KR20030061670A - 칼슘 이온 통로 알파１ｂ 유전자 변이 생쥐 및 그의제조방법 - Google Patents
칼슘 이온 통로 알파１ｂ 유전자 변이 생쥐 및 그의제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자 변이 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 배아간세포를 이용한 유전자 적중법(gene targeting)을 통하여 N-타입 칼슘 이온 통로의 알파1B 소단위체 유전자가 결실되어 기계적 자극 또는 복사열 자극에 대해 감소된 통증 반응을 나타내는 유전자 변이 생쥐, 그의 제조방법 및 N-타입 칼슘 이온 통로의 알파1B 단백질의 기능을 억제하여 통증을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 적중된 유전자 변이 생쥐는 N-타입 칼슘 이온 통로 활성이 없으므로 N-타입 칼슘 이온 통로와 관련된 통증을 조절하는 물질을 스크리닝하는 동물모델로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자 변이 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 배아간세포를 이용한 유전자 적중법(gene targeting)을 통하여 N-타입 칼슘 이온 통로의 알파1B 소단위체 특정유전자가 결실되어 기계적 자극 또는 복사열 자극에 대해 감소된 통증 반응을 나타내는 유전자 변이 생쥐, 그의 제조방법 및 N-타입 칼슘 이온 통로의 알파1B 단백질의 기능을 억제하여 통증을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
전압-의존성 칼슘 이온 통로(voltage-dependent calcium channel)는 신경전달 물질 분비, 막 흥분성 및 유전자 발현을 조절하는데 중요한 역할을 하는데, 현재까지 여러 종류의 칼슘 이온 통로가 밝혀져 있다(Catterall,Cell Calcium, 1998, 24:307-323). 전압-의존적 칼슘 이온 통로는 α1, α2δ, β 및 γ의 소단위체로 구성되는 다중-소단위체 구조를 갖고 있다(Dunlap et al.,Trends Neurosci.,1995, 18:89-98; De Waard et al.,Ion Channels, 1996, 4:41-87; Hofmann et al.,Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 1999, 139:33-87). 이중에서 α1소단위체는 칼슘 통로가 작용하는데 필수적인 역할을 하고 통로의 성질을 결정하는데, 현재까지 α1소단위체의 여러 이소타입을 코딩하는 6개의 서로 다른 유전자(α1B-α1F)가 밝혀져 있다(Chin.,Exp. Mol. Med., 1998, 30:123-130; Ertel et al.,Neuron, 2000, 25:533-535; Hofmann et al.,Rev. Physiol. Pharmacol., 1999, 139:33-87). 전압 의존적 칼슘 이온 통로는 전기생리학적 또는 약학적 성질에 따라 L-타입, N-타입, P-타입, Q-타입, R-타입 및 T-타입으로 나뉜다.
쥐의 뇌를 인 시투 혼성화(in situ hybridization)를 통해서 살펴보면 α1B소단위체는 뇌의 여러 지역에 분포해 있고, 특히 해마 CA(Cornu Ammonis) 지역, 치아랑(dentate gyrus) 및 소뇌 과립 세포층에 위치해 있다(TanaKa et al.,Brain Res. Mol. Brain Res., 1995, 30:1-16). 세포내 수준(level)에서 보면 α1B소단위체는 대부분의 뉴런에서 프리시냅스(presynapse) 신경 말단에 위치하여 신경전달물질의 분비를 조절하는 생리학적 기능을 한다(Miller,Science, 1987, 235:46-52; Hirning et al.,Science, 1988, 239:57-61; Westenbroek et al.,J. Neurosci., 1995, 15:6403-18).
세포외 칼슘 이온은 전압-의존성 칼슘 통로를 통해 유입되어 급성(acute) 침해수용(nociceptive) 정보를 척수에서 처리(spinal processing)하는 역할을한다(Maggi et al.,Neurosci. Lett., 1990, 114:203-206; Malmberg and Yaksh,J. Neurosci., 1994, 14:4882-90; Santaicioli et al.,Neurosci. Lett., 1992, 136:161-164). N-, P/Q-, L- 및 R-타입을 포함한 고전압-의존성 칼슘 전류의 여러 가지 타입은 DRGs(dorsal root ganglions)에 존재하는 작은 직경의 뉴런에서 밝혀졌다(Abdulla and Smith,J. Neurosci., 1998, 18:9685-94; Acosta and Lopez,J. Neurosci., 1999, 19:8337-48; Honma et al.,Brain Res., 1999, 832:195-206; Scroggs and Fox,J. Physiol.(Lond)., 1992, 445:639-658). DRG 뉴런을 이용한 N-타입 칼슘 통로의 많은 발현과 여러 약학적 연구에서, 이런 타입의 통로가 일차 구심성의 활성과 척수 등쪽 각(spinal dorsal horn)에서 침해수용 신호의 전달을 위한 신경전달물질의 분비에 관여한다는 것이 밝혀졌다(Gohil et al.,Brain Res., 1994, 653:258-266; Kerr et al.,Eur. J. Pharmacol., 1988, 146:181-183; Westenbroek et al.,J. Neurosci., 1988, 15:6403-18). 예를 들면 ω-코노톡신(conotoxin) GVIA에 의해서 N-타입 통로의 프리시냅스가 저해되면 글루탐산, 칼시토닌 유전자 유래 펩티드 또는 물질 P의 분비가 저해된다(Gruner and Silva,J. Neurosci., 1994, 14:2800-08; Maggi et al.,Neuroscience, 1990, 34:243-250; Santicioli et al.,Neurosci. Lett., 1992, 136:161-164; Evans et al.,Brain Res., 1996, 712:265-273). 여기에 대한 대부분의 약학적 연구 결과, N-타입 칼슘 통로를 저해하면 화학 물질 또는 뉴런 상해에 의해 유도되는 과민통증(hyperalgesia) 및 이질통증(allodynia)에 대한 통증 인식이 감소된다는 것을 확인하였다(Diaz and Kickenson,Pain, 1997, 69:93-100; Malmberg andYaksh,J. Neurosci., 1994, 14:4882-90; Nebe et al.,Exp. Brain Res., 1998, 120:61-69; Neugebauer et al.,J. Neurophysiol., 1996, 76:3740-49; Sluka,Pain, 1997, 71:157-164; Sluka,J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 287:232-237; White and Cousins,Brain Res., 1998, 801:50-58). N-타입 칼슘 통로는 척수 수준에서 통증을 인식하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, N-타입 칼슘 통로와 통증 인식의 관계에 대한 이러한 관찰에도 불구하고 생체내에서 침해수용 정보의 처리에 N-타입 칼슘 통로의 정확한 역할을 규명하는 유전적 연구가 뒷받침되지 않았다.
