KR100514090B1 - Ｎｃｘ2 단백질의 활성을 억제함으로써 학습능력 및기억력을 증진시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 학습능력 및 기억력을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 시냅스 전달을 억제하고 신경물질 분비를 억제하는 NCX2 단백질의 활성을 억제함으로써 학습능력 및 기억력을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, NCX2 유전자가 적중된 유전자변이 생쥐는 정상생쥐보다 학습능력 및 기억력이 현저히 증진되는 것을 나타내므로 NCX2 단백질의 활성을 억제하는 물질은 학습능력 및 기억력 조절제로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 NCX2 유전자 또는 단백질을 이용하여 학습능력 및 기억력을 향상시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

Description

ＮＣＸ2 단백질의 활성을 억제함으로써 학습능력 및 기억력을 증진시키는 방법{Method for enhancing learning and memory by suppressing the activity of NCX2 protein}

본 발명은 NCX2 단백질의 활성을 억제함으로써 학습능력 및 기억력을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 시냅스 전달을 억제하고 신경물질 분비를 억제하는 NCX2 단백질의 활성을 억제함으로써 학습능력 및 기억력을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Na⁺/Ca²⁺ 교환기(Natrium Calcium Exchanger; NCX)의 생리학적 기능은 원형질막을 따라 흐르는 전기화학적 구배의 발생에 따라 3개의 Na⁺을 1개의 Ca²⁺로 전기화학적으로 교환하는 것이다. 정상적으로 NCX는 전기화학적인 Na⁺의 구배에 대해 Ca²⁺을 배출하는 작용을 하지만, 특정한 상황에서는 NCX를 통해 Ca²⁺가 유입되는 것으로 밝혀졌다(Hryshko and Philipson, 1997, Basic Res. Cardiol. 92:45-51; Blaustein and Lederer, 1999, Physiol. Rev., 79, 763-854). Ca²⁺의 항상성 유지가 중요함에도 불구하고 뇌에서의 NCX의 생리학적 역할에 대해서는 잘 알려져있지 않다.

NCX 및 원형질막 Ca²⁺-ATPase(plasma membrane calcium ATPase; PMCA)는 신경세포 및 심근과 같은 흥분성 세포에서 휴지 세포내 Ca²⁺ 농도(intracelluar Ca²⁺; [Ca²⁺]_i)를 조절한다. PMCA는 높은 친화성으로 Ca²⁺와 결합하지만, 약 100 s^-1의 낮은 턴오버 속도(즉, Ca²⁺ 전달 수/전달자/단위시간)를 나타낸다. NCX는 PMCA에 비해 Ca²⁺에 대한 친화성이 10배 정도 낮지만, 턴오버 속도는 10-50배 높게 나타난다. 세포가 활성화되고 [Ca²⁺]_i가 증가된 상태로 유지되는 상황에서 PMCA는 Ca²⁺과 포화되어 Ca²⁺을 배출하는 능력이 제한되게 되지만 NCX는 이러한 과정에 있어서 우세한 역할을 수행하게 된다(Sanchez-Armass and Blaustein, 1987, Am. J. Physiol. 252:C595-603; Blaustein and Lederer, 1999, Physiol. Rev. 79:763-854).

NCX의 3가지 이소형태(NCX1, NCX2, NCX3)가 포유동물에서는 별개의 유전자에 의하여 코딩된다(Nicoll et al., 1990, Science, 250:562-565; Li et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:17434-17439; Nicoll et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:24914-24921). 뇌에서의 NCX2의 발현은 NCX1의 발현보다 4배 내지 10배 정도 높고, NCX3 보다는 100 배 이상 높다(Yu and Colvin, 1997, Brain Res. Mol. Brain Res. 50:285-292). NCX의 3가지 다른 이소형태는 매우 유사한 성질을 나타내지만(Linck et al., 1998, Am. J. Physiol. 274:C415-423; Blaustein and Lederer, 1999, Physiol. Rev. 79:763-854), 출생후 성장하는 동안 및 성인이 되었을때에의그들의 발현은 다르게 나타난다(Sakaue et al., 2000, Brain Res. 881:212-216; Gibney et al., 2002, Neuroscience, 112, 65-73; Yu and Colvin, 1997, Brain Res. Mol. Brain Res., 50, 285-292).

세포내 Ca²⁺ 제거에 NCX의 기여는 소뇌의 평행섬유(Regehr, 1997, Biophys. J., 73, 2476-2488) 및 푸르킨예 세포(purkinje cell)(Fierro et al., 1998, J. Physiol. 510:499-512)에서 증명되었다. 다른 연구에서, NCX에서 보존된 부위에 대한 안티센스 올리고디옥시뉴클레오타이드의 세포내 주입은 NMDA에 의한 Ca²⁺ 유입의 활성후에 기준 Ca²⁺ 수준이 천천히 회복되는 것으로 나타났다(Ranciat-McComb et al., 2000, Neurosci. Lett. 294:13-16). 또한, NCX는 해마신경의 시냅스 위치에서 [Ca²⁺]_i의 조절에 중요한 역할을 하고, 시냅스 소포 재순환에 영향을 미친다고 보고되었다(Reuter and Porzig, 1995, Neuron, 15:1077-1084; Bouron and Reuter, 1996, Neuron, 17:969-978). 따라서, 세포외의 Na⁺을 Li⁺으로 대체시킴으로써 NCX의 작용을 억제시키면 신경 말단에서의 자극 동안 및 자극 후에 [Ca²⁺]_i를 증가시키며, 이를 통해 시냅스 소포체(vesicle)에서의 최초 세포외 배출 속도를 빠르게 한다. 시냅스후 뉴런에서 빠르고 지속적인 [Ca²⁺]_i의 증가는 시냅스전 말단에서 많은 양의 신경전달물질이 분비되는 것과 시냅스후 위치에서의 지체된 Ca²⁺ 제거 때문이다. 따라서, 지체된 Ca²⁺ 제거는 전- 및 후시냅스에서 시냅스 활성을 강화할 것이다. 그러나, 시냅스 plasticity의 조절에 있어서의 NCX의 역할에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 학습능력과 기억력을 향상시키는 방법에 대하여 연구하던 중 뇌에서 NCX의 주요한 이소형태인 NCX2 유전자가 결핍된 돌연변이 생쥐를 제조하여 시냅스 활성에 대해 실험한 결과, NCX2 활성이 억제되면 Ca²⁺이 늦게 제거되고, 시냅스 -전 및 -후에서 시냅스 활성이 강화되어 학습능력 및 기억력이 향상됨을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 NCX2 활성을 억제함으로써 학습능력 및 기억력을 증진시키는 방법, 및 NCX2 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 학습능력 및 기억력 조절제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 NCX2 유전자 및 그의 단백질을 이용하여 학습능력 및 기억력을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

Ⅰ. 본 발명은 NCX2 단백질의 활성을 억제함으로써 학습능력 및 기억력을 증진시키는 방법을 제공한다.

NCX2의 활성을 억제시키는 방법은 유전자 적중법에 의해 NCX2 유전자를 적중시켜 NCX2 유전자의 발현을 억제하는 방법, 안티센스를 이용하여 NCX2 유전자를 적중시켜 NCX2 유전자의 발현을 억제하는 방법, NCX 유전자의 발현을 억제시켜 NCX 단백질의 양을 감소시키는 방법, NCX 단백질의 활성을 저해시키는 방법, NCX2 유전자의 전사를 억제하는 방법 또는 전사된 mRNA의 번역을 억제시키는 방법 등이 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명자들은 바람직한 실시예로서 NCX2 유전자를 적중하여 NCX2 유전자가 결실된 생쥐를 제조하여 실험하였다.

NCX2는 Ca²⁺ 농도에 관여함으로써 시냅스 활성을 조절한다. NCX2 유전자변이 생쥐는 NMDA에 의한 Ca²⁺ 유입의 활성화 이후에 세포내 Ca²⁺ 농도가 감소되는 속도가 야생형 생쥐에 비하여 느리지만, 기저 [Ca²⁺]_i 및 피크 [Ca²⁺]_i에서는 별다른 변화가 없었다(도 3의 C 참조). 이는 NCX2가 기저선 [Ca²⁺]_i 수준을 회복하는데 역할을 함으로써 시냅스 활성을 조절한다는 것을 알 수 있다.

NCX2 유전자변이 생쥐는 fEPSPs(field excitatory postsynaptic potentials)에 변화가 없었고(도 4의 A 참조), NMDA 수용체-매개 필드 반응을 변화시키지 않았으며(도 4의 B 참조), 또한 많은 신경전달 물질을 분비시켰다(도 4의 D 참조). 이는 NCX2가 신경전달 물질분비를 조절하고, 전시냅스 말단에서 Ca²⁺ 조절에 관여하고 단기 적응성을 변화시킨다는 것을 의미한다.

또한, NCX2 유전자변이 생쥐는 증가된 LTP를 나타내었고(도 5의 A 참조), 시냅스 강화를 나타내었다(도 5의 B 참조). 아울러 NCX2 유전자변이 생쥐는 시냅스 저하를 유지시키지 아니하고(도 5의 D 참조), LTD 유도를 생성하지 아니하였다. 즉, NCX2는 LTP를 유도하는데는 필요하지 아니하지만, LTD를 유도하고 유지시키는데 역할을 한다는 것을 의미한다.

