanas objetivo en los blastocitos y transferir los blastocitos en las hembras seudoembarazadas. Los animales quiméricos resultantes son criados y la descendencia es analizada por Southern blotting para identificar los individuos que portan el transgén.

[0061] Los procedimientos para la producción de mamíferos no roedores y otros animales han sido abordados por otros. Ver Houdebine y Chourrout, supra; Pursel y otros, Science 244: 1281-1288 (1989); y Sims y otros, Bo/TEchnology, 6: 179-183 (1988).

[0062] La inactivación o el reemplazo de del gen de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano endógeno se puede conseguir por un sistema de recombinación homóloga usando células madre embrionarias no humanas. Los mamíferos (preferiblemente primates) no humanos transgénicos resultantes que tienen una característica de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano interrumpida pueden ser hechos transgénicos para la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y usados como un modelo para compuestos de cribado como moduladores (agonistas o antagonistas/inhibidores) de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. De esta manera, se pueden identificar tales fármacos terapéuticos.

[0063] Adicionalmente, una versión normal o mutante de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano puede ser insertada en la línea germinal del ratón (o el animal) para producir animales transgénicos no humanos que constitutivamente o por inducción expresan la forma normal o mutante de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Estos animales son útiles en estudios para definir el papel y función de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en las células. Estos estudios son particularmente útiles en animales, que no expresan normalmente la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, como los no primates.

[0064] Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, o un fragmento del mismo, también puede ser usado para aislar los patrones de enlace nativos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, incluyendo, por ejemplo, el canal de calcio del tipo N. El aislamiento de tales patrones de enlace puede ser realizado de acuerdo a métodos bien conocidos. Por ejemplo, los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano aislados pueden ser unidos a un sustrato (por ejemplo, un medio cromatográfico, como cuentas de poliestireno, o un filtro), y después se puede aplicar una solución que se sospecha que contiene el canal de calcio del tipo N al sustrato. Si un canal de calcio del tipo N que puede interactuar con los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano está presente en la solución, entonces enlazará con el polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano enlazado con el sustrato.

El canal de calcio del tipo N después puede ser aislado. Otros polipéptidos que son parejas de enlace para la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano pueden ser aislados por métodos simialres sin experimentación excesiva.

[0065] Las composiciones de la invención son también útiles para propósitos terapéuticos.

[0066] La invención además proporciona métodos in vitro para aumentar la actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula.

[0067] La invención también abarca un método in vitro para aumentar la expresión de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula o sujeto. Es deseable aumentar la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en un sujeto que tienen un desorden caracterizado por una deficiencia en la afluencia de calcio regulada por voltaje. La cantidad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano puede ser aumentada en dicha célula o sujeto poniendo en contacto la célula, o administrando al sujeto, un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano o un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la invención al sujeto en una cantidad efectiva para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula o el sujeto. Un aumento en la actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano puede ser medida por los ensayos descritos en la presente, por ejemplo ensayos de afluencia de calcio.

[0068] Las composiciones en el presente caso son administradas en cantidades efectivas. Una cantidad efectiva es esa cantidad de una preparación farmacéutica que sola, o junto con dosis adicionales, produce la respuesta deseada. En el caso de tratar una condición caracterizada por la afluencia de calcio regulada por voltaje anormal, la respuesta deseada es reducir o aumentar la afluencia de calcio a un nivel que esté dentro del intervalo normal. Preferiblemente, el cambio en la afluencia de calcio produce una reducción detectable en una función fisiológica relacionada con la condición, por ejemplo, una reducción en la neurotoxicidad tras una apoplejía. Las respuestas pueden ser monitorizadas por métodos rutinarios. En el caso de una condición donde se desea un aumento en la afluencia de calcio regulada por voltaje, una cantidad efectiva es esa cantidad necesaria para aumentar la mencionada afluencia en el tejido objetivo. Lo opuesto es el caso cuando se desea una reducción en la afluencia. Un aumento o disminución en la liberación del neurotransmisor también podría ser medida para monitorizar la respuesta.

[0069] Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la condición particular que está siendo tratada, la severidad de la condición, los parámetros individuales del paciente incluyendo la edad, condición física, tamaño y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y pericia del profesional de la salud. Se prefiere de manera general que se use una dosis máxima, que es, la dosis más alta segura de acuerdo al juicio médico razonable. Se entenderá por aquellos con conocimientos ordinarios de la técnica, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis más baja o dosis tolerable por razones médicas, razones fisiológicas o por virtualmente cualquier otra razón.

[0070] Generalmente, las dosis de compuestos activos serán de alrededor de 0,01 mg/kg por día a 1000 mg/kg por día. Se espera que las dosis que van desde 50-500 mg/kg sean adecuadas y en una o varias administraciones por día. Resultarán dosis más bajas de otras formas de administración, como administración intravenosa. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente en la dosis inicial aplicada, se pueden emplear dosis más altas (o dosis eficazmente más altas por una vía de administración diferente, más localizada) en la medida que lo permita la tolerancia del paciente. Se contemplan múltiples dosis por día para conseguir los niveles sistémicos apropiados del compuesto, a pesar de que se darán típicamente menos dosis cuando los compuestos son preparados como medicaciones de liberación lenta o de liberación sostenida.

[0071] Cuando se administran, las preparaciones farmacéuticas de la invención son aplicadas en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. Dichas preparaciones pueden rutinariamente contener sales, agentes reguladores, conservantes, portadores compatibles, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales no farmacéuticamente aceptables pueden ser convenientemente usadas para preparar sales farmacéuticamente de las mismas y no están excluidas del ámbito de la invención. Dichas sales farmacológicamente y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitadas a, las preparadas de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, masónico, succínico, y similares. También, las sales farmacéuticamente acepatables pueden ser preparadas de metales alcalinos o sales de metales alcalinos, como las sales de sodio, de potasio o de calcio.

[0072] Los ácidos nucleicos y los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano útiles de acuerdo a la invención pueden ser combinados, opcionalmente, con un portador farmacéuticamente aceptable. El término “portador farmacéuticamente aceptable” como se usa en la presente significa uno o más cargadores, diluyentes o sustancias encapsuladoras sólidos o líquidos aceptables que son adecuadas para la administración en un humano. El término “portador” denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo par facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de ser co-mezclados con las moléculas de la presente invención, y entre sí, de una manera tal que no hay interacción que podría perjudicar sustancialmente la eficacia farmacéutica desada.

[0073] Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes reguladores adecuados, incluyendo ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; y ácido fosfórico en una sal.

[0074] Las composiciones farmacéuticas pueden también contener, opcionalmente, conservantes adecuados, como: cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos y timerosal.

[0075] Están disponibles una variedad de vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del compuesto particular seleccionado, la severidad de la condición que está siendo tratada y de la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de la invención, hablando de forma general, pueden ser practicados usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, significando cualquier modo que produce niveles efectivos de los compuestos activos sin causar unos efectos adversos clínicamente inaceptable. Tales modos de administración incluyen vías orales, rectales, tópicas, nasales, intradérmicas, o parenterales. El término “parenteral” incluye subcutáneo, intravenoso, intratecal, intramuscular, o infusión. Las vías intravenosas o intramusculares no son particularmente adecuadas para la terapia a largo plazo y la profilaxis.

[0076] Las composiciones farmacéuticas pueden ser presentadas convenientemente en una forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen el paso de llevar el agente activo a una asociación con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. De manera general, las composiciones son preparadas llevando uniformemente y cercanamente al compuesto activo en asociación con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, dar forma al producto.

[0077] Las composiciones adecuadas para la administración oral pueden ser presentadas como unidades discretas, como capsulas, comprimidos, pastillas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del compuesto activo. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o en líquidos no acuosos como un jarabe, elixir o una emulsión.

