KR100979438B1 - 불안장애 치료제 효과 검증 모델 동물로서의 ＰＬＣβ４돌연변이 생쥐 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PLCβ4 녹-아웃(knock-out) 동물의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 PLCβ4 녹-아웃 동물을 불안장애 동물모델로 사용하는 방법 또는 용도, 및 상기 동물을 이용한 불안장애 예방제 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 불안장애 모델 마우스는 학습능력, 장기 기억력 및 활동 능력은 정상적이지만, 기억소멸 능력에서는 심각한 결여를 나타내므로 불안장애 치료제의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.
포스포리파제β4, 불안장애, 동물모델
Description
본 발명은 PLCβ4 녹-아웃(knock-out) 동물의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PLCβ4 녹-아웃 동물을 불안장애 동물모델로 사용하는 방법 또는 용도, 및 상기 동물을 이용한 불안장애 예방제 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
불안장애에는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 신체형 장애(somatoform disorder), 해리성장애(dissociative disorder) 또는 인위성장애(factitious disorder) 등이 있다. 공포장애는 특정 대상이나 상황에서 불합리한 공포를 느끼고 이 때문에 지속적으로 그 대상이나 상황을 회피하는 장애를 말하며, 사회공포증(social phobia), 고소공포증(acrophogia), 협소공포증(claustrophobia) 또는 예기불안(expectation anxiety) 등의 그 대상에 따라 수 많은 유형이 있다. 범불안장애는 일상적인 상황에서 광범위하고 지속적인 불안을 느끼는 경우를 말하며, 강박장애는 자신의 의지와 무관하게 어떤 특정한 생각이나 행동을 계속 반복하게 되는 경우, 정상적으로도 어느 정도의 강박적인 생각이나 행동이 있을 수 있으나 강박증상 때문에 생활에 방해를 받거나 심신이 괴로운 정도면 강박장애로 진단한다. 대개 정확성, 완벽성, 원칙주의 등 강박적인 인격의 특징을 같이 보인다. 외상 후 스트레스 장애는 보통 사람들이 살면서 겪을 수 없는 극히 충격적인 사건(전쟁, 비행기 사고, 강간, 삼풍백화점 사고 등)을 경험한 다음 그러한 끔찍한 사고에 대한 생각이 되풀이되어 떠오르든지 꿈에 나타나는 등 재경험을 하게 되고, 외부에 대하여 무감각해지며 자율신경계 증상을 동반하는 장애를 말한다. 신체형 장애는 신체질환을 의심하게 하는 신체증상을 보이나 실제로는 신체이상은 없고 심리적 갈등이나 요인에 의하여 신체증상을 보이는 경우이다. 심리적 갈등이나 요인에 의하여 실제 신체적 증상이나 질병이 생기는 경우도 많이 있는데 이것은 정신신체질환(psycho- physiological disorders)이라고 한다. 심리적 갈등이 신체적 증상으로 표현되는 것은 대개 무의식적인 수준에서 이루어진다고 생각된다. 즉 환자가 의식하여 일부러 신체적 증상으로 표현하는 꾀병(malingering)과는 다르다. 해리성장애(dissociative disorder)는 '지킬 박사와 하이드'의 경우에서처럼 갑자기 정신기능의 일부분이 기능을 일시적으로 상실하는 장애로 드물게 나타난다.
시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)은 변연계(limbic system)의 한 부분으로 정서에 관련된 전전두엽과 편도체 그리고 해마와 서로 연결되어 있다. 그러나 MD가 정서라는 행동에 관여하는 기전은 잘 알려져 있지 않다. 한편, 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4, PLCβ4)는 MD에서 많이 발현 되지만, 공포 소멸에 중요한 전전두엽이나 편도체에 거의 발현 되지 않는다(Vertes RP. Neuroscience . 2006 Sep 29;142(1):1-20; Oyoshi T, et al ., J Neurosci . 1996 Sep 15;16(18):5812-29; Kuroda M, et al ., Prog Neurobiol . 1998 Mar;54(4):417-58; Nakamura M, et al ., Eur J Neurosci . 2004 Dec;20(11):2929-44).
