ES2312365T3 - Animal knockout del canal de calcio n. - Google Patents

Abstract

Ratón en el que se ha interrumpido una codificación genética para la subunidad alfa 1B del canal de calcio tipo N de manera que el ratón carece del canal de calcio tipo N funcional.

Description

Animal Knockout del canal de calcio N.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un animal deficiente en el canal de calcio tipo N y al uso del mismo.

Antecedentes de la técnica

Los canales de calcio (canales de Ca) son proteínas de membrana que transmiten información a las células controlando el influjo de Ca^{2+} hacia las mismas. En particular, los canales de Ca dependientes del voltaje presentes en células excitatorias tales como las células nerviosas y las células musculares son proteínas que juegan un papel importante en la conversión de información transmitida a través de cambios en el potencial de las membranas, a información intracelular que representa un aumento de la concentración de Ca^{2+}.

Se han identificado varios canales de Ca dependientes del voltaje a partir de células nerviosas y células musculares (Bean, B. P. et al, Ann Rev. Physiol., 51, págs. 367 a 384, 1989; Hess P., Ann. Rev. Neurosci., 56, pág. 337, 1990), y los mismos se clasifican en seis tipos (L, N, P, Q, R y T) según sus propiedades electrofisiológicas y la susceptibilidad a los antagonistas.

Entre estos canales de Ca, el canal de Ca tipo N es un canal de Ca caracterizado porque el influjo de Ca^{2+} es inhibido por una toxina peptídica aislada a partir de caracoles cónicos, la \omega-conotoxina GVIA.

Los antagonistas del calcio son ampliamente usados como fármacos antianginosos, fármacos antiarrítmicos y agentes terapéuticos para la hipertensión, y su mecanismo de acción se basa en la relajación de los músculos lisos vasculares o la supresión de la contracción miocárdica mediante inhibición del influjo de Ca^{2+} hacia una célula a través de una unión específica al canal de Ca tipo L presente en una membrana celular. Mientras tanto, se está dando a conocer que el Ca^{2+} es un factor importante para funciones normales en nervios, tales como la liberación de sustancias neurotransmisoras, la formación de patrones de impulsos y el crecimiento de neuritas, aunque en enfermedades tales como la muerte retardada de células nerviosas después de isquemia cerebral y un cierto tipo de epilepsia (Siesjo, Mayo Clin Proc., 61, pág. 299, 1986) se encuentra una implicación importante de un cambio de la cinética del Ca^{2+}. Durante los últimos años, se confirmó la existencia de canales de Ca tipo P, N, Q y R, que están presentes específicamente en nervios, además del tipo L y el tipo T. Los roles de estos canales de Ca en las funciones nerviosas están siendo centro de atención, y al mismo tiempo se están desarrollando

\hbox{activamente antagonistas de calcio
novedosos dirigidos a los mismos.}

En particular, se ha publicado que el canal de Ca tipo N se expresa en terminaciones nerviosas del sistema nervioso autónomo, y está llamando la atención su rol en el control a través de nervios autónomos (Lane D. H., et al., Science, 239, págs. 57 a 61, 1988; Diane, L, et al., Nature, 340, págs. 639 a 642, 1989).

Hasta el momento, las funciones del canal de Ca tipo N se han evaluado efectuando 1) un experimento in vitro usando sinaptosomas o células nerviosas cultivadas ó 2) un experimento in vivo usando la administración de \omega-conotoxina GVIA. Como el punto 1) es un experimento in vitro, el mismo no resulta adecuado para una evaluación precisa de las funciones del canal de Ca tipo N en cuerpos vivos. Por otro lado, aunque el punto 2) es un experimento in vivo, no resulta adecuado para una evaluación precisa de las funciones del canal de Ca tipo N en cuerpos vivos por una de las siguientes razones: (1) no se ha dilucidado completamente la selectividad de la w-conotoxina GVIA, (2) la \omega-conotoxina GVIA es un péptido y por lo tanto no tiene la suficiente permeabilidad para una célula nerviosa, (3) resulta difícil un experimento de fase crónica usando la administración de \omega-conotoxina GVIA, y otros similares.

Exposición de la invención

Para superar los inconvenientes antes mencionados, se ha deseado intensamente la preparación de un ratón knockout del canal de Ca tipo N que sea deficiente únicamente en el canal de Ca tipo N y que se pueda usar para un experimento en fase crónica.

Por consiguiente, uno de los objetivos de la presente invención es preparar un ratón knockout que carezca de la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N (al que se hará referencia en lo sucesivo como "ratón N-KO"). Mediante el uso de dicho ratón, se pueden dilucidar de qué funciones es realmente responsable el canal de Ca tipo N en cuerpos vivos, considerándose que dicho canal de Ca tipo N se expresa en terminales nerviosos del sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico y el mismo juega un rol importante en el mantenimiento de la homeostasis de cuerpos vivos.

Puede que el ratón N-KO no sea capaz de mantener la homeostasis a través del sistema nervioso autónomo, especialmente no puede controlar la presión sanguínea, y por lo tanto no puede sobrevivir de forma normal. No obstante, se consideró que, aun cuando el ratón N-KO no pudiera sobrevivir de forma normal, las funciones del canal de Ca tipo N se podrían deducir a partir de anomalías observadas en el ratón N-KO. De este modo, se intentó preparar un ratón N-KO en el que, mediante disrupción dirigida, se interrumpió una codificación genética para la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N.

Como consecuencia, se descubrió que el ratón N-KO podía experimentar ontogenia y crecimiento y podía producir progenie. Por otra parte, se demostró electrofisiológicamente que el influjo de Ca^{2+} que es inhibido por la \omega-conotoxina GVIA no se observaba en células nerviosas en ganglios de la raíz dorsal preparados a partir del ratón N-KO, y por lo tanto se confirmó que el ratón N-KO carecía de un canal de Ca tipo N funcional.

Como consecuencia de estudios adicionales, se descubrió también que el ratón N-KO presentaba características exclusivas de la deficiencia en el canal de Ca tipo N tales como ningún reflejo de la presión sanguínea a través de sistemas nerviosos, insensibilidad al dolor y un nivel bajo de azúcar en la sangre en comparación con un ratón tipo salvaje, y que el ratón N-KO resultaba útil para el análisis de funciones del canal de Ca tipo N en cuerpos vivos. Por ello se ha realizado la presente invención.

Es decir, la presente invención proporciona un animal no humano en el que se interrumpe una codificación genética para un canal de Ca tipo N de manera que falte el canal de Ca tipo N funcional (al que en lo sucesivo se hará referencia también como "animal de la presente invención"). El animal no humano es un ratón.

La codificación genética para el canal de Ca tipo N es una codificación genética correspondiente a una subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N. Más específicamente, se puede mencionar un gen que comprenda ADN definido en el siguiente punto (a) ó (b):

(a)

ADN que comprenda la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 1;

(b)

ADN que sea hibridable con ADN que comprenda la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 1 bajo condiciones estrictas y codifique en correspondencia con una subunidad \alpha_{1B} del canal de calcio tipo N funcional.

La presente invención proporciona también un método para determinar una acción de una sustancia, que comprende las etapas en las que se administra una sustancia al animal de la presente invención y se determina una acción de la sustancia sobre el animal (al que también se hará referencia en lo sucesivo como "método de determinación de la presente invención").

El método de determinación de la presente invención comprende preferentemente etapas en las que se administra una sustancia al animal de la presente invención y a un animal tipo salvaje, y se comparan acciones de la sustancia sobre el animal de la presente invención y el animal tipo salvaje para determinar la acción de la sustancia sobre el canal de calcio tipo N.

La presente invención proporciona además un método para cribado en búsqueda de una sustancia que tenga una acción farmacológica, que comprende una etapa en la que se determina una acción farmacológica de una sustancia mediante el método de determinación de la presente invención.

Como acción farmacológica, se pueden mencionar una acción para reducir la presión sanguínea, una acción analgésica y una acción para reducir el nivel de azúcar en la sangre. Las sustancias que presentan dichas acciones farmacológicas se pueden usar para elaborar fármacos hipotensores, fármacos analgésicos y fármacos hipoglucemiantes que comprendan estas sustancias como ingredientes activos, respectivamente.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra un mapa de enzimas de restricción de un ADN clonado fágico y pBS59/63/58n.