[0078] Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril del inhibidor de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano o de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, que es preferiblemente isotónica con la sangre del recipiente. Esta preparación acuosa puede ser formulada de acuerdo a métodos conocidos usando agentes humectantes o dispersores adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralemente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución 1,3-butano diol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden ser empleados están el agua, la solución de Ringer, y la solución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijos, estériles son empleados convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito se puede emplear cualquier aceite fijo suave incluyendo los mono o di glicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico pueden ser usados en la preparación de los inyectables. La formulación del portador adecuada para las administraciones oral, subcutánea, intravenosa, intratecal, intramuscular, etc. se pueden encontrar en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

[0079] Otros sistemas de administración pueden incluir sistemas de administración por tiempo, administración retardada, o administración sostenida como los vectores biológicos/químicos comentados anteriormente. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas del compuesto activo., aumentando la comodidad al sujeto y al facultativo. Están disponibles y son conocidos por aquellos con un conocimiento ordinario de la técnica muchos tipos de sistemas de administración. Puede ser deseable el uso de un implante de liberación sostenida a largo plazo. La liberación a largo plazo, como se usa en la presente, supone que el implante está construido y dispuesto para la liberación de niveles terapéuticos del ingrediente activo por al menso 30 días, y preferiblemente 60 días. Los implantes de liberación sostenida a largo plazo son bien conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios de la técnica e incluyen algunos de los sistemas de liberación descritos anteriormente.

[0080] La invención proporciona además métodos eficientes para identificar agentes farmacológicos de compuestos principales para agentes útiles en el tratamiento de condiciones asociadas con la afluencia de calcio regulada por voltaje anormal mediada por la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y los compuestos y agentes así identificados. De manera general, los métodos de cribado implican ensayos para compuestos que inhiben o potencian la afluencia de calcio regulada por voltaje a través de los canales de calcio del tipo N humanos. Dichos métodos son adaptables a cribados de alto rendimiento, automatizados de compuestos. Ejemplos de dichos métodos se describen en la patente US 5.429.921.

[0081] Se proporcionan una variedad de ensayos para agentes farmacológicos, incluyendo, ensayos de enlace de proteínas in Vitro etiquetados, ensayos de afluencia de Ca2+, etc. Por ejemplo, se usan pantallas de enlace de proteínas para examinar rápidamente el enlace de los agentes farmacológicos candidatos con una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. Los agentes farmacológicos candidatos pueden derivar de, por ejemplo, bibliotecas de péptidos combinatorios. Los reactivos convenientes para dichos ensayos son bien conocidos en la técnica. Un ensayo basado en células de la afluencia de calcio ejemplar implica poner en contacto una célula neuronal que tiene una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano con una agente farmacológico candidato bajo condiciones mediante las cuales la afluencia de calcio puede ser estimulada por la aplicación de un voltaje al sistema de prueba, es decir, por despolarización de la membrana. Las condiciones específicas son bien conocidas en la técnica y se describen en Lin y otros, Neuron 18:153-166, 1997, y en la patente US 5.429.921. Una reducción en la afluencia de calcio regulada por voltaje en la presencia del agente farmacológico candidato indica que el agente farmacológico candidato reduce la inducción de la afluencia de calcio de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en respuesta al estímulo por voltaje. Un aumento en la afluencia de calcio regulada por voltaje en la presencia del agente farmacológico candidato indica que el agente farmacológico candidato aumenta la inducción de la afluencia de calcio de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en respuesta al estímulo por voltaje. Los métodos para determinar los cambios en la concentración de calcio intracelular son conocidos en la técnica y están abordados en otras partes de la presente.

[0082] La subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano usada en los métodos de la invención puede ser añadida a una mezcla de ensayo como un polipéptido aislado (donde se va a medir el enlace de una agente farmacéutico candidato) o como una célula u otro espacio encapsulado por membrana que incluye un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano. En la última configuración de ensayo, la célula u otro espacio encapsulado por membrana puede contener la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano como un polipéptido precargado o como un ácido nucleico (por ejemplo, una célula transfectada con un vector de expresión que contiene una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano). En los ensayos descritos en la presente, el polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano puede ser producido de manera recombinante, o aislado de extractos biológicos, pero preferiblemente es sintetizada in Vitro. Los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano abracan proteínas quiméricas que comprenden una fusión de un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano con otro polipéptido, por ejemplo, un polipéptido capaz de proporcionar o mejorar el enlace proteína-proteína, o mejorar la estabilidad del polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano bajo condiciones de ensayo. Un polipéptido fusionado con un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano

o fragmento del mismo puede también proporcionar medios o detectar fácilmente la proteína de fusión, por ejemplo, por reconocimiento inmunológico o por etiquetado fluorescente.

[0083] La mezcla de ensayo también comprende un agente farmacológico candidato, Típicamente, se realizan una pluralidad de mezclas de análisis en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener un respuesta diferente a las varias concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a la concentración cero del agente o a la concentración del agente por debajo de los límites de detección del ensayo. Los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, a pesar de que típicamente son compuestos orgánicos. Preferiblemente, los agentes farmacológicos candidatos son compuestos orgánicos pequeños, es decir, aquellos que tienen un peso molecular de más de 50 pero de menos de alrededor de 2500. Los agentes candidatos comprenden grupos químicos funcionales necesarios para las interacciones estructurales con polipéptidos, y típicamente incluyen al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales y más preferiblemente al menos tres de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender la estructura heterocíclica o de carbón cíclica y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales identificados anteriormente. Los agentes candidatos también pueden ser biomoléculas como los péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroles, isopreoides, purinas, pirimidinas, derivativos o análogos estructurales de los anteriores, o combinaciones de los mismos o similares. Donde el agente es un ácido nucleico, el agente típicamente es una molécula de ADN o ARN, a pesar de que también se contemplan los ácidos nucleicos modificados que tienen enlaces o subunidades no naturales.

[0084] Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos y biomoléculas orgánicos, incluyendo expresiones de oligonucleotidos aleatorizados, bibliotecas combinatoriales orgánicas sintéticas, bibliotecas de muestra de fagos de péptidos aleatorios, y similares. Alternativamente, están disponibles o son fácilmente producidas bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Adicionalmente, las bibliotecas y los compuestos producidos natural y sintéticamente pueden ser fácilmente modificados a través de medios químicos, físicos, y bioquímicos. Además, los agentes farmacológicos conocidos pueden ser sometidos a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias como la acilación, alquilación, esterificación, acidificación, etc. para producir análogos estructurales de los agentes. Los agentes candidatos pueden ser seleccionados aleatoriamente o pueden basarse en compuestos existentes que enlazan con y/ modulan la función de los canales de calcio del tipo

N. Por ejemplo, los compuestos que se conoce que inhiben los canales de calcio de tipo N incluyen el fluspirileno, la ziconotida (SNX-111), los péptidos de w-conotoxina GVIA (SEQ ID NO: 11) y MVIIA (SEQ ID NO: 12), así como inhibidores del canal de calcio de moléculas orgánicas pequeñas, como la fluspirilina, NNC 09-0026(-)-trans-I-butil-4(4-dimetilaminofenilo)-3-[(4trifluorometil-fenoxi) metil] piperidinadihidrocloruro); SB 201823-A (4-[2-(3,4diclorofenoxi)etil]-1-pentilo piperidinahidrocloruro) NS 649 (2-amino-1-(2,5-dimetoxifenil)-5-trifluorometil benzimidazol); CNS 1237 (N-acebaftil-N’-4-metoxinafto-1-yl guanidina) y el riluzol. Por lo tanto, una fuente de agentes candidatos son las bibliotecas de moléculas basadas en los inhibidores del canal de calcio del tipo N anteriores, en los que la estructura del inhibidor se cambia en una o más posiciones de la molécula que contiene más o menos restos químicos o restos químicos diferentes. Los cambios estructurales hechos en las moléculas al crear las bibliotecas de inhibidores análogos pueden ser sustituciones y/ adiciones dirigidos, aleatorios, o una combinación de tanto dirigidas como aleatorias. Alguien con un conocimiento ordinario de la técnica de la preparación de bibliotecas combinatorias puede fácilmente preparar dichas bibliotecas en base a los inhibidores del canal de calcio del tipo N existentes.