아울러, NCX 유전자변이 생쥐는 모리스 물 미로(Morris water maze) 실험에 의하면 학습능력 및 기억력이 현저하게 증가한 것을 알 수 있다(도 6 참조). 또한 기억이 다른 행동에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 유전자변이 생쥐를 공포에 대하여 증가된 장기 기억을 나타내고 있다(도 7 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, NCX2의 활성이 억제되면 Ca²⁺의 유입을 촉진시키고 제거를 지연시켜 시냅스 전달이 증가되고, 많은 신경전달 물질이 분비되어 LTP가 유도되어 장기간 유지되므로 학습능력 및 기억력이 향상된다.

Ⅱ. 본 발명은 NCX2 유전자 및 그의 단백질을 이용하여 학습능력 및 기억력을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법은

(1) NCX2 구조 유전자 및 리포터 유전자가 작동하도록 포함된 벡터로 숙주세포를 전환시켜 형질전환체를 얻는 단계;

(2) 상기 형질전환체와 스크리닝하고자 하는 검체를 같이 넣고 배양하는 단계; 및

(3) 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계로 구성된다.

NCX2의 활성이 억제되면 학습능력 및 기억력을 증가시키므로 NCX2의 활성을 억제하는 물질 그 자체가 학습능력 및 기억력을 증가시키는 물질이 될 수 있다. 따라서, 단백질의 활성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 공지의 방법에 따라 NCX2의 활성을 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있다.

단백질의 활성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 일반적인 방법은 다음과 같다.

먼저, NCX2 구조유전자 및 리포터 유전자가 작동하도록 포함된 벡터를 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 얻는다. 여기에 스크리닝 하고자 하는 검체를 같이 넣고 형질전환체를 배양하여 리포터 유전자의 발현량을 측정하면 NCX2의 발현을 억제하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 이때, 발현벡터, 프로모터 또는 리포터 유전자는 사용하는 숙주세포 및 실험 조건에 따라서 다양하게 변화시킬 수 있으며, 특별한 것에 한정되지 않음은 당업자에게 있어서는 명백하다.

Ⅲ. 본 발명은 상기의 스크리닝 방법에 의해 선별된, NCX2 단백질의 활성을 억제하여 학습능력 또는 기억능력을 조절할 수 있는 물질을 제공한다.

NCX2 유전자변이 생쥐는 학습과 기억력이 증가되어 있으므로 이 NCX2에 대한 억제제는 치매의 예방과 학습현상 능력의 증가를 가져올 수 있다. 상기에서 NCX2 억제제는 NCX2에 특이적으로 작용하여 활성을 억제하는 화합물, 상기 NCX2에 특이적으로 결합하는 항체, NCX2 유전자의 전사를 억제하는 물질, 및 전사된 NCX2 유전자의 번역을 억제하는 물질 등이 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니며, 상기에서 열거된 물질이외에도 NCX2의 활성을 억제하는 모든 물질이 사용될 수 있다.

상기 NCX2 억제제는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제로는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액과 같은 비경구투여용 주사제 등이 있으며, 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을, 주사제의 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 사용하여 조제할 수 있다. 또한, 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 NCX2 억제제는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 NCX2 억제제의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 또한 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 NCX2 억제제의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 NCX2억제제 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

Ⅳ. 본 발명은 유전자 적중법에 의하여 NCX2 유전자의 특정부위가 적중된 NCX2 유전자변이 생쥐를 제공한다. 즉, 본 발명은 NCX2 유전자가 적중되어 NCX2 단백질이 발현되지 않는 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자변이 생쥐를 제공한다.

본 발명자들은 NCX2 +/- 유전자형을 갖는 유전자변이 생쥐의 수정란을 2002년 8월 6일부로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10322BP). 본 발명에서는 상기 +/- 형질을 갖는 수정란으로부터 얻어진 생쥐를 서로 교배하여 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 유전자변이 생쥐를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 NCX2 유전자변이 생쥐의 제조방법은

(1) NCX2 유전자에 대한 적중벡터(targeting vector)를 생쥐 배아줄기세포에 도입하는 단계;

(2) 상기 배아줄기세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 얻는 단계;

(3) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 NCX2 +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 생쥐를 얻는 단계; 및,

(4) 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자변이 생쥐를 얻는 단계로 구성된다.

상기 제조방법을 구체적으로 설명하면, 먼저 NCX2 유전자에 대한 적중 벡터를 제조한다. 본 발명의 적중벡터는 NCX2 유전자에 대한 상동 절편 2개, NLS-Cre, PGK 프로모터, neo 유전자, PGK poly A 및 HSV 티미딘 키나제를 포함한다. 상기의 적중벡터는 2개의 상동 절편에서 동형재조합(homologous recombination)이 발생하고 엑손 1의 시작 코돈을 NLS-Cre로 대치함으로써, 정상적인 NCX2 유전자가 발현되지 않는다(도 1 참조).

NCX2 유전자의 적중이 확인된 배아줄기세포 클론을 배양한 후 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐를 제조하였다. 배아줄기세포가 주입된 포배아를 정관 수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식하여 키메라 생쥐로의 발생을 유도하고, 이로부터 약 19일이 경과된 후에 배아줄기세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 섞인 키메라 생쥐가 생산되었다. 상기에서 선별된 NCX2 +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 본 발명의 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 유전자변이 생쥐를 얻었다. 상기 동형접합체 유전자변이 생쥐가 NCX2 -/- 유전자형을 갖고 있음을 서던 블럿 분석 및 PCR을 수행하여 확인하였으며, 웨스턴 블럿 분석을 수행하여 유전자변이 생쥐에서 NCX2 단백질이 발현되지 않음을 확인하였다(도 1 참조).

본 발명자들은 상기 NCX2 +/- 유전자형을 갖는 수정란을 2002년 8월 6일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10322BP).

본 발명은 또한 상기 수정란을 대리모에 이식하여 NCX2 +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 유전자변이 생쥐를 얻고, 이형접합체 유전자변이 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> NCX2 유전자변이 생쥐의 제조

<1-1> 적중벡터의 제작

본 발명자들은 NCX2 유전자가 결실된 유전자변이 생쥐를 제조하기 위하여, 일반적으로 사용되는 유전자 적중법(gene targeting method)을 이용하였다.

구체적으로, 생쥐 NCX2 유전자는 생쥐 129/Sv 게놈 파지 라이브러리(lambda FIXII, Staratagene)로부터 랫트 cDNA의 5' 부위 255 bp로 이루어진 cDNA 프루브 pII(Li et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:17434-17439)를 사용하여 분리하였다. 본 발명자들은 NCX2의 아미노산 잔기 1-226 및 227-446을 암호화하는 두 개의 엑손을 포함하는 3개의 클론을 얻었고, 이는 랫트 NCX2와 약 96% 상동성을 나타내었다. 이러한 엑손을 엑손 1 및 엑손 2 라고 명명하였고, 제한효소 맵핑, 올리고뉴클레오티드 혼성화 및 서열 확인을 통해 엑손 1 및 엑손 2를 포함하는 3개의 겹쳐지는 파지 클론으로 확인하였다.

상기 게놈 클론을 사용하여, 본 발명자들은 상동 재조합을 위한 적중 벡터를 제조하였다. 구체적으로, 엑손 1은 pxCANCre(NLS: nuclear localization seqeunce, Cre: cre recombinase)로부터 NLS-Cre의 1.7 kb를 갖는 시작 코돈(ATG)에 위치하고 있었다(Kanegae et al., 1995, Nucleic Acids Res, 23, 3816-3821). 본 발명의 적중벡터는 이중 선별마커인 neo 카세트(PGK(phosphoglycerate kinase) promoter-neo-PGK polyA) 및 pPNT의 티미딘 키나제(Herpes simplex virus thymidine kinase)(Tybulewicz et al., 1991, Cell, 65:1153-1163)를 갖는 7.8 kb 상동 절편을 포함한다.

엑손 1은 상동 재조합(homologous recombination)에 의해서 NLS-Cre 리컴비나제(recombinase) 유전자 및 양성 선별을 위한 네오마이신 저항 유전자 카셋트로 치환되고, HSV 티미딘 키나제 유전자는 음성 선별을 위해 포함되었다(도 1의 A). 엑손 1이 대부분의 전방 5개의 막투과 도메인을 암호화하고, NCX2의 시작 코돈(ATG)을 포함하고 있기 때문에, 유전자 적중에 의한 엑손 1의 결실에 의해 NCX2 유전자가 발현되지 않는다(Li et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:17434-17439). NCX2의 시작 코돈 부위를 NcoI 효소로 분해하면, NLS-Cre 리컴비나제 유전자는 시작 코돈(ATG)에 대치되어질 수 있고, Cre 리컴비나제는 NCX2 프로모터 유전자에 의해 조절된다.

<1-2> 배아줄기세포의 배양

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>로부터 제작된 적중벡터를 형질 도입시키기 위한 세포주로 J1 배아줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)를 사용하였다. 배아줄기세포 배양과 배아 조작은 김 등의 방법과 동일하게 수행하였다(Kim et al., Nature, 1997, 389:290-293). J1 배아줄기세포(미국, MIT의 R. Jaenisch로부터 분양 받음, Nature, 1989. 342, 435-438)를 ES 배지(15% 소태아 혈청(fetal bovine serum, Hyclone Co.), 1x 페니실린-스트렙토마이신(phenicillin-streptomycin, Gibco Co.), 1x 비-필수 아미노산(Gibco Co.), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol), DMEM 배지(Gibco Co.))에 접종하고 37℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다. 상기 배양으로부터 얻은 배세포군에 0.25% 트립신이 포함된 1 mM EDTA 용액을 가하여 단일세포들로 분리하였다.