이에, 본 발명자들은 PLCβ4 녹-아웃 마우스가 기억소멸 능력의 심각한 결여를 나타내어 불안장애 동물모델로 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기억소멸 능력의 심각한 결여를 나타냄으로써 불안장애 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝에 이용될 수 있는 PLCβ4 녹-아웃 동물모델을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기억소멸 능력에 결여를 나타내는 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 동물을 불안장애 동물모델로 사용하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 기억소멸 능력에 결여를 나타내는 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 동물을 불안장애 동물모델로 사용하는 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 동물을 이용한 정신장애 예방제 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 PLCβ4 녹-아웃 마우스는 학습 능력, 장기 기억력 및 활동 능력은 정상이지만, 기억소멸 능력은 현저하게 저하되어 있으므로, 각종 불안장애의 원인 을 해독하고 예방제 및 치료제를 스크리닝하기 위한 효과적인 동물모델로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기억소멸 능력에 결여를 나타내는 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 동물을 불안장애 동물모델로 사용하는 방법 및 용도를 제공하며, 상기 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 동물을 이용한 정신장애 예방제 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법은
1) 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 동물에 불안장애 예방제 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 후보물질 투여 후, 동물의 기억소멸 능력 테스트를 수행하는 단계; 및
3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 기억소멸 능력을 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)의 불안장애는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외 상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 신체형 장애(somatoform disorder), 해리성장애(dissociative disorder) 및 인위성장애(factitious disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 1)의 동물은 포유류, 바람직하게는 마우스, 랫트, 돼지 또는 원숭이 등이 될 수 있으며, 본 발명자들이 기탁한 수정란(수탁번호: KCTC 11247BP)으로부터 발생되는 마우스인 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 1)의 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.
상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 경구투여, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 등 중에서 대상 동물의 증상, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한 후보 물질의 투여량은 투여 방법, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.
상기 단계 2)의 기억소멸 능력 테스트는 조건화 반응 후, 1 시간 내지 60 시간 경과 후, 조건화와 관련된 환경을 주기적으로 노출시킨 후, 얼어붙음(freezing) 반응을 측정함으로써 수행되는 것을 의미한다. 또한, 상기 주기는 3초 ~ 180초 간격으로 15초 ~ 50초 동안의 조건화 반응을 20 ~ 30회 수행하는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.
시상의 등쪽 내측 핵(mediodorsal thalamus, MD)에서는 많이 발현되지만, 공포 소멸에 중요한 전전두엽이나 편도체에 거의 발현 되지 않는, 포스포리파제β4(Phospholipase β4, PLCβ4) 유전자가 결손된 녹-아웃 마우스(PLCβ4 녹-아웃 마우스)를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 우선, PLCβ4 유전자가 결손된 벡터를 제조하여 마우스의 배아간세포에 도입하였다. 다음으로, PLCβ4 유전자 결손이 확인된 배아간세포 클론을 배양한 후, 포배아의 포배강에 주입하여, 정관 수술한 수컷과 교배시켜 대리모 마우스의 자궁에 이식함으로써 키메라 마우스의 발생을 유도하였다. 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 PLCβ4 +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 마우스를 수득하였고, 다시 상기 이형접합체 마우스의 암컷과 수컷을 교배시킴으로써 PLCβ4-/- 유전자형을 갖는 유전자변이 마우스(PLCβ4 녹-아웃 마우스)를 제조하였다. 본 발명에서는 상기와 같이 제조한 PLCβ4 녹-아웃 마우스를 불안장애 동물모델로 이용하였으며, PLCβ4 녹-아웃 마우스의 수정란을 2007년 12월 6일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였 다(수탁번호: KCTC 11247BP).
본 발명자들은 상기 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 학습 능력, 장기 기억력, 활동 능력, 기억소멸 능력 등을 외부 소리가 차단된 특정한 상자(extinction chamber)에서 얼어붙음(freezing) 반응을 측정함으로써 불안장애의 동물모델로 사용할 수 있는지 테스트하였다.
고전적 공포 조건화 실험에서의 학습능력 테스트에서는 PLCβ4 녹-아웃 마우스는 정상 마우스와 같은 양상으로 특정 소리에 대한 조건화의 시도가 증가하면 얼어붙음(freezing) 반응의 %도 증가하는 경향(도 1 참조)을 보임으로써 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 학습능력은 정상임을 알 수 있었다.