La Fig. 2 muestra la preparación de un vector dirigido.

La Fig. 3 muestra la preparación de un vector dirigido.

La Fig. 4 muestra la preparación de un vector dirigido.

La Fig. 5 muestra la comparación de corrientes eléctricas que se hacen pasar a través de canales de Ca tipo N de un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje.

La Fig. 6 muestra la comparación del ritmo cardíaco y la presión sanguínea de un ratón N-KO y las correspondientes a un ratón tipo salvaje.

La Fig. 7 muestra la comparación de cambios en la presión sanguínea de un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje, a los que se administró \omega-conotoxina.

La Fig. 8 muestra la comparación de cambios en la presión sanguínea de un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje, que se sometieron a oclusión bilateral de carótida (BCO).

La Fig. 9 muestra la comparación de las susceptibilidades al dolor de un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje en un test de formalina.

La Fig. 10 muestra la comparación de los niveles de azúcar en la sangre de un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje.

La Fig. 11 muestra la comparación de niveles de azúcar en la sangre de un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje después de la administración de glucosa.

La Fig. 12 muestra la comparación del nivel de insulina en la sangre de un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje después de la administración de glucosa.

La Fig. 13 muestra la comparación de la inervación autónoma para fuerzas de contracción del músculo cardíaco auricular en un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje.

Mejor modo para llevar a cabo la invención

En lo sucesivo, en el presente documento, se explicarán detalladamente realizaciones de la presente invención.

Como se ha descrito anteriormente, los inventores de la presente invención observaron que un ratón deficiente en el canal de Ca tipo N funcional experimentaba ontogénesis y crecimiento y podía producir progenie, y que este ratón resultaba útil para el análisis de funciones del canal de Ca tipo N en cuerpos vivos. El animal de la presente invención se basa en estas observaciones y está caracterizado por ser un animal no humano en el que se interrumpe una codificación genética para el canal de Ca tipo N de modo que falte el canal de Ca tipo N funcional.

La disrupción de un gen significa la introducción de una mutación en el gen de manera que se pierda la función de su producto genético. Como método para interrumpir un gen, se puede mencionar la disrupción dirigida. La disrupción dirigida es un método para interrumpir un gen por direccionamiento génico (del inglés gene targeting), y hace referencia a una técnica de introducción de mutaciones en la que en una célula se introduce ADN que tiene una secuencia nucleotídica de un gen diana en el que se introduce una mutación mediante la cual se pierde la función del producto del gen, preferentemente ADN que tiene una secuencia nucleotídica de un gen diana en el que se inserta un marcador selectivo, más preferentemente un gen de resistencia a fármacos, de modo que se pierde la función del producto del gen, y se selecciona una célula que ha experimentado una recombinación homóloga entre el ADN introducido y el gen diana (Suzanne L. et al., Nature, 336, pág. 348, 1988). La disrupción dirigida mencionada en el presente caso es un ejemplo de una técnica para interrumpir la codificación genética correspondiente a un canal de Ca tipo N basándose en información sobre la secuencia nucleotídica del gen, y cualquier técnica se incluye dentro del alcance de la presente invención siempre que se interrumpa un gen basándose en información sobre la secuencia nucleotídica del
mismo.

Además, una carencia de un canal de Ca tipo N funcional significa que ya no existe influjo sustancial de Ca^{2+} que pasa a través del canal de Ca tipo N y esto se puede verificar por la ausencia de influjo sustancial de Ca^{2+} inhibido por la \omega-conotoxina GVIA. La \omega-conotoxina GVIA a la que se hace referencia en el presente documento es un péptido purificado a partir de toxina de caracoles cónicos (Conus geographus) (Baldomero, M.O. et al., Biochemistry, 23, pág. 5087, 1981), y está caracterizada por la secuencia de aminoácidos de N.º ID SEC: 3.

Una codificación genética para un canal de Ca tipo N significa una codificación genética para una subunidad básica contenida únicamente en el canal de Ca tipo N, por ejemplo, la subunidad \alpha_{1B}.

Entre los ejemplos específicos de la codificación genética para la subunidad \alpha_{1B} se incluyen un gen que tenga ADN definido en el siguiente punto (a) ó (b):

(a)

ADN que comprenda la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 1;

(b)

ADN que sea hibridable con ADN que comprenda la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 1 bajo condiciones estrictas y codifique en correspondencia con la subunidad \alpha_{1B} de un canal de calcio tipo N funcional.

Un ejemplo de las condiciones estrictas mencionadas en el presente documento incluye las condiciones de hibridación a 65ºC en 4 x SSC y un lavado subsiguiente a 65ºC en 0,1 x SSC durante 1 hora. Las condiciones estrictas pueden ser alternativamente 42ºC, 4 x SSC en formamida al 50%.

El animal no humano es preferentemente un roedor, más preferentemente un ratón.

El animal de la presente invención se puede preparar según un método habitual para preparar un animal knockout mediante direccionamiento génico excepto que como gen diana se usa la codificación genética correspondiente a un canal de Ca tipo N.

En lo sucesivo, en el presente documento, mediante la ejemplificación de una disrupción dirigida de una codificación genética correspondiente a un canal de Ca tipo N se explicarán en este orden la clonación del gen de la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N, la construcción de un vector dirigido usado en la disrupción dirigida y la adquisición de una célula madre embrionaria (célula ES) que haya experimentado una recombinación homóloga.

1. Clonación de ADN que incluye parte del gen de la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N

La codificación de ADN para la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N se puede obtener designando cebadores sobre la base de la secuencia nucleotídica descrita en Thierry, C. et al., FEBS Letters, 338, pág. 1, 1994, y realizando una PCR con el uso de ADN genómico ó ADNc animal no humano o realizando una RT-PCR con el uso de ARN animal no humano. Alternativamente, se puede sintetizar una sonda basándose en la secuencia nucleotídica descrita en la referencia antes mencionada, y a partir de una genoteca de ADN genómico animal no humano o genoteca de ADNc se pueden seleccionar clones hibridables con la sonda y los mismos se pueden determinar para las secuencias nucleotídicas con el fin de seleccionar un clon que contenga el gen de la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N ó una parte del mismo que comprenda una secuencia nucleotídica de preferentemente 500 pb ó mayor, más preferentemente 1 kpb ó mayor.

Se prepara un mapa de enzimas de restricción determinando sitios enzimáticos de restricción contenidos en el ADN clonado. En el caso de que no se obtenga un clon que contenga ADN de una longitud suficiente para provocar la recombinación homóloga, es decir, un clon de preferentemente 7 kpb ó mayor, más preferentemente 10 kpb ó mayor, se puede escindir ADN de una pluralidad de clones en sitios enzimáticos de restricción apropiados y los mismos se pueden ligar.

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2. Construcción del vector dirigido

Un marcador de selección positiva tal como un gen de resistencia a fármacos, preferentemente un gen de resistencia a neomicina, se introduce en un sitio enzimático de restricción de una región exónica en el ADN obtenido con una longitud suficiente para conseguir una recombinación homóloga. Además, una parte del exón se puede eliminar y sustituir con un gen de resistencia a fármacos. Cuando no existe un sitio enzimático de restricción apropiado, se pueden introducir sitios enzimáticos de restricción apropiados mediante PCR usando un cebador designado para incluir sitios enzimáticos de restricción, por ligación de oligonucleótidos que incluyan sitios enzimáticos de restricción y otros similares.

Preferentemente, el vector incluye un marcador de selección negativa tal como el gen de la timidina quinasa y el gen de la toxina de la difteria para eliminar células ES que no experimentan recombinación homóloga entre el ADN introducido y el gen de la subunidad \alpha_{1B} del canal Ca tipo N en la que el ADN introducido se inserta en un sitio que no es el gen de la subunidad \alpha_{1B} del canal Ca tipo N.