이에, 본 발명자들은 칼슘 이온 통로의 통로형성 소단위체(pore forming subunits)를 암호화하는 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 특정부위를 적중시켜 알파1B 유전자가 결실된 유전자 변이 생쥐를 제조하고, 통증 인식에서 N-타입 칼슘 통로의 생리학적 기능을 규명하기 위하여 여러 가지 통증 관련 행동 분석을 실시하여 상기 유전자 변이 생쥐가 정상 생쥐보다 감소된 통증 반응을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 감소된 통증 반응을 나타내는 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 특정부위가 적중된 유전자 변이 생쥐, 그의 제조방법, 상기 유전자의 기능을 억제하여 통증을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 알파1B 유전자좌, 적중벡터 및 적중된 유전자좌를 나타낸 모식도이고,
A : 정상 알파1B 유전자 좌,
B : IS3 부분이 GFP-Neo로 치환되고, tk 유전자를 포함하는 적중벡터,
C : 적중벡터에 의해 적중된 유전자 좌,
□: 프로브로 사용될 절편,
도 2의A는 본 발명의 유전자 변이 생쥐에 대한 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 PCR로 확인한 결과이고,
레인 1 : 마커, 레인 2 : 정상 생쥐(+/+),
레인 3 : 이형접합체 생쥐(+/-), 레인 4 : 동형접합체 생쥐(-/-),
도 2의B는 본 발명의 유전자 변이 생쥐에 대한 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 서던 블럿 분석(southern blot analysis)으로 확인한 결과이고,
레인 1 및 2 : 정상 생쥐(+/+), 레인 3 내지 5 : 이형접합체 생쥐(+/-),
레인 6 및 7 : 동형접합체 생쥐(-/-),
도 2의C는 본 발명의 유전자 변이 생쥐의 뇌조직에서 칼슘 이온 통로 알파1B 단백질이 발현되지 않음을 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)으로 확인한 결과이고,
레인 1 : 정상 생쥐의 소뇌, 레인 2 : 유전자 변이 생쥐의 소뇌,
레인 3 : 정상 생쥐의 대뇌, 레인 4 : 유전자 변이 생쥐의 대뇌,
도 3의A는 정상 생쥐의 작은 DRG 뉴런을 L-타입에 대한 니페디핀(nifedipine 10 uM), N-타입에 대한 ω-코노톡신-GVIA(1 uM) 및 잔여 전류에 대한 CdCl2(50 uM)과 같은 특정 저해제로 저해했을 때, 전체 세포 Ba2+전류(I Ba )를 나타낸 그래프이고,
도 3의B는 본 발명의 유전자 변이 생쥐의 작은 DRG 뉴런을 니페디핀(nifedipine 10 uM), ω-코노톡신-GVIA(1 uM) 및 CdCl2(50 uM)로 저해했을 때, 전체 세포 Ba2+전류(I Ba )를 나타낸 그래프이고,
도 3의C는 정상 생쥐와 본 발명의 유전자 변이 생쥐에서 여러 타입의 통로에서 전류 밀도 분포를 나타낸 그래프이고,
도 3의D는 정상 생쥐와 본 발명의 유전자 변이 생쥐에서 모든 전류 밀도의 전압과 전류의 관계를 나타낸 그래프이고,
도 4는 정상 생쥐와 본 발명의 유전자 변이 생쥐에서 로테이팅 로타로드에서자율 운동 행동 반응을 나타낸 그래프이고,
도 5의A는 기계적 자극에서 발 움츠림 반응을 나타낸 그래프이고,
○: 유전자 변이 생쥐(-/-), ●: 정상 생쥐(+/+),
도 5의B는 기계적 자극에 대한 꼬리치기 반응을 나타낸 그래프이고,
○: 유전자 변이 생쥐(-/-), ●: 정상 생쥐(+/+),
도 6의A는 복사열 자극에 대한 발 움츠림 반응잠복시간을 나타낸 그래프이고,
□: 유전자 변이 생쥐(-/-), ■: 정상 생쥐(+/+),
도 6의B는 복사열 자극에 대한 꼬리치기 반응잠복시간을 나타낸 그래프이고,
□: 유전자 변이 생쥐(-/-), ■: 정상 생쥐(+/+),
도 6의C는 50℃ 또는 52.5℃의 열판 자극에 대한 핥기/뛰기 반응잠복시간을 나타낸 그래프이고,
□: 유전자 변이 생쥐(-/-), ■: 정상 생쥐(+/+),
도 7의A는 정상 생쥐와 본 발명의 유전자 변이 생쥐의 뒷발에 0.2% 또는 2.0% 포르말린을 주사하였을 때 핥기/물기 반응을 나타낸 그래프이고,
도 7의B는 정상 생쥐와 본 발명의 유전자 변이 생쥐의 뒷발에 0.2% 또는 2.0% 포르말린을 주사하였을 때 단계 1 및 단계 2의 핥기/물기 반응을 나타낸 그래프이고,
■: 유전자 변이 생쥐(-/-), □: 정상 생쥐(+/+),
도 7의C는 정상 생쥐와 본 발명의 유전자 변이 생쥐의 아세트산 유도 내장 통증 반응을 나타낸 그래프이다.
□: 유전자 변이 생쥐(-/-), ■: 정상 생쥐(+/+)
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 적중법에 의해 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 특정부위가 결실된 유전자 변이 생쥐를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 칼슘 이온 통로 알파 1B 단백질의 기능을 억제하여 통증을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 변이 생쥐를 통증 억제제를 스크리닝하는데 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 유전자 적중법에 의해 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 결실된 유전자 변이 생쥐를 제공한다.
본 발명은 칼슘 이온 통로 알파 1B 단백질이 발현되지 않는 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐를 제공한다.
본 발명자들은 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을 갖는 유전자 변이 생쥐의 수정란을 2002년 1월 8일부로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10158BP). 본 발명의 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 유전자 변이 생쥐는 상기 +/- 형질을 갖는 수정란으로부터 얻어진 생쥐끼리의 교배를 통해서 얻을 수 있다
또한, 본 발명은 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 (homozygote) 유전자 변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 유전자 변이 생쥐의 제조방법은
(1) 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자에 대한 적중벡터(targeting vector)를 생쥐 배아간세포에 도입하는 단계;
(2) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 얻는 단계;
(3) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 생쥐를 얻는 단계; 및
(4) 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐를 얻는 단계로 구성된다.