[0085] Una variedad de otros reactivos también pueden ser incluidos en la muestra. Estos incluyen reactivos como sales, reguladores, proteínas neutras (por ejemplo, albúmina), detergentes, etc. que pueden ser usados para facilitar el enlace proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico óptimo. Tal reactivo puede también reducir las interacciones no específicas o de fondo de los componentes de reacción. También se pueden usar otros reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo como los inhibidores de la proteasa, inhibidores de la nucleasa, agentes antimicrobianos y similares.

[0086] La mezcla de los materiales de ensayo precedentes se incuba bajo condiciones mediante las cuales, peo por la presencia del agente farmacológico candidato, la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano transduce una cantidad de control de la afluencia de calcio regulada por voltaje. Para determinar el enlace de un agente farmacéutico candidato con una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, la mezcla se incuba bajo condiciones que permiten el enlace. El orden de adición de los componentes, temperatura de incubación, tiempo de incubación, y otros parámetros del ensayo se pueden determinar fácilmente. Dicha experimentación meramente implica la optimización de los parámetros del ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Las temperaturas de incubación están típicamente entre 4º C y 40º C. los tiempos de incubación preferiblemente son minimizados para facilitar el cribado de alto rendimiento rápido, y típicamente están entre 1 minuto y 10 horas.

[0087] Tras la incubación, el nivel de la afluencia de calcio regulada por voltaje o el nivel del enlace específico entre el polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y el agente farmacéutico candidato se detecta por cualquier método conveniente disponible para el usuario. Para los ensayos del tipo enlace libre de células, se usa a menudo un paso de separación para separar los componentes enlazados de los no enlazados. El paso de separación puede ser realizado de una variedad de formas. Convenientemente, al menos uno de los componentes es inmovilizado en un sustrato sólido, del que los componentes no enlazados pueden ser fácilmente separados. El sustrato sólido puede estar hecho de una amplia variedad de materiales y en una amplia variedad de formas, por ejemplo, placas de microtitulación, microesferas, varillas, partícula de resina, etc. El sustrato es preferiblemente elegido para maximizar las proporciones de la señal al ruido, primordialmente para minimizar el enlace de fondo, así como para facilitar la separación y el coste.

[0088] La separación puede ser efectuada por ejemplo, retirando una cuenta o varilla de un depósito, vaciando o diluyendo un depósito como un pocillo de una placa de micrititulación, aclarando una cuenta, partícula, columna cromatográfica o filtro con una solución o solvente de lavado. El paso de separación preferiblemente incluye múltiples aclarados o lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de microtitulación, los pocillos pueden ser lavados varias veces con una solución de lavado, que típicamente incluye aquellos componentes de la mezcla de incubación que no participan en los enlaces específicos como las sales, reguladores, detergentes, proteínas no específicas, etc. Donde el sustrato sólido es una cuenta magnética, las cuentas pueden ser lavadas una o más veces con una solución de lavado y aisladas usando un imán.

[0089] La detección puede ser efectuada de cualquier manera conveniente para ensayos basados en células como un ensayo de afluencia de calcio. La afluencia de calcio resultante del estímulo del voltaje del polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano típicamente altera un producto directa o indirectamente detectable, por ejemplo una molécula sensible al calcio como la fura-2-AM. Para ensayos de enlace de células libres, uno de los componentes habitualmente comprende, o está acoplado con, una etiqueta detectable. Se pueden usar una amplia variedad de etiquetas, como aquellas que proporcionan detección directa (por ejemplo, radioactividad, luminiscencia, densidad óptica o de electrones, etc.) o detección indirecta (por ejemplo, etiqueta de epítopos como el epítopo FLAG, etiqueta de enzimas como peroxidas de rábano picante, etc.) La etiqueta puede estar enlazada con un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano o con el agente farmacológico candidato.

[0090] Se pueden usar una variedad de métodos para detectar la etiqueta, dependiendo de la naturaleza de la etiqueta y otros componentes del ensayo. Por ejemplo, la etiqueta puede ser detectada durante el enlace con el sustrato sólido o posteriormente a la separación del sustrato sólido. Las etiquetas pueden ser directamente detectadas a través de la densidad óptica o de electrones, emisiones radioactivas, transferencias de energía no radiactivas, etc. o detectadas indirectamente con conjugados de anticuerpos, conjugados de estreptavidina-biotina, etc. Los métodos para detectar las etiquetas son bien conocidos en la técnica.

[0091] La invención será más completamente entendida por la referencia a los ejemplos siguientes. Estos ejemplos, sin embargo, están destinados meramente a ilustrar las realizaciones de la invención y no se interpretará que limitan el ámbito de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Análisis de las variantes de empalme del canal de calcio de tipo N del cerebro humano

[0092] La abundancia de variantes de empalme de los canales de calcio del tipo N en el cerebro humano fue determinada usando análisis de reacción en cadena de polimerasa y ensayos de protección de RNasa como se describe en Lin y otros (Neuron 18:153-166, 1997). Los clones de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano fueron secuenciados por métodos estándar de secuenciación de nucleótidos y se determino que un tipo de los clones tenía 12 insertos de nucleótido (SEQ ID NO:1) en comparación con las secuencias de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano previamente publicadas. L presente molécula de ácido nucleico de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano (designada ha1B+SFVG) corresponde con la secuencia de nucleótido publicada para las subunidades a1B del canal de calcio del tipo N humano con 12 insertos de nucleótido localizados tras el nucleótido 3855 (como se ha numerado en Williams y otros, Science 257:389-395, 1992). La secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 proporciona la tercera base del codón que codifica el Ser1237, tres nuevos codones (Ser1238, Phe1239 y Val1240), y las primeras dos bases del codón Gly1241, como se muestra en la SEQ ID NO:3: tcG AGC TTC GTG GGa (inserto en caperuzas). Este inserto codifica de este modo un inserto de cuatro aminoácidos en la proteína que es similar, pero sorprendentemente no es idéntico, a los aminoácidos 12361239 de una subunidad a1B del canal de calcio del tipo N de rata (SEQ ID NO:10, número de entrada en el banco de genes M92905). Se descubrió que la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano forma una parte significativa del ARNm de las subunidades a1B del canal de calcio del tipo N en el cerebro humano. También se determinó que la subunidad ha1B+SFVG fue distribuida diferencialmente en diferentes partes del cerebro, por ejemplo en ciertas partes del cerebro la ha1B+SFVG fue expresada más altamente que en otras partes del cerebro

Ejemplo 2: Construcción de ácidos nucleicos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano

[0093] La subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que contienen el inserto SFVG se construye de acuerdo a los procedimientos estándar descritos en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel y otros, John Wiley & sons, Inc., Nueva York), usando cebadores PCR que contienen los nucleótidos que codifican el SFVG (por ejemplo, SEQ ID NO:1) para amplificar el ácido nucleico de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano publicado. Los fragmentos generados por la PCR son después montados por ligación para preparar un ADNc completo que codifica la subunidad ha1B+SFVG humana.

Ejemplo 3: Función de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano

[0094] La actividad del canal de calcio regulada por voltaje de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano se prueba usando los métodos descritos en Lin y otros (1997) para una subunidad del canal de calcio del tipo N de rata, y se describen en el Ejemplo 4 más adelante.