Estas técnicas de ADN recombinante para manipular secuencias nucleotídicas de ADN se pueden implementar según, por ejemplo, los métodos descritos en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", de Sambruck, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, aunque dichas técnicas no se limitan a estos métodos siempre que se pueda obtener ADN recombinante apropiado.

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3. Adquisición de una célula madre embrionaria (célula ES) que haya experimentado recombinación homóloga

El vector dirigido preparado se digiere con enzimas de restricción para formar ADN lineal, se purifica mediante, por ejemplo, extracción con fenol/cloroformo, electrofóresis en agarosa, ultracentrifugación y similares, y se transfecta a una célula ES, por ejemplo, TT2. Entre los ejemplos del método de transfección se incluyen electroporación, lipofección y otros similares, aunque la presente invención no se limita a estos métodos.

La célula transfectada se cultiva en un medio de selección apropiado, por ejemplo, un medio de selección que contenga neomicina y ganciclovir cuando se construya un vector dirigido en el que se hayan incorporado un gen de resistencia a neomicina y un gen de timidina quinasa.

Mediante PCR ó similar se confirma fácilmente que un gen introducido, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, está incorporado en una célula ES que presenta resistencia a ambos fármacos y que crece. Además, la aparición de la recombinación homóloga también se puede confirmar mediante análisis de transferencia Southern usando una parte aguas arriba extremo 5' ó aguas abajo extremo 3' de ADN fuera del vector dirigido como sonda. Además, se puede confirmar mediante análisis de transferencia Southern usando ADN con el vector dirigido como sonda que el vector dirigido no se inserta aleatoriamente. Combinando estos métodos se puede obtener una célula ES que haya experimentado recombinación homóloga.

A continuación se describirá un ejemplo de un método para preparar un ratón knockout, aunque la presente invención no se limita a este ejemplo.

Se prepara un ratón knockout realizando las etapas de recogida de un embrión de 8 células o un blastocisto después de la fertilización, microinyección de una célula ES que haya experimentado recombinación homóloga, implantación de un óvulo manipulado en un ratón seudopreñado, parto del ratón seudopreñado y cría de la progenie, selección de un ratón transgénico por PCR y transferencia Southern, y establecimiento del árbol genealógico de los ratones que tengan el gen introducido (Yagi, T. et al., Analytical Biochem., 214, pág. 70, 1993).

1. Recogida de embrión de 8 células o blastocisto

En cuanto a los óvulos fertilizados, a un ratón hembra se le administran intraperitonealmente 5 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada y 2,5 UI de gonadotropina coriónica humana para inducir una superovulación, y se obtiene un embrión de 8 células del ratón hembra el día 2,5 después de la fertilización mediante el método de perfusión de oviductos y útero. Cuando se usa un blastocisto, el útero de un ratón hembra se extrae el día 3,5 después de la fertilización y se obtiene un embrión mediante perfusión uterina.

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2. Microinyección de una célula ES que ha experimentado recombinación homóloga

En el blastocisto o embrión de 8 células obtenido se microinyecta una célula ES que haya experimentado recombinación homóloga. La microinyección se puede realizar bajo un microscopio invertido usando un micromanipulador, microinyector, pipeta de inyección y pipeta de sujeción basándose, por ejemplo, en las descripciones de "A laboratory Manual", Hogan, B.L.M., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1986 (Yagi, T. et al., Analytical Biochem., 214, pág. 70, 1993). Además, como placa de inyección, por ejemplo, se usan pequeñas gotas del medio de 5 \mul y pequeñas gotas que contienen células ES flotantes formadas sobre Falcon 3002 (Becton Dickinson Labware), sobre las que se superpone parafina líquida. En lo sucesivo, a un blastocisto o embrión de 8 células microinyectado con una célula ES que haya experimentado recombinación homóloga se le hace referencia como óvulo manipulado.

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3. Implantación del óvulo manipulado en un ratón seudopreñado

Un ratón macho vasoligado y un ratón hembra normal se aparean para preparar un ratón seudopreñado, en el que se implanta un óvulo manipulado. La implantación de un óvulo manipulado se puede realizar basándose, por ejemplo, en las descripciones de "A laboratory Manual", de Hogan, B.L.M., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1986, y Analytical Biochem., de Yagi, T. et al., 214, p. 70, 1993. A continuación se describirá un ejemplo de procedimiento específico, aunque la presente invención no se limita a este ejemplo.

Un ratón seudopreñado se anestesia generalmente usando, por ejemplo, 50 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico. A continuación, se hace una incisión de aproximadamente 1 cm en ambas ijadas para exponer el ovario y el oviducto. Se hace una incisión en la bolsa ovárica usando pinzas bajo un microscopio estereoscópico para exponer las fimbrias tubáricas. Subsiguientemente, en las fimbrias tubáricas se introducen de 7 a 8 óvulos manipulados por oviducto. En este momento, la implantación de los óvulos manipulados en el oviducto se confirma por microburbujas de aire insertadas junto con los óvulos manipulados. A continuación, el oviducto y el ovario se devuelven a la cavidad abdominal, se suturan ambos sitios de la incisión, y se despierta al ratón de la anestesia. En algunos casos, se pueden cultivar óvulos manipulados hasta el día siguiente para que evolucionen a un blastocisto y a continuación se implantan en el útero.

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4. Parto del ratón seudopreñado y cría de la progenie

En muchos casos, se pueden obtener ratones descendientes el día 17 después de la implantación. Los ratones descendientes son habitualmente ratones quiméricos obtenidos a partir de la célula ES que ha experimentado recombinación homóloga y una célula del ratón a partir del cual se recoge el óvulo fertilizado. Por ejemplo, cuando se usa TT2 como célula ES y la misma se inyecta en un embrión de 8 células recogido de ICR, un ratón descendiente que tenga un elevado porcentaje quimérico presenta un color del pelo predominantemente agutí, mientras que un ratón que tenga un bajo porcentaje quimérico presenta un color del pelo predominantemente blanco.

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5. Cribado mediante PCR y transferencia Southern para encontrar un ratón con gen introducido

Se puede confirmar fácilmente si el gen está presente en una célula germinal por el color del pelo de un ratón descendiente obtenido mediante apareamiento de un ratón de interés con un ratón que tenga un color de pelo blanco, por ejemplo, ICR. Alternativamente, como se espera que un ratón que tiene un alto porcentaje quimérico tenga también una célula germinal que contenga el gen introducido, la presencia o ausencia del gen se puede confirmar usando un ratón que tenga un porcentaje quimérico lo más alto posible para el apareamiento, extrayendo ADN de la cola del ratón descendiente obtenido y sometiendo su ADN a PCR. Además, se puede identificar de forma más fiable un genotipo realizando un análisis de transferencia Southern en lugar de la PCR.

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6. Establecimiento del linaje de ratones que tienen el gen introducido

Se puede obtener un ratón N-KO en el que exista el gen introducido homocigóticamente de entre los ratones descendientes obtenidos apareando entre sí ratones heterocigóticos (a los que en lo sucesivo se hará referencia como ratones He). El ratón N-KO se puede obtener apareando entre sí ratones He, un ratón He con un ratón N-KO, o ratones N-KO entre sí.

La presencia o ausencia de expresión del ARNm de la subunidad \alpha_{1B} en el ratón N-KO se puede confirmar mediante análisis de transferencia Northern, RT-PCR, ensayo de protección a la RNasa, hibridación in situ o similares. Además, la expresión de la proteína de la subunidad \alpha_{1B} se puede confirmar mediante tinción inmunohistoquímica, \omega-conotoxina marcada o similares. Además, también se puede confirmar una función de un canal de Ca tipo N que incluya la subunidad \alpha_{1B} mediante un método electrofisiológico o similar.

Por otra parte, tal como se ha descrito anteriormente, los inventores de la presente invención observaron que un animal que carece de la codificación genética para un canal de Ca tipo N perdía el control de la presión sanguínea a través del sistema nervioso autónomo, tenía defectos en un mecanismo para la transmisión del dolor, especialmente el dolor de la segunda fase que aparece de una manera retardada, y presentaba anomalías en el control del nivel de azúcar en la sangre. Es decir, observaron que el animal presentaba características exclusivas asociadas a la supresión de la codificación genética para un canal de Ca tipo N. El método de determinación de la presente invención se basa en estas observaciones y es un método para determinar una acción de una sustancia que comprende las etapas en las que se administra una sustancia tal como un compuesto al animal de la presente invención y se determina la acción de la sustancia sobre el animal.

