CN104450602B - 非人哺乳动物神经精神疾病动物模型及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型及其制备方法和用途。本发明的小鼠模型与人类的神经精神疾病高度相似。基于该模型动物的神经精神疾病药物筛选平台，可用于筛选新药以及开发其他治疗方法。

Description

非人哺乳动物神经精神疾病动物模型及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型及其制备方法和用途。

背景技术

精神分裂症(Schizophrenia)是一类最常见精神疾病，影响全世界人口的0.5%-1%，以基本个性改变，思维、情感和行为的分裂，精神活动与环境不协调为主要特征。该病在男性中多发生于青春期晚期至25岁，在女性中25-35岁是高发期，自然病程多迁延，多数呈复发和加重，慢性化和衰退的过程，且与其他精神疾病遗传关联性强，重叠率高，最终结局约一半左右患者出现精神残疾并伴随高自杀率。

精神分裂症是一种人类复杂疾病，尽管目前对其病因的认识尚不很明确，但个体的易感素质和外部环境的不良因素对疾病的发生发展的作用已被大家所共识。多项研究表明，精神分裂症是在基因与环境相互作用的基础上发生的，但遗传因素在精神分裂症的发生中具有重要作用，其遗传度高达0.70～0.85(Picchioni,M.M.,and Murray,R.M.(2007).Schizophrenia.Bmj335,91-95.)。但其遗传方式不符合经典的孟德尔遗传规律，具有多基因高异质性遗传特征(McGuffin,P.,and Owen,M.(1991).The molecular genetics ofschizophrenia:an overview and forward view.European archives of psychiatryand clinical neuroscience240,169-173.)。精神分裂症的发生还与环境因素有关，通常认为在个体具有遗传易感性背景的基础上，环境有害因素作用于机体可导致疾病的发生。

精神分裂症的发病机制没有统一定论，各种假说一直处于争论与变化之中。目前有4种学说：神经递质紊乱学说、神经发育障碍学说、神经细胞膜学说和免疫系统障碍学说，但是，迄今为止并无任何一种假说能够十分恰当地阐明精神分裂症的发病机制并被精神医学界广泛接受(Keshavan,M.S.,Tandon,R.,Boutros,N.N.,and Nasrallah,H.A.(2008).Schizophrenia,"just the facts":what we know in2008Part3:neurobiology.Schizophrenia research106,89-107.)。

人类行为的基因控制和小鼠或其他动物模型的行为基因控制有相似性。比如，大多数啮齿类动物焦虑的形式和人类的突发焦虑症类似；人类抑郁症与啮齿类动物行为表现是压力诱导的逃避减弱；模拟精神分裂症啮齿类动物模型可以表现为运动活动性增加、精神兴奋、紧张性刺激、社交退缩、及对多巴胺拮抗剂的应答的抑制和惊反射中弱刺激的抑制作用减弱。所以人类疾病的动物模型为人类深入了解和认识疾病提供了有力的工具。

目前建立精神分裂症的动物模型主要有四种方式，第一种发育造模，包括营养缺乏、隔离饲养和免疫刺激等；第二种药物诱导，包括各种类型的受体激动剂和拮抗剂，常用的有苯环己哌啶(PCP)、MK801和可他命；第三种是基因修饰，包括基因敲除、基因敲入、转基因和突变；第四种是损毁造模，主要是损毁腹侧海马和前额叶(Jones,C.A.,Watson,D.J.,and Fone,K.C.(2011).Animal models of schizophrenia.British journal ofpharmacology164,1162-1194.)。

目前已提出的精神分裂症的重要候选基因包括G蛋白信号调节子4(RGS4)，dysbindin(DTNBP1)，神经调节素1(neuregulin-1，NRG1)，G72，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)，精神分裂症断裂基因1(DISC1)和代谢型谷氨酸受体3(GRM3，也被称为mGluR3)等。然而，由于精神分裂症等疾病的成因复杂，因此迄今为止，对所谓的“精神分裂症的重要候选基因”进行导入或敲除等操作，尚未获得令人满意的神经精神疾病动物模型。

因此，本领域迫切需要开发非人哺乳动物神经精神疾病动物模型。

发明内容

本发明的目的就是提供一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型，及其制备方法和用途。

在第一方面，本发明提供了一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因失活的细胞；

(2)利用步骤(1)中得到的CRMP2基因失活的细胞，制备得到CRMP2基因失活的神经精神疾病动物模型。

在另一优选例中，所述将CRMP2基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。

在另一优选例中，所述基因失活包括CRMP2基因不表达，或表达没有活性的CRMP2蛋白。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔、猴。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)利用DNA同源重组技术，将所述CRMP2基因中的外显子1至外显子14中一个或多个外显子剔除或中断，并任选地用筛选标记替换，得到CRMP2基因失活的非人哺乳动物细胞；

(2)利用步骤(1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳动物细胞制备得到嵌合非人哺乳动物；

(3)将步骤(2)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁育，在后代中筛选获得CRMP2基因失活的杂合子非人哺乳动物；

(4)通过将步骤(3)中得到的杂合子非人哺乳动物相互交配获得CRMP2基因失活的纯合子非人哺乳动物，从而得到CRMP2基因失活的非人哺乳动物模型。

在另一优选例中，所述CRMP2基因失活是通过缺失或敲除CRMP2的外显子3而失活。

在另一优选例中，所述的CRMP2基因失活是大脑特异性的CRMP2基因失活或全身的CRMP2基因失活。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(5)：将CRMP2基因失活的纯合子非人哺乳动物与同一物种的神经特异性敲除工具非人哺乳动物进行杂交，从而获得大脑特异性的CRMP2基因失活的非人哺乳动物动物模型。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物是小鼠，并且在步骤(5)中把CRMP2flox/flox小鼠与工具鼠Nestin-Cre交配，得到CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠。再把CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠与CRMP2flox/flox小鼠交配，即得到在神经前体细胞特异性CRMP2基因的敲除小鼠简称cKO小鼠(即大脑特异性CRMP2失活小鼠)。

在另一优选例中，所述筛选标记为neo基因。

在另一优选例中，所述步骤(2)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳动物模型中，与野生型对照动物相比，具有以下一个或或多个特征：

自发活动水平增加；

抑郁样的行为增加；

空间学习和记忆能力受损；

表现出孤独症样和精神分裂症样行为；

海马区突触后致密组分中部分受体亚基的含量减少；

长时程增强受损；和/或

成年新生神经元发生减少。

在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，将该模型用作研究神经精神疾病的动物模型。

在另一优选例中，所述神经精神疾病包括：精神分裂症、躁郁症、重度抑郁症、孤独症、和/或老年痴呆症。

在本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其中，将该模型用于筛选或鉴定可减轻或治疗神经精神疾病的物质(治疗剂)。

在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，所述的神经精神疾病是成年新生神经元发生减少相关疾病。

在另一优选例中，所述的成年新生神经元发生减少相关疾病是精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症、和/或老年痴呆症。

在本发明的第五方面，提供了用本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型。

在另一优选例中，对于CRMP2基因失活而言，所述的非人哺乳动物模型是杂合的或纯合的。

在另一优选例中，所述的CRMP2基因失活是大脑特异性的CRMP2基因失活或全身的CRMP2基因失活。

在本发明的第六方面，提供了一种筛选或鉴定治疗或缓解神经精神疾病的潜在治疗剂的方法，包括以下步骤：

a.将候选物质施用于本发明第五方面所述的非人哺乳动物模型；和

b.对所述动物模型的行为进行行为学分析，并与对照组进行比较；

其中，与对照相比，如果施用了候选物质的动物模型中表征神经精神疾病行为得到改善，则表明该候选物质是神经精神疾病的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述的行为学分析包括：开放场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验、悬尾实验、蔗糖偏好实验、水迷宫实验、关联/暗示条件恐惧实验、惊反射前脉冲抑制实验、筑巢实验、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个实施例中的CRMP2基因打靶载体构建策略。

图2显示了Pop Out载体的示意图

图3显示了CRMP2基因打靶载体及多酶切鉴定。

图4显示了ES细胞筛选loxP位点、3'端和5'端PCR鉴定结果示意图。

图5显示了.CRMP2嵌合体小鼠。

图6显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠繁殖策略。

图7显示了大脑特异性CRMP2敲除效率验证结果。其中，(A)CRMP2基因敲除小鼠基因型鉴定图示；(B)CRMP2基因敲除小鼠海马中CRMP2的mRNA的表达水平有显著下调，CRMPs家族的其他成员mRNA表达水平没有明显变化；(C)免疫印迹法检测显示CRMP2cKO小鼠各个脑区的CRMP2及p-CRMP2蛋白表达水平明显降低；(D)免疫荧光染色检测CRMP2在cKO小鼠脑片上明显降低。注：OB，嗅球；Cor，皮层；Cere,小脑；Hip,海马；Med,髓质；标尺：200μm。

图8显示了敲除CRMP2可使小鼠体重下降，但皮层分层基本正常。其中，(A)P56小鼠体重的定量分析(雌鼠：对照组n=13，cKO n=8雄鼠：对照组n=13，cKO n=8)；(B)出生56天的对照小鼠和CRMP2cKO小鼠(nestin-cre)的大脑形态(比例尺2mm)；(C)尼氏染色示出生56天的对照小鼠和CRMP2cKO小鼠大脑结构没有明显异常；(D)NeuN染色显示CRMP2特异敲除小鼠出生56天后皮层各层分布未见明显异常。注：所有数据均为平均值±平均值的标准差(±SEM)；t检验，**p<0.01，*p<0.05

图9显示了CRMP2敲除小鼠神经元迁移正常。其中，图A-D：TBR1,SATB2,FoxP1,CTIP2染色显示E18.5的CRMP2，表明cKO鼠脑中皮层各层并未出现明显的缺陷及异常。

图10显示了CRMP2神经特异敲除小鼠自发活动增加但是焦虑样行为正常。其中，(A)旷场实验中小鼠在30分钟内的活动总距离；(B)旷场实验中小鼠在30分钟内停留在中央区域的时间比例；(C)高架十字迷宫实验中小鼠在5分钟的测试时间内停留在开臂区域的时间占总时间的比例。