<1-3> 적중벡터의 도입

상기 실시예 <1-2>에서 단일세포로 분리한 배아줄기세포에 실시예 <1-1>에서 제작한 적중벡터를 도입(transfection)하기 위하여 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 수행하였다. 구체적으로, 분리된 단일의 배아줄기세포와 실시예 <1-1>에서 제조한 적중벡터 DNA 80 ㎍를 첨가하여 혼합한 후 270 V/500 microF 조건하에서 일렉트로포레이션을 수행하였다. 적중 벡터가 도입된 배아줄기세포를 0.3 ㎎/㎖ G418 및 2 μM의 간사이클로버(gancyclovior)가 포함된 ES 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 배아줄기세포 내 NCX2 유전자가 적중벡터에 의해 정확하게 적중된 배아줄기세포 클론을 다시 ES 배지에 분주하여 18 내지 22시간 동안 배양한 후 트립신을 처리하여 단일세포로 분리하고 생존한 세포만을 골라 미세주입에 사용하였다.

<1-4> 키메라(chimera) 생쥐의 제조

NCX2 +/-의 유전자형을 갖는 키메라 생쥐를 제조하기 위하여, 수정된 포배아 세포에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아줄기세포 클론을 미세주입하여 C57BL/6J 생쥐에 주입하였다. 구체적으로, C57BL/6J 생쥐(Jackson Laboratory, USA) 암컷과 수컷을 교배시키고, 교미 후 3.5일(3.5 p.c.)된 암컷을 경추탈골법으로 희생시켰다. 희생된 암컷으로부터 자궁을 적출하여 자궁 말단부를 가위로 절제한 후 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20 mM HEPES, 10% 소태아혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사 용액 1 ㎖를 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세 유리관을 사용하여 상기 자궁조직으로부터 포배아를 분리하였으며, 분리한 포배아를 35 mm 페트리디쉬 위에 미리 떨어뜨려 놓은 주사 용액 방울에 옮긴 후 후속하는 도입과정에 사용하였다.

이와 같이 분리한 포배아에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아줄기세포 클론을 도입하기 위하여, 미세주입기(Zeiss 사)를 이용하여 홀딩(holding) 피펫으로 포배아의 내부세포괴(inner cell mass) 방향을 음압으로 잡은 상태에서 10 내지 15개의 배아줄기세포 클론을 흡입한 주사 피펫을 포배아의 포배강내로 삽입한 후 양압을 주어 배아줄기세포 클론을 포배아의 포배강내로 주입하였다. 상기 클론이 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식하여 배아줄기세포 클론(J1) 및 C57BL/6J 생쥐의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 생쥐의 발생을 유도하였다. 이때, 자궁이식은 애버틴(avertine, 1 ㎎/㎏ 몸무게)으로 마취된 대리모의 복부를 1 ㎝ 정도 절제하고, 자궁 상부를 핀셋으로 집어 2 cm 정도 체외로 잡아당긴 후 주사 바늘로 자궁에 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 상기의 포배아를 미세유리관으로 주입한 뒤 내부 복강막을 봉합사로 두 바늘 꿰멘 다음 겉가죽을 내과용 클립으로 봉입하는 방법을 사용하였다. 이렇게 배아줄기세포가 주입된 포배아를 대리모 생쥐의 자궁으로 이식하여 약 19일 동안 배양함으로써 배아줄기세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 융합되어 게놈 내 NCX2 +/-의 유전자형을 가지는 키메라 생쥐를 확보하였다.

<1-5> NCX2 +/- 유전자형의 이형접합체 생쥐 제조

상기 실시예 <1-4>로부터 얻은 수컷 키메라 생쥐를 C57BL/6J 암컷 생쥐와 교배하여 배선-전달(germline-transmitted) F1 이형접합체(NCX2 +/-)를 제조하였다. 이중 NCX2 +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐를 선별하기 위하여, 꼬리 게놈 DNA를 이용하여 유전자 타이핑을 수행하였다. 구체적으로, 유전자 타이핑은 꼬리 끝에서 추출한 게놈 DNA로부터 PCR을 수행하여 확인하였다. PCR을 위한 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 F1 프라이머, 서열번호 2로 기재되는 B1 프라이머, 서열번호 3으로 기재되는 B2 프라이머를 사용하였다. PCR은 95℃에서 3분 동안 1회 수행하고, 94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 40초를 45회 반복 수행한 후, 72℃에서 5분 더 수행하였다.

그 결과, 정상 생쥐(+/+)에서는 494 bp의 하나의 밴드만 관찰되었고, 이형접합체 생쥐(+/-)에서는 494 bp와 347 bp 두 개의 밴드가 관찰되었다.(도 1의 B 하단).

<1-6> NCX2 -/- 유전자형의 동형접합체 유전자변이 생쥐의 제조

상기 실시예 <1-5>에서 선별된 NCX2 +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 유전자변이 생쥐를 얻었다. 본 발명자들은 제조된 유전자변이 생쥐가 게놈 내 NCX2 -/- 유전자형을 갖는지를 확인하기 위하여 상기 실시예 <1-5>와 동일한 방법으로 꼬리 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 유전자변이 생쥐에서 NCX2 단백질이 발현되지 않음을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.

<1-6-1> PCR (polymerase chain reaction)

본 발명자들은 유전자변이 생쥐의 꼬리 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 이 게놈 DNA 1 ㎕를 주형으로 사용하고, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 사용하여 상기 실시예 <1-5>와 동일한 조건에서 PCR을 실시하였다.

그 결과, 정상 생쥐(+/+)에서는 494 bp의 하나의 밴드만 관찰되었고, 이형접합체 생쥐(+/-)에서는 494 bp와 347 bp 두 개의 밴드가 관찰된 반면 상기에서 제조한 동형접합체 생쥐(-/-)에서는 347 bp 밴드 하나만 관찰되어 상기 유전자변이 생쥐가 NCX2 -/-의 유전자형을 갖고 있음을 확인하였다(도 1의 B 하단).

<1-6-2> 웨스턴 블럿 분석(western blot ananlysis)

NCX2 -/- 유전자의 유전자형을 갖고 있는 본 발명의 유전자변이 생쥐에서 실제적으로 NCX2 단백질이 발현되지 않음을 확인하기 위하여 김 등의 방법(Kim et al., 2001, Neuron, 31, 35-45)에 따라 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)을 수행하였다. 구체적으로, 생쥐로부터 뇌 전체를 분리하여 분쇄한 후 차가운 용해 버퍼(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 프로테아제 저해제 칵테일(Boehringer Mannheim), 칼파인 저해제 I 및 II)에서 초음파 처리하였다. 낮은 속도로 원심분리(1,000 x g, 5분, 4℃)를 수행하고, 상층액을 다시 원심분리(28,000 x g, 15분, 4℃)하여 막 분획을 얻었다. 상기 막 분획(15 ㎍)은 SDS PAGE 젤(8%)에서 2시간 동안 분리하고, 니트로셀룰로스 막에서 90 V로 2시간 동안 트랜스퍼 하였다. 5% 탈지유가 포함된 TBST(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)에서 1시간 동안 막을 블록킹한 후, 통상적인 방법에 따라 제조된 1차 항체(항-NCX2, 1:10,000 희석)로 4시간 동안 막을 처리하였다. 검출은 퍼옥시다제-접합 항-토끼 IgG 2차 항체로 수행하였고, ECL(chemiluminescence; Amersham, UK)을 수행하였다.

그 결과, NCX-/- 유전자형을 갖는 유전자변이 생쥐에서는 NCX2 단백질이 생성되지 않고 있음을 확인하여 NCX 유전자가 제거됨을 확인하였다(도 1의 C). 본 발명자들은 상기 NCX2 +/- 유전자형을 갖는 유전자변이 생쥐의 수정란을 2002년 8월 6일부로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10322BP).

<1-6-4> NCX2 유전자변이 생쥐의 형태학적 분석

본 발명자들은 NCX2 유전자변이 생쥐가 정상적으로 성장하였기 때문에 뇌에서의 변화를 관찰하기 위해 형태학적 관찰을 수행하였다. 구체적으로, 7주된 NCX2 유전자변이 생쥐의 뇌를 정중 절단하여(8 ㎛), 이를 크레실 바이올렛으로 염색하였다. 이를 위하여, 생쥐를 4% 파라포름알데히드가 포함된 0.1 M 포스페이트 버퍼(pH 7.4)에 넣고, 4℃에서 2일 동안 고정하였다. 표준 방법에 따라 파라핀 왁스에 넣은 후에, 마이크로톰으로 8 ㎛의 절편을 제조하였다. 파라핀을 제거하고 세척한 후에, 절편은 37℃에서 12시간 동안 90% 알코올에 정치한 후 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 2시간 동안 염색하였다.

그 결과, 정상적으로 성장한 NCX2 유전자변이 생쥐는 해마(hipoocampus), 소뇌, 대뇌피질(cortex), 시상(thalamus), 기저핵(basal ganglia) 및 소뇌편도(amygdala)와 같이 NCX2를 발현하는 모든 주요한 세포구조학적 분할이 변하지 않았다(도 1의 D).