El método de determinación de la presente invención comprende preferentemente las etapas en las que se administra una sustancia al animal de la presente invención y a un animal tipo salvaje y se comparan acciones de la sustancia sobre el animal de la presente invención y el animal tipo salvaje para determinar la acción de la sustancia sobre el canal de Ca tipo N. La influencia de la sustancia sobre el canal de Ca tipo N se puede revisar determinando la acción sobre el canal de Ca tipo N.

El término acción se refiere a una acción sobre una característica exclusiva del animal. Por ejemplo, cuando se presta atención a la anomalía del animal en el control de la presión sanguínea, la transmisión del dolor o el control del nivel de azúcar en la sangre, el término acción se refiere a una acción sobre la presión sanguínea, el dolor o el nivel de azúcar en la sangre. No obstante, la acción no se limita a estos ejemplos siempre que la misma esté asociada a las características exclusivas del animal. Estas acciones se pueden determinar como actividades de las sustancias.

Además, un tipo salvaje significa que no se ha perdido el canal de Ca tipo N funcional.

La presente invención proporciona además un método de cribado para encontrar una sustancia que tiene una acción farmacológica usando el animal de la presente invención (animal no humano deficiente en el canal de Ca tipo N). Específicamente, un método de cribado para encontrar una sustancia que tiene una acción farmacológica, por ejemplo, una sustancia que actúa sobre la presión sanguínea, la transmisión del dolor o el nivel de azúcar en la sangre del animal (es decir, una sustancia que tiene una acción para reducir la presión sanguínea, una sustancia que tiene una acción analgésica o una sustancia que tiene una acción para reducir el nivel de azúcar en la sangre) usando el método de determinación de la presente invención.

Como ejemplos, a continuación se describirán en este orden una sustancia que tiene una acción para reducir la presión sanguínea, una sustancia que tiene una acción analgésica o una sustancia que tiene una acción para reducir el nivel de azúcar en la sangre. No obstante, cualquier sustancia queda incluida dentro del alcance de la presente invención siempre que se obtenga utilizando un sistema de cribado que use el animal de la presente invención.

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1. Método de cribado para encontrar una sustancia que tenga una acción destinada a reducir la presión sanguínea (fármaco hipotensor)

Se pueden cribar sustancias candidatas para encontrar una sustancia que tenga una acción destinada a reducir la presión sanguínea a través del bloqueo del influjo de Ca^{2+} que pasa a través del canal de Ca tipo N administrando cada una de las sustancias candidatas a un animal no humano deficiente en el canal de Ca tipo N (animal N-KO) y a un animal tipo salvaje no deficiente en el canal (animal Wt) y seleccionando un fármaco que reduzca la presión sanguínea en el animal Wt, aunque no en el animal N-KO.

Además, por contraposición, se pueden cribar sustancias candidatas para encontrar una sustancia que tenga una acción destinada a reducir la presión sanguínea sin bloquear el influjo del Ca^{2+} que pasa a través del canal de Ca tipo N seleccionando una sustancia que tenga una acción para reducir la presión sanguínea en el animal N-KO. Aunque se había esperado que el ratón N-KO de la presente invención fuera deficiente en el control de la presión sanguínea a través de sistemas nerviosos, la presión sanguínea media de los ratones N-KO fue mayor que la correspondiente a los animal Wt y esto sugirió que en el animal N-KO actuaba de forma intensa un sistema de control de la presión sanguínea a través de un factor endógeno. Por lo tanto, el animal N-KO resulta particularmente útil para un cribado con el fin de encontrar una sustancia que tenga una acción destinada a reducir la presión sanguínea a través de un factor endógeno.

Específicamente, por ejemplo, cuando se usan un ratón N-KO y un ratón tipo salvaje (al que en lo sucesivo se hará referencia como ratón Wt), tras la anestesia de cada ratón, se coloca un tubo en la traquea y se obtiene respiración artificial usando un respirador para animales con ventilación de aire de 0,2 ml a una frecuencia respiratoria de 140 respiraciones/minuto. En la arteria carótida común derecha se inserta un tubo de polietileno llenado con una solución salina fisiológica que contiene heparina, y el mismo se conecta a un transductor de presión para medir la presión sanguínea. Cada una de las sustancias candidatas que se va a someter al cribado se administra usando un catéter permanente colocado en la arteria carótida común izquierda, y de entre los candidatos se selecciona una sustancia que tenga una acción para reducir la presión sanguínea.

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2. Método de cribado para encontrar una sustancia que tenga una acción analgésica (fármaco analgésico)

Se pueden cribar sustancias candidatas para encontrar una sustancia que tenga una acción analgésica a través o no del bloqueo del influjo de Ca^{2+} que pasa a través del canal de Ca tipo N administrando las sustancias candidatas a un animal N-KO y un animal Wt y comparando sus acciones analgésicas. La acción analgésica se puede confirmar, por ejemplo, mediante una prueba de formalina, una prueba de placa caliente, una prueba de contorsión inducida por ácido acético, una prueba de retirada de cola, una prueba de pinzamiento de cola, o similares.

Específicamente, por ejemplo, en el caso de una prueba de formalina usando un ratón N-KO y un ratón Wt, se administran subcutáneamente 20 \mul de formalina al 3% a cada uno de entre el ratón N-KO y el ratón Wt en la planta de la pata trasera izquierda. A continuación, se midió la duración del comportamiento del ratón lamiéndose su pata trasera izquierda (lametones) durante 30 minutos para ser usado como un indicador del dolor. Se administran sustancias sometidas al cribado, y se puede seleccionar una sustancia que reduzca el indicador de dolor.

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3. Método de cribado para encontrar una sustancia que tiene una acción destinada a reducir el nivel de azúcar en la sangre (fármaco hipoglucemiante)

Se pueden cribar sustancias candidatas para encontrar una sustancia que tenga una acción hipoglucemiante a través o no del bloqueo del influjo de Ca^{2+} que pasa a través del canal de Ca tipo N administrando cada una de las sustancias candidatas a un animal N-KO y un animal Wt y comparando sus acciones hipoglucemiantes.

Específicamente, por ejemplo, cuando se usan un ratón N-KO y un ratón Wt, se extrae sangre de la vena caudal de cada uno de entre el ratón N-KO y el ratón Wt en condiciones de alimentación (ayuno durante 2 horas antes de la extracción de sangre) o en condiciones de ayuno (ayuno durante 18 horas) y se mide el nivel de azúcar en la sangre. El nivel de azúcar en la sangre se puede medir, por ejemplo, de la manera siguiente. Se mezclan 10 \mul de sangre y 90 \mul de ácido perclórico 0,6 N y los mismos se someten a centrifugación (7.000 rpm, 2 minutos). A continuación, se mezclan 20 \mul del sobrenadante y 300 \mul de solución de revelado de color de Glucose CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries) y se deja que los mismos reaccionen a 37ºC durante 5 minutos, y se mide la absorción de la mezcla de la reacción en 505 nm.

Un fármaco que contenga una sustancia que tenga una acción farmacológica como ingrediente activo se puede elaborar según un método habitual de preparación de fármacos. El fármaco puede ser una composición farmacéutica de una sustancia que tenga una acción farmacológica y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

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Ejemplos

La presente invención se explicará más específicamente en referencia a los siguientes ejemplos. No obstante, el alcance de la presente invención no se limita a estos ejemplos.