图11显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠抑郁样行为增加。其中，(A)强迫游泳实验，每6分钟为一测试时段，累计小鼠不活动的时间；(B)悬尾实验，每6分钟为一测试时段，累计小鼠不活动时间；(C)蔗糖偏好实验。比较小鼠对蔗糖溶液和水的偏好程度。

图12显示了与孤独症非常类似的CRMP2敲除小鼠。

图13显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠学习和空间记忆能力受损。其中，(A)场景恐惧实验中小鼠在5分钟的测试时段内小鼠因恐惧而僵直的时间比例；(B)Morris水迷宫实验，计算5天的训练周期中小鼠到达隐藏平台所需的平均时间；(C)空间探索实验第六天小鼠停留在目标象限内的时间比例。

图14显示了CRMP2基因敲除小鼠表现出类精神分裂症行为。其中，(A)不同脉冲强度下对照小鼠和CRMP2基因敲除小鼠的惊吓反应幅度；(B)CRMP2基因敲除小鼠前脉冲抑制效应明显减弱；(C)对照组和CRMP2敲除小鼠做窝的图示；(D)CRMP2敲除小鼠在做窝评分明显低于对照小鼠。

图15显示了CRMP2神经细胞特异敲除小鼠海马区突触后致密区受体量选择性下降。其中，(A)免疫印迹显示分离的突触后致密区组分纯，同时表明突触后致密区组分中存在CRMP2；(B)免疫印迹显示敲除小鼠突触后致密区组分中NMDA受体NR1和NR2B的量减少。

图16显示了CRMP2神经细胞特异敲除小鼠海马CA1区突触超微结构观察。其中，(A)电子显微例图显示对照小鼠和敲除典型的突触结构突触前囊泡(箭状标记)、突触后致密组分(箭头)及树突棘(星号)；(B)CRMP2敲除小鼠的突触间隙与对照组没有差异；(C)CRMP2敲除小鼠在突触致密组分长度与对照组没有差异；(D)CRMP2敲除小鼠突触致密组分面积较对照组小；(E)CRMP2敲除小鼠突触致密组分厚度比明显变薄；(F)通过累积频率图及直方图分布和高斯曲线拟合的方式测绘突触后膜致密组分厚度。注：图B-E均为平均值±SEM。双尾T检验。

图17显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠LTP受损。其中，(A)输入-输出曲线显示CRMP2cKO小鼠的基础突触传导正常；(B)当间隔为60ms和500ms，对照和cKO小鼠双脉冲易化比例相似；(C)CRMP2神经特异敲除小鼠TBS诱导的LTP明显减弱。

图18显示了大脑特异性CRMP2敲除小鼠成年神经前体细胞增殖减少。其中，(A)Brdu免疫染色脑切片的共聚焦图示，比例尺：50μm；(B)齿状回区BrdU阳性细胞的体式学定量分析；(C)活化的半胱天冬酶-3免疫染色脑切片的共聚焦图示，比例尺：50μm；(D)齿状回颗粒下层及颗粒细胞层内活化的半胱天冬酶-3细胞密度的定量分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的神经精神疾病模型，它是CRMP2基因被剔除或失活的小鼠或其他非人哺乳动物。本发明的动物模型是一种有效的神经精神疾病动物模型，可用于研究精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症和老年痴呆症等神经精神疾病，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。在此基础上完成了本发明。

具体地，在本发明中，对大脑特异性CRMP2和全身敲除的小鼠模型的行为学检测证实，该神经精神疾病模型动物的自发活动水平增加，抑郁样行为增加和精神分裂症样的行为学表型，部分小鼠表现出典型的孤独症表型。对海马组织突触后膜致密组分中AMPA受体亚基和NMDA受体亚基的免疫印迹分析表明敲除小鼠中海马PSD组分中NR1和NR2B的量显著降低；通过透射电镜对海马CA1区放射层非对称突触的超微结构进行观察，发现敲除小鼠在该区的PSD面积明显变小，厚度变薄；通过电生理技术发现敲除小鼠海马谢弗侧支CA1区突触的基础传递和突触前膜的递质释放正常，但是TBS诱导产生的长时程增强却明显受损。同时该基因敲除小鼠齿状回中成年神经干细胞增殖明显减少。

CRMP家族和CRMP2

CRMPs家族(CRMP1-5)的各个成员在不同的物种被独立发现，其中日本科学家最早发现CRMP2在鸡胚的背根神经节中介导胞外信号Sema3A转导过程具有重要作用(Goshimaet al.,1995;Minturn et al.,1995)。在结构上，CRMP1-4相互之间大约75%氨基酸序列同源，但是CRMP5与其他成员只有50%-51%的氨基酸序列同源。CRMP1-4也与肝脏中的二氢尿嘧啶脱氢酶序列高度同源而且结构与金属依赖的氨基水解酶高度相似，都能形成稳定的四聚体(Hamajima et al.,1996)。但是CRMPs家族中没有一个成员具有酶活性，可能是由于缺少氨基水解酶活化位点结合金属原子所必需关键氨基酸残基组氨酸(Wang andStrittmatter,1996)。

CRMP2(collapsin response mediator protein-2，也被称为DPYSL2/DRP2,Unc-33,Ulip或TUC2)是CRMPs家族的一员。CRMP2在神经元的极性建立上具有重要作用，研究表明体外培养的海马神经元中过表达CRMP2促进多轴突形成，过表达功能缺失突变体导致轴突变短(Inagaki et al.,2001)。CRMP2通过促进与微管蛋白异源二聚体结合从而促进轴突的外向生长，而在神经突起的生长锥是通过调节极性蛋白Numb介导的内吞作用来调控的神经元极性(Yoshimura et al.,2005)。CRMP2参与极性建立是通过磷酸化与去磷酸化的方式调节与微管蛋白和Numb的亲和力来实现的。

CRMP2基因位于人类基因组8p22-p21上，全长150985bp(Genebank登录号：NG_030020.1)。CRMP2的基因组序列包括13个内含子和14个外显子，有8个不同的转录本，其中有三个转录本编码蛋白。这些序列信息可参见文献或Genebank等公共数据库。

小鼠等其他物种的CRMP2基因也可参见文献或Genebank等公共数据库。

应理解，术语“CRMP2”还包括各种天然存在的CRMP2基因的变异形式。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的CRMP2蛋白的核苷酸序列，编码野生型CRMP2蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于小鼠之外的其他哺乳动物时，该术语指CRMP2基因在该哺乳动物中的同系物。例如对于人而言，该术语指人的CRMP2(已知小鼠CRMP2基因与人类CRMP2的cDNA同源度为86%，氨基酸序列的同源度为99%)。

神经精神疾病及成年新生神经元发生(adult neurogenesis)减少相关疾病

神经精神疾病是以表现在神经系统病变、行为、心理活动紊乱的一组疾病，主要分为神经疾病与精神疾病。近年的研究表明，海马是与学习和记忆密切相关的脑区，从功能上看，海马齿状回成年新生神经元发生对神经网络的可塑性和维持上具有重要的作用，也是老年痴呆病早期阶段最容易受损的脑区，在精神分裂症与抑郁症等精神疾病病人中也常伴有海马功能的异常。越来越多的证据提示海马齿状回区成年新生神经元发生(adultneurogenesis)的减少可能是精神分裂症与抑郁症等精神疾病及老年痴呆发病发病的重要原因之一(Ming and Song,2011；Winner et al.,2011；Mu and Gage,2011)。

在本发明中，成年新生神经元发生减少相关疾病包括但不限于情绪类疾病如精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症，神经退行性疾病如老年痴呆、帕金森病等，优选地，包括精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症、和/或老年痴呆症。

基因失活

对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。

动物模型

在本发明中，提供了一种非常有效的神经精神疾病的非人哺乳动物模型。

在本发明中，非人哺乳动物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠。

如本文所用，术语“CRMP2基因失活”包括一个或两个CRMP2基因被失活的情况，即包括CRMP2基因杂合地和纯合地失活。例如，CRMP2基因失活的小鼠可以是杂合或纯合的小鼠。

在本发明中，可基因剔除或转入外源基因(或片段)而使CRMP2基因失活等方法制备CRMP2基因失活的非人哺乳动物(如小鼠)。在本领域中，通过基因剔除或转入外源基因而使靶基因失活的技术是已知的，这些常规技术都可用于本发明。

在本发明的另一优选例中，CRMP2基因的失活是通过基因剔除实现的。

在本发明的另一优选例中，CRMP2基因的失活是通过CRMP2基因中插入外源基因(或片段)而实现的。

在本发明的一具体实例中，可构建一含有外源插入片段的构建物，该构建物含有与靶基因(CRMP2)的插入位点的两侧的侧翼序列同源的同源臂，从而可以通过同源重组高频地将外源插入片段(或基因)插入至CRMP2基因组序列(尤其是外显子区域)，造成小鼠CRMP2基因的移码、提前终止、或敲除，从而导致CRMP2缺失或失活。

用本发明方法获得的纯合或杂合的小鼠可育，发育正常。失活的CRMP2基因可以孟德尔规律遗传给后代小鼠。

在一优选例中，本发明提供了一种缺失CRMP2基因的纯合小鼠模型动物。

候选药物或治疗剂

在本发明中，还提供了一种利用本发明的动物模型，筛选治疗神经精神疾病的候选药物或治疗剂的方法。

在本发明中，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明神经精神疾病模型的遗传稳定、表型稳定。

(b)用本发明方法获得的纯合或杂合的动物模型可育，发育正常。转基因杂合雄性小鼠具有生殖能力，失活的CRMP2基因可以孟德尔规律遗传给后代小鼠。

(c)所述神经精神疾病动物模型表现出多种神经和精神疾病样的症状，因此可以广泛用于神经精神类疾病的药物筛选和测试，包括精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症和老年痴呆等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料

1实验材料、主要试剂与实验仪器

1.1小鼠、细胞株、菌株和质粒

C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；ICR小鼠为中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心繁殖；工具鼠Nestin-Cre(品系名：B6.Cg(SJL)-TgN(Nes-cre)1Kln)/J)购自南京大学模式动物研究所；Thy1-GFP-M由清华大学左毅教授赠送。