<실시예 2> NCX2의 발현 분석

NCX2는 뇌 및 골격근에서만 발현되지만(Li et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 17434-17439), 골격근에서 NCX2가 발현한다는 것에 대해서는 아직까지 논쟁의 여지가 있다(Nicoll et al., 1996, J. Biol. Chem., 271, 24914-24921). 이에 본 발명자들은 골격근, CNS, 뇌 및 척수에서의 NCX2의 발현을 분석하기 위해 RT-PCR 로 mRNA의 발현을 분석하였다. 구체적으로, TRIzol 시약을 사용하여 새끼 쥐 및 어른 쥐의 뇌 및 골격근(뒷다리의 윗대퇴부)에서 제조회사(Gibco BRL)의 지침에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 상기에서 분리한 RNA를 이용하여 DyNAzyme^TMII DNA 중합효소(Finnzymes Inc.)를 이용하고 서열번호 4로 기재되는 RT-F1 프라이머, 서열번호 5로 기재되는 RT-B1 프라이머를 사용하여 상기 실시예 <1-5>의 NCX 유전자 타이핑과 동일한 조건으로 PCR을 수행해 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 젤에서 분리하였다. 오염은 세포질 주형을 물로 대치하여 확인하였다. 게놈 DNA로부터 산물의 기여를 배제하기 위하여, 대조군에서는 역전사효소를 빼고 역전사 반응을 수행하였다. 상기 두 대조군은 모두 음성이다.

그 결과, 골격근과 음성대조군(H₂O 및 DNase-처리 RNA)에서는 NCX2 발현이 관찰되지 않았고, NCX2의 발현은 뇌와 척수에 한정되어 발현되었다(도 2의 A). 상기 결과를 통해 이전의 연구에서는 NCX2가 골격근에 발현된다고 하고 있으나 이와는 다른 결과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

또한, NCX2가 골격근에서 mRNA의 발현이 관찰되지 않음을 확인하여 이를 좀더 명확하게 확인하기 위해 새끼 쥐 및 어른 쥐의 뇌 및 골격근(뒷다리의 윗대퇴부)에서 전체 단백질을 분리한 뒤 상기 실시예 <1-6-3>에 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

그 결과, NCX2 단백질의 발현은 CNS, 뇌 및 척수에만 제한되어 있었다(도 2의 B). 상기 RT-PCR 및 웨스턴 블랏 분석을 통해 NCX2는 골격근에서 발현되지 않음을 알 수 있다.

<실시예 3> Cre 리컴비나제의 발현 분석

NCX2 단백질에 대한 항혈청이 존재하지 않기 때문에 NCX2 결손 변이 생쥐가 NCX2 단백질이 발현하지 않음을 확실히 확인하기 힘들기 때문에 NCX2 유전자를 결손시키기위해 제조한 적중벡터에 존재하는 Cre 리컴비나제의 발현을 분석함으로써 NCX2 단백질이 존재하지 않는 여부를 확인하였다. 구체적으로, Cre 리컴비나제의 전사체를 확인하기 위하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 전체 RNA(20 ㎍)는 뇌로부터 TRIzol 시약(Gibco)을 가지고 분리하였고, 이를 포름알데히드가 포함된 1% 아가로스 젤에서 전기영동한 후 10X SSC에서 나일론 막으로 20시간 동안 트랜스퍼하였다. UV 크로스링크 후, pxCANCre 유래의 [α³²P]dCTP-표지 1060 bp PacI/NotI-분해 절편으로 65℃에서 20시간 동안 상기 나일론 막을 혼성화하였다. 상기 막은 상온에 2X SSC, 1% SDS로 10분 동안 세척하고, 0.2X SSC, 1% SDS로 65℃에서 15분간 2회 세척한 후 자기방사법을 수행하였다.

그 결과, 약 1.65 kb의 Cre 리컴비나제 전사체가 이형접합체 및 동형접합체 유전자변이 생쥐에서 관찰되었으나, 정상 생쥐에서는 관찰되지 않았다(도 2의 C). 따라서, NCX2가 결실되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 NCX2 유전자변이 생쥐에서 Cre 리컴비나제 전사체가 발현됨을 상기에서 확인한 후 NCX2가 뇌의 어느 부위에서 발현되는지의 여부를 확인하기 위해 NCX2 이형접합체 유전자변이 생쥐를 CAG-CAT-Z 리포터 생쥐와 교배시켜 CAG-CAT-Z 리포터 유전자 및 NCX2^+/- 유전형을 나타내는 생쥐를 선별한후 뇌를 X-gal 염색하였다. 구체적으로, NCX2 이형접합체 유전자변이 생쥐를 CAG-CAT-Z 리포터 생쥐(Sakai and Miyazaki, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:318-324)와 교배시켜 CAG-CAT-Z 리포터 유전자 및 NCX2^+/- 유전형을 나타내는 생쥐를 선별하였다. 상기 선별된 생쥐의 뇌(NCX2^+/--CAG-Δ-Z)를 3.7% 포름알데히드가 포함된 0.05 M 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 고정하여 절단하고(50-70 ㎛), PBS(phosphate buffered saline)로 3번 세척하고, LacZ 염색 용액(0.05 M phosphage buffer, 5 mM K₃Fe(CN)₆, 5 mM K₄Fe(CN)₆, 2 mM MgCl₂, 1 ㎎/㎖ X-gal)로 37℃에서 하룻밤 동안 정치하였다(Sakai and Miyazaki, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 237, 318-324). 양성 대조군(CAG-CAT-Z/CAG-Cre) 및 음성 대조군(CAG-CAT-Z)을 사용하여 X-gal 염색의 신빙성을 조사하였다.

그 결과, NCX2^+/-/CAG-CAT-Z 생쥐는 강한 X-gal 염색을 나타내고(이는 NCX2-Cre-매개 재조합을 나타낸다), 이는 NCX2-Cre가 기능적 단백질이라는 것을 제시하고(도 2의 D), NCX2는 모든 뇌 부위에 분포되어 있고, 해마(CA1, CA2, CA3, DG), 소뇌(과립, 프루킨예) 및 대뇌피질에서 강하게 염색이 되었다.

<실시예 4> 전체 원형질막에서의 NCX 전류의 분석

본 발명자들은 NCX2 전류(I _ncx)의 상실을 측정하기 위해 전방 교환 전류(Ca²⁺는 나가고, Na⁺는 들어옴)를 전체-세포 비쥬얼 패치-클램프 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 2-3주된 생쥐의 해마 절편(250 ㎛)을 사용하여 실험을 수행하였으며, 전체-세포 비쥬얼 패치-클램프 레코딩은 피에로 등의 방법(Fierro et al., 1998, J. Physiol. 510:499-512)을 변형하여 수행하였다. 세포는 전체-세포 전극(3-5 M, series resistance < 20 M)을 사용하여 -40 mV에서 전압 클램프하였다. 피펫에는 CsOH로 pH를 7.4로 맞추어 제조한 용액(3 mM NaCl, 114 mM CsCl, 9 mM EGTA, 9 mM HEPES, 1.8 mM MgCl₂, 4 mM MgATP, 0.3 mM Tris-GTP, 5.4 mM CaCl₂(상온에서 100 nM의 자유 Ca²⁺을 측정하기 위해 H₂CaEGTA를 추가로 첨가))을 채워 넣었다. Na⁺ /K⁺ 펌프 및 K⁺-의존 NCX(NCKX)의 활성에 의한 오염(Tsoi et al., 1998, J Biol Chem, 273, 4155-4162)을 막기 위하여 K⁺-없는 외부용액에 있는 TEA-Cl을 사용하였다. 상기 실험은 상온에서 EPC-9 증폭기 및 Pulse/Pulsefit 소프트웨어(HEKA, Germany)를 사용하여 수행하였다. 또한, 신호는 디지털 데이터 레코더(VR-10B Instrutech digital data recorder, Elmont,NY)를 사용하여 챠트 레코드(Gould, Cleveland, OH) 및 비디오 카세트 기록 테이프에 기록하였다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로 표현하였다. 절편당 한 실험을 수행하였고, 모든 약물은 살포 배지에 적용하였다. 모든 용액에는 5 mM TEA(tetraethylammonium chloride), 1 μM TTX(tetrodotoxin) 및 10 μM 비큐큘린(bicucullin)을 첨가하여 사용하였다.

그 결과, Incx는 124 mM Na⁺를 포함하고 있는 용액을 Li⁺ 외부 용액으로 치환함에 따라 활성화되었다. 유전자 변이 생쥐에서의 전류의 증폭된 피크는 야생형에 비해 약 50% 감소하였다(정상(+/+): -193.39±21.86 pA, n=8; 유전자변이(-/-): -84.45±13.19 pA, n=6, 스튜던트 t-테스트, p<0.01)(도 3의 A). 따라서, 다른 NCX 이소형태는 잔류 전류를 공급하는데 반해 NCX2는 CA1 추상(pyrimidal) 뉴런에 있는 Incx에 영향을 줌을 알 수 있다.