PLCβ4 녹-아웃 마우스의 장기 기억력 테스트에서는 조건화된 특정 소리에 대하여 정상 마우스와 비슷한 얼어붙음(freezing) 반응의 %를 나타냄으로써(도 2 및 도 3 참조) 장기 기억력도 또한 정상임을 알 수 있었다.
PLCβ4 녹-아웃 마우스의 활동 능력 테스트에서는 상기 외부 소리가 차단된 특정한 상자(extinction chamber)에서 마우스가 이동한 거리를 측정하였는데, 그 결과, 정상 마우스와 비교했을 때, 차이가 없었으므로(도 4 참조), PLCβ4 녹-아웃 마우스의 활동 능력이 얼어붙음에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있다.
기억소멸 능력 테스트에서는 특정 소리에 대한 조건화 학습을 하고 24 시간이 경과한 후, 정상 마우스는 20회의 시도로 소리에 대한 공포 기억이 사라진 반면, PLCβ4 녹-아웃 마우스에서는 소멸이 되지 않았으며(도 5 참조), 그 후에 24 시간이 지난 후, 정상 마우스는 6회의 시도로 특정 소리에 대한 공포 기억이 사라 진 반면, PLCβ4 녹-아웃 마우스에서는 여전히 소멸이 되지 않았다(도 6 참조). 이로써 PLCβ4 녹-아웃 마우스는 특정 소리에 대한 공포기억소멸이 비정상적임을 알 수 있었다.
일반적으로 불안 장애가 있는 환자는, 위험이 없는 공포 조건화된 특정 환경에 환자를 반복 노출함으로써 치료한다. 따라서 오래 전부터 이용되었으며, 본 발명에서 이용한 상기 공포 조건화의 기억 소멸 실험은 인간의 치료법과 가장 유사한 동물 실험 모델이며 파블로프 이후(1927) 계속적으로 사용되어져 왔다(Myers KM and Davis M. Neuron . 2002 Nov 14;36(4):567-84; Milad MR and Quirk GJ. Nature. 2002 Nov 7;420(6911):70-4; Marsicano G, et al ., Nature . 2002 Aug 1;418(6897):530-4).
그러므로, 상기에서 살펴보았듯이, PLCβ4 녹-아웃 마우스는 학습 능력, 장기 기억력 및 활동 능력은 정상이지만, 공포기억소멸 능력은 현저하게 저하되어 있으므로, 불안장애의 동물모델로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명을 한정하지는 않는다.
<
실시예
1>
포스포리파제
β4(
Phospholipase
β4) 유전자 녹-아웃(
knock
-
out
) 마우스(
PLCβ4 녹-아웃 마우스)의
제조
<1-1>
PLC
β4 유전자 결손 벡터의 제조
마우스 게놈으로부터 PLCβ4 유전자를 분리하기 위하여, PLCβ4 유전자의 cDNA(서열번호 1)의 시작 코돈으로 부터 226 - 369부분에 해당하는 부위를 RT-PCR로 분리해 내고 이를 탐침(probe)으로 사용하여 129/svJae 마우스 게놈 DNA 라이브러리(LamdaFixII, Stratagene Inc., USA)에 혼성화 반응을 수행하였다. 이로부터, PLCβ4 유전자를 가진 게놈 클론 파지를 선별한 후 제한 효소 지도, 서던 블럿 분석 및 염기서열 결정 등에 의하여 상기 파지 클론이 PLCβ4 유전자인 것을 확인하였다.
PLCβ4 유전자가 결실된 벡터를 제조하기 위하여, 상기 PLCβ4 유전자 클론에서 PLCβ4 단백질의 X 도메인의 일부분을 제거하여 PSK-플라스미드 벡터(Stratagene Inc., USA)에 클로닝하였다. 상기 PLCβ4 유전자의 일부가 결실된 것을 포함하는 적중벡터의 3' 상동절편 말단에는 유전자의 적중 효율을 높이기 위하여 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트 및 음성선별 마커(negative selection marker)를 삽입하였다.