ES细胞株(MPI-2,衍生自129SvJ品系)购自北京百奥赛图生物技术有限公司。

G418抗性小鼠原代成纤维细胞(MEF)购自National Cancer Institute atFrederic。

大肠杆菌TOP10菌株(购自北京康为世纪生物技术有限公司)和工程菌EL350(购自National Cancer Institute at Frederic)。

质粒pBluescript II KS+购自Stratagen公司；打靶载体构建过程中使用的质粒PL253，PL451，PL452购自National Cancer Institute at Frederic。含CRMP2基因全长的BAC克隆(RPCI23-414A17)购自Invitrogen公司。

1.2酶、培养基、试剂盒和生化药品

所用的各种内切酶、Taq DNA Polymerase、T4DNA ligase、DNA Marker购自NewEngland Biolab或Takara公司；基因型鉴定用的PCR mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司；DMEM，Trypsin，Pen-Strep为Hyclone产品；胰蛋白胨(LP0042)，酵母抽提粉(LP0021)为OXOID产品；DMSO购自Sigma公司；DNA回收纯化试剂盒购自索莱宝公司；质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；质粒中提，大提试剂盒购自Qiagen公司；寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3实验中使用的引物序列

1.3.1扩增同源臂所用引物序列：

1.3.2ES细胞筛选所用引物序列：

1.3.3小鼠基因型鉴定引物序列：

1.3.4CRMPs荧光定量PCR引物序列：

1.4实验中使用的抗体列表

通用方法

1、小鼠行为学分析方法

1.1开放场实验(open-field test)

开放场实验是评价动物自发活动能力、探索行为以及焦虑水平的实验。实验所用操作箱规格为40cm×40cm×49cm(长×宽×高)，里面的场地根据面积划分为12个象限，顶盖装有灯、摄像头，及连接装有小鼠行为记录分析系统的电脑。每只小鼠放在开放场的中间，在箱内自由活动30分钟，摄像头全程拍摄。所拍视频用小动物行为记录分析系统分析小鼠活动轨迹，小鼠的焦虑水平由小鼠在中间区域所呆的时间和靠近旷场壁的相对时间来衡量。由两个定量的指标组成：在中间象限时间占总时间的百分比；小鼠在开放场内运动的总距离。定义小鼠在某个象限的标准是小鼠的四肢都进入该象限。

1.2高架十字迷宫实验(Elevate Plus Maze Test)

高架十字迷宫由黑色的树脂玻璃制作，离地高70cm，由两个成十字排列的长坂组成，四个臂组成，每个臂长30cm，宽5cm，其中的两个臂被两个高14cm的黑色树脂玻璃隔开，形成两个闭合臂；另外的两个臂称之为开臂。在十字迷宫运动的小鼠由红外感应的追踪系统记录小鼠的运动轨迹。在开始实验时，小鼠放在暗室十字迷宫的中间，头朝开臂方向，每个测试环节中记录小鼠的运动轨迹10min。分析小鼠进入开臂和闭合臂的次数；分别在开臂和闭合臂的总时间；穿过中间区域的频率。小鼠进入开臂和闭合臂的标准是小鼠的四肢都进入该区域。反应焦虑水平的指标：小鼠处在开臂时间占总时间的百分比。

1.3强迫游泳实验(Forced Swim Test)

强迫游泳实验是一种经典的反应啮齿类动物抑郁相关行为的实验，本实验中用于测试小鼠抑郁样的行为。把小鼠放入装有22℃水的玻璃量筒中(高25cm，直径10cm)，水深18cm。每个测试周期为6min，记录6min中小鼠不动所占时间比例。不动的定义标准是小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面。游泳的定义标准是小鼠积极利用前肢在水中向前运动，这个行为不包括小鼠把爪子举出水面，小鼠的身体通常朝向量筒壁的一侧。攀爬定义为小鼠积极利用爪子趴在量筒壁上，同时把爪子举出水面，头朝着量筒壁，身体与量筒侧边垂直。反应抑郁水平的指标：小鼠在水中保持不动的时间。

1.4悬尾实验(Tail Suspension Test)

悬尾实验是反应啮齿类动物抑郁相关行为的实验，本实验中用于测试小鼠抑郁样行为。把小鼠的尾巴固定在悬尾测试仪上，使其头部向下悬挂，记录处于该环境中小鼠产生绝望不动状态的时间。反应抑郁水平的指标：小鼠在悬尾时不动的时间。

1.5蔗糖偏好实验(Sucrose Preference Test)

蔗糖偏好实验用于测试动物是否有快感缺乏的行为学现象，因为快感缺乏是抑郁行为的一个主要症状。实验前三天小鼠喂以1%的蔗糖水代替日常饮用水，以使小鼠习惯于蔗糖水；然后在给小鼠23h禁水之后，喂予小鼠可以自由的饮用两个水瓶，其中一个为日常饮用水，另一个为1%的蔗糖水；1h后称取每个水瓶的重量，计算液体的消耗量；蔗糖偏好实验连续2天，为了避免水瓶的位置效应对结果的影响，第2天变更蔗糖水和日常饮用水瓶放置的位置；蔗糖偏好的计算公式是：蔗糖偏好性(%)=饮用蔗糖水量/(饮用蔗糖水量+饮用日常饮用水量)×100%。

1.6水迷宫实验(Water Maze test)

水迷宫实验设备包括一个不锈钢圆形水池(直径120cm，高50cm)、一个平台(直径6cm)、水池上方固定一台摄像机以及与摄像机相连的计算机。池内盛水，深25cm，水温22℃左右。平台置于水下1cm。水面漂浮着一层无毒无味的白色塑料珠以防动物看清水下平台。房间墙壁贴上色彩鲜艳的、形状不同的纸板或塑料板，作为动物空间定位的标记。

实验包括两个阶段定位航行实验(place navigation)和空间探索实验(spatialprobe)。其中定位航行试验历时5天；训练期间，把平台放在水池中的一个象限，每天固定时间将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，如果小鼠在60s之内没有找到水下平台则引导其到平台上，小鼠到达平台后让其再呆上10s，然后迅速用毛巾弄干小鼠，放在37℃加热灯下，以保持体温；第6天进行空间探索试验，在定位航行试验后去除平台，然后在之前平台对侧的象限将小鼠放入水池中，记录其在60s内的游泳轨迹，考察小鼠对原平台的记忆。用视频追踪系统记录每只小鼠在水池中的的游泳路径，计算小鼠在60s跨原平台所在象限时间与其它三象限的时间比。

1.7关联/暗示条件恐惧实验(contextual/cued fear conditioning)

关联/暗示条件恐惧包括训练和测试两个阶段，具体步骤如下：

训练阶段(第一天)，调试仪器，确保操作箱底部栅板有电流刺激(用备用小鼠测试)；将小鼠放入箱内，适应2min；足电击刺激(0.7mA，2s)；58s间歇期，无任何刺激；紧跟2s足电击刺激(0.7mA，2s)；58s间歇期,无任何刺激；紧跟2s足电击刺激(0.7mA，2s)；58s间歇期，无任何刺激；实验终止；将小鼠放回饲养笼，70%乙醇擦拭操作箱。

测试阶段(第二天)，关联测试，把动物放入跟第一天实验使用的同一个测试箱，重力感应器记录小鼠5min内的活动状态；记录每分钟小鼠凝滞时间，计算小鼠凝滞的比率。

1.8惊反射的前脉冲抑制实验(Prepulse inhibition，PPI)

PPI的测试过程，由于小鼠需从北京送到苏州大学进行行为学实验，至少实验前一周把小鼠送到苏州大学实验室。根据文献和预实验，确定实验参数和测试方案，实验当天，将小鼠放入惊反射测试箱。实验步骤如下：

1)将小鼠置于单纯的背景声音中，适应5min(69dB)；

2)连续5次单独惊反射刺激(120dB，持续40ms)，并记录数据；

3)共48个trials，4种类型刺激，分别是单独的惊反射刺激(120dB，持续时间40ms，12trials)，3种联合刺激(其中前刺激强度分别为背景+4dB，+8dB和+12dB)前刺激持续20ms，惊反射刺激强度120dB，持续40ms，二者间隔100ms，各12trials，所有的trial按假随机的顺序进行，并记录数据；

4)最后给小鼠4种类型的单独惊反射刺激共20个trial，强度分别为90dB，100dB，110dB和120dB，各个刺激按假随机顺序进行并记录数据。

所有试验共73个trial，每个刺激间隔15-20s，每个刺激内含空白期100ms，前刺激或空白刺激持续20ms，间隔100ms，惊反射刺激持续40ms，延迟140ms。

行为学评价指标：1)惊反射幅度=最后5次单独惊反射刺激反应幅度的均值。用于评价动物的情绪状态。2)PPI=(1-前脉冲联合惊反射刺激的反应幅度/单独惊反射刺激的反应幅度×100%，数值为0表示无前脉冲抑制，数值越大代表抑制程度越强。

1.9筑巢实验(Nest building test)

熄灯前1h将小鼠分笼，单笼单只饲养。将正方形(10cm×10cm)的脱脂棉3.0g放于鼠笼内。12h后观察小鼠的筑巢情况，拍照屏蔽基因型并按照评分标准对其评分。评分标准0-1分：90%脱脂棉保持完好；1-2分：小部分脱脂棉被撕开，大部分保持完好(50%-90%)；2-3分：大部分脱脂棉被撕成碎片(50%-90%)，但是无窝状；3-4分：90%以上的脱脂棉被撕成碎片，成扁平状鼠窝(高度小于身高的50%)；4-5分：90%以上的脱脂棉被撕成碎片，成高质量鼠窝(高度大于身高的50%)；鉴于动物实验的复杂性，评分可以用小数，如小鼠的窝做的非常完美，但是还残留10%的脱脂棉没有被撕碎，可以评为4.5分。