<실시예 5> 세포내 Ca ²⁺ 측정

본 발명자들은 유전자변이 생쥐의 해마 절편 뉴런에서의 감소된 Incx가 [Ca²⁺]_i의 항상성에 미치는 영향을 분석하기 위해 세포내 Ca²⁺ 이미지 분석을 하였다. 구체적으로, 2-3주된 생쥐로부터 해마 절편(400 μM)을 얻은 후 ACSF(124 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 26 mM NaHCO₃ 및 10 mM glucose, pH 7.4, Sigma 제품)에 1시간 동안 정치하고, 0.1% 파파인(Roche)을 포함하는 뉴로베이살-A 배지(Neurobasal-A medium, GibcoBRL, Grand Island, NY, USA)에 32℃에서 30분 동안 효소처리하였다. CA1 추상 부위를 절단하고, 화염 살균한 파스테르 피펫으로 5회 분쇄하고, 폴리-L-라이신 코팅된 커버슬립에 플레이트하였다. 세포내 Ca²⁺는 세포체 내에서의 세포내 Ca²⁺ 표지인자인 퓨라-2 아세톡시메틸 에스터(Fura-2/AM)(Molecular Probes로부터 구입)를 사용하여 측정하였다(Kim et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun, 296, 247-254). CA1 뉴런은 60분동안 배양하면서 HEPES 버퍼(125 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl₂, 10 mM glucose 및 1.3 mM MgSO₄)로 3회 세척하였다. 그후 250 μM 글루타메이트를 10초 동안 처리한 후 나머지 4 내지 5분 동안 [Ca²⁺]_i의 감소를 모니터 하였다. 상기 실험은 각각 3회 수행하였다.

그 결과, 글루타메이트는 기존에 보고된 바와 같이(Kim et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun, 296, 247-254), [Ca²⁺]_i가 초기에는 빨리 증가하다가 서서히 기저(basal) 레벨로 회복되는 현상을 보였다(도 3의 B). 글루타메이트로 활성화시키고 난 뒤의 정상(n=16, 4 생쥐) 및 유전자변이 세포(n=17, 4 생쥐) 사이의 [Ca²⁺]_i의 기저 수준(정상(+/+): 80.4±3.23 nM; 유전자변이(-/-): 80.9±4.24 nM) 및 피크값(정상(+/+): 330.67±19.54 nM; 유전자변이(-/-): 307.57±30.19 nM)에서는 별다른 변화가 없었다. 그러나, 글루타메이트를 제거하고 난 뒤의 [Ca²⁺]_i의 기저 수준으로의 회복은 정상 생쥐에 비해 매우 느렸다(도 3의 C). 감소 상수(decay constant, τ)는 상기 결과를 단일 지수곡선에 맞춤으로써 얻었으며, 그 값은 야생형 세포(τ=9.96±1.14 s)에 비해 유전자변이 세포(τ=26.25±6.21 s)에서 약 40% 정도 높았다. 상기 결과를 통해 NCX2는 다른 세포에서 확인된 바와 같이(Ranciat-McComb et al., 2000, Neurosci. Lett;, 294, 13-16; Tang et al., 2000, J Neurochem, 74, 702-710; Domotor et al., 1999, J Physiol, 515, 147-155; Fierro et al., 1998, J Physiol., 510, 499-512; Sanchez-Armass and Blaustein, 1987, Am. J. Physiol., 252, C595-603), 해마 추상 뉴런에서 탈분극 후에 기저선 Ca²⁺ 수준을 회복하는 역할을 함을 알 수 있다.

<실시예 6> NCX2 유전자변이 생쥐에서의 기저 시냅스 전달

NCX2 유전자변이 생쥐에서 기저 시냅스 기능이 정상인지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 샤퍼 측지/교련 섬유(Schaffer collateral/commissural fibers)의 자극에 반응하여 해마의 CA1 부위로부터 fEPSPs(field excitatory postsynatic potentials)를 분석하였다. 구체적으로 7-8주된 생쥐의 해마 절편을 산소 처리된 차가운 인공 중추신경계 용액(ACSF)(124 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 1.3 mM MgSO₄, 26 mM NaHCO₃ 및 10 mM glucose, pH 7.4)에 준비하였다. 절편은 따뜻하고 습기있는(32℃, 95% O₂/5% CO₂) 레코딩 챔버에서 공기와 ACSF 사이 표면에 1.5 시간 동안 두었다. 양극 자극 전극을 CA1 부위의 층 라디아튬(stratum radiatum)에 놓고, 세포외 필드 포텐셜은 글래스 마이크로전극(borosilicate glass, 3-5 메가저항, 3M NaCl)을 사용하여 층 라디아튬에서 측정하였다(Jun et al., 1998, Learn Mem, 5, 317-330). 테스트 반응은 0.033 Hz에서 알아내었다.

그 결과, 주어진 전시냅스 파이버 발리(volley)에 의해 유도되는 fEPSP의 기울기가 정상 및 유전자변이 생쥐 사이에서 다르지 않았다(도 4의 A, B 및 C).

또한, AMPA 수용체 저해제인 CNQX를 10 μM 농도로 ACSF 용액에 첨가하여 Mg²⁺를 농도가 0.1 mM 농도로 줄이도록 함으로써 NMDA 수용체에 의해 매개되는 fEPSPs를 측정하였다. 그 결과, 정상 생쥐 및 유전자변이 생쥐에서의 NMDA 수용체에 의해 매개되는 fEPSPs는 별다른 차이를 보이지 않았다(도 4의 D).

따라서, 상기 결과를 통해 NCX2 유전자변이는 기저 시냅스 작용의 역할에 큰 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

<실시예 7> NCX2 유전자변이 생쥐에서 단기 적응성의 변화

Ca²⁺은 시냅스 전달을 조절하는데 관여한다고 알려져 있기 때문에 본 발명자들은 NCX2 유전자변이가 시냅스전의 두가지 단기 적응성(short-term plasticity, STP)에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 처음으로 PPF(paired-pulse facilitation)를 측정하여 두 밀접-공간 자극에 의해 분비되는 신경전달물질(neurotransmitter)의 잠재적인 상승을 분석하였다. 이러한 분비의 증가는 최초 자극에 따른 시냅스전 말단에 잔존하는 Ca²⁺에 의한 것이었다(Regher et al., 1994, J Neurosci, 14, 523-537). NCX2 유전자변이 생쥐 뉴런에서의 Ca²⁺가 지연되게 제거되는 것을 통해 PPF는 100 ms이하 간격의 인터펄스(30 ms 간격에서 p<0.001; 50 ms 간격에서 p<0.01; 70 ms 간격에서 p<0.01, 스튜던트 t-테스트)에서는 정상 생쥐에 비해 유전자변이 생쥐에서 훨씬 증가함을 알 수 있었다(도 4의 D).

시냅스전 단기 적응성의 두 번째 측정으로 PTP(posttetanic potentiation), 즉 고진동경련(high frequency tetanus, 100 Hz, 1 sec)에 의해 생기는 전시냅스 적응성의 단기 형태를 측정하였다. NMDA 수용체를 차단하기 위한 D-AP5(50 μM)의 존재하에서, 단일 100 Hz 경련 자극은 3분내로 기저선까지 저하시키는 전달의 촉진(EPSP)을 일으켰다. 또한, 유전자변이(-/-: 218.3±11.3%, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)는 정상(+/+: 157.1±8.4%, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)보다 촉진된 높은 PTP 피크를 보여주었다(도 4의 E). 상기 결과를 통해 두가지 형태의 시냅스전 단기간 적응성은 NCX2 유전자변이 생쥐에서 증가함을 할 수 있었다.

<실시예 8> 장기 적응성의 변화 분석

단기 적응성이 NCX2 유전자변이 생쥐에서 변하였기 때문에, LTP(long-term potention) 및 LTD(long-term depression)도 영향을 받을 수 있는 가능성이 있어 장기 적응성을 분석하기 위해 0.5-100 Hz 범위에서 양방향 시냅스 적응성을 분석하였다. 구체적으로, LTP 실험을 위하여 기저 자극은 최대 유발 반응의 약 40%에 해당하는 반응을 유발하는 세기로 하였다. LTD를 위해서는 3-4 주된 생쥐를 사용하였다. 시냅스 인풋-아웃풋 커브는 fEPSP 기울기 및 이에 해당하는 파이버 발리 사이즈를 그래프로 계산하여 만들어졌다. PPF는 30, 50, 70, 100, 200 및 500 msec의 펄스간 간격으로 테스트하였다. 몇몇 실험에서, 10 μM CNQX를 사용하여 AMPA/카이아네이트(kainate) 수용체를 봉쇄한 후 NMDA 수용체-매개 EPSP를 측정하였다. 이러한 실험에 사용된 Mg²⁺ 농도는 0.1 mM 이고, 잔여 EPSPs는 50 μM D-AP5에 의해 완전히 봉쇄하여 NMDA-수용체-매개 반응을 측정하였다. 각기 다른 강도의 자극은 파이버 발리 및 NMDA 수용체-매개 EPSP 기울기 플럿을 만드는데 사용하였다. PTP 테스트에서, NMDA 수용체 길항체(D-AP5, 50 μM)로 100 Hz의 단일 자극을 1초 동안 가하였다. 약물은 적어도 30분전에 살포 배지에 적용하였다. 데이터는 평균 ±SEM으로 나타내었다.