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Ejemplo 1

Disrupción de la codificación genética para el canal de Ca tipo N mediante direccionamiento génico (1) Clonación de la codificación genética para la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N

Se designaron cebadores (N.º ID SEC: 4 y 5) basándose en la secuencia nucleotídica del gen de la subunidad \alpha_{1B} de ratón descrito en FEBS Letters, 338, págs. 1 a 5, 1994, y se realizó una PCR usando la genoteca de ADNc de ratón como molde para obtener ADN que tuviera la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 6. Usando como sonda este ADN, se aisló de una genoteca genómica de ratón obtenido de 129SVJ (\lambdaFIXII) un ADN clonado fágico con una parte de la codificación genética para la subunidad \alpha_{1B} del canal de Ca tipo N. En la Fig. 1 se muestra el mapa de enzimas de restricción del ADN clonado fágico obtenido.

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(2) Construcción del vector dirigido

Se preparó un vector dirigido mediante un método en el que como región genética homóloga se usó una región que incluía el exón B en el gen de la subunidad \alpha_{1B}; en el exón B se introdujo un gen de resistencia a neomicina (Fig. 1), y como gen de selección negativa se introdujo el gen de la timidina quinasa del virus herpes simplex (Suzanne, L. et al., Nature, 336, pág. 348, 1988).

En las Figs. 2 a 4 se muestra el esquema de la construcción. El ADN clonado fágico obtenido en el punto (1) se digirió con BamHI y se subclonó en pBluescript II SK+ para obtener pBS59 y pBS58 con los fragmentos mostrados en las Figs. 2 y 3. El ADN clonado fágico se digirió también con HindIII y se subclonó en pBluescript II SK+ para obtener pBS63 con un fragmento mostrado en la Fig. 2. El pBS59 se digirió con AatII y EcoRI y en el mismo se introdujo un fragmento escindido de pBS63 con AatII y HindIII para obtener pBS59/63. Este pBS59/63 se digirió con AatII y en el mismo se introdujo un fragmento que incluía el gen de resistencia a neomicina para preparar pBS59/63n. Este último se digirió adicionalmente con EcoRV y en el mismo se introdujo un fragmento escindido de pBS58 con EcoRV para preparar pBS59/63/58n. El gen de la timidina quinasa, que es un gen de selección, se introdujo en el sitio SalI-XhoI de un sitio de clonación múltiple en pBS59/63/58n para producir un vector
dirigido.

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(3) Adquisición de una célula madre embrionaria (célula ES) que ha experimentado recombinación homóloga

El vector dirigido obtenido en el punto (2) se digirió con NotI para formar ADN lineal (1 mg/ml). Como célula ES de ratón, se usó TT2 (Analytical Biochem. de Yagi, T. et al., 214, pág. 70, 1993). El vector dirigido lineal (200 \mug/ml) se transfectó a las células ES (1 x 10^{7} células/ml) mediante electroporación (250 V, 975 \muF, temperatura ambiente), y las células se cultivaron en un medio que contenía G418 (250 \mug/ml) y ganciclovir (0,2 \muM) durante 3 días desde el día 2 de cultivo, y a continuación se cultivaron en un medio que contenía G418 (250 \mug/ml) durante 3 días. De una parte de las colonias de células ES generadas se extrajo ADN, y se realizó una PCR usando como molde este ADN, y como cebadores ADN que tenía la secuencia nucleotídica (N.º ID SEC: 7) fuera del vector dirigido y ADN que tenía la secuencia nucleotídica (N.º ID SEC: 8) incluida en el gen introducido (gen de resistencia a neomicina). Los clones que generan un producto de la PCR de 3,7 kb se consideraron como candidatos que tenían la posibilidad de haber experimentado recombinación homóloga.

Entre los clones candidatos, se identificó mediante análisis de transferencia Southern un clon que había experimentado únicamente recombinación homóloga. El genoma extraído se digirió con ApaLI y BalI, se hibridó con una sonda Pro9P fuera del vector dirigido (mediante PCR se obtuvo aproximadamente 0,9 kbp de ADN aguas arriba extremo 5' de la región recombinada homólogamente, véase Fig. 1) y una sonda Pro8 dentro del vector dirigido (aproximadamente 0,8 kbp de ADN escindido de pBS59 con SphI y BamHI, véase Fig. 1). Se seleccionó un clon que había experimentado recombinación homóloga, es decir, se seleccionó un clon para el que se detectó una banda de 6,9 kb en el producto de digestión de ApaL1 y se detectó una banda de 4,6 kb en el producto de la digestión de BalI cuando se usó Pro9P como sonda, mientras que cuando como sonda se usó Pro8 se detectó una banda de 6,9 kb en el producto de digestión de ApaL1 y se detectó una banda de 2,4 kb en el producto de digestión de BalI.

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(4) Preparación del ratón N-KO

A un ratón hembra se le administraron intraperitonealmente 5 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG, Serotropin, Teikoku Hormone Mfg., Tokyo) y 2,5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG, Gonatropin, Teikoku, Hormone Mfg., Tokyo). El día 2,5 después de la fertilización, se obtuvo un embrión de 8 células mediante el método de perfusión de oviductos y útero.

Las células ES que habían experimentado recombinación homóloga obtenidas en el punto (3) se microinyectaron en el embrión de 8 células bajo un microscopio invertido (DIAPHOTO TMD, Nippon Kogaku Kogyo, Tokyo) usando un micromanipulador (manipulador eléctrico de ajuste grueso equipado con un micromanipulador hidráulico de aceite, tridimensional, con joystick y del tipo suspendido, Narishige, Tokyo), un microinyector (Narishige, Tokyo), una pipeta de inyección y una pipeta de sujeción. Además, como placa de inyección, se usaron varias gotas pequeñas de medio de 5 \mul que contenían células ES flotantes formadas en Falcon 3002 (Becton Dickinson Labware) y sobre las que se había superpuesto parafina líquida.

Se aparearon ratones macho vasoligados y ratones hembra normales para preparar ratones seudopreñados, y en los ratones seudopreñados se implantaron óvulos manipulados en los que se microinyectaron tres clones de células ES diferentes que habían experimentado recombinación homóloga. Los ratones seudopreñados se anestesiaron en general con 50 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico (Nembutal, Abbott Laboratories). A continuación, se realizó una incisión de aproximadamente 1 cm en ambas ijadas para dejar al descubierto el ovario y el oviducto. Se realizó una incisión en la bolsa ovárica usando pinzas bajo un microscopio estereoscópico para dejar al descubierto las fimbrias tubáricas. Subsiguientemente, hacia las fimbrias tubáricas se transfirieron de 7 a 8 óvulos manipulados por oviducto. A continuación, el oviducto y el ovario se devolvieron a la cavidad abdominal, y se suturaron ambos sitios de
incisión.

Los ratones en los que se implantaron los óvulos manipulados para quedar preñados dieron a luz un ratón 100% quimérico con un color de pelo negro. Para confirmar que las células germinales del ratón 100% quimérico obtenido se derivaban de las células ES, el ratón quimérico se apareó con un ratón hembra ICR, y se examinaron sus ratones descendientes. El color del pelo de todos los ratones descendientes era negro, y por lo tanto se confirmó que las células germinales del ratón quimérico se derivaban de las células ES. Se obtuvieron ratones He apareando el ratón quimérico con C57BL/6, y se obtuvo un ratón N-KO apareando ratones He entre sí.

Los genotipos de los ratones obtenidos se confirmaron basándose en diferencias en el tamaño de fragmentos de ADN generados mediante PCR. Se realizó una escisión de una longitud de aproximadamente entre 2 y 3 milímetros en la cola de cada ratón y la misma se digirió (55ºC, 2 horas) con una solución de proteinasa K (se diluyó dos veces tampón de lisis (Perkin Elmer) con PBS(-), mercaptoetanol al 1%, 0,25 mg/ml de proteinasa K). Seguidamente, se extrajo ADN genómico mediante un método habitual y el mismo se disolvió en entre 100 y 200 \mul de agua destilada para preparar un molde para PCR. Se designaron cebadores para la secuencia incluida en el gen de resistencia a neomicina (N.º ID SEC: 8) y dos sitios en el gen de la subunidad \alpha_{1B} (N.º ID SEC: 9 y 10), y se realizó una PCR para identificar el genotipo de cada individuo. El gen que había experimentado una mutación produjo un producto de la PCR de 520 bp, mientras que el gen tipo salvaje produjo un producto de la PCR de 490 bp.