상기 제조방법을 구체적으로 설명하면, 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자 염기서열 내 IS3(intervening segment 3) 부위에 대한 적중 벡터를 제조하였다. 본 발명의 적중벡터는 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자에 대한 상동 절편 2개, GFP(green fluorescent protein), PGK-neo 카셋트 및 5' 말단에 위치하는 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트를 포함한다. 상기의 적중벡터는 2개의 상동 절편에서 동형재조합(homologous recombination)이 발생하고, GFP 및 PGK-neo카셋트가 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 IS3 부위를 대치함으로써, 정상적인 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 발현되지 않는다. 이때, 5' 말단에 삽입된 티미딘 키나제는 유전자 적중 효율을 높이는 역할을 담당한다(도 1참조). 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 적중이 확인된 배아간세포 클론을 배양한 후 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐를 제조하였다. 배아간세포가 주입된 포배아를 정관 수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식하여 키메라 생쥐로의 발생을 유도하고, 이로부터 약 19일이 경과된 후에 배아간세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 섞인 키메라 생쥐가 생산되었다. 상기에서 선별된 칼슘 이온 통로 알파1B +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 본 발명의 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 유전자 변이 생쥐를 얻었다. 상기 동형접합체 유전자 변이 생쥐가 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖고 있음을 서던 블럿 분석 및 PCR을 수행하여 확인하였으며, 웨스턴 블럿 분석을 수행하여 유전자 변이 생쥐에서 칼슘 이온 통로 알파1B 단백질이 발현되지 않음을 확인하였다(도 2참조). 본 발명자들은 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을 갖는 수정란을 2002년 1월 8일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10158BP).
본 발명은 또한 상기 수정란을 대리모에 이식하여 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 유전자 변이 생쥐를 얻고, 이형접합체 유전자 변이 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 칼슘 이온 통로 알파 1B 단백질의 기능을 억제하여 통증을 감소시키는 방법을 제공한다.
N-타입 칼슘 통로의 알파1B 소단위체는 배발생과 출생 후에 대부분의 신경세포에서 신경전달에 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 있음에도 불구하고(Iwasaki et al.,J. Physiol.(Lond)., 1998, 509:419-423; Jones et al.,J. Neurosci., 1997, 17:6152-64), 알파1B 유전자가 결실된 유전자 변이 생쥐는 외관상 또는 일반적인 행동에서 정상적인 표현형질을 갖는다. 이는 알파1B 유전자가 배발생 및 출생 후 발생동안에 시냅토제네시스(synaptogenesis) 및 신경 분화에서 필수요소가 아닐 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서는 상기 알파1B 유전자가 결실된 유전자 변이 생쥐의 특성을 전기생리학적 방법으로 분석하기 위해 전하 전달자로 Ba2+에 의한 칼슘 통로 전류를 L-타입에 대한 니페디핀(nifedipine), N-타입에 대한 ω-코노톡신-GVIA 및 잔여 전류에 대한 CdCl2과 같은 특정 저해제로 저해했을 때 Ba2+전류(I Ba )를 측정한 결과, 정상생쥐에서는I Ba 는 모든 칼슘 통로 저해제에 의해 저해되었으나, 알파1B 유전자 변이 생쥐에서는I Ba 는 L-타입 칼슘 통로 저해제(니페디핀) 및 CdCl2에 의해 저해되었고 N-타입 칼슘 저해제(ω-코노톡신-GVIA)에 의해서는 저해되지 않았다(도 3참조). 상기 결과로 본 발명의 알파1B 유전자가 결실된 유전자 변이 생쥐는 N-타입칼슘 통로의 활성이 없는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 알파1B 유전자 변이 생쥐의 행동을 분석해 보면 여러 가지 통증 분석에서 통증 반응의 차이가 있음을 알게 되었다. 이를 위해 바람직한 실험예로 발 움츠림 테스트, 꼬리치기 테스트 또는 열판 테스트를 통해 분석해보면, 기계적 자극에 대해 유전자 변이 생쥐는 감소된 반응을 나타내고(도 5참조), 복사열 자극에 대해서는 발 움츠림 및 꼬리치기의 긴 대기시간을 보이나 열판 테스트에서는 정상 생쥐와 동일한 반응을 나타내었다(도 6참조). 상기와 같이 본 발명의 알파1B 유전자 변이 생쥐는 기계적 자극 또는 복사열 자극에 대해서 정상 생쥐에 비하여 감소된 반응을 나타내는 반면 열판 테스트에서는 정상 반응을 나타내었다. 기계적 및 복사열 자극의 침해수용 정보는 수용적 필드(receptive field)로부터 Aδ-섬유(fiber)에 의해 등쪽 각(dorsal horn)으로 전달되고, 꼬리치기 또는 발 움츠림 같은 유해한 자극에 대한 급성 통증 반응은 반사궁(reflex arc)을 통한 단순 척수 반사의 하나이다(Chapman et al.,Pain, 1985, 22:1-31). 반면에, 물거나 핥는 열판 유도 통증 행동은 이전의 기술에서 보고된 바와 같이 침해수용에 관련된 극상척수(supraspinal) 및 척수와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Chapman et al.,Pain, 1985, 22:1-31; Wall and Melzack, In Textbook of Pain, chapter 14, pp.360-362, Churchill Livingstone, Edinburgh, U.K.). 상기에서 살펴본 바와 같이 서로 다른 자극에 의한 통증 반응이 각기 다른 경로로 전달되고 있고, 이에 본 발명의 알파1B 유전자 변이 생쥐는 이러한 통증에 관련된 연구를 하는 동물모델로써 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서는 포르말린 또는 아세트산에 의해 유도되는 염증성 통증에 대한 반응을 관찰한 결과, 생쥐에 포르말린을 피하주사하면 두가지 단계(biphasic) 통증 반응을 나타내었다. 알파1B 유전자 변이 생쥐는 포르말린 테스트의 단계1과 단계에서 통증에 대한 반응이 서로 다르게 나타나는 것을 관찰하였는데, 유전자 변이 생쥐는 단계 1 동안 정상적인 통증 반응을 나타내나 단계 2에서는 감소된 반응을 나타내었다(도 7참조). 포르말린 주사에 대한 반응으로 척수의 활성이나 통증에 대한 행동 사이의 2 단계 반응 패턴이 매우 유사한 것으로 알려졌다(Dickenson and Sullivan, 1987; Chapman and Dickenson, 1993). N-타입 칼슘 통로가 척수 레벨에서 침해수용 처리에 관련되어 있는 것으로 알려졌다(Malmberg and Yaksh,J. Neurosci., 1994, 14:4882-90). 포르말린 테스트에서 단계 1의 핥기와 물기 행동은 말초 침해수용 신경 끝에서 포르말린에 의한 C-섬유의 직접적인 활성에 의한 것이나, 단계 2의 통증반응은 중추 감작(sensitization) 처리에 의한 것이다.