Ejemplo 4: Activación de diferencias en los canales de calcio del tipo N de rata ±el exón ET

Valoración funcional de los constructos dl ADNc de la a1B del canal de calcio

[0095] Las propiedades funcionales de todos los constructos del ADNc de la a1B del canal de calcio (ca) descritos en este escrito fueron evaluados en el sistema de expresión del ovocito Xenopus. Todos los métodos y procedimientos fueron esencialmente los mismos que los descritos en Lin y otros (1997). Los ARNcs fueron transcritos in vitro usando el kit mMESSAGE mMACHINE (Ambion de los carios constructos del ADNc de la a1B subclonados en el vector de expresión Xenopus l-globina (pBSTA: Goldin & Sumikawa y otros, Methods Enzymo.I 207:279-297, 1992). Se inyectaron 46 nl de una solución de ARNc de 750 ng/1l en ovocitos desfoliculados usando un nanoinyector de precisión (Drummond). Las corrientes del canal de CA tipo N fueron registradas 6-7 días después de la inyección. Al menos 15 minutos antes del registro, los ovocitos fueron inyectados con 46 nl de una solución de 50mM de BAPTA (1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’tetraacetato). Encontramos esto crítico para minimizar la activación de una corriente de Cl- activada por Ca2+ endógena, incluso cuando el Ba2+ es el portador de la carga (Lin y otros, 1997). Las células que mostraron corrientes en los extremos, indicativo de la presencia de la activación dependiente de Ba2+ de la corriente de Cl- activada por Ca, fueron excluidas del análisis.

[0096] Las corrientes del canal de Ca2+ del tipo N fueron registradas de ovocitos usando la técnica de registro regulada por voltaje de microelectrodos amplificador Warner; OC-725b). Un circuito de tierra virtual eliminó la necesidad de la compensación de la resistencia en serie cando se registraban corrientes grandes. Se usaron micropipetas de 0,8-1,5 MO y de 0,3-0,5 MO de resistencia cuando se llenaban con 3 M de KCl para los electrodos de registro del voltaje y de la corriente, respectivamente. Los ovocitos que expresaban corrientes del canal de Ca2+ habitualmente tenían potenciales de la membrana en reposo de entre -40 y -50 mV cuando se traspasaban con dos electrodos. Se colocó un refuerzo de metal conectado a tierra entre los dos electrodos para aumentar el tiempo de asentamiento de la grapa. Las soluciones de registro contenían 5 mM de BaCl2, 85 mM de tetraetilamonio, 5mM de KCl, y 5 mM de HEPES (pH ajustados a 7,4 con ácido metanosulfónico). La temperatura de registro estaba entre 19º C y 22º C.

[0097] Las propiedades de cada constructo mutante fueron valoradas expresándolo junto con los controles apropiados (LETa1B y +ET a1B). Cada mutante fue probado en tres lotes separados de ovocitos y dentro de cada lote, los registros fueron hechos de al menos seis ovocitos para cada constructo y control mutante. Los registros de los ovocitos que expresan varios constructos de la a1B del canal de Ca fueron aleatorizados a lo largo del periodo de recogida de datos.

Análisis de Datos.

[0098] Los datos fueron adquiridos on-line y la pérdida sustraída usando un protocolo P/4 (PClampV6.0; Axon Inst.). Los escalones del voltaje fueron aplicados cada 10-30 segundos dependiendo de la duración del escalón, de un potencial de retención de -80 mV. Las corrientes del canal de Ca registradas bajo estas tres condiciones mostraron poco deterioro durante la duración de los registros. Se obtuvieron tres ajustes de relaciones corriente voltaje de cada célula usando despolarizaciones por escalón de 26,3 ms, 650 ms y 2,6 s de duración y digitalizadas a 25 kHz, 10 kHZ y 250 Hz, respectivamente. Las curvas exponenciales (activación e inactivación) fueron ajustadas a los datos usando rutinas de ajuste de curvas en el PClamp (Axon Instr.) y el Origin (Microcal). Se estimaron las constantes del tiempo de inactivación en el intervalo de 70-800 msec de las corrientes evocadas por la despolarización más larga (2,6 s). Las constantes del tiempo de activación fueron mejor resueltas de las corrientes evocadas por las despolarizaciones más cortas (26,3 ms; muestreada a 25 kHz).

Modelado de la entrada de Ca.

[0099] Se usó un modelo celular de un compartimiento empleando las técnicas de modelado compartimental estándar en NEURON (Hines & Carnevale, Neural Comput. 9:1179-1209, 1997) para predecir la cantidad de Ca que entra en una neurona expresando o la ma1B-b o las corrientes de calcio de Ca del tipo N ma1B-b.La célula tenía un área de membrana total de 1250 1m2, una capacidad de membrana específica de 0,75 1F/cm2 y una resistencia de membrana específica de 30 kOcm2. Para la simulación del potencial de acción se incluyeron una conductancia de sodio rápida (gNa) y una conductancia de potasio de rectificación retardada (gK,DR) (Mainen & Sejnowski, Science 268:1503-1506, 1995) cada una con densidades de 300 pS/1m2. La afluencia de Ca2+ fue mediada por una conductancia de clacio rápida (gCa; Yamada y otros, Multiple channels and calcium dynamics. In methods in Neuronal Modeling, Koch, C. & Segev, I. Eds. Pp 97-134, 1989) con una densidad de 1 pS/1m2. Las corrientes resultantes fueron calculadas usando esquemas cinéticos Hodgkin-Huxley convencionales de acuerdo a la fórmula proporcionada más adelante. El potencial de la membrana en reposo se estableció a -70 mV y los potenciales inversos de corriente de Na y K a +50 mV y -75 mV, respectivamente. EL canal de calcio fue computado usando la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz. La concentración de Ca extracelular fue de 2,5 mM y la concentración de Ca intracelular computada usando la entrada por el ICa y la retirada por una bomba de primera orden d[Ca2+]i/dt=(1x105.ICa/2F)-([Ca2+]i-[Ca2+]r)/TR,donde [Ca2+]r = 10 nM y TR = 80 ms. Las constantes temporales y las conductancias máximas fueron desarrolladas a temperatura ambientes y fueron por lo tanto puestas a escala a 37º C usando un Q10 de 2,3.

Las fórmulas usadas para el cálculo de carias corrientes fueron las siguiente:

Corriente de sodio (Ina), m3·h: am, Na = 0.182·(v + 25)/(I-e(v+25)/9); �m, Na = -0.124·(v+25)/(1-e-(v+25)/9) ah, Na = 0.024·(v + 40)/(l-e-(v+40)/5); �h, Na = -0.0091·(v+65)/(1-e-(v+65)/5); hr, Na = 1/(1-e-(v+55/6.2)

Rectificador retardado (IK(DR)), m: am, K(DR) = 0.02·(v-25)/(1-e-(v+25)/9); �m, K(DR) = -0.002-(v - 25)/(1-e(v+25)/9)

Corriente de calcio de tipo N, de alto umbral (Ica), m·h: mr, Ca = 1/(1+e-(v-3)/8);

Tm, Ca = 7.8/(e(v+6)/16); hCa = K/(K+[Ca2+]i) con K = 0.01 mM.

[0100] La forma predominante en el cerebro, ma1B-d, fue después modelada cambiando la dependencia del voltaje de la variable de activación de la conductancia del canal de Ca del tipo N (mr,Ca) por -7 mV, y disminuyendo la constante del tiempo de activación (Tm, Ca) en un 33% (Lin y otros, 1997 y ver la Figura 1A).

Ensayo de protección de la ribonucleasa.