<1-2> 세포 배양
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 적중벡터를 형질도입시키기 위한 세포주로 J1 배아간세포(embroinic liver cells)를 사용하였다. J1 배아간세포(미국 매사추세츠공과대학(MIT)의 R. Jeanisch로부터 분양받음)를 DMEM 배지(Gibco Co., USA)에 15% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Hyclone Co., USA), 1×페니실린-스트렙토 마이신(phenicillin-streptomycin), 1×비-필수 아미노산(Gibco Co., USA), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)이 첨가된 ES 배지에 접종한 후 37℃에서 2 내지 3 일 동안 배양하였다. 상기 배양으로부터 얻은 배세포군에 0.25% 트립신이 포함된 1 mM EDTA 용액을 처리하여 단일세포들로 분리하였다.
<1-3> 세포로의
PLC
β4 유전자 결손 벡터 도입
상기 실시예 <1-2>에서 단일세포로 분리된 배아간세포에 실시예 <1-1>에서 제조한 적중벡터를 트랜스펙션(transfection)하기 위하여 일렉트로포레이션 (electroporation)을 수행하였다. 구체적으로, 2×107 세포/㎖의 농도로 희석된 배아간세포에 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 적중벡터 DNA 25 ㎍를 첨가하여 혼합한 후, 270 V/500 μF 조건으로 전기충격을 가하였다. 상기 배아간세포를 0.3 mg/㎖ G418 및 2 μM의 간사이클로버가 포함된 ES 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 동형재조합(homologous recombination) 방법에 의해 배아간세포 내 PLCβ4 유전자가 적중벡터에 의해 정확하게 적중된 배아간세포 클론을 서던 블럿으로 선별·유지하였다.
<1-4>
PLC
β4+/- 마우스의 제조
PLCβ4 +/-의 유전자형을 갖는 키메라 마우스를 제조하기 위하여, 수정된 포배아 세포에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 미세주입하였다.
구체적으로, C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratory, USA) 암컷과 수컷을 교배시킨 후, 3.5일(3.5 p.c.)된 암컷을 경부탈구법으로 희생시켰다. 희생된 암컷으로부터 자궁을 적출하여 자궁 말단부를 가위로 절제한 후, 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20 mM HEPES, 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사 용액 1 ㎖을 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세 유리관을 사용하여 상기 자궁조직으로부터 포배아를 분리하였으며, 분리한 포배아를 35 mm 페트리디쉬 위에 미리 떨어뜨려 놓은 주사 용액 방울에 옮긴 후 하기의 도입과정에 사용하였다.
상기와 같이 분리한 포배아에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 도입하기 위하여, 미세주입기(Zeiss Inc., USA)를 이용하여 홀딩(holding) 피펫으로 포배아의 내부세포괴(inner cell mass) 방향을 음압으로 잡은 상태에서 10 내지 15 개의 배아간세포 클론을 흡입한 주사 피펫을 포배아의 포배강내로 삽입한 후 양압을 주어 배아간세포 클론을 포배아의 포배강내로 주입하였다. 상기 클론이 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후, 2.5 p.c.된 가임신 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 배아간세포 클론(J1) 및 C57BL/6J 마우스의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 마우스의 발생을 유도하였다. 이때, 자궁이식은 애버틴(avertine, 체중당 1 ㎎/㎏)으로 마취된 대리모의 복부를 1 ㎝ 정도 절제하고; 자궁 상부를 핀셋으로 집어 2 cm 정도 체외로 잡아당기고; 주사 바늘로 자궁에 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 상기의 포배아를 미세유리관으로 주입하고; 내부 복강막을 봉합사로 두 바늘 꿰멘 다음 겉가죽을 내과용 클립으로 봉입하는 방법을 사용하였다. 상기와 같이 배아간세포가 주입된 포배아를 대리모 마우스의 자 궁으로 이식하여 약 19 일 동안 배양함으로써 배아간세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 융합되어 게놈 내 PLCβ4 +/-의 유전자형을 가지는 키메라 마우스를 확보하였다.