2.蛋白水平研究实验方法

小鼠海马组织突触后致密区组分分离：取小鼠引颈或者断头处死，取出整个大脑组织，预冷的PBS中浸洗一次；然后迅速在冰上取出两侧海马，放入预冷的玻璃匀浆器，加入800μL组织匀浆缓冲液(320mM sucrose,2mM EDTA,20mM Tris-HCl(pH8.0),1mM PMSF)匀浆，单侧海马加400μL H缓冲液，使用匀浆器匀浆；4℃离心,1000g，10min，取上清，作为组分S1；从S1组分中取出45μL，加入5μL10%SDS，混匀，用作全蛋白检测；剩余的S1离心，4℃离心，10000g，20min，弃上清，留沉淀P2作为突触小体组分；加入400μL TET缓冲液(1%TritonX-100,2mM EDTA,20mM Tris-HCl pH7.4,1mM PMSF)重悬P2，4℃，旋转混匀1hr；超速离心，Beckman离心机，Sw41转子，4℃，100000g，1hr；单侧海马的最后沉淀用40μL TET缓冲液和5μLSET缓冲液(1%SDS,2mM EDTA，20mM Tris-HCl pH7.4)重悬，吹打溶解；Bradford法定量蛋白浓度；.取15μg蛋白，8%SDS-PAGE电泳。

3.形态学研究实验方法

3.1Nissl染色

挑取相应的脑片到经铬钒明胶包被过的载玻片上，室温晾干8-12h；把贴有脑片的载玻片于PBS中浸洗1min；后入0.5%的Nissl染色液5-10min；取出流水冲去染色液，入梯度酒精脱水，30%1min，50%1min，70%1min，80%1min，95%1min，100%5min；入100%二甲苯透明3次，每次5min；取出后迅速加上中性树胶，确保片子不干；盖上盖玻片封片，挤出气泡；后置于通风橱中晾干8-12h。

3.2小鼠脑切片免疫荧光染色

组织切片用PBS洗3次，每次5min；用封闭液室温封闭1h；吸去封闭液，加入封闭液稀释的一抗4℃过夜(8-12h)；收集一抗，PBST洗3次，每次5min；加入相应的荧光二抗避光室温作用1h；PBST洗3次，每次5min；贴片后加入一滴抗淬灭剂，盖上盖玻片，指甲油封片；避光晾干。

3.3小鼠脑Brdu标记方法及免疫荧光染色

8周龄成年小鼠腹腔注射Brdu，200mg/Kg，检测增殖情况于2h后灌流取脑，4%PFA固定过夜；后置于30%蔗糖溶液至沉淀；后TFM包埋组织于-80℃速冻；切片之前2h，取出放到切片机的冷冻台；滑动切片，切片厚度50μm，用毛笔将切片挑入到盛有0.01M PBS的培养皿中。也可挑入到防冻液中-20℃保存备用。

组织切片用PBS洗3次，每次5min；后用2N盐酸变性DNA，37℃20min，迅速用0.1M硼酸钠(pH8.5)中和，室温12min；切片用PBS洗3次，每次5min；后用封闭液室温封闭1h；吸去封闭液，加入封闭液稀释的Brdu一抗4℃(24-48h)；收集一抗，PBST洗3次，每次10min；加入相应的荧光二抗，避光室温作用2h；PBST洗3次，每次10min；贴片后加入一滴抗淬灭剂，盖上盖玻片，指甲油封片；避光晾干。

3.4小鼠海马突触超微结构电镜标本的制备及各指标的测量

取8周龄雄性CRMP2Ctrl和cKO小鼠各4只，用数字编号以保证对基因型保密，到所有的测量和计算结束之后，才核对编号对应的基因型，以避免实验人员偏见对结果的客观性造成损害；戊巴比妥钠腹腔麻醉后，用预冷的0.1M PB冲血，后用冰上预冷的2%多聚甲醛/2.5%戊二醛混合灌流液灌流固定；断头剥离全脑置于小鼠脑模上，在距视交叉后缘1mm处向尾侧切取2mm厚的组织切片；在体体视镜载物台上放上冰袋，滴两滴灌流液在冰袋上，将组织浸入灌流液，在解剖镜下去掉皮层，切取含海马CA1区的组织块约1mm3，整个过程保证组织块被灌注液浸润；将组织块放入盛放有2mL2.5%戊二醛的EP管内，4℃过夜前固定；0.1MPB洗三次，每次10min；1%OsO4，避光后固定1h，MilliQ H₂O洗三次，每次15min；2%醋酸双氧铀组织块染1h，MilliQ H₂O洗三次，每次15min；梯度丙酮脱水，30%5min，50%5min，70%5min，90%10min，100%5min，100%5min，100%10min；环氧树脂Epon-812包埋，丙酮：树脂Epon-812=2：11h，丙酮：树脂Epon-812=2：21h，丙酮：树脂Epon-812=1：21h，100%树脂Epon-8124h，100%树脂Epon-8124-12h，100%树脂Epon-8124h；100%树脂Epon-812包埋，60℃聚合48小时；光学显微镜下修块；2μm厚半超薄切片,甲苯胺兰染色定位；切65nm超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色；在JEM-1400透射电子显微镜下观察，以CA1区GrayⅠ型不对称突触为观察对象，分别用CCD采集放大30K的图像。形态计量学分析：用ImageJ软件测量PSD的面积和宽度及厚度，用distance-between Polylines插件突触间隙的距离。

实施例1打靶载体的构建

1.1小鼠BAC DNA的提取

将含有CRMP2基因组全长的BAC(RPCI23-414A17)DH10B的菌划线在含有氯霉素的平板上，37℃培养10h，挑取5个单克隆，分别摇5mL菌，12h。13000rpm，1min收菌，加300μL P1(Tris50mM，EDTA10mM，pH8.0)悬菌，然后加300μL P2(0.2M NaOH，1%SDS)，混匀，室温放置5min，然后加300μL P3(3M KAC，pH5.5)，轻摇放置2-5min，10000rpm，4℃，离心10min。将上清转移到新EP管中，然后加800μL预冷的异丙醇，颠倒混匀冰上放5min，4℃，10000rpm，15min，去上清，沉淀用600μL70%乙醇洗涤两次，晾干，加40μL双蒸水，及1μL RNaseA，37℃溶解30min。

1.2电转感受态的制备及转化

从-80℃冰箱取出保存的工程菌EL350，在没有抗生素的LB固体平板上划线，32℃过夜培养。挑取单克隆，接入10mL LB液体培养基中，32℃，220rpm，过夜培养。按1：10-20的比例，将菌液转接到50mL LB培养基中，32℃，220rpm，培养2-4h，直至OD600达0.5左右。冰浴10min，收菌至1.5mL EP管中，4℃，4000rpm，1min。用预冷的双蒸水洗菌三次，去除LB中的离子。最后用20-50μL双蒸水悬起菌体。操作过程中保持低温时是关键。可以加15%甘油将菌于液氮中速冻后保存于-80℃。也可直接电转。

将制备好的感受态和待转质粒或者DNA片段混匀，冰上放置10min，加入预冷电转杯(0.1cm，Bio-Rad)中，1.75kV，25μF，200Ω，电击完，迅速加入1mL无抗生素LB悬起菌体，吸至EP管中，32℃孵育1h，后涂于相应抗性的平板上。

1.3热击电转感受态的制备及转化

从-80℃冰箱取出保存的工程菌El350，在没有抗生素的LB固体平板上划线，32℃过夜培养。挑取单克隆，接入10mL LB液体培养基中，32℃，220rpm，过夜培养。按1：10-20的比例，将菌液转接到50mL LB培养基中，32℃，220rpm，培养2-4h，直至OD600到达0.5之间。将菌放于42℃水浴锅中摇动15min，然后放冰上摇动3min，再置于冰上5min。收菌至1.5mL EP管中，4℃，4000rpm，1min。用预冷的双蒸水洗菌三次，去除LB中的离子。最后用20-50μL双蒸水悬起菌体。可以加15%甘油将菌于液氮中速冻后，保存于-80℃。也可直接用于电转。

1.4打靶载体构建过程

1.4.1CRMP2基因打靶载体的构建策略

小鼠的CRMP2基因全长65825bp，一共有14个外显子。在本实施例中，计划敲除Exon3，该外显子长185bp，敲除之后会导致移码突变，从而导致CRMP2基因失活。

首先利用同源重组方式套取一段10Kb左右包含Exon3的CRMP2基因组片段，然后利用同源重组和位点特异性重组，在这段序列的Exon3两侧各加上一个loxP位点和相应的筛选标记。利用Exon3两侧的同源序列做为重组臂，其中5'端重组臂长为3.8Kb，3'端重组臂长为2.1Kb。电转打靶载体到ES细胞中，使得打靶载体和染色体上的CRMP2基因重组，从而完成对ES细胞基因的改造。具体打靶策略设计如图1。

1.4.2CRMP2基因打靶Mini-Targeting载体的构建

打靶载体的构建需要先构建三个中间载体(Liu et al.,2003)，分别命名为Pl253-Retriveval，Mini-Targeting-1，Mini-Targeting-2。以CRMP2-A，CRMP2-B，CRMP2-C，CRMP2-D，CRMP2-E，CRMP2-F，CRMP2-G，CRMP2-H，CRMP2-I，CRMP2-J，CRMP2-Y和CRMP2-Z为引物，以BAC RPCI23-414A17为模板扩增200-500bp的同源臂，分别命名为AB，CD，EF，GH，IJ，YZ。以质粒PL253、PL451、PL452(购自National Cancer Institute at Frederic)及pBluescript(购自Stratagene公司)为基本骨架，利用酶切和连接的方法，分别构建了含AB和YZ同源臂5888bp的PL253-Retrieval，含有CD和EF同源臂5420bp的Mini-Targeting-1及含有GH和IJ同源臂5520bp Mini-Targeting-2中间载体。

1.4.3CRMP2基因打靶Retrieval载体的构建

首先从购自Invitrogen公司含BAC RPCI23-414A17的大肠杆菌DH10B中提取BAC质粒，然后将其转入工程菌EL350(E.coli)中，挑取转入成功的克隆做成电转感受态。同时利用Hind III酶切线性化PL253-Retrieval，电泳回收切开的片段，将该片段10-100ng电转入含有RPCI23-414A17的EL350中，将电转后的菌涂于含Amp抗性的平板上，挑选出发生位点特异性重组的克隆，同时提取质粒进一步酶切鉴定。正确的阳性克隆命名为PL253-Retrieval-CRMP2。