[0101] Los procedimientos son esencialmente los mismos que los descritos en Lin y otros (1997). El ARN total fue purificado de varios tejidos neuronales de ratas adultas usando tiocanato de guanadino y el protocolo de extracción de fenol-cloroformo (adaptado de Chomczynski & sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159, 1987). Se construyeron sondas de ARN antisentido etiquetadas 32P superponiendo al ET (nt 4379-4836) en la ma1B-b y al NP (nt4605-4930) en la rba1A (Starr y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5621-5625, 1991) de plásmidos linealizaods (vector pGEM-T) conteniendo subclones derivados del RT-PCR apropiados usando el kit Maxi-script (Ambion). Las sondas fueron purificadas con gel y almacenadas como precipitados de etanol. Se precipitaron 1 1g de ARN purificado de ganglios simpáticos o sensoriales o 5 1g de ARN aislado de varios tejidos CNS con 2 x 105 cpm de sonda y se resupendieron en 30 1l de regulador de hibridación conteniendo: 60% de formamida; 0,4 M de NaCl; 10 mM de EDTA y 40mM de PIPES a pH de 6,4. Las muestras fueron desnaturalizadas a 85º C y se permitió que hibridizaran durante toda la noche a 60º C. Las muestras fueron después asimiladas en 350 1l de mezcla de reacción conteniendo 0,3 M de NaCl, 5mM de EDTA, 3,5 1l de combinado de RNasa (Ambion) y 10 mM de tris a pH 7,5, después se trataron con proteinasa K, se extrajeron y precipitaron con 10 1g de ARNt como portador. Tras la resuspensión en 30 1l de formamida cargando regulador, las muestras fueron desnaturalizadas y separadas en un gel con un 5% de poliacrilamida. Tras la exposición a una placa de imagen de fósforo para cuantificar las intensidades de banda relativas (Fuji BAS 1000), el gel fue posteriormente expuesto a una película con una pantalla intensificadora durante 4-5 días a -80º C.

Mutagénesis dirigida al sitio

[0102] Se usó una técnica basada en la PCR recombinante para introducir mutaciones (QT, EA, AT, AA, NP) y el sitio ET en el conector IVS3-S4 de la a1B-b. Una pareja de cebadores 5’-attcttgtggtcatcgccttgas (Bup 3460; SEQ ID NO: 13) y 5’-gacaggcctccaggagcttggtg (Bdw 5623; SEQ ID NO: 14) flanqueaban una región del clon que contenía dos sitios de restricción RsrII (nt3510) y BgIII (nt5465) localizados en cada lado del ET (nt4674). Un segundo par de cebadores contenía la mutación deseada y superponía directamente el sitio ET (Bdwmut y Bupmut; ver más adelante). Se realizaron dos PCRs separados con el Bup 3460 y el Bdwmut, y el Bupmut y el Bdw 5623. El producto de la PCR sirvió después como plantilla para una segunda ronda de PCR usando el Bup 3460 y el Bdw 5623 generando el fragmento de la PCR mutante final que fue posteriormente subclonado en la ma1B-b en los sitios Rsr II y Bgl II. Los mutantes fueron cribados por asimilación por restricción y confirmados por secuenciación de ADN. Todas las PCR fueron realizadas usando Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim). Los cebadores de la mutagénesis usados fueron los siguientes:

ET/AT: Bupmut 5’-gagattgcgGCAACGaacaacttcatc-3’:SEQID NO: 15 Bdwmut 5’-aagttgttCGTTTCcgcaatctccg-3’; SEQ ID NO: 16 ET/QT: Bupmut 5’-gagattgcgCAGACGaacaacttcatc-3’;SEQID NO: 17 Bdwmut 5’-aagttgttCGTCTGcgcaatctccg-3’; SEQ ID NO: 18 ET/EA: Bupmut 5’-gagattgcgGAAGCTaacaacttcatc-3’; SEQ ID NO: 19 Bdwmut 5’-aagttgttAGCTTCcgcaatctccg-3’; SEQ ID NO: 20 ET/AA: Bupmut 5’-gagattgcgGCAGCTaacaacttcatc-3’;SEQID NO: 21 Bdwmut 5’-aagttgttAGCTGCcgcaatctccg-3’; SEQ ID NO: 22 ET/NP: Bupmut 5’-gagattgcgAACCCTaacaacttcatc-3’; SEQ ID NO: 23 Bdwmut 5’-aagttgttAGGGTTcgcaatctccg-3’; SEQ ID NO: 24

Análisis genómico

[0103] La región IVS3-S4 de los genes de las a1B y a1A de rata fueron analizados por PCR genómica. Los pares de cebadores fueron dirigidos a las regiones que abarcan la membrana de la IVS3 y IVS4 que se presumió residían en los exones 5’ y 3’ que flanquean las inserciones ET y NP de los genes de la a1B y a1A, respectivamente. La PCR fue realizada en 50 1l de una mezcla de reacción que contenía 250 ng de ADN genómico de hígado de rata, 250 1M de cada nucleótido y 0,4 1M de cada cebador. Tras una preincubación durante 15 minutos a 92º C, se añadieron 0,75 1l de mezcla de enzima al comienzo de la amplificación. Los productos de ADNg resultantes fueron purificados con gel, clonados en el PGEM-T (Promega) y secuenciados. Los cebadores de la a1B generaron dos bandas de ~11 kb y ~900 bases. La banda de 11 kb se derivó del den de la a1B y contenía el exón que codifica el ET deseado en IVS3-S3. El producto de base 900 resultó de la amplificación del sitio equivalente en el gen de la a1E que contenía un intrón de ~700 bp relativamente corto y ningún exón interviniente. Los cebadores de la a1A generaron un único producto de la PCR de 9 kb que se confirmó derivaba del gen de la a1A por secuenciación del ADN (instalación de secuenciación de la Universidad de Yale). Los cebadores fueron los siguientes:

a1A: Aup4737 5’-tgcctggaacatcttcgactttgtga; SEQ ID NO: 25 Adw4876 5’-cagaggagaatgcggatggtgtaacc; SEQ ID NO: 26 a1B: Bup4599 5’-cagagatgcctggaacgtctttgac; SEQ ID NO: 27 Bdw4744 5’-ataacaagatgcggatggtgtagcc; SEQ ID NO: 28

El empalme alternativo en los conectores extracelulares S3-S4 putativos afecta a la activación del canal pero no a las cinéticas de la inactivación

[0104] En un estudio anterior se ha demostrado que las corrientes del tipo N de la ma1B-b (LSFMG/+ET) y la ma1B-b (+SFMG/LET) difieren con respecto a sus cinéticas de activación cuando se expresan en ovocitos de Xenopus (comparar L/+ y +/L en las Figuras 1A, B; ver también Lin y otros, 1997). Las cinéticas de inactivación de las dos variantes de empalme no han sido, sin embargo, comparadas (Lin y otros, 1997). En el presente estudio las despolarizaciones de duraciones de entre 26 ms y 2,6 s se emplearon para permitir la resolución del curso temporal de tanto la activación como la inactivación del canal de Ca. Las subunidades del canal de calcio del tipo N de rata (ma1B-b [L/+] y la ma1B-b [+/L] se expresaron en ovocitos de Xenopus y las corrientes del canal de Ca del tipo N resultantes se registraron usando 5 mM de Ba como el portador de la carga (Figura 1). La Figura 1A muestra la corriente de Ca normalizada, promediada inducida por la expresión en ovocitos de Xenopus de cuatro constructos diferentes de a1B. Las corrientes fueron evocadas por despolarizaciones escalonadas a 0 mV desde un potencial de retención de -80 mV. Cada traza representa la corriente normalizada, promediada calculada de al menos 6 ovocitos. Los clones que contienen SFMG se distinguen de los clones que carecen de SFMG por las líneas y flechas finas y gruesas, respectivamente. La Figura 1B muestra un plano de las constantes temporales de activación media (logaritmo natural) en diferentes potenciales de prueba (entre -20 u +10 mV) oara los clones +/+ (0), L/+ (.), +/L(0) y L/L (.). La presencia del SFMG en el dominio IIIS3-S4 no afectó a la tasa del canal de activación. No hubo una diferencia significativa en el Tactivo entre los clones +/+ y L/+ o entre los clones +/L y L/L (p>0,1 en todos los potenciales entre – 20 mV y +10 mV. La presencia del ET en el dominio IVS3-S4 ralentizó las cinéticas del canal de activación. Los valores de Tactivo para los clones +/+ y L/+ fueron significativamente más lentos en comparación con +/L y L/L, en todos los potenciales entre -20 mV y +10 mV (p<,05).