<1-5>
PLC
β4 녹-아웃 마우스의 제조
키메라 마우스를 각각 C57BL/6J 및 129sv 마우스와 20 차례 이상 교배하면서 유지하였고, 이로부터 생성된 C57BL/6J-PLCβ4+/- 및 129sv-PLCβ4+/- 마우스를 교배하여 F1 단계에서 PLCβ4+/+ 및 PLCβ4-/- 마우스를 제조하였으며, 이들을 하기의 행동실험에 사용하였다. 유전자 형 확인은 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 사용하였다. 프라이머는 K1(5'-CTCCACACTCTGCAACCTAC-3'; 서열번호 2), K9(5'-AGTTACTTCTGGATTTTCAGCC-3'; 서열번호 3) 및 PGK22(5'-CTGACTAGGGGAGGAGTAGAAG-3'; 서열번호 4)를 이용하여 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40회 반응시켰다. 상기 프라이머 K1 및 K9은 정상 마우스의 유전자 형을 확인하기 위한 프라이머 쌍으로, 프라이머 K1 및 PFK22는 돌연변이 마우스의 유전자 형을 확인하기 위한 프라이머 쌍으로 사용하였다. 이렇게 하여 수득한 PCR 산물은 1.5% EtBr/아가로스 겔에서 각각의 밴드를 확인하였다.(PLCβ4+/+: 190 bp, PLCβ4+/-: 250/190 bp 및 PLCβ4-/-: 250 bp)
<
실시예
2> 마우스의 사육 및 구성
상기 마우스들은 12 시간 밝은 조명, 12 시간 어두운 조명 일주기하에서 물 과 사료가 자유롭게 주어지며 온도 22℃, 습도 55%가 유지 되는 SPF(specific pathogen free) 환경에서 사육되었다. 실험에 사용된 마우스는 모두 수컷이며 6마리 ~ 18마리가 사용되었으며, T-test와 repeated two-way ANOVA를 사용하여 통계 테스트를 실시하였다.
<
실시예
3>
PLC
β4 녹-아웃 마우스의 고전적 공포 조건에서 학습 능력 조사
PLCβ4 녹-아웃 마우스의 학습 능력을 조사하기 위하여, 얼어붙음(freezing) 반응을 측정하였다.
외부 소리가 차단된 특정한 상자(conditioning chamber)에서 평소 들을 수 없는 특정한 소리(2900 Hz, 100 db)를 30초 동안 들려주고, 얼어붙음(freezing) 반응의 원인이 되는 발바닥 전기 자극(0.5 mA)을 1초 동안 주되 특정 소리와 동시에 끝나도록 하는 자극을 120초 간격으로 3회 수행하였다.
그 결과, 상기와 같은 학습을 통하여 첫 번째 시도에서는 얼어붙음(freezing) 반응이 거의 0% 였지만 조건화가 되어가면서 두 번째 및 세 번째 시도에서는 특정 소리에 대한 얼어붙음 반응이 점점 증가하는 경향이 정상 마우스 및 PLCβ4 녹-아웃 마우스 모두에서 나타났다(도 1). 즉, PLCβ4 녹-아웃 마우스는 정상 마우스와 비교하여 학습 능력에 차이가 없었다.
<
실시예
4>
PLC
β4 녹-아웃 마우스의 장기 기억력 조사
PLCβ4 녹-아웃 마우스의 장기 기억력을 조사하기 위하여, 얼어붙 음(freezing) 반응을 측정하였다.
상기 실시예 3에서 조건화를 시켰던 특정한 상자와는 전혀 다른 환경(소리, 냄새, 조도, 색, 질감 등)을 가진 상자에서 단지 조건화된 특정 소리에 대한 기억력을 측정하기 위해, 조건화를 시킨 후, 24 시간 및 48 시간이 경과한 후에 한 번의 특정 소리를 30초 동안 주어졌을 때의 얼어붙음 반응을 측정하였다.
그 결과, PLCβ4 녹-아웃 마우스는 93.6 ± 0.8 %[평균 ± SEM(Standard error of the mean), 도 2] 및 95 ± 1.1 %(도 3)의 얼어붙음 반응을 보였고, 정상 마우스도 상기 PLCβ4 녹-아웃 마우스와 비슷하게 88.3 ± 2.8 %(도 2) 및 84.4 ± 2.9 %(도 3)의 얼어붙음 반응을 보였다. 그러므로, PLCβ4 녹-아웃 마우스는 조건화된 특정 소리에 대한 장기 기억력은 정상임을 알 수 있었다.