상기에서 살펴본 바와 같이 칼슘 이온 통로 알파1B 단백질의 발현을 억제하면 N-타입 칼슘 이온 통로 활성을 나타나지 않고 기계적 또는 복사열에 대해서 감소된 통증 반응을 나타내므로, 칼슘 이온 통로 알파 1B 단백질의 기능을 억제하면 통증을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 변이 생쥐를 통증 억제제를 스크리닝하는데 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 알파1B 유전자가 결실된 유전자 변이 생쥐는 정상적으로 출생하고외관상 또는 일반적인 행동에서 정상적인 표현형질을 갖지만 통증에 대한 반응은 정상 생쥐와는 다르게 나타난다. 본 발명의 알파1B 유전자의 특정부위가 결실된 유전자 변이 생쥐는 N-타입 칼슘 통로의 활성이 나타나지 않는다. 또한, 본 발명의 알파1B 유전자 변이 생쥐는 기계적 자극 및 복사열 자극에 대하여 정상 생쥐에 비하여 감소된 반응을 나타내고 N-타입 칼슘 통로가 생체내에서 침해수용 정보의 처리에 관련되어 있기 때문에 상기 유전자 변이 생쥐는 N-타입 칼슘 통로와 관련된 통증 연구 및 통증을 억제하는 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 결실된 적중벡터의 제작 및 형질도입
<1-1> 적중벡터의 제작
본 발명자들은 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 결실된 유전자 변이 생쥐를 제조하기 위하여, 일반적으로 사용되는 유전자 적중법(gene targeting method)을 이용하였다.
우선, 알파1B 유전자를 포함하는 생쥐 게놈 DNA를 얻기 위해 129/sv 생쥐 게놈 DNA 절편들을 무작위로 삽입시킨 박테리오파지 람다 FIX II(bacteriophage lamda FIX II, Stratagene) 라이브러리를 알파1B 랫트 cDNA(AUG ~ 720 bp, Dr. JinHM(NIH)으로부터 얻음)를 프로브로 사용하여 스크리닝하였다. 상기 스크리닝을 통하여 알파1B 유전자 IS(intervening segment) 1-3 코딩 지역을 포함하는 18.4 kb 게놈 DNA를 가진 박테리오파지 클론을 얻었으며, 다양한 제한효소를 이용하여 제한효소지도를 완성한 후, 적중벡터를 만드는데 사용하였다. 기본벡터는 pBluescript II KS(+/-)(Stratagene)를 기본벡터로 사용하였으며, pEGFP-1(Clonetech) 벡터로부터 SV40-폴리A를 포함하는 GFP(green fluorescent protein) 유전자를 잘라내어 엑손(아미노산 158)을 포함하는 BamHI-태그 IS2에 융합하였다. pLNT 벡터(Sugitaui Noda로부터 얻음)로부터 PGK-neo 유전자를 잘라내어 GFP 유전자의 하위에 연결하였다.
그 결과,IS3 부분을 포함하는 절편이 결실되고, 양성 선별을 위한 GFP-NEO 카셋트로 치환시킨 적중벡터를 제조하였다(도 1). 음성 선별을 위해서는 HSB-tk 유전자를 5'-상동 지역의 5' 말단에 연결하였다.
<1-2> 배아간세포의 배양
상기 실시예 <1-1>로부터 제작된 적중벡터를 형질 도입시키기 위한 세포주로 J1 배아 간세포주를 사용하였다. 배아 기간세포 배양과 배아 조작은 이전의 문헌과 동일한 방법으로 수행하였다(Kim et al.,Nature, 1997, 389:290-293). J1 배아간세포(미국, MIT 의 R. Jeanisch 로부터 분양 받음)를 ES 배지((15% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Hyclone Co.), 1x 페니실린-스트렙토마이신(phenicillin-streptomycin, Gibco Co.), 1x 비-필수 아미노산(Gibco Co.), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol), DMEM 배지(Gibco Co.))에 접종하고 37℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다. 상기 배양으로부터 얻은 배세포군에 0.25% 트립신이 포함된 1 mM EDTA 용액을 가하여 단일세포들로 분리하였다.
<1-3> 적중벡터의 도입
상기 실시예 <1-2>에서 단일세포로 분리된 배아간세포에 실시예 <1-1>에서 제작한 적중벡터를 도입(transfection)하기 위하여 일렉트로포레이션(electroporation)을 수행하였다. 구체적으로, 분리된 단일의 배아간세포 2 x 107개와 실시예 <1-1>의 적중벡터 DNA 25 ㎍를 첨가하여 혼합한 후 270 V/500 microF 조건하에서 일렉트로포레이션을 실시하였다. 적중 벡터가 도입된 배아간세포를 0.3 mg/ml G418 및 2 uM의 간사이클로버(gancyclovior)가 포함된 ES 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 배아간세포 내 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 적중벡터에 의해 정확하게 적중된 배아간세포 클론을 선별·유지하였다. 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 결실이 확인된 배아간세포 클론을 다시 ES 배지에 분주하여 18 내지 22시간 동안 배양한 후 트립신을 처리하여 단일세포로 분리하고 생존한 세포만을 골라 미세주입에 사용하였다.
<실시예 2> 키메라(chimera) 생쥐의 제조
칼슘 이온 통로 알파1B +/-의 유전자형을 갖는 키메라 생쥐를 제조하기 위하여, 수정된 포배아 세포에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 미세주입하였다.
구체적으로, C57BL/6J 생쥐(Jackson Laboratory, USA) 암컷과 수컷을 교배시키고, 교미 후 3.5일(3.5 p.c.)된 암컷을 경추탈골법으로 희생시켰다. 희생된 암컷으로부터 자궁을 적출하여 자궁 말단부를 가위로 절제한 후 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20 mM HEPES, 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사 용액 1 ㎖을 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세 유리관을 사용하여 상기 자궁조직으로부터 포배아를 분리하였으며, 분리한 포배아를 35 mm 페트리디쉬 위에 미리 떨어뜨려 놓은 주사 용액 방울에 옮긴 후 후속하는 도입과정에 사용하였다.