1.4.4CRMP2基因打靶First-Targeting载体的构建

将已得到的PL253-Retrieval-CRMP2电转到普通EL350菌中，然后将其做成电转感受态。同时用NotⅠ和SalⅠ切Mini-Targeting-1，回收含有Neo基因的片段，将100ng该片段电转入含有PL253-Retrieval-CRMP2的EL350中，利用含Kana和Amp抗性平板筛选同源重组的克隆，经酶切鉴定确认。阳性克隆称为PL253-CRMP2-1^sttargeting。

1.4.5CRMP2基因打靶Pop Out载体的构建

将PL253-CRMP2-1stTargeting转入阿拉伯糖诱导的EL350感受态中，诱导两个loxp位点重组，得到PL253-CRMP2-Pop Out，酶切鉴定确认，两个loxP已重组为一个。此时载体上只有一个loxP位点，Neo基因已移除，经鉴定正确的克隆命名为PL253-CRMP2-Pop Out。其图谱如图2所示。

1.4.6CRMP2基因打靶Second-Targeting载体的构建

将PL253-CRMP2-Pop Out转入EL350中，做成电转感受态，然后利用NotⅠ和SalⅠ切Mini-targeting-2，回收含有GH-Neo-IJ的片段。取100ng转入含有PL253-CRMP2-Pop Out的EL350中，利用Kana和Amp双抗性平板筛选阳性克隆。

多酶切鉴定正确和相应片段测序正确的克隆命名为PL253-CRMP2-2^ndTargeting，其图谱和多酶切鉴定结果如图3A和3B所示。

1.4.7打靶载体PL253-CRMP2-2^ndtargeting重组能力检验

将构建好的PL253-CRMP2-2^ndtargeting载体转入阿拉伯糖诱导的感受态，诱导重组酶产生，引发两个loxP位点重组，切除中间的Exon3。经PCR和测序鉴定与预期结果一致。

1.4.8打靶载体PL253-CRMP2-2^ndtargeting操作片段全测序

为了确保在各个操作过程中没有引物突变，对操作过的片段AB、CD、EF、GH、IJ、YZ、两个loxP位点和Exon3进行测序验证。测序结果与预期的一致。

实施例2CRMP2基因敲除

2.1基因打靶

第1天：准备打靶载体，准备100mm滋养层细胞

打靶载体准备：

用NotI线性化打靶载体200μg(质粒提取方式按照QiaGen EndoFree PlasmidMaxi Kit)，加两倍体积无水乙醇，-80℃放置30min，12000rpm，30min，离心回收，70%乙醇洗涤两次，晾干，50μL Milli-Q水溶解。

小鼠原代成纤维(MEF)细胞复苏培养：

液氮中取出冻存的MEF细胞，37℃快速融化MEF滋养层细胞，加MEF培养基至总体积10mL，1000rpm离心，5min收集细胞。用10mL MEF培养基重悬细胞，种到100mm培养皿上。

第2天：检查滋养层细胞，复苏ES细胞

将前一日复苏的滋养层细胞培养基换为ES培养基，3小时后复苏ES细胞。融化ES细胞，直接加到含有滋养层细胞的培养皿上，不必离心收集细胞。ES细胞需要每天换新鲜的培养液。

第3天：培养ES细胞，换液

第4天：培养ES细胞，换液，如果生长密度大了，需要将ES细胞传代

ES细胞传代：传代前3个小时换液，之后用PBS洗ES细胞两次，加Trypsin至覆盖过ES细胞，放于37℃，消化8min。之后用Pipette吹打35-40次，将克隆吹打开。加等体积的ES培养基，中和Trypsin，1000rpm，离心3min，收集细胞，ES培养基重悬，加到新的含有滋养层细胞的培养皿上。

第5天：培养ES细胞，换液

第6天：电转

检查ES细胞是否分化，保证电转所用的ES细胞是没有分化的。对于一次电转，需要1×10⁷细胞，质粒需要50-100μg。

电转方法：

电转之前3小时换ES培养基；PBS洗细胞两次；Trypsin消化，37℃，8min；Pipette吹打细胞，使得细胞成为单细胞悬液；加等体积ES培养液中和trypsin；1000rpm，离心，5min；去除培养基，用ES培养基重悬ES细胞，计数，调整细胞浓度；取0.9mL含有1×10⁷细胞的培养液，加入质粒，混匀，加入到0.4mmBio-Rad电击杯中，室温放置5min；电击，500μF点亮，240V，电击常数正常时约为6.9-7.9，7.2最好；将电击后的细胞放到冰上2min，然后分到4个100mm含有滋养层细胞的培养皿。

第7～14天：加药筛选克隆

36小时之后，将ES细胞培养基中加入G418和2μM Ganciclovir，前两天用400μg/mLG418，后3-5天加200μg/mL G418，总共约筛选5-7天。

第14天：准备96孔板的滋养层细胞

种G418抗性的滋养层细胞到96孔板上，用于挑取克隆。

第15～16天：挑取克隆

挑克隆：

吸除96孔板中的滋养层细胞培养基，加入100μL的ES培养基;准备圆底的96孔板，加入30μL trypsin，一次准备一个;用5mL PBS洗长有ES细胞的培养皿两次;ES培养皿中加入10mL PBS，用200μL的Pipette吸取15μL PBS，然后用此黄色tip挑取ES克隆到含有trypsin的96孔板上;将挑入圆底96孔板的ES克隆放于37℃，消化8min;加70μL ES培养基到消化的ES细胞中，吹打40次，至单细胞;将打散后的ES细胞放入含有滋养层细胞的96孔板中，不加G418;培养96孔板上的ES细胞，每天换液，等细胞长到90%覆盖率。

第17～19天：培养细胞

培养挑取的96孔板的细胞，48小时后加150μg/mLG418。

第20天：冻存以及扩增细胞

冻存以及扩增细胞：

冻存细胞之前3小时为ES细胞换新鲜培养液；将2×冻存液放到冰上;PBS洗细胞两次;96孔板中每孔加50μL trypsin，37℃消化8min；加50μL ES细胞培养基中和trypsin，吹打40次；转移50μL消化下来的细胞到含有50μL预冷的2×ES细胞冻存液的96孔板上,用封口膜包起来，放冰上20min，然后转移到-80℃；96孔板中剩余的细胞加150μL ES培养液，培养3-4天，不需要滋养层细胞;细胞传代时准备铺Gelatin的平板；加100μL明胶到96孔板的每个孔中,室温放置30min，然后换为ES培养基；将96孔板上的细胞1:2传代到含有明胶的96孔板上，用于基因组DNA的提取。

第21～25天：培养细胞

第26天：提取DNA

2.2ES细胞基因组DNA的提取

划线标记96孔板盖子和板子，吸出培养液，PBS洗细胞两次。每孔加50μL DNA裂解液(50mL裂解液配方：Milli-Q Water32.72mL；1M Tris HCl(pH7.5)0.4mL；0.5M EDTA(pH8.0)0.8mL；10%SDS2mL；5M NaCl80μL；10mg/mL proteinase K4mL),放湿盒中，密封，保持内部湿润，56℃，过夜(12-16h)。每孔加100μL无水乙醇，用封口膜封住，室温摇2小时，可见DNA沉淀于皿底，1500rpm，离心15min，轻轻倒去无水乙醇。每孔加200μL70%乙醇，洗涤三次。室温晾干，约15-30min；每孔加40μL双蒸水，湿盒中密封，56℃2小时，后放于4℃保存备用。

2.3ES阳性细胞鉴定体系与条件

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

2.4ES细胞囊胚显微注射

2.4.1ES细胞的准备

自冻存的96孔板上复苏正确同源重组阳性的克隆，挑至含有滋养层细胞的24孔板上扩大培养，并冻存一部分细胞。同时将另一部分ES细胞同MEF cell一起用trypsin消化起来，铺到含有明胶的培养皿上，37℃培养30min后，轻轻吹打ES细胞，此时滋养层基本已经贴壁，所收集的细胞大多为ES细胞。

2.4.2注射囊胚准备

第1天，注射PMSG:

准备8周大的C57BL/6J小鼠，雌性，20-30只，每只腹腔注射10U PMSG(16：00左右)。

第3天，注射HCG，合笼:

48小时后腹腔注射HCG，10U每只，注射完即合笼。每笼放1只雌鼠，1只8周以上可交配的C57BL/6J雄鼠。

第4天，检栓:

早上8:00-10:00，检栓，可借用弯头镊子，小鼠阴道口处的白色固体样物质为栓，将见栓小鼠挑出，标记。

第6天，准备M2胚胎操作液，准备假孕母鼠

将M2操作液分装于1.5ml EP管中，开管口，放到37℃0.5%的CO2培养箱中，过夜。16:00，选发情的ICR雌鼠10只，与结扎的ICR雄鼠合笼。

第七天，取E3.5的胚胎

早9点以后，取见栓后的小鼠，断颈，酒精喷洗腹部，剪开腹腔，将两侧的子宫连同输卵管的膨大的腹部一起剪下，放到35mm培养皿中，1mL注射器吸取1mLM2胚胎，自子宫下角插针，将胚胎冲出。M2洗两次。待注射ES细胞。

2.4.3.干细胞囊胚显微注射及胚胎植入

显微操作，用机械手臂操作毛细玻璃吸管，吸取形态圆润的干细胞，注射到胚胎的囊胚腔中，每个胚胎植入干细胞15个左右。注射阿佛丁麻醉代育ICR假孕雌鼠(0.2mL/10g)，将注射干细胞后的胚胎植入假孕鼠的子宫中，自小鼠腰部剪开皮肤，用镊子夹出子宫，用1mL注射器刺破一个开口，然后将胚胎放到子宫里。然后将拉出的子宫送回小鼠体内，针线缝合皮肤。小鼠放白炽灯下(利用白炽灯温度，不直接接触)半小时左右苏醒，然后放回鼠房培养，待产仔