<
실시예
5>
PLC
β4 녹-아웃 마우스의 활동 능력 조사
얼어붙음 반응 정도는 마우스의 활동 능력과 상관 관계가 있으므로 활동 능력으로 많이 사용되는 이동 거리를 측정하였다.
조건화를 시킨 후, 24 시간이 경과한 후에 상기 실시예 4와 같은 상자에서 마우스가 10분 동안 이동한 총 거리를 측정하였다.
그 결과, PLCβ4 녹-아웃 마우스의 이동거리(2854.2 ± 150 cm)와 정상마우스의 이동거리(2394.3 ± 230.5 cm)는 비슷하였으므로(도 4) PLCβ4 녹-아웃 마우스와의 활동 능력은 정상 마우스와 차이가 없음을 알 수 있었다.
<
실시예
6>
PLC
β4 녹-아웃 마우스의 기억소멸 조사
실시예 3과 같이 정상 마우스 및 PLCβ4 녹-아웃 마우스에 특정 소리를 조건화한 후, 24 시간이 경과한 뒤에 조건화된 특정 소리 기억력 테스트 상자에서 특정 소리(30초)를 20회 들려주었다(extinction day1). 특정 소리와 특정 소리 간격은 5초로 하였다. 그 후 24 시간이 지난 후에 다시 특정 소리를 6회에 결쳐 들려 주었다(extinction day2).
그 결과, 정상 마우스에서는 20회의 시도로 소리에 대한 공포 기억이 사라진 반면, PLCβ4 녹-아웃 마우스에서는 유의하게 소멸 되지 않았다(도 5). 특정 소리를 조건화한 지 48 시간이 지난 후, 정상 마우스에서는 6회의 시도로 특정 소리에 대한 공포 기억이 사라진 반면, PLCβ4 녹-아웃 마우스에서는 얼어붙음(freezing) 반응이 정상 마우스에 비하여 유의하게 높았다(도 6).
도 1은 고전적 공포 조건화(fear conditioning) 실험에서 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 학습 능력을 나타내는 그래프이다:
+/+: 정상 마우스; 및
-/-: PLCβ4 유전자 녹-아웃(knock-out) 마우스.
도 2는 조건화 후, 24 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대한 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 장기 기억력을 나타낸 그래프이다:
+/+: 정상 마우스; 및
-/-: PLCβ4 유전자 녹-아웃(knock-out) 마우스.
도 3은 조건화 후, 48 시간이 경과한 다음의 조건화된 특정 소리에 대한 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 장기 기억력을 나타낸 그래프이다:
+/+: 정상 마우스; 및
-/-: PLCβ4 유전자 녹-아웃(knock-out) 마우스.
도 4는 특정 소리에 대한 기억력 테스트 상자에서 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 이동 거리를 측정한 그래프이다:
+/+: 정상 마우스; 및
-/-: PLCβ4 유전자 녹-아웃(knock-out) 마우스.
도 5는 특정 소리에 대한 기억력 테스트 상자에서 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 조건화된 특정 소리에 대한 공포 기억소멸 학습 테스트(extinction training day1) 결과를 나타낸 그래프이다:
+/+: 정상 마우스; 및
-/-: PLCβ4 유전자 녹-아웃(knock-out) 마우스.