그 결과, 100 Hz에서 단일 주입은 50분에서 정상(+/+: 기저선의 143±5.1%, n=9, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에 비하여 유전자변이(-/-: 기저선의 253.5±8.2%, n=12, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에서 매우 증가된 LTP를 나타내었다(도 5의 A). 또한, 50 Hz에서 주입은 50분에서 강건한 시냅스 강화가 유전자변이 생쥐에서 나타났고, 50분에서 정상(+/+: 기저선의 124.3±15.2%, n=13, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에 비하여 유전자변이(-/-: 기저선의 220.1±25.1%, n=11, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)는 적응성의 감소가 없었다(도 5의 B). 게다가, 10 Hz 자극을 주었을 때 50분에서는 유전자변이 생쥐에서 증가된 LTP가 관찰된 반면 정상 생쥐에서는 약한 수준의 시냅스 적응성이 나타났다(정상(+/+): 기저선의 117.2±6.0%, n=1; 유전자변이(-/-): 158.2±5.6%, n=12, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)(도 5의 C).

다음으로, 낮은 진동자극(LFS, 3-4 주 생쥐로부터)에 의해 유도된 LTD를 측정하였다. 비어와 아브라함이 밝힌바와 같이(Bear and Abraham, 1996, Annu Rev Neurosci,19, 437-462), LFS는 성인에서 LTD를 유발하지 않기 때문에 3 내지 4주된 생쥐를 이용하여 LTD 분석에 사용하였다. 그 결과, 1 Hz(15 min, 900 펄스)에서 자극은 정상(+/+: 50분에서 기저선의 81.5±78.5%, n=9, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에서 강하(저하)를 유도하나, 유전자변이(-/-: 50분에서 기저선의 124.1±6.6%, n=12, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에서 시냅스 저하를 유도하지 않았다(도 5의 D). 그러나, 유전자변이 생쥐에서는 시간이 지남에 따라 시냅스 반응이 서서히 증가하였다.

마지막으로, 0.5 Hz(30 min, 900 펄스)에 의해 유도된 LTD를 측정하였다. 그 결과, 상기 1 Hz에서의 결과와 동일하게 유전자변이(-/-: 50분에서 기저선의 122.7±9.8%, n=12, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에서는 정상(+/+: 50분에서 기저선의 72.5±5.4%, n=9, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에 비해 LTD가 생성되지 않았다(도 5의 E). 그러나, 0.2 Hz에 의해 유도된 LTD 측정 결과에서는 정상(+/+: 120분에서 기저선의 95.1±4.5%, n=6, p<0.01, 스튜던트 t-테스트)에 비교하였을때 유전자변이(-/-: 120분에서 기저선의 76.7±6.1%, n=7, p<0.001, 스튜던트 t-테스트)에서는 완벽하게 LTD(clear LTD)를 유발하였다(도 5의 F).

상기에서 살펴본 바와 같이, NCX2 유전자변이 생쥐의 뉴런에서는 자극후에도 높은 농도의 [Ca²⁺]_i가 상당한 시간동안 지연되어 존재함을 알 수 있다. 유전자변이 생쥐 절편에서 1 Hz 자극에서의 LTD 억제는 지연된 Ca²⁺의 제거로 인한 [Ca²⁺]_i 의 높은 농도 때문이다.

<실시예 9> NCX 유전자변이 생쥐에서 증가된 공간 학습 및 기억

NCX 유전자변이 생쥐에서 증가된 LTP가 공간 학습 및 기억을 증가시킬 수 있는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 우선 모리스 물 미로(Morris water maze) 테스트를 수행하였다. 이 방법은 먼 거리의 자극 및 숨겨진 탈출 플랫폼 사이의 관계를 학습하고 기억하는 동물의 능력에 의존하는 해마-의존적 수행방법이다(Morris et al., 1982, Nature, 297, 701-708). 구체적으로, 모리스 물 미로 실험을 위하여 8-12주된 생쥐를 사용하였다. 물 미로 기구는 24-26℃의 물을 포함하는 원형 풀(흰색 플라스틱, 직경 120 ㎝, 높이 93 ㎝)로 구성되어 있고, 비독성-수용성 페인트를 사용하여 불투명하게 하였다. 풀은 방(2.5 x 2.5 m)의 방의 가운데에 위치하였고, 여기서 4개의 다른 먼 부위의 큐(ques)를 4개의 벽에 걸고, 풀에서 충분히 보일 수 있도록 하였다. 그룹 1은 7 기간(4회 시도/기간/일) 동안 숨겨진 플랫폼(직경 10 ㎝의 원, 물 밑 1 ㎝에 정도 가라앉게 위치함)을 찾도록 훈련시키고, 그룹 2는 같은 시도로 4기간 동안 훈련시켰다. 생쥐는 무작위로 벽을 보게 하였고, 60초 동안 플랫폼을 찾도록 하고, 플랫폼에서 30초 동안 쉬게 하였다. 만일 생쥐가 60초 내에 플랫폼을 찾지 못하면, 이를 중단하고, 플랫폼에 30초 동안 두었다. 3개의 전달 테스트를 수행하였다. 1차는 3차 기간의 끝에서 그룹 1 및 그룹 2에 주었고, 2차는 마지막 기간의 끝에서 그룹 1에 주었고, 3차는 4 기간에서 2 주 후에 그룹 2에 주었다. 전달 테스트 동안 플랫폼을 없애고, 생쥐를 60초 동안 풀에서 수영할 수 있게 하였다. 생쥐는 트랙커 유니트에 연결된 적외선-민감 카메라(Advanced VP 2000)에 의해 자취를 조사하였다. 자취 위치는 저장하고 소프트웨어(HVS Water for windows software, HVS IMAGE Ltd)에 의해 수집하였다. 4분면에서 소요된 시간과, 플랫폼의 교차횟수를 분석하였다.

비쥬얼 플랫폼 과업에서, 다른 생쥐(그룹 3)를 사용하였고, 동일한 물 미로를 사용하여 숨김 플랫폼 과업을 하였고, 다음 두 가지가 다르다. 3번의 시도/기간/일; 플랫폼은 검은색이고, 매 시도마다 옮겼다.

본 발명자들은 3가지 그룹을 사용하였다. 그룹 1 생쥐는 획득을 위하여 1일부터 4일까지 연습시키고, 그룹 2 생쥐는 장기 기억 저장을 위하여 1일부터 4일까지 연습시키고, 그룹 3 생쥐는 눈에 띄는 테스트를 위하여 연습시켰다.

그 결과, 획득(acquisition) 동안에, 정상(n=12) 및 유전자변이 생쥐(n=13)는 연습기간 동안 플랫폼 위치의 학습 효과를 나타내는 탈출 잠재(F[6, 138]=30.29, p<0.0001, 양방향 반복된 ANOVA)가 줄어드는 것으로 나타났다(도 6의 A). 그러나, 유전자변이 생쥐는 연습기간 동안에 현저히 낮은 탈출 잠재를 보였고, 이는 유전자변이 생쥐의 공간 학습이 정상 생쥐(F[1, 23]=7.67, p<0.01, 양방향 반복된 ANOVA)보다 빠름을 알 수 있었다. 또한, Scheffe's 테스트(post hoc test)를 통해 2일(p<0.05), 3일(p<0.05) 및 5일(p<0.05)의 기간에서의 두 개의 유전자형 사이에는 상당히 큰 차이가 있음을 알 수 있었다. 게다가, 유전자변이 생쥐에서 증가된 공간 학습은 3일 후에 수행된 1차 전달 테스트에서 명백하였다(도 6의 D 및 도 6의 E). 이러한 테스트에서, 정상 생쥐 및 유전자변이 생쥐 모두는 타겟 사분면에서 다른 사분면(F[3, 69]=31.99, p<0.0001, 양방향 반복된 ANOVA)에 비해 더 많은 시간을 소비하였고(도 6의 D), 갈림길 위치(F[3, 69]=17.43, p<0.0001, 양방향 반복된 ANOVA)에 비해 지나가는 위치가 훨씬 더 자주 존재하였다. 그러나, 유전자변이 생쥐는 정상 생쥐(스튜던트 t-테스트, p<0.05)에 비해 타겟 사분면에서 훨씬 더 많은 시간을 소비하였으며(도 6의 D), 플랫폼을 지나가는 횟수의 측정을 통해 플랫폼 위치에 대해 더욱 정확한 기억을 나타냄을 알 수 있었다(도 6의 E). 7일 연습기간 후 수행된 2차 전달 테스트에서, 정상 및 유전자변이 생쥐는 타겟 사분면에 대하여 강력한 선호도를 나타내었다(도 6의 F 및 도 6의 G).

다음으로, 유전자변이 생쥐가 몇 번의 연습에서 오랜 기억을 나타내는지 알아보았다. 그룹 2 생쥐를 4일 동안 연습시키고, 이때 탈출 잠재는 정상 및 유전자변이에서 동일하였고, 3차 전달 테스트는 2주 후에 수행하였다. 그 결과, 정상 생쥐(n=11) 및 유전자변이 생쥐(n=10)에서의 탈출 잠재에는 차이가 없었다(도 6의 C).

상기 결과로부터 비-결합 인자가 물 미로 과업에서 공간 학습 및 기억에 영향을 줄 것이라는 가능성을 배제할 수 있었다.