이와 같이 분리한 포배아에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 도입하기 위하여, 미세주입기(Zeiss 사)를 이용하여 홀딩(holding) 피펫으로 포배아의 내부세포괴(inner cell mass) 방향을 음압으로 잡은 상태에서 10 내지 15개의 배아간세포 클론을 흡입한 주사 피펫을 포배아의 포배강내로 삽입한 후 양압을 주어 배아간세포 클론을 포배아의 포배강내로 주입하였다. 상기 클론이 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식하여 배아간세포 클론(J1) 및 C57BL/6J 생쥐의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 생쥐의 발생을 유도하였다. 이때, 자궁이식은 애버틴(avertine, 1 ㎎/㎏ 몸무게)으로 마취된 대리모의 복부를 1 ㎝ 정도 절제하고; 자궁 상부를 핀셋으로 집어 2 cm 정도 체외로 잡아당기고; 주사 바늘로 자궁에 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 상기의 포배아를 미세유리관으로 주입하고; 내부 복강막을 봉합사로 두 바늘 꿰멘 다음 겉가죽을 내과용 클립으로 봉입하는 방법을 사용하였다. 이렇게 배아간세포가 주입된 포배아를 대리모 생쥐의 자궁으로 이식하여 약 19일 동안 배양함으로써 배아간세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 융합되어 게놈 내 칼슘 이온 통로 알파1B +/-의 유전자형을 가지는 키메라 생쥐를 확보하였다.
<실시예 3> 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형의 이형접합체 생쥐 제조
상기 실시예 2로부터 얻은 수컷 키메라 생쥐를 C57BL/6J 암컷 생쥐와 교배하여 얻은 자손을 얻었다. 이중 칼슘 이온 통로 알파1B +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐를 선별하기 위하여, 다음과 같이 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다.
구체적으로, 생쥐 자손들로부터 게놈 DNA를 추출하기 위하여 생쥐 꼬리부분을 1.5 ㎝ 정도 크기로 잘라낸 후, 상기 조직을 용해 완충액(100 mM Tris (pH 8.0), 5 mM EDTA, 200 mM 염화나트륨 및 0.2% SDS) 0.4 ㎖에 넣고, 여기에 0.1 ㎎/㎖ 이 되도록 단백질 분해효소 K(proteinase K)를 넣은 후 55℃에서 5시간 동안 처리하였다. 상기 반응액에 8 M 칼륨아세테이트 75 ㎕와 클로로포름 0.4 ㎖을 가하여 흔들어 준 후 4℃에서 10분 동안 방치하였다. 상기 반응액을 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액 0.4 ㎖을 에탄올 1 ㎖에 넣어 게놈 DNA를 침전시킨 후 다시 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 다음 증류수 50 ㎕로 녹였다.
상기와 같이 추출된 생쥐 게놈 DNA 1 ㎕를 주형으로 사용하고서열번호 1로기재되는 프라이머 1,서열번호 2로 기재되는 프라이머 2 및서열번호 3으로 기재되는 프라이머 3을 각각 10 pmol로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 프라이머 1과 프라이머 2는 정상의 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 190 bp 크기의 영역을 증폭하고, 프라이머 1 및 프라이머 3은 적중된 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 320 bp 크기의 영역을 증폭하도록 고안되었다. PCR의 조건으로는 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 반응시키는 것을 40회 반복하였다. 이로부터 얻은 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)로 염색하여 관찰하였다.
그 결과, 190 bp 크기와 320 bp 크기의 두 개의 밴드를 나타내는 생쥐를 칼슘 이온 통로 알파1B +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐로서 선별하였다(도 2의A레인 3 참조).
<실시예 4> 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형의 동형접합체 유전자 변이 생쥐의 제조
상기 실시예 3에서 선별된 칼슘 이온 통로 알파1B +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 유전자 변이 생쥐를 얻었다. 제조된 유전자 변이 생쥐가 게놈 내 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는지를 확인하기 위하여 서던 블럿 분석 및 PCR을 수행하였으며, 유전자 변이 생쥐에서 칼슘 이온 통로 알파1B 단백질이 발현되지 않음을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
<4-1> 서던 블럿 분석(southern bloy analysis)
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 유전자 변이 생쥐의 꼬리 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한 후 제한효소 EcoRI으로 절단하였다. 상기 생쥐 DNA에 대해 실시예 <1-1>의 DNA로부터 얻은 박스부분(□) 절편(도 1의C)을 프로브로 사용하여 하이브리드 반응을 수행하였다. 이 때 대조구로는 정상 생쥐로부터 추출한 게놈 DNA와 칼슘 이온 통로 알파1B +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 유전자 변이 생쥐로부터 추출한 게놈 DNA를 사용하였다.
그 결과는도 2의B와 같다. 도면에서 레인 1 및 레인 2는 대조구인 정상 생쥐(+/+), 레인 3 내지 레인 5는 이형접합체 생쥐(+/-), 레인 6 및 레인 7은 동형접합체 생쥐(-/-)의 게놈 DNA를 나타내며, 8.0 kb 밴드는 정상 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자에서 유래된 것이고, 14.5 kb 밴드는 적중된 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자에서 유래된 것이다. 도면에서 보듯이, 제조된 유전자 변이 생쥐는 14.5 kb 밴드만을 보였으며, 이로부터 칼슘 이온 통로 알파1B -/-의 유전자형을 갖고 있음을 확인하였다.
<4-2> PCR (polymerase chain reaction)
본 발명자들은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 유전자 변이 생쥐의 꼬리 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 이 게놈 DNA 1 ㎕를 주형으로 사용하고 실시예 3과 동일한 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다.
그 결과, 정상 생쥐(+/+)에서는 190 bp의 하나의 밴드만 관찰되었고, 이형접합체 생쥐(+/-)에서는 190 bp와 320 bp 두 개의 밴드가 관찰되었다. 또한, 본 발명의 유전자 변이 생쥐에서는 320 bp 밴드 하나만 관찰되어 상기 유전자 변이 생쥐가 칼슘 이온 통로 알파1B -/-의 유전자형을 갖고 있음을 확인하였다(도 2의A).
<4-3> 웨스턴 블럿 분석 (western blot ananlysis)
칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자의 유전자형을 갖고 있는 본 발명의 유전자 변이 유전자 변이 생쥐에서 실제적으로 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 발현되지 않음을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)을 수행하였다.
구체적으로, 정상 생쥐와 동형접합체 유전자 변이 생쥐를 경추탈골법으로 희생시킨 후 두개골을 절개하여 대뇌(cerebrum)를 분리하였다. 분리된 대뇌 조직을 단백질 분해 억제제가 포함된 용해액(50 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EGTA, 1 mM DTT 및 1 mM PMSF, 단백질 분해 억제 혼합액 (Boehringer Mannheim), 칼페인 억제제 I 과 II)에 넣어 분쇄하였다. 상기 조직액을 1,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액과 침점물을 분리한 후 상층액만을 취하여 다시 28,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여서 대략의 세포막 단백질을 얻었다. 상기 세포막 단백질을 8~16% 아크릴아미드 겔에 전기영동하고 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane, PROTRAN, Schleicher & Schuell 사)에 트랜스퍼 하였다. 상기 니트로셀룰로오스 막에 5% 탈지유가 포함된 TTBS 완충액(10 mM Tris 완충용액(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨, 0.05% tween 20)을 처리하였다. 이어서 칼슘 이온 통로 알파1B에 대한 단일항체 알파1B (CW21, Vance et al.,J. Biol. Chem., 1998, 273:14495-502)를 처리하여 하이브리드 반응을 수행하였다. 칼슘 이온 통로 알파1B 단백질에 결합한 단일항체를 검출하기 위하여 퍼옥시다제 (peroxidase)가 결합된 항-생쥐 IgG 항체를 첨가한 후 ECL 키트 (Amersham 사)를 기질로 사용하여 발색반응을 시켰다.