도 6은 특정 소리에 대한 기억력 테스트 상자에서 PLCβ4 녹-아웃 마우스의 조건화된 특정 소리에 대한 공포 기억소멸 학습 후 24시간이 지난 후 기억소멸 회상 테스트 결과 (recall of extinction day2) 를 나타낸 그래프이다:
+/+: 정상 마우스; 및
-/-: PLCβ4 유전자 녹-아웃(knock-out) 마우스.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> PLC beta4 mutant mice as a model for testing anxiety disorder
drugs
<130> 7p-06-12
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 3528
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
atggccaaac cttacgaatt taactggcag aaggaagtgc cctctttctt gcaagaagga 60
gcagtttttg acagatacga agaggaatct tttgtgtttg agcccaactg cctcttcaaa 120
gtagatgaat tcggcttctt cctgacgtgg aagagtgaag gcaaggaagg acaagtgcta 180
gaatgttccc tcatcaacag tattcgccaa gcagccatac caaaggatcc caaaatcctg 240
gctgctctcg aagctgttgg aaaatctgaa aatgatctgg aagggcggat attgtgtgtc 300
tgcagcggca cggatctggt gaatatcggc ttcacttaca tggtggctga aaatccagaa 360
gtaactaagc aatgggtaga aggcctgaga tcgatcattc acaacttcag ggcaaacaac 420
gtcagtccga tgacatgcct caagaaacac tggatgaaac tggcctttct gaccaacaca 480
actggtaaaa tcccagtgag gagtatcact agaaccttcg catcagggaa aacagaaaag 540
gtgatctttc aagccctcaa ggaactaggt cttcccagtg gaaagaatga tgaaattgaa 600
cctgctgcat ttacttatga aaagttctat gaactgacac aaaagatttg tcctcggaca 660
gatatagaag atctttttaa aaaaatcaat ggagacaaaa ctgattattt aacggtagac 720
caattagtga gctttctaaa cgaacatcag cgagatcctc ggctgaatga aattttattc 780
ccattttatg atgctaaaag agcaatgcag atcattgaaa tgtatgagcc tgatgaagag 840
ctgaagaaaa aaggcctcat atccagtgat ggattctgca gatatctgat gtcagatgaa 900
aatgcccctg tcttcttaga tcgcttagaa ctttaccagg agatggacca cccgctggct 960
cattacttca tcagttcctc ccacaacacc tatctcactg gccggcaatt tggaggaaag 1020
tcttcagtgg aaatgtacag acaagttctc ctggctggtt gcaggtgtgt tgaacttgac 1080
tgttgggatg gaaaaggtga agatcaggaa ccgataataa ctcacggaaa agcaatgtgt 1140
acagacatcc tttttaagga tgtaatccag gccatcaagg aaacggcgtt tgtcacatca 1200
gaataccctg tcattctctc cttcgaaaac cactgcagca aatatcaaca gtacaagatg 1260
tccaagtatt gtgaagatct atttggggat ctcctgttga aacaagcact tgagtcgcat 1320
ccacttgaac caggaaggcc cttgccgtct cctaatgacc tcaaaagaaa aatactcatc 1380
aagaataaga ggctgaagcc tgaagttgaa aagaaacagc ttgaagcttt gaaaagcatg 1440
atggaagctg gagagtcagc cgccccagct agcatcttgg aagacgacaa tgaagaggaa 1500
atagaaagtg ctgatcaaga ggaagaagcc caccctgaat acaaatttgg aaatgaactt 1560
tctgccgatg actacagtca caaggaagcg gttgcaaaca gcgtcaagaa gggcctggtc 1620
accgtagagg atgagcaagc atggatggca tcttataaat acgtaggtgc taccacgaac 1680
atccatccgt acttgtccac gatgatcaac tatgcccagc ccgtgaagtt tcaaggtttc 1740
cacgtggctg aagagcgcaa tattcactat aacatgtctt cttttaacga gtcggttggc 1800
cttggctact tgaagacgca cgcgattgag tttgtaaatt acaataagcg acaaatgagc 1860
cgcatttacc ccaagggagg ccgagttgat tccagtaatt acatgcctca gattttctgg 1920
aacgctggtt gccagatggt ttcactgaac tatcaaaccc cagatttagc gatgcaattg 1980
aatcaaggaa aatttgagta taatggatca tgcgggtacc ttctcaagcc agatttcatg 2040
aggcggcctg atcggacatt tgaccccttc tctgaaaccc ctgtggacgg ggttattgca 2100
gccacgtgct cagtgcaggt tatatcaggg cagttcctct cagataagaa gatcgggaca 2160
tacgtggaag tcgatatgta cgggctgccc accgacacca tacggaaaga gttccgaacc 2220
cgcatggtta tgaacaatgg actcaaccca gtgtataatg aagaatcgtt tgtgtttcga 2280