<실시예 10> 공포 조건에서의 분석

기억이 다른 행동 과업에도 증가시키는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 해마 및 소뇌편도의 작용에 의해 일어난다고 알려져 있는(Phillips and LeDoux, 1992, Behav. Neurosci. 106:274-285) 상황 의존적 공포 조건을 분석하였다. 동물은 싫어하는 비조건 자극(US)과 짝을 이룬 상태와 같은, 온화한 전기 발 쇼크와 같은 새로운 환경 또는 조건 자극(CS)에 공포를 학습한다. 부동 및 움츠림으로 특징되는 조건 부동 반응은 조건 자극의 뒤이은 표출에서 관찰된다. 설치류에서 해마의 병변은 2가지 공포 조건의 형태로 한정되고, 그중 하나는 해마 병변에 민감한 비특이적인 신호(챔버의 상황)이고, 다른 하나는 해마 병변에 민감하지 않은 특정 신호(상태)이다. 상황 조건은 해마에 의존하나, 신호 조건은 소뇌편도를 필요로 한다.

스테인레스 철 막대 바닥(직경 5 ㎜, 1 ㎝ 공간을 띄움)을 포함하는 공포 조절 쇼크 챔버(19 X 20 X 33 ㎝) 및 활성 모니터를 사용하였다(WinLinc Behavioral Experimental control sofeware, coulbourn Instruments). 상황(contextual) 및 신호(cued) 공포를 주기 위하여, 동물(8-12 주된 생쥐)을 공포 조건 기구 챔버에 2분 동안 놓고, 20초 동안 청각 조건 자극(CS, white noise)을 주었다. 톤의 마지막 2초 동안 조절되지 않은 자극(US)으로 0.5 mA 쇼크를 바닥 그리드에 적용하였다. 상기 프로토콜은 한번 수행하였다. 자극 강도 및 훈련 짝의 횟수는 학습을 최적화하기 위하여 파일럿 실험의 기초에서 선택되었다. 전후관계 학습을 평가하기 위하여, 동물을 훈련 후 훈련 전후관계에 24시간 두었고, 5분 동안 부동을 측정하였다. 암시된 학습을 평가하기 위하여, 동물을 훈련 후에 다른 전후관계(새로운 챔버, 냄새, 바닥 및 비쥬얼 암시)에 24시간 두었다. 상기 테스트의 마지막 3분 동안 동물은 톤에 노출시켰다. 공포 반응은 동물이 부동 반응을 보이는 시간의 길이를 스톱워치로 측정함으로써 분석하였다. 기저 행동은 새로운 전후관계에서 6분동안 측정하였고, 다음으로 음향 CS를 1분 도안 주었다. 양쪽 상황 조건 및 신호 조건은 쇼크 챔버에서 한번의 CS/US 연습 후 24시간에서 활동에 의해 측정되었다.

그 결과, 우선 상황 공포 조건은 정상(n=12) 및 유전자변이 생쥐(n=12)는 연습 전 및 후에 움직임의 수준은 비슷한 것으로 나타났다(도 7의 A). 24시간 후에 생쥐를 같은 쇼크 챔버로 돌려보내어 관찰한 결과, 정상 및 유전자변이 생쥐 모두 공포 반응을 보였지만 유전자변이 생쥐는 챔버에서 급격한 활동의 감소를 나타냈고, 이는 정상 생쥐(F[1, 22]=15.37, p<0.0001, 양방향 반복된 ANOVA)에 비하여 상황 공포 반응에 대한 증가된 장기 기억을 나타내었다.

또한, Scheffe's 테스트(post hoc test)를 통한 상황 공포 분석 결과 첫 번째(p<0.001), 두 번째(p<0.01), 세 번째(p<0.05) 및 다섯 번째(p<0.05)분 동안에 두가지 유전자형 사이에 큰 차이를 보였다(도 7의 B). 반면, 신호 공포 분석에서는 정상(n=12) 및 유전자변이(n=12) 생쥐 사이에서 반응의 차이가 없어(도 7의 C) NCX2 유전자변이 생쥐에서의 증가된 기억력이 해마 의존적인 공포 상황에만 의존함을 알 수 있었다.

<실시예 11> 사물 인지 기억의 분석

해마의 작용에 의해 친숙한 것과 새로운 것 사이를 구별하는 것(Vnek and Rothblat, 1996, J Nerurosci, 16, 2780-2787)에 기초하여 새로운 사물을 인지하는 능력을 테스트하였다(Mansuy et al., 1998, Cell, 92, 39-49; Tang et al., 1999, Nature, 401, 63-69; Podhorna and Brown, 2002, Genes, Brain and Behavior, 1, 96-110). 구체적으로, 31마리의 동물(정상(+/+): 1시간, n=6; (+/+): 24시간, n=9; 유전자변이(-/-): 1시간, n=7; (-/-): 24시간, n=9)을 각각 3일 동안 열린 상자(40×40×40 ㎝)에서 훈련시켰다. 훈련기간 동안 상자안에 두 개의 사물을 5분동안 놓아두어 동물이 볼 수 있게 했다. 생쥐가 1 인치 이내의 거리에서 머리를 사물로 향하고 있을때에 사물을 인지하는 것으로 판단하였다. 뒤따르는 1시간 또는 24시간의 머무름(retention) 간격 후에 상자속에 같은 위치에 두 개의 사물을 놓아두는데 한 개의 친숙한 사물은 새로운 사물로 바꾸어 5분 동안 놓아두어 동물이 볼 수 있도록 하였다. 두가지 사물중 어느 한 사물을 인지하거나 새로운 한가지 사물을 인지하는데 걸리는 총 시간을 측정하여 인지 기억을 분석하는데 사용하였다.

그 결과, 정상(n=15) 및 유전자변이(n=16) 생쥐 사이에서의 두가지 사물을 인지하는 시간에는 차이가 없었다(도 7의 D 왼쪽). 1시간의 머무름 간격에서는 정상(n=6) 및 유전자변이(n=7) 생쥐 모두 친숙한 사물에 비해 새로운 사물에 대해 훨씬 더 반응하였지만(F[1, 11]=14.55, p<0.01, 양방향 반복된 ANOVA), 정상 및 유전자변이 생쥐 사이에는 차이가 없었다(F[1, 11]=0.01, p=0.96, 양방향 반복된 ANOVA). 그러나, 24시간의 머무름 간격에서는 유전자변이(n=9) 생쥐가 정상(n=9) 생쥐에 비해 새로운 사물에 대해 훨씬 더 반응하였기 때문에(F[1, 16]=16.48, p<0.001, 양방향 반복된 ANOVA, Scheffe's post hoc test, p<0.01) 유전자변이 생쥐는 사물을 인식하는 기억 수행을 훨씬 더 향상되게 수행할 수 있음을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 NCX2 유전자가 적중된 유전자변이 생쥐를 제조하고 이 생쥐를 이용하여 실험한 결과 NCX2의 활성이 억제되면 Ca²⁺ 제거가 지연되고, 많은 신경전달 물질이 분비되며 LTP를 유도하고 유지시켜 학습능력 및 기억력이 향상됨을 확인하였다. 즉, NCX2가 전- 및 후시냅스에서 증가된 [Ca²⁺]i의 감쇄를 조절하여 [Ca²⁺]i를 유지하여 시냅스 적응성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있고, NCX2 유전자변이는 해마-의존적 학습 및 기억에 영향을 주게된다. 따라서, NCX2 유전자 또는 그의 단백질은 학습 및 기억을 조절하는 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 A는 정상 NCX2 유전자좌, 적중 벡터 및 게놈상에서 파괴된 유전자좌를 나타낸 모식도이고,

■ : 적중 엑손(순서대로 엑손 1 및 엑손 2),

→ : PCR 프라이머의 위치,

정상 NCX2 유전자좌에서 밑줄 : 서던 블럿을 위한 NCX2 프로브,

NLS : 핵 국한 서열(nuclear localization sequence),

Cre : cre 리컴비나제(cre recombinase),

Neo : NEO 카세트, TK : TK 카세트,

B : BamHI, E : EcoRI, H : HindIII, N : NcoI, P : PstI, X : Xho I,

도 1의 B는 유전자 타이핑을 위하여 정상, NCX2+/- 및 NCX2-/- 생쥐의 꼬리 게놈 DNA를 이용하여 서던 블럿(위) 및 PCR 분석(아래)을 수행한 사진이고,

+/+ : 정상 생쥐, +/- : NCX2 +/- 생쥐, -/- : NCX2 -/- 생쥐,

도 1의 C는 NCX2 단백질의 발현을 알아보기 위하여, 정상, NCX2+/- 및 NCX2-/- 생쥐의 전체 뇌의 막 분획을 웨스턴 블럿 분석한 사진이고,