그 결과는도 2의C와 같다. 도면에서 레인 1은 정상 생쥐, 레인 2는 유전자 변이 생쥐의 소뇌 단백질이고, 레인 3은 정상 생쥐, 레인 4는 유전자 변이 생쥐의 대뇌 단백질이다. 도면에서 보듯이 유전자 변이 생쥐에서 칼슘 이온 통로 알파1B 단백질이 생성되지 않고 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을 갖는 유전자 변이 생쥐의 수정란을 2002년 1월 8일부로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10158BP).
<실험예 1> 알파1B 유전자 변이 생쥐의 전기생리학적 분석
이전 기술에서 전기생리학적 및 면역조직화학적 방법 연구를 통해 알파1B가 DRG 뉴런에 매우 많이 발현되고 기능을 하는 것을 밝혀내었다(Gohil et al.,Brain Res., 1994, 653:258-266; Kerr et al.,Eur. J. Pharmacol., 1988, 146: 181-183; Westenbroek et al.,J. Neurosci., 1998, 15:6403-18). DRG에서 작은 직경의 뉴런이 침해수용 경로의 일차 감각 뉴런으로 알려져 있기 때문에 본 발명자들은 DRG 뉴런 배양에서 작은 직경의 뉴런의 전기생리학적 성질을 분석하였다.
구체적으로, 해리된 DRG 뉴런을 5-6일된 생쥐로부터 준비하고 10% FBS 및100 U/㎖ 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM이 있는 커버글라스에서 배양하였다. 작은 사이즈의 침해수용 뉴런(< 25 ㎛)을 플레이트에서 5일 동안 기록하였다. 패치-클램프 방법은 이전의 문헌과 동일한 방법으로 수행하였다(Jun et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, 96:15245-50)). 마이크로피펫을 보로실리케이트 모세관 튜브(Warner Instruments Co.)에서 뽑아내어 불로 다듬은 후 마이크로피펫의 저항이 3-5 ㏁이 되게 하였다. 평균 연속 저항은 대조군에서 8.13±0.55 ㏁이고 유전자 변이에서는 8.14±0.54 ㏁이었다. 액소패치-200B 증폭기의 연속 저항 회로를 사용하여 80%를 보정하였다. 티로드(Tyrode) 용액에서 기가실(Gigaseals)을 얻었고 전체-세포 기록은 세포외 용액에서 만들어졌다. 티로드 용액 조성은 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코스, pH 7.4이고, 세포외 용액은 160 mM TEA-Cl, 2 mM BaCl2,10 mM HEPES-CsOH, 10 mM 글루코스, 0.001 mM 테트로도톡신(tetrodotoxin) 및 0.1 mg/ml 사이토크롬 c(cytochrome c), pH 7.4, 300 mOsm이고, 세포내 용액의 조성은 108 mM 세슘-메탄설포네이트(cesium-methanesulphonate), 4.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 9 mM HEPES-TEAOH, 4 mM ATP-Na, 1 mM GTP-Na, 15 mM 크레아틴 포스페이트(creatine phosphate), pH 7.3, 290 mOsm이었고, 모든 실험은 상온(22-24℃)에서 실시하였다.
전하 전달자로 Ba2+에 의한 칼슘 통로 전류는 L-타입에 대한 니페디핀(nifedipine 10 uM), N-타입에 대한 ω-코노톡신-GVIA(1 uM) 및 잔여 전류에 대한 CdCl2(50 uM)과 같은 특정 저해제의 의해 관찰되었다. 전체 세포 Ba2+전류(I Ba )를 내기 위하여 -80 mV에서 -10 mV로 10초 간격으로 펄스를 주었다.
그 결과, 정상생쥐에서I Ba 는 모든 칼슘 통로 저해제에 의해 저해되었으나 본 발명의 유전자 변이 생쥐에서I Ba 는 L-타입 칼슘 통로 저해제(니페디핀)에 의해서는 저해되었으나, N-타입 칼슘 저해제(ω-코노톡신-GVIA)에 의해서는 저해되지 않았다. 정상생쥐와 본 발명의 유전자 변이 생쥐 둘 다 Cd2+에 의해I Ba 이 저해되었다(도 3의A및B). 상기 데이터를 모아보면 전체 전류 밀도는 대조군에서는 206.99±12.03 pA/pF에서 돌변변이에서는 155.87±7.88 pA/pF까지 급격히 감소하였다. ω-코노톡신-GVIA에 의해 저해되는 N-타입 칼슘 전류는 정상 생쥐가 63.33±4.85 pA/pF인데 본 발명의 유전자 변이 생쥐는 4.28±0.57 pA/pF까지 떨어졌다(도 3의C). 그러나 L-, P/Q- 및 R-타입I Ba 는 대조군과 유전자 변이 생쥐에서 관찰되었다(도 3의C). N-타입 저해제와 연관된 작은 전류의 감소는 유전자 변이에 남아있는 N-타입 통로 활성보다는 레코딩 동안 전류의 감소를 나타내었다. 다른 통로 전류 밀도의 변화는 유전자 변이 생쥐에서 의미 있는 것은 아니므로 다른 통로의 변화는 없이 N-타입 통로 활성이 알파1B 유전자 변이 생쥐에서 없어졌다. 전류-전압(I-V) 커브는 N-타입 통로가 없는 유전자 변이가 막 전위의 넓은 범위에 영향을 미치는것을 나타내었다(도 3의D). 상기 결과는 DRG에서 작은 직경의 뉴런의 N-타입 칼슘 통로가 척수에서 통증 전달과 관련이 있다는 것을 나타내었다.
<실험예 2> 알파1B 유전자 변이 생쥐의 통증에 대한 반응
본 발명자들은 상기 실험예 1에서 N-타입 칼슘 통로가 통증 전달과 관련이 있다는 것을 확인하고 알파1B 유전자 변이 생쥐가 통증과 관련된 자극에 어떻게 행동 반응을 나타내는지를 관찰하였다.