2.5反转录及Real-Time PCR

25μL反转录体系，取3μL所提取的RNA(500ng/μL)，1μL Oligo(dT)₁₅(50μM)，13.15μL DEPC处理双蒸水，70℃热击5min，然后立即放冰上；加入下一组分，5μL5×MMLV Buffer，1.25μLdNTP(10mM)，0.6μL RNase inhibitor，1μL MMLV，冰上混匀，37℃，1h。结束后，在反应体系中加入75μL DEPC处理双蒸水；之后取2μLcDNA作为Real-Time-PCR模板。

荧光定量PCR反应体系：20μL

反应条件：

2.6数据处理：

通过分析产物的溶解曲线确定扩增的特异性，靶基因相对表达量由以下公式算出：2^-△△Ct。Ct值反映了目的片段扩增到一定量拷贝数是所需反应循环数的大小。Ct值越大表明参与反应的起始模板量就越小。所以用2^-△△Ct可以反应基因的相对表达量。

结果

CRMP2打靶ES细胞的筛选与鉴定

将经NotⅠ线性化后的打靶载体电转ES细胞，经G418和Ganciclovir正负筛选之后，一共挑取了288个ES细胞克隆。用位于第一个loxP位点左右两侧的引物CRMP2-loxP-F和CRMP2-loxP-R检测loxP位点是否整合进入ES细胞基因组，经PCR确定有60个ES细胞克隆中含有loxP位点。为了进一步排除随机插入用位于打靶载体同源臂3'端外侧的引物CRMP2-3'-F与位于打靶载体Neo上的引物CRMP2-3'-R，组成引物对检测含loxP位点的ES细胞克隆3'是否发生正确的同源重组，经检测有5个ES细胞克隆3'端是正确同源重组。为了确定这5个ES细胞克隆的5'端是否发生正确同源重组，用位于打靶载体同源臂5'端外侧的引物CRMP2-5'-F与位于打靶载体Neo上的引物CRMP2-5'-R，组成引物对检测确定有2个ES细胞克隆5'端同时正确同源重组，即确定筛选出两个正确同源重组的ES细胞克隆。用于后续的囊胚显微注射(图4)。

实施例3动物模型的制备

3.1CRMP2嵌合小鼠与F1代小鼠的获得

将鉴定为阳性的ES细胞克隆复苏进行囊胚显微注射共注射90个囊胚，每个胚胎注入15个ES细胞，然后将90个胚胎移植入8只ICR假孕母鼠子宫中。19天后产出18只子鼠，存活10只嵌合体，其中6只为雄鼠，如图2-6所示，只有1只的嵌合度为30%左右，其余5只为全身灰。用获得的6只雄鼠分别与C57BL/6J的雌鼠交配。其中有2只全身灰的小鼠不育，另外4只小鼠可育(图5)。

3.2CRMP2条件基因敲除小鼠的繁殖策略

嵌合体雄性小鼠与C57BL/6J雌鼠交配后生下的阳性CRMP2flox/+，定义为F1代。F1的CRMP2flox/+雌鼠与雄性CRMP2flox/+交配得到纯合的CRMP2flox/flox，出生比例符合孟德尔分离比例，CRMP2flox/flox小鼠形态体重都与同窝的野生型小鼠没有差异。为了特异地在神经细胞中敲除CRMP2基因，把CRMP2flox/flox小鼠与工具鼠Nestin-Cre交配，得到CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠。再把CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠与CRMP2flox/flox小鼠交配，即得到在神经细胞中特异敲除CRMP2基因的小鼠简称cKO小鼠(即神经特异性的CRMP2失活小鼠)，取同窝出生同性别的CRMP2flox/+；Nestin-Cre和CRMP2flox/flox基因型小鼠作为对照小鼠，用于确定CRMP2基因的生理功能(图6)。

3.3CRMP2基因敲除小鼠的鉴定

CRMP2cKO小鼠与Ctrl小鼠的出生比例符合孟德尔分离比例，说明CRMP2cKO小鼠能出生并且存活。为了证明确实在体内神经系统中把CRMP2敲除，在基因组水平，用CRMP2-269-F和CRMP2-269-R引物检测CRMP2flox/flox小鼠的基因组DNA可得到一条269bp的条带，检测CRMP2flox/+小鼠的基因组DNA可得到一条269bp和一条171bp的条带，而检测CRMP2+/+的基因组DNA则可得到一条171bp条带，如果是条件基因敲除的小鼠的在基因组水平还应该带有Cre基因，用Cre-531和Cre-819这一对引物检测，含有Cre基因的小鼠可以检测到一条288bp的条带(图7A)。为了进一步确认我们确实是只敲除了CRMP2基因，我们用荧光定量PCR方法检测了CRMPs家族的各个基因mRNA的表达情况，结果表明我们确实是特异敲了CRMP2，在转录水平上家族的其他成员并没有受到影响(图7B)。为了确认用nestin-Cre确实可以在蛋白水平上把CRMP2基因的敲除了，分离了小鼠各个脑区的蛋白，通过蛋白免疫印迹方法和免疫荧光的方法检测表达水平，实验结果表明在各个脑区CRMP2都被敲除了(图7C和7D)。

以上结果说明，在制备的动物模型体内，CRMP2被敲除了。

实施例4对大脑特异性CRMP2敲除小鼠的形态学和行为学分析

按通用方法中所述的方法，进行常规体重分析，Nissl染色、免疫荧光染色、行为学分析、海马区突触后致密组分分离检测和突触超微结构观察和定量分析。结果如下：

结果

1.大脑特异性CRMP2敲除小鼠形态学分析

1.1大脑特异性CRMP2敲除小鼠体重减轻

CRMP2神经特异敲除小鼠的出生比例符合孟德尔定律，形态未见明显异常，通过检测小鼠的体重，结果表明出生后8周cKO小鼠的体重相对于Ctrl大约有10%的减轻(图8A)。为了进一步确认体重的减轻是否会导致脑发育的异常，我们对8周龄的cKO和Ctrl小鼠的大脑形态进行分析，结果表明大脑的重量和周长大小都没有明显差别(图8B)。为了确认小鼠脑的精细结构是否有异常，我们进行了Nissl染色，实验结果表明小鼠的各个脑区未见明显异常(图8C)，为了进一步确认小鼠皮层神经元的分层是否异常，我们进行了成熟神经元特异的标志物NeuN染色，结果表明皮层成熟神经元的分布正常(图8D)。综合以上结果表明大脑特异性CRMP2敲除并没有影响成年小鼠大脑皮层的基本形态。

1.2大脑特异性CRMP2敲除小鼠胚胎期的皮层神经元分层基本正常

因为之前的颅内电转实验表明在胚胎期敲减CRMP2会导致神经元的迁移异常。为了检验在我们的基因敲除系统中是否有同样的表型，我们用各层神经元特异的标记物标记各层的神经元，比较胚胎期E18.5天Ctrl和cKO小鼠皮层的分层情况，其中Tbr1第6层神经元的标记物，免疫荧光染色结果表明其厚度和分布都没有明显异常(图9A)，SATB2第2层和第4层的标记物，免疫荧光染色结果表明其厚度和分布都没有明显异常(图9B)，FoxP1和CTIP2都为第5层的标记物，染色结果表明第5层神经元的厚度和分布正常(图9C和9D)。综合以上结果表明大脑特异性CRMP2敲除小鼠胚胎期的皮层神经元分布基本正常。

2、大脑特异性CRMP2敲除小鼠行为学分析

2.1大脑特异性CRMP2敲除小鼠自发活动水平增加

运动行为是动物最基本的行为表现，广泛用于评价基因变化或药物对动物一般性活动的影响。这种活动既不需要学习记忆的参与，也不存在条件或非条件反射，只是在没有外界环境干扰情况下测定到的动物的自主运动。因此也叫自发活动(spontaneouslocomotor activity)。开放场实验是评价动物自发活动广泛使用的方法，评价指标包括动物运动的总路程和在中间区域所占时间比例。

开放场仪器包括4个活动箱，每次每个箱内放入一只小鼠进行测试，测试时间5分钟。箱子顶部的摄像头全程录像，所有实验完毕后用软件分析每只小鼠的运动路径，计算总的运动距离。结果显示，CRMP2Ctrl小鼠运动的总路程为32.38±2.49m，CRMP2cKO小鼠运动的总路程为41.92±2.71m。在运动的中距离上cKO小鼠明显高于Ctrl小鼠，经独立样本t-检验P=0.0163，表明Ctrl小鼠和cKO小鼠间在运动的总路程上差异显著(图10A)。我们还分析实验过程中小鼠处在开放场中间区域所占时间的比例，结果显示Ctrl小鼠处在中间区域所占时间比例为14.03±2.421%，cKO小鼠处在中间区域所占时间的比例为15.18±2.203%，经独立样本t-检验P=0.7283，表明Ctrl小鼠和cKO处在中间区域所占时间比例没有显著性差异(图10B)。根据以上的结果说明cKO小鼠在自发活动显著增强，焦虑样行为并没有异常。

2.2大脑特异性CRMP2敲除小鼠焦虑样行为正常

高架十字迷宫是利用动物对新特异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑水平。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂，小鼠由于有嗜暗性倾向于在闭臂中活动，但是出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时小鼠同时产生探究的冲动和恐惧，造成了探究与回避的冲突行为，从而产生类似于人类的焦虑样心理。评价的主要指标是在开臂和闭臂的活动时间，计算出在开臂活动的活动时间占观察总时间的比例，在开臂活动的时间比例越低说明小鼠的焦虑情绪越严重。为了考察CRMP2cKO小鼠是否有更严重的焦虑样行为，我们进行了高架十字迷宫实验。实验结果显示cKO小鼠在开臂活动时间的比例为35.25±5.208%，Ctrl小鼠在开臂的活动时间比例为29.24±3.817%，统计分析显示两组小鼠在统计学上没有显著差异(图10C)。在开放场实验中cKO小鼠在中间区域所占时间比例与Ctrl小鼠在中间区域所占时间比例也没有显著差异，综合这两个结果说明cKO小鼠在焦虑样行为上没有异常。