Tal como es necesario, el genotipo se confirmó también mediante análisis de transferencia Southern. Cuando el ADN genómico extraído de la cola del ratón se digirió con BamHI, y una región adyacente al gen de resistencia a neomicina en el vector dirigido se hibridó con una sonda ProN (aproximadamente ADN de 1 kbp escindido de pBS59 con NcoI, véase Fig. 1), únicamente se detectó una banda de 3,1 kb para el ratón N-KO.

Se confirmó la cantidad de expresión de ARNm en el cerebro del ratón mediante transferencia Northern. Mediante el método AGPC se extrajo ARN total de cada uno de los cerebros de 3 ratones que tenían cada genotipo. A partir del ARN total se obtuvo ARNm purificado usando una columna de oligo dT (Amersham Pharmacia Biotech). El ARNm (5 \mug/calle) se sometió a electrofóresis en gel 0,5% y se hibridó con ADN que tenía la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 6 como sonda. El análisis de transferencia Northern reveló que el ARNm expresado en el ratón Wt había desaparecido completamente en el ratón N-KO.

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(5) Confirmación del N-KO basándose en corriente eléctrica que se hace pasar a través del canal de Ca tipo N

Usando células nerviosas en los ganglios de la raíz dorsal del ratón Wt y el ratón N-KO, se midieron cambios en la cantidad de influjo de Ca^{2+} inhibido por la \omega-conotoxina GVIA usando Ba^{2+} como portador de carga mediante el método de pinzamiento de membrana (del inglés patch clamp) en célula completa.

Se anestesió un ratón de entre 5 y 8 semanas de edad con éter, y sus ganglios de la raíz dorsal fueron extraídos y digeridos en una solución de Krebs usando pronasa (0,2 mg/ml) en primer lugar durante 30 minutos y a continuación termolisina (0,2 mg/ml) durante 30 minutos para aislar células.

Un amplificador de pinzamiento de membrana (Axopatch 200B) se fijó en un modo de célula completa, y se realizó una medición a temperatura ambiente. Se preparó una pipeta de membrana (diámetro externo: 1,5 mm, diámetro interno: 1,1 mm) usando un extractor de micropipeta P-87 Flaming-Brown (Sutter Instrument). Como solución externa de las células nerviosas aisladas se usó una solución que contenía BaCl_{2} 3 mM, cloruro de tetraetilamonio 155 mM, HEPES 10 mM y glucosa 10 mM (pH 7.4) y la pipeta de membrana se llenó con una solución que contenía aspartato de cesio 85 mM, CsCl 40 mM, MgCl_{2} 2 mM, EGTA 5 mM, ATPMg 2 mM, HEPES 5 mM y fosfato de creatina 10 mM (pH 7,4). La resistencia eléctrica de la pipeta era 1-2 Mohm, y la corriente de Ba^{2+} obtenida mediante un estímulo a 100 kHz se analizó usando el pCLAMP (Axon Instruments). Se midieron las corrientes de los canales de Ca totales de células nerviosas para el ratón Wt y el N-KO, y se adicionó la \omega-conotoxina GVIA (1 \muM) para medir la corriente diferente a la del canal de Ca tipo N.

Los resultados se muestran en la Fig. 5. Los valores de la figura son valores medios, y las barras representan desviaciones estándar (Wt (+/+): n = 4, N-KO (-/-): n = 7). Se demostró electrofisiológicamente que en células nerviosas de los ganglios de la raíz dorsal del nervio extraídos del ratón N-KO no se observó el influjo de Ca^{2+} inhibido por la \omega-conotoxina GVIA, y por lo tanto se confirmó que el ratón N-KO carecía del canal de Ca tipo N funcional.

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(6) Comparación del peso corporal, el ritmo cardíaco y la presión sanguínea entre genotipos

Se compararon y examinaron el peso corporal, el ritmo cardíaco y la presión sanguínea media de un ratón Wt y los correspondientes a un ratón N-KO. Los ratones Wt (de entre 15 y 16 semanas de edad, machos, n=4) y los ratones N-KO (de entre 15 y 16 semanas de edad, machos, n=4) se anestesiaron con uretano 10%. Tras una intubación traqueal, se realizó una respiración artificial usando un ventilador para animales (Columbs) con un volumen de ventilación de 0,2 ml a una frecuencia respiratoria de 140 respiraciones/minuto. En la arteria carótida común derecha se insertó un tubo de polietileno lleno de solución salina fisiológica que contenía heparina y el mismo se conectó a un transductor de presión (Millar, Modelo MPC-500) para medir la presión sanguínea. El ritmo cardíaco se obtuvo a partir del pulso de la presión sanguínea.

Los resultados se muestran en la Fig. 6. Los valores de la figura son valores medios, y las diferencias significativas se determinaron mediante la prueba t. No hubo ninguna diferencia en el peso corporal entre los dos grupos (28,2 \pm 3,2 g con respecto a 30,8 \pm 4,0 g). El ritmo cardíaco y la presión sanguínea media de los ratones N-KO eran significativamente mayores que los correspondientes a los ratones Wt (562 \pm 101,9 latidos/minuto con respecto a 742 \pm 32,5 latidos/minuto, p < 0,05, 73,4 \pm 7,7 mmHg con respecto a 100,0 \pm 6,6 mmHg, p < 0,05).

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Se considera que estos resultados sugieren una posibilidad de que el ritmo cardíaco y la presión sanguínea se mantuvieron en un nivel constante debido a vagotonía en el ratón Wt, mientras que en el ratón N-KO se perdió un estado de vagotonía debido a la carencia de inervación simpática e inervación parasimpática, y el ritmo cardíaco y la presión sanguínea fueron significativamente mayores. Además, se considera también que es posible que el ratón N-KO tenga constantemente niveles mayores de factores implicados en el aumento de la presión tales como sustancias neurotransmisoras incluyendo noradrenalina, angiotensina II, endotelina, etcétera.

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Ejemplo 2

Cambios en la presión sanguínea con la administración de \omega-conotoxina GVIA al ratón

Se evaluaron cambios en el ritmo cardíaco y la presión sanguínea de un ratón Wt y los correspondientes a un ratón N-KO debido a la \omega-conotoxina GVIA. Los ratones Wt (de entre 15 y 16 semanas de edad, machos, peso corporal 28,2 \pm 3,2 g, n = 4) y los ratones N-KO (de entre 15 y 16 semanas de edad, machos, peso corporal 30,8 \pm 4,0 g, n = 4) se anestesiaron con uretano 10%. Tras una intubación traqueal, se realizó una respiración artificial usando un ventilador para animales (Columbs) con un volumen de ventilación de 0,2 ml a una frecuencia respiratoria de 140 respiraciones/minuto. En la arteria carótida común derecha se insertó un tubo de polietileno lleno de solución salina fisiológica que contenía heparina y el mismo se conectó a un transductor de presión (Millar, Modelo MPC-500) para medir la presión sanguínea. Además, se implantó un catéter en la arteria carótida común izquierda para administrar \omega-conotoxina GVIA (omega-CgTx GVIA, 30 \mug/kg).

Los resultados se muestran en la Fig. 7. Los valores de la figura son valores medios, y las barras representan desviaciones estándar. En los ratones Wt, desde los 10 minutos después de la administración se observaron disminuciones significativas del ritmo cardíaco y la presión sanguínea. Por otro lado, en el ratón N-KO no se observaron cambios en el ritmo cardíaco ni en la presión sanguínea ni siquiera después de la administración de \omega-conotoxina GVIA.

Estos resultados sugieren que el canal de Ca tipo N debería estar implicado en los controles del ritmo cardíaco y la presión sanguínea. Por lo tanto, se considera que el ratón N-KO es un modelo animal útil para dilucidar los mecanismos de control del ritmo cardíaco y la presión sanguínea.