+/+ : 정상 생쥐, +/- : NCX2 +/- 생쥐, -/- : NCX2 -/- 생쥐,

도 1의 D는 정상 생쥐(좌측, +/+) 및 NCX2 유전자변이 생쥐(우측, -/-)의 뇌에 있는 해마를 형태학적으로 관찰한 사진이고,

도 2의 A는 정상 생쥐의 뇌 및 골격근으로부터 RNA를 추출하여 NCX2 발현을 RT-PCR 분석한 사진이고,

M : 마커, 레인 1: 대조군(물),

레인 2: 1일된 새끼 생쥐의 골격근에서 추출한 DNase 처리한 RNA,

레인 3: 6주된 생쥐의 골격근에서 추출한 DNase 처리한 RNA,

레인 4: 1일된 새끼 생쥐의 뇌에서 추출한 DNase 처리한 RNA,

레인 5: 6주된 생쥐의 뇌에서 추출한 DNase 처리한 RNA,

레인 6: 1일된 새끼 생쥐의 골격근의 cDNA,

레인 7: 6주된 생쥐 골격근의 cDNA, 레인 8: 1일된 새끼 생쥐 뇌의 cDNA,

레인 9: 3주된 생쥐 뇌의 cDNA, 레인 10: 6주된 생쥐 뇌의 cDNA,

레인 11: 게놈 DNA,

도 2의 B는 5주된 정상 생쥐의 각 기관의 막 분획을 웨스턴 블럿으로 분석한 사진이고,

레인 1: 척수, 레인 2: 심장, 레인 3: 뇌, 레인 4: 폐, 레인 5: 간,

레인 6: 신장, 레인 7: 췌장, 레인 8: 비장, 레인 9: 골격근

도 2의 C는 정상 생쥐, NCX2 +/- 생쥐, NCX2 -/- 생쥐에서 Cre 리컴비나제의 발현을 노던 블럿으로 분석한 사진이고,

+/+ : 정상 생쥐, +/- : NCX2 +/- 생쥐, -/- : NCX2 -/- 생쥐,

← : Cre 리컴비나제 RNA,

도 2의 D는 NCX2^+/-/CAG-CAT-Z 생쥐의 뇌 정중단면을 X-gal로 염색한 사진이고,

삽입 그림 : 소뇌의 단면(40×확대),

도 3의 A(윗 그림)는 Li⁺ 포함 용액에서 Na⁺ 포함 용액으로 변경하였을 때 앞으로 나가는 교환 전류를 활성화하는 것을 나타낸 그래프,

+/+ : 정상 생쥐, -/- : NCX2 -/- 생쥐,

도 3의 A(아랫 그림)는 정상(8 절편, 5 생쥐) 및 유전자변이 생쥐(6 절편, 4 생쥐)에서 -40 mV의 홀딩 포텐셜에 전류 크기를 나타낸 그래프이고,

도 3의 B는 정상 생쥐(선:+/+) 및 유전자변이 생쥐(점선:-/-)에서 글루타메이트에 의해 유도된 [Ca²⁺]_i의 증가를 나타낸 그래프이고,

스케일 바(_) : 글루타메이트를 10 초동안 처리,

도 3의 C는 정상 생쥐(16 세포, 4 생쥐) 및 유전자변이 생쥐(17 세포, 4 생쥐)에서 글루타메이트-유도 [Ca²⁺]_i 변화의 동력학을 나타낸 그래프이고,

도 4의 A는 자극 유도 및 이에 따른 fEPSP 기울기 사이의 시냅스 전달의 인풋-아웃풋 그래프이고,

도 4의 B는 주어진 시냅스전 섬유 발리(volley)에 의한 fEPSPs를 나타낸 그래프이고,

도 4의 C는 유도 장력 및 시냅스전 섬유 발리 증폭도 사이의 시냅스 전달을 나타낸 그래프이고,

도 4의 D는 CNQX(10 μM)와 적은 Mg²⁺(0.1mM)의 존재하에서 NMDA 수용체에 의해 유도된 시냅스 포텐셜을 나타낸 그래프이고,

도 4의 E는 정상 생쥐 및 돌연변이 생쥐에서 50 ms 인터벌 interpulse에서의 PPF를 나타낸 그래프이고(스케일바: 1 mV, 10 ms),

도 4의 F는 정상 생쥐 및 돌연변이 생쥐에 50 μM D-AP5로 수행한 PTP를 나타낸 그래프이고,

(상기 도 4에서 ●: 정상 생쥐(+/+), ○: NCX2 -/- 생쥐)

도 5의 A는 유전자변이 생쥐(12 절편, 10 생쥐) 및 정상 생쥐(9 절편, 8 생쥐)에서 100 Hz에 1초 동안 한번의 자극에 대한 반응을 나타난 LTP를 나타낸 그래프이고,

도 5의 B는 유전자변이 생쥐(11 절편, 5 생쥐) 및 정상 생쥐(13 절편, 7 생쥐)에서 단일, 2초, 50 Hz에 의해 나타난 LTP를 나타낸 그래프이고,

도 5의 C는 유전자변이 생쥐(12 절편, 7 생쥐) 및 정상 생쥐(10 절편, 7 생쥐)에서 단일, 1.5분, 10 Hz에 의해 나타난 LTP를 나타낸 그래프이고,

도 5의 D는 유전자변이 생쥐(12 절편, 10 생쥐) 및 정상 생쥐(9 절편, 8 생쥐)에서 단일, 15분, 1 Hz에 의해 나타난 LTD를 나타낸 그래프이고,

●: 정상 생쥐(+/+), ○: NCX2 -/- 생쥐,

△: 2 μM D-AP5를 처리한 NCX2 -/- 생쥐

도 5의 E는 유전자변이 생쥐(12 절편, 10 생쥐) 및 정상 생쥐(9 절편, 8 생쥐)에서 단일, 30분, 0.5 Hz에 의해 나타난 LTD를 나타낸 그래프이고,

도 5의 F는 유전자변이 생쥐(7 절편, 5 생쥐) 및 정상 생쥐(6 절편, 5 생쥐)에서의 단일, 75분, 0.2 Hz에 의해 나타난 LTD를 나타낸 그래프이고,

도 5의 G는 여러 진동(stimulation frequency)에서 시냅스 적응성을 요약한 그래프이고(스케일바: 1.5 mV, 10 ms),

(상기 도 5에서 ●: 정상 생쥐(+/+), ○: NCX2 -/- 생쥐)

도 6의 A는 정상 생쥐(n=12) 및 유전자변이 생쥐(n=13)의 7일 동안의 훈련 동안에 기일에 대한 평균 탈출에 걸리는 시간을 나타낸 그래프이고,

도 6의 B는 정상 생쥐 및 유전자변이 생쥐의 정상 수영 속도를 나타낸 그래프이고,

도 6의 C는 정상 생쥐(n=11) 및 유전자변이 생쥐(n=10)의 3일 동안의 과업 수행에서의 비주얼 플랫폼 과업 수행을 나타낸 그래프이고,

도 6의 D 및 E는 3일 동안의 과업 수행에서의 첫 번째 탐색 테스트를 타겟 사분면을 찾는데 소비되는 시간(D) 및 타겟 플랫폼 위치를 지나가는 횟수에 있어서의 기억 촉진(E)으로 나타낸 그래프이고,

도 6의 F 및 G는 3일 동안의 과업 수행에서의 두 번째 탐색 테스트를 타겟 사분면을 찾는데 소비되는 시간(D) 및 타겟 플랫폼 위치를 지나가는 횟수에 있어서의 기억 촉진(E)으로 나타낸 그래프이고,

T: 타겟 사분면, R: 인접한 오른쪽 사분면,

L: 인접한 왼쪽 사분면, O: 반대쪽 사분면,

(상기 도 6에서 ●: 정상 생쥐(+/+), ○: NCX2 -/- 생쥐)

도 7의 A는 정상 생쥐(n=12) 및 유전자변이 생쥐(n=12)에서 훈련에 따른 부동 반응을 나타낸 그래프이고,

굵은 선: CS(톤, 20 s), ▼: US(발바닥 쇼크, 2 s)

도 7의 B는 훈련을 시킨뒤 24시간 뒤에 상황 공포를 분석한 그래프이고,

도 7의 C는 훈련을 시킨뒤 24시간 뒤에 신호 공포를 분석한 그래프이고,

도 7의 D는 정상 생쥐(n=15) 및 유전자변이 생쥐(n=16)에서 훈련하는 동안(왼쪽) 및 머무름 간격 동안(오른쪽) 새로운 사물 인지 수행도를 평균 인지 선호도로 나타낸 그래프이고,

(상기 도 7에서 ●: 정상 생쥐(+/+), ○: NCX2 -/- 생쥐)

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Method for enhancing learning and memory by suppressing the activity of NCX2 protein <130> 2p-02-35B <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer <400> 1 tgtgcctttt gagtgacagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B1 primer <400> 2 cagggccatg agtgtaaggt 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2 primer <400> 3 cgcgaacatc ttcaggttct gcgg 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-F1 primer <400> 4 atggctccct tggctttgat g 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-B1 primer <400> 5 acccaggaac atgtagacca tg 22

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
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6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. NCX2 단백질이 발현되지 않는 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 유전자변이 생쥐.
10. (1) NCX2 유전자에 대한 상동 절편 2개, neo 카셋트 및 티미딘 키나제 유전자 카셋트를 포함하는 NCX2 유전자에 특이적인 적중벡터를 생쥐 배아줄기세포에 도입하는 단계;

    (2) 상기 배아줄기세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐를 얻는 단계;

    (3) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 NCX2 +/- 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐를 얻는 단계; 및,

    (4) 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 유전자 변이 생쥐를 얻는 단계로 구성되는 제 9항의 유전자변이 생쥐의 제조방법.
11. 삭제
12. NCX2 +/- 유전자형을 갖는 이형접합체 유전자변이 생쥐의 수정란(수탁번호 : KCTC 10322BP).
13. 제 12항의 수정란을 대리모에 이식하여 NCX2 +/- 유전자형을 갖는 이형접합체 유전자변이 생쥐를 얻고, 이형접합체 유전자변이 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 NCX2 -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 유전자변이 생쥐의 제조방법.