<2-1> 기계적 자극에 대한 감소된 반응
본 발명자들은 요신경(lumbar) 및 천골신경(sacral) 레벨에서 각각 Aδ-섬유(fibers)를 통한 빠른 척수 반사를 나타내는 발 움츠림(paw withdrawal)과 꼬리치기(tail flick) 테스트를 수행하였다. 기계적 자극에 대한 50% 움츠림 역치를 관찰하기 위해 본 발명자들은 업-다운(up-down) 패러다임을 이용하여 본 프레이(von Frey) 필라멘트에 의해 발 움츠림과 꼬리치기 정도를 측정하였다.
모든 동물들은 온도, 습도가 조절되는 환경에서 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하고, 12시간의 밤/낮 주기로 아침 8시에 낮이 시작하는 조건하에서 사육하였다. F2 생쥐의 암컷, 수컷 모두 실험에 사용하고 8-15주된 생쥐를 사용하였다. 모든 행동 실험은 눈을 가린 상태로 시행하였다. 로타로드 기구(Letica scientific instruments)는 가속 모드에 사용되어지고 4에서 35 rpm으로 5분 동안 증가시켰다. 생쥐를 기구에 올려놓고 회전을 시작하였다. 단 한번 시도하였으며,낙하하는데 걸리는 시간을 각각의 생쥐에 대해 기록하였다. 로타로드 테스트는 24시간 주기의 영향을 최소화하기 위하여 아침 9시에서 정오사이에 실험을 수행하였다.
상기 로타로드 테스트는 자발적인 운동신경에 대한 행동양식을 측정하는 실험으로 정상생쥐와 돌연변이 사이에 차이가 없음을 보였다. 따라서 본 발명의 알파1B 유전자 변이 생쥐는 운동감각능이 정상임을 보였다(도 4).
<2-1-1> 발 움츠림 테스트(paw withdrawal test)
본 발명자들은 알파1B 유전자 변이 생쥐의 통증에 대한 반응을 관찰하기 위하여 우선 발 움츠림과 꼬리치기 테스트를 수행하였다. 발 움츠림 테스트는 모길의 문헌에 따라 수행하였다(Mogil et al.,Pain, 1999, 80:67-82). 동물을 각각 미세한 망사 금속 판에 올려놓고 2시간 동안 익숙해지게 하였다. 기계적 역치는 보정된 본 프레이 필라멘트(Stoelting)를 사용하여 측정하고 생쥐가 발을 움츠릴 때 적용된 필라멘트의 굽힘력을 그램으로 정의하였다. 필라멘트를 망사를 통하여 금속 판 밑에서 각 다리의 발바닥까지 적용하였다. 반응 스코어는 각각의 필라멘트에 대해 10 번의 연속적인 실험에서 발 움츠림의 횟수를 측정하였고, 반응의 평균값을 분석에 사용하였다.
<2-1-2> 꼬리치기 테스트(tail flick test)
꼬리치기를 내는데 필요한 지역적 압력을 본 프레이 필라멘트를 사용하여 결정하였다. 생쥐 움직임억제기구(restrainer)를 사용하기 위해 생쥐를 2주 동안 하루 30분씩 움직임억제기구안에서 적응훈련을 실시하였다. 각각의 모노필라멘트의 굽힘력은 테이블에 놓인 꼬리에 지역적으로 적용하였다. 압력을 받은 꼬리치기만을 침해수용으로 정의하였다. 반응 스코어는 각각의 필라멘트 적용사이에서 10분의 간격으로 10번의 연속된 실험에서 꼬리치기 횟수를 평균하여 측정하였다.
그 결과, 상기 발 움츠림과 꼬리치기 테스트에서 기계적 자극의 넓은 범위에 대해서 본 발명의 유전자 변이 생쥐는 반응이 급격히 감소되었다(도 5의A및B). 발 움츠림과 꼬리치기의 역치는 반응-강도 커브에서 높은 강도로 이동하며 N-타입 칼슘 통로가 심한 침해수용에 필요하다는 것을 보여주었다.
<2-2> 복사열 및 열판에 대한 반응
다음으로 본 발명자들은 척수 반사 및 극상척수(supraspinal) 및 척수 메카니즘에 관여하는 열판 분석에 의해 매개되는 것으로 알려진 복사열 분석(Hargreaves 테스트)을 이용하여 온도 통증 반응을 측정하였다(Chapman et al.,Pain, 1985, 22:1-31).
<2-2-1> 발 움츠림 테스트
본 발명자들은 뒷발 움츠림 반응대기시간을 하르그레브 방법(Hargreaves et al.,Pain, 1988, 32:77-88)에 의해 유고바실(Ugo Basile) 발바닥 테스트기구(Stoelting)을 사용하여 측정하였다. 생쥐를 높여진 글래스 플레이트 위의 플렉시그라스(Plexiglas) 상자에 넣고 테스트 전에 2시간 동안 익숙해지도록 하였다. 테스트는 낮은 강도(20)와 높은 강도(40)에서 수행하였다. 반응은 머리를 돌릴 때와 발 핥기, 발 떨기가 관찰될 때 발의 움츠림으로 정의하였다. 시간은 발 움츠림 반응대기시간으로 정의하였다. 양쪽 뒷발에 각각의 실험 사이에 5-10분 간격을 두고 4-5번 실험을 평균하였다.
<2-2-1> 꼬리치기 테스트
본 발명자들은 상기 실험예 <2-1-2>와 동일한 방법으로 꼬리치기 테스트를 수행하였다. 꼬리치기 테스트는 조직 손상을 줄이기 위하여 최장시간을 15초로 하는 높은 강도(40)를 사용하였다. 복사열 자극을 꼬리의 중간 지역에 적용하였다. 꼬리 흔들림에 대한 반응잠복시간은 각각의 생쥐에서 4-5회 실험에서 결정하였고, 평균값을 산출하였다.
<2-2-3> 열판 테스트
본 발명자들은 열 통증 반응을 열판(Mogil et al.,Pain, 1999, 80:67-82)을 사용하여 평가하였다. 열판 테스트를 위하여, 생쥐를 금속 바닥의 투명한 테스트 박스(14 X 14 X 20 ㎝)에서 2일 동안 사육하였다. 그 다음 생쥐를 온도-조절 수조에서 원하는 온도까지 미리 데워둔 상자에 올려놓고, 처음 뒷발 핥기 또는 점프 반응을 하는 시간을 기록하였다(최장시간, 60초).