[0105] Las corrientes del canal de Ca del tipo N evocadas por la despolarización a 0 mV o más alto, se inactivaron con un curso temporal bi-exponencial (Trápido 100-150 ms y Tlento 700-800 ms). Las constantes de tiempo de inactivación de los canales clonados expresados en ovocitos de Xenopus (rna1B-b, L/+ y rna1B-d, +/L) fueron débilmente dependientes del voltaje consistente con los estudios de los canales de Ca del tipo N de las neuronas simpáticas de la rana toro (Jones & Marks, 1989). Las constantes del tiempo de inactivación rápidas y lentas de las corrientes de rna1B-b y rna1B-d evocadas por las despolarizaciones escalonadas a entre 0 mV y +30 mV no fueron significativamente diferentes. Por el contrario, las tasas de activación del canal de las dos variantes en las mismas células fueron significativamente diferentes (Figuras 1A, B). En base a estas observaciones se concluyó que un empalme alternativo en los dominios IIIS3-S4 y IVS3-S4 de la a1B-subunidad altero el curso temporal de la activación del canal de Ca del tipo N pero no tuvo efecto en las cinéticas de inactivación. Estos descubrimientos son consistentes con la proximidad cercana de los conectores S3-S4 a sus hélices S4 respectivas que son los sensores de voltaje putativos de la familia de la transmembrana 6 de los canales de iones regulados por voltaje. Por el contrario, los dominios de la subunidad a1B de los canales de Ca implicados en la inactivación dependiente del voltaje de los canales de Ca del tipo N (IS6 y conectores extracelulares e intracelulares putativos flanqueantes; Zhang y otros, Nature 372:97-100. 1994) es probable que estén más distantes de los sitios de empalme del conector S3-S4.

Las diferencias observadas en las propiedades de las corrientes de la rna1B-b y la rna1B-d son de suficiente magnitud para afectar la entrada de Ca inducida por potencial de acción.

[0106] Una suposición que motiva el presente estudio es que las diferencias en las cinéticas y la dependencia del voltaje de activación de la de las corrientes del canal de Ca del tipo N de la rna1B-b y la rna1B-d son suficientes para influenciar la magnitud y el curso temporal de la entrada de calcio dependiente del voltaje en las células nativas. Sin embargo, una prueba directa de esta hipótesis es complicada por la incapacidad de manipular selectivamente la expresión o la actividad de las variantes de empalme individuales en sus ambientes nativos. Hasta la fecha no existen anticuerpos o herramientas farmacológicas específicas de la isoforma para dirigir las variantes de empalme S3-S4 de la a1B del canal de Ca. Por lo tanto, la información disponible fue usada para estimar la eficacia relativa de las corrientes del tipo N de la rna1B-b y la rna1B-d para apoyar la afluencia de Ca inducida por potencial en una neurona modelo (Hines & Carnevale, 1997). Se usó un modelo de un compartimento para predecir el curso temporal y la magnitud de la entrada de calcio en la neurona durante la despolarización inducida por potencial de acción. Se usaron los potenciales de acción simulados con los cursos temporales similares a aquellos registrados en las neuronas simpáticas nativas (Yamada y otros, 1989; Figura 2A) para activar la afluencia de Ca dependiente del voltaje en las neuronas modelo (densidades de corriente de Na, K y CA de 300, 300 y 1 pS/1F, respectivamente) expresándolas corrientes de la canal de Ca del tipo N de o la rna1B-b o de la rna1B-d. Un potencial de acción simulado fue evocado por un escalón de corriente de 10 ms, 40 pA (Figura 2A); se muestra una comparación de la corriente del canal del tipo N y del curso temporal resultantes de la concentración de calcio intracelular (Figura 2C) esperada en una neurona modelo expresando los canales del tipo rna1B-b (A/+; línea sólida) o la rna1B-d (+/L; línea discontinua). Un cambio en la dependencia del voltaje de la variable de activación de la conductancia del canal de CA del tipo N (mr, Ca) por -7 mV, y una disminución en el contraste del tiempo de activación (tm, Ca) del 33% esperado para la rna1Bd (Lin y otros, 1997; y ver la Figura 1A), resultó en un aumento total en la transferencia de carga y en la concentración de Ca intracelular máxima del 49% y el 48%, respectivamente. Se predice un aumento del -50% en la transferencia de carga total (Figura 2B) y la concentración de Ca intracelular máxima (Figura 2C) durante un potencial de acción en una neurona que expresa los canales de Ca del tipo rna1B-d (línea discontinua) en relación a la rna1B-b (línea sólida). Siendo todos los otros factores constantes, las diferencias funcionales entre las corrientes de Ca del tipo N de la rna1B-b y la rna1B-d se espera que afecten significativamente la cantidad de calcio que entra en una neurona durante la excitación dependiente del potencial de acción.

El empalme del ET en el dominio IVS3-S4 es la base de la diferencia funcional principal entre la rna1B-b y la rna1B-d

[0107] La rna1B-b y la rna1B-d difieren en la composición por 6 aminoácidos localizados en dos regiones distintas de la subunidad a1B del canal de CA (SFMG en el domino IIIS3-S4 y ET en el dominio IVS3-S4). Para separar la contribución relativa del SFMG en el dominio IIs3-S4 y del ET en el dominio IVS3-S4 a las diferentes cinéticas de regulación observadas entre larna1B-b (LSFMG/+ET) y la rna1B-d (+SFMG/LET) se construyeron dos clones adicionales, +/+ y L/L y se compararon las propiedades funcionales de los cuatro clones. La Figura 1 (A y B) demuestra que la presencia del ET de secuencia dipéptida en el dominio IVS3-S4 está directamente correlacionada con las cinéticas de activación alteradas de las corrientes de la rna1B-b en comparación con la rna1B-d. Las constantes temporales de activación medidas para las corrientes del canal de CA del tipo N en los ovocitos que expresan clones L/+ (rna1B-b) y +/+ fueron indistinguibles y 1,5 veces más lentas de media que las inducidas por la expresión de los clones +/A(ma1B-d) y L/L (Figura 1 A, B). La presencia del ET en el domino IVS3-S4 también influenció la dependencia del voltaje del canal de activación. Una comparación de los puntos medios de la fase ascendente de los trazados de corriente-voltaje máximos (V1/2) generados para los dos clones que contienen ET, L/+ (rna1B: -7,8 ± 0,6 mV, n=6) y +/+ (-9,7 ± 1,0 mV, n=6) muestra que no son significativamente diferentes entre sí (p>0,05, prueba t de student). Igualmente, los valores de V1/2 estimados de los dos constructos que carecen de ET, +/L (rna1B-d; -15,4 ± 0,4 mV, n=7) y L/L (-13,4 ± 0,7, n=6), no fueron significativamente diferentes entre sí (p>0,05) y se activaron a potenciales que fueron, de media, 6mV más negativos comparados con los clones que contenían ET L/+ y +/+. Mientras que la presencia del ET en el dominio IVS3-S4 domina al regular la dependencia del voltaje de la activación, el análisis no revela una pequeña contribución del SFMG. Los clones que contienen SFMG (+/L y +/+) se activaron a potenciales que fueron hiperpolarizados a 2 mV en comparación a aquellos que carecían de SFMG (L/+ y L/L). Un cambio de 2 mV en la dependencia del voltaje de la activación no fue significativa al nivel del 5%, en comparación con los valores de V1/2 de los clones L/+ y +/+, pero alcanzó cierta significancia en una comparación de +/L y L/L (p<0,025 prueba t de student).