2.3大脑特异性CRMP2敲除小鼠抑郁样行为增加

强迫游泳实验中小鼠放入盛水的玻璃缸内强迫游泳。小鼠最初在水中拼命游动挣扎试图逃脱，当感到无法逃脱时便放弃挣扎和游动，仅仅将头露出水面，肢体漂浮，维持一种不动的状态，称之为绝望行为。反应绝望行为的指标是小鼠在单位时间内维持绝望行为所占的时间。在我们的实验结果显示在记录的6min中，Ctrl小鼠在水中保持不动的时间为224.1±11.19sec(n=10)，而cKO小鼠在水中保持不动的时间为279.1±8.561sec(n=14)，统计分析显示两组小鼠在统计学上存在显著差异(P=0.001)(图11A)。同样，反映小鼠抑郁样行为的悬尾实验，结果显示Ctrl小鼠保持不动的时间为128.7±14.84sec(n=9)，而cKO小鼠保持不动的时间为232.5±12.19sec(n=12)，统计分析显示两组小鼠在统计学上存在显著差异(P<0.0001)(图11B)。又因为正常的啮齿类动物都会偏爱蔗糖水，而具有抑郁样行为的小鼠对蔗糖水的偏好性会降低。蔗糖水的偏好实验结果表明Ctrl小鼠对蔗糖水的偏好率为61.34±5.312%(n=8)，而cKO小鼠对蔗糖岁的偏好率为44.08±4.152%(n=12)，统计结果显示两组小鼠在这糖水偏好性上存在显著差异(P=0.0227)(图11C)。综合上面的三个实验结果说明cKO小鼠抑郁样的行为增加。

2.4大脑特异性CRMP2敲除小鼠具有孤独症样行为学表型

我们观察了同一窝小鼠(包括父母和不同基因型的后代)的社交行为。一些大脑特异性CRMP2敲除小鼠，如图12右上角的小鼠所示，极力避开与其他家庭成员的接触包括父母在内，与孤独症非常类似。

2.5大脑特异性CRMP2敲除小鼠空间学习和记忆能力降低

暗示与关联条件恐惧也叫场景恐惧实验，是基于巴普洛夫条件反射而建立的。它测定动物学习、记忆不悦经历和环境暗示之间关联的能力。在本实验中以厌恶刺激(足点击)作为非条件刺激，通过训练目的使小鼠建立电击与周围环境之间的联系，即所谓的关联条件恐惧。恐惧作为非灵长类动物少有的几种情感反应之一，动物经历条件恐惧后，当再次接触条件刺激时，会产生一系列的生理反应，包括自主神经紧张，应激激素分泌增加以及防御行为增多等等。凝滞即是动物防御行为的一种，是指动物除呼吸之外没有其他的活动。它被认为是评价啮齿动物恐惧的可靠指标。参与条件关联学习过程的脑区主要为杏仁核和海马。前者调节恐惧，后者调节与恐惧事物相关联的学习认知。所以，这一模型主要用于检测杏仁核和海马依赖的学习记忆。

实验的第一阶段，即训练期，目的是让动物建立起环境和厌恶性刺激(足电击)之间的关联。第二阶段，即测试期，目的是观察环境是否能引起动物对足部电击的记忆，以及这种记忆的牢固程度。

从训练期的结果看，随着时间和足电击次数的增加，小鼠的凝滞比率逐渐增加。从训练24小时后测试期结果看Ctrl小鼠的凝滞比率为Ctrl79.29±2.184%(n=14)明显高于cKO小鼠67.93±4.097%(n=14)，统计学上具有显著差异(P=0.0127)(图13A)。以上结果提示，cKO小鼠恐惧相关的长时程记忆受损。

在水迷宫实验定位航行训练阶段，随着训练天数的增多，野生型小鼠寻找站台的潜伏期逐渐缩短，但是敲除小鼠在第三天之后寻找站台的潜伏期却未见明显缩短，第一天Ctrl52.806±2.366Vs cKO56.399±1.672sec(P>0.05)，第二天Ctrl33.5±6.233sec VscKO42.7222±3.348sec(P>0.05)，从第三天Ctrl25.778±2.337sec Vs cKO47.333±4.92sec(P<0.001),第四天Ctrl24.194±1.654sec Vs cKO39.056±4.49sec(P<0.05)，第五天Ctrl22.139±2.638Vs cKO39.861±4.978sec(P<0.01)，(图13B)。

在水迷宫空间探索实验阶段，移去平台，小鼠从原平台所在目标象限的对侧入水，记录小鼠在原平台所在目标象限的停留时间，观察时间为60秒。Ctrl小鼠在原平台象限停留的时间比例为55.48±4.422%(n=9)，而cKO小鼠为31.59±6.998%(n=9)，统计分析显示存在显著差异(P=0.0108)(图13C)。以上结果说明cKO小鼠空间学习记忆能力受损

2.6大脑特异性CRMP2敲除导致精神分裂症样行为

前脉冲抑制(Prepulse inhibition，PPI)是一种神经学上的现象，是指在强的惊反射刺激之前一定时间内的弱刺激会对强刺激的惊反射幅度产生抑制的现象。它是衡量感觉运动门控功能的重要指标。因为精神分裂症的病人存在前脉冲抑制受损的现象，而且前脉冲抑制还是哺乳动物中共有的一种现象，人类和啮齿类动物测量前脉冲抑制时所采用的刺激参数非常相似，所以前脉冲抑制常常作为评判精神分裂症动物模型的重要指标。

在单独的惊反射刺激下，Ctrl和cKO小鼠随着惊反射刺激强度的增加，惊反射幅度都逐渐增加，但是两组小鼠在给予相同强度的惊反射刺激时惊反射的幅度并没有显著差异(图14A)。当给予不同强度的前刺激时，cKO小鼠对强刺激的惊反射幅度的抑制作用明显弱于Ctrl小鼠。两两相比结果显示，当前刺激强度分别高于北京4、8和12dB时，cKO小鼠前脉冲抑制率分别为均低于Ctrl小鼠，统计学显示差异显著(+4dB：Ctrl45.746±2.737%VscKO24.384±4.785%,P<0.01;+8dB Ctrl47.171±3.657%Vs cKO24.933±8.491%,P<0.01;+12dBCtrl48.318±3.439%Vs cKO32.927±5.267%,P<0.05;Ctrl n=13,cKO n=13)(图14B)，以上结果表明大脑特异性CRMP2敲除小鼠前脉冲抑制明显受损。

筑窝能力是动物为了防止热量丧失和保护自己所需的基本技能，是小鼠社会性行为的表现。当分别给Ctrl和cKO小鼠相等量的棉花和同样的时间，然后对这两组的筑窝能力评分(图14C&14D)，结果表明cKO小鼠的筑窝能力明显低于Ctrl小鼠(Ctrl3.829±0.4612n=7Vs cKO2.138±0.4758n=8,P=0.0249)，提示cKO小鼠的社会性行为异常。

综合以上两个结果，提示我们大脑特异性CRMP2敲除小鼠可能存在精神分裂症样的行为。

3大脑特异性CRMP2敲除小鼠海马突触后致密区中NR2B和NR1量减少

cKO小鼠学习和记忆能力的下降提示海马的突触可塑性可能发生变化，而突触可塑性的变化往往伴随突触后致密区上受体量的变化。AMPA受体介导短时程的可塑性，AMPA受体是由多种亚基组成的四聚体，有4种亚基可以组装成AMPA受体：GluR1、GluR2、GluR3和GluR4，而海马中绝大多数AMPA受体是而海马中绝大多数的AMPA受体是GluR1-GluR1-GluR2-GluR2组合，另有少量的GluR3-GluR3-GluR4-GluR4组合。NMDA受体是离子型谷氨酸受体的一个亚型，功能性的NMDA受体必须含有NR1亚基，多个NR2亚基和NR1共同形成四聚体或五聚体，参与调节神经元的存活、轴突、树突发育及突触可塑性的形成。我们通过超速离心方式分离了海马区突触后致密区组分和免疫印迹的方式，首先检测了分离组分的纯度和确定了CRMP2在该组分中被敲除，其次检测了突触后致密区AMPA受体和NMDA受体各个亚基的含量，结果表明分离的突触后致密区组分是纯的而且CMRP2在敲除小鼠海马的突触后致密区确实被敲除了(图15A)，结果还表明NMDA受体的NR1亚基和NR2B亚基在突触后致密区的量明显减少(图15B)。

4大脑特异性CRMP2敲除小鼠海马CA1区突触超微结构观察

CRMP2神经特异敲除小鼠学习和记忆能力下降提示海马突触的可塑性发生异常，而可塑性的变化与突触的形态结构密切相关。我们通过透射电镜观察CA1区放射层的不对称突触即兴奋性突触(图16A)，该突触的特点是由CA1锥体细胞的树突干或树突棘形成突触后膜，突触前成分主要来自CA3椎体细胞的轴突。我们对CA1区放射层兴奋性突触的各个指标进行量化分析结果表明，CRMP2敲除小鼠突触间隙的宽度没有明显区别(Ctrl:23.10±0.2379nm,n=200vs CRMP2cKO:23.48±0.25nm,n=170)(图16B)，突触后致密组分的长度没有明显变化(Ctrl:231.3±3.562nm,n=282vs CRMP2cKO:235.3±4.235nm,n=269)(图16C)，突触后致密组分的面积明显变小(Ctrl:7723±193.9nm2,n=282vs CRMP2cKO:7076±193.2nm2,n=269,P=0.0187)(图16D)及突触后致密组分厚度明显变薄(Ctrl:33.07±0.5637nm,n=282vs CRMP2cKO:29.89±0.5116nm,n=269，P<0.0001)(图16E&16F)。

5CRMP2神经细胞特异敲除小鼠电生理上特性分析

5．1cKO小鼠海马谢弗侧支CA1区突触的基础突触传递正常

突触基本的属性包括突触对神经冲动的传导和反应，可以通过绘制反映fEPSP和刺激强度或突触前纤维群峰(fiber volley)对应关系的刺激-反应曲线(input-outputcurve)来表征。比较同一刺激强度引发的EPSP slope大小，结果表明cKO小鼠与Ctrl小鼠脑片在不同刺激强度下EPSP slope没有显著差异(图17A)。说明cKO小鼠海马谢弗侧支CA1区突触的基础突触传递是正常的。