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Ejemplo 3

Experimento sobre el mecanismo de control de la presión sanguínea - examen del cambio de la presión sanguínea con oclusión bilateral de carótida

Se evaluaron los cambios de presión sanguínea con oclusión bilateral de carótida (a la que en adelante se hace referencia como BCO) en un ratón Wt y un ratón N-KO. Los ratones Wt (de entre 15 y 16 semanas de edad, machos, peso corporal 28,2 \pm 3,2 g, n = 4) y los ratones N-KO (de entre 15 y 16 semanas de edad, machos, peso corporal 30,8 \pm 4,0 g, n = 4) se anestesiaron con uretano 10%. Tras una intubación traqueal, se realizó una respiración artificial usando un ventilador para animales (Columbs) con un volumen de ventilación de 0,2 ml a una frecuencia respiratoria de 140 respiraciones/minuto. En la arteria carótida común derecha se insertó un tubo de polietileno lleno de solución salina fisiológica que contenía heparina y el mismo se conectó a un transductor de presión (Millar, Modelo MPC-500) para medir la presión sanguínea. Además, en la arteria carótida común izquierda se colocó un hilo de seda (Natsume, aguja de sutura con hilo, Seda ancha negra n.º 8-0) para oclusión arterial, y el flujo sanguíneo se detuvo temporalmente manteniendo el hilo de seda hacia arriba para obtener un estado de BCO.

Como consecuencia de la BCO durante 30 segundos, se observó un aumento temporal de la presión sanguínea en los ratones Wt, aunque este aumento de la presión sanguínea desapareció en gran parte después de la administración de \omega-conotoxina GVIA (30 \mug/kg). Por otro lado, en los ratones N-KO no se observó ningún aumento de la presión sanguínea ni siquiera en el estado de BCO. En la Fig. 8 se muestran datos típicos (líneas superiores: presión arterial, líneas inferiores: presión sanguínea media en la Fig. 8).

A partir de estos resultados, se considera que el ratón N-KO carecía de un mecanismo de reflejo de presión a través de un receptor de presión presente en la arteria carótida interna, y que no se liberaron sustancias neurotransmisoras por lo menos desde un neuroterminal de la fibra postganglionar del nervio simpático.

Se considera que usando el ratón N-KO se pueden revelar los roles del canal de Ca de cada subtipo en un neuroterminal autónomo implicado en el mecanismo de control cardiocirculatorio.

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Ejemplo 4

Examen del efecto analgésico con la administración de formalina

En este experimento, se usaron un ratón Wt, un ratón He y un ratón N-KO (machos, de 6 semanas de edad). A 970 \mul de solución salina fisiológica se le adicionaron 30 \mul de solución de formaldehído (WAKO, entre el 35 y el 38%, primera calidad, lote n.º DLL4284). A esto se le hace referencia como formalina al 3%. Al ratón se le administraron subcutáneamente 20 \mul de la formalina al 3% en la planta de la pata trasera izquierda. Después de que se administrara la formalina, se midió la duración del comportamiento del ratón lamiéndose su pata trasera izquierda (lametones) durante 30 minutos para ser usado como indicador de dolor. La duración se calculó cada 5 minutos y se representó en segundos. La diferencia significativa se obtuvo realizando un análisis de varianza de una vía, paramétrico, y a continuación una prueba de comparación múltiple de Dunnet (*: 0,01(p<0,05, **: p<0,01 con respecto al grupo de control). En la prueba, se usó un sistema de soporte de análisis estadístico en el que se incorporó el SAS 6.12 (SAS Institute Japón, Tokyo).

Como consecuencia, no se observó ninguna diferencia para el dolor en una primera fase (de 0 a 5 minutos) en el ratón N-KO en comparación con el ratón Wt y el ratón He, aunque se observó un efecto analgésico sobre el dolor en una segunda fase (de 15 a 30 minutos) (Fig. 9). Esto sugiere que el canal de Ca tipo N está implicado en la transmisión del dolor. Sugiere también que, como la transmisión de dolor no se suprime completamente, el ratón N-KO resulta útil para la evaluación de fármacos analgésicos a través de puntos de acción que no sean el canal de Ca tipo N.

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Ejemplo 5

Nivel de azúcar en la sangre del ratón N-KO 1. Medición del nivel de azúcar en la sangre del ratón N-KO

Se extrajeron 10 \mul de sangre de cada vena caudal de ratones N-KO y ratones Wt (Wt (+/+) machos: n = 9, Wt hembras: n = 10, N-KO (-/-) machos: n = 10, N-KO hembras: n = 10) en condiciones de alimentación (en ayuno durante 2 horas antes de la extracción de sangre) o en condiciones de ayuno (en ayuno durante 18 horas), los mismos se mezclaron con 90 \mul de ácido perclórico 0,6 N y se centrifugaron (7.000 rpm, 2 minutos). 20 \mul del sobrenadante y 300 \mul de una solución de revelado de color de Glucose CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries) se mezclaron en una microplaca de 96 pocillos, y se dejaron reaccionar a 37ºC durante 5 minutos, y se midió la absorbancia de la mezcla a 505 nm.

Los resultados se muestran en la Fig. 10. Los valores de la figura son valores medios. En el caso de las condiciones de alimentación, los ratones N-KO presentaron unos niveles de azúcar en sangre significativamente bajos en comparación con los de los ratones Wt (prueba t). Por otro lado, en las condiciones de ayuno, no se observó ninguna diferencia significativa entre los niveles de azúcar en sangre de dichos ratones.

Estos resultados muestran que el nivel de azúcar en sangre se puede elevar por activación de la neurotransmisión a través del canal de Ca tipo N e indican que el canal de Ca tipo N debería estar implicado en la normalización del nivel de azúcar en la sangre (mantenimiento de la homeostasis).

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2. Prueba de tolerancia a la glucosa del ratón N-KO

A ratones Wt y ratones N-KO (machos, de entre 9 y 10 meses de edad, Wt: n = 9, N-KO: n = 9 para determinación del nivel de azúcar en la sangre, Wt: n = 8, N-KO: n = 9 para determinación del nivel de insulina) que habían estado en ayuno durante 16 horas se les administró oralmente 2 g/kg de peso corporal de solución de glucosa al 20%, y después de 0, 05, 1, 2, 3 y 4 horas se extrajeron 10 \mul de sangre de la vena caudal para medir el nivel de azúcar en la sangre mediante el mismo método que se ha descrito anteriormente. Además, 10 \mul de sangre extraídos de la misma manera se mezclaron con 10 \mul de solución salina fisiológica que contenía heparina y los mismos se centrifugaron, y a continuación se cuantificó el nivel de insulina en el sobrenadante usando un kit de inmunoensayo enzimático (Morinaga Milk Industry Co., Ltd, Biochemical Research Laboratory). En las Figs. 11 y 12 se muestran respectivamente los niveles de azúcar en sangre y los niveles de insulina. En las Figs. 11 y 12, los valores son valores medios, y las barras representan desviaciones estándar.

Tal como se muestra en la Fig. 11, los niveles de azúcar en sangre en ayuno de los ratones N-KO fueron significativamente menores que los de los ratones Wt, y los niveles de azúcar en sangre variaron dentro de un intervalo de valores significativamente bajo incluso después de que se administrase glucosa. Se consideró que los ratones Wt de entre 9 y 10 meses de edad tenían una resistencia a la insulina relacionada con la edad, mientras que los cambios de los niveles de azúcar en sangre de los ratones N-KO fueron similares a los de los ratones jóvenes.

Esta diferencia se presentó también en los niveles de insulina mostrados en la Fig. 12, y los ratones Wt mantuvieron una concentración de insulina elevada antes y después de la administración de glucosa, mientras que el ratón N-KO presentó una concentración de insulina baja, que volvió al nivel de antes de la administración de glucosa después de 1 hora. Además, los niveles de insulina de los ratones Wt variaron significativamente dependiendo de cada individuo.

Estos resultados experimentales indican que el ratón N-KO no se hace resistente a la insulina fácilmente, y que el canal de Ca tipo N está implicado en la resistencia a la insulina e indican además que la activación del canal de Ca tipo N está asociada a la normalización del nivel de azúcar en sangre.

Se midieron también las cantidades de glucagón y leptina, aunque no se observó ninguna diferencia entre los ratones Wt y los ratones N-KO.