Patrón de expresión del ARNm a1B del canal de calcio que contiene ET en diferentes regiones del sistema nervioso

[0108] La Figura 1 indica que el empalme alternativo del ET dentro del dominio IVS3-S4 de la subunidad a1B del canal de Ca cuenta con las mayores diferencias funcionales entre la rna1B-b y la rna1B-d. Esto impulsó un análisis sistémico del patrón de expresión de las seis bases en el ARN, a1B que codifica el ET (gaa acg). Se ha mostrado anteriormente que el ARNm a1B que contiene ET (+ET a1B) estaba en muy poca abundancia en los extractos de cerebro de rata (Lin y otros, 1997). Para determinar si el ARNm a1B que carece de ET (LET a1B) dominaba en todo el sistema nervioso central se analizó el ARN aislado de la médula espinal, del cerebelo, de la corteza, del hipocampo, del hipotálamo, de la medula y del tálamo de ratas adultas por ensayo de protección de ribonucleasa. En todas las regiones probadas >90% del ARNm a1B expresado en el sistema nervioso central carecía de la secuencia que codifica el ET. Por el contrario, en los ganglios simpáticos y sensoriales la mayoría del ARNm a1B contenía la secuencia de codificación del ET. Junto estos descubrimientos sugieren que las subunidades de la +ET a1B están restringidas ante todo a las neuronas del sistema nervioso periférico. De acuerdo con esto se analizó ARN aislado del cerebro humano y los ganglios trigéminos se observaron patrones análogos de expresión: bajos niveles de ARNm +ET a1B en el cerebro y altos niveles (>90%) en los ganglios.

Mutagénesis dirigida al sitio dentro del IVS3-S4

[0109] Habiendo mostrado que el empalme alternativo de la secuencia de codificación del ET en el conector IVS3-S4 de la a1B tiene un efecto significativo en las cinéticas y la dependencia del voltaje de la regulación del canal de Ca del tipo N, el uso de la mutagénesis dirigida al sitio se empleó para determinar la importancia relativa de cada aminoácido, glutamato y treonina. Se construyeron una serie de mutantes en los que el ET fue reemplazado ya sea con QT, AT, EA, AA o NP (Figura 3 del clona/+ (ma1B-b) que sirvió como estructura de fondo. Los constructos mutantes fueron después expresados en ovocitos de Xenopus y sus propiedades comparadas con los clones +ET (100% lento; Figura 3) y LET (100% rápido; Figura 3). Todos los mutantes se expresaron igualmente bien en el sistema de expresión de ovocitos de Xenopus.

[0110] El papel del glutamato en el dominio IVS3-S4 fue de interés principal ya que debería estar negativamente cargado a un pH neutro y por lo tanto podría influir en la maquinaria de regulación del canal por las interacciones electroestáticas. La Figura 3, sin embargo, muestra que reemplazar el glutamato con glutamina resultó en un canal que se activó sólo ligeramente más rápido que la +ET a1B (Figura 3; QT). Sustituir la alanina con glutamato (AT) disminuyo el Tact pero, en consistencia con el mutante QT, sugiere que la presencia de una carga negativa en el IVS3-S4 (glu) no es la base de las cinéticas de regulación lentas de la variante +ET a1B. De forma similar, la sustitución de alanina de treonina ya sea solo (EA) o junto con glutamato (AA) generó canales con cinéticas de activación que eran intermedias entre los clones +ET a1B y LET a1B. Juntos, estos resultados sugieren que la presencia de tanto el glutamato como la treonina en el conector IVS3-S4 es necesaria para reconstituir las tasas de apertura de canal relativamente lentas características de las subunidades a1B del canal de Ca tipo N que dominan en los ganglios sensoriales y simpáticos.

[0111] Las comparaciones de la secuencia de varios ADNcs que codifican las subunidades a1 de otros canales de Ca regulados por voltaje sugieren que el empalme alternativo en el conector IVS3-S4 podría ser un mecanismo general para regular la regulación del canal de Ca dependiente del voltaje. Esto ha sido recientemente demostrado para la a1A (Sutton y otros, Soc. Neurosci. Abs. 24:21, 1998), una subunidad del canal de Ca que está estrechamente relacionada tanto estructuralmente como funcionalmente con la subunidad a1B del canal de calcio de Ca de tipo N. Una comparación de la región IVS3-S4 de varios ADNcs a1A mamíferos derivados del riñón, páncreas y el cerebro (ver también Yu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10494-10498, 1992; Ligon y otros, J. Biol. Chem. 273:13905-13911, 1998; Sutton y otros, 1998) es consistente con el empalme alternativo de las seis bases que codifican los aminoácidos Asp Pro (NP) en esta región. La distribución de los ARNms +NP a1A y LNP a1A en diferentes regiones del sistema nervioso de rata no ha sido cuantificada. Por lo tanto el análisis de protección de la RNasa fue usado para determinar el patrón de expresión de las variantes de empalme IVS3-S4 de la a1A. Se encontraron bajos niveles de ARNM +NP a1A en rata, médula espinal, estriado y tálamo, un patrón que iguala los bajos niveles de ARNm +ET a1B en el CNS. Sin embargo, el patrón de la expresión NP en el cerebelo, corteza e hipocampo no se ajustó a este cuadro ya que el ARNm aislado de estos tejido contenía un parte significativa de ARNms +NP a1A. De hecho, en el hipocampo dominaban los ARNmS +NP a1A (~60%). En consistencia con la abundancia de ARNms +ET a1B en el tejido periférico, la mayoría del ARNm a1A en los ganglios de la raíz cervical y dorsal contenían las seis bases que codifican el NP en el domino IVS3-S4 de la a1A. El nivel absoluto de ARNm a1A expresado en las neuronas simpáticas fue muy bajo como se esperaba por la ausencia de corrientes del tipo P en los registros de las neuronas simpáticas de rata (Mintz y otros, 1992).

[0112] El alto grado de homología de la secuencia entre la a1B y la a1A en la región del conector IVS3-S4 junto con el descubrimiento de que una secuencia de base 6 está empalmada alternativamente en ambos sitios, sugirió que el ET y el NP comparten un papel funcional común. Para probar esta hipótesis se estudió el impacto funcional de las corrientes de Ca de tipo N de reemplazar el ET en la ma1B-b con el NP. La Figura 3 muestra que el mutante +NP a1B da lugar a unas corrientes de Ca de tipo N en los ovocitos con cinéticas de regulación indistinguibles del tipo salvaje (es decir +ET a1B). Las constantes temporales de activación fueron estimadas de las corrientes inducidas por la expresión de varios constructos a1B mutantes (QT, AT, EA, AA, NP) en ovocitos y la comparación con los clones ET y LET (A). Están trazados (B) los cambios en las constantes temporales de activación de los canales mutantes, en relación a los clones ET y LET (100% lento) y LET (100% rápido). Cada punto representa los datos recogidos de al menos 18 ovocitos por mutante (cada mutante fue probado en tres lotes separados de ovocitos y dentro de cada experimento al menos se analizaron 6 ovocitos por mutante). Los valores trazados son medias ± errores estándar de los tres conjuntos de datos. El asterisco indica una desaceleración significativa de la constante temporal de activación en comparación con el clon ET (P<0,05).