그 결과, 유전자 변이 생쥐는 대조군에 비하여 복사열 분석에서 발 움츠림 및 꼬리치기에 대한 긴 반응대기시간을 보여주었다(도 6의A및B). 그러나 열판 테스트에서 유해한 열 자극에 대한 통증 행동(핥기, 흔듦, 또는 뛰기)은 유전자 변이와 대조군 생쥐에서 동일하였다(도 6의C). 상기 결과는 유전자 변이 생쥐에서 복사열과 유해한 열 자극 사이의 통증 반응의 차이를 보여주었다.
<2-3> 화학약품 유도 염증 고통에 대한 감소된 반응
본 발명자들은 포르말린 또는 아세트산에 의해 유도되는 염증성 통증에 대한 반응을 관찰하였다.
<2-3-1> 포르말린 테스트
본 발명자들은 포르말린을 0.2% 및 2.0% 농도로 하여 포르말린 테스트를 수행하였다. 테스트는 발을 가리는 것 없이 관찰할 수 있도록 45° 각도의 거울 위에 올려둔 플렉시그라스(Plexiglas) 상자(12 X 12 X 00 ㎝)에서 수행하였다. 생쥐는 테스트전 30분 동안 챔버에서 사육하였다. 적응이 끝난 후, 포르말린(생리수에 0.2% 및 2.0%)을 왼쪽 뒷발의 등쪽 표면에 피하주사하여 테스트 챔버에 돌려보냈다. 이들의 행동을 60분간 관찰하였다. 반응의 형태(핥기, 물어 뜯기 및 흔듦) 및 각각의 행동에 드는 시간을 관찰하였다. 핥기/물기의 전체 시간을 실험의 60분간의 진행동안 5분 간격으로 측정하였다. 단계 1은 포르말린 주입 후 처음 10분간으로 정의하고, 단계 2는 포르말린 주입 후 나머지 50 분간으로 정의한다. 생쥐는 이 실험에 한번씩만 사용하고 각각의 생쥐는 한가지 농도의 포르말린을 투여하였다.
그 결과, 생쥐의 뒷발에 포르말린을 피하주사하면 주사한 발에서 두가지 단계(biphasic) 통증 반응을 일으켰다. 0.2% 농도의 포르말린은 일차 단계 반응(0-10 분; 단계 1)만을 유도하였고, 반면 2% 농도의 포르말린은 대조군에서 일차 및 이차 반응(20-60 분 ; 단계 2)을 유도하였고 상기 결과는 이전의 문헌(Rosland et al.,Pain, 1990, 42:235-242)의 결과와 일치하였다. 생리수를 주사하였을 때는 대조군 또는 유전자 변이 생쥐에서 통증 반응을 일으키지 않았다. 알파1B 유전자 변이 생쥐는 2% 포르말린 주사 후에 단계 2 반응에서 대조군과 비교하여 매우 감소된 것을 보였고, 포르말린 농도에 관계없이 단계1 반응에서는 아무런 변화가 없었다(도 7의B). 알파1B 유전자 변이 생쥐에서 단계 2 개시 시간은 포르말린 주사후 40분이었고 대조군에서는 20분이었다(도 7의A). 또한 유전자 변이의 단계 2 지속( ~20분)은 대조군( ~30분)보다 짧았다.
<2-3-2> 몸부림 테스트(writhing test)
본 발명자들은 아세트산 유도 내장 통증 반응을 관찰하기 위하여, 0.6% 아세트산을 생쥐의 복막강에 주입하였다. 내장 통증은 지연된 염증 반응에 대해 2차적으로 나타나고 복부 뻗기(abdominal stretching) 및 몸부림 행동을유도한다(Gyires and Torma,Arch Int. Pharmacodyn. Ther., 1984, 267:131-140). 생쥐를 투명 케이지(24 X 18 X 12 ㎝)에 각각 넣고 60분 동안 적응시켰다. 그리고 0.6% 아세트산(5.0 ㎎/㎏)을 복막(peritoneum)에 주입하여 테스트 챔버에 되돌려놓았다. 복부(abdominal) 뻗기 또는 몸부림 활동의 횟수를 20분 동안 측정하였다. 모든 생쥐는 이 실험에 한번씩 사용하였다.
그 결과, 아세트산 유도 내장 통증에 대해 본 발명의 알파1B 유전자 변이 생쥐는 대조군에 비해 감소된 뻗기 및 몸부림 행동을 나타내었다(도 7의C).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자가 동형접합체로 결실된 유전자 변이 생쥐는 N-타입 칼슘 이온 통로 활성을 나타내지 않고, 기계적 자극 또는 복사열에 대해 감소된 통증 반응을 나타내므로, 통증 관련 연구의 동물 모델 및 N-타입 칼슘 이온 통로 관련 통증을 조절하는 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (10)
- 칼슘 이온 통로 알파 1B 단백질이 발현되지 않는 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐(transgenic mouse).
- 제 1항에 있어서, 생쥐는 무스 무쿨러스(Mus musculus)인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 생쥐.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자의 IS(intervening segment) 3 부위가 결실된 유전자 변이 생쥐.
- (1) 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자에 대한 적중벡터(targeting vector)를 생쥐 배아간세포에 도입하는 단계;(2) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 얻는 단계;(3) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 생쥐를 얻는 단계; 및(4) 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐를 얻는 단계로 구성되는 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
- 제 4항에 있어서, 적중벡터는 GFP(green fluorescent protein) 및 PGK-neo 카셋트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
- 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 적중벡터는 칼슘 이온 통로 알파1B 유전자에 대한 상동 절편 2개, GFP, PGK-neo 카셋트 및 5' 말단에 위치하는 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
- 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 유전자 변이 생쥐(transgenic mouse)의 수정란(수탁번호 : KCTC 10158BP)
- 제 7항의 수정란을 대리모에 이식하여 칼슘 이온 통로 알파1B +/- 유전자형을갖는 이형접합체(heterozygote) 유전자 변이 생쥐를 얻고, 이형접합체 유전자 변이생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 칼슘 이온 통로 알파1B -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
- 칼슘 이온 통로 알파 1B 단백질의 기능을 억제하여 통증을 감소시키는 방법.
- 제 1항의 유전자 변이 생쥐를 통증 억제제를 스크리닝하는데 사용하는 용도.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| B601 | Maintenance of original decision after re-examination before a trial | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20040825 Effective date: 20060330 Free format text: TRIAL NUMBER: 2004101003784; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20040825 Effective date: 20060330 |
|
| J2X1 | Appeal (before the patent court) |
Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL Free format text: TRIAL NUMBER: 2006201004116; APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL |
|
| J302 | Written judgement (patent court) |
Free format text: JUDGMENT (PATENT COURT) FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20060505 Effective date: 20061222 Free format text: TRIAL NUMBER: 2006201004116; JUDGMENT (PATENT COURT) FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20060505 Effective date: 20061222 |