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3. Tinción de inmunofluorescencia del bazo

Para confirmar adicionalmente la implicación del canal de Ca tipo N en la resistencia a la insulina, se compararon células \beta pancreáticas en islotes de Langerhans de un ratón Wt y un ratón N-KO.

Un ratón Wt y un ratón N-KO (macho, de 11 meses de edad) se anestesiaron con Nembutal y se sometieron a sección abdominal, a continuación se escindió una parte en torno a una válvula del atrio derecho, y se extrajo sangre. Desde el ventrículo izquierdo se inyectó PBS que contenía heparina (4 U/ml), y se confirmó un blanqueamiento del hígado. A continuación, se inyectó adicionalmente paraformaldehído 4% disuelto en PBS. Cuando se confirmó la rigidez de cada individuo, se extrajo el páncreas y el mismo se fijó con paraformaldehído 4% a 4ºC durante 1 hora. Después de la fijación, el páncreas se dejó por la noche en PBS que contenía sacarosa 30% a 4ºC y se insertó en un compuesto OCT para preparar una sección delgada.

La sección delgada se tiñó usando un suero anti-insulina de cobaya (Linco Research) como anticuerpos primarios y anticuerpos IgG anticobaya marcados con rodamina (Chemicon International) como anticuerpos secundarios, y las células \beta que contenían insulina se observaron con un microscopio de fluorescencia. De forma similar, la sección delgada se tiñó usando anticuerpos anti-glucagón de conejo (Linco Research) y anticuerpos IgG anticonejo marcados con FITC (Organon Teknika), y se observaron las células \alpha que contenían glucagón.

En el ratón N-KO, una agregación celular de células \beta era pequeña, y no se observó ningún aumento en el número de células \beta con el paso del tiempo, lo cual sí se observó en el ratón Wt. Por otro lado, no se observó ninguna diferencia en las células \alpha entre ambos ratones.

Se considera que el ratón Wt presentaba una resistencia a la insulina relacionada con la edad y la producción de insulina en células \beta se aceleró, mientras que el ratón N-KO no presentaba resistencia a la insulina.

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Ejemplo 6

Inervación autónoma de la fuerza de contracción del músculo auricular del ratón N-KO

Se examinó la inervación autónoma de la fuerza de contracción del músculo auricular de un ratón N-KO. Se aislaron los atrios de ratones (ratones Wt y ratones N-KO: n = 5 cada uno de ellos), y se registraron simultáneamente la fuerza de contracción y el potencial de acción entregando un estímulo muscular directo y un estímulo nervioso desde dos estimuladores. En cuanto a las condiciones de los impulsos, el estímulo basal se proporcionó con una frecuencia de 2 Hz, un voltaje justo por encima del umbral y una anchura de impulso de 1 milisegundo. El estímulo nervioso se proporcionó con una frecuencia de 200 Hz, un voltaje 1,5 veces mayor que el estímulo basal y una anchura de impulso de 0,1 milisegundo. Se proporcionaron cuatro estímulos nerviosos por estímulo basal durante un periodo refractario del músculo cardíaco, que duró 15 segundos.

La Fig. 13 muestra resultados experimentales en el atrio izquierdo y el atrio derecho de 5 casos. Los valores son valores medios, y las barras representan desviaciones estándar. En la figura, w-AgTx representa \omega-agatoxina
GIVA.

En el atrio izquierdo, la fuerza de contracción del músculo auricular del ratón Wt se había incrementado considerablemente por el estímulo nervioso en presencia de atropina, y este aumento de la fuerza de contracción quedó casi completamente inhibido por \omega-conotoxina GVIA (\omega-agatoxina GIVA) 30 nM. Por otro lado, aunque en la fuerza de contracción del músculo auricular del ratón N-KO se observó un ligero aumento por el estímulo nervioso en presencia de atropina, este aumento de la fuerza de contracción no quedó suprimido por la \omega-conotoxina GVIA hasta 100 nM. Estos aumentos de la fuerza de contracción quedaron completamente inhibidos mediante tetrodotoxina 0,1 \muM, aunque los datos no se muestran en la figura.

Aunque ningún aumento en la fuerza de contracción del músculo auricular provocado por el estímulo nervioso de atropina no fue tan notable en el músculo auricular derecho como en el atrio izquierdo, el resultado obtenido fue prácticamente similar al del atrio izquierdo.

Se considera que estos resultados sugieren que la liberación de norepinefrina (NE) del nervio simpático dependían en gran parte del canal de Ca tipo N en el ratón Wt, aunque los canales de Ca de otros tipos se incrementaron de una manera compensatoria y contribuyeron a la liberación de NE en el ratón N-KO. En el ratón Wt, se espera que un aumento de la fuerza de contracción por un estímulo nervioso en el atrio derecho sea menor que el correspondiente al atrio izquierdo y por lo tanto existe una diferencia en las densidades de inervación en los atrios izquierdo y
derecho.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un animal que no presenta ninguna expresión funcional del canal de Ca tipo N. Usando el animal de la presente invención se puede deducir la función del canal de Ca tipo N. Además, administrando un fármaco a un animal N-KO y un animal Wt, se puede deducir a partir de la diferencia en sus respuestas si el fármaco actúa sobre el canal de Ca tipo N. Adicionalmente, se proporciona un método de cribado para encontrar una sustancia que tenga una acción farmacológica sobre el control de la presión sanguínea, la transmisión de dolor, el control del nivel de azúcar en sangre y otros aspectos similares usando el animal de la presente invención.

<110> Eisai Co., Ltd.

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<120> ANIMAL KNOCKOUT DE CANAL DE CALCIO TIPO N

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<130> 0019WOOP1098

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<150> JP 11-303809

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<151> 1999-10-26

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<150> JP 2000-37839

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<151> 2000-02-16

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<150> JP 2000-261979

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<151> 2000-08-31

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<160> 10

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<210> 1

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<211> 7185

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (121)..(6984)

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<400> 1

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1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

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<210> 2

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<211> 2288

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

12

13

14

15

16

17

18

19

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<210> 3

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Conus geographus

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> 4, 10, 21

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<223> Xaa=hidroxiprolina

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<400> 3

\hskip0,7cm

20

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<210> 4

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 4

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\hskip0,8cm

21

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<210> 5

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip0,7cm

22

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<210> 6

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<211> 713

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 6

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\hskip0,7cm

23

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<210> 7

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 7

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\hskip0,8cm

24

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<210> 8

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 8

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\hskip0,8cm

25

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<210> 9

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 9

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\hskip0,8cm

26

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<210> 10

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 10

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\hskip0,8cm

27

Claims (8)

1. Ratón en el que se ha interrumpido una codificación genética para la subunidad \alpha_{1B} del canal de calcio tipo N de manera que el ratón carece del canal de calcio tipo N funcional.

2. Ratón según la reivindicación 1, en el que el gen comprende ADN definido en el siguiente punto (a) ó (b):

a)

ADN que comprende la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 1;

b)

ADN que es hibridable con ADN que comprende la secuencia nucleotídica de N.º ID SEC: 1 bajo condiciones estrictas y codifica en correspondencia con una subunidad \alpha_{1B} del canal de calcio tipo N funcional.

3. Método para determinar una acción de una sustancia, que comprende etapas en las que se administra una sustancia al ratón según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y se determina una acción de la sustancia sobre el ratón.

4. Método para determinar una acción de una sustancia, que comprende etapas en las que se administra una sustancia al ratón según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y a un ratón tipo salvaje, y se comparan acciones de la sustancia sobre el ratón según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y el ratón tipo salvaje para determinar la acción de la sustancia sobre el canal de calcio tipo N.

5. Método de cribado para encontrar una sustancia que tenga una acción farmacológica, que comprende una etapa en la que se determina la acción farmacológica de la sustancia con el método según se ha definido en la reivindicación 3 ó 4.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la acción farmacológica es una acción para disminuir la presión sanguínea.

7. Método según la reivindicación 5, en el que la acción farmacológica es una acción analgésica.

8. Método según la reivindicación 5, en el que la acción farmacológica es una acción para disminuir el nivel de azúcar en la sangre.