aaggtgatcc tgcctgacct agctgtcctg agaatcgcag tctacgatga caacaacaag 2340
ctaattggcc agaggatcct tcctttggat ggtctccaag caggctaccg acacatctcc 2400
ctgagaaacg agggaaacaa accattatca ctgccaacaa ttttctgcaa tattgttctt 2460
aaaacatacg tgcctgatgg atttggagat attgtggatg ctttatccga tccaaagaaa 2520
tttctttcaa tcacagagaa gagagcagac caaatgagag caatgggcat tgaaactagt 2580
gacatagcag atgtgcccag tgacacttcc aaaaatgaca agaaaggcaa ggccaaccca 2640
gccaaagcga acgtgacccc tcagagcagc tctgagctca gaccaaccac cacagccgcc 2700
ctgggctctg gccaggaagc caagaaaggt attgaactta tccctcaagt gaggatagaa 2760
gatttaaagc aaatgaaggc ttacttgaag catttaaaga aacaacagaa ggagttaaac 2820
tctttaaaga agaaacatgc aaaggagcac agtaccatgc agaagttaca ctgcacacaa 2880
gttgacaaaa tcgtggccca gtatgacaaa gagaagtcga ctcatgagaa aatcctagag 2940
aaggcgatga agaagaaggg gggaagtaat tgtcttgaaa taaaaaaaga aacagaaatt 3000
aaaattcaga ccctgacaac ggatcacaaa tctaaggtca aagagattgt ggcccagcac 3060
acaaaggagt ggtcagaaat gatcaacact cacagtgcgg aggagcagga aatccgggat 3120
ctgcacctga gccagcagtg tgagctgctg agaaagctgc tcatcaatgc tcatgagcag 3180
cagacccagc agctgaaact ctcccatgac agggaaagca aggagatgag agcccatcag 3240
gctaagattt ctatggaaaa tagcaaggcc atcagtcaag ataaatctat caagaacaag 3300
gcagaacggg aaaggcgagt cagggagttg aacagcagca acactaagaa gttcctagaa 3360
gaaagaaaga gactggcgat gaagcagtca aaagaaatgg atcagttgaa aaaagtccag 3420
ctggagcacc tagaattcct agagaaacag aacgagcagg cgaaggagat gcagcagatg 3480
gtgaaattgg aagccgagat ggaccgcaga ccagcaacag tagtatga 3528
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer k1
<400> 2
ctccacactc tgcaacctac 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer k9
<400> 3
agttacttct ggattttcag cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer PFK22
<400> 4
ctgactaggg gaggagtaga ag 22
Claims (10)
- 기억소멸 능력에 결여를 나타내는 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 인간을 제외한 포유류를 불안장애 동물모델로 사용하는 방법.
- 삭제
- 1) 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자가 녹-아웃(knock-out)된 인간을 제외한 포유류에 불안장애 예방제 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;2) 상기 단계 1)의 후보물질 투여 후, 인간을 제외한 포유류의 기억소멸 능력 테스트를 수행하는 단계; 및3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 기억소멸 능력을 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 불안장애 예방제 및 치료제 스크리닝 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 불안장애는 공포장애(phobic disorder), 범불안장 애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 신체형 장애(somatoform disorder), 해리성장애(dissociative disorder) 및 인위성장애(factitious disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 3항에 있어서, 단계 1)의 인간을 제외한 포유류는 마우스, 랫트, 돼지 또는 원숭이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 단계 1)의 인간을 제외한 포유류는 수탁번호인 KCTC 11247BP로 기탁된 수정란으로부터 발생되는 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 단계 1)의 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 단계 2)의 기억소멸 능력 테스트는 조건화 반응 후, 1 시간 내지 60 시간 경과 후, 조건화와 관련된 환경을 주기적으로 노출시킨 후, 얼어붙음(freezing) 반응을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 주기는 3초 ~ 180초 간격으로 15초 ~ 50초 동안의 조건화 반응을 20 ~ 30회 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR20210075580A (ko) | 2019-12-13 | 2021-06-23 | 고려대학교 산학협력단 | 강박장애 동물모델 및 이의 제조방법 |
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