5.2cKO小鼠海马谢弗侧支CA1突触的双脉冲易化效应正常

双脉冲易化(paired-pulse facilitation，PPF)被定义为间隔一定时间的前后两个刺激所引发的两个反应(EPSP1和EPSP2)中，第二个反应(EPSP2)比第一个反应(EPSP1)增加的程度，被认为是一个表征突触前释放能力变化的电生理指标。比较同一间隔下Ctrl和cKO小鼠EPSP2/EPSP1值，发现两组之间没有显著差异(图17B)。以上结果说明大脑特异性CRMP2敲除并没有影响小鼠海马谢弗侧支CA1突触的突触前短时程可塑性。

5.3cKO小鼠海马谢弗侧支CA1突触的长时程增强受损

长时程增强是指给突触前纤维一个短暂的高频刺激后，突触传递效率和强度增加几倍且能持续数小时甚至几天保持这种增强的现象，它是突触可塑性的一种模式，NMDA受体与神经递质结合后，导致细胞内级联反应，触发神经元内一系列生化反应，最终改变突触后膜的性质，建立LTP。使用TBS在海马谢弗侧支CA1诱发LTP，可以明显看出敲除小鼠刺激后的EPSP远低于对照(P<0.001)(图17C)。

6大脑特异性CRMP2敲除小鼠海马齿状回成年新生神经元的发生减少

越来越多的证据提示海马齿状回区成年新生神经元发生(adult neurogenesis)的减少可能与多种神经精神疾病密切相关(Ming and Song,2011；Winner et al.,2011；Muand Gage,2011)，为此我们用Brdu标记的方法检测了大脑特异性CRMP2敲除小鼠成年神经前体细胞的增殖情况，结果表明敲除小鼠齿状回区神经前体细胞的增殖减少，但是凋亡并没有显著增加(图18A-D)。

实施例4

用治疗精神分裂症的药物验证药物筛选平台

在本实施例中，给实验小鼠注射当前临床治疗精神分裂症的药物利司培酮或奥氮平，随即进行惊反射前脉冲抑制行为学测试和分析。

结果表明，利司培酮对模型小鼠惊反射前脉冲抑制作用有不同程度的恢复。

药物奥氮平(Olanzapine)能精神分裂症的症状起到缓解甚至消除的作用。这进一步证明已建立的小鼠模型与人类的精神分裂症确实存在着相关性。

实施例5

利用精神分裂症药物筛选平台筛选候选药物

在本实施例中，计划通过给实验小鼠注射药物候选神经精神疾病的治疗药物，随即进行惊反射前脉冲抑制等行为学测试和分析。通过与给安慰剂的实验小鼠比较惊反射前脉冲抑制作用等行为学指标的差异，能够改善行为学指标的候选药物，即为该神经精神疾病的潜在治疗药物。

其它神经精神类疾病也可以参照上述方法，采用相应的行为学指标进行候选药物筛选。

讨论

人类的精神行为是异常复杂的，受许多因素影响，有外因和内因的作用，在人类的基础上直接研究精神疾病，受到伦理、统计和不可操作性等许多因素的影响。用实验动物来建立精神疾病动物模型，将现实疾病的复杂性简化成具体的、可控制的影响因素，对于了解和阐明精神疾病发病机制，量化精神疾病的诊断指标具有重要意义；同时在药物筛选或新药鉴定中也将发挥作用，成为新药开发的重要工具。

实验小鼠因其基因组成研究基础好以及与人类遗传的同源性，特别是中枢神经系统指导的行为与人类的大量神经活动具有高度的可比性，成为这一研究中具有其他实验材料无可比拟优越性的首选实验动物。

本发明中通过敲除等手段使得CRMP2基因失活后，小鼠都出现了类似精神分裂症症状，得到了类似的实验结果，从而进一步证明了该动物模型的有效性和可重复性。

蛋白质组学的研究表明，在精神分裂症病人的脑组织和神经系统中许多蛋白的表达水平存在变化，然而不同研究者报道的情况也不尽相同。Edgar通过比较蛋白质组分析研究在精神分裂症病人的海马中CRMP2的表达上调(Edgar,P.F.(2000).Comparativeproteome analysis.Tissue homogenate from normal human hippocampus subjectedto two-dimensional gel electrophoresis and Coomassie blue proteinstaining.Mol Psychiatry5,8,85-90.)，在颞叶内侧癫痫病人的海马组织中CMRP2的表达量下调(Czech,T.,Yang,J.W.,Csaszar,E.,Kappler,J.,Baumgartner,C.,and Lubec,G.(2004).Reduction of hippocampal collapsin response mediated protein-2inpatients with mesial temporal lobe epilepsy.Neurochem Res29,2189-2196.)。

CRMP2的表达水平在一些神经退行性疾病(譬如老年痴呆、帕金森氏病和其他神经系统疾病)中发生改变，提示这些蛋白可能在这些疾病病理发生过程中具有重要作用(Johnston-Wilson,N.L.,Sims,C.D.,Hofmann,J.P.,Anderson,L.,Shore,A.D.,Torrey,E.F.,and Yolken,R.H.(2000).Disease-specific alterations in frontal cortexbrain proteins in schizophrenia,bipolar disorder,and major depressivedisorder.The Stanley Neuropathology Consortium.Mol Psychiatry5,142-149)。

本发明动物模型与其他一些现有的精神分裂症候选基因被敲除后的动物模型的比较见下表：

+指受损或表现出神经精神相关表型

-指无表型或未检测

综上所述，本研究通过基因敲除技术建立了大脑特异性CRMP2和全身敲除的小鼠模型。通过小鼠行为学检测，发现大脑特异性CRMP2敲除小鼠自发活动水平增加，抑郁样行为增加和精神分裂症样的行为学表型，部分小鼠表现出典型的孤独症表型。对海马组织突触后膜致密组分中AMPA受体亚基和NMDA受体亚基的免疫印迹分析表明敲除小鼠中海马PSD组分中NR1和NR2B的量显著降低；通过透射电镜对海马CA1区放射层非对称突触的超微结构进行观察，发现敲除小鼠在该区的PSD面积明显变小，厚度变薄；通过电生理技术发现敲除小鼠海马谢弗侧支CA1区突触的基础传递和突触前膜的递质释放正常，但是TBS诱导产生的长时程增强却明显受损。同时该基因敲除小鼠齿状回中成年神经干细胞增殖明显减少。

本发明人在全身CRMP2敲除中发现与一些与大脑特异性CRMP2敲除类似的表型。因此，不同的CRMP2基因敲除小鼠模型可作为一种有效的神经精神疾病动物模型包括精神分裂症、躁郁症、抑郁症、孤独症和老年痴呆，可以广泛用于特定药物的筛选和测试试验。相对于上表中的其它动物模型，CRMP2基因敲除小鼠模型表现出更多的与神经精神疾病相关的表型，更有利于上述疾病的机制研究和筛选相关疾病的分子标记和治疗药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1) 提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因失活的细胞；

(2) 利用步骤(1)中得到的CRMP2基因失活的细胞，制备得到CRMP2基因失活的神经精神疾病动物模型，

其中，所述的CRMP2基因失活是大脑特异性的CRMP2基因失活；

其中，所述神经精神疾病包括：躁郁症、重度抑郁症、和/或孤独症；

其中，所述的非人哺乳动物为小鼠或大鼠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRMP2基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因失活包括CRMP2基因不表达，或表达没有活性的CRMP2蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为小鼠。

5.一种非人哺乳动物的神经精神疾病动物模型的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)利用DNA同源重组技术，将所述CRMP2基因中的外显子1至外显子14中一个或多个外显子剔除或中断，或者用筛选标记替换，得到CRMP2基因失活的非人哺乳动物细胞；

(2)利用步骤(1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳动物细胞制备得到嵌合非人哺乳动物；

(3)将步骤(2)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁育，在后代中筛选获得CRMP2基因失活的杂合子非人哺乳动物；

(4)通过将步骤(3)中得到的杂合子非人哺乳动物相互交配获得CRMP2基因失活的纯合子非人哺乳动物，从而得到CRMP2基因失活的非人哺乳动物模型；

其中，所述神经精神疾病包括：躁郁症、重度抑郁症、和/或孤独症；

其中，所述的非人哺乳动物为小鼠或大鼠。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CRMP2基因失活是通过缺失或敲除CRMP2的外显子3而失活。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述神经精神疾病为躁郁症、重度抑郁症、和孤独症。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤(5)：将CRMP2基因失活的纯合子非人哺乳动物与同一物种的神经特异性敲除工具非人哺乳动物进行杂交，从而获得大脑特异性的CRMP2基因失活的非人哺乳动物动物模型。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物是小鼠，并且在步骤(5)中把CRMP2 flox/flox小鼠与工具鼠Nestin-Cre交配，得到CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠；再把CRMP2flox/+；Nestin-Cre小鼠与CRMP2 flox/flox小鼠交配，即得到在神经前体细胞特异性CRMP2基因的敲除小鼠简称cKO小鼠。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述筛选标记为neo基因。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳动物模型中，与野生型对照动物相比，具有以下所有特征：

自发活动水平增加；

抑郁样的行为增加；

空间学习和记忆能力受损；

表现出孤独症样和精神分裂症样行为；

海马区突触后致密组分中部分受体亚基的含量减少；和

长时程增强受损。

12.一种非诊断和非治疗性的根据权利要求1-11之任一项所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，将该模型用于筛选或鉴定可减轻或治疗神经精神疾病的物质，其中，所述神经精神疾病包括：躁郁症、重度抑郁症、和/或孤独症。

13.一种非诊断和非治疗性的筛选或鉴定治疗或缓解神经精神疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 将候选物质施用于权利要求1或5所述方法制备的非人哺乳动物模型；和

b. 对所述动物模型的行为进行行为学分析，并与对照组进行比较；

其中，与对照相比，如果施用了候选物质的动物模型中表征神经精神疾病行为得到改善，则表明该候选物质是神经精神疾病的潜在治疗剂，

其中，所述神经精神疾病包括：躁郁症、重度抑郁症、和/或孤独症。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的行为学分析包括：开放场实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验、悬尾实验、蔗糖偏好实验、水迷宫实验、关联/暗示条件恐惧实验、惊反射前脉冲抑制实验、筑巢实验、或其组合。

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