El ET está codificado por un exón de base seis en la región del conector IVS3-S4 del gen a1B

[0113] Se ha planteado la hipótesis de la existencia de un exón empalmando alternativamente en la región IVS3-S4 del gen a1B del canal de Ca de rata (Lin y otros, 1997), pero no se ha confirmado todavía. Se emprendió, por lo tanto, el análisis genómico para localizar las uniones de empalme en la región IVS3-S4 del gen a1B y a determinar con precisión la localización de la base seis putativa, del ET que codifica el exón. La amplificación PCR del ADN genómico de rata usando cebadores diseñados para hibridizar con la IVS3-S4 que flanquea las hélices S3 y S4 que abarcan la transmembrana en la a1B reveló la presencia de un tramo largo de ~10 kb de secuencia de intrón. La secuenciación de ADN estableció la localización de los límites exón/intrón e intrón/exón y conservó las secuencias de la firma de la unión del empalme ag-gt inmediatamente 5’ y 3’ con el sitio de inserción ET putativo. Se localizó un exón de casete de base seis que codificaba al ET 8 kb dentro del intrón 5’ y establece que las variantes ET a1B son generadas por empalme alternativo. Se determinó la estructura exón/intrón en la región del conector IVS3-S4 del gen a1A estrechamente relacionado. El gen a1A de rata también contenía un tramo largo de secuencia de intrón (~8 kb) y las uniones de empalme ag-gt en los extremos 5’ (gt) y 3’ (at) del segmento intrónico. La localización precisa del NP que codifica el exón del casete en el gen a1A de rata no ha sido determinada pero se concluye que debe residir dentro de los 8 kb de la secuencia del intrón en la región del conector IVS3-S4. El empalme alternativo específico del tejido de los exones del casete de base seis en los conectores IVS3-S$ de tanto la a1A como la a1B explica la presencia de las variantes de empalme de estas subunidades en el cerebro mamífero y pone de relieve el alto nivel de conservación entre estos dos genes funcionalmente relacionados. También fue analizada la estructura genómica del gen a1E más distantemente relacionado que codifica un clase farmacológicamente y funcionalmente distinta del canal de Ca (Soong y otros, Science 260: 1133-1136, 1993). El gen a1E contiene un intrón de ~700 bp en la región del conector IVS3-S4 y ningún exón interviniente obvio. La ausencia de un exón de casete empalmado alternativamente en la región del conector IVS3-S4 del gen a1E es consistente con el análisis de protección de la ARNasa del ARNm a1E del cerebro de rata que no reveló evidencia de variaciones de la secuencia en este conector IVS3-S4.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0114]

<110> BROWN UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION

<120> ISOFORMA DEL CANAL DE CALCIO TIPO N HUMANO Y USOS DE LA MISMA

<130> B1055/7000WO

<150> US 60/077,901

<151> 1998-03-13

<160> 28 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1 gagcttcgtg gg 6

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 7376

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> 146..7174

<400> 3

<210> 4

<211> 2343

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 7364

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> 146..7162

<400> 5

<210> 6

<211> 2339

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 7178

<212> DN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> 146..6856

<400> 7

<210> 8

<211> 2337

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 7011

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> CDS

<222> 1..7008

<400> 9

<210> 10

<211> 2336

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 10

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> Conus geographus

<400> 4

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Conus magus

<400> 12

<210> 13

<211> 23

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 13 attcttgtgg tcatcgcctt gag 23

<210> 14

<211> 23

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 14 gacaggcctc caggagcttg gtg 23

<210> 15

<211> 27

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 15 gagattgcgg caacgaacaa cttcatc 27

<210> 16

<211> 25

<212>ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 16 aagttgttcg tttccgcaat ctccg 25

<210> 17

<211> 27

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 17 gagattgcgc agacgaacaa cttcatc 27

<210> 18

<211> 25

<212>A DN

<213> Rattus norvegicus

<400> 18 aagttgttcg tctgcgcaat ctccg 25

<210> 19

<211> 27

<212>A DN

<213> Rattus norvegicus

<400> 19 gagattgcgg aagctaacaa cttcatc 27

<210> 20

<211> 25

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 20 aagttgttag cttccgcaat ctccg 25

<210> 21

<211> 27

<212>A DN

<213> Rattus norvegicus

<400> 21 gagattgcgg cagctaacaa cttcatc 27

<210> 22

<211> 25

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 22 aagttgttag ctgccgcaat ctccg 25

<210> 23

<211> 27

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 23 gagattgcga accctaacaa cttcatc 27

<210> 24

<211> 25

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 24 aagttgttag ggttcgcaat ctccg 25

<210> 25

<211> 26

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 25 tgcctggaac atcttcgact ttgtga 26

<210> 26

<211> 26 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 26 cagaggagaa tgcggatggt gtaacc 26

<210> 27

<211> 25

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 27 cagagatgcc tggaacgtct ttgac 25

<210> 28

<211>

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 28 ataacaagat gcggatggtg tagcc 25

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2.
2.

Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4.
3.

Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la reivindicación 1, en donde el polipéptido consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4.
4.

Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2.
5.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la mencionada molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1,

o consiste de o comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:3.
6.

Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 5, conectado operativamente a un promotor.
7.

Una célula huésped transformada, o transfectada, con un vector de expresión como se reivindica en la reivindicación 6.
8.

Una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 o una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 5.
9.

Un método in vitro para aumentar la cantidad de una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 en una célula, comprendiendo poner en contacto la célula con una molécula seleccionada del grupo consistente de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 y un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2, en una cantidad efectiva para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula.
10.

Un método in vitro como es reivindica en la reivindicación 9, comprendiendo además poner en contacto la célula con una o más subunidades ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano del canal de calcio del tipo N humano o los ácidos nucleicos que codifican tales subunidades.
11.

Una composición, para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje del canal de calcio, que comprende un ácido nucleico que codifica una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2, o un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2.
12.

Un método para identificar compuestos principales para un agente farmacológico útil en el tratamiento de enfermedades asociadas con la afluencia de calcio regulada por voltaje aumentada o disminuida mediado por un canal de calcio del tipo N humano que comprende: proporcionar una célula u otro espacio encapsulado por membrana, que comprende un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2; poner en contacto la célula u otro espacio encapsulado por membrana con un agente farmacológico candidato bajo condiciones que, en ausencia del agente farmacológico candidato, causan una primera cantidad de afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula u otro espacio encapsulado por membrana; determinar una cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje como una medida del efecto de los compuestos principales para un agente farmacológico en la afluencia de calcio regulada por voltaje por un canal de calcio del tipo N humano, en donde una cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje que es menor que la primera cantidad indica que el agente farmacológico candidato es un compuesto principal para un agente farmacológico que reduce la afluencia de calcio regulada por voltaje y en donde un cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje que es mayor que la primera cantidad indica que el agente farmacológico candidato es un compuesto principal para un agente farmacológico que aumenta la afluencia de calcio regulada por voltaje.
13.

Un método como se reivindica en la reivindicación 12, comprendiendo además el paso de cargar la célula u otro espacio encapsulado por membrana con un compuesto sensible al calcio que es detectable en la presencia de calcio, en donde el compuesto sensible al calcio es detectable como una medida de la afluencia de calcio regulada por voltaje.
14.

Un método para identificar compuestos que preferiblemente enlazan con una isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2, comprendiendo:

proporcionar un polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1; proporcionar un polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; poner en contacto el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o la m nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 y el polipéptido o el ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano con un compuesto; determinar el enlace del compuesto con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 y el polipéptido o el ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; en donde un compuesto que enlaza con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 en una cantidad más grande que el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es un compuesto que preferiblemente enlaza con la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2.
15.

Un método como se reivindica en la reivindicación 14, en donde los compuestos identificados enlazan selectivamente con una isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, el método comprendiendo: proporcionar un polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1; proporcionar un polipéptido o un ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; poner en contacto el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o el ácido nucleico y el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano con un compuesto; determinar el enlace del compuesto con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o con el ácido nucleico y el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; en donde un compuesto que enlaza con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o con el ácido nucleico pero no enlaza con el polipéptido o el ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es un compuesto que enlaza selectivamente con la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2.
16.

El método de la reivindicación 14 ó 15, en donde la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 está expresada en la membrana celular de una primera célula u otro espacio encapsulado por membrana, y la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano está expresada en la membrana celular de una segunda célula u otro espacio encapsulado por membrana.